WO2024070172A1 - 歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤及び分化誘導方法 - Google Patents

歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤及び分化誘導方法 Download PDF

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differentiation
cells
acid
odontoblasts
dental pulp
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隆 山城
俊博 犬伏
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国立大学法人大阪大学
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the field of dentin regenerative medicine. Specifically, the present invention relates to a differentiation inducer for pulp cells to odontoblasts, and a method for inducing differentiation from pulp cells to odontoblasts. Furthermore, the present invention relates to a composition for dentin regeneration and a pulp capping material that contain the differentiation inducer as an active ingredient.
  • Dental pulp is a vascular connective tissue that fills the cavity inside the tooth called the pulp cavity, and is a non-calcified tissue formed from the mesodermally derived dental papilla.
  • dentin is a hard calcified tissue that surrounds the pulp cavity, and is produced by odontoblasts that differentiate from pulp cells.
  • Direct pulp capping agents induce reparative dentin on the exposed pulp surface, which is then covered again with reparative dentin, thereby repairing caries that has reached the pulp without the need to remove it.
  • Calcium hydroxide preparations and mineral trioxide aggregate (MTA) have traditionally been used as direct pulp capping agents. However, these do not have the effect of inducing differentiation into odontoblasts, and have not been able to efficiently promote dentin formation. Therefore, the application of direct pulp capping is limited to cases where the extent of caries is small and the exposed surface of the pulp after drilling and removal is small.
  • the nerves that come into contact with the calcium hydroxide preparation cause the pulp tissue to degenerate and necrotize, and the subsequent repair mechanism regenerates dentin, which has problems such as being time-consuming, inefficient, and with an uncertain prognosis.
  • Patent Document 1 Materials that have been reported to have a dentin formation promoting effect include bovine blood extracts (Patent Document 1), polysaccharides such as N-acetyl-glucosamine (Patent Document 2), and bone morphogenetic proteins (BMPs).
  • Patent Document 2 a dentin formation pulp capping agent containing BMP as an active ingredient.
  • Patent Document 3 a dentin formation pulp capping agent containing BMP as an active ingredient has been disclosed.
  • the inventors have also found that sodium chlorate, sodium perchlorate, lithium chloride, etc. induce differentiation of dental pulp cells into odontoblasts and have an odontoblast formation promoting effect.
  • Sodium chlorate, sodium perchlorate, lithium chloride, etc. activate the Wnt signaling pathway, causing dental pulp cells to differentiate into odontoblasts (Patent Document 4).
  • a dentin regeneration pulp capping agent material containing a saponified ethylene-vinyl acetate copolymer (A) with collagen immobilized thereon and a binder (B) has been disclosed (Patent Document 5).
  • a method for regenerating dentin a method has been disclosed in which human dental pulp cells are cultured in the presence of 1,25 (dihydroxy) vitamin D3 , dexamethasone and ⁇ -glycerophosphate to differentiate them into odontoblasts, and the cells are cultured and/or transplanted together with a carrier or the like to regenerate dentin (Patent Documents 6 and 7).
  • a dentin formation pulp capping agent (material) using polyphosphoric acid has been disclosed (Patent Document 8).
  • Non-Patent Document 1 a sample in which cultured human dental pulp cells were seeded on a powdered composite of hydroxyapatite and tricalcium phosphate was subcutaneously transplanted into a nude mouse and excised six weeks later, and the formation of hard tissue was confirmed from hematoxylin/eosin stained images after excision.
  • chlorates such as sodium chlorate and sodium perchlorate have a strong oxidizing power due to active oxygen, and it is difficult to control the oxidation reaction of these chlorates. Once a radical reaction occurs, the reaction progresses rapidly, so it is not easy to maintain the effect or use it stably.
  • a highly safe and highly effective disinfectant which includes a radical generating catalyst and a radical generating source, the radical generating catalyst including one or both of an organic ammonium and an organic compound having at least one of Lewis acidity and Brönsted acidity (Patent Document 9).
  • a radical generating catalyst that can generate (manufacture) radicals under mild conditions (Patent Document 10).
  • on-demand generation hypochlorite ion aqueous solution contains hypochlorite ions that generate the necessary amount of chlorine dioxide components in water only when bacteria, viruses, etc. that should react are present. As a result, the effect is maintained for a long time, and the reaction stops when it is no longer needed, making it highly safe, and it is applied in a variety of fields, not just infection control.
  • on-demand generation hypochlorite ion aqueous solution inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts, or of its ability to promote dentin formation.
  • JP 2002-363084 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 06-256132 Japanese Patent Application Laid-Open No. 06-340555 Patent No. 5808053 JP 2004-292433 A JP 2005-341961 A JP 2006-211957 A JP 2005-263681 A Patent No. 6236057 International Publication No. 2018/230743
  • the objective of the present invention is to provide an excellent agent and method for inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts. It is also an objective of the present invention to provide an excellent pharmaceutical composition and pulp capping agent for dentin regeneration.
  • a differentiation inducer for dental pulp cells into odontoblasts which contains an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ions, and hypohalic acid salts, induces differentiation from dental pulp cells into odontoblasts, thus completing the present invention.
  • a pharmaceutical composition for dentin regeneration and/or a pulp capping agent which contains the differentiation inducer as an active ingredient, has the effect of promoting dentin formation, thus completing the present invention.
  • the differentiation inducer induces desulfation of sulfate groups of heparan sulfate proteoglycan on the surface of dental pulp cells, thereby inducing differentiation from dental pulp cells into odontoblasts.
  • the present invention comprises the following.
  • An ammonium salt represented by the following chemical formula (XI) An agent for inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts, comprising at least one selected from the group consisting of a halous acid, a halous acid ion, and a halous acid salt.
  • R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 each represent a hydrogen atom or an alkyl group, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond, an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 may be the same or different;
  • X- is an anion. 2.
  • a pulp-capping agent comprising the differentiation inducer according to the preceding paragraph 1 as an active ingredient. 8.
  • R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 each represent a hydrogen atom or an alkyl group, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond, an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 may be the same or different; X- is an anion.
  • the ammonium salt represented by the chemical formula (XI) is benzethonium chloride.
  • the halogenous acid is chlorous acid.
  • An ammonium salt represented by the following chemical formula (XI) A method for inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts, comprising using at least one selected from the group consisting of a halous acid, a halous acid ion, and a halous acid salt.
  • R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 each represent a hydrogen atom or an alkyl group, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond, an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 may be the same or different; X- is an anion.
  • the differentiation induction method according to the preceding paragraph A wherein the ammonium salt represented by the chemical formula (XI) is benzethonium chloride.
  • D An ammonium salt represented by the following chemical formula (XI): A method for regenerating dentin, comprising using at least one selected from the group consisting of a halous acid, a halous acid ion, and a halous acid salt.
  • R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 each represent a hydrogen atom or an alkyl group, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond, an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 may be the same or different; X- is an anion.
  • E. The method for regenerating dentin according to the preceding paragraph D, wherein the ammonium salt represented by the chemical formula (XI) is benzethonium chloride.
  • R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 each represent a hydrogen atom or an alkyl group, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond, an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 , and R 41 may be the same or different; X- is an anion. H.
  • Axin2 axis inhibition protein 2
  • Dspp distalophosphoprotein
  • Dmp1 distalin matrix protein 1
  • the differentiation inducer of the present invention can increase the expression of differentiation markers such as Axin2, Dspp, and Dmp1 without causing cytotoxicity at low concentrations, and can promote the production of dentin-like calcified materials.
  • a pharmaceutical composition for dentin regeneration and/or a pulp capping agent containing the differentiation inducer of the present invention as an active ingredient can induce differentiation of dental pulp cells into odontoblasts and promote dentin formation.
  • Example 1 shows the results of evaluating the cytotoxicity of mouse dental pulp cells (mDPSC cells) by the MTT method when the cells were cultured after adding various concentrations of aqueous solutions of chlorite ions that were generated on demand.
  • Example 2 shows the desulfation of sulfate groups of heparan sulfate proteoglycan (HSPG) on the cell surface when mouse dental pulp cells (mDPSC cells) were cultured with an aqueous solution of freshly generated chlorite ions (Example 2).
  • HSPG heparan sulfate proteoglycan
  • the figures show the expression of Axin2 and Dspp 3 days after addition, and Dmp1 6 days after addition, when mouse dental pulp cells (mDPSC cells) were cultured with an aqueous solution of chlorite ions that can be generated on demand (Example 3).
  • the graph shows calcification after 2 weeks of culturing hDPSC cells, which are human dental pulp cells, with various concentrations of aqueous solutions of chlorite ions generated on demand (Example 4).
  • Example 5 shows the expression of Dspp and Dmp1 after 2 weeks of culturing human dental pulp cells (hDPSC cells) with an aqueous solution of chlorite ion that can be generated on demand (Example 5).
  • Example 6 shows the expression of Dspp 3 days after addition of an aqueous solution of freshly generated chlorite ions and/or lithium chloride to mouse dental pulp cells (mDPSC cells). The results are shown in Table 1. The cytotoxicity of mouse dental pulp cells (mDPSC cells) was evaluated by the MTT method when various concentrations of aqueous solutions of chlorite ions were added to the cells and cultured. (Reference Example 1) 1 shows the expression of Dspp and Dmp1 when mouse dental pulp cells (mDPSC cells) were cultured with various concentrations of aqueous solutions of chlorite ions (Reference Example 2). Fig.
  • FIG. 9 shows dentin formation when mouse incisors are cultured after adding an aqueous solution of hypochlorite ions that can be generated on demand.
  • Fig. 9A shows sagittal and transverse cross-sectional images of a mouse mandibular incisor.
  • Fig. 9B shows the thickness of dentin on the labial and lingual sides of a mouse incisor.
  • Fig. 9C shows a sagittal tissue image of a mouse incisor. (Example 7)
  • the present invention relates to an agent for inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts, which comprises an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ions, and hypohalic acid salts.
  • the differentiation inducer of the present invention contains an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ion, and hypohalic acid salt.
  • the "ammonium salt” in the present invention can refer to the ammonium salts exemplified in, for example, Patent Document 9 and Patent Document 10.
  • ammonium salt in the present invention is represented, for example, by the following chemical formula (XI).
  • R 11 , R 21 , R 31 and R 41 are each a hydrogen atom or an alkyl group (e.g., a linear or branched alkyl group having 1 to 40 carbon atoms), which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond or an amide bond, or an aromatic ring; R 11 , R 21 , R 31 and R 41 may be the same or different; X ⁇ is an anion.
  • ammonium salt represented by the chemical formula (XI) may be, for example, an ammonium salt represented by the following chemical formula (XII).
  • R 111 is an alkyl group having 5 to 40 carbon atoms, which may contain an ether bond, a carbonyl group, an ester bond or an amide bond, or an aromatic ring; R 21 and X ⁇ are the same as those in the above formula (XI).
  • R 21 may be, for example, a methyl group or a benzyl group, and the benzyl group may or may not have one or more hydrogen atoms in the benzene ring substituted with an arbitrary substituent, and the arbitrary substituent may be, for example, an alkyl group, an unsaturated aliphatic hydrocarbon group, an aryl group, a heteroaryl group, a halogen, a hydroxy group (-OH), a mercapto group (-SH), or an alkylthio group (-SR, R is an alkyl group).
  • ammonium salt represented by the chemical formula (XII) may be, for example, an ammonium salt represented by the following chemical formula (XIII).
  • the ammonium salt represented by the chemical formula (XI) is, for example, benzethonium chloride, benzalkonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride, tetramethylammonium chloride, ammonium chloride, methylammonium chloride, tetrabutylammonium chloride, cetylpyridinium chloride, hexadecyltrimethylammonium bromide, dequalinium chloride, edrophonium, didecyldimethylammonium chloride, benzyltriethylammonium chloride, oxitropium, carbachol, glycopyrronium, safranine, sinapine, tetraethylammonium bromide, ammonium, hexadecyltrimethylammonium bromide, suxamethonium, sphingomyelin, denatonium, trigonelline, neos
  • Benzethonium chloride (Bzn + Cl - ) can be represented, for example, by the following chemical formula: Benzalkonium chloride can be represented, for example, by the above-mentioned chemical formula (XIII): where R 111 is an alkyl group having 8 to 18 carbon atoms and X - is a chloride ion.
  • the Lewis acidity of the ammonium salt in the present invention is, for example, 0.4 eV or more, 0.5 eV or more, or 0.6 eV or more.
  • the upper limit of the Lewis acidity is not particularly limited, but is, for example, 20 eV or less.
  • hypohalous acid is preferably hypochlorous acid
  • hypohalous acid salts is preferably hypochlorite ion
  • the differentiation inducer of the present invention may contain a substance having at least one of Lewis acidity and Bronsted acidity as exemplified in Patent Document 9 and/or Patent Document 10, an amino acid, a peptide, a phospholipid, a sulfonic acid amine or its ammonium, a nicotinic acid amine or its ammonium and a nitrite amine or nitrite ammonium, an oxoacid or its salt, or an electron donor-acceptor linked molecule.
  • the combination of "ammonium salt” and "at least one selected from the group consisting of hypohalous acid, hypohalous acid ion, and hypohalous acid salts" contained in the differentiation inducer of the present invention can be appropriately selected, but a preferred combination is benzenethonium chloride as the "ammonium salt” and hypochlorite ion as the "at least one selected from the group consisting of hypohalous acid, hypohalous acid ion, and hypohalous acid salts".
  • Patent Document 10 indicates that a drug produced by the method of the document from an aqueous solution of sodium hypochlorite and an aqueous solution of benzenethonium chloride and adjusting the pH is MA-T (registered trademark).
  • MA-T (registered trademark) is an aqueous solution of hypochlorite ions that is generated on demand.
  • An aqueous solution of hypochlorite ions that is generated on demand (MA-T (registered trademark), manufactured by Acenet Co., Ltd.) is commercially available as a disinfectant, and is a system that generates the minimum amount of chlorine dioxide components in water when it is necessary to generate radicals.
  • Patent Document 10 discloses that ammonium salts such as benzenethonium chloride act as radical generating catalysts for sodium hypochlorite, which is a radical generating source, to generate chlorine dioxide radicals (Patent Document 10).
  • the “differentiation inducer” of the present invention promotes differentiation of dental pulp cells into odontoblasts by activating the Wnt signaling pathway.
  • Wnt is one of the intercellular signaling molecules, and currently, more than 17 types are known as the Wnt family.
  • Wnt10a is expressed in the basement membrane, and among Wnt molecules other than Wnt10a, Wnt5a and Wnt10b are expressed in ameloblasts and cementoblasts.
  • the type of Wnt activated in the Wnt signaling pathway is not particularly limited, but in order to induce differentiation of dental pulp cells into odontoblasts, it is particularly preferable to activate the pathway including Wnt10a.
  • Patent Document 4 discloses that sodium chlorate and the like removes sulfate groups from heparan sulfate proteoglycans, activating the Wnt signaling pathway, and thereby inducing differentiation of dental pulp cells into odontoblasts.
  • oxidizing agents such as sodium chlorate and sodium chlorite
  • the reaction proceeds rapidly, making it difficult to maintain the effect or use it stably, and particularly difficult to maintain a constant concentration at room temperature.
  • the differentiation inducer of the present invention can remove sulfate groups from heparan sulfate proteoglycan, and since it is possible to efficiently control the radical reaction as described above, the differentiation inducer of the present invention is considered to be highly safe.
  • the differentiation inducer of the present invention may contain lithium chloride, which can activate other Wnt signaling pathways, as exemplified in Patent Document 4.
  • the differentiation inducer of the present invention which contains at least one selected from the group consisting of ammonium salt, halous acid, halous acid ion, and halous acid salt, and further contains lithium chloride, further promotes differentiation into odontoblasts (Example 6).
  • a concentration that does not cause cytotoxicity includes the concentration of the pharmaceutical composition or pulp-capping agent of the present invention administered at one time.
  • the content of ammonium salt or at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ion and hypohalic acid salts in the differentiation inducer of the present invention, and the concentration ratio of ammonium salt to at least one selected from hypohalic acid, hypohalic acid ion and hypohalic acid salts in the differentiation inducer of the present invention are not particularly limited and can be set appropriately, and for example, Patent Document 9 or Patent Document 10 can be referred to.
  • the differentiation inducer of the present invention may further contain one or more types of water, organic solvent, pH adjuster or buffer agent, etc., as exemplified in Patent Document 9 or Patent Document 10, and the state of the "solvent” and "solute” in the differentiation inducer of the present invention is as described in Patent Document 9 or Patent Document 10.
  • the differentiation inducer of the present invention may be, for example, liquid, solid, or semi-solid, but is preferably liquid, and the differentiation inducer of the present invention may be, for example, acidic or not acidic, basic or not basic, neutral or not neutral, but is preferably not acidic.
  • the pH of the differentiation inducer of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, 4.0 or more, 4.5 or more, 5.0 or more, 5.5 or more, 6.0 or more, 6.5 or more, 7.0 or more, or 7.5 or more, or 11.5 or less, 11.0 or less, 10.5 or less, 10.0 or less, 9.5 or less, 9.0 or less, 8.5 or less, 8.0 or less, or 7.5 or less.
  • the differentiation inducer of the present invention can be produced, for example, by mixing an ammonium salt with at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ions, and hypohalic acid salts, and, if necessary, with at least one of the water and the organic solvent.
  • an ammonium salt with at least one selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ions, and hypohalic acid salts, and, if necessary, with at least one of the water and the organic solvent.
  • it can be produced by the method described in Patent Document 9 or Patent Document 10, but is not limited thereto.
  • the present invention also extends to a pharmaceutical composition for dentin regeneration, which contains the above-mentioned differentiation inducer as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has the effect of inducing differentiation from dental pulp to odontoblasts and promoting dentin formation, and is therefore expected to regenerate dentin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in normal caries treatments, for example, by applying or filling the cavity of the dental pulp after pulp extraction.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with a direct or indirect pulp capping agent, for example, a direct or indirect pulp capping agent may be used after applying or filling the pharmaceutical composition of the present invention to the affected area.
  • the present invention also extends to a pulp capping agent containing the above-mentioned differentiation inducer as an active ingredient.
  • the pulp capping agent of the present invention has the effect of inducing differentiation from the dental pulp to odontoblasts and promoting dentin formation, and further protects the exposed dental pulp surface.
  • the pulp capping agent of the present invention can be used, for example, by applying or filling the cut surface of the dental pulp cavity in the cavity after pulp removal, in the same manner as the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pulp capping agent of the present invention may be used in combination with a direct pulp capping agent or an indirect pulp capping agent, either before or after application of the agent, or by mixing with the direct pulp capping agent or the indirect pulp capping agent.
  • the affected area after applying or filling the affected area with the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention, it can be covered and protected with MTA cement or a light-cured composite resin for dental fillings consisting of an organic resin matrix and an inorganic filler.
  • MTA cement or a light-cured composite resin for dental fillings consisting of an organic resin matrix and an inorganic filler.
  • a direct pulp capping agent or an indirect pulp capping agent for example, those exemplified in Patent Document 4 can be used.
  • the content of one or more selected from the group consisting of a differentiation inducer, an ammonium salt, a subhalogen acid, a subhalogen acid ion, or a subhalogen acid salt in the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention can be appropriately set.
  • the differentiation inducer, ammonium salt, and one or more selected from the group consisting of hypohalic acid, hypohalic acid ion, or hypohalic acid salt in the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention can be formulated alone or mixed with pharmacologically and pharmaceutical acceptable additives into various preparations suitable for application to the affected area.
  • preparation forms suitable for the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention include injections, external liquids (injections, liniments), pastes, solid preparations (granules, fine granules, powders, tablets), ointments, etc.
  • the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention may contain, for example, fibronectin (FN).
  • Pharmacologically and pharmacy-acceptable additives that can be used include, for example, excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers or solubilization aids, isotonicity agents, pH regulators, stabilizers, preservatives, dispersants, emulsifiers, gelling agents, thickeners, adhesives, flavoring agents, etc.
  • the gelling agent may be, for example, one that absorbs dental exudate and gels. It may also be in the form of a powder and a liquid, which are mixed and kneaded when used.
  • the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention may further contain other active ingredients such as bactericides, antibiotics, and anti-inflammatory agents.
  • the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention may be supported on a carrier to facilitate application of the active ingredient of the drug to the affected area and to enable the active ingredient to be retained at the affected area for a period sufficient for differentiation induction into odontoblasts.
  • the period sufficient for differentiation induction into odontoblasts can be appropriately set depending on the frequency of administration, the number of administrations, etc., but since the production of dentin-like calcified matter was confirmed after about two weeks in the cultured dental pulp cells in this example, it is expected that the effect will appear in, for example, 1 to 5 weeks, preferably 2 to 4 weeks, when applied to humans.
  • the pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention may be in the form of a dental material in which the differentiation inducer of the present invention, ammonium salt, and at least one selected from the group consisting of subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt are immobilized or impregnated in a structure having a shape such as a monofilament, film, fiber aggregate, microparticle, etc. together with an appropriate auxiliary agent.
  • the dose of the differentiation inducer, pharmaceutical composition or pulp capping agent of the present invention is not particularly limited and is adjusted appropriately depending on the patient's symptoms (degree of progression of dental caries), age, dosage form, etc., but is, for example, 0.2 to 2 ppm, preferably 0.2 ppm to 1 ppm, per administration.
  • the present invention also encompasses a method for inducing differentiation from dental pulp cells to odontoblasts, characterized by using the differentiation inducer described above. Furthermore, the present invention also encompasses a method for inducing differentiation from dental pulp cells to odontoblasts, comprising the use of an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt. Furthermore, the present invention also encompasses a method for regenerating dentin, comprising the use of an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt.
  • the present invention also encompasses a method for capping a tooth pulp, comprising the use of an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt.
  • a method for capping a tooth pulp comprising the use of an ammonium salt and at least one selected from the group consisting of subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt.
  • Such a method may be used, for example, in vitro, ex vivo, in vivo, etc.
  • an effective amount of at least one selected from the group consisting of an ammonium salt and a subhalogen acid, subhalogen ion, and subhalogen salt when used on a subject, the amount varies depending on the subject's weight, age, symptoms, administration method, etc., but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • subject refers to humans or other animals that require the differentiation induction, dentin regeneration, dental pulp capping, etc.
  • Example 1 Cytotoxicity when a chlorite ion aqueous solution is used
  • the cytotoxicity of mouse dental pulp cells was examined by the MTT method when the cells were cultured in a system containing a chlorite ion aqueous solution that is generated on demand.
  • MA-T registered trademark
  • MA-T manufactured by Acenet Co., Ltd.
  • Cytotoxicity was evaluated using 3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, manufactured by Nakarai Co., Ltd.).
  • mDPSC cells were seeded at 5 ⁇ 10 3 cells/well in a 96-well cell culture plate, and after culturing in Low glucose DMEM medium for 1 day, they were cultured for 48 hours in Low glucose DMEM medium containing 10% FBS and a freshly generated aqueous solution of chlorite ions at final concentrations of 10 ppm, 2.0 ppm, 1.0 ppm, 0.2 ppm, 0.1 ppm, and 0.02 ppm. The culture was carried out in an environment of 5% CO 2 and 37 ⁇ 0.5°C. The number of live cells was measured using an MTT cell count measurement kit (Nacalai).
  • Example 2 Desulfation of sulfate groups of HSPG when a freshly generated aqueous chlorite ion solution is used
  • desulfation of sulfate groups of heparansulfate proteoglycans (HSPG) on the surface of mouse dental pulp cells (mDPSC cells) when the cells were cultured in a system containing a freshly generated aqueous chlorite ion solution was confirmed by immunohistochemical staining.
  • mDPSC cells were seeded in a 24-well cell culture plate at 1x104 cells/well, and cultured in 20% FBS-containing Low glucose DMEM medium for 1 day. On the second day of culture, they were cultured for 72 hours in 20% FBS-containing Low glucose DMEM medium containing a freshly generated aqueous solution of chlorite ion with a final concentration of 1.0 ppm. Culture was performed in an environment of 5% CO2 and 37 ⁇ 0.5°C. After 72 hours, the cells were washed with PBS and fixed with methanol. Immunohistochemical staining was performed with mouse anti-heparan sulfate antibody (10E4) (Seikagaku Corporation) and DAPI, and observed under an optical microscope. Blocking was performed with 0.3% Tritonx-100 and 5% BSA-containing PBS. The results are shown in Figure 2.
  • Example 3 Differentiation induction into odontoblasts when using a freshly generated aqueous solution of chlorite ions 1
  • the expression of Axin2, Dspp, and Dmp1 in mouse dental pulp cells was confirmed when the cells were cultured in a system containing a non-cytotoxic aqueous solution of chlorite ions at 2.0 ppm or less. The expression of these was confirmed by qPCR.
  • mDPSC cells were suspended in aMEM differentiation induction medium ( hereinafter simply referred to as "aMEM differentiation induction medium") containing 100 nM dexamethasone (DEX, SIGMA), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (B-glycerophosphate, SIGMA), 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Ascorbic acid, SIGMA), and 10% v/v fetal bovine serum (FBS) to a cell number of 1.0 ⁇ 10 5 cells/ml, and 1 ml of the cell suspension was added to a 24-well cell culture plate (Falcon) and cultured.
  • aMEM differentiation induction medium containing 100 nM dexamethasone (DEX, SIGMA), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (B-glycerophosphate, SIGMA), 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Ascorbic acid, SIGMA), and 10% v/v fetal bovine
  • the cells were cultured for 3 or 6 days in aMEM differentiation induction medium containing a freshly generated aqueous solution of chlorite ions to a final concentration of 0.2 ppm or 1.0 ppm. Culture was performed in an environment of 5% CO 2 and 37 ⁇ 0.5°C.
  • mRNA was extracted using RNeasy Mini Kit TM (QIAGEN), and then reverse-transcribed using PrimeScript (R) Reverse Transcriptase (TAKARA) to obtain cDNA, which was used as a PCR sample. Extraction of mRNA and preparation of cDNA were performed according to the instructions of each company. Primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 of the sequence table were used as primers for amplifying Axin2, SEQ ID NOs: 3 and 4 of the sequence table were used as primers for amplifying Dspp, and SEQ ID NOs: 5 and 6 of the sequence table were used as primers for amplifying Dmp1. PCR was performed using a LightCycler ( Roche).
  • Mouse Axin2 amplification primer (SEQ ID NO: 1) forward 5'-GGCAACTCAGTAACAGCCCAA-3' (SEQ ID NO: 2) reverse 5'-GCTCATGTGAGCCTCCTCTCTTT-3'
  • Mouse Dspp amplification primer (SEQ ID NO: 3) forward 5'-AGCCGTGGAGATGCTTCTTA-3' (SEQ ID NO: 4) reverse 5'-TCACTCTGGCTGTCACCATC-3'
  • Primer for amplifying mouse Dmp1 (SEQ ID NO: 5) forward 5'-CAGTGAGGATGAGGCAGACA-3' (SEQ ID NO: 6) reverse 5'-TCGATCGCTCCTGGTACTCT-3'
  • Primer for amplifying mouse Gapdh (SEQ ID NO: 7) forward 5'-GTCCCGTAGACAAAATGGTG-3' (SEQ ID NO: 8) reverse 5'-CAATGAAGGGGTCGTTGATG-3'
  • Example 4 Induction of differentiation into odontoblasts using a freshly generated aqueous solution of chlorite ions 2
  • human dental pulp stem cells hDPSCs
  • hDPSCs human dental pulp stem cells
  • hDPSC cells (Lonza Biologics, Switzerland) were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells/well in a 24-well cell culture plate and cultured for 2 weeks using aMEM differentiation induction medium.
  • a on-demand generation of chlorite ion aqueous solution was added so that the final concentration of sodium chlorite was 0.2 ppm or 1.0 ppm, and the cells were cultured for another 12 days. Culture was performed in an environment of 5% CO 2 and 37 ⁇ 0.5°C.
  • the same amount of deionized distilled water was added instead of the on-demand generation of chlorite ion aqueous solution.
  • the culture medium was replaced every 3 days, and on that occasion, the on-demand generation of chlorite ion aqueous solution or deionized distilled water was added in the same manner.
  • the cells were washed with 1mL of PBS and fixed with 10% neutral formalin solution at room temperature for 15 minutes.
  • calcium phosphate formed during calcification was stained with 500 ⁇ L of 1% Alizarin Red S (SIGMA) for 5 minutes, washed three times with 1mL of distilled water, and observed under an optical microscope.
  • SIGMA Alizarin Red S
  • the results are shown in Figure 4.
  • the upper part of Figure 4 is a photograph of a 24-well plate taken with an optical microscope, and the lower part is an enlarged view of the same, with a scale bar of 200 ⁇ m.
  • Example 5 Induction of differentiation into odontoblasts using a freshly generated aqueous solution of chlorite ions 3
  • human dental pulp cells hDPSCs
  • hDPSCs human dental pulp cells
  • the hDPSC cells were subjected to differentiation induction treatment using the same method as in Example 4.
  • the hypochlorite ion aqueous solution was added so that the final concentration of sodium chlorite was 1.0 ppm.
  • Dspp and Dmp1 Expression of Dspp and Dmp1 was confirmed by the same method as in Example 3. Primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 9 and 10 in the sequence listing were used as primers for amplifying Dspp, and primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 were used as primers for amplifying Dmp1. PCR was performed using a LightCycler® ( manufactured by Roche). The results are shown in Figure 5. In Figure 5, * indicates p>0.05.
  • Example 6 Induction of differentiation into odontoblasts using lithium chloride and/or a chlorite ion aqueous solution that can be generated on demand
  • expression of Dspp in mouse dental pulp cells was confirmed when the cells were cultured in a system containing lithium chloride (LiCl) and/or a chlorite ion aqueous solution that can be generated on demand.
  • Expression of Dspp was confirmed by qPCR.
  • Differentiation induction treatment was performed using the same method as in Example 3, using lithium chloride and/or a hypochlorite ion aqueous solution that can be generated on demand, and the expression of Dspp was confirmed.
  • a hypochlorite ion aqueous solution that can be generated on demand was added so that the final concentration of sodium chlorite was 0.2 ppm, and lithium chloride was administered at a final concentration of 50 mM, and differentiation induction into odontoblasts was continued for a further 3 days.
  • the results are shown in Figure 6.
  • * indicates p>0.05.
  • Reference Example 1 Cytotoxicity when a chlorite ion aqueous solution is used
  • the cytotoxicity of mouse dental pulp cells, mDPSC cells, cultured in a system containing a chlorite ion aqueous solution (NaClO 2 ) was examined by the MTT method.
  • the cytotoxicity was measured in the same manner as in Example 1, except that a chlorite ion aqueous solution was used instead of the on-demand chlorite ion aqueous solution.
  • the final concentration of sodium chlorite was 10 ppm, 1.0 ppm, 0.2 ppm, or 0.02 ppm.
  • Example 7 Promotion of dentin formation when using a hypochlorite ion aqueous solution that can be generated on demand
  • promotion of dentin formation in mouse incisors was confirmed when the incisors were cultured in a system containing a hypochlorite ion aqueous solution that can be generated on demand.
  • Mandibular incisor tooth germs were excised from mouse embryos on embryonic day 16.
  • Mandibular incisor tooth germs from mouse embryos on embryonic day 16 were organ cultured for 10 days on a track-etched polycarbonate membrane filter (Nuclepore) in BGJB medium (Gibco) containing a freshly generated aqueous solution of chlorite ions at a final concentration of 1.0 ppm by the Trowell method.
  • BGJB medium was supplemented with 100 nM dexamethasone (DEX, SIGMA), 10 mM b-glycerophosphate (Sigma), and 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Sigma) to induce mineralization.
  • DEX dexamethasone
  • SIGMA 10 mM b-glycerophosphate
  • 50 ⁇ g/mL ascorbic acid Sigma
  • the left image shows a sagittal cross-sectional image and the right image shows a transverse cross-sectional image.
  • the upper image of the transverse cross-sectional image shows enamel mineralization, and the lower image shows mineralization including enamel and dentin.
  • dentin thickness on the labial and lingual sides of the incisors was measured using sagittal and transverse images reconstructed from micro-CT images of the mandibular incisors (Fig. 9B). Dentin thickness was measured on the transverse image at the center position of the sagittal image. A line was drawn through the center of the enamel shape on the transverse image of the incisor. Dentin thickness was measured along this line on the lingual and labial sides using Image J. For labial dentin thickness, the thickness of the mineralized tissue on the labial side was first measured. Then, Image J was used to measure the enamel thickness at the designated measurement sites. Finally, labial dentin thickness was calculated as the difference between the thickness of the mineralized tissue and the thickness of the enamel.
  • the use of the differentiation inducer of the present invention significantly enhances the expression of Dspp and Dmp1, which are extracellular matrices specific to odontoblasts, in dental pulp cells.
  • the differentiation inducer of the present invention acts directly on the dental pulp and has the effect of promoting differentiation induction from dental pulp cells to odontoblasts. It also has the effect of promoting dentin formation. For this reason, pulp removal has often been selected as the treatment for advanced caries, but the use of the differentiation inducer of the present invention makes it possible to preserve the dental pulp, which leads to improvements in the patient's oral environment and QOL and can greatly contribute to industrial applicability.
  • dentin will be actively regenerated directly under the caries by directly applying or filling a pharmaceutical composition or pulp capping agent containing the differentiation inducer as an active ingredient to the caries-affected area. After sufficient formation of secondary (repair) dentin has been confirmed, the carious area is removed and repair treatment is performed using resin or metal.

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Abstract

歯髄細胞から象牙芽細胞への優れた分化誘導剤及び分化誘導方法を提供する。さらには、優れた象牙質再生用医薬組成物、覆髄剤を提供する。アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤による。さらには、当該分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物及び／又は覆髄剤による。より詳しくは前記分化誘導剤が、歯髄細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンの硫酸基の脱硫酸化を生じさせることで、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化を誘導する。

Description

歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤及び分化誘導方法
　本発明は、象牙質の再生医療にかかわる分野に関する。具体的には、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤に関し、また歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法に関する。さらに、前記分化誘導剤を有効成分として含む、象牙質再生用組成物及び覆髄材に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2022-152553号優先権を請求する。
　歯髄は、歯の内部にある歯髄腔という空洞を満たしている血管性の結合組織であり、中胚葉由来の歯乳頭から形成された非石灰化組織である。一方、象牙質は歯髄腔の周囲にある硬い石灰化組織であり、歯髄細胞から象牙芽細胞に分化し産生される。
　従来、齲蝕（むし歯）の治療においては、齲蝕部分は切削によって取り除かれ、この削った部分にレジンやセメントが詰められて人工的に回復させ、治療する方法が採用されている。齲蝕によって発生するう窩が大きい場合、歯髄が除去されるが、歯髄除去後は、歯への栄養の供給が絶たれるため象牙質の脆弱化が起こり、また痛みを伝える神経がないため、再び齲蝕が進行した場合に自覚症状が得られず悪化するという問題がある。従って、歯の健康状態を維持するためにはできるだけ歯髄を保存するのが好ましいと考えられている。歯髄を保存し、その機能を維持するためには、象牙質の破損状態と歯髄の病理学的状態に応じて、間接覆髄剤又は直接覆髄剤が用いられる。間接覆髄剤は、象牙質は破損しているが歯髄が露出していない状態に用いられ、直接覆髄剤は、歯髄が露出している場合や治療により歯髄の一部を切断した場合に用いられる。
　直接覆髄剤は露出した歯髄面において修復象牙質を誘導し、露出した歯髄面は修復象牙質で再び覆われることで、歯髄が取り除かれることなく歯髄にまで達したう蝕は修復される。直接覆髄剤としては、従来、水酸化カルシウム製剤、Mineral trioxide aggregate (MTA)が用いられている。しかしながら、これらには象牙芽細胞への分化誘導の作用はなく、効率的な象牙質形成促進は得られていない。そのため直接覆髄の適応は、う蝕の範囲が小さく切削除去後に生じる歯髄の露出面が小さい場合に限られている。また水酸化カルシウム製剤と接する神経は歯髄組織を変性壊死させ、その後の修復機転で象牙質を再生させるため、時間を要し、効率が悪く、予後が不確定であること等の問題点があった。
　象牙質形成促進作用を有するものとして、ウシの血液抽出物（特許文献１）、N-アセチル-グルコサミン等の多糖類（特許文献２）、骨形成因子(BoneMorphogeneticProtein: BMP)等が報告されている。歯髄細胞の象牙芽細胞への分化誘導方法及び象牙質の再生方法に関しては、BMPを有効成分とする象牙質形成覆髄剤（材）について開示がある（特許文献３）。また本発明者らは塩素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム又は塩化リチウム等が、歯髄細胞から象牙芽細胞へ分化誘導し、かつ象牙芽質形成促進作用を有することを見出した。塩素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム又は塩化リチウム等がWntシグナル伝達経路を活性化することで、歯髄細胞が象牙芽細胞へ分化する（特許文献４）。
　象牙質再生に関するその他の技術として、コラーゲンを固定化したエチレン－酢酸ビニル共重合体ケン化物（Ａ）及びバインダー（Ｂ）を含有してなる象牙質再生覆髄剤（材）について開示がある（特許文献５）。さらに、象牙質を再生する方法としてヒト歯髄細胞を1,25（ジヒドロキシ）ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ－グリセロホスフェートの存在下で培養することにより象牙芽細胞に分化させ、該細胞を担体等と一緒に培養及び／又は移植することにより象牙質を再生する方法について開示がある（特許文献６、７）。また、他の方法として、ポリリン酸を用いる象牙質形成覆髄剤（材）について開示がある（特許文献８）。
　天然の象牙質を再生させて治療に使用する方法に関しては、例えば培養ヒト歯髄細胞をハイドロキシアパタイトとリン酸三カルシウムの複合体の粉体に播種した試料をヌードマウス皮下へ移植して6週間後に摘出し、摘出後のヘマトキシリン／エオシン染色像から硬組織の形成が確認されたことが報告されている（非特許文献１）。
　塩素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムが、細胞表面のへパラン硫酸の硫酸基の酸化作用を介して歯髄細胞が象牙芽細胞へ分化することを見出したものの（特許文献４）、塩素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム等の塩素酸塩は活性酸素による強い酸化力を有しており、これらの塩素酸塩は酸化反応の制御が難しく、一旦、ラジカル反応が生じると一気に反応がすすむため、効果の維持やその安定的な使用が容易ではない。
　ラジカル発生について、安全性が高く、且つ高い殺菌効果を有する薬剤として、ラジカル発生触媒と、ラジカル発生源を含み、前記ラジカル発生触媒が、有機アンモニウムと、ルイス酸性およびブレーンステッド酸性の少なくとも一方を有する有機化合物との、一方又は両方を含むことを特徴とする薬剤（特許文献９）、また温和な条件下でラジカルを発生させる（製造する）ことが可能なラジカル発生触媒について開示がある（特許文献１０）。
　革新的な酸化剤である「要時生成型亜塩素酸イオン水溶液（MA-T（登録商標））」は、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の中に含まれている亜塩素酸イオンが、反応すべき菌やウイルス等が存在する時にのみ、必要な量だけ二酸化塩素の成分を水の中で生成する。その結果、効果が長時間維持され、必要がなくなれば反応が停止するため安全性が高いといえ、感染制御分野だけでなく様々な分野に応用されている。しかしながら、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液が歯髄細胞から象牙芽細胞に分化誘導すること、さらには象牙質形成促進作用を有することについての報告はない。
特開2002-363084号公報 特開平06-256132号公報 特開平06-340555号公報 特許第5808053号公報 特開2004-292433号公報 特開2005-341961号公報 特開2006-211957号公報 特開2005-263681号公報 特許第6236057号公報 国際公開第2018/230743号
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97(25),13625-30(2000)
　本発明は歯髄細胞から象牙芽細胞への優れた分化誘導剤及び分化誘導方法を提供することを課題とする。さらには、優れた象牙質再生用医薬組成物、覆髄剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤によれば、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導することを見出し、本発明を完成した。さらには、当該分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物及び／又は覆髄剤によれば、象牙質形成を促進する作用を有することを見出し、本発明を完成した。より詳しくは前記分化誘導剤が、歯髄細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンの硫酸基の脱硫酸化を生じさせることで、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化を誘導する。
　即ち本発明は、以下よりなる。
１．下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤。
（前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。）
２．前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、前項１に記載の分化誘導剤。
３．前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、前項１に記載の分化誘導剤。
４．さらに塩化リチウムを含む、前項１～３のいずれかに記載の分化誘導剤。
５．前記分化誘導剤が、0.2～2ppmの濃度で投与されるように用いられることを特徴とする、前項１～３のいずれかに記載の分化誘導剤。
６．前項１に記載の分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物。
７．前項１に記載の分化誘導剤を有効成分とする、覆髄剤。
８．下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤をin vitro又はex vivoで用いることを特徴とする、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法。
（前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。）
９．前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、前項８に記載の分化誘導方法。
１０．前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、前項８に記載の分化誘導方法。
Ａ．下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法。
（前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。）
Ｂ．前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、前項Ａに記載の分化誘導方法。
Ｃ．前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、前項Ａに記載の分化誘導方法。
Ｄ．下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、象牙質の再生方法。
（前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。）
Ｅ．前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、前項Ｄに記載の象牙質の再生方法。
Ｆ．前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、前項Ｄに記載の象牙質の再生方法。
Ｇ．下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、歯の覆髄方法。
（前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。）
Ｈ．前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、前項Ｇに記載の歯の覆髄方法。
Ｉ．前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、前項Ｇに記載の歯の覆髄方法。
　アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤を用いると、歯髄細胞において、Wntシグナル伝達経路の活性化のマーカーであるAxin2(axisinhibitionprotein 2)の発現が亢進するとともに、象牙芽細胞に特異的な細胞外マトリクスであるDspp(dentinsialophosphoprotein)やDmp1(dentinmatrix protein 1)の発現が有意に亢進する。また本発明の分化誘導剤は、低濃度において細胞毒性を生じさせることなく、Axin2, Dspp, Dmp1等の分化マーカーの発現を増大し、象牙質様の石灰化物の産生を促進させることができる。さらに本発明の分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物及び／又は覆髄剤は、歯髄細胞から象牙芽細胞へ分化誘導し象牙質形成を促進しうる。
マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、各濃度の要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときのmDPSC細胞の細胞毒性をMTT法によって評価した結果を示す。（実施例１） マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときの、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）の硫酸基の脱硫酸化を示す。（実施例２） マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときの、添加3日後のAxin2とDspp、および6日後のDmp1の発現を示す。（実施例３） ヒト歯髄細胞であるhDPSC細胞に、各濃度の要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときの、2週間後の石灰化を示す。（実施例４） ヒト歯髄細胞であるhDPSC細胞に、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときの、2週間後のDspp及びDmp1の発現を示す。（実施例５） マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液及び／又は塩化リチウムを添加して培養したときの、添加3日後のDsppの発現を示す。（実施例６） マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、各濃度の亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときのmDPSC細胞の細胞毒性をMTT法によって評価した結果を示す。（参考例１） マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞に、各濃度の亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養したときのDspp及びDmp1の発現を示す。（参考例２） マウスの切歯に要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加して培養ときの象牙質形成を示す。図９Ａはマウスの下顎切歯の矢状断面像と横断面像を示す。図９Ｂはマウスの切歯の唇側と舌側の象牙質の厚さを示す。図９Ｃはマウスの切歯の矢状組織像を示す。（実施例７）
　本発明は、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤に関する。
　本発明の分化誘導剤はアンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む。本発明における「アンモニウム塩」は、例えば特許文献９及び特許文献１０において例示される、アンモニウム塩を参照することができる。
　本発明におけるアンモニウム塩は例えば下記化学式（XI）で表される。
　前記化学式（XI）中、
Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基（例えば、炭素数１～４０の直鎖又は分枝アルキル基）であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
Ｘ－はアニオンである。
　前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩は、例えば下記化学式（XII）で表されるアンモニウム塩であってもよい。
　前記化学式（XII）中、
Ｒ１１１は、炭素数が５～４０のアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、
Ｒ２１及びＸ－は、前記化学式（XI）と同じである。
　前記化学式（XII）中、
Ｒ２１は、例えばメチル基又はベンジル基でも良く、前記ベンジル基はベンゼン環の水素原子の１以上が任意の置換基で置換されていても置換されていなくても良く、前記任意の置換基は、例えばアルキル基、不飽和脂肪族炭化水素基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メルカプト基（－ＳＨ）、又はアルキルチオ基（－ＳＲ、Ｒはアルキル基）であっても良い。
　前記化学式（XII）で表されるアンモニウム塩は、例えば下記化学式（XIII）で表されるアンモニウム塩であってもよい。
　前記化学式（XIII） 中、
Ｒ１１１及びＸ－は、前記化学式（XII） と同じである。
　前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩は、例えば塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化アンモニウム、塩化メチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化デカリニウム、エドロホニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、オキシトロピウム、カルバコール、グリコピロニウム、サフラニン、シナピン、臭化テトラエチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、スキサメトニウム、スフィンゴミエリン、デナトニウム、トリゴネリン、ネオスチグミン、パラコート、ピリドスチグミン、フェロデンドリン、プラリドキシムヨウ化メチル、ベタイン、ベタニン、ベタネコール、ベタレイン、レシチン、及びコリン類（ベンゾイルコリンクロリド及びラウロイルコリンクロリド水和物等のコリンクロリド、ホスホコリン、アセチルコリン、コリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び重酒石酸コリン等）等が挙げられ、特に塩化ベンゼトニウムが好ましい。また前記化学式（XII）で表されるアンモニウム塩は、塩化ベンゼトニウムであることが特に好ましい。
　なお、塩化ベンゼトニウム（Ｂｚｎ＋Ｃｌ－）は、例えば、下記化学式で表すことができる。また、塩化ベンザルコニウムは、例えば前記化学式（XIII） 中、Ｒ１１１が炭素数８～１８のアルキル基であり、Ｘ－が塩化物イオンである化合物として表すことができる。
　本発明におけるアンモニウム塩のルイス酸性度は例えば0.4eV以上、0.5eV以上、又は0.6eV以上である。前記ルイス酸性度の上限値は、特に限定されないが、例えば20eV以下である。
　本発明における「亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」において、亜ハロゲン酸は亜塩素酸が好ましく、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上の少なくとも１つは、特に亜塩素酸イオンが好ましい。
　本発明の分化誘導剤に、特許文献９及び／又は特許文献１０で例示されるルイス酸性及びブレーンステッド酸性の少なくとも一方を有する物質、アミノ酸、ペプチド、リン脂質、スルホン酸系アミン若しくはそのアンモニウム、ニコチン系アミン若しくはそのアンモニウム及び亜硝酸系アミン若しくは亜硝酸系アンモニウム、オキソ酸又はその塩、又は電子供与体・受容体連結分子等を含んでもよい。
　本発明の分化誘導剤に含まれる、「アンモニウム塩」と「亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」の組み合わせは適宜選択することができるが、好ましい組み合わせは、「アンモニウム塩」として塩化ベンゼントニウム、「亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」として亜塩素酸イオンである。例えば特許文献１０には、亜塩素酸ナトリウム水溶液と塩化ベンゼントニウム水溶液から該文献の方法で製造しpHを調整した薬剤をMA-T（登録商標）と示している。MA-T（登録商標）とは要時生成型亜塩素酸イオン水溶液である。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液（MA-T（登録商標）、株式会社エースネット製）は、除菌剤として市販されており、ラジカルを発生させる必要な時に、最小限で必要な量だけ二酸化塩素の成分を水の中で生成するシステムである。二酸化塩素ラジカルの発生については、特許文献１０に塩化ベンゼントニウム等のアンモニウム塩が、ラジカル発生源である亜塩素酸ナトリウムに対し、ラジカル発生触媒として働くことで二酸化塩素ラジカルを生成することが開示されている（特許文献１０）。
　本発明の「分化誘導剤」は、Wntシグナル伝達経路を活性化することで、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化を促す。ここで、Wntは細胞間シグナル分子の１つであるが、Wntファミリーとしては現在17種以上が知られている。Wnt10aは基底膜に発現が認められ、Wnt10a以外のWnt分子では、Wnt5aとWnt10bとがエナメル芽細胞やセメント芽細胞に発現が認められている。本明細書において、Wntシグナル伝達経路において活性化されるWntの種類は、特に限定されないが歯髄細胞から象牙芽細胞へ分化誘導するためには、Wnt10aを含む経路を活性化するのが特に好ましい。背景技術の欄にも示した通り、特許文献４には塩素酸ナトリウム等が、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの硫酸基を除去し、Wntシグナル伝達経路を活性化することで歯髄細胞から象牙芽細胞への分化を誘導することが開示されている。しかしながら、塩素酸ナトリウムや亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤は、酸化反応の制御が難しく、一旦、ラジカル反応が生じると一気に反応がすすむため、効果の維持やその安定的な使用が容易ではなく、特に常温で濃度を一定に保つことが困難であった。本実施例において本発明の分化誘導剤に含まれる「アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」が、ヘパラン硫酸プロテオグリカンから硫酸基を除去しうることが確認され、また上述したようにラジカル反応を効率よく制御することが可能であるため、本発明の分化誘導剤は安全性が高いと考えられる。本発明の分化誘導剤は、特許文献４に例示する、他のWntシグナル伝達経路を活性化しうる塩化リチウム等を含んでもよい。また、アンモニウム塩と亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上に、さらに塩化リチウムを含む、本発明の分化誘導剤は、象牙芽細胞への分化をさらに促進する（実施例６）。
　また、塩素酸ナトリウムや亜塩素酸ナトリウム等は強い酸化剤であるため、口腔で処方される場合、毒性に配慮しなければならない。本実施例において、亜塩素酸イオン水溶液では、歯髄細胞から象牙芽細胞へ分化誘導し得る濃度では、細胞毒性が生じることを確認した（参考例１、２）。これに対し、本発明の分化誘導剤に含まれる「アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」は、細胞毒性が生じない濃度で歯髄細胞から象牙芽細胞へ分化誘導することを確認した（実施例１～５）。さらに、本発明に含まれる「アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上」は、細胞毒性が生じない濃度で象牙質形成を促進することを確認した（実施例７）。これより、本発明の分化誘導剤を用いれば、細胞毒性を生じさせることなく、歯髄細胞から象牙芽細胞に分化誘導することができる。さらには、本発明の象牙質再生用医薬組成物及び／又は覆髄材を用いれば、象牙質形成を促進することができる。本明細書において、細胞毒性が生じない濃度とは、本発明の医薬組成物又は覆髄剤の一回の投与濃度等が挙げられる。
　本発明の分化誘導剤におけるアンモニウム塩若しくは亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上の含有率、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩から選択される少なくとも１つ以上の、本発明の分化誘導剤中の濃度比（亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩から選択される少なくとも１つ以上／アンモニウム塩）は、特に限定されず適宜設定可能であり、例えば特許文献９又は特許文献１０を参照することができる。本発明の分化誘導剤はさらに特許文献９又は特許文献１０に例示される水、有機溶媒、pH調整剤又は緩衝剤等を１種類以上含んでもよく、本発明の分化誘導剤における「溶媒」及び「溶質」の状態は特許文献９又は特許文献１０に記載の通りである。
　本発明の分化誘導剤は例えば液状、固体状、半固体状であってもよいが液状であることが好ましく、本発明の分化誘導剤は例えば酸性でも、酸性でなくても良く、塩基性でも、塩基性でなくても良く、中性でも中性でなくても良いが、酸性ではないことが好ましい。本発明の分化誘導剤のpHは特に限定されないが、例えば4.0以上、4.5以上、5.0以上、5.5以上、6.0以上、6.5以上、7.0以上、又は7.5以上であってもよいし、11.5以下、11.0以下、10.5以下、10.0以下、9.5以下、9.0以下、8.5以下、8.0以下、又は7.5以下であってもよい。
　本発明の分化誘導剤は、例えばアンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上とを、必要に応じ前記水及び有機溶媒の少なくとも一方とを混合することにより製造することができる。例えば特許文献９又は特許文献１０に記載の方法により製造することができるが、これらに限定されない。
　本発明は、上述の分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物にも及ぶ。本発明の医薬組成物は、歯髄から象牙芽細胞へ分化誘導させ、かつ象牙質形成を促進する作用を有するため、象牙質が再生されることが期待できる。本発明の医薬組成物は、通常の齲蝕処置、例えば、髄腔開拡、抜髄後の窩洞部歯髄切断面上に塗布又は充填することにより使用できる。本発明の医薬組成物は、直接覆髄剤又は間接覆髄剤と併用してもよく、例えば本発明の医薬組成物を患部に塗布又は充填した後に、直接覆髄剤又は間接覆髄剤を使用してもよい。
　さらに本発明は、上述の分化誘導剤を有効成分とする覆髄剤にも及ぶ。本発明の覆髄剤は、歯髄から象牙芽細胞へ分化誘導させ、かつ象牙質形成を促進する作用を有し、さらに露出した歯髄面を保護する。本発明の覆髄剤は、本発明の医薬組成物と同様に例えば、髄腔開拡、抜髄後の窩洞部歯髄切断面上に塗布又は充填することにより使用できる。本発明の覆髄剤は、直接覆髄剤又は間接覆髄剤と併用して、その適用前又は適用後に適用しても、直接覆髄剤又は間接覆髄剤に混合して適用してもよい。
　また本発明の医薬組成物又は覆髄剤を患部に塗布又は充填した後、MTAセメントや、有機質レジンマトリックスと無機質フィラーから成る歯科充填用光重合型コンポジットレジンを用いて被覆、保護することもできる。直接覆髄剤又は間接覆髄剤は、例えば特許文献４に例示されるものを用いることができる。また、本発明の医薬組成物又は覆髄剤における分化誘導剤、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン又は亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される１つ以上の含有率は適宜設定可能である。
　本発明の医薬組成物又は覆髄剤における分化誘導剤、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン又は亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される１つ以上は、それ単体で、あるいは薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した形態の各種製剤に製剤化することができる。本発明の医薬組成物又は覆髄剤に適した製剤形態としては、例えば注射剤、外用液剤（注入剤、塗布剤）、糊剤、固形製剤（顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤）、軟膏剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物又は覆髄剤は、例えばフィブロネクチン（FN）を含んでもよい。
　薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、保存剤、分散剤、乳化剤、ゲル化剤、増粘剤粘着剤、矯味剤等を用いることができる。ゲル化剤は、例えば歯の浸出液を吸収してゲル化するものでもよい。また、粉剤と液剤からなる形態として、用時混合及び混練して用いてもよい。本発明の医薬組成物又は覆髄剤は、さらに殺菌剤、抗生物質、抗炎症剤等の他の有効成分を含んでいてもよい。
　本発明の医薬組成物又は覆髄剤は、薬剤の有効成分の患部への適用を容易にし、象牙芽細胞への分化誘導に十分な期間、有効成分を患部に保持することを可能にする上で、担体に担持されていてもよい。象牙芽細胞への分化誘導に十分な期間は、投与頻度、投与回数等に応じて適宜設定することができるが、本実施例において培養した歯髄細胞で約2週間後に象牙質様の石灰化物の産生を確認したことから、ヒトへ応用した場合、例えば1～5週間、好ましくは2～4週間で効果が現れることが期待される。従って、本発明の医薬組成物又は覆髄剤は、本発明の分化誘導剤、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を適当な補助剤と共にモノフィラメント、フィルム、繊維集合体、微小粒等の形状を有する構造体に固定化又は含浸させた歯科材料の形態であってもよい。
　本発明の分化誘導剤、医薬組成物又は覆髄剤の用量は、特に限定はされず、患者の症状（齲歯の進行度）、年齢、剤形等により適宜調整されるが、例えば一回の投与濃度として0.2～2ppm、好ましくは0.2ppm～1ppmである。
　本発明は、上述の分化誘導剤を用いることを特徴とする、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法にも及ぶ。さらに、本発明は、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法にも及ぶ。さらに、本発明は、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、象牙質の再生方法にも及ぶ。さらに、本発明は、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を用いることを含む、歯の覆髄方法にも及ぶ。係る方法は、例えばin vitro、ex vivo、in vivo等のいずれで用いてもよい。また、これら方法において、アンモニウム塩と、亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上の有効量を対象に用いる場合、対象の体重や年齢、症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適宜選択することができる。なお、「対象」とは、当該分化誘導、象牙質の再生、歯の覆髄等を必要とするヒト又はその他の動物である。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例等に限定されることはない。
（実施例１）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの細胞毒性
　本実施例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC(Mouse Dental Pulp Stem Cells)細胞を、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの細胞毒性をMTT法によって検討した。本実施例及び以降の実施例で、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液としてMA-T（登録商標）（株式会社エースネット製）を用い、コントロール群では脱イオン蒸留水を用いた。細胞毒性は、3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide （MTT、ナカライ社製）を用いて評価した。
　mDPSC細胞を5×103cells/wellにて96 well cellculture plateに播種し、Low glucoseDMEM培地にて1日間培養後、最終濃度が10 ppm, 2.0ppm, 1.0 ppm, 0.2ppm, 0.1 ppm, 0.02 ppmの要時生成型亜塩素酸イオン水溶液含有10％ FBS含有Low glucoseDMEM培地にて48時間培養を行った。培養は、5% CO2、37±0.5℃の環境下で行なった。生細胞数の測定にはMTT細胞数測定キット（ナカライ社製）を用いて行った。培養48時間経過後、MTT溶液を各ウェルに10μLずつ添加を行い、CO2インキュベーター（37℃）内で2時間呈色反応を行った。その後、付属の可溶化溶液を各ウェルに100μLずつ添加、混合を行った。プレートシールで密閉後CO2インキュベーター（37℃）内で一晩静置を行った。その後、析出物が完全に溶解しているか確認し、マイクロプレートリーダーを用いて570 nmの吸光度値を測定した。結果を図１に示す。なお、図１中*はp>0.05を示す。
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液は10 ppmの濃度において生細胞数を減少させた（図１）。また、2.0 ppm以下の濃度においては、mDPSC細胞に細胞毒性は認められなかった。
（実施例２）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときのHSPGの硫酸基の脱硫酸化
　本実施例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞を、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときのmDPSC細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG:Heparansulfate proteoglycans）の硫酸基の脱硫酸化を免疫組織化学染色により確認した。
　mDPSC細胞を1×104cells/wellになるように24 well cellculture plateに播種し、20％FBS含有Low glucoseDMEM培地にて1日間培養後、培養2日目に最終濃度が1.0ppmの要時生成型亜塩素酸イオン水溶液含有20％FBS含有Low glucoseDMEM培地にて72時間培養を行った。培養は、5% CO2、37±0.5℃の環境下で行なった。72時間経過後、PBSにて洗浄を行い、メタノール固定後、マウス抗ヘパラン硫酸抗体(10E4)（生化学工業社製）及びDAPIにて免疫組織化学染色を行い、光学顕微鏡で観察した。ブロッキングは0.3%Tritonx-100、5% BSA含有PBSにて行った。結果を図２に示す。
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液群では、1.0ppmの濃度でmDPSC細胞表面のHSPGの硫酸基を脱硫酸化した（図２）。
（実施例３）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙芽細胞への分化誘導１
　本実施例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞を、細胞毒性が見られない2.0 ppm以下の要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの細胞におけるAxin2,Dspp及びDmp1の発現を確認した。これらの発現は、qPCRにより確認した。
　mDPSC細胞を細胞数1.0×105cells/mlとなるように100nM デキサメタゾン(DEX,SIGMA社製), 10mM β－グリセロリン酸(b-glycerophosphate, SIGMA社製), 50μg/mL アスコルビン酸(Ascorbic acid, SIGMA社製), 10 %v/v ウシ胎児血清(Fetal bovine serum; FBS)を含むaMEM分化誘導培地（以下、単に「aMEM分化誘導培地」という。）に懸濁し、細胞浮遊液を24 well cell culture plate (Falcon社製)に1ml加え培養を行った。培養2日目に、最終濃度が0.2 ppm又は1.0 ppmとなるように要時生成型亜塩素酸イオン水溶液含有aMEM分化誘導培地にて3日間又は6日間培養した。培養は、5% CO2、37±0.5℃の環境下で行なった。
　上記培養した細胞からRNeasy Mini KitTM（QIAGEN社製）を用いてmRNAを抽出後、PrimeScript(R) Reverse Transcriptase（TAKARA社製）を用いて逆転写を行いcDNAを得、これをPCR用試料とした。mRNAの抽出及びcDNAの調製は、各社の指示書に従い行なった。Axin2増幅用プライマーとして配列表の配列番号１及び２、Dspp増幅用プライマーとして同配列番号３及び４、Dmp1の増幅用プライマーとして、同配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。PCRは、ライトサイクラー(R)（Roche社製）を用いて行なった。結果を図３に示す。なお、図３中のAxin2及びDsppは要時生成型亜塩素酸イオン水溶液添加3日後の結果であり、Dmp1は添加6日後の結果である。*はp>0.05を示す。 
Ａ. Mouse Axin2 増幅用プライマー
（配列番号１）forward 5'-GGCAACTCAGTAACAGCCCAA-3'
（配列番号２）reverse 5'-GCTCATGTGAGCCTCCTCTCTTT-3'
Ｂ．Mouse Dspp増幅用プライマー
（配列番号３）forward 5'-AGCCGTGGAGATGCTTCTTA-3'
（配列番号４）reverse 5'-TCACTCTGGCTGTCACCATC-3'
Ｃ．Mouse Dmp1増幅用プライマー
（配列番号５）forward 5'-CAGTGAGGATGAGGCAGACA-3'
（配列番号６）reverse 5'-TCGATCGCTCCTGGTACTCT-3'
Ｄ. Mouse Gapdh増幅用プライマー
（配列番号７）forward 5'-GTCCCGTAGACAAAATGGTG-3'
（配列番号８）reverse 5'-CAATGAAGGGGTCGTTGATG-3'
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の添加により、0.2 ppm及び1.0 ppmのいずれの濃度においても、添加3日後にAxin2及びDspp、添加6日後にDmp1の発現の亢進が見られた。これより、mDPSC細胞から象牙芽細胞への分化を誘導することが示された。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液は強力な酸化剤として知られている。そのため、mDPSC細胞への酸化剤添加は、Wntシグナル伝達経路を活性化することで直接的又は間接的にmDPSC細胞から象牙芽細胞への分化を促進させるものと考えられた。さらに、象牙質は分化した象牙芽細胞が産生する基質であり、Dsppの発現の亢進は象牙質の形成の促進につながると考えられる。
（実施例４）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙芽細胞への分化誘導２
　本実施例ではヒト歯髄細胞であるhDPSC(Human Dental Pulp Stem Cells)細胞を、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときのhDPSC細胞の石灰化をアリザリンレッド染色により確認した。
　hDPSC細胞(Lonza Biologics社製, スイス)を1×105cells/wellにて24 well cellculture plateに播種し、aMEM分化誘導培地を用いて2 週間培養した。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液群では培養2日目に、亜塩素酸ナトリウムの最終濃度が0.2 ppm又は1.0 ppmとなるように要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加し、さらに12日間培養した。培養は、5% CO2、37±0.5℃の環境下で行なった。コントロール群は要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の代わりに同量の脱イオン蒸留水を添加した。培養液は3日ごとに交換し、その際に要時生成型亜塩素酸イオン水溶液又は脱イオン蒸留水を同様に添加した。培地を除去後、PBS 1mLで洗浄し、室温で15分間10%中性ホルマリン溶液により細胞を固定した後、蒸留水1mlで3回洗浄後、石灰化の際に形成されるリン酸カルシウムを1%アリザリンレッドS（SIGMA社製）500μLにより5分間染色し、蒸留水1mLで3回洗浄し、光学顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。なお、図４の上段は24wellplateを光学顕微鏡にて写真を撮影したものであり、下段はその拡大図であり、スケールバーは200μmである。
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液群では、0.2 ppm及び1.0 ppmのいずれの濃度においてもhDPSC細胞の石灰化物の産生がcontrol群に比べ亢進した。（図４）
（実施例５）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙芽細胞への分化誘導３
　本実施例では、ヒト歯髄細胞であるhDPSC細胞を、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの、石灰化時における、hDPSC細胞のDspp及びDmp1の発現を確認した。これらの発現は、qPCRにより確認した。
　実施例４と同手法によりhDPSC細胞を分化誘導処理を行った。なお、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液群では亜塩素酸ナトリウムの最終濃度が1.0 ppmとなるように要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加した。
　実施例３と同手法によりDspp及びDmp1の発現を確認した。Dspp増幅用プライマーとして配列表の配列番号９及び１０、Dmp1の増幅用プライマーとして、同配列番号１１及び１２に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。PCRは、ライトサイクラー(R)（Roche社製）を用いて行なった。結果を図５に示す。なお、図５中の*はp>0.05を示す。
Ａ．Human Dspp増幅用プライマー
（配列番号９）forward 5'-GGCAGTGCATCAAAAGGAGC-3'
（配列番号１０）reverse 5'-TGCTGTCACTGTCACTGCTG-3'
Ｂ．Human Dmp1増幅用プライマー
（配列番号１１）forward 5'-CAACTATGAAGATCAGCATCC-3'
（配列番号１２）reverse 5'-CTTCCATTCTTCAGAATCCTC-3'
Ｃ． Human GAPDH増幅用プライマー
（配列番号１３）forward 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'
（配列番号１４）reverse 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の添加により、石灰化時においても、DsppとDmp1の発現は著しく亢進した（図５）。これより、hDPSC細胞から象牙芽細胞への分化を誘導することが示された。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液は強力な酸化剤として知られている。そのため、hDPSC細胞への酸化剤添加は、直接的又は間接的にhDPSC細胞から象牙芽細胞への分化を促進させるものと考えられた。さらに、象牙質は分化した象牙芽細胞が産生する基質であり、Dsppの発現の亢進は象牙質の形成の促進につながると考えられる。
（実施例６）塩化リチウム及び／又は要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙芽細胞への分化誘導
　本実施例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞を、塩化リチウム(LiCl)及び／又は要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの細胞におけるDsppの発現を確認した。Dsppの発現は、qPCRにより確認した。
　塩化リチウム及び／又は要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いて、実施例３と同手法により、分化誘導処理を行いDsppの発現を確認した。なお、培養2日目に亜塩素酸ナトリウムの最終濃度が0.2 ppmとなるように要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を添加し、塩化リチウムは最終濃度50mMで投与し、さらに3日間、象牙芽細胞への分化誘導を行った。結果を図６に示す。なお、図６中の*はp>0.05を示す。
　上記の結果、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液によってDsppの発現が亢進し、塩化リチウムによってさらにその発現が促進した（図６）。これよりWntシグナル伝達経路の活性化によって、相加的に亢進することを示された。
（参考例１）亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの細胞毒性
　本参考例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞を、亜塩素酸イオン水溶液(NaClO2)を含む系で培養したときの細胞毒性をMTT法によって検討した。細胞毒性は、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の代わりに、亜塩素酸イオン水溶液を用いる以外は実施例１と同手法により行った。なお、亜塩素酸イオン水溶液群では亜塩素酸ナトリウムの最終濃度が10 ppm, 1.0 ppm, 0.2 ppm又は0.02 ppmとした。
　結果を図７に示す。なお図７中の*はp>0.05を示す。この結果、亜塩素酸イオン水溶液は10 ppmの濃度において生細胞数を減少させた。一方、1.0 ppm以下の濃度では細胞毒性は認められなかった（図７）。
（参考例２）亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙芽細胞への分化誘導
　本参考例では、マウス歯髄細胞であるmDPSC細胞を、亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの細胞におけるDspp及びDmp1の発現を確認した。Dspp及びDmp1の発現は、qPCRにより確認した。
　要時生成型亜塩素酸イオン水溶液の代わりに、亜塩素酸イオン水溶液を用いる以外は実施例３と同手法により、分化誘導処理を行いDspp, Dmp1の発現を確認した。なお、培養2日目に亜塩素酸イオン水溶液群では亜塩素酸ナトリウムの最終濃度が100 ppm、10 ppm又は1ppmとなるよう亜塩素酸イオン水溶液を添加し、さらに6日間培養した。結果を図８に示す。なお図８中の*はp>0.05を示す。
　上記の結果、亜塩素酸イオン水溶液の添加より、100 ppmの濃度において、添加6日後にDspp及びDmp1の発現の亢進が認められたものの、10 ppm及び1 ppmの濃度では、有意な発現の亢進は認められてなかった（図８）。
　参考例１と参考例２の結果から、亜塩素酸イオン水溶液は100 ppmで象牙芽細胞への分化を促進するものの、同時にこの濃度では細胞毒性が生じる。細胞毒性が生じない亜塩素酸イオン水溶液の濃度は1 ppm以下であるが、この濃度では象牙芽細胞への分化は促進されなかった。
（実施例７）要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を用いたときの象牙質形成の促進
　本実施例では、マウスの切歯を、要時生成型亜塩素酸イオン水溶液を含む系で培養したときの切歯の象牙質形成の促進を確認した。
　胎生16日のマウス胚から下顎切歯歯胚を切り出した。胎生16日のマウス胚の下顎切歯歯胚を、track-etched polycarbonate membrane filter（Nuclepore）上で、最終濃度1.0ppmの要時生成型亜塩素酸イオン水溶液含むBGJB培地（Gibco）で10日間、Trowell法により器官培養した。BGJB培地には、石灰化を誘導するために100nM デキサメタゾン(DEX,SIGMA社製), 10mM β－グリセロリン酸(b-glycerophosphate, SIGMA社製), 50μg/mL アスコルビン酸(Ascorbic acid, SIGMA社製)が添加された。10日間培養した後、マイクロコンピューター断層撮影（micro-CT）分析及び組織学的評価によって象牙質形成の促進を確認した。
　培養マウス下顎切歯を4% パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）で一晩固定後、90KV、200 μA、microfocus5 μm/voxel sizeの撮影条件で、micro-CT(R_mCT2, Rigaku)撮影を行った。得られた３次元情報から、Volume Graphics (VGstudio) MAX 2.2ソフトウェアを用いて下顎切歯の矢状断面像と横断面像を再構成した。結果を図９Ａに示し、スケールバーは200μmである。象牙質は比較的石灰化が少なく、一方、エナメル質は高度に石灰化していた（図９Ａ）。図９Ａにおいて、左図は矢状断面像を示し、右図は横断面像を示す。横断面像のうち上図はエナメル質の石灰化像、下図はエナメル質と象牙質を含む石灰化像を示す。
　さらに、下顎切歯のmicro-CT画像より再構成された矢状断面像と横断面像を利用して、切歯の唇側と舌側の象牙質の厚さを測定した（図９Ｂ）。象牙質の厚さは、矢状断面像の中心位置における横断面像上で測定した。切歯の横断面像で、エナメル質の形状の中心を通る線を引いた。象牙質の厚さは、この線に沿って舌側と唇側でImage Jを用いて測定した。唇側の象牙質の厚さについては、まず唇側の石灰化組織の厚さを測定した。次に、Image Jを使用して、指定された測定部位でのエナメル質の厚さを測定した。 最後に、唇側の象牙質の厚さは、石灰化組織の厚さとエナメル質の厚さの差として算出した。
　上記の結果を図９Ｂに示す。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液群では、象牙質の厚みを増加させた（図９Ｂ）。なお、図９Ｂ中*はp>0.05を示し、P値は、unpaired Student's t-testによって決定された。
　micro-CT撮影後、歯の脱灰のために、固定したマウス切歯を脱灰剤であるOsteosoft(Sigma-Aldrich) に浸した。パラフィン包埋下顎骨の矢状切片を作製し、ヘマトキシリンエオシン(hematoxylin-eosin;HE)を用いて組織学的評価によって確認した（図９Ｃ）。図９Ｃには、下切歯の矢状組織像を示し、スケールバーは100μmである。要時生成型亜塩素酸イオン水溶液により象牙質形成の亢進が認められたことから、象牙質の再生が期待できる。
　以上詳述したように、本発明の分化誘導剤を用いると、歯髄細胞において、象牙芽細胞に特異的な細胞外マトリクスであるDspp及びDmp1の発現が有意に亢進することが確認された。本発明の分化誘導剤は、歯髄に直接作用し歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導を促進する効果がある。さらに象牙質形成を促進する効果がある。そのため、進行した齲蝕の処置は抜髄が選択されることが多かったが、本発明の分化誘導剤を用いることで歯髄の保存が可能となり、患者の口腔内環境やQOLの改善に繋がり、産業上の利用可能性に大きく貢献しうる。臨床的には、当該分化誘導剤を有効成分とする、医薬組成物又は覆髄剤をう蝕の患部に直接塗布又は充填することで、う蝕の直下に象牙質が活発に再生されることが期待される。十分な二次（修復）象牙質の形成が確認された後、う蝕部位を削除し、レジンあるいは金属による修復処置が行われる。

Claims (10)

  1. 下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
    亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤。
    （前記化学式（XI）中、
    Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
    Ｘ－はアニオンである。）
  2. 前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、請求項１に記載の分化誘導剤。
  3. 前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、請求項１に記載の分化誘導剤。
  4. さらに塩化リチウムを含む、請求項１～３のいずれかに記載の分化誘導剤。
  5. 前記分化誘導剤が、0.2～2ppmの濃度で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の分化誘導剤。
  6. 請求項１に記載の分化誘導剤を有効成分とする、象牙質再生用医薬組成物。
  7. 請求項１に記載の分化誘導剤を有効成分とする、覆髄剤。
  8. 下記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩と、
    亜ハロゲン酸、亜ハロゲン酸イオン及び亜ハロゲン酸塩からなる群から選択される少なくとも１つ以上を含む、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導剤をin vitro又はex vivoで用いることを特徴とする、歯髄細胞から象牙芽細胞への分化誘導方法。
    （前記化学式（XI）中、
    Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ水素原子又はアルキル基であり、エーテル結合、カルボニル基、エステル結合若しくはアミド結合、又は芳香環が含まれていてもよく、Ｒ１１、Ｒ２１、Ｒ３１、及びＲ４１は、それぞれ同じでも異なっていてもよく、
    Ｘ－はアニオンである。）
  9. 前記化学式（XI）で表されるアンモニウム塩が、塩化ベンゼトニウムである、請求項８に記載の分化誘導方法。
  10. 前記亜ハロゲン酸が亜塩素酸である、請求項８に記載の分化誘導方法。
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