KR20100103821A - 재생 근관치료의 전달을 위한 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치근관 내부로부터 건강치 못한 또는 괴사성 치수 조직을 제거하고, 이를 재생 근관치료에 의해 생성된 새로운 혈관화된 조직으로 대체하기 위한 신규 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명은 현재 근관 치료요법에 대한 대안, 뿐만 아니라 치과용 재료에 의한 근관의 충전을 제공한다.

Description

재생 근관치료의 전달을 위한 방법 및 키트 {METHOD AND KIT FOR DELIVERING REGENERATIVE ENDODONTIC TREATMENT}

본 발명은 치의학의 전문의 하위 분야인 근관치료 (일반적으로 근관 치료요법이라고 공지됨)의 실시에 관한 것이다. 본 발명의 실시양태는 근관치료 절차에서 사용하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

근관치료 (일반적으로 근관 치료요법이라고 공지됨)의 실시는 치수 및 치근 주변 조직을 다루는 치의학의 전문의 하위 분야이다. 치수 (신경, 세동맥 및 세정맥, 뿐만 아니라 림프 조직 및 섬유 조직 함유)는 병들거나 손상될 수 있고, 종종 그 자체를 복구할 수가 없다. 치수가 죽거나 괴사하는 경우, 근관치료가 필요하다. "근관"은 치아의 상아질 내의 주요 관에 대해 일반적으로 사용되는 용어이다. 이들 관은 치수강으로 구성된 치아 내의 자연 공동의 일부이다. 근관은 치수 조직이라고 공지된 고도로 혈관화된 성긴 결합 조직으로 채워져 있다. 치수 조직은 일반적으로 충치 또는 치아 파절로 인해 감염되고/거나 병들고/거나 염증이 생겨서, 미생물 (주로 구강 균총으로부터의 박테리아 또는 그의 부산물)이 치수강 또는 근관에 접근하게 할 수 있다. 감염된 조직은 종종 근관 치료요법이라고 공지되고 일반적으로 "근관"이라고 지칭되는 외과 시술에 의해 제거된다.

재생 의학은 의학을 발전시키기 위한 노력으로 생물학적 기능을 개선하거나 또는 대체하기 위한 유전자 치료요법 또는 적합한 생화학 인자 및 생물의학 영상화, 선조 세포, 삼차원 스캐폴드 재료의 조합의 사용을 지칭한다. 재생 의학의 기초는 조직 공학 치료요법의 활용이다. 실제로, 재생 의학은 다른 기관 및 조직 중에서 골, 연골 및 혈관을 포함하는 구조적 및 기능적 조직을 복구하거나 대체하는 응용을 나타낸다. 재생 의학의 원리는 근관치료 조직 공학에, 구체적으로는 치수 조직의 재생 및 혈관재생을 통해 적용될 수 있다. 치수 조직을 재생하고 혈관재생하는 능력은 환자에게 현재 근관 치료요법에 대한 명확한 대안, 뿐만 아니라 치과용 재료에 의한 근관의 충전을 제공한다.

<발명의 요약>

본 발명의 실시양태는 치근관 내부로부터 건강치 못한 치수 조직을 제거하고, 이를 재생 근관치료에 의해 생성된 새로운 혈관화된 조직으로 대체하기 위한 신규 방법을 제공한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 또한 치근관 내부로부터 건강치 못한 치수 조직을 제거하고, 이를 재생 근관치료에 의해 생성된 새로운 혈관화된 조직으로 대체하기 위한 신규 키트를 제공한다.

도 1은 재생 근관치료의 개략도를 나타낸다.
도 2는 재생 근관치료를 위한 방법의 한 예의 흐름도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 재생 근관치료 키트의 한 예를 기술하는 흐름도를 나타낸다.
도 4는 근관 내부의 대체 혈관재생된 조직의 생성을 나타낸다.
도 5는 재생 근관치료의 생체적합성 측정을 나타낸다. 치수 줄기 세포 (A), 및 치주 줄기 세포 (B)를 포함하는 다른 유형의 세포의 생존, 사멸, 부착 및 증식은 도 1, 2 또는 3에 나타낸 재생 근관치료의 일부로서 사용되는 스캐폴드, 파일/세정 기구, 생체재료, 소독제 및 의약의 생체적합성 및 세포독성을 시험하는데 사용될 수 있다. 생체내 임상 또는 동물 시험 전에, 이들 절차는 시험관내 발치된 치아 및 세포 배양 기술을 이용하여 시험될 수 있다.
도 6은 재생 근관치료의 효능 측정을 나타낸다. 생체내 치아의 근관 내의 재생된 조직의 효능은 비침윤 방법, 예컨대 혈류의 도플러(Doppler) 측정 및 전기 치수 생활력 시험을 이용하여 측정될 수 있다. 임상 시험의 경우에는, 환자에게 치료의 성공률에 대해 질문할 수 있다. 또한, 혈관재생된 근관과 관련된 조직 재생의 평가를 위해 치아를 발치할 수 있다. 별법으로, 발치된 치아는 임상 또는 동물 시험 전에 재생 근관치료 절차의 시험관내 효능을 측정하기 위한 근관치료 조직 재생의 다양한 측면에 대한 대상물일 수 있다. 측정 방법은 세포 생존 분석법, 뿐만 아니라 주사/투과 전자 현미경법 및 조직학을 사용하는 근관 표면으로의 접착을 포함한다. 하기 영상은 치수 조직의 제거 및 그의 소독 후 근관으로 이식된 치수 구조체를 생성하기 위해 치수 줄기 세포로 시딩된 콜라겐 스캐폴드의 효능 시험을 나타낸다. 접착이 줄기 세포를 함유하는 이식된 스캐폴드와 근관 표면 사이에서 관찰되었다 (A). 줄기 세포는 배양물 중 14일 이하 동안 스캐폴드에 부착된 채 남아있었다 (B). 스캐폴드 내의 대체 치수 세포의 조직학은 능동적으로 대사화되는 것으로 밝혀졌으며 (C), 이는 구조체가 생활력이 있었다는 것을 제안한다.
도 7은 재생 근관치료에서 사용하기 위한 줄기 세포 및 스캐폴드의 제공, 뱅킹 및 전달을 나타낸다.
도 8은 재생 근관치료를 위한 치수 줄기 세포 은행을 나타낸다.
도 9은 콜라겐 스캐폴드를 함유하는 혈관재생된 치근관 내의 세포 재증식 및 조직 재생을 나타낸다.
도 10은 P15 펩겐(Pepgen)을 함유하는 혈관재생된 치근관 내의 세포 재증식 및 조직 재생을 나타낸다.
도 11은 혈괴를 함유하는 혈관재생된 치근관 내의 세포 재증식 및 조직 재생을 나타낸다.
도 12는 재생 근관치료 후 치근관 내의 세포 재증식 및 조직 재생을 나타낸다.
도 13은 재생 근관치료 후 혈관재생된 근관의 세포 재증식을 나타낸다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 건강치 못한 또는 괴사성 치수 조직의 제거 후 생체내, 생체외 또는 재이식된 치아의 근관을 소독하고 세정하고 혈관재생시키기 위한 방법, 조성물, 장치 및 키트를 기재한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 근관치료에서 근관 충전 재료로서 현재 사용되는 구타 페르카, 광물성 삼산화물 집합체 및/또는 치과용 시멘트의 사용에 대한 직접적 대체 또는 대안으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기에 더 상세히 제공된다. 하기 사용되는 제목은 조직화 목적만을 위한 것이며, 구체적 표시가 없는 경우 문서에 대한 어떠한 구분 또는 의미도 부여하는 것으로 의도되지 않는다.

근관치료 방법

한 실시양태에서, 본 발명은 치근관 내부로부터 건강치 못한 치수 조직을 제거하고, 이를 재생 근관치료에 의해 생성된 새로운 혈관화된 조직으로 대체하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 근관계에 접근 개구부를 생성하는 단계; (b) 근관계로부터 건강치 못한 또는 괴사성 치수 조직을 제거하는 단계; (c) 근관계를 세정하고 소독하는 단계; (d) 치근첨의 기구화에 의해 근관계로 혈액이 흐르게 하는 단계; 및 (e) 선조 치수 세포 및/또는 성장 인자를 가질 수 있는 스캐폴드 (예를 들어, 강성 또는 주입가능한)를 근관계에 삽입하는 단계 중 임의의 또는 모든 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 근관 기구화는 치과용 기구, 통상적으로 근관치료 파일 및/또는 초음파 팁을 관주 용액 (예를 들어, NaOCl) 및 임의로 도말 층 제거제 (예를 들어, EDTA)와 조합하여 사용하는, 상아질 및 치수 조직의 제어된 제거를 의미한다.

임의로, 본원에 기재된 방법은 감염 예방을 돕기 위해 근관으로의 치관 및/또는 치근첨 접근부에 수술후 실란트를 적용하는 단계를 포함할 수 있다.

치아의 준비

건강치 못한 또는 괴사성 치수 조직를 제거하기 위한 근관 치료를 필요로 하는 치아를 확인한다. 수술 전에 치아를 마취시킬 수 있다. 근관에 접근하기 위해 치아관 또는 치근첨을 통해 개구부를 만든다. 치과용 핸드-피스 및 버를 사용하여 상아질을 통해 근관으로의 접근을 또한 준비할 수 있다. 그 후, 예를 들어, 파일, 관주 용액, 산, 킬레이트화제 및/또는 임의의 적합한 그의 등가물을 사용하여 근관으로부터 건강치 못한 또는 괴사성 치수 조직을 제거한다. 그 후, 근관치료 근관 치료요법에 의해 괴사성 치수 조직의 거의 전부를 제거한 후 근관을 소독한다.

혈관재생

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 혈관재생을 포함한다. 혈관재생은 근관에 새로운, 추가 또는 증가된 혈액 공급을 제공하기 위한 수술 절차이다. 혈관재생은 여러 장점을 갖는다. 상기 절차는 기술적으로 간단하고, 고가의 생명공학 없이 현재 이용가능한 기구 및 의약을 사용하여 완료될 수 있다. 또한, 환자 자신의 혈액 세포에 의한 근관계의 조직의 재생은 면역 거부 및 치수의 조직 공학 구조체로의 대체로부터의 병원체 투과의 가능성을 회피한다. 또한, 치근첨 구멍의 확대는 혈관화를 촉진할 뿐만 아니라, 또한 영양소 확산을 통해 초기 세포 생활력을 유지시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 괴사성 근관계를 세정하고 소독한 후, 근관계는 과도-기구화를 통해 근관계로의 출혈을 확립함으로써 혈관재생된다. 한 실시양태에서, 치근첨의 기구화는 혈액이 근관으로 흐르게 한다. 다른 실시양태에서, 수주 동안 항생제 (예를 들어, 시프로플록사신, 메트로니다졸 및 미노사이클린 페이스트의 혼합물)와 함께 근관내 관주제 (NaOCl 및 클로르헥시딘)의 사용은 근관계를 소독하고, 벗겨진 치아 및 괴사성 치아의 혈관재생을 증가시킨다.

대략 1.1 mm의 치근첨 개구부를 갖는 벗겨진 치아 및/또는 괴사성 치아의 재이식은 혈관재생시킬 가능성이 더 클 수 있다. 완전히 형성된 ("밀폐된") 치근첨을 갖는 괴사성 치수의 혈관재생은 근관계로의 전신 출혈을 허용하기 위해 치근첨 직경을 대략 1 내지 2 mm로 하는 치근첨의 기구화를 필요로 한다.

선조 세포

본 발명의 방법은 선조 세포의 첨가를 포함할 수 있다 (임의로 하기 기재된 스캐폴드를 환자에 이식하면서). 치수는 치수 줄기 세포라고 지칭되는 선조 세포 집단, 또는 미숙 치아의 경우 인간 박탈 유치 (SHED)로부터의 줄기 세포를 함유한다. 치수 줄기 세포는 또한 상아질모세포양 세포라고 지칭되며, 이는 이들 세포가 이들이 대체하는 상아질모세포와 같은 상아질 매트릭스를 합성하고 분비하는 것으로 보이기 때문이다. 중증 치수 손상 또는 기계적 또는 우식 노출 후, 상아질모세포는 종종 창상 부위 아래에서 비가역적으로 손상된다. 상아질모세포는 유사분열후 말단에 분화된 세포이고, 증식하여 아래의 비가역적으로-손상된 상아질모세포를 대체할 수 없다. 상아질모세포양 세포를 위한 치수 줄기 세포는 상재 미분화된 중간엽 세포이다. 이들 세포의 기원은 치아 발달 중에 치아 유두의 신경 능선 유래 세포 집단만이 상아질모세포 분화를 위한 기저막-매개 유도 신호에 특이적으로 반응할 수 있기 때문에 일차 상아질모세포에 관련될 수 있다. 수복 상아질발생의 유도에 의해 손상에 반응하는 어린 치아 및 오래된 치아 양자 모두의 능력은 적격 치수 줄기 세포의 소집단이 평생 동안 치수 내에 존재할 수 있다는 것을 제안한다.

선조 세포는 예를 들어 하기 네 가지 기술을 이용함으로써 혼합된 세포 집단으로부터 확인되고 단리될 수 있다: i) 세포를 특이적 항체 마커로 염색하고 형광 항체 세포 분류법 (FACS)이라고 불리는 방법으로 유동 세포측정기를 사용함; ii) 면역-자성 비드 선택; iii) 면역-조직화학 염색; 및 iv) 생리학적 및 조직학적 기준 (표현형 (외관), 화학주성, 증식, 분화 및 광물화 활성을 포함하나 이에 제한되지 않음). FACS는 단백질 마커 CD34와 함께 말초 혈액, 제대혈 및 세포 배양물로부터 CD34를 발현하는 인간 줄기 세포를 분리하는데 광범위하게 사용된다. 상이한 유형의 선조 세포는 종종 그의 막 상에 상이한 단백질을 발현하므로, 동일한 선조 세포 단백질 마커에 의해 확인되지 않는다. 가장 많이 연구된 치아 선조 세포는 치수 줄기 세포이다. 인간 치수 줄기 세포는 폰 빌레브란트 인자 CD146, 알파-평활근 액틴 및 3G5 단백질을 발현한다. 인간 치수 줄기 세포는 또한 특정 증식, 분화 및 광물화 활성 패턴을 갖는 섬유모세포 표현형을 갖는다.

본 발명의 한 실시양태에서, 자가유래 (환자 자신의) 세포로부터의 선조 치수 세포는 협점막 생검으로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 치수 줄기 세포는 질병 및 병원체-비함유인 동종 정제된 치수 줄기 세포주로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 치수 줄기 세포는 실험실에서 성장된 이종 (동물) 치수 줄기 세포로부터 유래된다.

다른 실시양태에서, 자가 세포로부터의 선조 세포는 출생 후 극저온으로 저장된 제대 줄기 세포로부터 유래된다. 자가 줄기 세포는 수확하기에 상대적으로 용이하고, 주사기에 의해 전달하기 용이하고, 상기 세포는 새로운 치수 재생을 유도하는 잠재성을 갖는다. 자가 인간 치수 줄기 세포주의 사용이 또한 이로우며, 이는 환자가 생검을 통해 자기 자신의 세포를 제공할 필요가 없기 때문이다. 또한, 세포의 정제 및 세포수의 증식은 더 작은 조직 생검의 수집을 허용할 것이나, 환자는 여전히 세포가 정제되고/거나 세포수가 증식되기 전에 얼마 동안은 기다려야 할 것이다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 선조 치수 세포는 발치된 또는 원위치 유치 또는 영구치, 및 주변 구강 조직으로부터 공급된다. 선조 치수 세포는 세포 배양물 중에서 세포를 성장시키거나 또는 줄기 세포 마커에 의한 세포 분류법 기술을 사용함으로써, 치수, 치주, 치근첨 유두 또는 시멘트질 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 치아 조직으로부터 수집될 수 있다. 치아 조직은 효소적 소화에 의한 세포 배양을 위해 준비되거나, 또는 기계적 기구화에 의해 분해된다. 그 후, 조직은 세포 배양 플레이트 상에서 건조되거나, 또는 고체 유리 또는 플라스틱 커버-슬립 하에 고정된다. 예를 들어 1 내지 50%의 농도의 소 혈청 또는 합성 대용품을 함유하거나 함유하지 않는 영양소 세포 배양 배지에 조직을 침하시키고, 예를 들어 37℃의 온도 및 1 내지 10% CO₂ 분위기에서 인큐베이터에서 유지시킨다.

몇몇 실시양태에서, 세포 배양물은 임의로 필요에 따라 수많은 첨가제에 의해 처리될 수 있다. 예를 들어, 항생제 및 항진균제가 세포 배양물의 감염을 회피하기 위해 첨가될 수 있다. 비타민 C 및 L-글루타민이 또한 필수 단백질을 제공하기 위해 배양 배지에 첨가될 수 있다. 생활성 분자, 예를 들어 성장 인자가 또한 배양 배지에 첨가될 수 있다.

세포가 전면성장에 도달한 후, 세포는 예를 들어, 트립신화 (EDTA 함유 또는 비함유)를 사용하여 배양 접시로부터 수확되고, 원심분리되고, 세포 배양 배지를 갖는 세포 배양 플레이트에서 재현탁된다. 임의의 시점에, 수확된 세포는 동결 배지 (예를 들어, 소 혈청 또는 합성 혈청 중 10% DMSO 포함) 또는 세포 배양 배지에서 현탁될 수 있다. 동결 배지 중 세포는 작은 분액으로 천천히 동결되고, 저장을 위해 초저온 동결기에 위치시키거나 또는 액체 질소를 함유하는 탱크에 위치시키고 저장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포의 각 분액은 이를 공여자와 연결시키거나 또는 공여자에 대한 임의의 정보를 확인하기 위해 코드로 마킹된다. 세포는 임의의 시점에 저장물로부터 제거되고 세포의 생활력을 보증하기 위해 배양물에서 성장될 수 있다. 다른 실시양태에서, 동결된 분액은 매년 또는 수년마다 해동된다.

결손, 손실, 병든, 손상된 또는 상한 치아, 골 또는 연부 조직을 재생시키기 위한 재생 치과 치료의 일부로서 세포를 사용할 필요가 있는 시간에 세포가 동결된 경우, 세포는 동결된 저장물로부터 제거되고, 배양 배지에서 현탁되고, 전면성장에 도달할 때까지 인큐베이터에서 유지된다. 세포가 이미 배양물에 있는 경우, 세포는 전면성장에 도달할 때까지 성장된다. 전면 세포는 총 세포수를 증식시키기 위해 재플레이팅된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 충분한 수의 세포가 생성되면, 세포는 예를 들어 트립신화를 통해 수확되고, 일반적으로 조직 공학 스캐폴드라고 공지된 삼차원 생체재료 상에 시딩된다.

삼차원 구조체

본 발명의 다른 실시양태에서, 선조 치수 세포는 세포 조직화 및 혈관화를 지지할 수 있는 삼차원 스캐폴드로 조직화된다. 이는 치수 구조체를 생성시키기 위해 선조 치수 세포로 시딩된 다공성 중합체 스캐폴드를 사용하여 달성될 수 있다. 세포는 스캐폴드 상에 시딩되고, 인간 또는 동물의 구강 조직에 즉시 이식되거나, 다른 실시양태에서, 세포 및 스캐폴드 구조체는 인간 또는 동물의 구강 조직에 이식 전에 수일, 수주 및 심지어 수개월 동안 세포 배양물 중에서 유지될 수 있다.

조직 스캐폴드는 균일한 크기, 색상 및/또는 형상으로 제조될 수 있다. 치아의 경우, 합성 구조체는 일정 범위의 천연 치아 크기, 치아 색상 및 치아 형상으로 제조될 수 있다. 치수, 치주조직, 시멘트질, 에나멜, 골 및/또는 구강 점막 조직의 경우, 조직의 크기, 두께 및 외관은 조직 공학 스캐폴드의 크기, 형상 및 특성에 의해 결정될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 히드록실아파타이트 (히드록시아파타이트); 세포 접착 분자; 세포외 매트릭스 프로테오글리칸 매트릭스 구성성분, 예컨대 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸, 케라틴 술페이트 프로테오글리칸; 또는 비-프로테오글리칸 매트릭스 구성성분, 예컨대 라미닌, 히알루론산, 콜라겐, 피브로넥틴 및 엘라스틴 중 하나 이상에 의해 코팅될 수 있다.

한 실시양태에서, 스캐폴드는 추가로 세포 생존 및 성장을 촉진하기 위한 영양소, 뿐만 아니라 근관계에서 임의의 박테리아 내성장을 예방하기 위한 항생제를 포함한다. 또한, 스캐폴드는 대체 조직에 의해 필요로 되는 필수적 기계적 및 생물학적 기능을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 치수가 노출된 치아에서, 상아질 칩은 수복 상아질 브릿지 형성을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 상아질 칩은 선조 치수 세포 부착을 위한 매트릭스를 제공하고, 또한 성장 인자의 저장소로서 기능할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 수술적 제거의 필요성 없이 주변 조직에 의해 흡수될 수 있도록 생분해성이다. 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드는 세포 및 영양소 양자 모두의 전체 구조를 통한 확산 및 세포 시딩을 촉진하기에 적절한 세공 크기 및 높은 다공도를 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 스캐폴드 분해가 일어나는 속도는 스캐폴드 근처의 조직 형성 속도와 일치할 수 있다. 다시 말해서, 세포가 그 자신 주변에 그 자신의 천연 매트릭스 구조를 제작하는 동안, 스캐폴드는 구조 일체성을 제공할 수 있어야 한다. 마찬가지로, 새로 형성된 조직이 기계적 하중을 독립적으로 담지할 수 있는 지점에서 발생하는 시간 주변에서, 스캐폴드는 분해되기 시작해야 한다.

본 발명의 스캐폴드는 생분해성 또는 영구적인 천연 또는 합성 재료로 제조될 수 있다. 흔한 합성 재료에는 젤라틴, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL)이 포함되나 이에 제한되지 않으며, 이들은 모두 인간 체내에서 분해하는 흔한 폴리에스테르 재료이다. 이들 스캐폴드는 모두 조직 공학 적용에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 이는 다양한 상이한 선조 세포 유형의 성장을 지지하는 능력을 갖는 분해성 섬유 구조이기 때문이다.

스캐폴드는 또한 여러 단백질성 재료, 예컨대 콜라겐, 인산칼슘, 섬유소 및 다당류 재료, 예컨대 키토산 또는 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함하나 이에 제한되지 않는 천연 재료로부터 제작될 수 있다. 대부분의 이들 스캐폴드 재료는 새로운 조직이 근관 내에서 재생할 수 있도록 생체적합성이고 생분해성이다. 그러나, 특정 스캐폴드 재료, 예컨대 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE)은 영구적 비분해성 스캐폴드 재료이고, 근관에서 남아있을 것이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 강성 조직 공학 스캐폴드 구조가 근관계 내의 선조 치수 세포의 조직화 및 혈관화를 조력할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조직 공학 치수 조직은 연질 삼차원 스캐폴드 매트릭스, 예컨대 중합체 히드로겔, 젤라틴 및 한천-기재 겔로 투여된다. 히드로겔 및 다른 겔-기재 제형은 주사기에 의해 전달될 수 있는 주입가능한 스캐폴드이다. 주입가능한 스캐폴드의 한 장점은 비침윤성이고 근관계로 전달하기 용이하다는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 주입가능한 스캐폴드는 광중합가능하거나, 또는 원하는 조직 부위에 이식되면 강성 구조를 형성할 수 있다.

다른 실시양태에서, 조직 구조체는 인간 또는 동물에서 단일 또는 다중 수용자 부위를 정밀하게 맞추기 위해 방사선사진 및/또는 자기 공명 영상 및/또는 마이크로-CT x-선 단층촬영법으로부터 수집된 자료를 사용하여 컴퓨터 소프트웨어에 의해 설계될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 삼차원 스캐폴드는 이식 전에 시험관내에서 또는 원위치에서 이들 스캐폴드 상의 선조 세포의 시딩 없이 인간 또는 동물에 수술로 이식된다. 대신에, 스캐폴드의 수용자에게는 스캐폴드를 집락화하고 손실, 결손, 병든 또는 상한 치아 조직을 재생하기 위해 숙주 수용자 자신의 선조 세포를 활성화하고 이동시키는 제약 화합물 (예를 들어, 약물, 생물 또는 아쥬반트)을 함유하는 의약이 제공된다.

성장 인자 및 세포 이동의 분자 제어

본 발명의 방법의 다른 실시양태는 근관 내의 혈관재생 및 조직의 재생을 자극하기 위한 효과적인 치료요법을 제공하는 것을 포함한다. 이들 방법은 환자에게 성장 인자 또는 성장 인자 생성을 자극할 수 있는 화합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상아질 (예를 들어, 칩 형태)이 환자에서 성장 인자 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 상아질은 조직 반응을 자극할 수 있는 많은 단백질을 함유한다. 방출되면, 이들 성장 인자는 삼차 상아질발생의 많은 사건, 치수-상아질 복구의 반응을 신호전달하는데 있어서 핵심적 역할을 할 수 있다. 성장 인자, 특히 전환 성장 인자-베타 (TGFβ) 족의 성장 인자가 상아질모세포 분화 및 상아질 매트릭스 분비의 자극을 위한 세포 신호전달에서 중요하다. 이들 성장 인자는 상아질모세포에 의해 분비되고, 상아질 매트릭스의 다른 구성성분과의 상호작용을 통해 활성 형태로 보호된 상태를 유지시키는 상아질 매트릭스 내에 침착된다. 정제된 상아질 단백질 분획물의 첨가가 또한 삼차 상아질 매트릭스 분비의 증가를 자극할 수 있다.

치아 발생 및 재생에서 다른 중요한 족의 성장 인자는 골형성 단백질 (BMP)이다. 재조합 인간 BMP2는 배양물에서 성인 치수 줄기 세포의 상아질모세포양 형태학으로의 분화를 자극한다. TGF B1-3 및 BMP7의 유사한 효과는 배양된 치아 슬라이스에서 입증되었다. 재조합 BMP-2, BMP-4, BMP-7은 생체내에서 수복 상아질의 형성을 유도한다. 콜라겐과 함께 재조합 인간 인슐린-유사 성장 인자-1의 적용은 완전 상아질 가교 및 관상 상아질 형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, BMP는 본원에 기재된 방법의 일부로서 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 선조 세포의 방향성 이동을 촉진하기 위해 본원에 기재된 방법에서 제약 화합물의 사용을 포함한다. 선조 세포 또는 줄기 세포의 방향성 이동은 배아 발생 뿐만 아니라 성인에서 손상된 기관 및 조직의 항상성 유지 및 복구에 필수적일 수 있다. 예를 들어, 이동의 부재하에, 기능성 기관 및 조직의 발생에 대한 선조 세포의 기여는 가능하지 않을 것이며, 이는 모든 선조 세포가 기능에 필요한 부위로 이동해야 하기 때문이다.

GTPase의 Rho 족은 위치 및 활성화 상태에 의해 조절되는 세포내 전령의 한 족을 구성한다. 이들은 접착 및 이동을 포함하는 선조 세포의 거의 모든 기능에 중요한 영향을 미친다. 예를 들어, Rho는 세포의 수축 및 박리에 중요한 효과를 발휘하는 반면, Rac은 분극화 세포의 방향성 이동에 필요한 효과를 발휘한다. Cdc42는 Rac과 동일한 많은 수용체를 활성화시키나, 그의 효과는 세포 형태학 및 라멜리포디아 발생을 포함하는 것에 제한되는 것으로 보인다. 연구는 Rho가 사실 불활성화되거나 또는 붕괴된 이동하는 세포의 앞 가장자리에 있는 Rac을 입증하였다. 역으로, 이동하는 줄기 세포의 마지막 가장자리에서, 활성화된 Rho는 그의 이펙터 Rho 키나제, Pak-1과 관련된다. Pak-1의 키나제 활성은 Rac을 그의 GTP "활성화된" 형태로 고정시킬 때 향상된다.

핵에서, 종양 억제 단백질 p27 kip은 그의 아미노-말단 영역 (N)과 결합하여 사이클린 및 사이클린-의존성 키나제 (CDK)의 복합체를 형성하여, 세포 증식을 억제시킨다. 인산화된 (P) p27 kip 1은 세포질로 이동하는 것으로 믿어지는 경우 (베슨(Besson) 등에 의해 나타낸 바와 같이), 이는 그의 카르복시 말단 (C)을 통해 RhoA에 결합하고, 구아닌-뉴클레오티드-교환 인자 (GEF)에 의해 RhoA 활성화를 방해한다. RhoA, Cdc42 및 Rac은 세포 이동에 필요한 세포골격 변화를 조절한다. Cdc42 및 Rac은 주로 분극화 세포의 앞 부분에서 작용하여, 액틴-구동 돌출 및 전방향 이동에 필요한 새로운 접착의 형성을 조절한다. RhoA는 ROCK 단백질을 통해 주로 뒷 부분에서 작용하여, (다른 방법 중에서) 국소 접착이라고 공지된 접착 부위의 턴오버 및 이에 의해 후부 퇴축을 결정한다. RhoA 활성화를 방해함으로써, FAK는 세포 유형에 따라 세포 이동을 억제하거나 촉진한다.

몇몇 실시양태에서, 선조 치수 세포의 이동은 Rac/Rho-키나제 활성화의 균형에 의해 제어될 수 있다. Rac이 활성화된 경우 세포는 전방향으로 이동하고, Rho-키나제가 활성화된 경우 세포는 제자리에 고정된 채로 유지된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 약물 치료요법은 본원에 기재된 조직 공학 치료요법의 일부로서 선조 치수 세포 이동을 제어하기 위해 Rho 족의 GTPase로 표적화되고 전달될 수 있다.

재생 근관치료의 생체적합성 및 효능 측정

본 발명의 다른 실시양태에서, 치수 줄기 세포 및 다른 유형의 선조 세포, 예를 들어 치주 줄기 세포의 생존, 사멸, 부착 및 증식은 본원에 기재된 재생 근관치료의 일부로서 사용되는 스캐폴드, 파일/세정 기구, 생체재료, 소독제 및 의약의 생체적합성 및 세포독성을 시험하는데 사용될 수 있다. 생체내 임상 또는 동물 시험 전에, 이들 절차는 시험관내 발치된 치아 및 세포 배양 기술 또는 분석법을 이용하여 시험될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 생체내 치근관 내의 재생된 조직의 효능은 비침윤 방법, 예컨대 혈류의 도플러 측정 및 전기 치수 생활력 시험을 이용하여 측정될 수 있다. 임상 시험의 경우, 연구자에게 관심있는 정량 또는 정성 특징을 기준으로 하는 치료의 성공률에 대해 환자에게 질문할 수 있다.

치아는 또한 혈관재생된 근관과 관련된 조직 재생의 평가를 위해 발치될 수 있다. 별법으로, 발치된 치아는 임상 또는 동물 시험 전에 재생 근관치료 절차의 시험관내 효능을 측정하기 위한 근관 조직 재생의 다양한 측면에 대한 대상물일 수 있다. 측정 방법은 세포 생존 분석법, 뿐만 아니라 주사/투과 전자 현미경법 및 조직학을 사용하는 근관 표면으로의 접착을 포함한다.

근관치료 키트

본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한, 뿐만 아니라 다른 적합한 치과 적용에서 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 상기 방법의 일부로서 기재된 구성성분의 임의의 예 뿐만 아니라 하기 기재된 구성성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 스캐폴드 (또한 본원에서 "이식가능한 매트릭스"라고 지칭됨)가 진료의사가 포괄적 재생 근관치료를 전달할 수 있게 하는 키트에 포함될 수 있다. 이들 키트는 소독 용액, 단리된 치수 세포 또는 근관치료 파일 중 임의의 것 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어 스캐폴드, 수동형 및/또는 모터구동형 근관치료 파일, 관주/소독 용액 및 산/킬레이트화제 (괴사성 치수 조직을 세정하고 근관을 소독하기 위해 사용됨)를 가질 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 키트 중의 이식가능한 매트릭스는 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위해 포장된 히드로겔일 수 있다. 키트 중의 이식가능한 매트릭스는 콜라겐, 섬유소, 키토산, 글리코사미노글리칸 및 이들의 혼합물 중 임의의 재료로 적어도 부분적으로 구성될 수 있다. 키트 중의 이식가능한 매트릭스는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로락톤 및 이들의 혼합물 중 임의의 재료로 적어도 부분적으로 구성될 수 있다. 키트 중의 이식가능한 매트릭스는 혈소판 풍부 혈장, 혈액 또는 임의의 혈청 생성물로 적어도 부분적으로 구성될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 키트는 항생제를 함유한다. 항생제는 예를 들어 이식가능한 매트릭스의 일부이거나 또는 키트 내에 개별적으로 포장될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 키트는 줄기 세포 또는 다른 단리된 치수 세포를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 이들 세포는 폰 빌레브란트 인자 CD146, 알파-평활근 액틴 및 3G5 단백질 중 하나 이상을 발현할 수 있다.

본 발명의 키트는 또한 전환 성장 인자-베타 족의 구성원, 골형성 단백질, 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 -II, 집락 자극 인자, 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 II, 인터류킨 IL-1 내지 IL-13, 혈소판-유래 성장 인자 및 신경 성장 인자로 구성된 군에서 선택된 세포 성장 인자를 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 제공되고 본 발명을 제한하려는 것으로 의도되지 않는 예시적 실시양태의 하기 기재를 통해 명백하게 될 것이다.

실시예 1

치아의 세정 및 성형

인간 대상체를 등록시키거나, 또는 임상연구심의위원회 승인 후 발치된 치아를 사용하였다. 통상적인 근관치료를 위해 치아를 준비하였다. 15 K-파일 (덴트스플리 툴사 덴탈(Dentsply Tulsa Dental), 미국 오클라호마주 툴사 소재)이 치근첨 구멍에서 보였을 때의 길이로부터 1 mm를 공제함으로써 근관 작용 길이를 달성하였다. 프로테이퍼(Protaper) 및 프로파일(ProFile) 회전식 기구 (덴트스플리 툴사 덴탈, 미국 오클라호마주 툴사 소재)를 이용하여 치아를 세정하고 성형하였다. 하기 파일 순서를 사용하여 근관을 기구화하였다: SX, S1, S2, F1, F2, F3 및 35/.06. 세정 및 성형 중에, 각 기구 크기 후 6% 차아염소산나트륨 [NaOCl] (클로록스(Clorox), 미국 캘리포니아주 오클랜드 소재) 관주 용액 1 ml를 사용하였다. 작은 플라스틱 바늘 (울트라덴트 프로덕츠(Ultradent Products), 미국 유타주 사우스 조단 소재)을 사용하는 생물기계적 제조 중에 관주 용액 총 6 ml를 사용하였다. 그 후, 1분 동안 17% EDTA (펄프덴트(PulpDent), 미국 매사추세츠주 워터타운 소재) 3 ml를 적용하고, 6% NaOCl 6 ml로 최종 플러싱하였다.

치아의 소독

5분 동안 6% NaOCl (클로록스, 미국 캘리포니아주 오클랜드 소재) 중에 침하시킴으로써 치아를 소독하였다. 그 후, 표본을 멸균 염수에서 세척하고, 추가 2회 재세척하였다. 기구화된 치아를 행크(Hank) 균형 염 용액 (HBSS, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 중에서 3일 이하 동안 5℃에서 유지시켰다.

선조 치수 세포

선조 치수 세포는 지원자 환자로부터 수집되고 사용 전에 동결된 인간 박탈 유치 (SHED)로부터 얻은 세포였다. 세포를 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM, 비디 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에서 배양하였다. 배양 배지를 60일 이하 동안 2일마다 보충하면서, 세포 배양물을 37℃에서 5% CO₂의 가습 분위기에서 유지시켰다. 트립신화 (0.25% 트립신/EDTA, 메디아테크, 인크.(Mediatech, Inc.), 미국 버지니아주 헤른돈 소재)에 의해 전면 세포 배양물을 수집하였다.

세정되고 성형된 치아로의 치수 조직 구조체의 이식

3종 유형의 삼차원 스캐폴드를 연구하였다: 개방-셀 폴리락트산 (OPLA), 인산칼슘, 및 소가죽으로부터 제조된 콜라겐 스캐폴드 (비디 바이오사이언시스, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재). 각 원통형 스캐폴드를 조각 2개로 슬라이싱하여, 대략 5 mm의 길이 및 2 mm의 너비, 및 0.01195 ㎤의 추정 부피를 갖는 스캐폴드를 제공하였다. 스캐폴드를 중성 인산염 완충 염수 (PBS)에 침지시키고, 5℃에서 저장하였다. 세포 시딩 24시간 전에 PBS를 DMEM으로 대체하였다.

처음 두 치료군이 대조군이었다. 어떠한 스캐폴드 또는 세포도 없이 세정되고 성형된 근관을 포함하는 군 1, 및 어떠한 스캐폴드도 없이 치아 15개의 세정되고 성형된 근관으로 주사되는 SHEDx10⁶을 포함하는 군 2. 나머지 군들은 실험 치료군을 구성하였다. 배양 조건을 균일화하기 위해 OPLA 스캐폴드를 포함하는 군 3을 세포 적용 전에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이식 24시간 전에 멸균 마이크로-주사기를 사용하여 각 OPLA 스캐폴드에 SHEDx10⁶을 시딩함으로써 치수 구조체를 제조하였다. 그 후, 멸균 겸자 및 근관치료 충전기 (밀텍스 인크.((Miltex Inc.), 미국 펜실베이니아주 요크 소재)를 사용하여 세정되고 성형된 치아 15개의 근관에 구조체를 이식하였다. 스캐폴드가 소 콜라겐으로부터 제조된 것을 제외하고 군 3과 동일한 스캐폴드를 포함하는 군 4. 스캐폴드가 인산칼슘으로부터 제조된 것을 제외하고 군 3과 동일한 스캐폴드를 포함하는 군 5. BMP-2 50 ng을 PBS (pH 7.4) 중 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 50 ㎕ 중에서 각 스캐폴드에 첨가한 것을 제외하고 군 3과 동일한 스캐폴드를 포함하는 군 6. TGF-β1 (시그마-알드리히(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 50 ng을 PBS (pH 7.4) 중 0.1% BSA 50 ㎕ 중에서 각 스캐폴드에 첨가한 것을 제외하고 군 3과 동일한 스캐폴드를 포함하는 군 7. 13-글리세로포스페이트 50 ng을 PBS (pH 7.4) 중 0.1% BSA 50 ㎕ 중에서 각 스캐폴드에 첨가한 것을 제외하고 군 3과 동일한 스캐폴드를 포함하는 군 8. 세포, 스캐폴드 및 치수 구조체를 함유하는 모든 치아를 DMEM 배양 배지 1 ml에서 침하시키고, 1, 7 또는 14일 동안 24-웰 배양 플레이트 (비디 바이오사이언시스, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)에서 유지시켰다.

주사 전자 현미경법을 위한 준비

치아를 10% 중성-완충된 포르말린 용액에서 18℃에서 24시간 동안 침하시킴으로써 고정하였다. 그 후, 치아를 사산화오스뮴 (1%v/v)에서 2시간 동안 후고정한 후, 단계적 시리즈의 에탄올 용액 (80%, 90%, 95%)에서 각각 15분 동안, 이어서 100% 에탄올로 3 x 10분 동안 탈수시켰다. 치아를 용액으로부터 제거하고, 탈수된 표본을 고정시키기 위해 헥사메틸디실라잔에서 5분 동안 위치시켰다. 치아를 치즐을 이용하여 세로 축을 따라 2개-절반으로 파절시킴으로써 주사 전자 현미경 (SEM)에서 시각화를 위해 치아를 준비하였다. 치아를 여과지 상에서 30분 동안 건조시켰다. 급속 설정된 아랄다이트(Araldite) (데브콘 리미티드(Devcon Ltd), 아일랜드 샤논 소재)를 갖는 알루미늄 스테레오스캔 토막 상에 치아 표본을 탑재하였다. 건조된 탑재 표본을 크레싱턴 스퍼터 코우터(Cressington Sputter Coater) 모델 108오토 (영국 왓퍼드 소재)에서 금/팔라듐의 20 내지 30 nm 금속 박층으로 코팅하였다.

조직 공학 조직의 주사 전자 현미경법

표본을 콴타(Quanta) 200 SEM (FEI, 미국 오리건주 힐스보로 소재)에서 관찰하였다. 디지털 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 SEM 현미경사진을 x2,000 확대로 얻었다. 일반적인 표면 국소형태학의 개관을 얻기 위해 각 근관을 전체 스캐닝하였다. 현미경사진을 사용하여 세포 부착을 치수 구조체 내부 및 근관 상아질로 시각화하였다. 반정량적 기준을 사용하여 근관에 접착하는 조직 공학 치수 구조체의 유효성을 평가하였다.

실시예 2

엠. 파시쿨라리스(M. fascicularis) 비인간 영장류의 상악 치아 14개 (n=14)를 치근첨 ISO 크기 40으로 표준 근관치료 기술을 사용하여 기구화하였다. 빈 근관 공간 내에, 본 발명자들은 3개의 상이한 재생 치료를 시도하였다: 첫번째, P15-펩겐 골 재생 재료를 이식하였다. 두번째, 본 발명의 콜라겐 조직-공학 스캐폴드를 이식하였다. 세번째, #15 K-파일로 치근첨을 프로빙함으로써 혈괴를 자극시켰다.

7일 후, 비인간 영장류를 희생시키고, 조직학을 위해 치아를 가공하고, 치아를 광학 현미경 x200 하에 관찰하였다. 콜라겐 스캐폴드는 대부분의 백혈구를 근관 공간에 부착시켰고, 세포는 균일하게 분포되었다. P15-펩겐 골 재생 재료는 백혈구를 거의 유인하지 않았다. P15-펩겐은 겔 결합제를 갖는 고체 과립형 재료이나; 백혈구는 스캐폴드 내부가 아닌 가장자리 상에 있었다. 비교하여, 혈괴는 근관 내에 가장 적은 세포를 가졌다. 이들 결과는 조직 공학 스캐폴드 및 골 확장 재료의 이식이 근관 내의 조직 재생을 달성하기 위해 혈괴보다 더 최적일 수 있다는 것을 나타낸다.

2. 재료 및 방법

2.1. 동물 사용

대략 7세의 엠. 파시쿨라리스 비인간 영장류의 모든 전치 및 소구치 (구개관) 및 대구치 (구개관)에 대해 통상적인 근관치료 근관 치료요법을 수행하였다. 치과 절차와 관련된 통증 또는 스트레스를 최소화하기 위해 동물에게 수술중 전신 마취 및 수술후 진통제를 제공하였다.

2.2. 전신 마취

엠. 파시쿨라리스 비인간 영장류를 10 내지 15 mg/kg 케타민으로 마취시키고, 1.5% 농도의 이소플루란으로 유지시켰다. 치과 절차 중에 원숭이를 삽관하였다. 절차 중에 심박수, 호흡수 및 발가락 핀치 반사 (심부통 평가)를 모니터링하였다.

2.3. 치과 치료

임상 치과 실습에서 일반적으로 적용되는 동일한 절차에 따라 비인간 영장류 치아를 치료하였다. 근관 내의 치료전 대 치료후 변화의 비교를 위해 각 치아의 방사선사진을 찍었다. 고무 댐 클램프로 고착된 고무 댐을 사용하였고, 수술장을 2% 클로로헥시딘으로 소독하였다. 각 치아의 치아관 내의 치수강 접근 공동을 절단하기 위해 치과용 핸드 피스를 사용하였다. 접근 공동 절단 도중 치아를 냉각시키기 위해 물-스프레이를 사용하였다.

2.4. 근관 기구화 및 관주

수동적 단계 백 기술, 프로테이퍼 및 프로파일 GTX 회전식 기구화 (툴사 덴트스플리, 미국 오클라호마주 툴사 소재)의 조합을 이용하여 치아를 크기 40.04로 기구화하기 위해 작은 근관치료 파일을 사용하였다. 세정 및 성형 중에, 각 기구 크기 후 관주 용액 (6% NaOCl, 클로록스, 미국 캘리포니아주 오클랜드 소재) 5 ml를 사용하였다. 모든 군에서, 작은 플라스틱 바늘 (울트라덴트 프로덕츠, 미국 유타주 사우스 조단 소재)을 사용하는 생물기계적 제조 중에 관주 용액 총 25 내지 30 ml를 사용하였다. 그 후, 15초 동안 부식제 (17% EDTA; 펄프덴트, 미국 매사추세츠주 워터타운 소재) 2 ml를 적용하였다. 그 후, 15초 동안 관주 용액 10 ml로 최종 플러싱하였다. 치관을 또한 초음파 활성화와 함께 멸균 염수 10 ml로 최종 플러싱하였다.

세정된 근관계로 출혈을 야기하기 위해 #15 K-파일을 사용하여 치근첨을 기구화하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 치아를 무작위로 3개의 상이한 치료군으로 나누었다: 1. 어떠한 스캐폴드 또는 충전 재료의 삽입 없이 양성 대조군으로서 치아 3개 (n=3)의 근관계에서 혈괴가 형성되도록 하였다. 2. 소 콜라겐 조직-공학 스캐폴드 (비디 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)를 치아 6개 (n=6)의 세정된 근관계에 삽이하였다. 3. P15-펩겐 (덴트스플리 프리아덴트(Dentsply Friadent), 독일 만하임 소재)이라고 불리는 주입가능한 스캐폴드를 치아 5개 (n=5)의 세정된 근관계에 삽입하였다. 각 치료군의 스캐폴드 또는 혈괴는 자가-치유 유리 아이오노머 (후지(Fuji) II, GC, 일본 동경 소재)에 의한 최종 복원 전에 생체적합성 기재로서 위치된 MTA 4 mm를 가졌다.

2.5. 안락사

조직학적 분석을 위한 조직 수확 7일에 엠. 파시쿨라리스 비인간 영장류를 안락사시켰다.

2.6. 조직의 수집 및 조직학적 처리

광학 현미경 조직학을 위해 수확된 조직를 처리하였다. 발치된 치아를 24시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 탈광물화 용액 (VWR, 미국 조지아주 스와니 소재)을 사용하여 탈광물화시켰다. 세척 후, 치아를 단계적 시리즈의 알콜 (70%, 80%, 90%, 95%, 각각 2시간 동안), 이이서 100% 에탄올로 2시간 탈수시킨 후, 파라핀 왁스 블록에 매봉하고, 마이크로톰으로 5 마이크로미터 슬라이스로 절단하였다. 치아의 조직학적 슬라이스를 유리 슬라이드 상에 수집하고, 65℃에서 12시간 동안 유지시켰다. 하기 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신 염색약으로 염색하였다: 크실렌 (3분), 크실렌 및 100% 알콜 (50/50, 침적), 95% 에탄올 (3분), 70% 메탄올 (1분), 물 (1분), 헤마톡실린 (2분), 흐르는 물 (침적), 산 알콜 (침적), 물 (침적), 13% 암모니아 (침적), 흐르는 물 (5분), 80% 에탄올 (침적), 에오신 (15초), 95% 에탄올 (3 침적), 100% 에탄올 (3분) 및 크실렌 (1분 또는 슬라이드 상에 고정될 때까지). 유리 슬라이드 상의 조직을 슈어-마운트(Sure-Mount) 접착제 (트라이앵글 바이오메디칼 사이언시스(Triangle Biomedical Sciences), 미국 노쓰 캐롤라이나주 더럼 소재)로 적용된 커버-슬립으로 밀봉하였다.

2.7. 근관 내의 세포의 조직학

숙주 면역 반응에 의해 전달된 치근관 내의 세포수를 현미경 시야당 개수하고, 세포의 유형 및 1) 유핵 세포, 2) 무핵 세포의 비례량을 검사하였다. 기준: 1) 세포 없음, 2) 가장자리에 위치됨, 3) 중앙에 위치됨 및 4) 균일하게 분포됨을 사용하여 근관 내의 유핵 세포의 위치를 나타내었다.

2.8. 통계적 분석

모든 실험으로부터의 원자료를 분산 분석 (ANOVA) 검정, 및 최종적으로 다목적이고 가장 보수적인 다중 비교 검정 (문헌 [Dawson-Saunders and Trapp 1994])이라고 주장된 쉐페의 사후 절차 (문헌 [Scheffe 1953])를 사용하여 검사하였다.

3. 결과

3.1. 재생된 근관 내의 세포수

콜라겐 조직 공학 스캐폴드가 이식된 경우에 숙주 면역 반응에 의해 전달된 치근관을 재증식시킨 세포수가 가장 많았다 (도 9). 어떠한 재료도 첨가되지 않고 혈괴가 근관 공간을 충전시키도록 허용된 경우에 많은 적혈구가 근관을 재증식시켰다 (도 10). 몇몇 세포는 P15 펩겐 및 근관 벽 사이의 공간을 재증식시켰으나, 재료를 투과시켜 근관의 코어를 재증식시킨 세포는 거의 또는 전혀 없었다 (도 11). 재생 근관치료 A 후 가장 많은 수의 세포가 혈관재생된 근관을 증식시켰다.

3.2. 혈관재생된 근관의 세포 재증식

조직 재생을 위한 전구체 세포에서와 같이 근관치료 재생후 혈관재생된 근관 내의 숙주 전신 백혈구의 위치를 평가하였다. P15-펩겐이 이식된 재생된 근관에서, 스캐폴드의 가장자리 주변에서 백혈구 및 적혈구가 관찰되었다 (도 13). 콜라겐 스캐폴드는 백혈구의 균일한 분포를 가졌고, 적혈구는 가장자리 주변에 분포하였다 (도 13). 혈관재생된 근관에 형성된 혈괴는 주로 적혈구를 함유하였고, 몇몇 백혈구는 가장자리 주변에 분포하였다 (도 13).

상기 교시내용에 비추어 본 발명의 수많은 변형 및 변화가 가능하다. 그러므로, 첨부된 청구의 범위 내에서 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 바와 다르게 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

Claims (32)

1. (a) 근관계로부터 건강치 못한 또는 감염된 치수 조직을 제거하는 단계;
   (b) 근관계를 혈관재생시키는 단계;
   (c) 근관계에 스캐폴드, 선조 치수 세포 및 성장 인자를 개별적으로 또는 조합하여 삽입하는 단계; 및
   (d) 감염 예방을 돕기 위해 근관으로의 치관 및/또는 치근첨 접근부에 수술후 실란트를 적용하는 단계
   를 포함하는, 재생 근관치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 강성인 방법.
3. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 주입가능한 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 혈관재생이 치근첨의 기구화 또는 제거에 의해 근관계로 혈액이 흐르게 함으로써 달성되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 근관내 관주 용액 및 항생제가 근관계를 소독하고 혈관재생을 증가시키는데 사용되는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 협점막 생검으로부터 유래된 자가유래 세포로부터의 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 질병 및 병원체-비함유인 것으로 예상되는 동종 정제된 치수 줄기 세포주로부터 유래된 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 실험실에서 성장된 이종 치수 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 제대 줄기 세포로부터 유래된 자가 세포로부터의 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 발치된 또는 원위치 유치 또는 영구치, 및/또는 주변 구강 조직으로부터 얻어진 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 선조 치수 세포가 세포 조직화 및 혈관화를 지지할 수 있는 삼차원 스캐폴드로 조직화된 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 삼차원 스캐폴드가 치수 구조체를 생성하기 위해 선조 치수 세포로 시딩된 다공성 중합체 스캐폴드인 방법.
13. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 세포 생존 및 성장을 촉진하기 위한 영양소 및 항생제를 추가로 포함하는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 스캐폴드가 상아질 칩을 포함하는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 스캐폴드 매트릭스가 중합체 히드로겔을 포함하는 것인 방법.
16. 이식가능한 스캐폴드 매트릭스, 소독 용액 및 단리된 치수 세포를 포함하는 근관치료 키트.
17. 제16항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 히드로겔인 키트.
18. 제16항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 콜라겐, 섬유소, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 구성된 군에서 선택된 재료를 포함하는 것인 키트.
19. 제16항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리카프로락톤으로 구성된 군에서 선택된 재료를 포함하는 것인 키트.
20. 제16항에 있어서, 스캐폴드가 항생제를 포함하는 것인 키트.
21. 제16항에 있어서, 단리된 치수 세포가 줄기 세포인 키트.
22. 제16항에 있어서, 단리된 치수 세포가 폰 빌레브란트 인자 CD146, 알파-평활근 액틴 및 3G5 단백질 중 하나 이상을 발현시키는 것인 키트.
23. 제16항에 있어서, 관주 용액을 추가로 포함하는 키트.
24. 제16항에 있어서, 산 및 킬레이트화제로 구성된 군에서 선택된 근관 세정제를 추가로 포함하는 키트.
25. 제16항에 있어서, 근관치료 파일을 추가로 포함하는 키트.
26. 제16항에 있어서, 전환 성장 인자-베타 족의 구성원, 골형성 단백질, 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 -II, 집락 자극 인자, 표피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자-I 또는 II, 인터류킨 IL-1 내지 IL-13, 혈소판-유래 성장 인자 및 신경 성장 인자로 구성된 군에서 선택된 세포 성장 인자를 추가로 포함하는 키트.
27. 이식가능한 스캐폴드 매트릭스, 소독 용액, 세정 용액 및 근관치료 파일을 포함하는 근관치료 키트.
28. 제27항에 있어서, 세정 용액이 산 또는 킬레이트화제인 키트.
29. 제27항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 콜라겐, 섬유소, 키토산 및 글리코사미노글리칸으로 구성된 군에서 선택된 재료를 포함하는 것인 키트.
30. 제27항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리카프로락톤으로 구성된 군에서 선택된 재료를 포함하는 것인 키트.
31. 제27항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 항생제를 포함하는 것인 키트.
32. 제27항에 있어서, 이식가능한 스캐폴드 매트릭스가 혈소판 풍부 혈장, 혈액 또는 임의의 혈청 생성물인 키트.

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