JP4915004B2

JP4915004B2 - 生分解性樹脂複合材料により構成される組織再生用足場（スカフォールド）

Info

Publication number: JP4915004B2
Application number: JP2006511277A
Authority: JP
Inventors: 千秋日和; 泰治安達; 俊輔馬場
Original assignee: New Industry Research Organization NIRO
Current assignee: New Industry Research Organization NIRO
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2025-03-22
Also published as: JPWO2005089828A1; WO2005089828A1

Description

本発明は、医療用の組織再生用足場（スカフォールド）に用いることができる生分解性樹脂複合材料に関するものである。さらに詳しくは、歯槽骨や骨組織再生用足場に関するもので、幹細胞や骨芽細胞などを本発明に係る構造体の内部に注入し、組織の欠損部に施術することで、組織の再生を図ることができる材料技術に関するものである。

人体に何らかの欠損が生じた場合、自然治癒される場合が多い。しかし、欠損が大きくなると自然治癒力では修復できない場合がでてくる。このような時に未分化細胞である幹細胞などで組織を再生する再生医療技術は、人体のあらゆる場所にその適用を広げつつある。その際、必要となるものは組織再生を誘導するための足場（スカフォールド）であり、このスカフォールドには、組織再生に従い体内で分解する生分解性樹脂が用いられている。

生分解性樹脂は, 生体内または通常の環境下で自ら分解していくため、近年脚光を浴びている再生医療において重要な位置を占めている。医療用に使用されている生分解性樹脂としては、ポリ乳酸 (Polylactic acid; ＰＬＡ) 樹脂やポリカプロラクトン(ＰＣＬ) 樹脂などがある。生分解性プラスチックのなかでもＰＬＡ樹脂は生体内分解吸収性に優れており，高強度と生体適合性，さらに自己分解性を兼ね備えた新しい医療用材料として期待されている。

ところで、生体内に大きな欠損空間が生じると、一般的にその部位は瘢痕性のコラーゲン組織によって補填される。瘢痕組織により占有された組織の欠損部では、本来の生体組織の再生を期待することは不可能である。組織を再生する１つの方法は、再生部位を占拠している瘢痕組織を除くことであり、もう一つの方法は、欠損部を瘢痕組織に占有されないように、あらかじめ欠損部での再生のスペースを確保(スペース・メイキング)し、細胞の分化や増殖を支援するための場を欠損部に作ることが必要である。この場を作るためには、細胞の足場材料（スカフォールド）が必要なのである。

スカフォールドは、その適用範囲が広がる中で、細胞などの播種が容易である、肉芽などの近隣組織の浸入を防止できる、適度な剛性と十分な強度を持っている、及び場所により生分解性が制御できるなどの機能が必要とされており、これらの機能を具備する新しい材料が求められている。

従来、組織再生用スカフォールドには，骨再生には多孔質のヒドロキシアパタイトや、軟骨再生にコラーゲンゲルによるもの（非特許文献１）、若しくは、ポリカプロラクトン繊維による構造体（非特許文献２）などが研究されておりそれぞれに臨床試験が行われつつある。

また、生体材料用スカフォールドとして、ハイブリッド型アパタイト・コラーゲン複合体が提案されている。これは、炭酸アパタイトが生体骨組織に近い組成と結晶性とを有すること、生体組織に対して親和性に優れた材料であることから、このアパタイトをコラーゲンにより複合化し、これをスポンジ状にすることで、高気孔率、多孔質の生体再生医用アパタイト・コラーゲン複合体を再生医療材料に用いようとするものである（特許文献１）。

また、骨の疾患または外傷によって骨に欠損を生じた場合など、例えば、人体の骨折に対する補助骨材としてはステンレス鋼やチタン合金あるいはセラミックス等が従来から用いられてきた。このような人工骨或いは人工歯根のように、欠損を生じた生体硬組織の機能を修復するために、該欠損部に移植されるものは、分解し難く、また錆びない金属でほとんど健康に悪影響がないものの、骨が癒合すれば摘出したほうがよい。しかし、高齢者など手術によるリスクが大きい場合には摘出しない場合もある。かかる事情があり、十分な強度や剛性に持ち、欠損部が治癒するに従い、自己分解して生体吸収性があるような材料が求められている。

特開２００３−１６９８４５号公報 S.Wakitani,T.Goto,R.G.Young,J.M.Mansour,V.M.Goldberg and A.I. Caplan, Tissue Engineering,4,429(1998)) Hutmacher DW, Schantz T, Zein I, Ng KW, Teoh SH, Tan KC. J Biomed Mater Res. 2001 May; 55(2): 203-16

スカフォールドの開発において最大の問題点は生きた細胞の均一で高密度な播種と成長に適した環境である。従来のコラーゲンゲルでは注射器による播種が可能だが、剛性に乏しく挿入した欠損部で、運動による荷重を支持できないため使用部位が限られていた。
また、多孔質のアパタイトは細胞を播種しにくく、材料は剛性が大きいが非生分解性であり、欠損部との界面接合部に応力が集中しやすいといった問題がある。
さらに、アパタイトは構造が決まってしまう点で、医療の現場での寸法合わせが困難である点、非生分解性のため自然に溶けて無くならず、将来も生体内に残り続ける点が問題である。

ハイブリッド型アパタイト・コラーゲン複合体の場合は、スポンジ状を呈した状態に設計されてため、治療部位に応じた形状加工が容易であるが、目的が細胞の浸潤性と共に強度をも重視する場合には、他の支持機構と組み合わせ、併用して用いなければならないという問題がある。

また、医療用に使用されている生分解性樹脂であるポリ乳酸(ＰＬＡ)は、例えば骨折部位を固定する生体埋込ボルト用の材料としてすでに市販されており、骨の自己再生とともにボルトが自然に自己分解し、ボルト摘出のための再手術なしに完全骨化・治癒が可能であるという優れた効果を有している。しかし、ＰＬＡは結晶性高分子であり、その高次構造は分子量や熱処理過程に強く依存する。そのため、強度や剛性などの機械的性質や生分解速度を広く制御することが困難であった。

本発明に係る生分解性樹脂複合材料は、上記の課題を解決すべくなされたものである。

本発明者は、生分解性樹脂複合材料についての検討を長年進めた結果、高強度で高靱性のＰＬＡ樹脂繊維と柔軟性に優れたＰＣＬ樹脂を特定の手段により複合化させることが上記課題に対して有効であること知見し、本発明を完成するに至った。

本発明に係る生分解性樹脂複合材料は、生体内分解吸収性に優れており強度と剛性に優れたＰＬＡ樹脂と、柔軟性に優れたポリカプロラクトン(ＰＣＬ)樹脂を特定の観点により複合化することにより、強度や剛性に優れ、強度や生分解速度を広く制御できるものである。

本発明の第１の観点からは、「ポリ乳酸（ＰＬＡ）樹脂からなる繊維を織ることによりポーラスな織物構造体を作製し、前記織物構造体にバインダーとしてＰＣＬ樹脂を用いたことを特徴とする生分解性樹脂複合材料により構成される組織再生用足場（スカフォールド）であって、織物構造体の内部に空洞を有し、空洞内部に綿状の生分解性ポリマーを有し、ポリカプロラクトン樹脂によりポリ乳酸樹脂繊維同士の接着とポリ乳酸樹脂繊維間に外殻に微小円孔を有する膜構造を形成させ、織物構造体と該織物構造体を覆うポリカプロラクトン樹脂膜により３次元構造体を成し、ポリ乳酸樹脂繊維の径、織物構造体の織のピッチ、バインダーのポリカプロラクトン樹脂膜の膜厚、空洞内部の綿状の生分解ポリマーの量をパラメータとして、織物構造体の剛性，空隙率，生分解速度を制御できる組織再生用足場」が提供される。
スカフォールドは、多孔質(ポーラス)で高い空孔率が必要なことから、欠損部の補強財としてＰＬＡ繊維を織物構造とし、それに柔軟性に優れたＰＣＬ樹脂をバインダーとして用いて、ＰＬＡ繊維同士の接着と繊維間に膜構造が形成される構造としたものである。

本発明の第２の観点からは、第１の観点において、「織物構造体を内部に空洞を有する籠形状の組紐構造体とし、籠形状の内部にＰＬＡ繊維からなる綿を有するスカフォールド」が提供される。
籠形状とし内部の空洞にＰＬＡ繊維からなる綿を有することで、内部への細胞の着床率を上げることができ、また、織物構造の大きさを織り方により制御できるので、大きな欠損部に用いるスカフォールドの作製が可能になる。特に、歯槽骨の組織再生用スカフォールドへの適用可能性が高い。

本発明の第３の観点からは、第１の観点において、「織物構造体を複数のＰＬＡ繊維を編むことによりロープ状の組紐構造体としたスカフォールド」が提供される。
ロープ形状であり、ＰＬＡ繊維の太さを変えることにより様々な大きさの構造物が作れるため、欠損部の大きさに対応したスカフォールドが容易に作製できる。これも、歯槽骨の組織再生用スカフォールドへの適用可能性が高い。

本発明の第４の観点からは、第１の観点において、「織物構造体において、ＰＬＡ繊維を平織りとし、それを積層することにより成形したスカフォールド」が提供される。
このようにして成形したスカフォールドは、非常に強度が高く、アパタイトの代用として骨組織の組織再生用スカフォールドへの適用可能性が高い。

本発明は、ＰＬＡ繊維径と織のピッチ、若しくはバインダーのＰＣＬ樹脂の膜厚をパラメータとして、剛性，空隙率，若しくは生分解速度を制御できる。骨再生の場所によって必要とされる剛性が異なるため、剛性，空隙率，若しくは生分解速度を制御するパラメータをスカフォールドが具備する。

バインダーとして用いられるポリカプロラクトン（ＰＣＬ）樹脂は、生分解性プラスチックの代表として知られている。ＰＣＬ樹脂は融点が約６０℃と極めて低く、ガラス転移温度が−６０℃という半硬質系結晶性プラスチックであり、整形外科用のインプラントや骨組織再生用のバイオマテリアルとして広く使用されている。
発明者は、このＰＣＬ樹脂を有機溶剤に５〜２０重量％、好ましくは１０〜１５重量％溶かした溶剤を作り、織物構造体に塗り、乾燥により固化させることで、織物構造体のバインダーとして機能することを試行錯誤の上、知見するに至った。ここで、ＰＣＬ樹脂の濃度が５重量％より低くなると、ＰＬＡ繊維の交差部の接着強度が弱くなり剛性がよくなく、また、ＰＣＬ樹脂の濃度が２０重量％より高くなると、濃すぎてポーラスにならず、またＰＣＬ樹脂膜が厚すぎて生分解に時間がかかる。また、有機溶剤としてはアセトン、トルエン、アルコールなどを使用する。

本発明に係るスカフォールドは、生分解性樹脂の繊維と樹脂とで構成され、織物構造の骨格が繊維からなり、外殻は微小円孔を有する樹脂膜で覆われている。このため、スカフォールドに必要な強度や剛性を保ちながらも形を自由に変形させることが可能である。これにより手術の際には、患部の寸法に一致するように成形できるとともに、スカフォールドに注入された、組織再生に必要な細胞や栄養などが外部に漏出することがないといった効果がある。

そして、手術後には時間と共に外殻膜の円孔が生体内で生分解により大きくなって、組織再生に必要な成分を体内から取り入れることが可能になる。やがて組織再生と共に、スカフォールド自身は生分解して消失してしまう。このように本スカフォールドは、治療過程に対応してその機能を変化させるという効果も有する。

また、ＰＬＡ樹脂繊維による織物構造体とそれを覆うＰＣＬ樹脂膜により３次元構造体をつくり、欠損部を取り囲む軟組織の成長による肉芽などの近隣組織の浸入を防ぐ構造を設けることができ、特定の構造にすることで十分な強度を有することができ、人体の活動による荷重の支持も可能である。

さらに、バインダーであるＰＣＬ樹脂膜の厚さを変えることにより、施術後に欠損部との界面でただちに生分解させる構造を設けることができ、速やかにスカフォールド内に体液を循環させて組織再生によりよい環境を整えることができる。

この他、構造的に開口部を有することができ、臨床時に注射による細胞などの播種も可能である。

以下、本発明の実施の形態を図表、写真を示しながら、その性状、機械的性質や生分解特性について詳細に説明する。

本発明に係るスカフォールドの第１の形態は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）樹脂からなる繊維を織ることにより籠形の織物構造体を作製し、この織物構造体の内部にＰＬＡ繊維からなる綿を設け、かつ、この織物構造体にバインダーとしてＰＣＬ樹脂を用いたもので構成される。

図１に、本発明に係るスカフォールドの第１の形態の模式図を示す。
本発明に係るスカフォールドの第１の形態は、ＰＬＡ樹脂繊維１を編み上げることにより籠形の織物構造体２とし、それを覆う伸びに優れたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）樹脂膜３、及び織物構造体２の内部のＰＬＡ繊維綿４から構成されるものである。

ここでＰＬＡ樹脂は島津製作所製のラクティ（Ｒ）＃5000を用い、ＰＣＬ樹脂はダイセル化学工業製のセルグリーン（Ｒ）ＰＨ７を用いた。ＰＬＡ樹脂からなる繊維は、射出成形機により２００℃で紡糸し、適当な温度下で延伸ののち熱固定を行い、直径０．１mmのモノフィラメントとしたものを用いている。織物構造体は、このＰＬＡ繊維１本を織器で編み込み、籠形の組紐材としたものである。

この織物構造体を、トルエンにＰＣＬ樹脂を１５mas％溶かした溶剤に浸し、自然乾燥によって固化させた後、真空中に２４時間置きトルエンを蒸発させて硬化させた。特に、籠形の組紐材は、成形するために棒にかぶせてからＰＣＬ溶剤に含浸し、自然乾燥によって固化させている。図２にＰＣＬ溶剤に含浸する前の織物構造体の写真を、図３にＰＣＬ溶剤に含浸後の織物構造体のＳＥＭ写真を示す。図２と図３で直径が小さくなっているのは、引張りを加えた状態でＰＣＬ樹脂膜を形成したからである。

図３に示されるように、作製された織物構造体は、直径約２mmの断面積で、長さは１５mm（調整自由）である。この織物構造の空孔率は約９０％である。この織物構造の内部に、ＰＬＡ繊維からなる綿を設けることで、自由に空孔率を制御できるのである。空孔率は、織物構造を直径が一定な円柱と仮定し、ある長さに作製した織物構造体の体積を求め、その織物構造体に使用されたＰＬＡ繊維の体積を求めることにより算出している。

また、作製された織物構造の機械的特性を知るため、ＰＬＡ繊維だけの織物構造（Fabric）と、それにＰＣＬ樹脂膜で複合化したもの（Composite）の張力と変位の様子を図４に示す。初期接線係数（Initial tangent modulus）は、ＰＬＡ繊維だけの織物構造（Fabric）では0.0187（N/mm）であるのに対し、ＰＣＬ樹脂膜で複合化したもの（Composite）では9.97（N/mm）であり、強度が約５３０倍に上がっていることが示されている。ＰＣＬ樹脂を塗ることにより外殻に膜構造ができるので、効果的に剛性を高めることができるのである。尚、ＰＬＡ繊維に付着したＰＣＬ樹脂膜の膜厚は、図３から約２５μｍであった。

従来は、用いる材料と空孔率が決まれば、機械的特性は一意に定まってしまう。ところが、本スカフォールドでは、繊維の織り構造を覆うＰＣＬ樹脂の膜構造によって、剛性を５００倍以上増大させることができる。そして、この値は繊維径や織ピッチあるいは膜厚を変える事で変化させることが可能であり、人体での適用部位を広げることが可能となる。

本スカフォールドの必要な部分の膜厚を大きくすることで、欠損部に隣接する他の組織の浸入（肉芽の形成など）から、再生骨など本来の組織の生成を保護することができる。また、再生に必要な欠損部と接する部分では膜厚を薄くすることで、10μm径の多孔膜を形成できるため、手術後直ちに体液による生分解により孔径が増大する。これにより生体内の体液や栄養素あるいは酸素などが速やかにスカフォールドに浸透して、骨芽細胞などの成長に適した環境を作ることができる。
さらに、元の膜の孔径は微小なため、臨床時に注射器によって注入された細胞などが漏出することはないという有用な効果を持っている。

次に、本発明に係るスカフォールドの生分解による特性の変化について説明する。一般にPLAは、in vivoでも非酵素型の加水分解によって分子量が低下するため、in vitroとin vivoの加水分解挙動の間に差異はほとんどないと言われている。本スカフォールドの生分解による特性の変化に関しても、作製した織物構造体を生理食塩水に浸漬させることにより生分解を行った。

作製した織物構造体を、生理食塩水中に浸漬させることにより、生理食塩水による加水分解でＰＣＬ樹脂膜構造部の小孔が大きくなると共に合体していく結果が得られた。図５に、生理食塩水中でＰＣＬ樹脂膜の小孔が大きくなる様子を示す。織物構造体にコーティングするＰＣＬ樹脂膜の膜厚を場所により変化させることで、当該部位の生分解性が制御できることとなる。

上述の如く構成され、生分解性、強度、剛性に優れた本スカフォールドは、細胞などの播種が容易である、肉芽などの近隣組織の浸入を防止できる、適度な剛性と十分な強度を持っている、及び場所により生分解性が制御できるなどの機能を全て具備したものと言える。

本スカフォールドのアプリケーションとして、例えば、歯槽骨の欠損部に歯を囲むようにして、使用することが考えられる。図６に、本スカフォールドの応用の１つとして、歯槽骨の欠損部を組織再生する様子を模式図で表す。(a)は歯槽骨に欠損部がある状態、(b)ではその欠損部に作成した試験片を埋め込んだ状態、(c)は(b)での状態を上から見たもの、(d)では試験片が完全に生分解し完治した様子を表している。

歯に咀嚼力がかかり、その力は本スカフォールドにもかかる。また、スカフォールドの上には歯肉があり、その歯肉からも力がかかる。本発明に係るスカフォールドは強度と剛性に優れた特性を持っており、繊維の太さ、本数、空孔率、ＰＣＬ樹脂の膜厚をパラメータとして、かかる力に十分耐えられる設計構造とすることができるものである。

実際に歯槽骨などの欠損部に本スカフォールドを使用する場合においては、スカフォールドを滅菌処理する必要がある。本スカフォールドの特徴である強度・剛性を損なわないように滅菌処理を行う必要がある。紫外線照射（４８時間）、高温・高圧蒸気（１２０℃，０．１ＭPa，１０分）、ＥＯガス（エチレン・オキサイド・ガス）（５０℃，１時間）による滅菌処理によるＰＬＡ繊維の物理的特性変化を調べた。結果を下表に示す。また、図７に各滅菌処理後のＰＬＡ繊維の強度グラフ図を示す。

表１からＰＬＡ繊維は、ＥＯガス滅菌以外では４０％近い分子量の低下が認められた。また図７に示すように、滅菌処理としてＥＯガスを用いた場合が、最も強度・剛性を損なわないことがわかる。なお、熱分析には示差熱走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定分析を行った。また分子量の測定には液体クロマトグラフィ（島津製作所製ＬＣ−９４）を用いた。以上から、ＰＬＡ繊維の滅菌処理には、ＥＯガスが適しているといえる。

本発明に係るスカフォールドの第２の形態は、複数のＰＬＡ繊維を編むことによりロープ状の織物構造体を作製し、この織物構造体にバインダーとしてＰＣＬ樹脂を用いたもので構成される。ＰＬＡ繊維およびＰＣＬ樹脂は、実施例１と同じである。ロープ状の織物構造体では、ＰＬＡ繊維の太さ・本数を変えることにより様々な大きさの物が作ることができ、欠損部の大きさに応じて作製している。ここでは、0.２mmの径のＰＬＡ繊維を１６本用いて編み上げている。これは、歯槽骨などの小さな欠損部に用いることを目的としているためである。また、空孔率を大きくして細胞の着床率を上げようとするためである。ＰＣＬ樹脂膜のコーティングは実施例１と同じである。

図８にＰＣＬ溶剤に含浸する前の織物構造体の写真を、図９にＰＣＬ溶剤に含浸後の織物構造体のＳＥＭ写真を示す。図９に示されるように、作製された織物構造体は、直径約１．６mmの断面積で、長さは１５mm（調整自由）である。この織物構造の空孔率は約５０％である。

上述したように、生体内に大きな欠損空間が生じると、その部位は瘢痕性のコラーゲン組織によって補填されるため、欠損部を瘢痕組織に占有されないように、あらかじめ欠損部での再生のスペースを確保し、細胞の分化や増殖を支援するための場を欠損部に作ることが組織の再生に必要である。そして、組織再生に伴い、その場のスペースが小さくなるよう体内で分解される必要がある。従い、この組織再生の速度と体内での分解速度のバランスが重要である。

ここで、ロープ状の織物構造体からなるスカフォールドに関し、ＳＥＭによる生分解過程における形状変化を説明する。図１０は生理食塩水に浸漬前、図１１から図１５は、本スカフォールドを各々、１週間、２週間、４週間、８週間および１２週間、生理食塩水に浸漬させた状態を示している。各々（ａ）がＰＬＡ繊維の交差部、（ｂ）がＰＬＡ繊維の表面を示したものである。

表面に凹状のくぼみ穴が見られることより、被覆したＰＣＬ樹脂から先に生分解が始まっていることが分かる。ＰＣＬ樹脂は約１週間で生分解が始まり、２週間、４週間と時間が経過するごとに生分解が進んでいっている。しかし、８週間頃から表面の凹凸が逆に少なくなっている。これは、表層のＰＣＬ樹脂は生分解していき膜厚は薄くなっているのだが、ＰＬＡ繊維とＰＣＬ樹脂の界面では複合化することによりＰＬＡ繊維とＰＣＬ樹脂がお互いに化学的な影響を及ぼしており、ＰＣＬ樹脂の生分解の速度が遅くなっているために、一様な表面となっている。これは図１５でよく見ることができる。

また、繊維の交差部ではＰＣＬ樹脂が残っており、そこではＰＬＡ繊維同士が接着され繊維はほどけず形状が維持できている。すなわち、本スカフォールドは、１２週間浸漬するとＰＬＡ繊維はほとんど生分解することはなくＰＣＬ樹脂から先に生分解していくのであるが、繊維と樹脂の界面ではＰＣＬ樹脂の生分解の速度が遅くなっており、交差部はＰＣＬ樹脂で接着されたままとなっている。

一般にＰＬＡやＰＣＬは、生体外でも非酵素型の加水分解によって分子量が低下し、生体外と生体内の加水分解挙動の間に差異はほとんどないので、骨芽細胞などをのせて、手術し、歯槽骨の欠損部にいれたとしても繊維がほどけることなく形状が維持でき、強度もＰＣＬ樹脂が生分解するために低下するものの、ＰＬＡ繊維の強度はほとんど変化しない。

本発明に係るスカフォールドの第３の形態は、ＰＬＡ繊維を平織りとし、それを積層することにより成形して織物構造体を作製し、この織物構造体にバインダーとしてＰＣＬ樹脂を用いたもので構成される。ＰＡＬ繊維およびＰＣＬ樹脂は、実施例１と同じである。本スカフォールドは、立体的かつ細胞が着床する空間を有する構造であり、非常に強度が高く、骨組織の再生のスカフォールドとして利用することができる。

本スカフォールドの作製方法は、先ずＰＬＡ繊維を縦と横に順番に織って積層し、それにアセトンにＰＣＬ樹脂を５重量％溶かした溶剤を塗り自然乾燥させる。次にこれを１２枚重ねて同じ溶剤を塗り、錘を載せて２４時間真空中に置いてアセトンを蒸発させて硬化させるものである。補助骨材として利用する場合、補助骨材のサイズに合わせて積層数を増やし、また、精密切断機などで任意の形状・大きさに切断するのである。図１６の（ａ）に本スカフォールドの形状（ここでは直方体）、（ｂ）（ｃ）にＰＣＬ樹脂膜を塗布前後のＳＥＭ写真を示す。

本発明に係るスカフォールドの第４の形態は、ＰＬＡ繊維を互いに直交するＸ方向、Ｙ方向で形成される面内およびその面に直交するＺ方向に織込み、３次元織物構造体を作製し、この織物構造体にバインダーとしてＰＣＬ樹脂を用いたもので構成される。ＰＡＬ樹脂繊維およびＰＣＬ樹脂は、実施例１と同じである。本スカフォールドは、立体的かつ細胞が着床する空間を有する構造であり、実施例３で示したものよりもさらに、Ｚ方向の強度が高まり、同様に骨組織の再生のスカフォールドとして利用することができる。図１７に本スカフォールドにおけるＰＬＡ繊維の織り込みの模式図を示す。

（ＰＬＡ繊維綿の量の違いによる剛性の変化）
次に、本発明に係るスカフォールドの第１の形態に関し、本スカフォールドの内部に入れたＰＬＡ繊維綿４の量の違いによる剛性の変化について図１８〜２０を参照しながら説明する。図１８は、スカフォールドの内部にＰＬＡ繊維綿を挿入したものの写真である。図１８に図示するように、引張試験はスカフォールドの長手方向（軸方向）に引っ張って剛性を調べたもので、圧縮試験はスカフォールドの径方向に厚さ３ｍｍ幅２０ｍｍの剛体の板で挟んで圧縮して剛性を調べたものである。

図１９は、ＰＬＡ繊維綿の挿入による剛性の変化をしめすグラフ(軸方向の引張試験結果)である。
図１９に示されるCASEＩの条件は、スカフォールドと同質量のＰＬＡ繊維綿をスカフォールド内部に挿入したもので、CASEIIの条件は、スカフォールドの２倍の質量のＰＬＡ繊維綿を挿入したものである。図１９のグラフから、CASEＩの条件のスカフォールドで、内部にＰＬＡ繊維綿を挿入していない空のスカフォールド（図１９中、Scaffoldのプロット）と比較して３．２倍の剛性増大があり、一方、CASEIIの条件のスカフォールドで、内部にＰＬＡ繊維綿を挿入していない空のスカフォールドと比較して４．０倍の剛性増大があることが理解できる。
ここで、本スカフォールドのＰＬＡ繊維直径は0.085ｍｍで、内部に入れたＰＬＡ繊維綿の繊維直径は0.067ｍｍである。

また、図２０は、ＰＬＡ繊維綿の挿入による剛性の変化をしめすグラフ(径方向の圧縮試験結果)である。
図２０に示されるCASEＩ，IIの条件は図１９と同じである。図２０のグラフから、径方向に1ｍｍ変形させるのに必要な力は、Scaffoldでは0.67N/mm，CaseＩでは0.98N/mm（Scaffold の1.46倍），CaseIIでは1.56N/mm（Scaffold の2.33倍）であった。これらから、スカフォールド内部にＰＬＡ繊維綿を挿入したものは、内部にＰＬＡ繊維綿を挿入していないスカフォールドと比較して、引張剛性と曲げ剛性とも向上していることが理解できる。

（本スカフォールドの製造方法）
本スカフォールドの製造方法について説明する。本スカフォールドでは織物とするため、ＰＬＡは繊維に成形して使用している。ＰＬＡの化学式を下記に示す。ＦＤＡ（米国食品医薬品局）認定の医療用のＰＬＡペレット（米国ＡＰＩ社製）を、クリーンルームに置かれた射出成形機を用いて溶融紡糸法で、ＰＬＡ繊維に成形している。ここで溶融紡糸法とは、原料を溶かした状態で口金から押し出して繊維状にした後、冷やして固めて繊維を作る方法である。

また、バインダーとして用いた樹脂はポリカプロラクトン(ＰＣＬ)のペレット（米国ＡＰＩ社製）を用いている。この樹脂もＦＤＡ（米国食品医薬品局）認定の医療用のものである。
ＰＣＬは、ε-カプロラクトン（ε-CL）が熱と触媒により環を開き，直鎖を作る開環重合により得られる。ＰＣＬの化学式を下記に示す。ＰＣＬはメチレン基とエステル基の単一ユニットの繰り返し構造を持つ熱可塑性ポリマーであり、また，分子鎖のコンフォーメーションの可撓性(flexibility)が大きいことを反映した軟質性ポリマーである。

ＰＣＬを織物のスカフォールドの強度と剛性を上げるためにＰＬＡ繊維の構造体にコーティングするバインダーとして使用する。ＰＬＡが溶けずＰＣＬを溶解させる溶媒としてアセトンを用いている。アセトンは生体内にも微量が存在するのでスカフォールドに用いることができる。溶解方法は自然に攪拌するだけでは時間がかかるので、超音波を用いることにより約３０分で溶解させることができる。時間が経過すると、ＰＣＬが白く固形化して分離するが、超音波で攪拌することで再び溶解させることができるのである。

（細胞培養条件について）
本スカフォールドに用いる細胞は、マウスの骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1細胞（理研BRC）を用いている。これを播種して、スカフォールドを培地上で６週間培養した。In-vitroでの培養条件を下記表２に示す。骨芽細胞様細胞とは骨芽細胞になる前の細胞であり，MC3T3-E1細胞は骨芽細胞に分化して骨を作る細胞株であり、コラーゲンを比較的大量に産出しているものである。

（ＡＬＰ活性の測定方法）
細胞を播種し9日間培養した後に，分化させるために培地に５０ μｇ／ｍｌのアスコルビン酸，１０ｍＭのβ−グリセロリン酸を加え培養した。培養期間は１および２週とし, その時のＡＬＰ（Alkaline phosphatase）活性の測定を行った。ここでは, スカフォールドと比較するために、細胞を同時にディッシュやコラーゲン綿でも培養した。
細胞が播種されたスカフォールドを、0.2%のポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル, 10 mMのTris-HCl, 1 mMのMgCl_2 を混合したpH 7.5の溶液に浸し、その後、その溶液よりＡＬＰ活性を測定した。

ＡＬＰ活性は、 p-ニトロフェニルリン酸を基質としたALP活性測定キット（商標Wako LabAssay ALP）を用い、マイクプレートリーダーで測定した。測定原理としては、 p-ニトロフェニルリン酸を含む炭酸塩緩衝液(pH 9.8)中で検体を作用させると、検体中のALPによりp-ニトロフェニルリン酸はp-ニトロフェノールとリン酸に分解され、生成したp-ニトロフェノールはアルカリ性側で黄色を呈する。この405 nmの吸光度を測定することにより検体中のALP活性値を求めるというものである。

ＡＬＰ活性の結果を図３３に示す。ここでは同時にDNA量も測定し、単位DNA量あたりに換算している。また、培養9日目で分化誘導かけた時間を0 sとし、pH 9.8, 37℃で、１分間に1 nmolのp-フェノールを生成する酵素活性を1 unitとしている。

３種類共、０sの時点でALP活性が上がっているが、MC3T3-E1細胞では分化誘導をかけなくてもALP活性が上昇すると言われている。
また、ディッシュで培養したものに比べ、スカフォールドおよびコラーゲン綿で培養したほうがＡＬＰ活性の上昇が大きい。コラーゲン綿での培養はディッシュで培養した時よりもＡＬＰ活性の上昇が大きいと言われているが、スカフォールドでもコラーゲン綿と同じように大きく上昇しており, コラーゲン綿で培養した細胞と同じように分化しているのが分かる。これは、ディッシュ上では２次元の培養になるが、スカフォールやコラーゲン綿では３次元での培養となるので、形状の違いによる影響（ポーラスな形状のため表面積が大きい）といえよう。

（生分解性について）
マウスの骨芽細胞様細胞を播種し培地上で生分解させたスカフォールドの引張り試験の結果を図２１に示す。１週目ではほぼVirginとほぼ等しい剛性であるが、２週目以降は急激に剛性が低下していた。６週目ではVirginの約1/10の強度にまで低下している。一定時間は剛性があり，その後急激に剛性が低下するという機械的特性の変化は，組織が再生を始めるまでは足場として機能し，組織が再生し始めた後は組織の再生を阻害することが少ないと言える。このことは組織再生用足場として適した特性であると理解される。

また，培地から取り出したスカフォールドにグルタルアルデヒド固定液，オスミウム酸固定液を用いて細胞を固定した後に，水分をエタノールで脱水置換しデシケータ内で自然乾燥させることにより，ＳＥＭ観察用のスカフォールド片を作成している。グルタルアルデヒド固定液は主にタンパク質，核たんぱく質，DNA，RNAの固定に用いられ，細胞成分への浸透性が良く，オスミウム酸固定液は脂質・リン脂質分の固定に使用されているものである。この方法を用いることで，特殊な装置を用いず，常温環境下でＳＥＭ観察用の試験片を作成することができる。この後，Auコーティングを施し，走査電子顕微鏡(ＳＥＭ：Scanning electron microscope、日本電子製;JSM-5300)による観察を行った．

スカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で３日間、１週間、２週間、４週間および６週間培養した時の顕微鏡での観察を図２２から図２６に示す。図２２は細胞播種後３日間の状態，図２３は細胞播種後１週間の状態，図２４は細胞播種後２週間の状態，図２５は細胞播種後４週間の状態，図２６は細胞播種後６週間の状態を表したものである。

次に、スカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で１週間、２週間、４週間および６週間培養した時のＳＥＭ写真を図２７から図３１に示す。図２７は滅菌処理後の細胞を播種する前の状態，図２８は細胞播種後１週間の状態，図２９は細胞播種後２週間の状態，図３０は細胞播種後４週間の状態，図３２は細胞播種後６週間の状態を表したものである。

図２７から図３１から時間が経過してもＰＬＡ繊維，ＰＣＬ樹脂の表面にはあまり変化が見られないことが理解できる。このことからＰＬＡ，ＰＣＬの加水分解が表面分解ではなく，塊状分解であることが分かる。また，強度が低下していてもＰＣＬ樹脂がバインダーとして依然存在し同じ形状を維持できていることが示されている。
図２７から細胞を播種する前の状態でＰＬＡ繊維に割れが生じていることが分かる。これは滅菌処理を行う前にSEM観察を行ったときには確認されなかったので，滅菌処理の影響であると考えられる。0.10mmのＰＬＡ繊維が繊維軸方向に結晶化していて裂けやすいことやスカフォールドの直径が約２mmに対して0.10mmのＰＬＡ繊維の降伏する時の曲率ρが1.78と小さいことも原因として考えられる．このことはスカフォールドに強度低下をもたらす要因としてあげられる。

図２２から図２６に示した顕微鏡での観察と図２７から図３１に示したＳＥＭ写真とから、時間の経過とともに細胞がスカフォールド上で増殖していく様子が確認される。ＳＥＭでの観察ではＰＬＡ繊維間の細胞の膜が時間の経過とともに割れてしまっているが，これはＳＥＭ用の試験片にする前の顕微鏡での観察では確認されていないので，細胞の膜厚が大きくなり自然乾燥時に割れてしまったものと考えられる．このことからも細胞の増殖が確認できる．ＳＥＭでの観察からＰＬＡ繊維の表面に見える繊維の幅が小さくなっていることからも細胞がだんだん増大していることが分かる．また，顕微鏡での観察からスカフォールド上での細胞の接着性は良好であるということが分かる。

（歯槽骨の再生）
次に、歯槽骨の再生手技に関し、培養骨と本発明に係るスカフォールドの移植手順について説明する。先ず、手術の１カ月前に、腸骨から骨髄液（20ml）を採取し、この中から間葉系幹細胞を分離する。これを約３週間培養して増やしたものを、その後の約１週間で骨芽細胞に分化誘導する。細胞の分化誘導条件は、細胞を播種して４日後に、β-グリセロリン酸（10 mM），デキサメタゾン（10-8 M），アスコルビン酸（50 μg/ml）を培地に加えることにより培養を行っている。
また、手術の前に患者本人から血液（100〜200ml）を採取し、遠心分離を行い多血小板血漿（ＰＲＰ）を取り出す。
手術直前にこれらを混ぜ合わせたもの（培養骨）を、本スカフォールドの中に注入し、それを歯槽骨欠損部分に挿入または埋入する。
図３２に、本発明に係るスカフォールドの移植手術前と移植手術後（８Ｗｅｅｋ後）の歯槽骨欠損部分のレントゲン写真を示す。移植手術前は歯と歯ぐきの間に溝があったのが、移植手術後（８Ｗｅｅｋ後）は、歯槽骨が再生されて溝が小さくなっていることが理解できる。

本発明は、医療用や学術研究実験用の組織再生用足場（スカフォールド）に用いるバイオ材料としての利用が期待される。特に、歯槽骨や骨組織再生用足場に関して、幹細胞や骨芽細胞などを本発明に係る構造体の内部に注入し、組織の欠損部に施術することで、組織の再生を図ることができる材料としての利用可能性が高い。

本発明に係るスカフォールドの第１の形態の模式図を示す。ＰＣＬ溶剤に含浸する前の織物構造体の写真を示す。ＰＣＬ溶剤に含浸後の織物構造体のＳＥＭ写真を示す。ＰＣＬ樹脂膜で複合化したもの（Composite）の張力と変位の関係を示すグラフ図である。生理食塩水中でＰＣＬ樹脂膜の小孔が大きくなる様子を示す写真である。（ａ）は第１の形態のスカフォールドの外膜部を、（ｂ）は外膜部の膜の孔径１０μｍの様子を、（ｃ）は生理食塩水中１週間後の生分解による孔の拡大と合体する様子を示している。歯槽骨の欠損部を組織再生する様子を模式図に示している。(a)は歯槽骨に欠損部がある状態、(b)ではその欠損部に作成した試験片を埋め込んだ状態、(c)は(b)での状態を上から見たもの、(d)では試験片が完全に生分解し完治した様子を表している。各滅菌処理後の繊維の強度グラフ図を示す。ＰＣＬ溶剤に含浸する前の織物構造体の写真を示す。ＰＣＬ溶剤に含浸後の織物構造体のＳＥＭ写真を示す。第２の形態のスカフォールドに関して、生分解過程における一連の形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に浸漬前）である。（ａ）がＰＬＡ繊維の交差部、（ｂ）がＰＬＡ繊維の表面を示している。形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に１週間浸漬させた状態）形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に２週間浸漬させた状態）形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に４週間浸漬させた状態）形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に８週間浸漬させた状態）形状変化を示すＳＥＭ写真（生理食塩水に１２週間浸漬させた状態）第３の形態のスカフォールドに関して、（ａ）に本スカフォールドの形状（ここでは直方体）、（ｂ）と（ｃ）にＰＣＬ樹脂膜を塗布前後のＳＥＭ写真を示す。第４の形態のスカフォールドに関して、ＰＬＡ繊維の織り込みの模式図を示す。本発明に係るスカフォールドの第１の形態（スカフォールドの内部にＰＬＡ繊維綿を挿入したもの）の写真ＰＬＡ繊維綿の挿入による剛性の変化をしめすグラフ(軸方向の引張試験結果) ＰＬＡ繊維綿の挿入による剛性の変化をしめすグラフ(径方向の圧縮試験結果) マウスの骨芽細胞様細胞を播種し培地上で生分解させたスカフォールドの引張り試験の結果グラフ図本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で３日間培養した時の顕微鏡での観察写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で１週間培養した時の顕微鏡での観察写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で２週間培養した時の顕微鏡での観察写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で４週間培養した時の顕微鏡での観察写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で６週間培養した時の顕微鏡での観察写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種する前のＳＥＭ写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で１週間培養した時のＳＥＭ写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で２週間培養した時のＳＥＭ写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で４週間培養した時のＳＥＭ写真本発明のスカフォールドにマウスの骨芽細胞様細胞を播種して培地上で６週間培養した時のＳＥＭ写真本発明に係るスカフォールドの移植手術前と移植手術後（８Ｗｅｅｋ後）の歯槽骨欠損部分のレントゲン写真ＡＬＰ活性の測定結果

符号の説明

１ＰＬＡ樹脂繊維
２籠形の織物構造体
３ＰＣＬ樹脂膜
４ＰＬＡ繊維綿
５スカフォールド
６歯
７歯肉
８歯槽骨

Claims

ポリ乳酸樹脂の織物構造体とバインダーとしてポリカプロラクトン樹脂を用いた複合材料により構成される組織再生用足場であって、前記織物構造体の内部に空洞を有し、前記空洞内部に綿状の生分解性ポリマーを有し、前記ポリカプロラクトン樹脂によりポリ乳酸樹脂繊維同士の接着とポリ乳酸樹脂繊維間に外殻に微小円孔を有する膜構造を形成させ、前記織物構造体と該織物構造体を覆うポリカプロラクトン樹脂膜により３次元構造体を成し、ポリ乳酸樹脂繊維の径、前記織物構造体の織のピッチ、バインダーの前記ポリカプロラクトン樹脂膜の膜厚、前記空洞内部の綿状の生分解ポリマーの量をパラメータとして、前記織物構造体の剛性，空隙率，生分解速度を制御し得ることを特徴とする組織再生用足場。
前記織物構造体が組み紐型、籠型またはロープ状、若しくは、これらの組み合わせの構造体であることを特徴とする請求項１に記載の組織再生用足場。
前記織物構造体が平織りを積層したものであることを特徴とする請求項１に記載の組織再生用足場。
請求項１の組織再生用足場の製造方法であって、前記織物構造体にバインダーとして前記ポリカプロラクトン樹脂をコーティングする際、有機溶剤にポリカプロラクトン樹脂を５〜２０重量％溶かした溶剤を前記織物構造体に塗り、乾燥により固化させることで、前記織物構造体のバインダーとすることを特徴とする組織再生用足場の製造方法。
前記有機溶剤がアセトンであることを特徴とする請求項４に記載の組織再生用足場の製造方法。
更に、ＥＯガスを用いた滅菌処理を含むことを特徴とする請求項４に記載の組織再生用足場の製造方法。