WO2019065478A1 - 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット - Google Patents

非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット Download PDF

Info

Publication number
WO2019065478A1
WO2019065478A1 PCT/JP2018/034948 JP2018034948W WO2019065478A1 WO 2019065478 A1 WO2019065478 A1 WO 2019065478A1 JP 2018034948 W JP2018034948 W JP 2018034948W WO 2019065478 A1 WO2019065478 A1 WO 2019065478A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cellular
root canal
filling material
regeneration
dental pulp
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/034948
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
中島　美砂子
庵原　耕一郎
Original Assignee
国立研究開発法人国立長寿医療研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター filed Critical 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター
Priority to EP18861751.8A priority Critical patent/EP3689386A4/en
Priority to CN201880062522.0A priority patent/CN111148536B/zh
Priority to US16/651,483 priority patent/US11969487B2/en
Publication of WO2019065478A1 publication Critical patent/WO2019065478A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/50—Preparations specially adapted for dental root treatment
    • A61K6/54—Filling; Sealing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3865—Dental/periodontal tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis

Definitions

  • the present invention relates to a non-cellular root canal filling material and non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit for promoting regeneration of dental pulp, dentin and apical periodontal tissue without using stem cells or stem cell components.
  • tooth loss leads to occlusion, pronunciation, taste, touch, loss of aesthetics, and a decrease in QOL.
  • oral and flail caused by deterioration of teeth and oral cavity function cause deterioration of living function due to sarcopenia such as low muscle strength and low physical function and malnutrition, and eventually the state of needing nursing care.
  • dental pulp stem cells separated from their own unneeded teeth by autologous transplantation, or allogeneically transplant the dental pulp stem cells separated from the unneeded teeth of another person.
  • a dental pulp regeneration treatment has been developed which restores the teeth to the original condition so as not to reach the infected root canal or tooth extraction (Patent Documents 1 to 3).
  • dental pulp is regenerated by autologous or allogeneic transplantation of not only dental pulp stem cells but also other tissue stem cells derived from bone marrow or fat.
  • Non-patent Document 4 The dental pulp regeneration treatment by autologous dental pulp stem cell transplantation has already been confirmed by clinical studies to be safe and suggested to be effective (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 a method of filling a clot in the root canal without using dental pulp stem cells is the mainstream (Non-patent Document 2).
  • PRP Platinum-Rich Plasma
  • Non-patent Document 4 stromal cell derived factor (SDF1 ⁇ ), basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet-derived growth factor (PDGF), stem cell factor (SCF), and granulocyte colony-stimulating factor (G) without using stem cells
  • SDF1 ⁇ basic fibroblast growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • SCF stem cell factor
  • G granulocyte colony-stimulating factor
  • Non-patent Document 6 it has been reported that it is not a sufficient amount of dental pulp regeneration and is mostly a fairly dense fibrous connective tissue with blood vessels, and that the entire root canal may be calcified (Non-patent Document 6) 7). Therefore, it has been considered that stem cells are essential for dental pulp tissue regeneration, particularly in complete root teeth (Non-patent Document 8).
  • dental pulp regeneration was promoted when CCL11 neutralizing antibody / CCR3 antagonist (antagonist) or ALK5 inhibitor (inhibitor) was transplanted together with dental pulp stem cells in dental pulp regeneration treatment by middle and old dental pulp stem cell transplantation.
  • CCL11 neutralizing antibodies or CCR3 antagonists inhibit CCL11 binding to CCR3 and block signaling.
  • GDF11 also binds to type I TGF-beta superfamily receptors ACVR1B (ALK4), TGFBR1 (ALK5) and ACVR1C (ALK7), but signaling takes place at ALK4 and ALK5.
  • ALK5 inhibitors block GDF11 signaling.
  • Non-patent Document 11 When dental pulp stem cells were seeded on trypsin-treated dentin surface in vitro, the adhesion of the cells was increased and differentiation to odontoblasts was observed.
  • the action of promoting dental pulp regeneration with trypsin pretreatment in middle and old dogs is due to inactivation of inhibitors accumulated in middle and old dentin by protein dissolution or activation by cleavage of precursors, and cell adhesion to dentin It was suggested that the promotion was due to the odontoblast differentiation promoting action.
  • Patent Document 5 In addition, when dental pulp stem cells were not transplanted only with trypsin pretreatment, or when dental pulp stem cells were not transplanted only with CCR3 antagonist or ALK5 inhibitor, dental pulp regeneration was hardly observed (Patent Document 5).
  • the present invention has been made in view of the above problems, and when tooth tissue regeneration is performed, teeth are effectively non-cellular, in particular, even when autologous or allogeneic stem cells or stem cell-derived components are not transplanted.
  • An object of the present invention is to provide a non-cellular root canal filling material that enables tissue regeneration.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for promoting non-cellular tooth tissue regeneration using the non-cellular root canal filling material.
  • the non-cellular root canal filling material for tooth tissue regeneration has a regeneration promoting compound containing at least one of a CCR3 antagonist, a CCL11 neutralizing antibody and an ALK5 inhibitor, and an extracellular matrix. It is characterized by The acellular root canal filling can include at least one migration factor such as G-CSF, bFGF and SDF-1.
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit for tooth tissue regeneration comprises a pretreatment agent containing serine protease, and a regeneration promoting agent containing at least one of a CCR3 antagonist, a CCL11 neutralizing antibody and an ALK5 inhibitor. It has a compound and an extracellular matrix.
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit can include at least one migration factor such as G-CSF, bFGF and SDF-1.
  • tooth tissue regeneration can be effectively performed even when autologous or allogeneic dental pulp stem cells or their stem cell-derived components (supernatant, secretome or exosome) are not transplanted.
  • a and B are low
  • the arrowhead indicates the top of regenerated tissues
  • C and D indicate high folds
  • black arrows indicate odontoblast-like cells
  • white arrows indicate dentin-like hard tissue formation.
  • a and C used a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes, and transplanted non-cellular root canal filling material mixed with regeneration promoting compound (CCR3 antagonist, ALK5 inhibitor) into atelocollagen and migration factor G-CSF. It is a thing.
  • B and D are transplants of cellular root canal filling material in which allogeneic dental pulp stem cells (MDPSCs) and migration factor G-CSF are mixed with atelocollagen without pretreatment.
  • E is a statistical analysis of dental pulp regeneration. 28 days after transplantation comparing angiogenesis and nerve fiber elongation in regenerated tissue with those of a non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit and a conventional cellular root canal filling material at the age of 2 years in dogs.
  • B is angiogenesis (BS-1 lectin staining)
  • V is a neovascular
  • C is nerve fiber elongation (PGP 9.5 staining)
  • an arrow shows a neurite.
  • a and C used non-cellular root canal filling material mixed with atelocollagen using CTR3 antagonist, ALK5 inhibitor and G-CSF, using a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes, and B and D
  • the cells were transplanted with a cellular root canal filling material in which allogeneic dental pulp stem cells (MDPSCs) and G-CSF were mixed with atelocollagen without pretreatment.
  • E is a statistical analysis of the amount of angiogenesis
  • F is a statistical analysis of the amount of nerve fiber elongation.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and implant non-cellular root canal filling material mixed with atelocollagen with regeneration promoting compound (CCR3 antagonist, ALK5 inhibitor) and migration factor G-CSF.
  • a and B were transplanted with a cellular root canal filling material in which allogeneic dental pulp stem cells (MDPSCs) and G-CSF were mixed with atelocollagen without pretreatment.
  • MDPSCs allogeneic dental pulp stem cells
  • G-CSF G-CSF
  • a and B are low-magnification HE photographs in 13 days after transplantation comparing the regenerated dental pulp tissue of non-cellular root canal filling material with and without the regeneration promoting compound
  • ALK5 inhibitor at 8 months of age in dogs head indicates the top of regenerated tissue
  • C and D are high magnification
  • black arrows indicate odontoblast-like cells
  • white arrows indicate dentin-like hard tissue formation.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the acellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which only the CCR3 antagonist is mixed with atelocollagen.
  • Fig. 13 is a photographic view 13 days after transplantation comparing the neovascularization and nerve fiber elongation in regenerated tissues of the non-cellular root canal filling material with and without the regeneration promoting compound ALK5 inhibitor at 8 months of age in dogs.
  • a and B indicate angiogenesis (BS-1 lectin staining), V indicates a neovascular, C and D indicate nerve fiber elongation (PGP 9.5 staining), and arrows indicate neurites.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the acellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which only the regeneration promoting compound CCR3 antagonist is mixed with atelocollagen.
  • a and B are dental pulp markers (TRH-DE immunostaining), arrows are positive cells, and C and D are in situ hybridization of odontoblast marker Enamelysin mRNA.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the acellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which only the CCR3 antagonist is mixed with atelocollagen.
  • A, B are low-magnification in the HE staining photograph of 13 days after transplantation comparing the regenerated dental pulp tissue with the non-cellular tooth tissue regeneration promotion kit supplemented with the migration factor bFGF or G-CSF at 8 months of age in dogs
  • Arrowhead indicates the top of regenerated tissue
  • C and D are high magnification
  • black arrows indicate odontoblast-like cells
  • white arrows indicate dentine-like hard tissue formation.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor bFGF are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes, and transplant the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF are mixed with atelocollagen.
  • 13A is a photograph showing 13 days after transplantation comparing angiogenesis and nerve fiber elongation in regenerated dental pulp tissue with a noncellular tooth tissue regeneration promotion kit supplemented with migration factor bFGF or G-CSF at 8 months of age in dogs.
  • B shows angiogenesis (BS-1 lectin staining)
  • V shows new blood vessels
  • C, D show nerve fiber elongation (PGP 9.5 staining)
  • arrows show neurites.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor bFGF are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes, and transplant the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF are mixed with atelocollagen.
  • the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF are mixed with atelocollagen.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor bFGF are mixed with atelocollagen.
  • B and D use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes, and are transplanted with a regeneration promoting compound CCR3 antagonist and an ALK5 inhibitor and a non-cellular dental pulp regeneration promoter mixed with migration factor G-CSF in atelocollagen.
  • 28-day HE stained photographs comparing transplanted dental pulp tissue of non-cellular root canal filling material with and without trypsin pretreatment at 2 years of age in dogs.
  • C and D are high magnification
  • black arrows indicate odontoblast-like cells
  • white arrows indicate dentin-like hard tissue formation.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material mixed with atelocollagen with the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF.
  • B and D did not undergo trypsin pretreatment, but were transplanted with the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist, ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF were mixed with atelocollagen.
  • a and B are photographs of 28 days after transplantation comparing angiogenesis and nerve fiber elongation in regenerated dental pulp tissue of non-cellular root canal filling material with and without trypsin pretreatment at 2 years of age in dogs.
  • C, D are nerve fiber elongation (PGP 9.5 staining)
  • arrows indicate neurites.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material mixed with atelocollagen with the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF. .
  • a and B are photographs of regenerated tissues 28 days after transplantation using dental pulp and odontoblast markers in regenerated dental pulp tissue of non-cellular root canal filling material with and without trypsin pretreatment at 2 years of age in dogs. Is a dental pulp marker (TRH-DE immunostaining), arrows are positive cells, C, D are in situ hybridization of odontoblast marker Enamelysin mRNA.
  • a and C use a pretreatment agent consisting of trypsin for 10 minutes and transplant the non-cellular root canal filling material mixed with atelocollagen with the regeneration promoting compound CCR3 antagonist and ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF.
  • B and D did not undergo trypsin pretreatment, but were transplanted with the non-cellular root canal filling material in which the regeneration promoting compound CCR3 antagonist, ALK5 inhibitor and migration factor G-CSF were mixed with atelocollagen.
  • FIG. 7 shows CCL11 and CCR3 mRNA expression in each lot of human young and old dental pulp stem cells (DPSCs).
  • the non-cellular root canal filling material for tooth tissue regeneration comprises a regeneration promoting compound containing at least one of a CCR3 antagonist, a CCL11 neutralizing antibody and an ALK5 inhibitor, and an extracellular matrix.
  • the acellular root canal filling can include at least one migration factor such as G-CSF, bFGF and SDF-1.
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit for tooth tissue regeneration includes a pretreatment agent containing a serine protease, and a regeneration agent containing at least one of a CCR3 antagonist, a CCL11 neutralizing antibody and an ALK5 inhibitor. It has a promoting compound and an extracellular matrix.
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit can include at least one migration factor such as G-CSF, bFGF and SDF-1.
  • Tooth tissue regeneration is regeneration of tissue including at least one of dental pulp, dentin and apical periodontal tissue.
  • ALK5 inhibitors and CCR3 antagonists or CCL11 neutralizing antibodies are effective in dental pulp regeneration
  • ALK5 inhibitors are more effective in angiogenesis than CCR3 antagonists or CCL11 neutralizing antibodies
  • CCR3 antagonists or CCL11 Neutralizing antibodies are more effective at neurogenesis than ALK5 inhibitors.
  • the mixing ratio is not particularly limited, and for example, 10% by weight: 90% by weight to 90% by weight: 10% by weight Is possible.
  • the ALK5 inhibitor is not particularly limited, and is, for example, the following compound.
  • the CCR3 antagonist is not particularly limited, and is, for example, the following compound.
  • A is CH 2 or O
  • R 1 is NHR (R is C 1 -C 6 alkyl)
  • R 2 is C 1 -C 6 alkylene-phenyl and
  • R 3 is H or C 1 -C 6 alkyl
  • R 4 is H or C 1 -C 6 alkyl.
  • CCL11 transmits a signal by using CCR3 as a receptor, but an anti-CCL11 neutralizing antibody has an action of binding CCL11 and inhibiting CCL11 binding to CCR3, and CCL11 signal transduction is suppressed.
  • CCR3 antagonists also bind to the receptor CCR3, and also have an effect of inhibiting CCL11 binding to CCR3.
  • Commercially available anti-CCL11 neutralizing antibodies can be used.
  • the CCL11 neutralizing antibody or CCR3 antagonist that inhibits CCL11 according to the present embodiment, or the ALK5 inhibitor that inhibits GDF11 signaling is, for example, 50 ng / ml to 50 ⁇ g / ml, preferably 3 ⁇ g / ml to 30 ⁇ g / ml. It is ml.
  • the extracellular matrix is not particularly limited, but, for example, collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, chitosan, And at least one of PLA, PLGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold.
  • the acellular root canal filling can include a migration factor.
  • the migration factor is, for example, at least one of G-CSF, SDF-1, bFGF, TGF- ⁇ , NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF and HGF. It includes one. It is added for the purpose of promoting the migration ability of the host tooth cells around the tooth which declines with age.
  • the migration factor is preferably G-CSF or bFGF or SDF-1.
  • the acellular root canal filling material according to the present embodiment is preferably used for young individuals, but is applicable to middle and old individuals.
  • a young individual is not particularly limited, for example, in the case of a human, it is 1 to 29 years of age, and in the case of a rat, it is 1 to 29 weeks of age after birth. In the case of a dog, it is 1 week old to 1 year old.
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit according to this embodiment has a pretreatment agent containing serine protease and the above-mentioned non-cellular root canal filling material.
  • the pretreatment agent is used before inserting the non-cellular root canal filling material into the canal.
  • Pretreatment is the injection of a liquid containing serine protease into the root canal.
  • Serine protease is a protease (proteolytic enzyme) having a serine residue that performs nucleophilic attack as a catalytic residue.
  • Serine proteases are classified into subtilisin-like serine proteases and chymotrypsin-like serine proteases based on similarity of amino acid sequences and conformations.
  • the former includes subtilisin BPN ', thermidase, proteinase K, lantibiotic peptidase, kexin, cucumisin and the like, and the latter includes trypsin, chymotrypsin, thrombin, factor Xa, elastase and the like.
  • the serine protease is a chymotrypsin-like serine protease, more preferably trypsin.
  • the concentration of serine protease included in the pretreatment agent is not particularly limited as long as it can degrade the inhibitor that suppresses tissue regeneration in teeth and periodontal tissue or can activate the migration factor. There is no, for example, 10 ⁇ g / ml (0.001%) to 50 mg / ml (5%), preferably 500 ⁇ g / ml (0.05%) to 5 mg / ml (0.5%).
  • the time for which the pretreatment agent is injected into the root canal is not particularly limited as long as it can degrade the inhibitor that inhibits tissue regeneration in the teeth and periodontal tissue, or can activate the migration factor. However, it is, for example, 3 minutes to 30 minutes, preferably 5 minutes to 20 minutes, and more preferably 10 minutes.
  • the pretreatment agent according to the present embodiment can also include nanobubbles in addition to the serine protease.
  • Nanobubbles have vesicles formed of lipids and a gas or gas precursor that fills the inside of the vesicles.
  • the diameter of the nanobubbles is not particularly limited, and is, for example, 10 to 500 nm, preferably 70 to 300 nm.
  • the diameter of the nanobubbles is measured, for example, by a nanoparticle distribution measuring apparatus (SALD-7100, Shimadzu Corporation).
  • SALD-7100 nanoparticle distribution measuring apparatus
  • the lipid composition, charge state, density, weight, particle size, etc. of the nanobubbles can be appropriately designed.
  • the lipids used to prepare the vesicles consist of, but not limited to, membrane components containing lipids.
  • Lipids are, for example, phospholipids, glyceroglycolipids and glycosphingolipids, as well as cationic lipids in which a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group or a quaternary ammonium group has been introduced into these lipids. It is.
  • the nanobubble concentration is indicated by the number of nanobubbles in the pretreatment agent.
  • the nanobubble concentration is not particularly limited, but can be, for example, 2 ⁇ 10 7 pieces / cm 3 to 2 ⁇ 10 9 pieces / cm 3 .
  • the nano bubble concentration can be quantitatively analyzed, for example, by electron spin resonance (ESR).
  • the non-cellular tooth tissue regeneration promoting kit according to the present embodiment is preferably used for middle and old aged individuals.
  • the middle-aged individual is not particularly limited.
  • the age in the case of a human, the age is 30 to 49 and in the case of a rat, the age is 30 to 39 weeks of age, and dogs If the age is between 2 and 4 years old.
  • the elderly individual is not particularly limited.
  • the age in the case of a human, the age is 50 years or more, in the case of a rat, it is 40 weeks old or more, and in the case of a dog, it is 5 years or more It is. Therefore, in the present specification, human middle and old individuals define individuals of 30 years or older, rat middle and old individuals define individuals of 30 weeks of age and older, and dog middle and elderly individuals It defines individuals over 2 years.
  • Example 1 Canine allogeneic membrane separation dental pulp stem cells
  • the maxillary canine is removed, and a secant line that does not reach the dental pulp from the crown to the root part is inserted longitudinally with a turbine bar, and 20 ⁇ g / ml Gentamycin (Gentalol (registered trademark) ), Nippon Eye Drops Research Institute, Inc.) and 0.25 ⁇ g / ml Amphotericin B (Fungizon (registered trademark), Bristol Myers Co., Ltd.) containing Hanks solution as transport solution, using special transport containers to control teeth under temperature control Was transported within one hour.
  • the dental pulp was excised and minced in a cleebench, 5 ml of a 0.04 mg / ml riberase solution was added and mixed by inversion, and shaken at 37 ° C. and 500 rpm for 30 minutes on a Thermomixer Comfort (Eppendorf Co., Ltd.). After shaking, the cells were suspended 30 times and then centrifuged at 200 rpm for 1 minute to collect the supernatant in a centrifuge tube. The supernatant was centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes, DMEM with 10% canine serum was added to the precipitated cells, and after suspension, it was centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes.
  • the final concentration of migration factor G-CSF (neutrogin, Nakagai Pharmaceutical) in DMEM containing 10% canine self-serum in 24 wells of the lower structure was seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l in the lower part of the membrane. 100 ng / ml was added, G-CSF was removed after 48 hours, and the medium was changed to DMEM containing 10% canine autologous serum. The cells were further cultured, passaged after 70% confluence, passaged to passage 6, and frozen.
  • trypsin preparation Francetin T powder (crystal Trypsin 2,500 USP per 10 mg, Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) 500 ⁇ g / ml (0.05%, dissolved in nano bubble water) for 10 minutes in the right root canal , Washed with saline.
  • the left root canal was not pretreated with trypsin in the root canal, and suspended 5 ⁇ 10 5 cells of the same type of membrane-separated dental pulp stem cells in 20 ⁇ l of collagen, and further 150 ng of G-CSF (neutrogin) was added to make a root canal filling material (cellular root canal filling material), and this root canal filling material was injected while being careful not to put air bubbles in the root canal.
  • the membrane-sorted dental pulp stem cells are dental pulp stem cells sorted using the membrane sorter described above.
  • Angiogenesis was carried out in a 30-day sample for comparison staining with immunofluorescence staining with 20 ⁇ g / ml of Fluorescence Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin 1 / fluorescein-galanthus nivalis (snowdrop) lectin, BS-1 lectin, Vector lab.
  • the Neurite outgrowth was compared by immunostaining with PGP 9.5 (Ultra Clone, 1: 10,000) in a 28-day sample.
  • TRH-DE Thirotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme
  • in situ hybridization of odontoblast marker enamelysin were performed on a 28-day preparation (Iohara (Iohara) , et al., 2011, Tissue Engineering part A).
  • TRH-DE immunostaining includes primary antibody (anti-canine TRH-DE, mouse IgM clone # 6E5E, 1: 100, MBL) and secondary antibody (Goat anti-mouse IgM, poly-biotin, 1:50, Vector) Color was developed using DAB (VECTASTAIN ABC kit, Vector lab.).
  • a non-cellular root canal filling material containing a regeneration promoting compound (ALK5 inhibitor and CCR3 antagonist) and migration factor G-CSF was injected into the root canal after exfoliation of the teeth of middle-aged dogs, After 28 days, no inflammatory cell infiltration or internal absorption was observed, which is similar to the conventional injection of a non-trypsin-pretreated non-trypsin-treated allogeneic membrane-separated dental pulp stem cell and G-CSF containing cellular root canal filling material There was regeneration of the pulp like tissue rich in vascular rich sparse connective tissue (FIG. 1A-D).
  • TRH-DE positive cells were found in some cells as in the conventional application of the cellular root canal filling material (FIG. 3A, B) ).
  • cells expressing mRNA of enamelysin were seen in the dentin wall (Fig. 3C, D).
  • Example 2 Pulmonary pulp regeneration in young dogs with a noncellular tooth tissue regeneration promotion kit
  • the young (8-month-old) dog is treated for demyelination of the upper and lower left and right anterior teeth, and enlarged to # 55 up to the apex, 5% sodium hypochlorite solution and 3% peroxide They were alternately washed with hydrogen water, further washed with physiological saline, completely dried in the root canal at the paper point, hemostasis, and then completely sealed with cement and resin.
  • the temporary seal was removed, and after alternate washing and washing with physiological saline again, the root canal was reacted with 3% EDTA (Smear clean) for 2 minutes, and further washed with physiological saline and dried. After that, soak a trypsin preparation (Francetin T powder (crystal Trypsin 2,500 USP per 10 mg)) 5 mg / ml (0.5%, dissolved in nanobubble water) in the root canal for 10 minutes to pretreat and wash with saline did.
  • trypsin preparation Francetin T powder (crystal Trypsin 2,500 USP per 10 mg)
  • a non-cellular root provided with a CCR3 antagonist ((SB 328 437, 200 ng) and an ALK 5 inhibitor (SB 43 542, 200 ng) as regeneration promoting compound and 20 ⁇ l extracellular matrix collagen (Koken atelocollagen implant)
  • the canal filling material was filled into the root canal, while the root canal in the left and upper jaws was acellular root with CCR3 antagonist (SB 328 437, 200 ng) as regeneration promoting compound and 20 ⁇ l extracellular matrix collagen (Koken atelocollagen implant)
  • the tube filling material was filled in the root canal, then a hemostatic gelatin sponge (spongel) was placed thereon, and the cavity was completely sealed with glass ionomer cement and photopolymer resin.
  • non-cellular root canal filling material containing ALK5 inhibitor and CCR3 antagonist and collagen was injected into the canal after demyelination of the young dog teeth, and after 13 days, inflammatory cell infiltration or internalization No absorption was observed, and pulp regeneration of sparse connective tissue with abundant blood vessels was observed (Fig. 4A, C).
  • regeneration amount tends to decrease slightly compared to root canal filling material containing both ALK5 inhibitor and CCR3 antagonist Although seen, regeneration of dental pulp tissue was similarly seen (Fig. 4B, D).
  • Example 3 Comparison of canine young post-myelination dental pulp regeneration with non-cellular tooth tissue regeneration promotion kit containing migration factor bFGF or G-CSF
  • the young (8-month-old) dog is treated for demyelination of the upper and lower left and right anterior teeth, and enlarged to # 55 up to the apex, 5% sodium hypochlorite solution and 3% peroxide
  • the root canal is completely dried at the paper point, and after hemostasis, the root canal is reacted with 3% EDTA (Smear clean) for 2 minutes, and further saline Washed and dried.
  • 3% EDTA Smear clean
  • trypsin preparation Francetin T powder (crystal Trypsin 2,500 USP per 10 mg)
  • Dietin T powder crystal Trypsin 2,500 USP per 10 mg
  • Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 5 mg / ml (0.5%, dissolved in nano bubble water) in the root canal for 10 minutes and perform pretreatment , Washed with saline.
  • CCR3 antagonist ((SB328437, 200 ng) and ALK5 inhibitor (SB431542, 200 ng) as regeneration promoting compounds and bFGF (Fiblast Spray, Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) 150 ng as a migration factor in the root canals of the right and lower jaws And a non-cellular root canal filling material having 20 ⁇ l of extracellular matrix collagen (Koken atelocollagen implant) was filled in the root canal, while CCR3 antagonist ((SB 328 437, 200 Fill the root canal with non-cellular root canal filling material with ng) and ALK5 inhibitor (SB 43 542, 200 ng), 150 ng of G-CSF (neutrogin) as migration factor, and 20 ⁇ l of extracellular matrix collagen (Koken atelocollagen implant) After that, place a hemostatic gelatin sponge (spongel) on it, and use a glass ionomer cement and a photopolymer resin.
  • bFGF Fiblast Spray, Kaken Pharmaceutical
  • the sinus was completely sealed, extracted 13 days after transplantation, and 5 ⁇ m paraffin sections of longitudinal section were prepared according to a general method, and morphological observation was performed after HE staining, angiogenesis was BS-1 lectin, and neurite extension was PGP9. Immunostaining and comparative examination were performed at .5, and further immunostaining of TRH-DE and in situ hybridization of enamelysin were performed on a 13-day sample.
  • non-cellular root canal filling material containing ALK5 inhibitor and CCR3 antagonist, bFGF, and collagen was injected into the root canal after demyelination of young dog teeth, and after 13 days G- Similar to the CSF-containing non-cellular root canal filling material, regeneration of dental pulp-like tissue with new blood vessels was observed, but the amount of dental pulp regeneration showed a slight decrease (FIG. 7A-D). In both cases, it was also observed that odontoblast-like cells were attached to the side wall of dentin to form dentin (Fig. 7C, D). Dentin formation tended to be slightly higher in G-CSF. Furthermore, in both cases, angiogenesis (Fig. 8A, B) and neurite outgrowth (Fig.
  • TRH-DE positive cells were similarly found in some cells (FIGS. 9A, B).
  • cells expressing mRNA of enamelysin were similarly found in the dentin wall (Fig. 9C, D).
  • Example 4 Comparison of canine middle age post-myelination dental pulp regeneration with non-cellular root canal filling material with and without trypsin pretreatment
  • the middle and left middle incisors of middle-aged (2-year-old) dogs are demineralized and expanded to # 5 up to the apex, 5% sodium hypochlorite solution and 3% peroxide They were alternately washed with hydrogen water, further washed with physiological saline, completely dried in the root canal at the paper point, hemostasis, and then completely sealed with cement and resin.
  • ALK5 inhibitor SB 431 542, 200 ng
  • CCR3 antagonist SB 328 437, 200 ng
  • extracellular matrix collagen 20 ⁇ l Keren atelocollagen implant
  • G-CSF neutralin, 150 ng as migration factor
  • Example 5 Human dental pulp stem cell culture and analysis of CCL11 and CCR3 mRNA expression
  • the dental pulp is removed from the third molars of the elderly (60, 70) and young (19, 26), and after mincing in Hanks solution, 37 mg, 1 hour, 0.04 mg /
  • the dental pulp cells are isolated by enzymatic digestion with ml Liberase solution (Roche diagnostics, Pleasanton, CA, USA) and separated into DMEM (D6429) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing 10% human serum, 2
  • the cells were seeded at a cell concentration of ⁇ 4 ⁇ 10 4 / ml in 35 mm dishes. Thereafter, the medium was changed every 2 to 3 days, and was passaged when it reached 70% confluence.
  • TrypLE (R) Select (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) was used.
  • Real-time RT-PCR PowerUp® SYBR® Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) for CCL11 mRNA; Power SYBR® for b-actin and CCR3 mRNA ) Amplified and detected on an Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems) using Green master mix (Applied Biosystems).
  • the reaction conditions for Real-time RT-PCR were 40 cycles, one cycle consisting of 95 ° C. for 15 seconds and 65 ° C. for 1 minute.
  • the nucleotide sequences of the primers used are as shown in Table 1.
  • the mRNA expression of the amplified gene was corrected with b-actin mRNA.
  • CCR3 mRNA expression was very low and CCL11 mRNA expression also tended to be absent or low at short passages (6 to 10 passages).
  • CCL11 mRNA and CCR3 mRNA expression were observed after long passages (19-21) (FIG. 13).
  • the sensitivity of CCL11 is increased by the increase in CCR3 expression which is a receptor for CCL11 (Wang H et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011). That is, it has been suggested that the expression of CCL11 and the expression of CCR3, which is a receptor for CCL11, may be correlated particularly with age.

Abstract

自家あるいは同種幹細胞あるいは幹細胞由来成分を移植しない場合であっても、効果的な歯組織再生を可能とする非細胞性歯組織再生促進キットを提供する。セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、を有する。中高齢個体に使用されることが好ましい。

Description

非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット
　本発明は、歯髄、象牙質及び根尖歯周組織の再生を促進する、幹細胞あるいは幹細胞成分を用いない、非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キットに関する。
　超高齢化社会において、歯が健康でしっかり噛めることは健康長寿のために重要である。しかしながら、中高齢者では、すでに歯の神経を除去（抜髄）した歯が数十年後に再感染して根の下に膿が溜まる病気（感染根管）に陥っている場合が20%を超え、さらに約25%は治療を受けてもなかなか完治できない。その慢性的な感染病巣が免疫力の低下した高齢者の全身に与える影響は大きい。高齢者では骨粗鬆症治療薬服用中で抜歯できない場合も多い。また、抜歯してもインプラントを適用できる症例は中高齢者では減少する。
　一方、歯喪失は咬合・発音・味覚・触覚・審美性低下、QOL低下を招く。最近では、歯や口腔機能低下によるオーラル・フレイルが低筋力や低身体機能等のサルコペニアや低栄養等による生活機能の低下を招き、ひいては要介護状態に陥ることが懸念されている。
　従って、歯及び口腔機能の維持のために、自己の不用歯から分取した歯髄幹細胞を自家移植して、あるいは他者の不用歯から分取した歯髄幹細胞を同種移植して、抜髄しても感染根管・抜歯に至らないように歯を元通りに回復させる歯髄再生治療法が開発されている（特許文献１－３）。また、歯髄幹細胞のみならず、骨髄や脂肪由来の他の組織幹細胞を自家あるいは同種移植しても歯髄は再生される。
　しかしながら、歯髄幹細胞移植に比べて歯髄再生量、血管新生量、神経再生量が劣る（特許文献４）。すでに自家歯髄幹細胞移植による歯髄再生治療法は臨床研究により安全性が確認され、有効性が示唆されている（非特許文献１）。
　一方、歯髄再生治療においては、前者のstem cell therapy(幹細胞移植法)に対して、cell homing（細胞遊走法）がある。ヒト若齢の歯根未完成歯に対しては、歯髄幹細胞を用いずに根管内に血餅を満たす方法が主流である（非特許文献２）。あるいは血餅の代わりにPRP(Platelet-Rich Plasma)を注入する方法もある（非特許文献３）。
　しかしながら、歯髄固有組織の再生はほとんどみられず、主に血管に富む線維性・骨様組織が再生されるにすぎないといわれている（非特許文献４）。動物実験においては、幹細胞を使わず、stromal cell derived factor (SDF1α)、basic fibroblast growth factor (bFGF)、platelet-derived growth factor (PDGF)、stem cell factor (SCF)、及びgranulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)等の細胞成長因子growth factorやサイトカインを遊走因子として用いるcell homing(細胞遊走法)も開発されている（非特許文献５）。
　しかしながら、十分な量の歯髄再生にはいたらず、大部分は血管を伴うかなり密な線維性結合組織であり、根管全部が石灰化する場合もあると報告されている（非特許文献６、７）。よってこれまで、特に根完成歯では歯髄組織再生には幹細胞が必須であると考えられている（非特許文献８）。
　しかしながら、自家幹細胞移植は、歯髄幹細胞を用いる場合は智歯等の自己の不用歯が必要であること、細胞加工物の安全性確認に高額のコストがかかること、必要な時にすぐには細胞を供給できないこと、さらに、中高齢者では幹細胞形質が変化し、分取できる歯髄幹細胞総数が減少し増幅にも時間がかかるという欠点がある。同種移植では、一ロットあたりの細胞製品数の増加により細胞製造加工後の安全性確認に要するコストは自家移植に比べて減少するが、安全性が担保された歯の供給源の問題、ヒト歯髄幹細胞製品化による歯を供給したヒトに対する権利や報酬等の法律の問題、ヒトでの免疫反応の安全性の問題等、未解決な部分が残されている。
　従って、幹細胞あるいは幹細胞由来成分を用いることなく、抜髄あるいは感染根管治療後の歯組織、すなわち、歯髄、象牙質、根尖部歯周組織を再生促進する技術開発が望まれる。一方、歯髄再生のために用いる、宿主細胞を遊走促進する幹細胞源のさらなる研究により、適切なシグナル因子を選択できると考えられている。すなわち、血管新生能、神経分化能をもつ宿主の幹細胞の遊走を促進し、骨形成やセメント質形成能をもつ細胞の遊走を抑制する適切なシグナル因子による歯髄再生法の今後の開発が望まれている（非特許文献９）。
　その中で、中高齢個体の歯髄の再生は若齢個体に比べて遅延する。近年、イヌ動物実験により、中高齢の歯髄幹細胞移植による歯髄再生治療において、CCL11中和抗体/CCR3アンタゴニスト（拮抗剤）あるいはALK5インヒビター（阻害剤）を歯髄幹細胞とともに移植すると歯髄再生が促進された。あるいは、歯髄幹細胞移植前にトリプシンを用いて中高齢の歯の根管内を前処理すると歯髄再生が促進された（特許文献５）。CCL11中和抗体あるいはCCR3アンタゴニストはCCL11がCCR3に結合するのを阻害し、シグナル伝達をブロックする。またGDF11はtype I TGF-beta superfamily receptors ACVR1B (ALK4)、TGFBR1 (ALK5)及びACVR1C (ALK7)と結合するが、シグナル伝達はALK4及びALK5で行われる。ALK5阻害剤はGDF11のシグナル伝達をブロックする。歯髄再生時には、象牙質に蓄積されている歯髄幹細胞からの分泌因子が象牙質から遊離されて、歯髄再生が促されると考えられる（非特許文献１０）。in vitroにおいて老化歯髄幹細胞の分泌因子を含む培養上清にCCR3アンタゴニストを添加することにより培養上清の神経突起伸長促進作用及び遊走促進作用が有意に増加した。またALK5阻害剤を添加することにより、培養上清の血管誘導能及び神経突起伸長促進作用が有意に増加した。よって、中高齢イヌでのCCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤の歯髄再生促進作用は血管誘導促進、神経突起伸長促進及び遊走促進作用によることが示唆された。
　しかしながら、若齢イヌの歯髄再生においては、CCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤を歯髄幹細胞とともに移植しても全く効果は認められなかった（特許文献５）。一方、トリプシンは、医薬品として、壊死組織や凝血、変性タンパクを融解させ、創面を正常にして抗生物質の作用を容易にする目的で使用されている（非特許文献１１）。in vitroにおいてトリプシンで処理した象牙質面上に歯髄幹細胞を播種すると、細胞の付着性が増し、象牙芽細胞への分化促進がみられた。
　よって、中高齢イヌでのトリプシン前処理での歯髄再生促進作用は蛋白融解作用による中高齢象牙質に蓄積されているインヒビターの不活性化あるいは前駆体の切断による活性化、象牙質への細胞付着促進、象牙芽細胞分化促進作用によることが示唆された。
　しかしながら、若齢イヌの歯髄再生においては、トリプシン前処理による効果は全く認められなかった（特許文献５）。また、トリプシン前処理のみで歯髄幹細胞を移植しない場合、あるいはCCR3アンタゴニストあるいはALK5阻害剤のみで歯髄幹細胞を移植しない場合、歯髄再生はほとんど認められなかった（特許文献５）。
特許５６２１１０５号公報 特許６０３１６５８号公報 特許５７４８１９４号公報 特許５９３９５５９号公報 特願2016-072306、PCT/JP2017/13572
Nakashima M., Iohara K., Murakami M., Nakamura H., Sato Y., Ariji Y., Matsushita K.: Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: A pilot clinical study. Stem Cell Res Therapy. 8(1):61, 2017. Galler KM.：Clinical procedures for revitalization: current knowledge and considerations. Int Endod J. 2016 Oct;49(10):926-36. Kontakiotis EG, Filippatos CG, Tzanetakis GN, Agrafioti A.: Regenerativeendodontic therapy: a data analysis of clinical protocols. J Endod. 41(2):146-54. 2015. Del Fabbro M, Lolato A, Bucchi C, Taschieri S, Weinstein RL.: Autologous plateletconcentrates for pulp and dentin regeneration: a literature review of animal studies. J Endod. 42(2):250-7, 2016. Yang J., Yuan G., Chen Z.: Pulp Regeneration: CurrentApproaches and Future Challenges. Front Physiol.: 7:58, 2016. He L, Kim SG, Gong Q, Zhong J, Wang S,Zhou X, Ye L, Ling J, Mao JJ.: Regenerative endodontics for adult patients. J Endod. 43(9S):S57-S64, 2017. Iohara K, Murakami M, Takeuchi N, Osako Y, Ito M, Ishizaka R, Utunomiya S, Nakamura H, Matsushita K, Nakashima M.: A novel combinatorial therapy with pulp stem cells and granulocyte colony-stimulating factor for total pulp regeneration. Stem Cells Transl. Med. 2(7): 521-533, 2013. Cao Y, Song M, Kim E, Shon W, Chugal N, Bogen G, Lin L, Kim RH, Park NH, Kang MK.：Pulp-dentin Regeneration: Current State and Future Prospects. J Dent Res. 94(11):1544-51, 2015. Yang J, Yuan G, Chen Z.: Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges.Front Physiol. 7:58, 2016. eCollection 2016. KawamuraR, Hayashi Y, Murakami H, Nakashima M.: EDTA soluble chemical components and the conditioned medium from mobilized dental pulp stem cells contain an inductive microenvironment, promoting cell proliferation, migration and odontoblastic differentiation. Stem Cell Res.Ther. 7(1):77, 2016. 皮膚科性病科雑誌 64巻, 野口義圀他, 497-506頁1954年
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、歯組織再生を行う際、非細胞性、特に、自家あるいは同種幹細胞あるいは幹細胞由来成分を移植しない場合であっても、効果的に歯組織再生を可能とする非細胞性根管充填材を提供することを目的とする。またその非細胞性根管充填材を用いる非細胞性歯組織再生促進キットを提供することを目的とする。
　本発明にかかる歯組織再生のための非細胞性根管充填材は、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする。非細胞性根管充填材には、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
　本発明にかかる歯組織再生のための非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性歯組織再生促進キットには、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
　本発明によれば、自家あるいは同種歯髄幹細胞あるいはそれらの幹細胞由来成分（上清、secretomeあるいはexosome）を移植しない場合であっても、効果的に歯組織再生が可能である。
イヌ２歳齢において、非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織を従来の細胞性根管充填材による再生歯髄組織と比較した移植後28日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物（CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤）をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材、及び遊走因子G-CSFを移植したものである。Ｂ及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）と遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。Ｅは歯髄再生量の統計学的解析を行ったものである。 イヌ２歳齢において、再生組織中の血管新生及び神経線維伸長を、非細胞性歯組織再生促進キットと従来の細胞性根管充填材によるものと比較した移植後28日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）であり、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤及びG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものであり、Ｂ及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）とG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。Ｅは血管新生量の統計学的解析、Ｆは神経線維伸長量の統計学的解析を行ったものである。 イヌ２歳齢において、歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後28日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカー　Enamelysin mRNAのin situ hybridizationであり、矢印は陽性細胞を示す。そのうちＡ、及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物（CCR3アンタゴニスト、ALK5阻害剤）をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材、及び遊走因子G-CSFを移植したものであり、Ｂ、及びＤは前処理を行わずに、同種歯髄幹細胞（MDPSCs）とG-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織を比較した移植後13日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の、再生組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後13日の写真図である。Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、再生促進化合物ALK5阻害剤の有無による非細胞性根管充填材の、再生組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後13日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤をアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、CCR3アンタゴニストのみをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織を比較した移植後13日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍であり、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後13日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）を示し、Vは新生血管を示し、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ８か月齢において、遊走因子bFGF又はG-CSFを添加した非細胞性歯組織再生促進キットによる再生歯髄組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後13日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子bFGFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性歯髄再生促進剤を移植したものである。 イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織を比較した移植後28日のH-E染色写真図で、Ａ、Ｂは低倍、arrow headは再生組織最上部を示し、Ｃ、Ｄは高倍であり、黒矢印は象牙芽細胞様細胞、白矢印は象牙質様硬組織形成を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織中の血管新生及び神経線維伸長を比較した移植後28日の写真図で、Ａ、Ｂは血管新生（BS-1 lectin染色）、Ｃ、Ｄは神経線維伸長（PGP9.5染色）であり、矢印は神経突起を示す。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 イヌ２歳齢において、トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材の再生歯髄組織中の歯髄及び象牙芽細胞マーカーを用いた移植後28日の再生組織の写真図であり、Ａ、Ｂは歯髄マーカー（TRH-DE免疫染色）で矢印は陽性細胞であり、Ｃ、Ｄは象牙芽細胞マーカーEnamelysin mRNAのin situ hybridizationである。そのうちＡ及びＣはトリプシンからなる前処理剤を10分使用し、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。Ｂ及びＤはトリプシン前処理を行わず、再生促進化合物CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤及び遊走因子G-CSFをアテロコラーゲンに混ぜた非細胞性根管充填材を移植したものである。 ヒト若齢及び高齢者由来歯髄幹細胞（DPSCs）の各ロットにおけるCCL11とCCR3のmRNA発現を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかる歯組織再生のための非細胞性根管充填材は、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性根管充填材には、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
　本実施形態にかかる歯組織再生のための非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する。非細胞性歯組織再生促進キットには、G-CSF、bFGF及びSDF-1等の少なくとも一つの遊走因子を包含させることが可能である。
　歯組織再生とは、歯髄、象牙質、及び、根尖歯周組織の少なくとも何れか一つを包含する組織の再生である。
　ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体はともに歯髄再生において効果的であるが、ALK5阻害剤はCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体よりも血管新生において効果的であり、一方で、CCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体はALK5阻害剤よりも神経新生において効果的である。ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体の混合物を使用する場合においてはその混合割合は特に限定されるものではなく、例えば10重量％：90重量％～90重量％：10重量％とすることが可能である。
　ALK5阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えば下記化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　またCCR3アンタゴニストは、特に限定されるものではないが、例えば下記化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
ここでＡはCH2又はOであり、R1はNHR(RはC1～C6アルキル)であり、R2はC1～C6アルキレン-フェニルであり、R3はH又はC1～C6アルキルであり、R4はH又はC1～C6アルキルである。
　CCL11はCCR3をレセプターとしてシグナルが伝達されるが、抗CCL11中和抗体はCCL11と結合しCCL11がCCR3に結合するのを阻害する作用を有しCCL11のシグナル伝達が抑制される。一方CCR3アンタゴニストもレセプターCCR3に結合し、同様にCCL11がCCR3に結合するのを阻害する作用を有する。抗CCL11中和抗体は、市販のものを使用することができる。
　本実施形態にかかるCCL11を抑制するCCL11中和抗体あるいはCCR3アンタゴニスト、あるいはGDF11のシグナル伝達を阻害するALK5阻害剤は、例えば50 ng/ml～50μg/mlであり、好ましくは3μg/ml～30μg/mlである。
　細胞外基質は、特に限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、ハイドロキシアパタイト、β-TCP、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む。
　非細胞性根管充填材には、遊走因子を包含させることが可能である。遊走因子は、例えば、G-CSF、SDF-1、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF及びHGFのうち少なくとも何れか一つを含むものである。年齢とともに衰える歯周囲の宿主幹細胞の遊走能を促進させる等の目的で添加する。遊走因子はG-CSFあるいはbFGFあるいはSDF-1であることが好ましい。
　本実施形態にかかる非細胞性根管充填材は若齢個体に使用されることが好ましいが中高齢個体でも適用可能である。なお、若齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢１歳以上２９歳以下であり、ラットである場合は生後1週齢以上29週齢以下であり、イヌである場合は生後1週齢以上１年齢以下である。
　本実施形態にかかる非細胞性歯組織再生促進キットは、セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、前述の非細胞性根管充填材と、を有する。
　前処理剤は、非細胞性根管充填材を根管に挿入する前に使用するものである。前処理とは、セリンプロテアーゼを含有する液体を根管内に注入することである。前処理剤を使用することにより、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する、あるいは潜在型latent formを活性型active formに変える処理を行うことができる。
　セリンプロテアーゼは、触媒残基として求核攻撃を行うセリン残基をもつプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）である。セリンプロテアーゼは、アミノ酸配列や立体構造の類似性から、スブチリシン様(subtilisin-like)セリンプロテアーゼと、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼとに分類される。前者にはsubtilisin BPN'、thermitase、proteinase K、lantibiotic peptidase、kexin、cucumisin等があり、後者にはトリプシン、キモトリプシン、thrombin、Xa因子、elastase等がある。好適には、セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼであり、より好適にはトリプシンである。
　前処理剤に包含されるセリンプロテアーゼの濃度は、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する処理を行うことができる限り特に限定されるものではないが、例えば10μg/ml（0.001%）～50 mg/ml（5 %）であり、好ましくは500μg/ml（0.05%）～5 mg/ml（0.5%）である。
　前処理剤を根管内に注入させる時間は、歯や歯周組織中の組織再生を抑制するインヒビターを分解する、あるいは遊走因子を活性化する処理を行うことができる限り特に限定されるものではないが、例えば3分～30分、好ましくは5分～20分であり、より好ましくは10分である。
　本実施形態にかかる前処理剤には、セリンプロテアーゼに加えてナノバブルを包含することも可能である。ナノバブルは、脂質で形成される小胞と、この小胞内を充填するガス又はガス前駆体とを有する。ナノバブルの直径は、特に限定されるものではないが、例えば10～500ｎｍであり、好適には70～300ｎｍである。なお、ナノバブルの直径は、例えばナノ粒子分布測定装置（ＳＡＬＤ－７１００、島津製作所）により測定される。ナノバブルの脂質組成、帯電状態、密度、重量、粒子径等は、適宜設計することができる。小胞を調製するために使用される脂質は、特に限定されるものではないが、脂質類を含有する膜構成成分からなる。脂質類は、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質及びスフィンゴ糖脂質の他、これらの脂質に、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基又は第４級アンモニウム基が導入されたカチオン性脂質である。
　前処理剤にナノバブルが含まれる場合、ナノバブル濃度は前処理剤中におけるナノバブルの個数にて示される。ナノバブル濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、2×107個/cm3～2×109個/cm3とすることが可能である。ナノバブル濃度は、例えば電子スピン共鳴法(ESR)により定量解析可能である。
　本実施形態にかかる非細胞性歯組織再生促進キットは、中高齢個体に使用されることが好ましい。中齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢３０歳以上４９歳以下であり、ラットである場合は生後30週齢以上39週齢以下であり、イヌである場合は生後２年齢以上４年齢以下である。高齢個体とは、特に限定されるものではないが、例えば、ヒトである場合は年齢５０歳以上であり、ラットである場合は生後40週齢以上であり、イヌである場合は生後５年齢以上である。従って本明細書においてヒト中高齢個体とは３０歳以上の個体を規定するものであり、ラット中高齢個体とは生後30週齢以上の個体を規定するものであり、イヌ中高齢個体とは生後２年以上の個体を規定するものである。
　［実施例１］
　（イヌ同種膜分取歯髄幹細胞）
　イヌ若齢において全身麻酔を施した後、上顎犬歯を抜去し、歯冠から歯根部に歯髄に達しない程度の割線をタービンバーにて縦方向に入れて、20μg/ml ゲンタマイシン（ゲンタロール(登録商標)、株式会社日本点眼薬研究所）及び0.25μg/ml アンホテリシンB（ファンギゾン(登録商標)、ブリストル・マイヤーズ株式会社）含有Hanks液を輸送液として、特殊な運搬容器を用いて温度管理下で歯を１時間以内に輸送した。クリーベンチ内で歯髄を摘出、細切し、0.04 mg/mlリベラーゼ溶液を5 ml加え転倒混和した後、サーモミキサー コンフォート（エッペンドルフ株式会社）の上で37℃、500 rpmで30分振盪した。振盪後、30回懸濁した後、200 rpmで1分遠心し、遠心チューブ内の上清を採取した。この上清を2,000 rpm、5分遠心し、沈殿した細胞に10%イヌ血清含有DMEMを加え、懸濁後2,000 rpm、5分で遠心した。再び遠沈した細胞に10%イヌ血清含有DMEMを5 ml加え、30回懸濁した。細胞懸濁液をトリパンブルー（0.4%, SIGMA）と等量混ぜ、10回懸濁し、生細胞数をカウントした。残りの懸濁液をT25フラスコへ均一に播種後、CO2インキュベータ（パナソニック株式会社）（37℃, CO2 5%）内にて培養し形態を観察した。60～70%コンフルエントに達した後に細胞を継代した。その後、2代目において、幹細胞膜分取法にて膜分取歯髄幹細胞を分取した。すなわち、2×104 cells/100 μlで膜上部に播種し、下部構造体の24 well中に10%イヌ自己血清を含むDMEM中に遊走因子G-CSF (ノイトロジン、中外製薬) を最終濃度で100 ng/ml入れ、48時間後にG-CSFを取り除き、10%イヌ自己血清を含むDMEMに培地交換した。さらに培養して、70 %コンフルエント後に継代し、6代目まで継代し、凍結した。
　細胞表面抗原については、７代目において、20％血清を含むPBS中に1×107 cells/mlで細胞を分散させ、Blocking（FcγIII/II receptor blocking）4℃、20分反応後、幹細胞表面マーカー（CD31 (PE) (JC70A) (Dako)、CD29 (PE-Cy7) (HMb1-1) (eBioscience)、CD44 (Phycoerythrin-Cy7, PE-Cy7) (IM7) (eBioscience)、CD73 (APC) (AD2) (BioLegend)、CD90 (PE) (YKIX337.217) (eBioscience)、CD105 (PE) (43A3) (BioLegend),、及びCXCR4 (FITC) (12G5) (R&D)を90分4℃で暗所にて反応させた。ネガティブコントロールとしては、マウスIgG1 negative control (AbD Serotec)、マウス IgG1 negative control (fluorescein isothiocyanate、FITC) (MCA928F) (AbD Serotec)、マウス IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy7、PE-Cy7) (299Arm) (eBioscience)を用いた。フローサイトメーター (FACS Aria II (BD bioscience)) にて、陽性率を比較した。
　凍結保存した6代目細胞を解凍し、フローサイトメトリーによる表面抗原の発現をみると、CD29、CD44、CD73、CD90及びCD105陽性率は95%以上で、CD31は陰性であり、幹細胞・前駆細胞が多く含まれると考えられた。また、CXCR4陽性率は約18%であった。
　なお、イヌ膜分取歯髄幹細胞は、DLA（Dog leukocyte antigen、イヌ主要組織適合抗原）のハプロタイプを一致させずに同種移植を根管内に移植した場合でも、ハプロタイプを一致させた場合と、歯髄再生において質的及び量的な差はみられないことが判明している。
　（非細胞性歯組織再生促進キットを用いたイヌ中齢の抜髄後歯髄再生：幹細胞治療法との比較）
　全身麻酔を施した後、中齢（２歳齢）のイヌ上下顎前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#50~55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置4日後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を3％EDTA（スメアクリーン、日本歯科薬品株式会社）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。この後、右側根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP）、持田製薬株式会社) 500μg/ml（0.05%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。その後、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（SB328437、TOCRIS bioscience) 200 ng及びALK5阻害剤（SB431542、TOCRIS bioscience）200 ng、遊走因子G-CSF（ノイトロジン、中外製薬株式会社）150ng及び細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。コントロールとして左側の根管には、根管内のトリプシンによる前処理は行わず、同種の膜分取歯髄幹細胞5×105個を20μlのコラーゲンにサスペンドし、さらにG-CSF（ノイトロジン）150 ngを添加して根管充填材(細胞性根管充填材)を作成し、この根管充填材を根管内に気泡を入れないよう注意しながら注入した。なお膜分取歯髄幹細胞は、上述した膜分取培養器を用いて分取した歯髄幹細胞である。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル、アステラス製薬）を置き、グラスアイオノマーセメント（GC Fuji IX EXTRA、GC）及び光重合レジン(Clearfil Mega Bond 及びClearfil DC core automix、クラレノリタケデンタル)にて窩洞を完全封鎖した。移植28日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。それぞれの標本（n=3）の歯髄再生量は1サンプルにつき、4枚の切片を測定し、3サンプルの平均で表した。血管新生は、30日標本において、Fluorescence Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin 1/fluorescein-galanthus nivalis (snowdrop) lectin、BS-1 lectin、Vector lab.) 20μg/ml にて15分免疫染色し比較検討を行った。神経突起伸長は28日標本において、PGP9.5（Ultra Clone、1:10,000）にて免疫染色し比較検討を行った。さらに歯髄及び象牙芽細胞分化を確認するため、それぞれ、歯髄マーカー TRH-DE (Thyrotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme) の免疫染色及び象牙芽細胞マーカー enamelysinのin situ hybridizationを28日標本で行った（Iohara, et al., 2011, Tissue Engineering part A参照）。なお、TRH-DE免疫染色は一次抗体(anti-canine TRH-DE, mouse IgM clone #6E5E, 1: 100, MBL) および二次抗体（Goat anti-mouse IgM, poly-biotin, 1:50, Vector）を用いて、DAB（VECTASTAIN ABCキット、Vector lab.）で発色した。
　トリプシン前処理後、再生促進化合物(ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト)及び遊走因子G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を中齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、28日後、炎症性細胞浸潤や内部吸収はみられず、従来法の、トリプシン前処理せず同種膜分取歯髄幹細胞及びG-CSFを含有する細胞性根管充填材の注入に比べて同様の、血管に富む疎性結合組織の歯髄様組織の再生がみられた（図１A-D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図１C、D）。歯髄再生量に統計学的有意差はみられなかった（図１E）。非細胞性歯組織再生促進キットを適用すると細胞性根管充填材と同様に血管新生(図2 A、B)や神経突起伸長(図2 C、D)がみられ、血管新生量は、28日後において、非細胞性歯組織再生促進キットを適用したものは、従来の細胞性根管充填材に比べて有意差はみられなかった(図2 E)。神経突起伸長量も、28日後において、両者に有意差はみられなかった(図2F)。さらに、非細胞性歯組織再生促進キットを適用した再生組織において、従来の細胞性根管充填材適用と同様に、一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図3 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞がみられた(図3C、D)。
　これらの結果により、トリプシン前処理後、再生促進化合物(ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト)及び遊走因子G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、従来の歯髄幹細胞及びG-CSF移植による歯髄再生と同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
　［実施例２］
　（非細胞性歯組織再生促進キットによるイヌ若齢の抜髄後歯髄再生）
　全身麻酔を施した後、若齢（８か月齢）のイヌ上下顎左右前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置3日後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））5 mg/ml（0.5%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。さらに、右側上下顎の根管には再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）並びに細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。一方、左側上下顎の根管には、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（SB328437、200 ng）及び細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を備える非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植13日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを13日標本で行った。 
　トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を若齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、13日後、炎症性細胞浸潤や内部吸収はみられず、豊富な血管を伴う疎性結合組織の歯髄再生がみられた（図4A、C）。また、トリプシン前処理後、CCR3アンタゴニスト及びコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を注入したところ、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト両方を含有する根管充填剤に比べて再生量はやや減少傾向はみられたが、同様に歯髄組織の再生がみられた（図4B、D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図4C、D）。また、両者とも、同様に血管新生(図5 A、B)や神経突起伸長(図5 C、D)がみられた。両者の非細胞性歯組織再生促進キットによる再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図6 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図6C、D)。
　これらの結果により、トリプシン前処理後、CCR3アンタゴニスト及びコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンを含有する非細胞性根管充填材とほぼ同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙芽細胞様細胞が付着し、象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
　［実施例3］
　（遊走因子bFGFあるいはG-CSFを含有した非細胞性歯組織再生促進キットによるイヌ若齢の抜髄後歯髄再生の比較）
　全身麻酔を施した後、若齢（８か月齢）のイヌ上下顎左右前歯部に抜髄処置を行い、根尖部まで#55で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、根管内にトリプシン製剤（フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））(持田製薬株式会社) 5 mg/ml（0.5%、ナノバブル水に溶解）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。さらに、右側上下顎の根管には再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）、遊走因子としてbFGF（フィブラストスプレー、科研製薬株式会社）150ng、並びに、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。一方、左側上下顎の根管には、再生促進化合物としてCCR3アンタゴニスト（（SB328437、200 ng）及びALK5阻害剤（SB431542、200 ng）、遊走因子としてG-CSF（ノイトロジン）150ng、並びに、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）を有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植13日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを13日標本で行った。 
　トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、bFGF、並びに、コラーゲンを含有する非細胞性根管充填材を若齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、13日後、G-CSFを含有する非細胞性根管充填材と同様に新生血管を伴う歯髄様組織の再生がみられたが、歯髄再生量はやや減少傾向がみられた（図7A-D）。また両者とも象牙芽細胞様細胞が象牙質側壁に付着して象牙質を形成しているのがみられた（図7C、D）。象牙質形成はG-CSFの方がやや高い傾向がみられた。さらに、両者とも、同様に血管新生(図8 A、B)や神経突起伸長(図8C、D)がみられた。両者の根管充填剤による再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図9 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図9C、D)。
　これらの結果により、トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト並びにコラーゲンに、遊走因子としてbFGF若しくはG-CSFを含有する非細胞性根管充填材を注入すると、ほぼ同様に、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生され、象牙質側壁に象牙質様硬組織が形成されることが明らかとなった。
　［実施例４］
　（トリプシン前処理の有無による非細胞性根管充填材によるイヌ中齢の抜髄後歯髄再生の比較）
　全身麻酔を施した後、中齢（２歳齢）のイヌ上顎左右中切歯に抜髄処置を行い、根尖部まで#50で拡大後、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液と3%過酸化水素水で交互洗浄し、さらに生理食塩水で洗浄し、ペーパーポイントで根管内を完全乾燥、止血した後、セメントとレジンにて完全に仮封した。抜髄処置後、仮封をはずし、再度交互洗浄、生理食塩水で洗浄後、根管内を３％EDTA（スメアクリーン）で2分反応させ、さらに生理食塩水で洗浄、乾燥させた。その後、右側根管内にトリプシン製剤(フランセチンTパウダー（10 mgあたり結晶Trypsin 2,500 USP））5 mg/ml（0. 5%）を10分浸し前処理を行い、生理食塩水で洗浄した。一方、左側根管はトリプシン前処理を行わなかった。さらに、すべての根管に、ALK5阻害剤（SB431542、200 ng）及びCCR3アンタゴニスト（SB328437、200 ng）、細胞外基質コラーゲン20μl（コーケンアテロコラーゲンインプラント）、並びに、遊走因子としてG-CSF（ノイトロジン、150ng）含有する非細胞性根管充填材を根管に充填した。その後、その上に止血用ゼラチンスポンジ（スポンジェル）を置き、グラスアイオノマーセメント及び光重合レジンにて窩洞を完全封鎖した。移植28日後に抜歯し、通法に従って縦断面の5μmパラフィン切片を作製し、H-E染色後形態観察を行った。血管新生はBS-1 lectinにて、神経突起伸長はPGP9.5にて免疫染色し比較検討を行った。さらにTRH-DEの免疫染色及びenamelysinのin situ hybridizationを28日標本で行った。 
　トリプシン前処理後、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、コラーゲン、並びに、G-CSFを含有する非細胞性根管充填材を中齢イヌの歯の抜髄後の根管内に注入したところ、28日後、トリプシン前処理なしとほぼ同様に歯髄組織の再生がみられたが、歯髄再生量はトリプシン前処理の方がやや増加傾向がみられた（図10A-D）。また、トリプシン前処理を行った場合は、象牙芽細胞様細胞がより象牙質側壁に付着し、象牙質様硬組織形成量もやや高い傾向がみられた（図10C、D）。さらに、両者とも、同様に血管新生(図11A、B)や神経突起伸長(図11C、D)がみられた。両者の根管充填剤による再生組織において、同様に一部の細胞にTRH-DE陽性細胞がみられた(図12 A、B)。また、象牙質壁にはenamelysinのmRNAを発現する細胞が同様にみられた(図12C、D)。
　これらの結果により、ALK5阻害剤及びCCR3アンタゴニスト、コラーゲン、並びに、G-CSF含有する非細胞性根管充填材を注入すると、血管新生と神経伸長を伴う歯髄が再生されるが、非細胞性歯組織再生促進キットとして、トリプシン前処理を行った後に非細胞性根管充填材を注入すると、より象牙質側壁に細胞が付着し、象牙芽細胞への分化、象牙質様組織形成が促進されることが明らかとなった。
　［実施例５］
（ヒト歯髄幹細胞培養とCCL11およびCCR3 mRNA発現の解析）
　同意を得た後に、高齢者 (60、70歳) および若齢者 (19、26歳) の第3大臼歯より歯髄を取り出し、Hanks液中で細切後、37℃ 1時間、0.04 mg/mlリベラーゼ溶液 (Roche diagnostics, Pleasanton, CA, USA) にて酵素消化して歯髄細胞を分離し、10%ヒト血清含有DMEM (D6429) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) に、2～4×104/mlの細胞濃度で35mm dishに播種した。以後、培地は、2～3日ごとに交換し、70%コンフルエントになった時に継代した。細胞剥離には、TrypLE(登録商標) Select (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を使用した。
　Trizol (Life Technologies)を用いて、各種細胞からtotal RNAを抽出し、DNase (Roche diagnostics) 処理後、ReverTra Ace-a (TOYOBO, Tokyo, Japan)にてFirst-strand cDNAを合成した。Real-time RT-PCRは、CCL11 mRNAについてはPowerUp(登録商標) SYBR(登録商標) Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、b-actin 及びCCR3 mRNAについてはPower SYBR(登録商標) Green master mix (Applied Biosystems)を用いて、Applied Biosystems 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems)にて、増幅・検出した。Real-time RT-PCRの反応条件は、95℃ 15秒、65℃ 1分を1サイクルとし、40サイクル行った。用いたプライマーの塩基配列は、表1に示す通りである。増幅した遺伝子のmRNA発現は b-actinmRNAにて補正した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ヒト若齢および高齢歯髄幹細胞とも、短期継代 (6～10代)では、CCR3 mRNA発現が非常に低くCCL11 mRNA発現も全くみられないか低い傾向がみられた。また、若齢、高齢とも、長期継代 (19～21代)すると、CCL11 mRNA及びCCR3 mRNA発現の増加がみられた (図13)。一方、高齢個体由来の細胞では、CCL11の受容体であるCCR3発現が増加することで、CCL11の感受性が上がることが報告されている(Wang H et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011)。すなわち、CCL11発現とCCL11の受容体であるCCR3発現は、特に年齢とともに相関性が現れる可能性が示唆されている。
　したがって、非細胞性根管充填材を用いた歯髄再生において、CCL11と結合するCCL11中和抗体と、CCL11のレセプターCCR3と結合するCCR3アンタゴニストはほぼ同様の作用を有するものと示唆される。
　歯組織再生に利用可能である。
　配列番号１～６：プライマー

Claims (10)

  1. 　CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする非細胞性根管充填材。
  2. 　CCR3アンタゴニスト及びALK5阻害剤を含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有することを特徴とする請求項１に記載の非細胞性根管充填材。
  3. 　G-CSF、bFGF及びSDF-1の少なくとも一つを有する遊走因子を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の非細胞性根管充填材。
  4. 　若齢個体に使用されることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の非細胞性根管充填材。
  5. 　セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、
    　CCR3アンタゴニスト、CCL11中和抗体及びALK5阻害剤の少なくとも何れか一つを含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、
    を有することを特徴とする非細胞性歯組織再生促進キット。
  6. 　セリンプロテアーゼを含む前処理剤と、
    　CCR3アンタゴニスト若しくはCCL11中和抗体及びALK5阻害剤を含む再生促進化合物と、細胞外基質と、を有する非細胞性根管充填材と、
    を有することを特徴とする請求項５に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
  7. 　前記非細胞性根管充填材は、G-CSF、bFGF及びSDF-1の少なくとも一つを有する遊走因子を有することを特徴とする請求項５又は６に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
  8. 　中高齢個体に使用されることを特徴とする請求項５乃至７の何れか１項に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
  9. 　前記セリンプロテアーゼは、キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼであることを特徴とする請求項５乃至８の何れか１項に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
  10. 　前記キモトリプシン様(chymotrypsin-like)セリンプロテアーゼは、トリプシンであることを特徴とする請求項９に記載の非細胞性歯組織再生促進キット。
PCT/JP2018/034948 2017-09-29 2018-09-21 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット WO2019065478A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18861751.8A EP3689386A4 (en) 2017-09-29 2018-09-21 NON-CELLULAR RADICULAR CANAL LOAD AND KIT PROMOTING NON-CELLULAR DENTAL TISSUE REGENERATION
CN201880062522.0A CN111148536B (zh) 2017-09-29 2018-09-21 非细胞根管填料以及非细胞牙体组织再生促进试剂盒
US16/651,483 US11969487B2 (en) 2017-09-29 2018-09-21 Non-cellular root canal filling material and non-cellular dental tissue regeneration promoting kit

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017190744A JP2019063191A (ja) 2017-09-29 2017-09-29 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット
JP2017-190744 2017-09-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019065478A1 true WO2019065478A1 (ja) 2019-04-04

Family

ID=65901287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/034948 WO2019065478A1 (ja) 2017-09-29 2018-09-21 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11969487B2 (ja)
EP (1) EP3689386A4 (ja)
JP (2) JP2019063191A (ja)
CN (1) CN111148536B (ja)
WO (1) WO2019065478A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196867A1 (ja) * 2019-03-28 2020-10-01 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 非細胞性根管充填材および非細胞性歯組織再生促進キット

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102104933B1 (ko) * 2019-10-31 2020-04-27 주식회사 라이프온 줄기세포 유래 엑소좀을 함유하는 치아 재강화 또는 치아골 이식재 조성물 및 그 제조방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5621105B2 (ja) 1974-12-06 1981-05-18
JPS5748194B2 (ja) 1975-06-09 1982-10-14
JPS5939559B2 (ja) 1975-03-21 1984-09-25 フイルマ・アツシユ・クランツ 織物の湿式処理方法
JPS6031658B2 (ja) 1976-11-15 1985-07-23 古河電気工業株式会社 熱可塑性樹脂発泡網状体の製造方法
JP2016072306A (ja) 2014-09-26 2016-05-09 京セラサーキットソリューションズ株式会社 印刷配線板およびその製造方法
WO2017170996A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 歯科用前処理材及び歯組織再生キット

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5856481Y2 (ja) 1979-07-25 1983-12-27 松下電器産業株式会社 「ちゆう」房装置
JPS5748194U (ja) 1980-09-05 1982-03-17
JPS58148828A (ja) * 1982-02-27 1983-09-05 Advance Res & Dev Co Ltd 歯根管処理剤並びに同処理用キツト
JPS5939559U (ja) 1982-09-02 1984-03-13 三洋電機株式会社 無線電話機の充電回路
JPS6031658U (ja) 1983-08-10 1985-03-04 新コスモス電機株式会社 ガス検知装置
IE64155B1 (en) * 1989-03-29 1995-07-12 Lepetit Spa New substituted alkylamide derivatives of teicoplanin
EP2211752A4 (en) * 2007-10-25 2013-10-02 Univ Columbia BIOPULPA
WO2009113733A1 (ja) * 2008-03-12 2009-09-17 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 根管充填材及び歯組織再生方法
JP5572291B2 (ja) * 2008-04-07 2014-08-13 独立行政法人国立長寿医療研究センター 歯髄及び／又は象牙質形成促進のための薬剤及びその利用
MX339068B (es) * 2008-08-22 2016-05-10 Anthrogenesis Corp Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias.
EP2411065A2 (en) * 2009-03-27 2012-02-01 National University of Ireland Galway Implantable medical devices coated with nucleic acid-encapsulating liposome
US20120164604A1 (en) 2009-09-11 2012-06-28 National Center For Geriatrics And Gerontology Unextracted tooth root canal filler and dental tissue regeneration method for unextracted tooth
EP2496273B1 (en) * 2009-11-02 2016-11-30 Straumann Holding AG Purified emd protein composition
CN103068415B (zh) * 2010-08-05 2014-11-26 严仁雄 使用牙齿的骨移植材料的加工方法及由其加工的骨移植材料
JP5939559B2 (ja) 2011-02-28 2016-06-22 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法
CN104548212B (zh) * 2014-12-31 2018-05-11 新科沃再生医学（苏州）有限公司 一种促进牙髓及牙本质再生的组合物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5621105B2 (ja) 1974-12-06 1981-05-18
JPS5939559B2 (ja) 1975-03-21 1984-09-25 フイルマ・アツシユ・クランツ 織物の湿式処理方法
JPS5748194B2 (ja) 1975-06-09 1982-10-14
JPS6031658B2 (ja) 1976-11-15 1985-07-23 古河電気工業株式会社 熱可塑性樹脂発泡網状体の製造方法
JP2016072306A (ja) 2014-09-26 2016-05-09 京セラサーキットソリューションズ株式会社 印刷配線板およびその製造方法
WO2017170996A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 歯科用前処理材及び歯組織再生キット

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO YSONG MKIM ESHON WCHUGAL NBOGEN GLIN LKIM RHPARK NHKANG MK: "Pulp-dentin Regeneration: Current State and Future Prospects", J DENT RES., vol. 94, no. 11, 2015, pages 1544 - 51
CHANG, HSIAO HUA ET AL.: "Role of ALK5/Smad2/3 and MEK1/ERK Signaling in Transforming Growth Factor Beta 1-modulated Growth, Collagen Turnover, and Differentiation of Stem Cells from Apical Papilla of Human Tooth", JOURNAL OF ENDODONTICS, vol. 41, no. 8, 2015, pages 1272 - 1280, XP009519677, DOI: 10.1016/j.joen.2015.03.022 *
DEL FABBRO MLOLATO ABUCCHI CTASCHIERI SWEINSTEIN RL: "Autologous platelet concentrates for pulp and dentin regeneration: a literature review of animal studies", J ENDOD., vol. 42, no. 2, 2016, pages 250 - 7, XP029394758, DOI: 10.1016/j.joen.2015.10.012
GALLER KM.: "Clinical procedures for revitalization: current knowledge and considerations", INT ENDOD J., vol. 49, no. 10, October 2016 (2016-10-01), pages 926 - 36
GOLDBERG, MICHEL ET AL.: "Inflammatory and immunological aspects of dental pulp repair", PHARMACOLOGICAL RESEARCH, vol. 58, 2008, pages 137 - 147, XP025506780, DOI: 10.1016/j.phrs.2008.05.013 *
HAYASHI, YUKI ET AL.: "Review of mechanism for recovering amount of dental pulp regeneration by means of continuous administration of anti-CCLll antibody in elderly mouse", REGENERATIVE MEDICINE, vol. 16, no. Suppl., 1 February 2017 (2017-02-01), pages 419, XP009519637, ISSN: 1347-7919 *
HE LKIM SGGONG QZHONG JWANG SZHOU XYE LLING JMAO JJ.: "Regenerative endodontics for adult patients", J ENDOD., vol. 43, no. 9S, 2017, pages S57 - S64
IOHARA ET AL., TISSUE ENGINEERING PART A, 2011
IOHARA KMURAKAMI MTAKEUCHI NOSAKO YITO MISHIZAKA RUTUNOMIYA SNAKAMURA HMATSUSHITA KNAKASHIMA M: "A novel combinatorial therapy with pulp stem cells and granulocyte colony-stimulating factor for total pulp regeneration", STEM CELLS TRANSL. MED., vol. 2, no. 7, 2013, pages 521 - 533
KAWAMURA RHAYASHI YMURAKAMI HNAKASHIMA M: "EDTA soluble chemical components and the conditioned medium from mobilized dental pulp stem cells contain an inductive microenvironment, promoting cell proliferation, migration and odontoblastic differentiation", STEM CELL RES. THER., vol. 7, no. 1, 2016, pages 77
KONTAKIOTIS EGFILIPPATOS CGTZANETAKIS GNAGRAFIOTI A.: "Regenerative endodontic therapy: a data analysis of clinical protocols", J ENDOD., vol. 41, no. 2, 2015, pages 146 - 54
LIN, PO SHUEN ET AL.: "Transforming growth factor beta1 down-regulates Runx-2 and alkaline phosphatase activity of human dental pulp cells via ALK5/Smad2/3 signaling", ORAL SURG ORAL MED ORAL PATHOL ORAL RADIOL ENDOD, vol. 111, 2011, pages 394 - 400, XP028357915, DOI: 10.1016/j.tripleo.2010.09.079 *
NAKASHIMA M.IOHARA K.MURAKAMI M.NAKAMURA H.SATO Y.ARIJI Y.MATSUSHITA K.: "Pulp regeneration by transplantation of dental pulp stem cells in pulpitis: A pilot clinical study", STEM CELL RES THERAPY, vol. 8, no. 1, 2017, pages 61
NOGUCHI YOSHIKUNI ET AL., JAPANESE JOURNAL OF DERMATOLOGY AND VENEREOLOGY, vol. 64, 1954, pages 497 - 506
WANG H ET AL., INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., 2011
YANG J.YUAN G.CHEN Z.: "Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges", FRONT PHYSIOL., vol. 7, 2016, pages 58
YANG JYUAN GCHEN Z.: "Pulp Regeneration: Current Approaches and Future Challenges", FRONT PHYSIOL, vol. 7, 2016, pages 58

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196867A1 (ja) * 2019-03-28 2020-10-01 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター 非細胞性根管充填材および非細胞性歯組織再生促進キット

Also Published As

Publication number Publication date
CN111148536B (zh) 2021-12-28
JP2019063191A (ja) 2019-04-25
CN111148536A (zh) 2020-05-12
US11969487B2 (en) 2024-04-30
EP3689386A1 (en) 2020-08-05
US20200261321A1 (en) 2020-08-20
JP2022116298A (ja) 2022-08-09
EP3689386A4 (en) 2021-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2682136B1 (en) Tooth root canal filling material containing mesenchymal stem cells and use in a method of treatment for dental tissue regeneration
JP6031658B2 (ja) 根管充填材
EP2476442B1 (en) Root canal filler for non-extracted tooth and non-extraction method for regenerating dental tissue
El Ashiry et al. Tissue engineering of necrotic dental pulp of immature teeth with apical periodontitis in dogs: radiographic and histological evaluation
JP2022116298A (ja) 非細胞性根管充填材及び非細胞性歯組織再生促進キット
WO2009125859A1 (ja) 薬剤、歯科材料、及びスクリーニング方法
JP7112538B2 (ja) 根管充填材
Rezaei et al. Transplantation of Bone Marrow" Derived Mesenchymal Stem Cells, Platelet-Rich Plasma, and Fibrin Glue for Periodontal Regeneration.
JP7212144B2 (ja) 非細胞性根管充填材および非細胞性歯組織再生促進キット
RU2812019C2 (ru) Неклеточный наполнитель корневого канала и неклеточный набор, стимулирующий регенерацию тканей зуба

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18861751

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018861751

Country of ref document: EP

Effective date: 20200429