CN102046194B

CN102046194B - 药剂、牙科材料及筛选方法

Info

Publication number: CN102046194B
Application number: CN200980112243.1A
Authority: CN
Inventors: 中岛美砂子; 中村洋
Original assignee: National Center for Geriatrics and Gerontology
Current assignee: National Center for Geriatrics and Gerontology
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2016-08-31
Anticipated expiration: 2029-04-06
Also published as: US20110044960A1; ES2548451T3; EP2286829B1; JP2009249344A; WO2009125859A1; EP2286829A1; US20160008405A1; EP2286829A4; JP5572291B2; CN102046194A; US9597360B2

Abstract

本发明提供了一种用于治疗牙髓炎和/或促进象牙质形成的牙科材料。根据本发明的牙科材料至少含有具有基质金属蛋白酶‑3(matrix metalloproteinase，MMP‑3)活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶‑3前体蛋白(即酶原)的任意一种；另外，根据本发明的牙科材料含有机体亲和性载体；根据本发明的牙科材料中至少含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、能分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞(odontoblast)以及能分化为成齿质细胞的细胞的任意一种。

Description

药剂、牙科材料及筛选方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂及其使用，特别涉及利用基质金属蛋白酶-3对牙髓及其附近组织损伤及缺损时的修复。

背景技术

以往，在龋齿等治疗方法中，当发生龋齿深入牙髓时，通常通过拔除全部牙髓，然后在空隙处填充根管充填剂进行封闭治疗(拔髓治疗)。然而，近年来，由于拔髓产生的弊端(如象牙质脆化、丧失咬合感觉而引起再度龋齿的扩大等)，因此期望尽可能保留牙髓组织。保留牙髓的方法有直接盖髓术和活髓切断术(vital pulpotomy)，其中，直接盖髓术是用覆髓剂覆盖牙髓创面(露髓创面)，活髓切断术只去除一部分牙髓并用覆髓剂覆盖根部牙髓。

在考虑到牙髓的保存时，在牙髓外侧形成象牙质很重要。为此，如专利文献1、2、3所述，尝试采用以提高象牙质促进作用为目的的覆髓剂。

另外，在考虑到牙髓的保存时，抑制牙髓炎症及疼痛，且促进血管新生及牙髓再生很重要。为此，如非专利文献1所述，尝试采用以抗炎症作用为目的的覆髓剂。

专利文献1：特开2002-363084号公报

专利文献2：特开平6-256132号公报

专利文献3：特开2005-263681号公报

非专利文献1：Kawanishi HN，Kawashima N，et al.，Effects of an iNOS inhibitoron experimentally induced rat pulpitis，J.Oral.Sci.，112，332-337，2004.

发明内容

但，这些现有覆髓剂的促进象牙质形成的作用还不十分令人满意。专利文献1所述的覆髓剂是以血液抽提物为有效成分的一种覆髓剂，然而，专利文献1所记载的覆髓剂其促进象牙质形成的功效还不足，而且还存在安全方面的问题。另外，专利文献2所述的覆髓剂是以N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)为有效成分的一种覆髓剂。然而，如专利文献2所述的覆髓剂不包含成齿质细胞分化诱导所必须的形态形成因子、细胞增殖分化因子、细胞迁移因子，所以只不过是间接吸附游离在局部的因子而已。因此，专利文献2所述的覆髓剂在促进象牙质形成以及象牙质-牙髓复合体再生方面的功效不足。专利文献3所述的覆髓剂是一种以聚磷酸为有效成分的覆髓剂，然而使促进象牙质形成的功效发挥不足。非专利文献1中述的覆髓剂是一种以诱导型一氧化氮合酶抑制剂为有效成分的覆髓剂，非专利文献1所述的覆髓剂通过阻断诱导型一氧化氮合酶、破坏炎症介质网络的一端来发挥消炎作用。然而，其促进新生血管及牙髓再生的作用不足。

因此，本发明以提供一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂为目的。另外，本发明还以提供一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的牙科材料为目的。另外，本发明还以提供一种治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂的有效成分的筛选方法为目的。

本发明人从含有丰富牙髓干细胞的SP细胞(CD31^-；CD146^-SP细胞)中采集具有高血管再生能力的细胞，同时对牙髓SP细胞进行基因表达谱分析。其结果为本发明人发现，涉及细胞外基质及基底膜分解的细胞外基质分解酶的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)为高表达。进一步，本发明人还发现这些蛋白质可促进牙髓创伤的愈合，同时有利于牙髓、象牙质的形成和再生以及牙髓炎的治愈，本发明人基于上述发现完成了此项发明。即，本发明具有如下步骤。

根据本申请发明的第一实施方式的药剂，其含有有效成分，其中，该有效成分至少包括具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。本发明的药剂可以作为牙髓损伤或部分缺失时的药剂使用。尤其，本发明的药剂可以作为牙髓炎及/或根尖性牙周炎等牙髓相关疾病的预防或治疗剂使用。

优选地，有效成分的含量比例在12ng/ml-1000ng/ml之间，其中，该有效成分为至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。

根据本申请发明的第二实施方式的牙科材料，其含有有效成分，其中，该有效成分至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。

优选地，所述牙科材料含有具有机体亲和性的载体。该载体为符合药理学的载体。

优选地，所述载体的至少一侧具有排列多个深度方向为一定方向的凹形结构，是一种由氧透过性及/或物质透过性的材料制成的膜状载体。

优选地，所述载体至少含有骨胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱(phosphocholine)、透明质酸、几丁质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素(heparansulfate)、肝素、层粘连蛋白、磷酸三钙、羟基磷灰石、β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚-DL-乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、多晶硅、聚已酸内酯(polycaprolactone)、碳酸钙、钛、金、陶瓷、硅树脂、硅水凝胶(silicone hydrogel)中的任意一种。

优选地，本发明的牙科材料中至少还含有牙髓细胞、牙髓于细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞(odontoblast)以及可分化为成齿质细胞的细胞中的任意一种。

优选地，细胞含量在1×10³个/μl～1×10⁶个/μl之间，其中，所述细胞至少包含所述牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞(odontoblast)以及可分化为成齿质细胞的任意一种。

优选地，本发明的牙科材料含有血管内皮细胞或血管内皮前体细胞。

优选地，本发明的牙科材料含有上皮细胞。

优选地，本发明的牙科材料含有象牙质基质。

另外，优选地，在本发明的牙科材料中，所述基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种所构成的有效成分的含量比例在12ng/ml-1000ng/ml之间。

优选地，所述牙髓干细胞至少包含牙髓SP细胞、CD31^-且CD146^-细胞、CD24⁺细胞、CD105⁺细胞、CD150⁺细胞中的任意一种。

根据本申请发明的第三实施方式的筛选方法，一种用于治疗牙髓炎及/或促进象牙质形成的药剂有效成分的筛选方法，在牙髓干细胞或血管内皮细胞中添加被检验化合物，然后测定牙髓干细胞或血管内皮细胞基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；在牙髓干细胞或血管内皮细胞中没有添加被检验化合物时，测定基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；将两者基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量进行比较，以将基质金属蛋白酶-3编码基因表现量所增加的被检验化合物作为所述药剂的有效成分进行选择。

根据本发明的药剂，能够达到减轻牙髓炎的炎症状态，促进血管内皮细胞的迁移，防止血管内皮细胞凋亡的效果，并促进牙髓干细胞以及血管内皮细胞在创面的增殖，同时促进新生血管，从而促进象牙质的形成，因此在牙髓炎的治疗效果方面优秀。另外，通过将根据本发明的牙科材料填充至活体牙窝洞处，可减轻牙髓炎的炎症状态，并促进牙髓干细胞以及血管内皮细胞在创面的增殖，促进新生血管，从而促进象牙质的形成。并且，根据本发明提供的筛选方法，通过比较基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量，从被检验化合物中可筛选出能够促进牙髓炎以及/或象牙质形成的药剂的有效成分。

附图说明

图1A为具有凹状部的膜状载体的平面图。

图1B为具有凹状部的膜状载体的侧面图。

图1C为将凹状部扩大的说明图。

图2A为严重龋齿引起牙髓裸露的牙齿的说明图。

图2B为表示牙齿模具的说明图。

图2C为对将带有间叶干细胞(mesenchymal stem cell)的凹面载体置入牙形模具中的牙窝洞内的情况进行说明的说明图。

图2D为对将带有MMP3活性蛋白的载体以及凹面载体置入牙形模具中的牙窝洞的情况进行说明的说明图。

图2E为对在培养装置中培养干细胞的情况进行说明的说明图。

图2F为对垂直加压后，干细胞分化为成齿质细胞以及成釉细胞(enameloblast)的情况进行说明的说明图。

图2G为对将凹面载体移植至牙窝洞后的情况进行说明的说明图。

图3A为对大鼠上颚切齿情况进行说明的说明图。

图3B为对使用钻石牙钻(diamond point bur)去除大鼠上颚切齿牙冠上部的情况进行说明的说明图。

图3C为使用球钻(round bur)切断大鼠上颚切齿牙髓的情况进行说明的说明图。

图3D为对清洗、止血处理断面的情况进行说明的说明图。

图3E为对在断面开口处填充明胶、树脂的情况进行说明的说明图。

图4为对牙髓创伤处进行说明的低倍图片。

图5A为创伤出现1小时后的情况的显微照片。

图5B为图5A中方框区域的显微照片。

图5C为创伤出现24小时后的情况的显微照片。

图5D为图5C中方框区域的显微照片。

图5E为创伤出现72小时后的情况的显微照片。

图5F为图5E中方框区域的显微照片。

图5G为创伤出现7天后的情况的显微照片。

图5H为图5G中方框区域的显微照片。

图6A为创伤下部牙髓处的mRNA表达的经时变化示意图；MMP1、MMP2、MMP3、MMP9以及MMP14的表达示意图。

图6B为创伤下部牙髓处的mRNA表达的揭示变化示意图；VEGF、SDF1以及CXCR4的表达示意图。

图7A为活髓切断后24小时内，MMP3及BS 1-1ectin双重免疫荧光染色当中的MMP3显微照片。

图7B为活髓切断后24小时内，MMP3以及BS1-lectin双重免疫荧光染色当中BS 1-lectin的显微照片。

图7C为活髓切断后24小时内，MMP3以及BS1-lectin双重免疫荧光染色当中Merge处理的显微照片。

图7D为活髓切断后24小时内，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色当中MMP3的显微照片。

图7E为活髓切断后24小时内，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色当中CXCR4的显微照片。

图7F为活髓切断后24小时内，经MMP3以及CXCR4双重免疫荧光染色当中经Merge处理的显微照片。

图7G为经MMP3及CXCR4双重免疫组织荧光染色当中MMP3的放大显微照片。

图7H为经MMP3及CXCR4双重免疫组织荧光染色当中CXCR4的放大显微照片。

图7I为经MMP3及CXCR4双重免疫组织荧光染色当中Merge处理的放大显微照片。

图7J为活髓切断后24小时内，牙髓创面经HE染色后的显微照片。

图7K为活髓切断后24小时内，牙髓断面新生毛细血管以及新生大血管经HE染色后的显微照片。

图7L为活髓切断72小时后，新生毛细血管以及新生大血管经HE染色后的显微照片。

图7M为活髓切断后24小时内，经原位杂交，MMP3mRNA在血管内皮细胞以及血管内皮前体细胞中表达情况的显微照片。

图7N为活髓切断后72小时内，经原位杂交，MMP3mRNA在血管内皮细胞以及血管内皮前体细胞中表达情况的显微照片。

图8A为在体外，MMP3促进血管内皮细胞增殖的示意图。

图8B为在体外，MMP3促进血管内皮细胞迁移的示意图。

图8C为在体外，MMP3促进血管内皮细胞抗凋亡的示意图。

图9A为大鼠活髓切断后24小时内，添加MMP3后经BS1-lectin染色的显微照片。

图9B为大鼠活髓切断后24小时内，未添加MMP3，经BS1-lectin染色的显微照片。

图9C为大鼠活髓断面处的上部牙髓组织中经MMP3对新生血管密度增加定量的示意图。

图9D为大鼠活髓切断后24小时内，添加MMP3后经PCNA免疫染色时的显微照片。

图9E为大鼠活髓切断后24小时内，未添加MMP3，经PCNA免疫染色后的显微照片。

图9F为大鼠活髓切断后72小时内，添加MMP3后经HE染色的显微照片。

图9G为大鼠活髓切断后72小时内，未添加MMP3，经HE染色时的显微照片。

图9H为大鼠活髓切断后72小时内，添加MMP3后经马松染色(Masson′sTrichrome Stain)的显微照片。

图9I为大鼠活髓齿切断后72小时内，添加MMP3，原位杂交的显微照片。

图9J为大鼠活髓齿切断后72小时内，未添加MMP3，经马松染色的显微照片。

图9K为大鼠活髓切断后72小时内，添加MMP3及NNGH后经马松染色的显微照片。

图9L为大鼠活髓切断后7内，未添加MMP3，经马松染色的显微照片。

图9M为大鼠活髓切断后7天内，添加MMP3及NNGH后经马松染色的显微照片。

图9N为大鼠活髓切断后72小时内，经MMP3对骨胶原蛋白基质增加情况示意图。

图9O为大鼠活髓齿切断后7天内，经MMP3对骨胶原蛋白基质增加情况示意图。

图10A为狗上颚臼齿活髓切断14天后，添加MMP3后狗上颚臼齿象牙质的形成情况的显微照片。

图10B为狗上颚臼齿活髓切断14天后，添加MMP3后狗上颚臼齿象牙质的形成情况的高倍显微照片。

图10C为狗上颚臼齿活髓切断14天后，添加MMP3后狗上颚臼齿象牙质的形成情况的超高倍显微照片。

图10D为狗上颚臼齿活髓切断14天后，PBS控制时的显微照片。

图10E为狗上颚臼齿活髓切断14天后，PBS控制时的高倍显微照片。

图11A为发生牙髓炎的狗上颚臼齿添加MMP314天后，炎症治疗情况的显微照片。

图11B为发生牙髓炎的狗上颚臼齿添加MMP314天后，炎症治疗情况的高倍显微照片。

图11C为发生牙髓炎的狗上颚臼齿的PBS控制时的14天后的显微照片。

图11D为发生牙髓炎的狗上颚臼齿的PBS控制时的14天后的高倍显微照片。

图12A为将源于猪牙髓的CD31^-；CD146^-SP细胞附着于带有凹状部的硅氧树脂(silicone)膜载体上，培养12小时后的相差显微照片。

图12B为垂直加压6小时，培养48小时后，β-肌动蛋白(β-actin)、Dspp以及釉质溶解素(Enamelysin)的mRNA表达的示意图。

附图标记说明

100：带有凹状部的载体；

110：凹状部；

200：牙齿；

210：牙髓；

290：模具；

300：吸附有MMP3蛋白的载体；

400：培养设备；

500：大鼠上颚切齿；

510：钻石牙钻(diamond point bur)；

520：球钻(round bur)；

540：断面；

550：明胶；

560：树脂。

具体实施方式

以下将参照附图具体说明本发明的实施方式。

本发明涉及一种可促进牙髓炎治愈及/或象牙质的形成的药剂、牙科材料及有效成分的筛选方法，其中，至少含有具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质以及基质金属蛋白酶-3前体蛋白中的任意一种。

本发明的各种实施方式均是利用基质金属蛋白酶-3对牙髓炎进行治疗以及/或促进象牙质的形成。基质金属蛋白酶-3属于基质金属蛋白酶(MMP)族，考虑为相关细胞外基质的分解。但是，每种MMP的特性还不完全知晓。

本发明人根据从牙髓细胞中采集的特定SP细胞的表达图谱，在该特定的SP细胞内表达的所促进的大量蛋白质中，发现了MMP3具有出众的促进象牙质形成的作用。关于MMP3已进行了多方面的研究，示出了MMP3对各种软骨基质成分的分解作用，从MMP3作为破坏相关软骨的蛋白质，已被认为是作为风湿症(rheumatism)的参与因子或标志使用。另外，在相关牙周病引起的牙周组织破坏，现在已尝试使用MMP3编码基因的表达抑制剂作为预防或治疗牙周病(特开2006-298913号公报)。但，有关对MMP3的牙髓炎的治愈参与还完全不清楚。同时，对MMP3的牙髓及/或象牙质的形成、再生也完全不清楚。

本发明的药剂和牙科材料将具有基质金属蛋白酶-3活性的蛋白质直接应用于创伤部位及/或炎症部位，根据本发明的药剂及牙科材料，可以促进牙髓炎治疗。另外，根据本发明的药剂和牙科材料，可以促进牙髓及/或象牙质的形成并再生。本发明的效果并不限于本发明，推测MMP3作用于血管内皮细胞或血管内皮前体细胞迁移、增殖、抗凋亡，通过新生血管，在促进牙髓的再生以及象牙质形成、再生方面具有独特的功效。

下面，将说明本发明的各种实施方式。

(牙髓炎治疗及/或促进象牙质形成的药剂)

本药剂含有具有MMP3活性的蛋白质(以下称MMP3活性蛋白)、MMP3前体蛋白或这些蛋白的混合物为其有效成分。以下将MMP3活性蛋白、MMP3前体蛋白或它们的混合物定义为MMP3蛋白。MMP3属于MMP族中的一种蛋白质，也被称为基质降解因子(stromelysin)1。MMP3可来源于各种物种，例如，人类MMP3的氨基酸序列以及碱基序列可在GenBank中，通过登录号码NP_002413.1获得。

MMP3活性蛋白可采用重组MMP3，即可来源于大肠杆菌、昆虫或人纤维组织母细胞。MMP3活性蛋白是指天然MMP3的氨基酸序列中，具有任何1个或多个氨基酸发生替换、缺失、插入以及增加的任何一种或2种以上的氨基酸序列，具有MMP3活性的尤佳。也就是说，可以是一种天然MMP3的突变体。这些突变体的获得，除了本领域技术人员中公知的方法以外，还可参照MolecularCloning：A laboratory Mannual，3^nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY.，2001(以下简称为Molecular Cloning第三版)或CurrentProtocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley &Sons(1987-1997)(以下简称为Current Protocols in Molecular Biology)获得。MMP3的活性可通过MMP3活性测定系统(Nagase et a1.，J.Biol.Chem.1994269：20952-20957)等进行测定，其中，MMP3活性测定系统使用明胶酶谱(Gelatin-zymography)、酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA))或荧光肽。另外，对于突变体中MMP3的活性程度无特殊限制。MMP3前体蛋白是由结缔组织细胞等分泌的一种无活性前体(pro MMP3)，是前体肽(Pro-peptide)区域被限定分解前的前体，还包含天然MMP3前体的突变体。

MMP3活性蛋白是将MMP3前体蛋白利用人工胰朊酶、纤溶酶、丝氨酸蛋白酶等切断得到。也就是说，MMP3前体蛋白通过其他或自身的蛋白酶活性，前体肽区域经限定分解，从而具有了酶活性。因此，使药剂中含有MMP3前体蛋白质可防止药物在用于活体前药效发生劣化，MMP3前体蛋白进入机体后，会自然地或因其他作用而被激活。若使用MMP3活性蛋白和MMP3前体蛋白的混合物，二者混合的比例无特别限制，可适当配比。

本发明的药剂中的MMP3蛋白，在药理学以及药剂学原理容许的情况下，可与其他添加物混合，制作成适用于患处的各种制剂。本发明中的覆髓剂可采用多种剂型如注射剂、外用液剂(注入剂、搽剂)、固体制剂(颗粒剂、细粒剂、散剂、软膏剂、锭剂)、软膏剂等。

药理学以及药剂学范围内容许的添加物包括如赋形剂、崩解剂或崩解助剂、结合剂、润滑剂、涂饰剂、色素、稀释剂、主剂、溶解剂或溶剂助剂等张化剂、酸度调节剂、稳定剂、防腐剂、保护剂、分散剂、乳化剂、胶化剂、增稠剂、粘合剂、增味剂等。关于胶化剂，如吸收牙齿的浸出液，能使之胶化即可。粉剂以及液剂等剂型，使用时可混合或搅拌。

本发明药物中可含有杀菌剂、抗生素、消炎药物等其他有效成分。

本发明药物除可用于治疗龋齿时的牙科修复以及修补处置外，还可用于外伤引起的牙髓裸露以及拔髓后用于露髓面或其附近。例如，可将本发明药物涂抹或填充于髓腔扩大、拔髓后的牙窝洞处、象牙质、活髓齿的断面处。另外，在拔髓或根管清创扩创后的牙髓再生治疗时，也可将本药物用于再生牙髓表面或根管内及其附近处。

本发明药物可单独使用，也可与直接覆髓剂或间接覆髓剂配伍使用。在使用直接覆髓剂或间接覆髓剂前后均可使用本发明药物，也可将本药物与直接覆髓剂或间接覆髓剂混合使用。在本发明中，“直接覆髓剂”是指部分牙髓暴露时，用于保护牙髓的药剂，如氢氧化钙等制剂。“间接覆髓剂”是指象牙质变薄而牙髓未裸露时，用于阻断外来刺激、杀菌等目的的药剂，如氧化锌丁香油酚、锌化杂酚油。

本发明药物中MMP3蛋白的含量可在12ng/ml～1000ng/ml之间，适宜含量为50ng/ml～500ng/ml，最佳含量为80ng/ml～200ng/ml。若其含量低于10ng/ml，则MMP3对HUVEC迁移的促进作用不明显。若MMP3的含量高于1000ng/ml，则本发明药物用于人体时可能会产生不可预期的副作用。本发明药物的用量无特别限制，可根据患者的症状(龋齿的程度、牙髓损伤及缺损程度)、年龄、剂型酌情处置。本发明药物中有效成分MMP3活性蛋白的每次用量可在1ng～100μg之间，适宜用量为10ng～10μg，最佳用量为10ng～1μg，所述用量均指干重。

本发明药物可促进牙髓及/或象牙质形成，在其损伤或缺损时还会促进其再生。因此，将药物用于裸露的牙髓表面或其附近可较好的发挥保存牙髓的功效。从而，本发明的药剂可以作为覆髓剂单独使用或与其他覆髓剂合用。

另外，本发明药物还有利于牙髓炎等牙髓或其附近炎症的治愈或改善其症状。因此，本药物可用于包括牙髓炎或根尖性牙周炎等牙髓及其附近炎症疾病在内的牙髓相关疾病的预防或治疗。

(牙科材料)

本发明提供的牙科材料中，除含有MMP3蛋白外，也可含有具有机体亲和性的MMP3蛋白的支撑载体。将本材料用于牙髓缺损部位及其附近处，可促进牙髓及/或象牙质的形成，能较好地保留牙髓或促进其再生。

(载体)

在本牙科材料中，由于载体的作用可使本牙科材料中的MMP3蛋白更易于到达患处。另外，在牙髓及象牙质再生或形成时载体还可将MMP3蛋白充分地保留于患处。同时，载体还可成为富集各种细胞，促进组织再生的支架或充填材料而发挥作用。载体既可事先与MMP3蛋白组成复合物，也可与MMP3蛋白分别独立制成试剂盒使用。

MMP3蛋白与载体可通过某种相互作用而被保留在载体表面。

载体最好由具有机体亲和性材料制成。机体亲和性材料如I型及III型骨胶原蛋白、缺端胶原等各种骨胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱、透明质酸、几丁质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、磷酸三钙、羟磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP等天然材料及其衍生物，除所述物质外还可使用PLA(聚乳酸)、PGA(多聚葡萄糖酸)、PDLLA(聚-DL-乳酸)、PLGA(乳酸葡萄糖共聚物)、PEG(聚乙二醇)、聚硅氧烷(poly silicone)、PCL(caprolactone)等高分子材料。机体亲和性载体材料可采用如碳酸钙、钛、金及陶瓷等无机材料。另外，蛋白聚糖是蛋白质与糖苷键(糖胺聚糖)共价结合的一种复合糖蛋白。考虑到细胞的粘附性及细胞的增殖性，可在聚硅氧烷等高分子材料载体表面使用等离子涂层材料(Plasma-Coating)、骨胶原蛋白溶液或纤连蛋白等天然材料及其衍生物制成载体材料层。为了提高细胞的粘附性，也可对载体表面采取等离子(plasma)处理、制作骨胶原蛋白涂层(Collagen Coat)等措施。

I和III型骨胶原蛋白系将I型骨胶原蛋白和III型骨胶原蛋白混合组成的混合骨胶原蛋白。I型骨胶原蛋白是一种基础性胶原，属于纤维性骨胶原蛋白。III型骨胶原蛋白与骨胶原纤维不同，会形成细网状的构型即细网状纤维，可成为细胞的支架。III型骨胶原蛋白在混合骨胶原蛋白中的比例最好在30％～50％(重量比)，III型骨胶原蛋白的重量比若大于50％，混合骨胶原蛋白可能不发生凝固。若III型骨胶原蛋白的重量比低于30％，多量的I型骨胶原蛋白不是影响新生血管而是有可能引起象牙质的再生。I型和III型骨胶原蛋白的重量比最好为1∶1。

机体亲和性载体可使用由热塑性高分子等高分子体制作而成的平均直径在1nm～1000nm、海绵状的具有三维立体结构的纳米纤维。三维立体结构纳米纤维的孔隙率最好在80％～99.99％之间。另外，纳米纤维的平均直径可通过下列方法求得：使用扫描电镜观察海绵状三维立体结构的横断面或纵断面，用图像处理软件分析在同一断面内随机选取的150根单纤维的断面面积，计算圆周换算直径，从而求得平均直径。

载体的三维立体结构无特别限制，长纤维状、薄膜状、纤维集合体状、网状、海绵状、微粒状等各种形状均可。另外，载体既可涂于牙髓表面，也可制成拔髓或牙髓切断后所产生的三维立体空隙的形状(牙窝洞修复形状)。

载体的表面最好既能成为MMP3蛋白的支架，又有利于细胞的粘附，最理想的载体是易确保一定表面积与空隙的多孔材质或网状骨架材质。

也可将具有不同三维立体结构的载体组合使用，如将多孔材质的载体(适合用于覆盖在裸露牙髓表面和填充于裸露牙髓上侧的空隙处)与在靠近表面侧的用于象牙质再生支架的载体组合使用。这样使用时，两种载体上都可吸附有MMP3蛋白，若牙髓侧的载体中也有MMP3蛋白时，则促进组织再生的效果会更好。

牙科材料含有载体时，可将MMP3蛋白事先吸附于载体上。将MMP3蛋白保持于载体上时，若二者依靠相互作用较易粘附时，则只要将二者混合、浸泡等相互接触即可。

用于象牙质再生的支架载体，如图1A所示，可使用表面具有微小凹陷结构110的凹陷载体100。这种微小凹陷结构110可模拟象牙质的象牙细管的形态来制作。凹陷结构110不需完全模仿象牙质的象牙细管形态，最好参照象牙细管的尺寸(直径与深度)、方向及形成间隔(pitch)来制作。载体上之所以准备凹陷结构110是为了促进象牙质的再生。

如图1B所示，凹陷结构110至少在凹陷载体100的一侧设有开口。凹陷结构110的深度d可制成1μm至几十μm，深度d的较好范围值在1μm～15μm之间，更好的范围值在1μm～13μm之间，最理想的范围值在2μm～10μm之间。如图1C所示，凹陷结构110的直径t及倾斜度p可在数μm至数十μm之间，其中直径t可在1μm～12μm之间，较好的范围值为1μm～10μm，更好的范围值为2μm～8μm。凹陷结构110的倾斜度p值可在2μm～30μm之间，较好的范围值为3μm～30μm，最好的范围值在4μm～26μm之间。这样的凹陷结构110优选为多个形成以覆盖牙髓。牙髓的断面积大约为1mm²。对于牙髓(露髓面)来说，凹陷结构110最好在5000个～50000个/mm²左右。另外，凹陷结构110既可制成非贯通型的(未贯穿至具有开口部的表面的对侧)，也可制成贯通型的。不过，凹陷结构110制成非贯通型的较好。具有凹陷结构110的凹面载体100的厚度无特别限制，可在200μm～1000μm之间。

凹面载体100最好由氧透过性或物质透过性的材料制成，这样可促进成齿质细胞及象牙质的形成。这种载体最常用硅树脂材料制成。硅树脂载体不需采用激光及一些后加工工艺形成凹陷结构，在参照牙窝洞形态加工成立体三维结构时即可形成凹陷结构。例如，参照牙窝洞形态的母模模具在加工成形的同时，凹陷结构也随之形成了。硅树脂材料制成的载体在用于病灶部位后，在规定的时间内比较容易清除。硅水凝胶也可制成的凹面载体100。硅水凝胶是由含有聚碳酸酯骨架的共聚物和由亲水性单体聚合而成的亲水性高聚物构成的，可用于共聚物与高聚物相互形成的网状结构组成的透明凝胶。除硅水凝胶外，硅橡胶(PDMS)、Poly(dimethylacrylamide-co-glycidylmethacrylate)(PDMA-co-GMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(hydroxyethylmethacrylate)等合成橡胶也可制成凹面载体100。

将细胞接种至凹面载体100进行培养时，培养基通常采用动物细胞培养中常用的血清培养基或无血清培养基，培养条件一般选择动物细胞的培养条件(例如，37℃左右、5％CO₂下)。具体培养方法如下：准备凹面载体100，从牙髓等组织中采集牙髓细胞，然后使之附着于载体凹陷结构110具有开口部的表面，再将载体置于适当的支撑物上，在适当的培养基中进行培养。进行细胞培养时，将载体的凹陷结构110的开口部朝下浸泡在液体培养基中，从液体培养基的表面沿载体的凹陷结构110的纵深方向实施反复加压操作，通过所述培养后，附着于载体上的细胞会排列生长、分化为成齿质细胞。加压操作可以使用机械装置进行，机械压力的大小无特别限制，不过，压力过大的话，对干细胞或成齿质细胞可能会产生损伤，所以，压力可选在0.75N/cm²～1.5N/cm²之间，压力较好的范围值为0.85N/cm²～1.25N/cm²，最好的范围值在0.95N/cm²～1.0N/cm²之间。另外，加压操作的频率为每分钟1次-10次左右，最好在3次-8次/每分钟，每次持续数秒至数十秒，压力应施加于置于容器中的液体培养基。加压的原则应以不影响细胞的增殖为原则。经过所述的加压操作后，成齿质细胞就会形成象牙质。

将上皮细胞粘附于凹面载体100的凹陷结构110具有开口部的表面一侧方向的对侧面时，通过加压操作，上皮细胞会分化为成齿质细胞，同时也能分化为成釉细胞。

当凹面载体100的凹陷结构110具有开口部的表面一侧接种并培养齿髓干细胞时，也可以在该开口面处以与吸附有MMP活性3蛋白质的其他载体(吸附有MMP3蛋白的载体)相接触的状态下进行培养。这样，该其他载体变成重新产生的成齿质细胞的支架的同时，MMP3活性蛋白质速进成齿质细胞的生长。

凹面载体100可直接覆盖在拔髓或牙髓切断后裸露的牙髓表面。将凹面载体100直接覆盖在拔髓或牙髓切断后裸露的牙髓表面时，可根据拔髓后所留空隙的形状，特别是对于象牙质处空隙的三维立体形状，将载体制成合适的形状使用。另外，可以将吸附有MMP3蛋白的载体置于进行拔髓或牙髓切断处置后产生空隙的牙髓侧面(通常在里面)，而将凹面载体100置于该空隙的表面。同时，还需尽可能将载体100的象牙细管状的凹陷结构110的开口面朝向牙髓侧放置。凹面载体100和MMP3蛋白载体可分别制作，然后移植在处置后的部位。凹面载体100和MMP3蛋白载体也可做成预定的形状成为一体后，再移植至处置后的部位。

下面将参照图2A-图2G说明凹面载体100与MMP3蛋白载体的使用。图2A-图2G为使用凹面载体(膜)100，形成象牙细管及牙釉质的模式图。首先，如图2A所示，以牙齿200为治疗对象，因严重龋齿牙髓210已裸露，进行活髓切断处置。如图2B所示，用物理法取牙形，制作模型290，也可以不使用物理法取牙形，而通过计算机测量后制作模型。如图2C所示，将源于牙髓的干细胞或前体细胞等间叶干细胞附着于凹面载体100的凹面结构110的表面，然后再放入牙形模具290的牙窝洞内。在所述操作过程中，也可事先将口腔粘膜上皮等上皮细胞吸附于凹面载体100的凹面结构110加工表面的相反侧。如图2D所示，也可将MMP3蛋白载体300放入牙形窝洞的牙髓侧(内侧)。另外，有时也将源于牙髓的干细胞及前体细胞注入MMP3蛋白载体300内。如图2E所示，在培养装置400内，沿凹面结构110的纵深方向垂直加压，进行间叶干细胞的三维细胞培养。如图2F所示，如果将三维细胞培养一段时间后，细胞会排列分布，分化为成齿质细胞及成釉细胞，从而形成象牙质及牙釉质。如图2G所示，将凹面载体100的凹陷结构110朝下，移植至牙窝洞内，再用树脂等封闭。这种情况下，有时也可将MMP3蛋白载体300置于牙髓裸露面或活髓断面上，在其上再直接放置未粘附有源于牙髓的干细胞及前体细胞的凹面载体100。通过上面的一系列操作，牙髓、象牙细管及牙釉质(牙釉质是在口腔粘膜上皮等上皮细胞粘附于凹面载体100的凹状部加工表面的相反侧的时候形成的)即可形成。

也可以只将凹面载体100覆盖在裸露的牙髓表面。牙髓断面较浅时，只将MMP3蛋白配置为保持在载体上即可见效。

(牙髓细胞等)

本发明提供的牙科材料可单独含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞及可分化为成齿质细胞的细胞中1种或2种以上的细胞成分，也可与载体共同含有所述细胞成分。将这些细胞置于缺损部位时，会进一步促进牙髓及/或象牙质的形成及再生。其中，牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞及可分化为牙髓细胞的细胞能促进牙髓及象牙质的形成及再生，而成齿质细胞及可分化为成齿质细胞的细胞能促进象牙质的形成及再生。本牙科材料优选为以载体为支持物，成为这些细胞的支架，使之粘附其上，以使细胞得以增殖。这些细胞(牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞、可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞及可分化为成齿质细胞的细胞)的含量最好在1×10³个/μl-1×10⁶个/μl之间。若其含量低于1×10³个/μl，则促进牙髓及象牙质形成、再生的效果可能不理想。若其含量高于1×10⁶个/μl，在填充至牙窝洞内时则会产生无法预期的副作用。

牙髓干细胞来源于恒齿或乳齿。特别是在源于人乳齿的牙髓细胞中，CD105⁺细胞含量较多，大约占50％左右(在源于人恒齿的CD31^-SP细胞中，CD105⁺细胞的含量约为20％)，源于人乳齿的牙髓细胞在试管内的实验表明，这种细胞具有诱导血管再生、恢复下肢缺血部位的血流、促进新生血管形成的功能。

牙髓干细胞包括人牙髓SP细胞、CD31^-且CD146^-细胞、CD24⁺细胞、CD105⁺细胞或CD150⁺细胞等。例如，人牙髓SP细胞在促进血管新生等组织再生方面的功能较强。在促进下肢缺血部位血管新生能力上，人牙髓SP细胞与人乳齿牙髓细胞比较，前者是后者的1.2倍；人牙髓SP细胞是人恒齿牙髓细胞的2.6倍。

这些细胞可从拔掉的人齿中采集。人牙髓细胞可参照Nakashima M.Archs oral Boil.36(9)，655-663，1991文献中记载的方法采集。可分化为人牙髓细胞的细胞可按照下列方法采集：无菌取出阻生牙，在Phosphate BufferedSaline(以下简称PBS)溶液等适当的保持液中保存。清除牙齿中的钙化部分，再将组织切成小块，用PBS溶液清洗。优选地，接着用胶原酶或中性蛋白酶酶解组织。酶解后，通过过滤和离心操作以分离细胞。所得细胞为均质的同类细胞较好，最好为自体细胞。也可以是经细胞培养所得的细胞。

成齿质细胞的采集方法如下：将重组子Bone MorphogeneticProteins(BMPs)(从BMP2、BMP7及BMP11中选择1种或2种以上)加入至牙髓细胞、牙髓干细胞或牙髓前体细胞内或导入其编码基因，在Dulbecco’sModified Eagle Medium(DMEM)中进行二维或三维培养，使所述细胞发生分化即可得到成齿质细胞。可分化为成齿质细胞的细胞是指例如牙髓细胞、牙髓干细胞或牙髓前体细胞等细胞。牙髓细胞是通过胶原酶酶解牙髓组织后，分离得到的(参照文献Nakashima M.Archs oral boil.36(9)，655-663，1991)。牙髓前体细胞及牙髓干细胞是经流式细胞仪，从大量排出Hoechst 33342的组分Side population(SP)中分选后得到的。另外，牙髓前体细胞及牙髓干细胞也可用CD24、CD34、CD105、CD133或CD150抗体来分选CD24⁺、CD34⁺、CD105⁺、CD133⁺或CD150⁺细胞进而得到所需细胞。

本发明牙科材料还可含有血管内皮细胞或血管内皮前体细胞。因MMP3活性蛋白可促进这些细胞向损伤部位迁移增殖、促进新生血管的形成，同时还能促进牙髓及/或象牙质的形成。这些细胞为同类细胞较好，最好为自体细胞。这二种细胞也可通过细胞培养的方法获得。

本发明牙科材料还可含有上皮细胞或其前体细胞。上皮细胞或其前体细胞随着成齿质细胞的成齿质形成及再生，分化为成齿质细胞及成釉细胞，从而形成象牙质及牙釉质。这样的上皮细胞或其前体细胞可以从口腔粘膜上皮或羊膜上皮采取。相比同种细胞，这种细胞更加优选同族细胞。另外，这种细胞可以是培养细胞。

本发明牙科材料含有牙髓细胞、牙髓干细胞、牙髓前体细胞及可分化为牙髓细胞的细胞、成齿质细胞、可分化为成齿质细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、上皮细胞或其前体细胞，也可在所述细胞中添加从骨髓、胎盘及脐带血等组织中采集的间叶干细胞或未分化的间叶干细胞。

另外，也可通过下列方法将采集的细胞作为本牙科材料中含有的细胞成分即用CD31、CD146、CD105及VEGFR2抗体标记牙髓细胞，利用流式细胞仪分选CD31^-及/或CD146^-及/或CD105⁺及/或VEGFR2⁺细胞，进而获得所需细胞。本发明发明人通过所述方法，分离得到一种大量分泌MMP3活性蛋白的SP细胞，这种细胞中可能富含牙髓干细胞。

牙科材料中若含有细胞成分，无论是否添加MMP3活性蛋白，只要含有细胞培养增殖后产生的细胞培养物即可。另外，如果牙科材料中含有细胞，有无载体均可。如果牙科材料中含有载体，只要将细胞(或培养细胞)接种至载体上即可，也可将其培养物接种至载体。

在牙科材料包含细胞和载体时，MMP3蛋白最好吸附于载体上。MMP3蛋白既可在细胞接种前吸附于载体上，也可在细胞接种的同时、细胞培养时或细胞培养后吸附于载体上。

本发明牙科材料中也可含有象牙质基质。象牙质基质可促进损伤部位象牙质的形成。骨胶原蛋白、羟磷灰石(hydroxyapatite)、磷酸三钙等均可作为象牙质基质。象牙质基质中也可含有蛋白质成分，如牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein(Dspp))、人造蛋白聚糖、牙本质基质蛋白(dentin matrixprotein(Dmpl))等。

本发明牙科材料中还可含有形态形成因子，该因子可促进细胞分化诱导为成齿质细胞。这种形态形成因子包括1，25(二羟基)维生素D3、地塞米松、骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins(BMPs))、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors(IGFs))、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growthfactors(FGFs))等。

(筛选方法)

本发明提供的筛选方法是指下列所述工艺即：在牙髓干细胞或血管内皮细胞中添加被检化合物，然后测定牙髓干细胞或血管内皮细胞中的基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量，牙髓干细胞或血管内皮细胞中没有添加被检验化合物时，测定基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量；将两者基质金属蛋白酶-3编码基因的表达量进行比较，以将基质金属蛋白酶-3编码基因表达量所增加的被检验化合物作为所述药剂的有效成分进行选择。根据此筛选方法来选择能促进牙髓干细胞或血管内皮细胞表达MMP3蛋白的被检化合物。这些被检化合物可与MMP3蛋白同时或代替MMP3蛋白作为所述药物的有效成分。

MMP3基因的表达量，按照下述方法测定，即从接触被检化合物的细胞中采集全RNA，逆转录反应得到的cDNA后根据已知MMP3蛋白的碱基序列将完成的通过涂饰得到的PCR进行扩增，从扩增产物中得出MMP3基因的表达量。MMP3活性蛋白的表达量可通过测定牙髓细胞的上清培养液中的MMP3活性来获得。MMP3的活性可通过MMP3活性测定系统(Nagase et al.，J.Biol.Chem.1994269：20952-20957)进行测定，这些测定系统主要是基于明胶酶谱(Gelatin-zymography)、酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA))或荧光肽等方法。

以下，将通过应用实例具体说明本发明。本发明并不只限于以下几个应用实例。

实施例

(实施例1：牙髓创伤治愈过程中，MMP3的表达情况)

1.大鼠活髓切断模型的制作

首先准备大鼠上颚切齿500，如图3A所示。大鼠体重在220g～260g之间，为8周龄雄鼠(CLEA公司，东京)。如图3B所示，使用钻石牙钻510，将大鼠上颚左右切齿的牙冠上部除去2mm。如图3C所示，用#1/2球钻520疏通，然后对大鼠上颚左右切齿进行活髓切断处置。如图3D所示，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗断面540并止血。如图3E所示，将含有50ng MMP3的明胶550和树脂560(Unifil low flow、GC、东京)填充至断面开口处。暂封处置后，分别于1小时、12小时、24小时、72小时及7天后，使用4％的多聚甲醛固定液(nacalai tesque公司，京都)进行灌流固定，摘除上颚切齿。将摘除的上颚切齿在4℃下、置于4％的多聚甲醛溶液中浸泡固定过夜，然后在10％乙酸中脱钙2周。将所述处理后的上颚切齿使用乙醇进行脱水，石蜡(Sigma)包埋，制成5μm厚度的切片，将石蜡切片置于APS涂层幻灯片涂层幻灯片(Matsunami东京)上。玻片在进行原位杂交实验及HE染色之前需4℃保存。将免疫组化用的样本使用OCT复合物(Sakura东京)进行包埋处理，制成12μm厚的冷冻切片后，置于APS涂层幻灯片涂层幻灯片上。

图4为创伤出现12小时后的低倍图片，在箭头处进行断髓操作。图5A为1小时后的创伤状态，图5B为图5A方形区域的放大图片。如图5A和图5B所示，在创伤出现1小时后，图中可观察到出血及血管扩张现象。大鼠覆髓后，创伤表面出现坏死、变性现象，在创伤面下可见以嗜中性粒细胞为主的炎症性细胞浸润，整个牙髓组织出现浮肿。

图5C为创伤24小时后的情况，图5D为图5C中方框区域的放大图片。v表示新生血管。如图5C和图5D所示，在创伤出血24小时后炎症性细胞浸润减轻，在变性牙髓正下方，可见断面下的牙髓组织内出现很多成纤维细胞样细胞、多角形细胞及新生血管。

图5E为创伤72小时后的情况，图5F为图5E中方框区域的放大图片。OD表示骨样象牙质。如图5E及图5F所示，创伤72小时后，断面下牙髓组织内的上部附近，纺锤形细胞周围有幼弱骨胶原蛋白基质并形成了一些骨样象牙质。

图5G为创伤7日后的情况，图5H为图5G中方框区域的放大图片。OB表示成齿质细胞，TD表示细管象牙质。如图5G及图5H所示，创伤7日后，出现了具有一定方向性的、1～2层成齿质细胞(OB：odontoblast-like cells)，骨样象牙质下形成了细管象牙质(TD：tubular dentin)。如图5G所示，新生血管(V：vessel)已延伸至成齿质细胞层附近，显示牙髓创伤已治愈。所述情况说明，在牙髓创伤治愈过程中，此模型有助于研究分析MMP3的表达情况并推测其功能。

2.牙髓创面中mRNA表达的变化情况

在形成创伤后的0(刚创伤后)、12、24、48、72小时，分离牙髓组织。从上颚切齿中采集的正常牙髓组织做对照。从切碎的牙髓组织中，使用TRIzol(R)试剂(Invitrogen)分离全RNA，取2μg的RNA用ReverTra Ace^-α(东洋纺，东京)进行逆转录。通过实时RT-PCR，使用LightCycler Fast Start DNA MasterSYBR Green I(Rochediagnostics，Pleasanton)对cDNA进行扩增。在95℃10秒、62℃15秒、72℃8秒条件下，以经LightCycler FastStart DNA Master SYBRGreen I(Roche diagnostics，Mannheim)标记的β-肌动蛋白(β-actin)、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14、VEGF、CXCR4、SDF1为引物(如表1所示)，在LightCycler(Roche Diagnostics)中进行实时RT-PCR扩增。根据GenBank中大鼠基因序列来设计引物。根据对解链曲线的分析和PCR产物的电泳结果，来确认扩增片段的大小，另外，将各自的RT-PCR产物亚克隆至pGEM-T Easy Vector(T载体)(Promega，Madison，WI，美国)上，在数据库中确认基因序列，从而进行PCR产物特异性分析。β-actin值标准化后，用与大鼠切齿牙髓正常组织的比值来表示各产物的表达量。结果如图6A和图6B所示。

表1

在创伤产生后的0小时、12小时、24小时、48小时、72小时，利用实时RT-PCR来分析MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP14、VEGF、SDF1、CXCR4mRNA的表达情况。如图6A所示，在大鼠牙髓创伤的治愈过程中，MMP3mRNA的表达量在切断牙髓24小时时开始上升，其表达量是正常牙髓组织的9倍。MMP3mRNA的表达量在切断牙髓24小时时开始减少，其表达量是正常牙髓组织的4倍，72小时后是正常牙髓组织的2倍。MMP9mRNA的表达量在12小时后为牙髓组织的2倍，其表达水平较低，但在牙髓创伤治愈过程中均维持此低水平表达。在牙髓创伤的治愈过程中，MMP1、MMP2、MMP14/MT1-MMPmRNA的表达量与正常牙髓组织基本相同，未见表达水平的变化。MMP10mRNA在正常和创伤牙髓组织中均未表达。由此可见，MMP3的表达情况与创伤治愈的关系最为密切。

另一方面，如图6B所示，VEGF的表达量在经治疗处置后上升了3.5倍，24小时后，上升了5倍，然后其表达量开始减少，72小时后，其表达量与正常牙髓组织相同。SDF1在24小时后开始上升以至表达高峰，其表达量是正常组织的3.5倍，表达水平较低。SDF1配体的受体CXCR4的表达量在24小时后达到正常牙髓组织的3.5倍。

3.牙髓创伤模型中，MMP3、SDF1、CXCR4表达的局部性

在处置牙髓24小时、72小时后，用4％的多聚甲醛固定液进行灌流固定，然后浸泡固定过夜。过夜后用OCT复合物(sakura，东京)包埋，制作12μm厚的冷冻切片，最后置于APS涂层幻灯片上(Matsunami Glass In.，大阪)。对CXCR4和MMP3、MMP3和BS1-血凝素分别进行免疫荧光双重染色。

将切片置于2％的H₂O₂中反应20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，再加入10mg/ml blocking reagent(Invitrogen corporation，carlsbad，CA，USA)在室温下反应1小时以消除非特异性反应，然后加入溶于Cangent 1 buffer(东洋纺，大阪)中的一抗羊抗大鼠CXCR4(Santa cruze、Santa Cruz，CA，USA)(1∶50)，室温反应1小时。反应完成后，用PBT(PBS，0.05％ Tween20，pH7.4)洗涤3次，再加入Alexa488标记的二抗兔抗羊IgG(Invitrogen)(1∶200)，室温下反应1小时。反应完成后，用PBT洗涤3次，最后将切片置于一抗小鼠抗大鼠MMP3中(第一化学，富山)(0.5μg/ml)，4℃过夜。过夜后，用PBT洗涤3次，再加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，室温下反应1小时。反应结束后，用10ng/ml的Hoechst 33342(Sigma、St.Louis、MO、USA)细胞核染色10min，最后用封片剂prolong Gold antifade reagent(Invitrogen)封片。如图7D-图7I所示。

为进一步研究MMP3与血管之间的关系，将冷冻切片置于20μg/ml的proteinase K(Invitrogen)中，室温下反应6min，反应结束后用PBS洗涤3次，再用20μg/ml的Fluorescein Griffonia(Bandeiraea)染色，染色完成后将切片置于Simplicifolia lectin(BSl-lectin、vector laboratories，Burlingame，CA)中反应15min。上面的BSl-lectin是用于对血管内皮细胞和血管内皮前体细胞进行染色。反应结束后，用PBS洗涤3次，再按照所述方法对MMP3进行荧光染色。阴性对照只使用一抗和二抗。结果如图7A-图7C所示。

在切断活髓后，MMP3和CXCR4均未表达。图7J是活髓切断后24小时内的牙髓创伤面，经HE染色后的情况。图7K是活髓切断后24小时内，牙髓断面下新生毛细血管和新生大血管经HE染色后的情况。图7L是活髓切断后72小时内，新生毛细血管和新生大血管经HE染色后的情况。MV表示新生毛细血管，LV表示新生大血管。

图7A为活髓切断后24小时内，对MMP3及BS1-lectin进行免疫荧光双重染色后MMP3的图片。图7B为活髓切断后24小时内，对MMP3及BS1-lectin进行免疫荧光双重染色后BS1-lectin的图片。图7C为活髓切断后24小时内，对MMP3及BS1-lectin进行免疫荧光双重染色后，经Merge处理的图片。如图7A-图7C所示，活髓切断后24小时内，在牙髓创面下，通过BS1-lectin染色可见新生毛细血管和新生大血管已延伸至血管内皮细胞和血管内皮前体细胞，且在新生血管周围表达有MMP3。

图7D为活髓切断后24小时内，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，MMP3的表达情况。图7E为活髓切断后24小时内，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，CXCR4的表达情况。图7F为活髓切断后24小时内，MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，经Merge处理的图片。图7G为MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，MMP3的放大图像。图7I为MMP3和CXCR4经免疫荧光双重染色后，经Merge处理的图片。CXCR4是SDF1配体的受体，在干细胞中可表达，如图7D-图7I所示，可见CXCR4靠近SDF1，表达具有局部性。在血管周围可见MMP3和CXCR4的一部分重复表达。

图7M为活髓切断后24小时内，经原位杂交，MMP3mRNA在血管内皮细胞和血管内皮前体细胞中的表达情况。图7N为活髓切断后72小时内，经原位杂交，MMP3mRNA在血管内皮细胞和血管内皮前体细胞中的表达情况。如图7M的箭头所示，在活髓切断后24小时内，经原位杂交，可见血管周围MMP3mRNA大量表达。如图7N箭头所示，在活髓切断后72小时内，MMP3mRNA的表达量减弱。由此可见，牙髓干细胞迁移至牙髓创伤处，定居在血管周围，分泌MMP3，通过旁分泌作用于血管内皮细胞，促进新生血管的形成。

(实施例2：MMP3在体外对血管内皮细胞和牙髓细胞的作用)

1.MMP3促进血管内皮细胞增殖的作用

将1000个源于人脐带血的血管内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells、HUVECs)(kurabo公司、大阪)接种至96孔细胞培养板上，在各种包含人体MMP3(50ng/ml、Chemicon，Temecula，CA)的EBM2(cambrex Bio ScienceWalkersville，Inc.，Walkersville，MD，USA)中分别进行以下2情况的培养：包含有同时加NNGH((N-Isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)-glycylhydroxamic Acid)0.13μM，Biomol，Plymouth Meeting，PA)、或不加NNGH、或仅NNGH、或MMP10(50ng/ml，R&D systems，Minneapolis，MN)共4种，或者，包含有VEGF-A(50ng/ml，Peprotech London，东京)。添加10μl的Tetra-color one(Seikagaku Kogyo，Co.，东京)后，分别于2，12，24，36，48，60小时在吸光度450nm下进行测定。未接种细胞的孔值做对照。

图8A为体外，MMP3促进血管内皮细胞增殖情况的图片。图8B为体外，MMP3促进血管内皮细胞迁移情况的图片。图8C为体外，MMP3对血管内皮细胞的抗凋亡作用的图片。如图8A所示，添加MMP3后，可促进血管内皮细胞(HUVEC)的增殖。在MMP3添加组中，活髓切断48小时的增殖效果与添加2小时进行比较，前者增加了约10倍。在未添加MMP3组中，活髓切断48小时的增殖效果与切断2小时比较，约增加了5倍。所述数值均具有统计学差异(p＜0.01)。另一方面，同时添加NNGH(MMP3的特异抑制剂)时，在各个时间点上，MMP3刺激细胞增殖的活性均被抑制。添加NNGH组的增殖效果与未添加MMP3组进行比较，结果显示二者几乎无差异。另外，MMP3对HUVEC的增殖促进作用与添加VEGF-A(50ng/ml)组基本相同。

2.MMP3对血管内皮细胞的迁移促进作用

在24孔PET膜(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)上，37℃条件下，进行24小时的Modified Boyden腔体实验。分别在10ng/ml的MMP3或100ng/ml的MMP3或100ng/ml的MMP3与0.13μmol的NNGH或50ng/ml的MMP10或50ng/ml的MMP10和0.13μmol的NNGH或0.13μmol的NNGH或50μg/ml的VEGF-A存在下，将5×10⁴的HUVEC置于腔体的上部进行培养。0.02％小牛血清白蛋白(Sigma)做对照。培养完成后，使用胰蛋白酶剥离迁移至过滤器下部的HUVEC并进行细胞计数。用橡胶刮刀(Scraper)的将残留在过滤器上部未迁移的细胞刮掉。实验数据用4个样品的平均值±SD来表示。结果如图8B所示。

如图8B所示，在10ng/ml水平下，MMP3对HUVE的迁移促进作用与对照组比较无统计学差异。在100ng/ml水平下，观察到MMP3的迁移促进作用是对照组的3.5倍且显著上升(p＜0.01)。观察到100ng/ml的VEGF对细胞迁移的促进作用约为对照组的2倍且显著上升(p＜0.01)。也就是说，MMP3具有浓度依赖性，确实具有迁移促进作用。另外，若在添加MMP3的同时添加NNGH，其促进迁移作用受到抑制。

3.MMP3对血管内皮细胞凋亡的抑制作用

为研究MMP3的凋亡抑制作用，将HUVEC置于EGM2中，用35mm dish培养3天，接着在分别加有50ng/ml的MMP3或50ng/ml的MMP3和0.13μmol的NNGH或50ng/ml的MMP10或0.13μmol的NNGH或50ng/ml的VEGF-A的EBM-2中添加100nM的星型胞菌素(staurosporine)(Sigma)，诱导细胞凋亡。NNGH在添加MMP3的30min前加入。在Stauroporine存在下，未添加任何成分的EBM-2中培养的细胞做对照。4小时后，剥离HUVEC，在所得细胞悬液中加入Annexin V-FITC(Roche)和Propidium Iodide(Sigma)作用15min，然后使用flow cytometer JSAN(Bay Bioscience，神户)测定坏死和凋亡细胞的比例。每个数据测量3次，取典型数据作为实验结果如图8C所示。

如图8C所示，HUVEC中加入100nM的Stauroporine诱导细胞凋亡4小时后，52％的细胞出现凋亡现象。同时添加Stauroporine与MMP3时，凋亡细胞的比例减少至20％，与添加VEGF-A的结果相同，均出现了凋亡抑制现象。同时添加NNGH时，其抑制凋亡的作用受到抑制。MMP10/Stromelysin-2是MMP3的异构体。如图8A-图8C所示，MMP10/Stromelysin-2实验组中未观察到MMP3实验组中所见的细胞增殖、细胞迁移、凋亡抑制现象。

4.MMP3诱导牙髓细胞分化为成齿质细胞的功能

从大鼠上颚切齿中，用酶解法(胰蛋白酶和胶原酶)分离得到的牙髓细胞，在含有100单位/ml的penicillin G、100μg/ml的streptomycin(Invtrogen，CarIsbad，CA，USA)、50μg/ml的L-抗坏血酸磷酸酯镁盐(L-Magnesium ascorbylphosphate)(和光纯药(日本公司名))和10％(v/v)胎牛血清(SAFC Biosciences，Lenexa，Kansas，USA)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO，USA)中培养。二次传代细胞铺满(confluent)后，添加100ng/ml的MMP3或0.13μmol的NNGH和50ng/ml的重组人BMP2。14天或21天后，提取RNA，使用实时RT-PCR来分析成齿质细胞的分化标志、Dentin Sialophosphotein(Dspp)及enamelysin的表达情况(如表1所示)。所述物质的表达量，用标准β-actin值n与大鼠第二代牙髓细胞铺满(confluent)时的比值来表示。添加MMP3实验组与对照组比较，14天和21天后，均未观察到细胞分化为成齿质细胞的现象。

因此，根据所述实验结果，在大鼠牙髓创伤治愈过程中，MMP3可促进血管内皮细胞及血管内皮前体细胞向创伤局部迁移、增殖、抗凋亡，同时在血管新生、象牙质及牙髓再生过程中可能发挥作用。

(实施例3：在大鼠及狗活髓切断模型中，体内MMP3对象牙质及牙髓再生促进作用)

1.在大鼠活髓切断模型中添加MMP3

切断大鼠上颚切齿，用生理盐水清洗断面，在明胶内添加50ng的MMP3，然后用于断面的牙髓表面上。将50ng的MMP3及30nmol的NNGH加至明胶上，用于断面牙髓的表面作为实验对照。最后将粘合剂涂布于表面，再用光聚合型复合树脂(Unifillow flow、GC、东京)暂封。接着分别于24小时、72小时、7天后制作5μm厚的石蜡切片，然后做HE染色或马松三色染色，进行形态学观察。为了进行新生血管的定量检测，取4颗牙齿分别制作40张切片，经MMP3及PBS处理24小时后，每颗牙齿选取5张切片用Fluorescein Griffonia(Bandeirase)Simplicifolia lectin(BS1-lectin)染色。在每颗牙齿的5张切片的断面下方的牙髓组织上，选取面积为0.1mm²的标准矩形区域。使用KeyenceBZ-9000荧光显微镜(Keyence，东京)的BZ-II Anaalyzer(Keyence)软件对总面积为1.5mm²的lectin阳性区域进行定量分析。实验数据用4颗牙齿所得数据的平均值±SD来表示。为研究MMP3对细胞增殖的促进作用，通过PCNA(proliferating Cell Nuclear Antigen)法，进行免疫组化分析。将切断牙髓24小时后制作的石蜡切片进行脱蜡处理，按照通常用法，使用抗原修复液(vectorlaboratories，Burlingame，CA)进行抗原修复。同时需封闭内源性过氧化物酶活性及非特异性染色。切片中加入抗PCNA抗体(Dako)，4℃孵育过夜，抗PCNA抗体使用时需用抗体稀释液进行1：100稀释。孵育过夜后加入过氧化物酶标记的二抗(ImmPRESS reagent；Vector Laboratories)室温孵育30min。用DBA液系(Dako)显色后，再用苏木精进行对比染色，然后用Olympus Vanox-s显微镜(购于Olympus公司，东京)拍照。增殖细胞的定量分析方法如下：用MMP3和PBS处理24小时后，从每个牙齿的3张石蜡切片断面下方的牙髓组织上部，取3个面积为0.1mm²的标准矩形区域。对染色阳性细胞进行细胞计数、定量分析。为了进行细胞外基质的定量分析，分别取4颗切齿的5张切片，经MMP3、NNGH、PBS处理，7天后，进行马松三色染色。在阳性区域中，对断面下(2mm深)的上部牙髓组织，用BZ-II Analyzer软件进行定量分析。实验数据用4颗牙齿的平均值±SD来表示。

通过实验来验证MMP3在机体内是否能诱导牙髓创伤部位产生新生血管。在大鼠切齿牙髓处分别加入MMP3、MMP3与NNGH，PBS为阴性对照。图9A为大鼠活髓切断后加入MMP3，24小时后再经BS1-lectin染色后的图片。图9B为大鼠活髓切断后未使用MMP3，24小时后，再经BS1-lectin染色后的图片。添加MMP3的实验组与未使用MMP3组进行比较，在24小时后经BS1-lectin染色，牙髓断面下形成了大量的新生血管。

图9C为大鼠活髓断面下的上方牙髓组织，通过使用MMP3使其血管密度增加的定量显示图。如图9C所示，MMP3使用组与PBS对照组比较，其新生血管的密度增加了2倍并有统计学差异。

图9D为大鼠活髓切断24小时内加入MMP3后，PCNA的免疫染色图片。图9E为大鼠活髓切断后未使用MMP3，24小时后，PCNA的免疫染色图片。MMP3使用组细胞密度为98.5cells/mm²±17.7，MMP3未使用组(PBS对照组)为36.0cells/mm²±14.1。也就是说，MMP3使用组与PBS对照组比较，在其创面下牙髓组织中，PCNA染色阳性的增殖细胞是对照组的2.7倍。另外，在其断面下方可观察到大量的PCNA染色阳性细胞。

图9F为大鼠活髓切断72小时内加入MMP3后的HE染色图片。图9G为大鼠活髓切断处未使用MMP3，72小时后的HE染色图片。如上图所示，MMP3使用组与未使用组比较，前者已形成了大量的骨样象牙质。2组均未出现炎症性细胞浸润。

图9H为大鼠活髓切断72小时内加入MMP3后，经马松三色染色的图片。如图9H所示，72小时后，在MMP3使用组中，新分化的成齿质细胞/骨样成齿质细胞周围可观察到骨样象牙质的形成。

图9I为大鼠活髓切断处72小时后加入MMP3后，原位杂交的图片。如图9I所示，原位杂交图片显示，在骨样象牙质基质周围新近分化的成齿质细胞/骨样成齿质细胞中已有DSPP mRNA的表达。

图9J为大鼠活髓齿切断72小时后，未添加MMP3，经马松染色的染色图。如图9J所示，PBS添加组及MMP3周围观察不到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。

图9K为大鼠活髓切断72小时后，添加MMP3及NNGH，经马松染色的染色图。如图9K所示，MMP3及NNGH添加组周围观察不到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。

图9L为大鼠活髓切断后未加入MMP37天后经马松三色染色的图片。如图9L所示，未使用MMP3组(PBS对照组)未观察到成齿质细胞/骨样成齿质细胞。

图9M为大鼠活髓切断7天后加入MMP3和NNGH经马松三色染色的图片。如图9M所示，在使用MMP3和NNGH组中，未见成齿质细胞/骨样成齿质细胞的形成。

图9N为大鼠活髓切断72小时后加入MMP3和NNGH，骨胶原蛋白基质增加情况的图片。如图9N所示，72小时后，在断面下象牙质基质的形成方面，MMP3使用组与PBS对照组比较，前者增加了3.8倍并观察到显著差异(P＜0.01)。

图9O为大鼠活髓切断7天后加入MMP3，骨胶原蛋白基质增加情况的图片。如图9O所示，NNGH添加组与PBS对照组比较，象牙质基质形成受到抑制且观察到显著差异(*P＜0.01)。所述现象可能是由于MMP3可促进修复性象牙质的形成，后者又会促进新生血管的形成，而不能直接促进成齿质细胞的分化。

2.在狗活髓切断模型中加入MMP3的情况

将狗上颚臼齿活髓切断后，用5％的亚氯酸钠和3％过氧化氢交替清洗断面后再用生理盐水清洗断面，把加有100ng MMP3的明胶涂于牙髓断面上。接着填充磷酸粘固粉，再将粘合剂涂布于表面，最后用化学聚合型复合树脂暂封。14天后拔牙，在4％多聚甲醛固定液中4℃浸泡、过夜固定后，4℃下在10％乙酸中脱钙1周。制作标本纵断面5μm厚的石蜡切片，经H.E.染色后在光学显微镜下观察修复性象牙质的形成情况，结果如图10A-图10E所示。图10A为狗上颚臼齿活髓切断后第14天内添加MMP3，显示修复性象牙质形成的显微照片。OD代表骨样象牙质。图10B为狗上颚臼齿活髓切断后第14天内添加MMP3，修复性象牙质形成的高倍显微照片。图10C为狗上颚臼齿活髓切断后第14天内添加MMP3，修复性象牙质形成的超高倍显微照片。图10D为狗上颚臼齿活髓切断后第14天内PBS控制时的显微照片。图10E为狗上颚臼齿活髓切断后第14天内加入PBS控制时的高倍显微照片。

如图10A-图10C所示，在MMP3添加组中，牙髓断面附近可见大量增殖细胞，其上部可见大量修复性象牙质的形成。可是在PBS对照组中，如图10D和图10E所示，未见修复性象牙质的形成。

(应用实例4：在狗牙髓炎模型中，象牙质及牙髓的再生)

将发生牙髓炎的狗上颚臼齿活髓切断后，把棉球置于牙髓断面上，在开放状态下放置24小时。接着用5％亚盐酸纳溶液和3％的过氧化氢溶液交替清洗牙髓断面，然后用生理盐水清洗，洗净后，把加有100ngMMP3的明胶涂于牙髓断面上。接着填充磷酸粘固粉，再将粘合剂涂布于表面，最后用化学聚合型复合树脂暂封。14天后拔牙，4℃浸泡固定过夜，4℃下在10乙酸中脱钙1周。脱钙完成后，制作5μm厚的石蜡切片、进行HE染色，最后在光学显微镜下观察修复性象牙质的形成情况，结果如图11A-图11D所示。图11A为在患有牙髓炎的狗上颚臼齿中加入MMP3，14天后，显示炎症治愈情况的显微照片。图11B为患有牙髓炎的狗上颚臼齿中加入MMP3，14天后，显示炎症治愈情况的高倍显微照片。图11C为患有牙髓炎的狗上颚臼齿中PBS控制时14天后的显微照片。图11D为患有牙髓炎的狗上颚臼齿中PBS控制时14天后的高倍显微照片。

如图11A和图11B所示，在MMP3添加组中，牙髓的炎症程度非常轻，在牙髓断面附近可见细胞增殖，同时MMP3还促进了新生血管的形成。另外，还可观察到一些修复性象牙质的形成。而在PBS对照组中，如图11C和图11D所示，炎症情况未见好转。因此，本发明提供的药剂和牙科材料不仅具有促进损伤牙髓再生的功效，同时对牙髓炎还具有抗消炎、镇静作用，促进新生血管的形成以及牙髓再生的作用。牙髓出现创伤与牙髓炎出现炎症是两种不同的状态。在创伤(机械性创伤)治疗时不会发生感染，局部炎症细胞浸润一旦开始，创伤组织则趋向治愈。另一方面，由牙髓炎引起的炎症具有感染症状，为排除机体异物，机体的免疫防御系统被启动，根据感染物质的质和量，引发了以嗜中性粒细胞、巨噬细胞为首的炎症性细胞浸润。牙髓组织的血管处于扩张状态，毛细血管的通透性增加。毛细血管通透性的增加，血液成分会渗出(炎症性渗出)，结果引起间质压力增高。进而，免疫细胞产生的炎症介质、蛋白酶组成一个复杂的网络，引起进一步的炎症恶化及组织坏死。在牙髓因创伤产生的炎症和牙髓炎引起的炎症二种情况下，二者炎症性介质的表达情况是不同的。

(实施例5：穴加工硅酮膜的成齿质细胞的分化)

将机体亲和性高、具有氧透过性的硅酮膜的表面进行等离子化处理，在其表面制成宽7μm、深7μm、节距20μm的小孔(参照图1A～图1C)，然后进行I型胶原蛋白涂层处理。将源于猪牙髓的CD31^-；CD146-SP细胞高密度地吸附于硅酮膜上，然后在含有10％小牛血清、50μg/ml的抗坏血酸的Dulbecco’sModified Eagle Medium(DMEM)培养基培养12小时。培养后的细胞形态如图12A所示。图12A为附着在凹面硅酮膜载体上的源于猪的CD31^-；CD146^-SP细胞，培养12小时后，相差显微镜观察的照片。培养完成后，在容器中注满培养基，使用氟树脂封闭，然后从外部对膜表面进行单方向垂直加压，加压时，弱加压操作(引起弱压力刺激)与强加压操作(引起强压刺激)分别进行6小时，弱加压操作和强加压操作的频率分别为每分钟加压6次和每分钟加压10次以上。

另外，牙髓CD31^-；CD146^-SP细胞的采集方法如下：将猪牙髓组织摘除后利用骨胶原酶解法(Nakashima M.Archs oral Biol.36(9)，655-663，1991)酶解、分离细胞。细胞分离后，用流式细胞仪，通过CD31和CD146抗体从强烈排出Hoechst 33342的组分(Side Population(SP))中分选出CD31^-；CD146^-SP细胞。分选后的细胞接种至I型骨胶原涂层盘上，在添加10％小牛血清、insulin-like growth factor^-1(IGF-1)和Epidermal Growth factor(EGF)的EBM2培养基中培养。

图12B为再培养2天后，显示β-actin、Dspp、Enamelysin的mRNA表达情况的图片。如图12B所示，再培养2天时，则膜上的细胞排列紧密，Enamelysin和Dentin sialophosphoprotein(Dspp)等的mRNA已表达，已分化诱导为成齿质细胞。尤其是经弱加压刺激处理过的细胞，能有效地对其进行分化诱导。

产业利用价值

本发明具有很好的消炎镇静作用，对于发生炎症龋齿的牙髓炎也具有能适当恢复牙髓功能的作用。另外，因本发明具有很好的促进血管新生、牙髓再生及象牙质形成作用，所以，完全可以用于创伤性象牙质的治疗、修复领域。

Claims

1.一种用于治疗牙髓炎和/或促进象牙质形成的牙科材料，其特征在于，含有：具有机体亲和性，在至少一侧排列多个深度方向为一定方向的凹形结构，由具有物质透过性的材料制成的膜状载体；

所述载体担载的基质金属蛋白酶-3。

2.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于，所述载体至少含有下列中的任意一种：骨胶原蛋白、人造蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、明胶、水凝胶、纤维素、磷酸胆碱、透明质酸、几丁质、氨基葡萄糖、纤连蛋白、海藻酸、肝素、层粘连蛋白、磷酸三钙、羟基磷灰石、β-TCP、多聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚乙二醇、多晶硅、聚已酸内酯、碳酸钙、钛、金、陶瓷、硅树脂、以及硅水凝胶。

3.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于,还含有可分化为牙髓细胞的细胞。

4.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于,还含有牙髓干细胞或牙髓前体细胞。

5.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于,还含有可分化为成齿质细胞的细胞。

6.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于,还含有成齿质细胞。

7.如权利要求3所述的牙科材料，其特征在于，可分化为牙髓细胞的细胞的含量在1×10³个/μl～1×10⁶个/μl之间。

8.如权利要求5所述的牙科材料，其特征在于，可分化为成齿质细胞的细胞的含量在1×10³个/μl～1×10⁶个/μl之间。

9.如权利要求6所述的牙科材料，其特征在于，成齿质细胞的含量在1×10³个/μl～1×10⁶个/μl之间。

10.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于，还含有血管内皮细胞或血管内皮前体细胞。

11.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于，还含有上皮细胞。

12.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于，还含有象牙质基质。

13.如权利要求1所述的牙科材料，其特征在于，基质金属蛋白酶-3的含量比例为12ng/ml～1000ng/ml。

14.如权利要求4所述的牙科材料，其特征在于，所述牙髓干细胞至少包含牙髓SP细胞、CD31^-且CD146^-细胞、CD24⁺细胞、CD105⁺细胞、CD150⁺细胞中的任意一种。