CN102827806A

CN102827806A - 增强间充质前体细胞（mpc）的增生和/或存活的方法

Info

Publication number: CN102827806A
Application number: CN2012102958571A
Authority: CN
Inventors: 斯坦·格龙托斯; 安德鲁·克里斯托弗·威廉·赞内蒂诺
Original assignee: Medvet Science Pty Ltd
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2025-06-29
Also published as: US10544394B2; EP2361970A1; KR20160028498A; KR20150029760A; JP2013099347A; AU2005287855A1; EP1807505A4; WO2006032075A1; US20110223668A1; CN101103101B; CN102827806B; ES2645012T3; CA2581237C; CN101103101A; JP2008514188A; EP1807505B1; US20090029912A1; US20150072422A1; CA2581237A1; AU2005287855B2

Abstract

本发明涉及在体外增强组织特异性定型细胞(TSCC)的增生和/或存活的方法，包括将所述TSCC暴露于表达SDF的STRO-1^亮细胞。其中，所述TSCC和STRO-1^亮细胞在分化偏向于一种特异性组织类型的条件下进行培养。

Description

增强间充质前体细胞(MPC)的增生和/或存活的方法

本申请是申请日为2005年6月29日，题为“增强间充质前体细胞(MPC)的增生和/或存活的方法”的中国专利申请No.200580039970.1的分案申请。

技术领域

本发明涉及包含间充质前体细胞(MPC)和/或其衍生的前体细胞的组合物，以及用于增强这些细胞在体外或体内增生和/或存活的方法。本发明还涉及用于哺乳动物体外或体内骨形成的方法。

背景技术

骨再造是发生在成熟骨骼(其中，骨吸收之后是新骨形成)中的持续生理过程，维持机械强度和结构。负责这种偶联过程的骨细胞包括骨吸收细胞(破骨细胞，其来源于单核细胞/巨噬细胞系的造血细胞)和骨形成细胞(成骨细胞，其为间充质起源)。骨吸收过程在许多与风湿病学家的工作相关的临床表现中涉及到，如RA和其它炎性关节炎中的局部骨破坏或腐蚀以及在骨质疏松症中出现的弥漫性骨质丢失。

破骨细胞激活对于病理性骨吸收如风湿性关节炎(RA)中的腐蚀或全身性骨丢失来说是一个关键的细胞过程。在诸多触发过度破骨细胞活性的因素中，诸如IL-1或肿瘤坏死因子(TNF)-α的细胞因子发挥主要作用。最近，已证实趋化因子-基质细胞衍生因子-1(SDF-1)促进人破骨细胞的趋化性补充、形成和存活(Wright et al.，Bone 36：840-853，2005；Zannettino et al.，Cancer Res 65(5)：1700-1709，2005；Grassi et al.，J.Cell.Physiol.199：244-251，2004)。

趋化因子是调节各种生物反应的趋化蛋白超家族，它们促进多个种系的白细胞和淋巴细胞补充到身体器官组织。趋化因子可以根据该蛋白中最初两个半胱氨酸残基的相对位置分为两个家族。一个家族中，起始两个半胱氨酸由一个氨基酸残基分开，即CXC趋化因子；而另一个家族中，起始两个半胱氨酸是邻接的，即CC趋化因子。在人类，CXC趋化因子的基因群集于染色体4上(除了SDF-1基因，其已被定位于染色体10)而CC趋化因子的基因则群集于染色体17上。

趋化因子的分子靶向物是细胞表面受体。一个这样的受体是CXC趋化因子受体4(CXCR4)，其为7次跨膜蛋白，偶联于G1并且先前被称为LESTR(Loetscher et al.，(1994)J.Biol.Chem，269：232-237，1994)、HUMSTR(Federsppiel et al.，Genomics 16，707-712，1993)和融合素(Feng et al.，Science 272：872-877，1996)。CXCR4在造血源细胞上广泛表达，并且是用于人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的CD4+的主要辅助受体(Feng et al.，Science 272：872-877，1996)。

目前唯一已知的用于CXCR4的天然配体是SDF-1。基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)和基质细胞衍生因子-1β(SDF-1β)是密切相关的蛋白(在本文中，共称为SDF-1)。SDF-1α和SDF-1β的天然氨基酸序列是已知的，如同编码这些蛋白的基因组序列一样也是已知的(美国专利第5,563,048号和美国专利5,756,084号)。

SDF-1的3-维晶体结构已被描述(Crump et al.，EMBO J.16：6996-7007，1997)。SDF-1的结构-活性分析表明，尽管N-末端残基1-8或1-9在受体结合中涉及到，但是单独的1-8和1-9肽并没有表现出可指示受体结合的体外活性，支持所报道的结论，即，所述肽并不呈现对于结合至受体必要的构象。这个结果可以表明，蛋白质骨架的其余部分和/或蛋白质中其它位置的各种通用的受体结合位点对于介导结合至受体的N-末端的构象要求非常重要(Crump et al.，EMBO J.16：6996-7007，1997)。基于这些结果，已经提出了SDF-1结合至CXCR4的两位点模型，涉及残基1-17中的两个结合位点，N-末端位点和上游RFFESH位点(Crump et al.，EMBO J.16：6996-7007，1997)。两个公认的结合位点通过CXC基序(其表征整个CXC趋化因子家族)接合。经鉴定，这两个公认的结合区域在其它CC和CXC趋化因子也很重要(Crump et al.，EMBO J.16：6996-7007，1997)。这与以下发现一致：尽管多种趋化因子的N-末端区域对于受体激活是关键的，但是已有报道表明除SDF-1以外的趋化因子的N-末端肽缺少受体结合活性并且不是受体激动剂(Crump et al.，EMBO J.16：6996-7007，1997)。

当移植入免疫缺陷小鼠时，出生后的人骨髓间质干细胞(BMSSC)或间充质前体细胞(MPC)具有再生支持造血的骨髓器官和相关骨小梁的能力(Friedenstein et al.Exp Hematol.6：440-444，1978；Kuznetsov et al.J Bone Miner Res.12：1335-1347，1997；Pittenger et al.Science 284：143-147，1999；Bianco et al.，StemCells 19：180-192，2001；Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)。最近的研究也已报道：借助于其可形成各种细胞系，如脊髓支持基质、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、肝细胞、心肌细胞以及神经细胞的能力，BMSSC比最初认识的更具可塑性(Liechty et al.Nat Med.6：1282-1286，2000；Zhao et al.Exp Neurol.174：11-20，2002；Verfaillie et al.Ann N Y Acad Sci.996：231-234，2003)。这些进展已促进深入研究体外扩增的BMSSC种群在骨再生的中可能应用。然而，由于缺乏对调节人类多能BMSSC的生长和存活以及这些细胞最终发育成骨的关键因子的理解，这些研究的进展受到很大程度的限制。

发明内容

现在，本发明人已将SDF-1鉴定为一种差异性表达的基因，其在培养之前由纯化的BMSSC高度表达。更具体地，本发明人已发现，当与代表成骨细胞和骨细胞/骨衬细胞的成熟细胞类型相比时，体外培养的未成熟成骨细胞表达较高水平的SDF-1。此外，当BMSSC在骨诱导性条件下培养时，SDF-1的表达被快速下调。

研究还表明，BMSSC表达功能性的细胞表面SDF-1受体(CXCR4)。相比于对照BMSSC系，转导的BMSSC系(分泌高水平SDF-1)表现为体内形成异位骨的能力增强。此外，高表达SDF-1的BMSSC表现为细胞生长和防止白介素-4诱导的凋亡的能力增强。类似地，在体外血小板源生长因子BB(PDGF-BB)和SDF-1的协同作用下，成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)也表现出生长增强以及对α-干扰素-2a-诱导的凋亡的抗性。

这些发现表明，趋化因子SDF-1在未成熟BMSSC种群的增生、存活以及成骨能力中发挥作用。

因此，本发明提供了一种增强间充质前体细胞(MPC)或其衍生后代的增生和/或存活的方法，该方法包括将所述MPC或后代暴露于SDF-1或其类似物。

本发明还提供了一种形成组织特异性定型细胞种群的方法，该方法包括以下步骤：

将MPC或其衍生后代与SDF-1或其类似物相接触，以增强所述MPC或后代的增生和/或存活；以及

使所述增生的种群处于使该MPC或其衍生后代的分化偏向于特异性组织类型的条件下。

本发明还提供了一种已经过遗传修饰以过表达SDF-1或其类似物的MPC或其衍生的前体细胞。

本发明还提供了一种组合物，其包含根据本发明的转染MPC种群。

本发明还提供了一种组合物，其包含MPC或其衍生后代以及SDF-1或其类似物。

本发明还提供了一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。

本发明还提供了一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将本发明的组合物在预期的骨形成部位处给予该受治者。

附图说明

图1：来源于培养的MPC细胞且表达STRO-1^bri或STRO-1^dim的细胞的基因表达谱。体外扩展的骨髓MPC单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理加以制备。细胞利用STRO-1抗体染色，随后通过用羊抗鼠IgM-荧光素异硫氰酸盐(酯)孵育显示。在荧光激活的细胞分选之后，总细胞RNA制备自表达STRO-1^bri或STRO-1^dim的细胞纯化种群(A)。利用RNAzolB提取方法和标准步骤，将总RNA分离自每个亚群并用作cDNA合成的模板。各种转录体的表达利用如前所述(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)的标准流程通过PCR扩增进行评估。用于本研究的引物对示于表2中。扩增之后，每种反应混合物通过1.5％琼脂凝胶电泳进行分析，并通过溴化乙锭染色使其可视化(B)。利用ImageQant软件，参照管家基因(GAPDH)的表达对每种细胞标记物的相对基因表达进行评估(C)。

图2：来源于骨髓MPC的体外扩增细胞的免疫表型表达模式。来源于骨髓MPC的体外扩增细胞的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA而制备，接着用STRO-1抗体以及鉴定广泛范围的细胞系相关标记物的抗体孵育。STRO-1利用羊抗-鼠IgM荧光素异硫氰酸盐(酯)加以鉴定而所有其它标记物利用羊抗-小鼠或抗-兔IgG-藻红蛋白加以鉴定。对于那些鉴定胞内抗原的抗体，细胞制备物首先用STRO-1抗体进行标记，用冷的70％乙醇固定以透过细胞膜，然后利用胞内抗原特异性的抗体进行孵育。在相同条件下使用匹配的同型对照抗体。利用COULTER EPICS流式细胞仪实施双色流式细胞计数分析并收集列表模式数据。点图代表5,000个列表模式的表示用于每个种系细胞标记物(y-轴)和STRO-1(x-轴)的荧光素强度水平的情形。垂直和水平象限参照匹配的同型阴性对照抗体而建立。

图3：体外成脂发育。单细胞悬浮液通过从体外扩增细胞(来源于STRO-1^bri/VCAM-1⁺分选的骨髓细胞)的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光素激活的细胞分选，将扩增的细胞根据其STRO-1表达进行分离，如图1A所示。然后，STRO-1^bri和STRO-1^dim分选的MPC衍生细胞在常规生长培养基中，以1x 10⁵个细胞/孔的密度铺于6孔板中过夜。第二天，将培养基用如在方法中所述的成脂诱导性培养基替换。此后，将培养基每周补充两次，共计三周，此时固定该细胞并用油红O进行染色。本图示出了低(4x)和高(20x)功率放大以描述含有遍布粘附性间质层中含有脂质的脂肪细胞的油红O染色。与STRO-1^dim培养物中7±2脂肪细胞(20x的每单位面积，n＝9个视野)相比，在STRO-1bri培养物中鉴定了平均22±5个油红O阳性脂肪细胞(20x的每单位面积，n＝9个视野)。

图4：体外成骨发育。单细胞悬浮液通过从来源于STRO-1^bri/VCAM-1⁺分选的骨髓细胞的细胞的物胰蛋白酶/EDTA消化来生成。然后利用单色荧光素激活的细胞分选(FAC)将的细胞根据其STRO-1的表达加以分离。然后将STRO-1^bri和STRO-1^dimFACS分离的细胞在常生长、以0.3X10⁵细胞/孔的密度48孔板中过夜(每个条件重复4次)。天，将培养如在方法中所述的成骨诱导替。将培养物每周两次，三周，洗涤该细胞，然后用0.6N HCL处理以提取矿化中的钙。将样品与o-甲酚-酞-配位酮比色反应在570nm处读。绝对钙浓度根据钙的标准曲线来确定。(A)钙测量值表明，相比于STRO-1^dim培养物，STRO-1^bri培养物合成显著(*；p＜0.05；t-检验)多矿物。培养物并用茜素红染色加以染色以描述在STRO-1^bri(B)和STRO-1^dim(C)培养的粘附层中矿化沉的典型水平。

图5：体外软骨发育。单细胞悬浮液通过从来源于STRO-1^bri/VCAM-1⁺分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的继代培养物进行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用单色荧光激活的细胞分选(FACS)，根据其STRO-1的表达分离该扩增的细胞，如图1A所示。然后将STRO-1^bri和STRO-1^dimFACS分离的细胞以2.5x10⁵个细胞/管的密度成团于聚丙烯管中并在软骨形成诱导性培养基中培养。此后，将该培养物每周补充两次，共计三周。回收细胞团并用于组织学检查或如方法中所述的总RNA制备。STRO-1^bri(A)和STRO-1^dim(B)细胞种群均能够形成含软骨细胞样细胞的细胞团。RT-PCR分析表明，相比于STRO-1^dim(SD)细胞种群，STRO-1^bri(SB)种群显示出较高水平的软骨相关基因X型胶原和聚集蛋白聚糖(来自软骨)(C)。

图6：STRO-1^Bri细胞诱导STRO-1^dim细胞增生。体外扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理加以制备。细胞用STRO-1抗体进行染色并分选为表达STRO-1^dim或STRO-1^bri的培养细胞种群，如图1中所述。细胞用如方法中所述的CFSE加以标记。未标记的细胞用来建立阴性对照(自体荧光)。利用

(100ng/ml)来抑制细胞分裂并提供一个总标记指数(0代)。随后将未标记的STRO-1^bri以(A)0STRO-1^bri个细胞：1x10⁵STRO-1^dim个细胞(0％)；(B)0.05x10⁵ STRO-1^bri个细胞：0.95x10⁵STRO-1^dim个细胞(5％)；(C)0.1x10⁵ STRO-1^bri个细胞：0.9x10⁵STRO-1^dim个细胞(10％)；(D)0.2x10⁵ STRO-1^bri个细胞：0.8x10⁵STRO-1^dim个细胞(20％)；(E)0.5x10⁵ STRO-1^bri个细胞：0.5x10⁵STRO-1^dim个细胞(50％)的比率加回到CFSE标记的STRO-1^dim细胞中。将该补加的混合物培养7天，收集，并通过如方法中所述的流式细胞仪进行分析。利用用于win 32的ModFit LT(2.0版)来分析细胞增生，发现STRO-1^bri细胞(R1)以剂量依赖性方式刺激STRO-1^dim细胞的增生。

图7：细胞因子和成骨性试剂增加培养物中的STRO-1^bri细胞的数量。将已建立的MPC培养物在补充了10％FCS(A)，或一系列因子(包括1x10^-8M 1α，25-二羟维生素D₃(1，25D)(B)；10ng/ml血小板源生长因子(PDGF)(C)；10ng/ml瘤坏死因子-α(TNF-α)(D)；10ng/ml白介素-1β(IL-1β)(E)以及30ng/ml间质细胞衍生因子1-α(SDF-1α)(F))的基础培养基中培养5天，用STRO-1mAb染色并如上所述进行分析，发现这些因子增加STRO-1^bri MPC的数量。示出的结果是3次独立实验的代表性实例。

图8：将无胸腺裸大鼠进行冠状动脉左前降支(LAD)结扎并于48小时后注射盐水、1x10⁶个人STRO-1^dim细胞、1x10⁶个人STRO-1^bri细胞或1x10⁶个人Stro-1-缺失的骨髓单核细胞。两周后，杀死动物，固定心脏组织，同时用两种单克隆抗体加以染色：第一种抗体与大鼠(而不是人类)Ki67抗原选择性反应，第二种抗体与心肌细胞标记物肌钙蛋白I反应。双重染色的细胞(表示增生的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或1x10⁶个STRO-1^dim人细胞的对照动物，接受1x10⁶个STRO-1^bri人细胞的动物表现为增生的大鼠心肌细胞呈2.5-5倍较高的数量(p＜0.05)。

图9：将无胸腺裸大鼠皮下注射大鼠成胶质细胞瘤细胞，其构成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、0.5x10⁶个人STRO-1^dim细胞或0.5x10⁶个人STRO-1^bri细胞。一周后，杀死动物，固定瘤组织，同时用两种单克隆抗体加以染色：第一种抗体与α-平滑肌肌动蛋白抗原(由平滑肌细胞表达)反应，而第二种抗体与vWF抗原(由脉管内皮细胞表达)反应。双重染色的结构(表示含有内皮和平滑肌的小动脉和动脉)通过免疫过氧化酶技术进行检测。相比于接受盐水或1x10⁶个STRO-1^dim人细胞的对照动物，接受0.5x10⁶ STRO-1^bri个人细胞的动物在瘤内细胞注射的部位表现为小动脉和动脉呈3.5-8倍的较高数量(p＜0.05)。在注射了人细胞的远端部位处未观察到差异。

图10：IL-1β增加从MPC扩增的细胞的增生能力。如方法中所述，将细胞用CFSE进行标记，随后在10ng/ml IL-1β存在的情况下将细胞培养5天，用STRO-1和ALK PHOS mAb加以染色并如上所述进行分析。(A)未处理的(NT)和(B)IL-1β处理的培养物表现出STRO-1^bri/ALP阳性细胞数量的增加。这种STRO-1表达的增加伴随着如(C)中所示的细胞增生的增加，其中未处理的培养物经历了四次细胞分裂，同时(D)IL-1β处理的培养物通过增加STRO-1^bri骨原细胞的数量而表现出细胞分裂次数增加。示出的结果是3次独立实验的代表性实例。当1，25D、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β以及SDF-1用来刺激MPC时，也可得到类似结果。

图11：在成骨诱导剂(地塞米松，desamethasone)存在的情况下，IL-1β刺激MPC增生并且增强其骨形成能力。将人(A)体外扩增的MPC后代以2,000个细胞/孔的细胞密度接种于96孔板中并在α-MEM-10中培养。培养基补充了指定浓度的IL-1β，并且如在方法中所述，利用WST-1对细胞数和生存力进行进量。浓度为0.01ng/ml的IL-1β显著将细胞数增至未处理对照培养物的136.6±1.2％(D，P＝0.000003，学生t-检验)。在大于0.1ng/ml的浓度下获得平台效应。数值表示每个浓度的三次重复培养物的平均值±SEM。(B&C)将体外扩增的MPC后代以5x10⁴/孔的细胞密度三份平行接种于24孔板中，并在成骨诱导性条件下(如方法中所述)进行培养。该细胞用浓度为10ng/ml的IL-1β处理，并且培养物每周补充含有IL-1β的新鲜培养基。从基质中释放的游离钙通过如方法中所述在酸性条件下处理粘附细胞而获得。将样品与邻甲酚-酞配位酮反应，并且该比色反应在570nm处读数。绝对钙浓度根据钙的标准曲线来确定。结果表明，相比于未处理的细胞(B)，矿物沉积在用IL-1β处理的细胞中增加(C)。在IL-1β处理的细胞中，钙水平在第4周(**P＝0.00009，学生t-检验)和第6周(**P＝0.00004，学生t-检验)均显著高于未处理的细胞(D)。示出的结果是3次独立实验的代表性实例，其中利用来源于三个不同供体的基质细胞。

图12：IL-1β刺激STRO-1^briMPC增生，而地塞米松诱导碱性磷酸酶(ALP)表达。将已建立的人MPC培养物以3x10⁴/孔的细胞密度接种到(A)无补充物(NT)、补充了(B)10ng/ml IL-1β或(C)1x10^-8M地塞米松以及(D)10ng/ml IL-1β和1x10^-8M地塞米松的完全培养基的24孔板中。将细胞如方法中所述培养21天。结果表明，IL-1β的促有丝分裂作用用于增加STRO-1^briMPC的数量(B)，后者又刺激STRO-1^dim细胞的增生(参考图6)。另外，MPC响应存在于生长培养基中的FCS和抗坏血酸盐-2-磷酸盐而获得ALP表达，ALP表达在响应于糖皮质激素(glucocorticosteroid)地塞米松(dex)时被增强(D)。IL-1β和dex的组合作用用来增强骨形成，如图11所示。实验进行三次并且在来源于三个不同供体的MPC中观察到相似的趋势。

图13：PDGF对体内骨形成的作用。将来源于STRO-1^bri/VCAM-1⁺分选的骨髓细胞的体外扩增细胞的半铺满继代培养物在PDGF-BB(10ng/ml)存在或不存在的情况下培养5天。单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA消化形成，然后如方法中所述利用用于植入的40mg羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)在免疫缺陷小鼠中进行孵育。8周后，将获得的植入物固定并加以处理用于组织学检查。新骨形成的分析利用Scion成像软件根据三个重复植入物的每个表面积(20x)来确定(A)。相比于未处理的对照培养物，用PDGF-BB预处理的培养物显示出显著(*；p＜0.05；t-检验)较多的异位骨形成。示出的典型图片以横截面描述苏木精/伊红染色的异位骨，代表未处理的(B)和PDGF处理的(C)移植物。

图14：BMSSC表达高水平的SDF-1。(A)将STRO-1⁺MACS分离的BMMNC制备物利用FACS，根据区域STRO-1^亮和STRO-1^暗划分成不同的STRO-1亚群。总RNA从每一个STRO-1亚群制备并用来构建如在“材料和方法”中所述的STRO-1^亮差减杂交库(subtraction hybridization library)。(B-C)重复的硝化纤维滤膜，其已利用代表性PCR产物进行印迹(blot)，该产物从STRO-1^亮扣除cDNA转化的细菌克隆体扩增。然后利用[³²p]7三磷酸脱氧胞苷酸(dCTP)标记的STRO-1^亮(B)或STRO-1^暗(C)扣除cDNA对该滤膜进行探测。箭头表示含有对应于人SDF-1的cDNA片段的1个克隆体的差异表达。(D)逆转录酶(RT)-PCR分析显示了SDF-1和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)转录体在总RNA中的相对表达，该总RNA从培养前的MACS/FACS新鲜分离的BMMNC STRO-1种群制备。bp表示碱基对。

图15：未成熟的BMSSC比成熟的种群表达更高水平的SDF-1。(A)点图表示体外扩增BMSSC的单细胞悬浮液的双流式细胞计数分析，其考查在标准培养基中培养后细胞表面STRO-1和AP抗原表达。不同的分选STRO-1/AP亚群根据分选区域R1、R2、R3和R4利用FACS加以分离。(B)该图描述了在总RNA中，相比于管家基因GAPDH，SDF-1相对表达的半定量RT-PCR分析，其中该总RNA从未分选的以及根据其STRO-1和AP的细胞表面表达而用FACS分离的培养BMSSC种群制备。最不成熟的成骨前体种群(STRO-1⁺/AP^-)比前成骨细胞(STRO-1⁺/AP⁺)表达较高水平，依次是较成熟的成骨细胞(STRO-1^-/AP⁺)和骨细胞(STRO-1^-/AP^-)种群。数据表示利用从2个不同健康骨髓供体建立的继代BMSSC培养物的2次独立实验的平均值±标准差。

图16：骨诱导后，SDF-1由BMSSC下调。(A)通过在骨诱导性培养基长时间存在的情况下培养的BMSSC表达的SDF-1，相对于GAPDH的半定量RT-PCR。平均值±标准差表示4次独立实验。成骨诱导性条件与对应的对照在每个时间点以p＜0.05的显著性值(*)利用成对t检验进行分析。(B)点图表示根据STRO-1和碱性磷酸酶抗原的细胞表面表达，体外扩增BMSSC的单细胞悬浮液的双色流式细胞计数分析，其在成骨诱导培养基存在的情况下培养48小时。

图17：BMSSC表达功能性SDF-1受体。(A)RT-PCR分析表示总RNA中的CXCR4和GAPDH转录体的相对表达，该总RNA从原代BMSCC培养物或人骨肉瘤细胞系(MG63)分离。(B)培养BMSSC的单细胞悬浮液利用小鼠抗-人CXCR4抗体或匹配的同型对照抗体1A6.11随后用羊抗-小鼠IgG₁的FITC轭合抗体进行孵育。代表性的柱状图表示相对于对照样品(点线)，通过流式细胞计数分析评估BMSSC的CXCR4(实线)细胞表面表达水平。(C)该图表示在加入人重组SDF-1α(30ng/mL)后，在长时间的原代BMSSC培养物中测得的胞内钙水平。

图18：BMSSC的SDF-1加强表达增强其成骨能力。(A)逆转录病毒包装系PT67用来利用含人SDF-1cDNA或仅含载体的pLNCX2构建体转导来源于3种不同骨髓吸出物的继代BMSSC培养物，G418筛选后产生稳定的多克隆起源的高表达SDF-1的BMSSC和相应对照系。利用商业上可获得的ELISA试剂盒来评估组织培养物上清液的三次重复样品的SDF-1α水平。数据表示从3个不同的高表达SDF-1的BMSSC细胞系相对其对应对照产生的平均值±标准差。(B)每个转导的BMSSC系的单细胞悬浮液与羟磷灰石(HA/TCP)颗粒混合，然后皮下植入NOD/SCID小鼠。图片表示8周龄收集的新骨移植物的横截面(b)，由经苏木精和伊红染色的高表达SDF-1的BMSSC(SDF-1)和对照细胞系(LNCX2)所形成(x 200)。这些图片是利用装配有Olympus D11数码相机的Olympus BX50光学显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)捕获的，放大200倍。(C)每个图表示来源于3个不同骨髓供体的不同高表达SDF-1的BMSSC系和相应的对照细胞系。新骨形成的水平表示为利用Scion成像软件从12个代表性组织切片分析的总组织表面积的百分比。该数据表示来自两次重复的移植物的平均值±标准差。高表达SDF-1的BMSSC系和相应对照之间的p＜0.05的统计学差异(*)利用非成对t检验来确定。

图19：BMSSC的SDF-1表达加强促进细胞存活。(A)将高表达SDF-1的BMSSC和载体对照细胞系以5x10³个细胞/孔的密度铺于96孔板的三个重复孔中，在常规生长培养基中培养达5天，而实施增生研究。然后通过胰蛋白酶/EDTA消化而制备单细胞悬浮液，并计数评估细胞总数。(B)在白介素4(IL-4；30ng/mL)存在的情况下建立平行培养物，凋亡细胞的百分数通过利用台盼蓝排除法测定。(C)该柱状图表示相比于匹配的同型对照抗体(点线)，在IL-4存在的情况下培养的对照细胞系的细胞表面膜联蛋白V(annexin V)染色的水平(实线)。示出的代表性图片是活细胞上原位荧光染色的强度(x 100)。(D)该柱状图表示相比于在IL-4存在的情况下培养的匹配的同型对照(点线)，高表达SDF-1的BMSSC系的细胞表面膜联蛋白V染色的水平(实线)。示出的代表性图片是活细胞上原位荧光染色的强度(x 100)。数据表示三次重复实验的平均值±标准差。在高表达SDF-1的BMSSC系和相应对照之间的p＜0.05的统计学差异(*)利用非成对t检验来确定。

图20：SDF-1促进CFU-F的生长和存活。对来源于MACS/FACS分离的STRO-1^亮BMMNC(铺于在不同细胞因子组合存在的情况下的无血清培养基中)的CFU-F集落的总数进行计数。重组人PDGF-BB、SDF-1α和α-干扰素2a的最佳使用浓度分别为5ng/mL、30 000IU/mL和30ng/mL。数据表示三个重复孔的平均值±标准差。利用3种不同骨髓吸出物可获得类似结果。所有处理的统计学显著性(p＜0.1)通过利用单向ANOVA而确定。然后利用Fisher试验来确定所有组之间的差异。相比于单独的PDGF-BB(*)，所有处理均发现显著性差异(P＜0.05)，并且在PDGF+的IFN(干扰素)与PDGF+SDF-1+的IFN(**)之间也发现P＜0.05的显著性。

图21：SDF-1以剂量依赖性方式保护CFU-F形成免于IFN-α的凋亡作用。将STRO-1 MACS选择的人骨髓单核细胞的铺入仅存在PDGF(5ng/ml)或PDGF和IFN-α(30,000i.u./ml)或者存在PDGF和IFN-α以及SDF-1(0.1-100ng/ml)的无血清培养基中。培养14天后，将该板固定并如方法中所述进行染色用于CFU-F集落计数。

具体实施方式

本发明的发明人得到了惊人的发现，即趋化因子SDF-1在未成熟BMSSC种群的增生、存活以及成骨能力中发挥作用。

因此，本发明提供一种增强间充质前体细胞(MPC)或其衍生后代的增生和/或存活的方法，该方法包括将该MPC或后代暴露于SDF-1或其类似物。

如本文所使用的，MPC是能够形成大量多能细胞集落的非造血祖细胞。

在本发明的一个优选实施例中，该MPC对选自由STRO-1^亮、VCAM-1^亮、THY-1^亮、CD146^亮和STRO-2^亮组成的组中的至少一种标记物呈阳性。

当在本文中使用时，术语“亮(bright)”指的是在细胞表面上的标记物，在可检测地标记时其可产生相对较高的信号。同时不希望受限于理论，提出了“亮”细胞比样品中的其它细胞表达更多的靶标记蛋白(例如，由STRO-1识别的抗原)。例如，当用FITC轭合的STRO-1抗体标记(如通过FACS分析所确定的)时，STRO-1^亮细胞相比非亮细胞(STRO-1^暗/neg)产生较高的荧光信号。优选地，“亮”细胞构成含于起始样品中最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其它具体实施方式中，“亮”细胞构成含于起始样品中最亮标记的骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。优选地，该“亮”细胞是STRO-1^亮、VCAM-1^亮、THY-1^亮、STRO-2^亮和/或CD146^亮细胞。如在WO 01/04268中讨论的，基于标记强度选择的细胞亚群如STRO-1^亮细胞比单独基于细胞标记物的阳性/阴性鉴定所选择的亚群具有较大比例的MPC。

在本发明进一步的优选实施例中，MPC携带至少两个标记物，该标记物选自由对间充质前体细胞特异的STRO-1^bri、LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、β-1整合素、6-19、血栓调节素、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL和CD146等表面标记物或这些标记物的任意组合组成的组。

在本发明的进一步优选实施例中，该MPC对选自由CD34、CD14、CD45、CBFA-1、II型胶原、PPARγ2以及血型糖蛋白A组成的组中的至少一种标记物呈阴性。

用于制备富含MPC种群的方法在WO01/04268和WO2004/085630中有描述。

在体外环境中，MPC很少以绝对纯的制品存在，通常与作为组织特异性定型细胞(TSCC)的其它细胞一起出现。WO01/04268提及以约0.1％至90％的纯度水平从骨髓收集这样的细胞。可替换的收集方法可能导致MPC比例以较低水平存在。

包含MPC的种群(本发明的方法适用于此)可以直接从组织源收集，或可替换地其可以是已在体外扩增的种群。

例如，本发明的方法可以被适用于已收集而未扩增的基本上纯化的MPC种群，构成它们存在于其中的种群总细胞的至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％。这个水平可通过例如选择对选自由STRO-1^亮、VCAM-1^亮、THY-1^亮、CD146^亮和STRO-2^亮组成的组中的至少一种标记物是阳性的细胞来实现。

MPC可以来源于在WO01/04268或WO2004/085630中提出的任何一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或可能更广泛地来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱以及骨骼肌。

这样的细胞的优选来源是人，然而，期望本发明也可适用于动物，包括家用动物如奶牛、羊、猪等，家畜如狗和猫，实验动物如小鼠、大鼠、仓鼠和兔，或用于运动的动物如马。

如本文所使用的，术语“后代”用于指起源于MPC的细胞。该后代可以是前体细胞或完全分化的细胞(如骨细胞)。

在一个优选具体实施方式中，所述后代是一种前体细胞。

如本文所使用的，起源于MPC的“前体细胞”是一种部分专化或组织特异的定型细胞，其分裂并获得分化的细胞。尽管前体细胞定型于一种分化途径，但是其通常不表达成熟而完全分化细胞的标记物或充当成熟的完全分化的细胞。因此，前体细胞产生相关类型的细胞，但是在其常规状态并不产生多种细胞类型。前体细胞趋于定型至一种细胞或组织系类型，然而它们可以是双能的(bi-potential)，即能够进一步分化成两种不同细胞或组织类型中的一种。

前体细胞可以被定型至其的直系后代的非限制性实例包括骨前体细胞；肝祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经元限制性细胞，其可产生发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，其发展为神经元；用于心肌和心肌细胞的前体、分泌血糖感应胰岛素的胰腺β细胞系。其它定型前体细胞包括但不限于软骨细胞、成牙质细胞、产生牙质和软骨细胞以及下列细胞的前体细胞：视网膜色素上皮细胞，成纤维细胞、皮肤细胞如角化细胞，树突细胞，毛囊细胞，肾管上皮细胞，平滑肌和骨骼肌细胞，睾丸前体，脉管内皮细胞，肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞，成纤维细胞，髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、脉管、上皮、神经胶质、神经元、星形胶质和少突胶质细胞。前体细胞还包括那些特异导致产生结缔组织包括脂肪、蜂窝(areolar)、骨质、软骨、弹性和纤维结缔组织的细胞。

在本发明的一个优选实施例中，该前体细胞是骨前体细胞。

如本文所使用的，“骨前体细胞”是能够分化或扩增为成骨细胞的任何细胞。优选的骨前体细胞包括骨祖细胞和前成骨细胞。

通过本发明的方法实现的增生增强可以引起MPC数量相对于未受刺激的对照增加超过10、20、30、40或50％。可替换地，该增加可以达1倍、2倍或更多倍。

在本发明的一个优选实施例中，SDF-1类似物是一种激活CXCR4信号转导的配体。该SDF-1类似物可以是例如天然存在的SDF-1的生物学活性片段、变异体或衍生物。

在本发明的一个进一步优选实施例中，该SDF-1类似物选自由HIV-1外壳蛋白gp120、AMD3100(AnorMED Inc，British Columbia，Canada)和ALX40-4C(Allelix Biopharmaceuticals Inc，Canada)组成的组。

在本发明的一个进一步优选实施例中，该MPC或其衍生后代也被暴露于一种刺激因子，其选自由外源性血小板源生长因子(PDGF)、干细胞因子(SCF)、Fit3配体(FL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、1α，25-二羟维生素D3(1，25D)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及白介素-1β(IL-1β)组成的组。

通常考虑的是，本发明的方法具有对细胞的体外培养(例如，对于新鲜收集或体外扩增的培养物)的适用性，然而，当MPC或其衍生后代位于人体组织部位的原位且外源性SDF-1或其类似物被递送至该部位时，本发明也具有适用性。一次这样的递送可能是足够的，然而，短暂而间隔的递送提供的益处可能会加速或更大。

该外源性SDF-1或其类似物可以以多肽的形式或以可表达产生多肽的核酸形式给予受治者。例如，该外源性SDF-1或其类似物可以以含有核酸的组合物的形式或以已经过遗传修饰以过表达SDF-1或其类似物的宿主细胞的形式给予。

在体外递送的教导中，递送(与SDF-1或其类似物同时)包含MPC或其衍生后代的组合物也可能是理想的。例如，在骨、心肌、脉管组织或内皮细胞损伤的情况下，被递送的后代优选至少部分定型至一种相关细胞型(例如，成骨细胞、心肌细胞或内皮细胞)。这些可以作为一种混合前体细胞培养物的部分或以更纯的形式(例如，已根据在组织特异性定型细胞型上存在的已知标记物进行分选的)而提供。可替换地或另外，被递送的组合物可以包括一种或多种分化刺激因子以使存在于该组合物中或原位存在于一种或多种感兴趣组织类型的靶位点处的MPC分化。

本发明还提供一种使组织特异性定型细胞种群分化的方法，该方法包括

将MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物，以增强该MPC或后代的增生和/或存活，以及

使该增生的种群处于使该MPC或其衍生后代的分化偏向于一种特异性组织类型的条件下。

该组织类型可以选自由心肌、脉管组织、成骨细胞、成牙质细胞、骨细胞、骨衬细胞和内皮细胞组成的组。用于体外培育这些组织类型以及用于这些组织类型体外发育的示例性条件对于本领域的熟练技术人员是已知的。

上述方法可适用于骨骼肌、心肌、骨、牙或脉管组织的生成或修复。尤其是，该方法可以适用于选自由心肌、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、成牙质细胞、成牙软骨细胞、骨细胞、骨衬细胞、骨骼肌细胞、脉管内皮细胞、骨髓基质、破骨和造血支持基质、心肌、骨骼肌、内皮细胞和脉管细胞组成的组的细胞或组织的形成或修复。

在一种具体实施例中，本发明提供了一种用于体外成骨的方法，该方法包括

使该增生的种群处于使所述MPC的分化偏向骨前体细胞的条件，或处于骨前体细胞的分化偏向骨的条件下。

使MPC或其衍生的骨前体细胞的分化偏向骨的条件可涉及例如在补充了10％FCS、100μM L-抗坏血酸盐-2-磷酸盐、地塞米松10^-7M和3mM无机磷酸盐的αMEM中的培养。这些条件已被证实诱导人BM间质细胞在体外发育成一种矿化的骨基质(Gronthos etal.，Blood.84：4164-73，1994)。

在一个可替换的实施例中，该方法可以涉及骨前体细胞通过在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙蛋白或骨粘连蛋白存在的情况下培养骨前体细胞而分化成成骨细胞。在一个具体实施例中，骨前体细胞在I型胶原、纤维蛋白原以及纤维蛋白存在的情况下进行培养。在一个可替换实施例中，骨前体细胞在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、骨钙蛋白以及骨粘连蛋白存在的情况下进行培养。在该方法中，I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙蛋白或骨粘连蛋白可以单独使用或在生长因子存在的情况下使用。应当理解，本段以上列出的化合物的任意组合也属于本发明的构思范围。

本发明还提供一种组合物，包含分离的MPC或其衍生后代以及SDF-1或其类似物。

在一个优选实施例中，该组合物包含基本上纯的MPC或后代，其构成该组合物总细胞的至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％。

在一个进一步优选实施例中，该SDF-1或其类似物以约0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM的浓度存在于所述组合物中。

本发明还提供一种已经过遗传修饰以过表达SDF-1的MPC或其衍生后代。

在一个实施例中，该MPC或其衍生的前体细胞用编码SDF-1的多核苷酸加以转染。

在另一个实施例中，该MPC或其衍生的前体细胞的基因组被修饰，以实现所述SDF-1蛋白的过表达。在一个实施例中，该MPC或其衍生的前体细胞的SDF-1基因的一个调节区被修饰以实现SDF-1蛋白的过表达。

本发明还提供了一种组合物，包含根据本发明的转染的MPC种群。

本发明的该组合物可以进一步包含一种或多种其它刺激因子。例如，所述其它刺激因子可以选自由PDGF、SCF、FL、G-CSF、IL-3、IL-6、1，25D、TNF-α和IL-1β组成的组。

本发明涵盖的递送系统，其中本发明的组合物(例如包含遗传修饰的MPC的组合物)被系统给予或局部给予以定位于选定的组织类型，例如损伤的组织。例如，本发明组合物可以直接注入靶组织。注射部位优选在损伤部位或该损伤组织附近。可替换地，表达SDF-1以及特异性重组配体或受体的遗传修饰的MPC可以被引入受治者，然后该细胞通过诱导靶组织中的同源结合伴侣表达而靶向于希望的靶组织。

应当理解，本发明的组合物对于增强用于修复或再生组织(例如，由于缺血或在再灌注相关损伤而凋亡的心肌细胞；在骨、韧带、肌腱或软骨的创伤性损伤后的软骨细胞；或在醇诱导性肝硬化中的肝细胞)的移植MPC或其衍生细胞的存活很有用。

在一个具体实施例中，本发明的组合物对于增强用于修复或再生骨的移植MPC或其衍生细胞的存活很有用。因此，本发明的组合物可以进一步包含一种基质，如可吸收的明胶、纤维素或胶原。该组合物可以以海绵状、条状、粉末、凝胶或网状物的形式加以利用。

本发明还提供一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将所述受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。

本发明还提供一种在受治者中成骨的方法，该方法包括将本发明的一种组合物在需要骨形成的部位给予所述受治者。

该方法可以用于例如骨的修复，并且同样地，本发明的一种组合物以及可选的，一种合适载体(support)可以被引入到一个需要骨形成的部位。因此，例如，由骨损伤或患肿瘤的骨的部分去除引起的骨骼缺损可以通过将本发明的组合物植入该缺损部位而进行修复。这样的缺损包括例如节段性骨缺损、不愈合、骨连接不正或愈合延迟、囊肿、肿瘤、坏死或发育异常。需要骨增加(如关节重建、创面重建或者骨融合例如脊骨融合或关节融合)的其它病症，可以通过将本发明的一种组合物给予至需要增加的骨部位内部而在个体中进行治疗。该组合物可以与例如可再吸收的生物聚合物如明胶、纤维素或胶原基的介质联合应用，或存在于磷酸钙陶瓷载体中，达到足以增加其骨形成的程度。可再吸收的生物聚合物可以为粉末或海绵状形式，并且优选为一种源于猪皮的明胶。陶瓷载体可以为特殊形式或可以为结构稳定的三维植入物形式。该结构稳定的三维植入物可以是例如立方体、圆柱形、块状或一种恰当的解剖形式。该组合物也可包含一种或多种以接近新组织形成的速率降解、再吸收或重建的其它组分。合适的方法和技术参见Caplan等的美国专利5,226,914和美国专利5,837,539。

该方法还可以用来辅助固定假体装置。因此，假体装置(如用于髋关节、膝关节和肩关节置换的那些装置)的表面可以在植入前涂覆本发明的一种组合物。然后该组合物中的MPC或其衍生后代可以分化为成骨细胞，从而加速骨向内生长的过程以及假体装置的整合(参见Caplan等的美国专利5,226,914和美国专利5,837,539)。

上述方法可以进一步包括给予个体至少一种生物活性因子，其诱导或加速MPC或其衍生后代分化成骨种系。该生物活性因子可以是例如一种合成的糖皮质激素如地塞米松，或一种骨形态发生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7。该骨形态发生蛋白可以存在于一种适合于肌内、静脉内、髓内或关节内注射的液体或半固体载体中。

本发明还提供一种在受治者中形成脉管组织的方法，该方法包括将所述受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。本发明还提供一种在受治者中形成脉管组织的方法，该方法包括将本发明的一种组合物在需要脉管组织形成的部位处给予该受治者。

本发明还提供一种在受治者中形成心肌或平滑肌的方法，该方法包括将该受治者中的MPC或其衍生后代暴露于外源性SDF-1或其类似物。

本发明还提供一种在受治者中形成心肌或平滑肌的方法，该方法包括将本发明的一种组合物在心肌或平滑肌形成部位给予给受治者。

在整个说明书中，词语“包括”或变形如“包含”应当理解为表示包括所述元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，但不排除任何其它元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。

基质细胞衍生因子-1及其类似物

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在本领域中也被称为趋化因子CXC基序配体12(CXCL12)和前B细胞生长刺激因子(PBSF)。基质细胞衍生因子1-α和1-β是较小的细胞因子，属于间分泌素(intercrine)家族，该家族的成员激活白细胞并且经常由促炎刺激物如脂多糖、TNF或IL-1所诱导。间分泌素的特征在于存在4个保守半胱氨酸，可形成2个二硫键。它们可被分成两个亚家族。在CC亚家族中，半胱氨酸残基相互邻接。在CXC亚家族中，它们由插入的氨基酸所分隔。SDF-1蛋白属于后一组。

如上所述，至少存在两种已知的SDF-1异构体，称为SDF-1α和SDF-1β。Shirozu等(Genomics，28：495，1995)鉴定了人SDF-1染色体组的克隆体，并且证实该α和β异构体是单个基因可替换剪接的结果。α形式来源于外显子1-3而β形式包含来自外显子4的其它序列。全长人基因大约10kb，位于染色体10q11.1处。

除非有相反声明，如本文所使用的，术语“SDF-1”指至少该α和/或β异构体。该术语还包括天然存在分子的生物学活性片段、变异体和衍生物，其保持至少一部分活性使其对本发明的方法有用。在一个优选具体实施方式中，本发明涉及该α异构体的应用。

多种不同天然哺乳动物的SDF-1α和/或β蛋白的氨基酸序列是已知的，包括人、大鼠、小鼠和猫(参见，例如Shirozu et al.，Genomics，28：495，1995；Tashiro et al.，Science 261：600，1993；Nishimura et al.，Eur.J.Immunogenet.25：303，1998；和GenBank登记号AF189724)。人α异构体的氨基酸序列作为SEQ ID NO：1提供，而人β异构体的氨基酸序列作为SEQ ID NO：2提供。SDF-1蛋白的一种优选形式是纯化的天然SDF-1蛋白，其具有的氨基酸序列与前述哺乳动物SDF-1蛋白中的一种或获自其它物种的其直系同源物相同。

对应于一种或多种特定基序和/或结构域或对应于长度为任意大小(例如，至少5、10、25、50或75个氨基酸)的SDF-1生物学活性片段也属于本发明的范围。该片段可被产生(重组或通过化学合成)和检测以鉴定那些可充当天然SDF-1蛋白的类似物的肽基片段。

SDF-1变异体具有的肽序列在一个或多个氨基酸上不同于天然SDF-1蛋白。这些变异体的肽序列可能的特征是天然SDF-1蛋白的一个或多个氨基酸缺失、插入或替换。氨基酸插入优选为约1至4个邻接氨基酸，而缺失优选为约1至10个邻接氨基酸。

SDF-1变异体可通过各种本领域已知的技术来形成。例如，SDF-1变异体可通过引起突变来形成，如通过引入分散的点突变或通过截短来形成。突变可产生一种具有与天然SDF-1蛋白基本上相同的功能活性的SDF-1变异体。特别地，可生成该蛋白的激动形式，其组成性地表达天然SDF-1蛋白的一种或多种功能活性。可产生的其它SDF-1蛋白变异体包括抵抗蛋白水解切割的那些变异体，例如由于改变蛋白酶靶序列的突变作用。肽的氨基酸序列改变是否得到具有天然SDF-1蛋白的一种或多种功能活性的变异体，可通过测试该变异体的天然SDF-1蛋白功能活性而很容易确定，例如，如本文所述的测试该变异体刺激MPC增生的能力。

在本领域中已知多种技术可用来筛选由点突变或截短形成的组合文库的基因产物，并用来筛选cDNA文库中具有某种性能的基因产物。这样的技术通常可适用于通过SDF-1基因变异体的组合突变产生的基因文库的快速筛选。最广泛使用的用于筛选较大基因文库的技术通常包括将该基因文库克隆到可复制的表达载体中，利用所得到的载体文库转化合适的细胞，并且在一定条件下表达该组合基因，而在该条件下检测预期活性有利于相对容易分离编码其产物被检测的基因的载体。

SDF-1是G-偶联的7次跨膜CXCR4受体(在本领域也称为融合蛋白或LESTR)目前唯一为人们所知天然存在的激动剂。而且，已证实MPC表达CXCR4受体(人类分子，作为SEQ ID NO：3提供)。因此，本文所述的SDF-1的生物学作用最可能是通过趋化因子受体CXCR4介导的。因而，对本发明的方法很有用的SDF-1类似物也可以是CRCX4激动剂。然而，本发明不排除MPC表达一种不同于CXCR4的受体，本文描述的生物学活性由其完全介导，或连同另一受体如CRCX4来介导。

如本文所使用的，术语“SDF-1类似物”指的是结构上或功能上与SDF-1相关并且适合用于本发明方法的任何分子。优选地，SDF-1类似物是SDF-1结合于CXCR4的拮抗剂。SDF-1类似物包括如上所述的天然存在的SDF-1的生物学活性片段、变异体和衍生物。

SDF-1类似物的实例包括描述于US 20050065064、US20050059584和Pelus et al.，Exp.Hematol.33：295，2005中的分子。另外，有证据表明HIV-1外壳蛋白gp120作为SDF-1类似物起作用(Tran et al.，J.Neuroimmunol.160，68 2005)。此外，研究已证实，AMD3100(AnorMED Inc，British Columbia，Canada)和ALX40-4C(Allelix Biopharmaceuticals Inc，Canada)可作为CXCR4受体的激动剂(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277，24515 2002)起作用。

多种肽或模拟(包括肽模拟物)SDF-1蛋白类似物可利用传统技术生成。例如，抗体或抗体片段可针对结合SDF-1的受体(如CXCR4)生成，然后进行筛选以鉴定那些作为天然SDF-1蛋白的类似物起作用的抗体或抗体片段。而且，SDF-1类似物可通过鉴定结合SDF-1蛋白受体如CXCR4的那些分子而筛选其它分子(如小有机或无机分子)的文库进行鉴定。那些经鉴定的分子可进一步根据其在细胞中诱导或阻止的信号类型而表征为激动剂。

对于本发明方法很有用的SDF-1类似物还可利用CXCR4受体激动剂再分布^TM分析(CXCR4 Receptor Agonist Redistribution^TMassay)加以鉴定和/或验证(BioImage A/S，Soeberg，Denmark)。

SDF-1类似物的其它实例是含有对应于SDF-1各个区域或部分的结构的化合物。在一个具体实施方式中，该类似物包含N-末端区和C-末端区，借助于一个连接物(接头，linker)结合在一起。在其它具体实施方式中，SDF-1的氨基酸残基通过例如赖氨酸和丝氨酸残基的醚化或通过本领域已知的其它方式而环化。在又一个具体实施方式中，该SDF-1类似物包含的氨基酸序列来源于野生型趋化因子序列，但一个或多个半胱氨酸被另一种氨基酸替换。其它具体实施方式包括趋化因子类似物，其包含一个N-末端区、一个含有达3个反平行β折叠的内部区、一个含有α-螺旋结构的C-末端区、一个直接连接在一起的该N-和C-末端区的组合、一个N-末端区和内部区的组合或一个内部区和C-末端区的组合或最后地一个N-末端区、内部区和C-末端区的组合。选自该N-末端区、内部区和C-末端区的区域的长度可以为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25、30、35、40、41或45个氨基酸。

对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以包括衍生物，如C-末端羟甲基衍生物、O-修饰的衍生物(例如，C-末端羟甲基苄基醚)、N-末端修饰的衍生物包括取代酰胺如烷基酰胺和酰肼以及C-末端的苯基丙氨酸残基为苯乙酰胺类似物所取代的化合物(例如，作为三肽Ser-Ile-Phe类似物的Ser-Ile-苯乙酰胺)、糖基化的趋化因子衍生物、聚乙二醇修饰的衍生物或生物素化的衍生物。

对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以直接或间接偶联于至少一个修饰基团。术语“修饰基团”用来包括直接连接于肽结构(例如，通过共价键或共价偶联)的结构，以及间接连接于肽结构(例如，通过一个稳定的非共价键结合或通过一个连接物共价偶联于另外的氨基酸残基)的那些结构。术语“修饰基团”还可指其模拟物、类似物或衍生物，其可以位于SDF-1核心肽结构的侧面。例如，该修饰基团可偶联于SDF-1肽结构的氨基末端或羧基末端，或者偶联于核心结构侧面的肽或肽模拟区。可替换地，该修饰基团可偶联于SDF-1肽结构至少一个氨基酸残基的侧链，或偶联于核心结构域侧面的肽或肽模拟区(例如，通过赖氨酰残基的ε氨基；通过天冬氨酸残基或谷氨酸残基的羧基；通过酪氨酰残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基；或氨基酸侧链上任何其它合适的反应性基团)。共价偶联于肽结构的修饰基团可利用本领域中熟知的用于连接化学结构的手段和方法来连接，包括例如酰胺、烷胺基、硫化物、氨基甲酸酯(盐)或脲键。

在一些具体实施方式中，该修饰基团可以包括一个环状、杂环或多环基团。如本文所使用的，术语“环状基团”包括具有3至10、4至8或5、6、7个碳原子的环状饱和或不饱和(即，芳族)基团。示例性非芳族环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基以及环辛基。术语“杂环基团”包括可选取代的、饱和的或不饱和的、3至8元环状结构，其中一个或多个骨架原子是氧、氮、硫或其组合。环状基团或杂环基团可以在一个或多个环位置处未被取代或被取代。一个环状基团可以例如被卤素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂环、羟基、氨基、硝基、硫醇胺、亚胺、酰胺、磷酸酯、磷化氢、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、硫醚、磺酰基、磺酸盐、硒基醚、酮、醛、酯、-CF₃、-CN所取代。该环状基团还可以借助一条含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多碳原子的饱和或不饱和链连接于一个取代基，例如卤素、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂环、羟基、氨基、硝基、硫醇胺、亚胺、酰胺、磷酸酯、磷化氢、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、硫醚、磺酰基、磺酸盐、硒醚、酮、醛、酯、-CF₃、-CN；另外的一个或多个可以由氧、氮或硫原子所取代。

对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以通过加入聚乙二醇(PEG)进行修饰。PEG修饰可以引起循环时间改善、溶解性提高、蛋白水解抗性提高、抗原性和免疫原性减弱、生物利用度提高、毒性降低、稳定性提高以及配制更容易。PEG化还可以引起生物活性显著降低。

对本发明的方法很有用的SDF-1类似物可以以“前药”形式制备，其中，该化合物本身不作为SDF类似物起作用，而是可以通过体外和/或体内的代谢作用而转化成SDF-1类似物。例如，在这种类型的化合物中，修饰基团可以以能够通过代谢作用而转化成活性SDF-1类似物形式的前药形式存在。这种前药形式的修饰基团在本文中称为“二次修饰基团”。已知本领域有多种方案可用于制备限制代谢作用的肽前药，以便优化该活性形式的肽基前药的递送。

在上面各个部分提及的本发明各个特征和具体实施方式只要合适即可应用于其它部分。特别地，在一个部分说明的特征只要合适就可以结合其它部分说明的特征。

遗传修饰细胞的制备

在本发明的另一个方面，MPC或其衍生的前体细胞经遗传修饰以制备SDF-1或其肽类似物。典型地，该细胞将经过遗传修饰以使得SDF-1或其肽类似物从其分泌。

遗传修饰的细胞可在至少一种其量足以支持该经修饰细胞生长的细胞因子存在的情况下进行培养，然后选择其中编码的多肽被过表达的修饰细胞，这样获得的遗传修饰细胞可以立即被利用(例如，在移植物中)、培养和体外扩增或保存以备用。该修饰的细胞可以通过本领域熟知的方法例如在液氮中冷冻而保存。

如本文所使用的，遗传修饰涵盖任何遗传修饰方法，其涉及将外源性或外来多核苷酸引入MPC或其衍生的前体细胞中，或在MPC或其衍生的前体细胞内对内源性基因的修饰。遗传修饰包括但不限于转导(病毒介导的宿主DNA从宿主或供体到受体的转移，在体外或体内)、转染(用分离的病毒基因组DNA转化细胞)、脂质体介导的转移、电穿孔、磷酸钙转染或共沉淀以及其它。转导的方法包括将细胞与包装细胞直接共培养(Bregni et al.，Blood80：1418-1422，1992)，或在有或没有合适生长因子和聚阳离子的情况下单独利用病毒上清液进行培养(Xu et al.，Exp.Hemat.22：223-230，1994)。

通常将编码SDF-1或其肽类似物的多核苷酸以载体形式引入宿主细胞。该载体常常包括对于插入的编码序列的转录和翻译所必需的元件。用来构建这种载体的方法在本领域是熟知的。例如，用于构建合适表达载体的技术在Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.(3rd Ed.，2000)；和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，Inc.，New York(1999)中有详细描述。

载体可以包括但不限于病毒载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒、粘粒、质粒载体、合成型载体以及通常用于本领域中的其它重组载体。含有启动子和克隆位点(多核苷酸可操作地与其连接)的载体在本领域中是熟知的。这样的载体能够在体外或体内转录RNA，并且可从诸如Stratagene(La Jolla，Calif.)和Promega Biotech(Madison，Wis.)等来源购得。具体实例包括来自Stratagene的pSG、pSV2CAT、pXtl以及来自Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV和pSVK3。

优选的载体包括逆转录病毒载体(参见Coffin et al.，″Retroviruses″，Chapter 9 PP；437-473，Cold Springs HarborLaboratory Press，1997)。本发明中有用的载体可通过本领域熟知的工艺经重组制备。例如，WO94/29438、WO97/21824和WO97/21825阐述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例性载体包括pCMV哺乳动物表达载体，例如pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.)、pSFFV-Neo和pBluescript-Sk+。有用的逆转录病毒载体的非限制性实例是那些来源于鼠类、鸟类或灵长类逆转录病毒的载体。通用的逆转录病毒载体包括那些基于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV-载体)的载体。其它源于MoMLV的载体包括Lmily、LINGFER、MINGFR和MINT(Chang et al.，Blood 92：1-11，1998)。另外的载体包括那些基于长臂猿白血病毒(GALV)和莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾病灶形成病毒(SFFV)的载体。来源于鼠干细胞病毒(MESV)的载体包括MESV-MiLy(Agarwal et al.，J.of Virology，72：3720-3728，1998)。逆转录病毒载体还包括基于慢病毒的载体，非限制性实例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的载体。

制备逆转录病毒载体构建体时，病毒gag、pol和env序列可从该病毒去除，形成用于外来DNA序列插入的空间。由外来DNA编码的基因通常在长末端重复序列(LTR)中的强病毒启动子控制下表达。合适的控制调节序列的选择取决于所使用的宿主细胞，且选择属于本领域技术人员的能力范围。除LTR的启动子外，还有多种启动子为人所知。非限制性实例包括噬菌体λPL启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MMSV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的U3区启动子、Granzyme A启动子以及Granzyme B启动子。另外，可使用可诱导或多重控制元件。选择合适的启动子对于本领域技术人员是显而易见的。

如果gag、pol和env功能由包装细胞系反式提供，则这样的构建体可被有效地包装到病毒粒子中。因此，当该载体构建体被引入所述包装细胞中时，由该细胞产生的gag-pol和env蛋白与载体RNA一起组装以产生感染性病毒颗粒(viron)而分泌到培养基中。这样产生的病毒可感染并整合入靶细胞的DNA，但不产生感染性病毒粒子因为其缺少基本的包装序列。目前使用的大多数包装细胞系已用单独的质粒(每种质粒含有必需的编码序列中的一个)进行转染，因此多重重组情况在可复制病毒产生之前是必需的。可替换地，该包装细胞系带有一种前病毒。该前病毒已被破坏，因此尽管其可以产生组装感染性病毒所必需的全部蛋白质，但是其自身RNA不能包装入病毒，而是包装由重组病毒产生的RNA。因此，从该包装细胞释放的病毒原种仅含有重组病毒。逆转录病毒包装株系的非限制性实例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP、RDI 14、GP7C-tTA-G10、ProPak-A(PPA-6)以及PT67。参考了Miller et al.，Mol.Cell Biol.6：2895，1986；Miller et al.，Biotechniques 7：980，1989；Danos et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460，1988；Pear et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396，1993；and Finer et al.，Blood83：43-50，1994。

其它合适的载体包括腺病毒载体(参见Frey et al.，Blood91：2781，1998；和WO 95/27071)以及腺相关病毒载体。这些载体在本领域中都是熟知的，如Chatterjee et al.，Current Topics in Microbiol.And Immunol.，218：61-73，1996；Stem cell Biology and Gene Therapy，eds.Quesenberry et al.，John Wiley & Sons，1998；and U.S.Pat.Nos.5,693,531 and 5,691,176中所描述的。腺病毒衍生载体的应用在某些情形下可能是有利的，因其不能够感染非分裂细胞。与逆转录病毒DNA不同，腺病毒DNA不整合入靶细胞的基因组中。而且，腺病毒载体携带外来DNA的能力比逆转录病毒载体大很多。腺相关病毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以被整合入非分裂细胞中，利用腺相关病毒载体已将多种多核苷酸成功引入不同细胞型中。

在一些具体实施方式中，该构建体或载体包括两种或更多种异源性多核苷酸序列：a)编码SDF-1或其类似物的核酸序列，和b)一种或多种其它核酸序列。优选地，所述其它核酸序列是编码选择性标记物、结构基因、治疗基因、CXCR4受体或其它细胞因子/趋化因子基因的多核苷酸。

一种选择性标记物可以被包含于构建体或载体中，用于监测遗传修饰的成功以及用于选择DNA已整合入其中的细胞。非限制性实例包括耐药性标记物，如G148或潮霉素。另外也可采用阴性选择，例如，其中的标记物是HSV-tk基因。该基因使该细胞对诸如阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(gancyclovir)等药物敏感。通常使用NeoR(新霉素/G418抗性)基因，但任何便利的标记基因均可使用，只要其基因序列尚未存在于靶细胞中。进一步的非限制性实例包括低亲和力的神经生长因子(NGFR)、增强绿色荧光蛋白(EFGP)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、细菌hisD基因、鼠CD24(HSA)、鼠CD8a(lyt)、赋予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因以及β-半乳糖苷酶。

其它多核苷酸序列可以在与编码SDF-1或其肽类似物的多核苷酸相同的载体上被引入到宿主细胞中，或者所述其它多核苷酸序列可以在另一个载体上被引入宿主细胞。在一个优选的具体实施方式中，一种选择性标记物将被包含在与编码SDF-1或其肽类似物的多核苷酸相同的载体上。

本发明还涵盖对内源性SDF-1基因的启动子区进行遗传修饰，以使该内源性基因的表达上调，导致相比于野生型MPC或其衍生的前体细胞，SDF-1的产生增加。

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及其类似物的给予

本发明的方法可以涉及将SDF-1或其类似物给予一个受治者，以原位增强MPC或其衍生后代的增生和/或存活。

这些方法可以涉及部分、系统或局部如在植入物或装置内部给予SDF-1或其类似物。

在一个特定的具体实施方式中，本发明提供一种通过将SDF-1或其类似物系统性地给予所述受治者，而在需要其的受治者中增强MPC或其衍生后代增生和/或存活的方法。例如，该SDF-1或其类似物可通过皮下或肌内注射而给予。

本发明的这个具体实施方式可能对那些希望特定组织中MPC的增生和/或存活增加的系统变性疾病的治疗很有用。可用这种方式治疗的系统变性疾病的实例包括骨质疏松症或骨折、软骨变性疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病或心血管疾病等。

因此，根据本发明，包含治疗或预防有效量SDF-1或其类似物的组合物可以用于治疗的疾病或失调选自由自身免疫性疾病、急性慢性炎症、癌症、心血管病、感染性疾病以及炎症性疾病(包括风湿性关节炎、慢性炎症性肠道疾病、慢性炎症性盆腔疾病、多发性硬化症、哮喘、骨关节炎、动脉粥样硬化、银屑病、鼻炎、自身免疫性和器官移植排斥)组成的组。在一个实施例中，这样的组合物包括治疗或预防有效量的SDF-1或其类似物，足以用来辅助刺激组织特异性细胞的产生。

“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间期内可有效获得MPC或其衍生后代的增生和/或存活增强的量。

“预防有效量”是指在必要的剂量和时间期内可有效获得希望的预防效果如防止或抑制MPC或其衍生后代死亡的量。

在特定的具体实施方式中，SDF-1或其类似物的治疗或预防有效量的优选范围可以是0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM。应当注意，剂量值可以随着待缓解病症的严重程度而变化。对于任何特定的受治者，根据个体需要以及给予或监控该组合物给予的人员的专业判断，特定的剂量方案可随时间进行调整。本文提出的剂量范围仅是示例性的，并不限制可能由医疗人员选择的剂量范围。组合物中的SDF-1或其类似物的量可以根据诸如个体疾病状态、年龄、性别以及等因素而变化。可对剂量方案进行调整以提供最佳治疗应答。例如，可以给予单一推注，可以在一定时间内给予若干分次剂量，或者该剂量可以根据治疗情形紧急性的指示而成比例地减少或增加。将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，可能对方便给予和统一剂量是有利的。如本文所使用的，“剂量单位形式”是指物理性分开的单位，适合作为用于待治疗受治者的单一剂型；每一个单元含有经计算的预定量活性化合物，以联合必需的药用载体而产生希望的治疗作用。

应当理解，SDF-1或其类似物可以以一种包含药用载体或赋形剂的组合物形式而给予。

如本文所使用的，“药用载体”或“赋形剂”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延缓吸收剂等。在一个具体实施方式中，该载体适合于肠胃外给予。可替换地，该载体可适合于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服给予。药用载体包括无菌水性溶液或分散液以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。这些用于药学活性物质的介质和试剂应用在本领域是熟知的。除了任何与该活性化合物不相容的常规介质或试剂的范围，均考虑其在本发明药物组合物中的应用。补充的活性化合物也可并入到该组合物中。

用于肠胃外给药的药物制剂可以包括脂质体。脂质体和乳液是熟知的对于疏水性药物特别有用的递送工具或载体的实例。根据治疗试剂的生物学稳定性，可以采用其它用于稳定蛋白质的方案。此外，人们可以给予存在于靶向药物递送系统中的药物，例如，存在于涂覆靶特异性抗体的脂质体中。该脂质体会结合于靶蛋白并由表达靶蛋白的细胞选择性吸收。

通常，在生产和贮存条件下治疗组合物应该是无菌且稳定的。该组合物可配制成溶液、微乳液、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可通过例如利用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需颗粒大小以及通过利用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选在该组合物中包括等渗剂，例如糖类、多醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延迟吸收可通过在该组合物中包含一种延缓吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶而实现。此外，SDF-1或其类似物可以在延时释放制剂中给予，例如在包括缓释聚合物的组合物中给予。该活性化合物可利用防止该化合物快速释放的载体如控释制剂一起制备，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这些制剂的许多方法都被授予专利或通常对于本领域技术人员是已知的。

另外，本发明化合物的悬浮液可被制成适当的油状悬浮液用于注射。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂质体。用于注射的悬浮液也可含有增加该悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加该化合物溶解性的试剂，以制备高度浓缩的溶液。

无菌可注射溶液可通过在合适溶剂中以需要量的活性化合物根据需要与上述列举组分中的一种或其组合加以混合而制备，随后进行过滤消毒杀菌。通常，分散液通过将活性化合物并入含有一种基本分散介质以及所需的来自以上列举的其它组分的无菌载体中而制备。在用于无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，可从其之前已无菌过滤的溶液得到一种活性成分与任何其它希望组分的粉末。根据本发明的一个可替换方面，SDF-1或其类似物可以与一种或多种增强该SDF-1或类似物溶解性的其它化合物一起配制。

如果本发明的化合物需要通过吸入给予，则它们可以以压缩包装的气溶胶喷射规格或雾化剂的形式，同时采用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三绿氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体)一起方便地加以递送。在一种压缩气溶胶的情况下，剂量单位可以通过一个阀递送可测定的量来确定。例如用于吸入器的胶囊和明胶套可以配制成包含该化合物和一种合适粉末基质如淀粉或乳糖的粉末混合物。

本发明的细胞组合物的给予

包含MPC和/或其衍生后代的本发明的细胞组合物可对多种类型的组织再生很有用，包括骨、软骨、肌腱、韧带、肌肉、皮肤和其它结缔组织，以及神经、心脏、肝、肺、肾、胰腺、脑和其它器官组织。

在一些具体实施方式中，本发明的组合物可以结合一种适当的基质(例如，用于支持MPC和/或其衍生后代和为骨、软骨、肌肉、神经、表皮和/或其它结缔组织的生长提供表面)一起给予。该基质可以是传统基质生物材料的形式。该基质可以提供表达的蛋白和分化的细胞的缓释和/或其存在的适当环境。在一些具体实施方式中，预期多种胶原和非胶原被上调并从MPC或其衍生后代分泌。这种现象通过增强基质沉积而加速组织再生。基质蛋白也可在遗传改造的细胞中表达且促进移植的细胞移入并连接到移植区。

基质材料的选择根据生物相容性、生物降解性、机械性能、创面外观和界面性质。该基于细胞的组合物的特定应用将确定适当的制剂。用于该组合物的可能基质可以是生物可降解的以及化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐(polyanhydride)。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上良好定义的，如骨或真皮胶原。其它基质由纯蛋白或胞外基质组分构成。其它可能的基质是非生物降解的和化学定义的，如烧结的羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷材料。基质可以由上述类型的材料中任意的组合，如聚乳酸和羟磷灰石或胶原与磷酸三钙的组合。生物陶瓷在组成上可以被改变如在磷酸铝钙中，也可经加工以改变孔径大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性。

本发明的细胞组合物可以用来治疗由疾病或创伤或该组织发育不正常引起的需要软骨或骨组织的修复或置换的受治者，或用来提供一种整容功能，如增强身体的面部或其它特征。治疗可使得本发明的细胞的应用很必要，以产生新的软骨组织和骨组织。例如，包含未分化的或软骨形成分化诱导的前体细胞的组合物可用来治疗软骨病症，例如风湿性关节炎或骨关节炎，或一种对软骨的创伤性或手术性损伤。作为另一个实施例，包含骨前体细胞的组合物可用来治疗骨病症，包括代谢和非代谢骨疾病。骨病症的实例包括半月板撕裂、脊柱融合、脊柱盘摘除、脊柱重建、骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育异常、脊柱侧凸、骨质疏松症、牙周病、牙骨质丢失、骨软化症、软骨病、纤维性骨炎、肾性骨营养不良和骨佩吉特式病(Paget′s disease of bone)。

本发明的细胞组合物可单独给予或作为与其它细胞的混合物给予。可以结合本发明组合物而给予的细胞包括但不限于其它多潜能或多向性细胞或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、干细胞或骨髓细胞。不同类型的细胞可在给予前立即或短期内与本发明的组合物进行混合，或在给予前它们可共培养一段时间。

本发明的细胞组合物可与其它有益的药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起给予。当MPC和/或其衍生后代与其它试剂一起给予时，它们可以在单一药物组合物中一起给予，或在分开的药物组合中同时或与其它试剂按顺序给予(在给予其它试剂之前或之后)。可以共同给予的生物活性因子包括抗凋亡试剂(例如，EPO，EPO模拟抗体(mimetibody)，TPO，IGF-I和IGF-II，HGF，胱冬酶抑制剂(caspase inhibitor))、抗炎剂(例如，p38 MAPK抑制剂，TGF-β抑制剂，他汀类药物，IL-6和IL-1抑制剂，PEMIROLAST，TRANILAST，REMICADE，SIROLIMUS，和NSAID(非甾族抗炎剂物；例如TEPOXALIN，TOLMETIN，SUPROFEN))、免疫抑制/免疫调节剂(例如，钙调磷酸酶(calcineurin)抑制剂，如环孢素，他克莫司(tacrolimus)；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS，EVEROLIMUS)；抗增生剂(例如，咪唑巯嘌呤，吗乙霉酚酸盐/酯)；皮质激素类(例如，氢化泼尼松(prednisolone)，氢化可的松)；抗体如单克隆抗-IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗(basiliximab)，达克珠单抗(daclizumab))、多克隆抗-T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、单克隆抗-T细胞抗体OKT3))、抗-血栓形成剂(例如，肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿斯匹林、双嘧啶胺醇、鱼精蛋白，水蛭素，前列腺素抑制剂，和血小板抑制剂)和抗氧化剂(例如，丙丁酚，维生素A，抗坏血酸，生育酚，辅酶Q-10，谷光甘肽，L-半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉剂。作为另一个实施例，该细胞可以与瘢痕抑制因子(如在美国专利第5,827,735号中描述的，其内容结合于此作为参考)一起给予。

在一个具体实施方式中，本发明的细胞组合物作为未分化的细胞给予，即，如在生长培养基中培养的细胞。可替换地，该细胞组合物可以在培养过程中暴露于刺激分化朝向希望表型例如成骨表型的条件之后进行给予。

本发明的细胞组合物可以手术植入、注射、递送(例如，通过导管或注射器)，或以其它方式直接或间接给予至需要修复或加强的部位。这些细胞可以借助基质(例如，一种三维支架)而给予。这些细胞可以与传统药用载体一起给予。本发明的细胞或其组合物或组分(例如，ECM，细胞溶解产物，条件培养基)的给予途径包括肌内、眼用、肠胃外(包括静脉内)、动脉内、皮下、口服以及鼻道给予。肠胃外给药的特定路径包括但不限于肌内、皮下、腹膜内、大脑内、心室内、脑心室内、胸内、脑池内，脊柱内和/或脊柱周围的给药路径。

当这些细胞以半固态或固态装置进行给予时，手术植入体内的精确位置通常是一种合适的给药方式。然而，液体或流体药物组合物可以给予至一个更广泛的位置(例如，整个广泛受影响的区域)，其从该位置移动到一个特定位置，例如，通过对化学信号产生反应。

其它具体实施方式涵盖了通过给予含细胞组分(例如，细胞溶解产物或其组分)或产物(例如，通过遗传修饰产生的胞外基质、营养和其它生物因子)的药物组合物的治疗方法。

用于给予本文所述的细胞组合物的剂型和方案是根据良好的医疗实践而开发的，考虑了个体受治者的情况，例如正治疗病症的性质和程度、年龄、性别、体重和整体医疗条件以及其它为医疗人员所知的因素。因此，待给予受治者的药物组合物的有效量是由本领域已知的这些考虑来确定的。

在本发明的一些具体实施方式中，在用本发明的细胞组合物开始治疗之前抑制一个受治者的免疫反应可能是不必要的或不希望的。因此，利用同种异体或甚至异基因的MPC或其衍生后代进行移植在某些情况下可耐受的。

然而，在其它情况下，可能希望或需要在细胞治疗开始之前药理学地抑制一个受治者的免疫反应。这可以通过系统或局部应用免疫抑制剂来实现，或者通过在囊化装置中递送该细胞而实现。MPC或其衍生后代可以被包被于胶囊中，该胶囊允许细胞和治疗因子所需的营养物质和氧气透过，而该细胞对免疫体液因素和这些细胞是不可透过的。优选地，该胶囊密封材料是低变应原性的，易于稳定定位于靶组织中，并且对该植入的结构提供额外保护。这些以及其它用于减少和消除对该植入细胞的免疫反应的方式在本领域中是已知的。作为一种替换方案，MPC和其衍生后代可以经过遗传修饰以减少其免疫原性。移植的MPC或其衍生后代在生存患者中的存活可通过利用各种扫描技术来确定，例如计算机化轴向断层检查(CAT或CT)扫描、磁共振成像(MRI)或正电子发射断层成像术(PET)扫描。移植物存活的确定也可通过死后取出靶组织，并通过肉眼或通过一个显微镜来检查而完成。可替换地，这些细胞可利用特异于特定种系细胞染剂来处理。移植的细胞也可通过提前并入示踪性染料如罗丹明或荧光素标记的微球体、快蓝(fast blue)、二苯甲酰胺、含铁微粒或遗传性导入报道子基因产物如β-牛乳糖或β-葡糖醛酸糖苷酶来而加以鉴定。

移植的MPC或其衍生后代功能性整合至受治者可通过检查被损伤或病态的功能的恢复而进行评估，例如关节或骨功能的恢复或功能的加强。

本发明的细胞组合物可以包括一种或多种生物活性因子，例如但不限于生长因子、分化诱导因子、细胞存活因子如胱冬酶抑制剂、抗炎剂如p38激酶抑制剂或血管生成因子如VEGF或bFGF。生物活性因子的一些实例包括PDGF-bb、EGF、bFGF、IGF-1和LIF。

可替换地，待移植的MPC或其衍生后代可以经过遗传改造，以表达这些生长因子、抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎剂或血管生成因子。

本发明的药物组合物可以包含MPC或其衍生后代的同源或异源种群、胞外基质或其细胞溶解产物或在药用载体中的条件培养基。用于本发明细胞的药用载体包括合适的有机或无机载体物质，其不会与本发明的细胞或其组合物或组分有害地反应。在它们是生物相容性的程度上，合适的药用载体包括水、盐溶液(如林格氏溶液)、乙醇、油、明胶和碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷。这样的制剂可被消毒杀菌，如果需要，其可与辅助试剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂和着色剂一起进行混合。适合用于本发明中的药用载体在本领域是已知的，且在例如Pharmaceutical Sciences(17.sup.th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.)和WO 96/05309中有描述，其每一个的内容均结合于此作为参考。

可将一种或多种其它组分添加到移植的细胞中，包括所选的胞外基质组分，如本领域已知的一种或多种类型的胶原、和/或生长因子、富血小板血浆以及药物。可替换地，本发明的细胞可经遗传改造以表达和产生生长因子。本文中提供了关于本发明细胞的遗传改造的详细内容。

在一个非限制性具体实施方式中，制备包含本发明细胞的制剂，用于直接给予至需要新组织如骨组织产生的部位。例如，但不限制地，该MPC或其衍生后代可被悬浮在一种用于注射的水凝胶溶液中。用于本发明的合适水凝胶的实例包括自组装肽如RAD16。可替换地，含有这些细胞的水凝胶溶液植入前可允许固化，例如在一个模具中形成细胞分散于其中的一种基质。或者，一旦该基质已被固化，则该细胞制备物可以被培养，以使这些细胞在植入前经有丝分裂而扩增。该水凝胶是一种有机聚合物(天然的或合成的)，其通过共价键、离子键或氢键交联产生三维开放的晶格结构，其捕获水分子而形成凝胶。可用来形成凝胶的材料的实例包括离子交联的多糖(如藻酸盐)及其盐、肽、聚磷嗪和聚丙烯酸酯，或者嵌段聚合物如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分别通过温度或pH进行交联。在一些具体实施方式中，MPC或其衍生后代的支撑物是生物可降解的。

在本发明的一些具体实施方式中，制剂包含一种可原位聚合的凝胶，例如美国专利申请公开2002/0022676；Anseth et al.，J.ControlRelease，78(1-3)：199-209(2002)；Wang et al.，Biomaterials，24(22)：3969-80(2003)中所描述的。

在一些具体实施方式中，该聚合物在含水溶液如水、缓冲盐溶液或水-乙醇溶液中至少部分可溶，所述溶液具有带电侧基或其单价离子盐。带有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物实例是聚(膦腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，如磺酸化聚苯乙烯。也可以使用通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基、磺酸基、卤化的(优选氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基。

带有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物实例是聚(乙烯胺)、聚(乙烯吡啶)、聚(乙烯咪唑)以及一些亚胺基取代的聚磷腈。该聚合物的铵盐或季盐也可由主链氮或侧链亚氨基形成。碱性侧基的实例是氨基和亚氨基。

室温下，藻酸盐可在水中与二价阳离子进行离子交联，形成一种水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已成为用于杂交瘤细胞囊化最通用的聚合物，例如在Lim的第4,352,883号美国专利中描述的。在该Lim工艺中，包含待封装生物材料的含水溶液被悬浮于水溶性聚合物的溶液中，所述悬浮液形成微滴，其通过接触多价阳离子而被配制成分散的微胶囊，然后该微胶囊的表面用多氨基酸进行交联，而在囊化的材料周围形成半透膜。

聚膦腈是其主链由交替单键和双键分隔的氮和磷构成的聚合物。每一个磷原子共价键合至两条侧链。

适合于交联的聚膦腈其大部分的侧链基团是酸性的并且能够与二价或三价阳离子形成盐桥。优选的酸性侧基的实例是羧酸基和磺酸基。水解稳定的聚膦腈由具有羧酸侧基(其通过二价或三价阳离子如Ca²⁺或Al³⁺进行交联)的单体形成。通过并入具有咪唑、氨基酸酯或丙三醇侧基的单体可合成通过水解作用而降解的聚合物。例如，一种聚阴离子的聚(双(羧酸根苯氧基))膦腈(PCPP)可以被合成，其可于室温或低于室温下在含水介质中与溶解的多价阳离子进行交联，以形成水凝胶基质。

生物可降解的聚膦腈具有至少两种不同类型的侧链：能够与多价阳离子形成盐桥的酸性侧基以及在体内条件下可水解的侧基，例如咪唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。

侧链的水解导致聚合物的腐蚀。水解性侧链的实例是未取代和取代的咪唑以及氨基酸酯，其中该基团通过一个氨基键结合于磷原子(其中两个R基团以这种方式连接的膦腈聚合物被称为聚氨基膦腈)。对于聚咪唑膦腈，在聚膦腈主链上的“R”基团的一部分是咪唑环，通过一个环氮原子连接于主链中的磷。其它“R”基团可以是不参与水解的有机残基，如甲基苯氧基基团或其它在Allcock et al.，Macromolecule 10：824(1977)的科学论文中示出的基团。该水凝胶材料的合成方法以及用于制备这样的水凝胶的方法在本领域中是已知的。

制剂中也可包括其它组分，包括但不限于下列组分中的任何一种：(1)用来提供适当pH和等渗压性的缓冲剂；(2)润滑剂；(3)用来在给予部位或附近保持该细胞的粘性材料，包括例如藻酸盐、琼脂和植物胶；以及(4)可以在给予部位处产生预期效应的其它细胞类型，例如组织或其物化特性形成的增强或修饰，或者作为用于细胞生存的支撑物，或者抑制炎症或排斥。这些细胞可以用一种适当的创面覆盖物加以覆盖以防止细胞离开该部位。这样的创面覆盖物对于本领域技术人员是已知的。

骨组织补片的配制

MPC或其衍生后代在预成型孔中的培养或共培养使得能够制造预定厚度和体积的组织补片。所得组织补片的体积取决于孔的体积和该孔中MPC或其衍生后代的数量。最佳预定体积的组织可通过改变前述参数中的一个或两个而以常规实验进行制备。

孔的细胞接触表面可以涂覆一种阻碍MPC或其衍生后代粘附至该细胞接触表面的分子。优选的涂覆剂包括硅基试剂，即二氯二甲基硅烷，或聚四氟乙烯基试剂，即TEFLON。用于将材料涂覆硅基试剂，特别是二氯二甲基硅烷的流程步骤在本领域是熟知的。参见，例如Sambrook et al.(1989)″Molecular Cloning A LaboratoryManual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，其内容结合于此作为参考。应当理解，阻止细胞连接于孔表面的其它生物相容性试剂在本发明的实践中可能很有用。

可替换地，该孔可由一种柔韧性或可塑性生物相容材料(其本身不允许细胞连接)铸成。阻止这种细胞连接的优选材料包括但不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养塑料和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未处理的细胞培养塑料，即还没有用具有静电荷的材料处理或由其制成的塑料是商业上可获得的，并且可从例如FalconLabware，Becton-Dickinson，Lincoln Park，N.J.购得。然而，前述材料不用于限制的目的。应当理解，本身可阻止MPC或其衍生后代连接的任何其它柔韧性或可塑性生物相容材料在本发明的实践中可能很有用。

悬浮液中的MPC或其衍生后代可以接种到预成型孔中并进行培养。MPC或其衍生后代可以在该孔的培养基中被诱导分化成成软骨或成骨表型，或可能在接种到孔中之前已被诱导分化。可通过加入培养基而将细胞稀释到细胞密度为约1x10⁵至1x10⁹个细胞/毫升。

这些细胞可以形成一种细胞的内聚塞(cohesive plug)。所述细胞内聚塞可以从该孔移出，经手术植入组织缺损中。预期未分化的MPC或其衍生后代可以原位分化，从而在体内形成组织。

骨缺损可以通过利用计算机辅助层析成像(CAT扫描)、X射线检查、磁共振成像(MRI)、滑液或血清标记物的分析，或通过本领域已知的任何其它工艺步骤而进行推理鉴定。哺乳动物中的缺损在关节镜检查或开放性手术过程中也易于肉眼鉴定。该缺损的治疗可利用本文中披露的方法和组合物在关节镜检查或开放性手术过程中实现。

因此，一旦该缺损被鉴定，则该缺损可通过以下步骤进行治疗：(1)在预定部位植入利用本文所述方法制备的组织补片，以及(2)允许该组织补片整合入预定部位处。

该组织补片具有的最适大小和形状可使得当该补片被植入所述缺损中时，植入的组织的边缘直接接触该缺损的边缘。另外，可在手术过程中将该组织补片固定于适当位置。这可以通过手术将该补片利用生物可降解的缝固定入所述缺损中和/或通过将生物粘合剂施加于该补片和缺损的分界区域而实现。

在某些情况下，损伤的组织可以在该组织补片植入前手术切除。

利用支架移植MPC或其衍生后代

本发明的细胞组合物或其共培养物可以接种到一个三维支架上或其内部并植入体内，其中接种的细胞将在该框架上增生并与受治者的细胞共同在体内形成置换组织，如骨组织。

例如但不是限制地，该支架可以被设计，以使该支架结构：(1)在没有后续降解的情况下支撑接种的细胞；(2)从接种直至该组织移植物由宿主组织重建的时间内支撑这些细胞；(3)允许接种的细胞连接、增生、并在体外发育成具有足够机械整体性以支撑其自身的组织结构，此时该支架被降解。支架设计的综述提供于Hutmacher，J.Biomat.Sci.Polymer Edn.，12(1)：107-124(2001)中。

本发明的支架可联合任意一种或多种生长因子、细胞(例如，干细胞，骨髓细胞，软骨细胞，成软骨细胞，骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，骨衬细胞，或它们的前体)、药物或上述的刺激组织形成或其它方式增强或改进本发明实践的其它组分一起给予。待接种于该支架上的MPC或其衍生后代可进行遗传改造以表达生长因子或药物。

本发明的细胞可用来在体外产生新的组织，其随后可被植入、移植或以其它方式插入受治者需要组织修复、置换或加强的部位。

在一个非限制性具体实施方式中，本发明的细胞用来在体外产生三维组织构建体，其随后植入体内。作为产生三维组织构建体的一个实例，参见美国专利第4,963,489号，其内容结合于此作为参考。例如，本发明的细胞可“接种”到一个三维框架或支架上，并在体外增生或生长，以形成可植入体内的活组织。

本发明的细胞可在培养皿内自由生长至亚融合或融合，从培养基转移接种于三维框架上。利用高浓度细胞(例如，约10⁶至5x10⁷个细胞/毫升)接种该三维框架将实现在相对较短的时间周期内建立三维支撑物。

可用于本发明的支架实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以是例如利用由合成的乙醇酸和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)构成的纤维形成，该共聚物以商标名VICRYL出售。由例如利用诸如冷冻干燥或冻干过程(如在美国专利第6,355,699中论述的)形成的聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物构成的泡沫也是可能的支架。也可以使用诸如自组装肽(例如，RAD16)的水凝胶。这些材料经常用作用于组织生长的支撑物。

三维框架可由陶瓷材料制成，其包括但不限于：磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、磷酸α三钙、磷酸β三钙和磷酸四钙；羟磷灰石；氟磷灰石；硫酸钙；氟化钙；氧化钙；碳酸钙；磷酸钙镁；生物学活性玻璃如BIOGLASS(University of Florida，Gainesville，Fla.)及其混合物。目前在市场上存在多种合适的多孔生物相容性陶瓷材料，如SURGIBON(Unilab Surgibone，Inc.，Canada)、ENDOBON(Merck Biomaterial France，France)、CEROS(Mathys，A.G.，Bettlach，Switzerland)和INTERPORE(Interpore，Irvine，Calif.，United States)，以及矿化胶原骨嫁接产品，如HEALOS(Orquest，Inc.，MountainView，Calif.)和VITOSS，RHAKOSS，以及CORTOSS(Orthovita，Malvem，Pa.)。该框架可以是天然和/或合成材料的混合物、掺合物或复合物。在一些具体实施方式中，该支架为笼子形式。在一个优选具体实施方式中，该支架涂覆有胶原。

根据一个优选的具体实施方式，该框架是毡制品，其可由多纤维丝(复丝)构成，而该多纤维丝由生物可吸收材料，例如PGA、PLA、PCL共聚物或掺合物或透明质酸制成。该纤维丝利用标准的织物加工技术(包括卷边、剪切、梳理和缝制)制成毡制品。

在另一个优选的具体实施方式中，本发明的细胞被接种于可以为复合结构的泡沫支架上。另外，该三维框架可以被模制成有用的形状，如为耳朵外部、骨、关节或体内待修复、置换或加强的特定结构的形状。

在另一个优选的具体实施方式中，这些细胞被接种到构成用于植入患者体内的假体装置的框架上，如描述于第6,200,606号美国专利中的，其内容并入本文作为参考。如其中所描述的，多种临床有用的假体装置已被开发用于骨和软骨嫁接手术。(参见例如，Bone Grafts and Bone Substitutions.Ed.M.B.Habal & A.H.Reddi，W.B.Saunders Co.，1992)。例如，有效的膝关节和髋关节置换装置已被且将持续广泛用于临床环境中。许多这些装置是利用各种具有较低免疫原活性的无机材料制造的，其在体内安全地发挥作用。已经过试验证实的合成材料的实例包括钛合金、磷酸钙、陶瓷羟磷灰石以及各种不锈钢和钴-铬合金。这些材料提供结构支撑并且可形成宿主血管形成和细胞迁移可在其内部发生的支架。

该框架可以在接种本发明的细胞之前加以处理以便增强细胞连接。例如，在用本发明的细胞接种之前，尼龙基质可用0.1摩尔乙酸加以处理并在多聚赖氨酸、PBS和/或胶原中孵育以涂覆该尼龙基质。聚苯乙烯可利用硫酸类似地加以处理。

另外，该三维框架的外部表面可加以修饰以改善细胞的连接或生长以及组织分化，如通过等离子喷涂的框架或加入一种或多种蛋白质(例如，胶原，弹力纤维，网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素，4-硫酸软骨素，6-硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸角质素)、细胞基质和/或其它材料如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶，等等。

在一些具体实施方式中，该支架由可使其为非血栓形成性的材料构成或用该材料进行处理。这些处理和材料也可促进并维持内皮生长、迁移和胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料如基膜蛋白如层粘连蛋白和IV型胶原，合成材料如ePTFE，以及分段的聚氨酯脲硅酮如PURSPAN(The PolymerTechnology Group，Inc.，Berkeley，Calif.)。这些材料可进一步加以处理以使该支架为非血栓形成性的，这些处理包括抗血栓形成剂如肝素，以及改变该材料表面电荷的处理如等离子喷涂。

在一些具体实施方式中，支架的表面是粗糙的。例如，在本发明的某些方面，所提供的支架带有一种凹槽和山脊纹型。该凹槽优选小于约500微米，更优选小于约100微米，并且最优选在约10纳米与10微米之间。这样的“微槽”允许细胞可以根据表面凹槽的引导进行排列和/或迁移。

在一些具体实施方式中，在培养基中再造体内存在的细胞微环境很重要，以使本发明的细胞在植入体内或体外应用之前的生长程度可以变化。另外，可以在这些细胞接种之前、过程中或之后将生长因子、软骨形成分化诱导剂、成骨诱导剂以及血管形成因子加入培养基中，以引发利用MPC或其衍生后代或其共培养物的分化和组织形成。

该三维框架可以被修饰以使细胞的生长和其上的组织产生增强，或使得对植入物的排斥减弱。因此，可以将一种或多种生物学活性化合物(包括但不限于抗炎剂、免疫抑制剂或生长因子)添加到该框架。

胞外基质或细胞溶解产物的治疗应用

作为本发明植入这些细胞或其产生的活组织的可替换方案，需要组织修复、置换或加强的受治者可获益于MPC或其衍生后代的组分或产物的给予(尤其是在它们已经过遗传修饰的情况下)，如由这些细胞产生的胞外基质(ECM)或细胞溶解产物。

在一些具体实施方式中，本发明的细胞已在体外培养后，例如通过利用本文描述的三维支架系统，使得希望量的ECM分泌到该框架上。一旦ECM分泌到该框架上，即可移出这些细胞。ECM可以进一步处理以备后用，例如作为一种可注射的制剂。

在一些具体实施方式中，这些细胞被杀死并且将细胞碎片(例如，细胞膜)从该框架移出。这个过程可以多种不同方式实施。例如，活组织可在没有低温保存剂(低温防腐剂)时在液氮中被闪冻，或者该组织可被浸入无菌蒸馏水中，以使这些细胞响应于渗透压而破裂。一旦这些细胞被杀死，则细胞膜可被破坏并且通过用温和去垢剂漂洗(如EDTA、CHAPS或两性离子去垢剂)处理而移出细胞碎片。利用温和去垢剂漂洗的优点在于其溶解膜结合的蛋白(其经常是高度抗原性的)。

可替换地，该组织可被酶促消化和/或用破碎细胞膜的试剂进行提取。这种酶的实例包括但不限于透明质酸酶、分散酶(中性蛋白酶)、蛋白酶、核酸酶(例如，脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)。去垢剂的实例包括非离子去垢剂例如烷基芳基聚醚醇(TRITON^TMX-100)，辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas Philadelphia，Pa.)，BRIJ-35，聚乙氧基乙醇月桂酰醚(Atlas Chemical Co.，SanDiego，Calif.)，聚山梨酸酯20(TWEEN 20^TM)，聚乙氧基乙醇山梨聚糖单月桂酸酯(Rohm and Haas)，聚乙烯月桂酰醚(Rohm andHaas)；以及离子去垢剂例如十二烷基硫酸钠，硫酸化高级脂肪醇，在支化或未支化链中含有7至22个碳原子的磺酸化烷烃和磺酸化烷基芳烃。

包含ECM的支架可以如上所述在治疗上使用。可替换地，ECM可从该支架收集。ECM的收集可以以多种方式来实现，取决于例如该支架为生物可降解的还是非生物可降解的。例如，如果该框架为非生物可降解的，则ECM可通过使该框架经受声波降解、高压水射流、机械刮取或者用去垢剂或酶的温和处理或上述处理的任意组合而移出。

如果该框架是生物可降解的，则ECM可通过例如使该框架在溶液中降解或溶解而收集。可替换地，如果该生物可降解框架由一种其自身可与ECM一起注射的材料构成，则该框架和ECM可全部加工用于随后的注射。可替换地，ECM可通过用于从非生物可降解框架收集ECM的上述方法中的任何一种从该生物可降解框架移出。优选地，所有收集工艺加以设计，以便不会使由本发明的细胞所产生的ECM或细胞溶解产物变性。

现在，将参考以下非限制性实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述。

实施例

材料和方法

受治者和细胞培养

按照由南澳大利亚皇家阿德莱德医院的伦理委员会批准的方法步骤，在知情同意后，骨髓(BM)吸出物获自健康成人志愿者(19-35岁)的后髂嵴。如前所述制备骨髓单核细胞(BMMNC)(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)。原代BMSSC培养物如前所述在补充了20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μML-抗坏血酸-2-磷酸盐的α-MEM(最小必需培养基)中建立(Gronthoset al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)。如下所述，在血清充足的培养基中传代培养后，BMSSC克隆细胞系通过从第14天的集落(来源于STRO-1^bri/VCAM-1⁺分选的细胞)的限制性稀释而形成，用于增生、RT-PCR、免疫组织化学和发育研究。

磁激活的细胞分选(MACS)

这一步可如前所述而实施(Gronthos et al.，Isolation，Purificationand In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal PrecursorCells.In Marrow Stromal Cell Culture.Owen M.and Beresford J.N.(eds).Cambridge University Press UK，Chapter 3，p.26-42，1998；Gronthos and Simmons，Blood 85(4)：929-940，1995)。简而言之，按照制造商的说明，在Mini MACS磁性柱(Miltenyi Biotec Inc.，Aubum，CA)上被分开之前，将约1-3x10⁸个正常人骨髓单核细胞依次用STRO-1上清液、抗-IgM-生物素、抗生蛋白链菌素微珠和最后的抗生蛋白链菌素FITC(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)进行孵育。

荧光激活的细胞分选(FACS)

将STRO-1+MACS分离的细胞用轭合抗生蛋白链菌素的FITC进行标记，然后在冰上利用纯化的抗-CD106(VCAM-1)抗体6G10或抗-CD146(MUC-18)抗体或同型对照1B5(10μg/ml)孵育30分钟，洗涤并在冰上用轭合藻红蛋白(PE)的羊抗-鼠IgG抗体(1/50；Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)再孵育20分钟。利用一种FACStar^PLUS流式细胞仪(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)来分选细胞。将STRO-1^bri/CD106⁺或STRO-1^bri/CD146⁺细胞在在补充了20％胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM)的α-MEM中进行培养，于含5％CO₂、37℃湿润大气环境下启动原代培养。

利用间接免疫荧光的双色流式细胞计数分析

该方法之前已经报道过了(Gronthos et al.，Isolation，Purificationand In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal PrecursorCells.In Marrow Stromal Cell Culture.Owen M.and Beresford J.N.(eds).Cambridge University Press UK，Chapter 3，p.26-42，1998)。简而言之，MPC或MPC衍生细胞的原始培养物通过胰蛋白酶/EDTA消化而释放，然后在冰上孵育30分钟。将约2x10⁵个细胞洗涤，然后再悬浮于200μl的第一抗体(一抗)混合物中，置于冰上1小时。每一管的第一抗体(一抗)混合物均由饱和浓度的小鼠IgM单克隆抗体STRO-1和小鼠IgG单克隆抗体或兔IgG构成(表1)。为了用可与胞内抗原反应的抗体进行染色，染色之前这些细胞首先用PBS洗涤，然后在冰上用70％乙醇处理10分钟使其透化，随后进行洗涤。将小鼠同型IgM和IgG阴性对照Mab在相同条件下进行处理。在用第一抗体(一抗)孵育后，将这些细胞进行洗涤并暴露于最终体积为100μl的饱和水平的羊抗-小鼠IgMμ-链特异性FITC(1/50稀释)和羊抗-小鼠IgGγ-特异性PE(1/50稀释)或抗-兔Ig-特异性PE(1/50稀释)(Southern Biotechnology Associates)。将这些细胞在冰上孵育45min，然后洗涤两次，接着在FAX FIX(补充了1％(v/v)、2％(w/v)D-葡萄糖、0.01％叠氮化钠的PBS)中固定。然后将这些细胞在

流式细胞仪(BeckmanCoulter，Hialeah，FL)上进行分析。

羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记

细胞通透性荧光素基染料CFSE用来研究在MPC衍生细胞发育过程中分裂相关的表型和功能变化。CFSE共价结合于细胞的胞质组分，得到均匀的明亮荧光，其随细胞分裂而均等地分布于子细胞之间。利用流式细胞仪该技术可得到高达8个细胞分裂周期的分辨率。将体外扩增的MPC衍生细胞的单细胞悬浮液洗涤一次，再悬浮在1ml的PBS/0.1％BSA中，加入2μl的5mM CFSE(终浓度10μM)，然后在37℃孵育10min。通过加入5体积的冰冷培养基α-MEM-10使染色淬火，并在冰上孵育5min。将这些细胞在培养基中洗涤三次，然后以低密度1x10⁵铺在培养瓶(T-25)中。在各个时间点，通过胰蛋白酶-EDTA分离细胞并利用流式细胞计数分析而进行分析。

逆转录酶聚合物酶链式反应(RT-PCR)分析

原代MPC衍生培养物如上所述通过胰蛋白酶/EDTA处理而释放，然后用STRO-1上清液染色。洗涤后，将细胞用轭合藻红蛋白的羊抗-小鼠IgM抗体(1/50；Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)在冰上再孵育20分钟。利用FACStar^PLUs流式细胞仪(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)来分选细胞。根据制造商的建议，总细胞RNA从2x10⁶个STRO-1^bri或STRO-1^dim分选的原代细胞、软骨细胞团以及其它的诱导培养物制备，并利用RNAzolB提取方法(Biotecx Lab.Inc.，Houston，TX)使其溶解。然后将从每一个亚群分离的RNA用作cDNA合成的模板，而cDNA利用一种First-strand cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)制备。各种转录体的表达利用以前描述的一种标准流程(Gronthos etal.，J.Bone and Min.Res.14：48-57，1999)，通过PCR扩增进行评估。在本研究中使用的引物对示于表2。扩增后，将每一反应混合物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析并通过溴化乙锭染色使其可视化。RNA完整性通过GAPDH的表达来评估。

体外CFU-F的分化

我们之前已报道了用于诱导在补充了10％FCS、100μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐、地塞米松10^-7M和3mM无机磷酸盐的α-MEM中培养的人BM基质细胞在体外形成矿化骨基质的条件(Gronthos etal.，Blood.84：4164-4173，1994)。矿物沉淀通过阳性von Kossa染色进行鉴定。脂肪形成如前所述在0.5mM甲基异丁基甲基黄嘌呤、0.5μM氢化可的松和60Mm吲哚美辛存在的情况下进行诱导(Gimble，J.M.Marrow stromal adipocytes.In Marrow stromal cellculture.Owen M.and Beresford J.N.(eds).Cambridge：CambridgeUniversity Press UK.Chapter 5，p.67-87，1998)。油红O染色用来鉴定充满脂质的脂肪细胞。软骨形成分化如前所述在用10ng/mlTGF-β3处理的聚集培养物中加以评估(Pittenger et al.，Science，284：143-147，1999)。

骨形成的体内分析

将来源于代龄2-3的STRO-1^bri/VCAM-1⁺细胞的粘附细胞胰蛋白酶化，与40mg羟磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒(Zimmer Corporation，Warsaw，IN)进行混合，然后如前所述植入两月龄SCID小鼠的背侧皮下间隙中(Gronthos et al.，Proceedings of the National Academyof Sciences(USA)，97(25)：13625-13630，2000)。这些方法步骤依据一个批准的动物方案来实施(Adelaide University AEC#M/079/94)。将植入物在6-8周后取回，在4％多聚甲醛中固定2天，随后在10％EDTA中再脱钙10天，然后包埋入石蜡。为了组织学分析，制备该植入物的5μm切片并用苏木精和伊红进行染色(Gronthos et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)，97(25)：13625-13630，2000)。

神经组织发育。将单层培养物在成神经细胞A培养基(Ivitrogen/GIBCO+5％马血清，1％胎牛血清，L-谷氨酰胺(2mM)，转铁蛋白(100μg/ml)，胰岛素(2μg/ml)，维甲酸0.5mM，脑衍生的神经营养因子(10ng/ml))中进行生长。

脂肪发育。将单层培养物在补充了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM)、0.5mM甲基异丁基黄嘌呤、0.5mM氢化可的松、60mM吲哚美辛的α-MEM(JRH)中进行培养。

软骨发育。将在聚丙烯管中的颗粒培养物在补充了1％牛血清白蛋白、转铁蛋白(100μg/ml)、胰岛素(2μg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM/ml)、地塞米松(10^-8M)和BMP-7(50ng/ml)、TGFβ₃(10ng/ml)的α-MEM中进行培养。

骨骼肌和心肌发育。将单层培养物在补充了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺(2mM)、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM/ml)以及5-氮胞苷(5μM/ml)的α-MEM(JRH)中进行培养。

上皮发育。将单层培养物在补充了牛垂体提取物(50μg/ml)、表皮生长因子(10ng/ml)、氢化可的松(0.5μg/ml)、胰岛素(5μg/ml)的角化细胞基本培养基中进行培养。

成骨细胞、肌腱、韧带或成牙质细胞发育。将单层培养物在补充了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM)、地塞米松(10^-7M)和BMP-2(50ng/ml)的α-MEM(JRH)中进行培养。

周细胞或平滑肌细胞发育。将20,000个体外培养的MPC/孔的培养物在补充了10％胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗坏血酸-2-磷酸盐(100μM)、血小板源生长因子-BB(10ng/ml)(悬浮于48孔板的2001的基质胶(matrigel)中)的α-MEM(JRH)中进行培养。第一抗体(一抗)

用于本研究的第一抗体(一抗)如下：STRO-1(小鼠IgM[免疫球蛋白M])(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)、抗-人碱性磷酸酶抗体(B4-78，小鼠IgG1；Hybridoma Studies Bank，University of Iowa，Ames)、抗-人CXCR4抗体(小鼠IgG2b；Chemicon International，Temecula，CA)以及抗-人膜联蛋白V抗体(小鼠IgG1；Chemicon)，分布作为1∶稀释的组织上清液或作为纯化的免疫球蛋白10μg/ml而使用。用于本研究中匹配的同型对照小鼠单克隆抗体包括1A6.12(IgM)、1B5(IgG1)和1A6.11(IgG2b)(由Prof L.K.Ashman惠赠，University of Newcastle，NSW，Australia)。

BMSSC的纯化

这基本上如前所述来实施(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003；Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995)。简而言之，根据制造商的建议，将约1至3x10⁸个成熟人BMM NC用封闭缓冲液(blocking buffer)(补充了1％人血清、1％牛血清白蛋白和5％胎牛血清的Hanks平衡盐溶液[HBSS])孵育，然后在Mini磁激活的细胞分选(MACS)磁性柱(Miltenyi Biotec)上被分开之前，依次用STRO-1上清液、抗-IgM-生物素、抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec，Aubum，CA)以及最后的抗生蛋白链菌素荧光素异硫氰酸酯(FITC；Caltag Laboratories，Burlingame，CA)进行孵育。接下来根据其高(STRO-1亮)或低(STRO-1暗)表达STRO-1，将MACS-分离的STRO-1+骨髓单核细胞利用FACStar流式细胞仪(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)进行分选(图1A)。

STRO-1/碱性磷酸酶BMSSC亚群的分离

如在Gronthos et al.，J Bone Miner Res.14：47-56，1999中所述，将人BMSSC的继代培养物通过胰蛋白酶/EDTA(乙二胺四乙酸)消化制成单细胞悬浮液，然后用鉴定STRO-1的抗体和骨相关抗原碱性磷酸酶(AP)B4-78进行孵育。将大约2x10⁷个细胞用与STRO-1反应和碱性磷酸酶(B4-78)的抗体于冰上孵育1小时。重复管用对应的单色和阴性对照抗体进行孵育。洗涤后，将样品用作为二级检测试剂的羊抗-小鼠IgG1-FITC和IgM-PE(藻红蛋白)抗体(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)在冰上孵育45分钟。洗涤后，根据该4个STRO-1/AP BMSSC亚群，随后利用FACStar流式细胞仪(Becton Dickinson)将细胞通过两次分选进行分选以纯化(Gronthos et al.，J Bone Miner Res.14：47-56，1999；Panet al.，Bone 34(1)：112-23，2004；and Atkins et al.，J Bone Miner Res.18(6)：1088-98，2003)。

钙流量测定

胰蛋白酶分离的继代BMSSC培养物的单细胞悬浮液在补充了1％胎牛需求(FCS)和1.25mM CaCl₂的HBSS中再悬浮为1x10⁶个细胞/ml的浓度。将这些细胞用2μM fura-2-AM(fura-2乙酸甲酯；分子探针，Eugene，OR)于37℃孵育30分钟。过量的fura-2-AM通过两次洗涤细胞而去除，并将这些细胞再悬浮于2mL含有1％FCS和1.25mM CaCl₂的HBSS中，至浓度为1x10⁶个细胞/mL。[Ca2+]_i利用分光荧光计(LS55荧光分光计；Perkin Elmer，Boston，MA)通过340和380nm交替激发和510nm处的荧光发射而进行检测。在建立[Ca2+]_i的基线水平后，将细胞用30ng/mL SDF-1α处理。当获得[Ca2+]_i响应于SDF-1α的稳定峰值时，用0.1mM洋地黄皂苷使BMSSC透化，并且加入乙二醇四乙酸(EGTA)至终浓度5mM。利用如前所述的标定公式(Grynkiewicz et al.，J Biol Chem.260：3440-3450，1985)，洋地黄皂苷和EGTA测量值用来相对于每一样品中的Fura-2-AM荧光而标定[Ca2+]_i。

集落效价测定

如前所述，集落形成的测定利用MACS/FACS分离的STRO-1^亮BMMNC，然后在无血清条件下以5x10⁴/孔的密度铺于24孔板中来实施(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003；Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995)。将细胞在不同细胞因子组合存在的情况下进行铺放。用于本研究的生长因子包括α-干扰素2a(30 000 IU/mL；F Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)、血小板源生长因子-BB(5ng/ml)、白介素-4(30ng/ml)和基质细胞衍生因子-1(30ng/mL；CytoLab/PeproTech，Rehovot，Israel)。将培养物在第14天终止，并在用0.1％(wt/vol)甲苯胺蓝/1％多聚甲醛染色后进行CFU-F计数。多于50个细胞的聚集体划分为CFU-F衍生的集落。

流式细胞计数分析

BMSSC培养物通过胰蛋白酶/EDTA消化，然后在封闭缓冲液中再悬浮30分钟而制备。然后将单细胞悬浮液用浓度10μg/mL的抗-CXCR4抗体或1A6.11在冰上孵育1小时。类似地，高表达SDF-1的BMSSC和载体对照细胞系通过胰蛋白酶/EDTA处理、封闭、然后用抗-膜联蛋白V抗体或同型匹配的对照抗体1D4.5进行孵育而制备。洗涤后，将细胞用二次检测试剂即羊抗-小鼠IgG1-或IgG2b-FITC-轭合的抗体(1/50；Southern Biotechnology Associates)在冰上孵育45分钟。洗涤后，样品利用Epics-XL-MCL流式细胞仪(Beckman Coulter，Hialeah，FL)进行分析。

RT-PCR分析

利用RNA STAT-60系统(TEL-TEST，FriendsWood，TX)，总RNA从2x10⁴个STRO-1^亮-、STRO-1^暗-和STRO-1^阴性-分选的骨髓单核细胞、培养的BMSSC STRO-1/碱性磷酸酶分选的亚群或人骨肉瘤细胞系MG63制备。然后将从每个亚群分离的总RNA用作cDNA合成的模板，利用第一链(first-strand)cDNA合成试剂盒来制备(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。各种转录体的表达利用之前描述的一个标准方案而通过PCR扩增进行评估。用于本研究中的5对引物如下：SDF-1(正向，5′-gacccgcgctcgtccgcc-3′；反向，5′-gctggactcctactgtaaggg-3′)；CXCR4(正向，5′-tctggagaaccagcggttac-3′；反向，5′-gacgccaacatagaccacct-3′)；GAPDH(正向，5′-catggagaaggctggggctc-3′；反向，5′-cactgacacgttggcagtgg-3′)。扩增的产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来分析并通过溴化乙锭染色使其可视化。转录体丰度的半定量分析利用ImageQant软件(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)相对于GAPDH表达而加以评估。

转导BMSSC株系的生成

逆转录病毒表达构建体用编码全长人SDF-1cDNA的逆转录酶病毒载体pLNCX2(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)来生成，其中全长人SDF-1 cDNA 利用PCR 正向(5′-aataactcgagacccgcgctcgtccgcc-3′)和反向(5′-aattaagcggccgctggactcctactgtaaggg-3′)引物对(加下划线的)扩增，分别用XhoI和NotI(黑体)限制位点加以构建。利用Fugene-6-试剂(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)，用含SDF-1的构建体或仅用pLNCX2载体转染包装细胞系PT67，然后用800μg/mL G418进行筛选(Sigma，Castle Hill，NSW，Australia)。从稳定PT67株系收集的含感染颗粒的上清液用来在5μg/mL polybrene(Sigma)存在的情况下转导培养的BMSSC。用800μg/mL G418筛选后，建立表达高水平SDF-1α的稳定多集落衍生的BMSSC和对照细胞系。根据制造商说明(R&D Systems，Minneapolis，MN)，利用标准SDF-1酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，从通过0.2μm滤器过滤的上清液测量分泌的SDF-1α浓度。

BMSSC cDNA差减杂交文库的构建

在最初研究中，通过如在“BMSSC纯化”中所描述的MACS/FACS方法步骤分离表达STRO-1暗的骨髓细胞(血型糖蛋白-A+有核红细胞)和表达STRO-1亮的细胞(CFU-F种群)。利用RNA STAT-60系统，总RNA制备自(TEL-TEST)从5个不同骨髓样品(2男和3女，年龄19-32岁)集合的STRO-1亮和STRO-1暗细胞。第一链合成利用SMART cDNA合成试剂盒(ClontechLaboratories)来实施。根据制造商的说明，得到的mRNA/单链cDNA杂合体，利用在起始RT过程中形成于3’和5’端的特异性引物位点，通过长距离PCR(Advantage 2 PCR kit；Clontech)进行扩增。在用RsaI消化STRO-1亮cDNA后，2个等分试样利用ClontechPCR-Select cDNA Subtraction Kit来连接不同的特异性连接寡核苷酸。根据制造商的流程，利用STRO-1亮(tester，检测方)和STRO-1暗(driver，驱动方)cDNA实施两轮差减杂交，反之亦然。该方法步骤也利用STRO-1暗tester cDNA对STRO-1亮driver cDNA的杂交来实施。

BMSSC差减文库的差异筛选

为了鉴定通过STRO-1亮BMSSC种群独特表达的基因，将STRO-1亮差减的cDNA连接到T/A克隆载体(AdvaTAge PCRcloning kit；Clontech)中，然后转化到DH5_α大肠杆菌中。根据制造商的说明，200个随机选择的抗氨苄西林的细菌克隆体，利用Clontech PCR-Select Differential Screening Kit通过PCR进行扩增。简而言之，如制造商所建议的，利用BRL Hybri-dot 96孔模式的复合管真空系统，cDNA用来构建重复低密度微阵列过滤器(zeta-probe GT membranes；BioRad，Hercules，CA)。差减的STRO-1亮和差减的STRO-1暗的cDNA于95℃发生变性，然后利用Klenow酶(exo-；5U)，用50μCi(1.85MBq)α-[32P]dCTP(3000 Ci[1.85MBq]/mmol；ICN Radiochemicals，Irvine，CA)于37℃标记40分钟。利用Clontech Express Hyb，将DNA探针杂交于复制过滤器，72℃过夜。将过滤器在68℃用2x标准柠檬酸盐溶液(SSC)/0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤两次并用0.2x SSC/0.5％SDS洗涤两次，然后利用PhosphoImager筛选并利用ImageQuant软件进行分析(Molecular Dynamics)。

体外CFU-F的分化

我们之前已经报道了在体外用于诱导在补充了10％FCS、100μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐、地塞米松10^-7M和3mM无机磷酸盐的αMEM中培养的人BM基质细胞以形成一种矿化骨基质的条件(Gronthos et al.，Blood.84：4164-4173，1994)。

异位骨形成的测定

将来源于2至3代的STRO-1亮分选的骨髓单核细胞的粘附细胞胰蛋白酶化，与40mg羟磷灰石/磷酸三钙陶瓷颗粒进行混合(Zimmer，Warsaw，IN)，然后如前所述植入8周龄非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠背侧皮下空隙中(Gronthos etal.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)。这些方法步骤根据一个批准的动物协议的规定来实施(The University Adelaide AEC no.M29/2002)。8周后将植入物取回，在4％多聚甲醛中固定2天，在10％EDTA中再脱钙10天，然后包埋入石蜡中。将每一个植入物切成2片，然后将切面向下铺放用于石蜡包埋。为了组织学分析，制备该植入物的5-μm切片，并用苏木精和伊红(H&E)进行染色表示长度约3至4mm的每一个植入物的中部及两端。将新骨形成的量计算为12个组织切片中存在的总表面积的百分比。新骨形成的测量值如前所述利用Scion成像软件(Frederick，MD)进行评估(Shiet al.Nat Biotechnol.20：587-591，2002)。

统计

学生t检验如所示用于配对比较。统计显著性在P小于0.05处给出。单向方差分析(ANOVA)如所示用于多重比较。各组之间的统计显著性在P小于0.05时利用Fisher投影最小显著差检验来确定。

实施例1：Stro-1^dim培养细胞是较高定型的而Stro-1^bri细胞是较低定型的前体细胞。

我们之前已报道了，多能间充质前体细胞(MPC)可根据表型STRO-1^bri/VCAM-1(CD106)⁺或STRO-1^bri/MUC-18(CD146)⁺从成人骨髓单核细胞纯化(Gronthos et al.J.Cell Sci 116：1827-1835，2003；Shi and Gronthos JBMR 18(4)：696-704，2003；PCTAU2004/000416)。在特定培养条件下MPC种群易于进行体外扩增(Gronthos et al.J.Cell Sci 116：1827-1835，2003)。我们现在根据与不同细胞种系相关的标记物，分别利用逆转录聚合物酶链反应(RT-PCR)和流式细胞计数分析在mRNA和蛋白质水平提供表征体外扩增的MPC后代的数据。同时，在体外扩增后，所有新鲜分离的骨髓MPC高水平表达STRO-1(Stro-1^bri)，而大多数细胞下调STRO-1表达(Stro-1^dim)(Gronthos et al.J.Cell Sci 116：1827-1835，2003)。在首次系列实验中，采用半定量RT-PCR分析来检查各种由STRO-1^dim或STRO-1^bri种群表达的种系相关基因的基因表达谱，所述种群通过荧光激活细胞分选加以分离(图1A)。每个标记物的相对基因表达参照管家基因GAPDH的表达利用ImageQant软件进行评估(图1B、C)。另外，双色流式细胞计数分析连同STRO-1抗体用来检查体外扩增MPC的蛋白质表达谱，这基于其更宽范围的细胞种系相关标记物的表达(图2)。基于STRO-1^dim和STRO-1^bri培养细胞的基因和蛋白质表达的通用表型概括展示于表3中。该数据表明，体外扩增的STRO-1^bri MPC表现出与血管周细胞相关的标记物(包括血管生成素-1、VCAM-1、SDF-1、IL-1β、TNFα和RANKL)的差异性较高表达。相反地，STRO-1^dim体外扩增细胞表达较高水平的巢蛋白(nestin)、GFAP、osterix(成骨细胞特异基因)、骨钙蛋白、SOX9、GATA-4、瘦素和平滑肌肌球蛋白重链。因此，相比于STRO-1^dim细胞，似乎体外扩增的STRO-1^briMPC表现出一种更不成熟和血管周样表型，STRO-1^dim细胞表现出一种较高定型的前体细胞型(包括成软骨细胞、成骨细胞、成脂肪细胞、表皮细胞、神经祖细胞和成心肌细胞)的表型特性。STRO-1^dim和STRO-1^bri培养细胞的蛋白质和基因表达谱之间的比较总结在表3和表4中。

实施例2：STRO-1^dim和STRO-1^bri培养细胞在体外分化的差异能力

接下来，我们考察了在STRO-1^dim和STRO-1^bri培养细胞的基因和蛋白质表达谱之间观察到的差异是否反映其分化成多种细胞种系的能力方面的任何功能性差异。体外扩增的STRO-1^bri/CD146⁺衍生细胞的培养物如上所述基于其STRO-1抗原表达而通过FACS进行分离。随后FACS分离的STRO-1^dim和STRO-1^bri培养细胞置于用于脂肪(图3)、骨(图4)和软骨(图5)形成的诱导条件下。在所有情形下，相比于STRO-1^dim培养细胞，STRO-1^bri培养细胞在指定条件下，显示出较高的脂肪、骨和软骨形成的能力。来自这些实验的数据证实了以上获得的基因和蛋白表达结果，表明STRO-1bri培养细胞是一种含有高比例较低定型的前体细胞的原始种群，其可被影响以在适当培养条件下朝向任何特定细胞种系分化(图3、4、5)，并且可以称为MPC。相反，STRO-1^dim培养细胞含有高比例的代表各种种系的定型细胞并且可以称为TSCC。人们提出STRO-1^dim种群是异源性的，包含单独定型于一系列不同组织类型的细胞。

实施例3：STRO-1^bri细胞可修饰体外和体内组织特异性定型细胞的生长能力

代表不同发育阶段的两种不同的体外扩增MPC衍生细胞种群的鉴定对于来源于STRO-1^bri细胞的完全培养制备物应用于临床治疗具有重要启示。将最初研究设计为考察原始的较低定型的STRO-1^bri培养MPC对更成熟和定型STRO-1^dim培养TSCC生长的影响。设计实验将FACS分离的STRO-1^dim培养TSCC(其之前已用一种荧光标签CFSE进行标记)与百分比不断增加的FACS分离的STRO-1^bri培养MPC一起加入。图6示出了标记的STRO-1^dim细胞的增生受未标记的STRO-1^bri细胞存在的影响。当一个CFSE标记的细胞分裂时，两个子细胞含有亲细胞的一半荧光。因此，不同代龄的子细胞被表示为具有成比例一直降低的荧光强度的荧光分布，其中在直方图的最右方(垂线相交的)的曲线表示起始STRO-1^dim种群的点(图6)。该数据表明，较高比例的STRO-1^dim细胞被刺激以增加其增生速率，其中可证实更多细胞在加入大于5％STRO-1^bri细胞后经历至少3至4次分裂。因此，为了获得未分裂MPC衍生细胞的可持续且有效的体外扩增，应遵循：该培养物需要多于5％的STRO-1^bri细胞存在于种群中。

实施进一步考察以确定更原始的较低定型STRO-1^bri培养MPC是否也可以影响体内TSCC的增生能力。两个体内模型用来解决这个问题。第一个模型采用无胸腺裸大鼠，其进行了左前降支(LAD)冠状动脉的结扎并且在48小时后注射盐水、FACS分离培养的人STRO-1^dim和STRO-1^bri细胞以及无STRO-1的骨髓单核细胞的新鲜吸出物(图7)。两周后，将动物处死，固定心脏组织并同时用两种单克隆抗体进行染色：第一个与大鼠(而不是人)Ki67抗原是选择反应性的，并且第二个与心肌细胞标记物肌钙蛋白I是反应性的。双重染色的细胞(表示增生的大鼠心肌细胞)通过免疫过氧化物酶技术进行检测。与接受盐水或STRO-1^dim人细胞的对照动物相比，接受STRO-1^bri人细胞的动物表现出2.5-5倍较高数量的增生大鼠心肌细胞(图7)。

第二个模型利用无胸腺裸大鼠，其皮下注射了大鼠成胶质细胞瘤细胞，其组成性地分泌VEGF。两周后，该大鼠接受瘤内注射盐水、FACS分离的STRO-1^dim或STRO-1^bri人细胞(图8)。一周后，将动物处死，固定肿瘤组织并同时用两种单克隆抗体进行染色：第一个与平滑肌细胞表达的α平滑肌肌动蛋白抗原是反应性的，第二个与脉管内皮细胞表达的vWF抗原是反应性的。双重染色的结构(表示既含内皮又含平滑肌的微动脉和动脉)通过免疫过氧化物酶技术进行检测。与接受盐水或STRO-1^dim人细胞的对照动物相比，接受STRO-1^bri人细胞的动物在肿瘤内的细胞注射部位处表现出3.5-8倍较高数量的微动脉和动脉(图8)。在已注射人细胞处的远端部位处未观察到差异。

实施例4：来源于STRO-1阳性细胞的细胞培养物中的STRO-1^briMPC的数量增加

在证实STRO-1^bri培养MPC增加更多TSCC增生的能力之后，我们接下来考察了一系列生长因子增加体外扩增的STRO-1^bri MPC比例的作用(图9)。将已建立的来源于STRO-1^bri/CD146⁺分离的骨髓细胞的培养物在补充了10％FCS(A)或一系列因子包括1x10^-7M1α，25-二羟维生素D₃(1，25D))(B)、10ng/ml血小板源生长因子(PDGF)(C)、10ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)(D)；10ng/ml白介素-1β(IL-1β)(E)以及30ng/ml基质衍生因子1-α(SDF-1α)(F)的基础培养基中培养5天，用STRO-1mAb进行染色(图9)。发现这些因子极大地增加体外STRO-1^briMPC的数量。

为了研究这些因子如何在体外扩增后增高表达STRO-1^bri的细胞百分数的机制，将培养的Stro-1^bri如方法中所述用CFSE进行标记，然后暴露于各种因子。图10示出了一个代表性实验，其中IL-1β增加用CFSE标记(如方法中所述)的MPC的增生能力。将细胞在10ng/ml IL-1β存在的情况下培养5天，用STRO-1mAb染色并如上所述进行分析。发现IL-1β通过增加亮STRO-1⁺骨祖细胞的数量而增加MPC分裂的次数。1，25D、PDGF-BB、TNF-α、IL-1β和SDF-1α用来刺激MPC时也可获得类似结果。

实施例5：增加STRO-^bri细胞的增生也增加Stro-^dim细胞的数量

在各种因子存在的情况下增高STRO-1^bri培养MPC比例的能力也与STRO-1^dim细胞的数量增加相关。例如，STRO-1^bri/Alk Phos⁺(图10B)，一种与成骨前细胞一致的表型(Gronthos et al.，J BoneMiner Res.14：47-56，1999；Pan et al.，Bone 34(1)：112-23，2004)。因此，我们考察了表型的这种变化是否也与诱导的STRO-1^bri MPC分化为骨形成细胞(成骨细胞)的能力增加相关。图11示出了在骨诱导剂地塞米松存在的情况下，IL-1β不仅刺激STRO-1阳性MPC增生，而且增强其骨形成能力。浓度为0.01ng/ml的IL-1β显著将MPC数量增加到未处理的对照培养物的136.6±1.2％(图11A)。在大于0.1ng/ml的浓度下获得了一个平台效应。将体外扩增的MPC后代如方法中所述在骨诱导条件存在的情况下接种到24孔板中。这些细胞也用浓度为10ng/ml的IL-1β进行处理，每周给培养物“供应”含IL-1β的新鲜培养基。根据所述方法确定绝对胞外基质钙浓度。结果表明，相比于未处理的细胞(图11B)，用IL-1β处理的细胞(图11C)中的矿物沉积增加。经IL-1β处理细胞中的钙水平在第4周和第6周显著高于未处理细胞的钙水平。

图12中展示的数据表明，IL-1β刺激STRO-1^BriMPC的增生，引起骨祖细胞的扩增，同时随后加入另一种分化试剂地塞米松，诱导碱性磷酸酶(ALP)表达和STRO-1表达丧失，有效地提高体外功能性成骨细胞的数量。不同因子可扩增和调节STRO-1^BriMPC种群的概念进一步在体内进行测试。从Stro-1^briMpC扩增的的半融合的体外继代培养物在存在或缺乏PDGF-BB(10ng/ml)(另一种已知可增高体外扩增的STRO-1^BriMPC数量的因子)下进行培养(请参考图9C)。PDGF诱导的和非诱导的细胞制备物接着如方法中所述用羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)共移植到免疫缺陷的小鼠中。8周后，对收集的移植物进行研究表明，如通过Scion Imaging量化的(图13A)，当与未处理的对照培养物(图13B)相比时，用PDGF-BB预处理的培养物表现出显著较多的异位成骨(图13C)。

实施例6：纯化的人BMSSC表达高水平SDF-1

差减杂交之前已被用来增加在稀有细胞种群中差异表达基因的频率(Xu et al.，Cancer Res.60：1677-1682，2000；Kingsley et al.，Dev Growth Differ.43：133-143，2001)。在本研究中，利用之前描述的一种组合MACS/FACS步骤(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003)分离了STRO-1^暗(血型糖蛋白-A⁺成核红细胞)和较小部分的表达STRO-1^亮的骨髓细胞(其包括所有形成集落的BMSSC)(图14A)。对于每一个分选的STRO-1种群，总RNA从5个单独的骨髓供体制备并集合。在第一链合成后，使STRO-1^亮和STRO-1^暗cDNA经历如在“材料与方法”中所述的一系列差减杂交步骤。为了鉴定由STRO-1^亮BMSSC种群独特表达的基因，STRO-1^亮差减的cDNA用来构建重复低密度微阵过滤器，包含200个随机选择的用STRO-1^亮差减的cDNA转化的细菌克隆体，其连接于T/A克隆载体中。该微阵列随后用[³²p]dTCP标记的STRO-1^亮或STRO-1^暗差减的cDNA进行探测(图14B-C)。差异筛选共鉴定了44个克隆体，其在STRO-1^暗和STRO-1^亮亚群之间高度差异性表达。所有差异表达的克隆体的DNA测序表明了，仅有1个克隆体代表一种已知的促基质细胞有丝分裂剂；即，血小板源生长因子(PDGF)(Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995)。有趣地，我们发现该44个克隆体中有6个包含对应于趋化因子，基质衍生因子-1(SDF-1)，的DNA插入物。人BMSSC中的高丰度SDF-1转录体通过总RNA的半定量RT-PCR加以证实，所述总RNA制备自新鲜分选的STRO-1^亮、STRO-1^暗和STRO-1^阴性骨髓亚群(图14D)。

实施例7：SDF-1在体外由未成熟基质种群优先表达

我们接下来研究SDF-1的表达是否与体外BMSSC的发育阶段有关。根据STRO-1和碱性磷酸酶(AP)的细胞表面表达，SDF-1表达水平通过利用一种建立的体外骨原分化模型在不同基质种群中进行评估(Gronthos et al.，J Bone Miner Res.14：47-56，1999；Stewart et al.，J Bone Miner Res.14：1345-1356，1999；Pan et al.，Bone.34(1)：112-23，2004)。根据图15A中描述的分选区域(R1-R4)，将双色FACS用来分开不同的BMSSC STRO-1/AP亚组分。每一个STRO-1/AP亚组分经双重分选获得超过99.9％的纯度。随后在从每一个STRO-1/AP分选的种群分离的总RNA上实施半定量RT-PCR，考察SDF-1表达。该分析表明，当参照管家基因GAPDH标准化时，相比于最成熟的细胞种群STRO-1^-/AP⁺(成骨细胞)和STRO^-1-/AP^-(骨细胞，骨衬细胞)，最不成熟的基质种群STRO-1⁺/AP^-(骨祖细胞)随后是STRO-1⁺/AP⁺(成骨前细胞)表达较高水平的SDF-1(图15B)。

在平行实验中，补充了成骨诱导介质(补加了L-抗坏血酸-2-磷酸盐、地塞米松以及无机磷酸盐)的BMSSC的继代培养物以一种时间依赖性方式表现为SDF-1表达的降低(图16A)。该数据表明，在用成骨诱导介质刺激48小时后，较低水平的SDF-1表达与较高比例的前成骨细胞样细胞(STRO-1⁺/AP⁺)相关(图16B)。

实施例8：BMSSC表达SDF-1受体CXCR4

为了确定SDF-1是否可作为自分泌因子起作用，利用RT-PCR分析的初步实验证实了实际上BMSSC的确表达SDF-1受体CXCR4(图17A)。对正常培养的BMSSC和人骨肉瘤细胞系MG63的CXCR4表达的研究表明了预期的568个碱基对PCR产物的不同表达和一个另一个较大条带。DNA序列分析证实较低条带对应于正常人CXCR4异构体，而较大带对应于一个以前报道的可变剪接变异(Gupta and Pillarisetti，J Immunol.163：2368-2372，1999)。还证实BMSSC组成地在细胞表面表达低水平CXCR4蛋白，如通过流式细胞计数分析所证实的(图17B)。开展钙动员研究以确定BMSSC表达的CXCR4是否为功能活性的。FURA-2-加载的BMSSC用30ng/ml重组人SDF-1α(rhSDF-1α)进行攻击，引起表征SDF-1/CXCR4信号转导的胞内钙水平快速而强烈的增加(图17C)。

实施例9：SDF-1的过表达增强BMSSC在体内形成异位骨的能力

为了确定SDF-1是否在基质细胞发育中具有任何功能性作用，含有全长人SDF-1cDNA的逆转录病毒表达构建体用来转染包装细胞系PT67，如“材料和方法”中所述。然后收集的含有感染颗粒的上清液用来产生稳定的表达高水平SDF-1α的多克隆源BMSSC细胞系和对应的用空pLNCX2载体转导的对照细胞系(图18A)。

将来源于3个独立骨髓吸出物的细胞系连同羟磷灰石/磷酸三钙颗粒如“材料和方法”中所述植入免疫缺陷小鼠。来自收集的植入物的组织切片经Scion Imaging分析证实，相比于载体对照，在那些含有高表达SDF-1的BMSSC系的移植物中每个区域均有显著较高水平(P＜0.05，t检验)的异位骨形成。

实施平行研究以鉴定所观察到的SDF-1介导的增强骨形成能力的可能机制。令人惊讶地，相比于载体对照细胞系，在高表达SDF-1的BMSSC体外形成羟磷灰石矿化沉积物的能力方面我们未能检测到任何差异(数据未示出)。此外，在高表达SDF-1和相配合的载体对照BMSSC系之间的各种骨相关基因(BMP2、BMP4、CBFA1、osterix(成骨细胞特异基因)、骨钙蛋白、碱性磷酸酶[AP])的表达方面，我们未能检测到任何一致性的差异(数据未示出)。总起来说，这些数据表明SDF-1对体内骨形成施加了一种间接作用。

实施例10：SDF-1介导BMSSC生长和存活

我们接下来研究SDF-1的过表达可以对转导的BMSSC提供一种生长或存活优势的可能性。这个主张通过增生研究得到支持，其中该增生研究证实：相对于BMSSC载体对照细胞系，高表达SDF-1的BMSSC生长能力表现为适度但不显著的增加(图19A)。此外，过表达SDF-1的BMSSC系还表现出对炎性细胞因子IL-4(以前已证实抑制体外BMSSC的生长)的凋亡诱导作用的较大抗性，如通过台盼蓝吸收方法所评估的(图19B)。根据这些发现，当用IL-4攻击时，过表达SDF-1的BMSSC活培养物还表现出早期凋亡标记物膜联蛋白V的细胞表面染色降低(图19C-D)。

随后开展比较实验以确定外源性SDF-1对正常BMSSC生长的作用。将纯化的STRO-1阳性骨髓细胞在无血清条件下进行培养，该条件以前被证实在PDGF-BB存在的情况下将最早可鉴定的间充质前体细胞(CFU-F；成纤维集落形成单位)的形成增高至可比拟血清充分的培养物的水平(Gronthos et al.J Cell Sci.116：1827-1835，2003；Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995)。尽管外源性rhSDF-1α未表现出固有的单独刺激集落产生的能力，但是联合PDGF-BB即可观察到CFU-F数量的增加(图20)。此外，加入已知为有效CFU-F抑制剂的α-干扰素2α(Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995；Wang et al.，Am J Hematol.40：81-85.1992)表现出PDGF-BB诱导的集落形成的典型下降，该集落形成在SDF-1存在的情况下表现为部分可逆。我们发现，0.1至100ng/mL的浓度范围内，在30ng/mL SDF-1存在的情况下观察到的反应是最佳的(图21)。总起来说，这些数据表明，SDF-1在促进BMSSC的自我更新和存活能力方面发挥作用。

讨论

本研究首次证实：直接从人骨髓吸出物分离的最早可检测的BMSSC在培养之前表达高水平的SDF-1。我们之前已报道了多能BMSSC位于大血管的周血管细胞之间的骨髓微环境中(Shi andGronthos，J Bone Miner Res.18：696-704，2003)。这些观察结果与已公开的SDF-1在人骨髓中的分布模式一致，其中最高水平的SDF-1由围绕血管(包括血管周围区域和骨的毛细血管)的细胞以及早期髓细胞生成和B-淋巴细胞发育部位骨内膜附近的一些骨髓基质细胞来表达(Ponomaryov et al.，J Clin Invest.106：1331-1339，2000；Petit et al.，Nat Immunol.3：687-694，2002；Salvucci et al.，Blood 99：2703-2711，2002)。重要地，位于骨表面的成熟骨原细胞种群或骨基质内的骨细胞似乎缺少SDF-1的原位表达(Ponomaryov et al.，J ClinInvest.106：1331-1339，2000)。

Stewart等(Stewart et al.，J Bone Miner Res.14：1345-1356，1999)和我们实验室(Gronthos et al.，J Bone Miner Res.1999；14：47-56，1999；Pan et al.，Bone.34(1)：112-23，2004)的前期工作已证实，早期前骨原细胞存在于表达间充质干细胞标记物STRO-1但缺少表达成骨细胞相关标记物碱性磷酸酶的正常基质培养物中。这些前体细胞种群朝向一种成熟和功能性成骨细胞表型的进展与STRO-1表达丧失以及AP细胞表面表达的获得相关(Gronthos et al.，J Bone Miner Res.1999；14：47-56，1999；Stewart et al.，J Bone MinerRes.14：1345-1356，1999)。利用这种骨原细胞分化的体外模型，我们已证实培养的BMSSC细胞(代表定型骨原种群)相比于更不成熟的STRO-1⁺BMSSC组分显示出SDF-1水平降低。此外，在用成骨诱导介质处理BMSSC后出现SDF-1表达的显著降低，提供了进一步的证据，即高SDF-1表达与前骨原分化的较原始的较低定型阶段有关。总起来说，我们的数据表明，SDF-1可发挥作用以将初始未定型BMSSC种群定位于其血管周围小生境内，直至响应于可能发挥作用以破坏SDF-1/CXCR4相互作用的环境信号而需要增生和分化。

尽管认为SDF-1在正常造血作用、炎症以及各种肿瘤转移中很关键，但是关于SDF-1对BMSSC的生长或分化的作用所知甚少。

SDF-1通过其受体CXCR4(一种跨膜糖蛋白，属于G蛋白偶联分子家族)介导其作用，其中CXCR4还充当人免疫缺陷1型病毒的主要辅助受体(Bleul et al.，Nature 382：829-833，1996；Oberlin etal.，Nature 382：833-835，1996；Ma et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.95：9448-9453，1998)。有趣的，我们在正常培养的BMSSC和人骨肉瘤细胞系MG63中观察到2个CXCR4剪接变异体。DNA序列分析证实，较小剪接变异体对应于跨越外显子1和2的正常人CXCR4cDNA，是正常BMSSC中大量存在的形式。相反，我们发现在MG63细胞中高度丰富的较大间接变异体对应于一种之前描述过的可变剪接变异，通过包含来自交叉内含子的转录DNA序列所形成的，引起增加另外的9个氨基酸(Gupta et al.，J Immunol.163：2368-2372，1999)。组织分布研究证实，较小的转录体是在正常组织中发现的主要CXCR4异构形式，而较大转录体在各种白血病和癌细胞系中高度表达(Gupta etal.，J Immunol.163：2368-2372，1999)。尽管两种剪接变异体都是活性的，但是较大CXCR4转录体的功能重要性还没有被确定，但可能作为一种胚胎发育期间CXCR4剪接可能发生的任何差错的补偿机制而与发育中SDF-1/CXCR4的重要性相关。

在本研究中，我们证实，BMSSC组成地表达较低细胞表面水平的功能性CXCR4蛋白，如通过流式细胞计数分析和钙动员研究所证实的。因此，SDF-1/CXCR4信号转导可能在调节BMSSC生长和移动中起关键作用。

在本研究中，我们还证实，大部分体外扩增的BMSSC开始经历部分骨原分化，其与SDF-1表达降低相关。这种成熟作用似乎增强BMSSC对诱导凋亡因子的敏感性。我们的研究证实，过表达SDF-1的BMSSC系表现出对IL-4(以前证实其抑制体外BMSSC的生长)凋亡作用的抵抗增加(Gronthos and Simmons，Blood.85：929-940，1995)。类似的实验证实，高表达SDF-1的BMSSC系在IL-4存在的情况下对早期凋亡的诱导具有更大抗性。

本研究证实，由SDF-1在最早可鉴定的间充质前体细胞(含有CFU-F种群的新分离的STRO-1^亮骨髓细胞)上传递存活和生长优势。尽管外源性rhSDF-1α没有表现出固有的单独刺激集落产生的能力，但是当与PDGF-BB一起加入时可观察到CFU-F数量的增加。SDF-1对不同BMSSC种群之间的生长速率的不同作用可能是由于新鲜分离的原始BMSSC相对于较成熟的体外扩增的基质细胞的发育阶段的差异。因此，PDGF和SDF-1可在促进BMSSC的自我更新和存活能力方面协同发挥作用。

已包括在本说明书中的文献、条例、材料、装置、制品等的任何论述仅用于为本发明提供一种背景的目的。不应该视为承认这些物件的任何或全部形成如同其在本申请的每一权利要求的优先权期限之前已经存在一样的部分现有技术基础或本发明相关领域中的公共常识。

本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明宽泛描述的精神和范围的情况下，对于如在具体实施方式中示出的，可以对本发明做出各种变化和/或修饰。因此，本发明的具体实施方式在所有方面都应被认为是描述性的而不是限制性的。

表1：本专利中采用的抗体

表2：用于人mRNA特异性扩增的Rt-PCR引物和条件

表3：STRO-1^Bri和STRO-1^Dim种群中相对基因表达的总结。提供了通过逆转录-PCR确定的STRO-1^Bri和STRO-1^Dim种群之间表现出可检测和差异表达的基因列表。数值表示参照管家基因GAPDH的相对基因表达。

表4：STRO-1^Bri和STRO-1^Dim种群中相对基因表达的总结。提供了通过流式细胞仪确定的STRO-1^Bri和STRO-1^Dim种群之间表现出差异表达的蛋白质列表。数值表示如图2中所述染色的相对平均荧光强度。

Claims

1.一种在体外增强组织特异性定型细胞(TSCC)的增生和/或存活的方法，所述方法包括将所述TSCC暴露于表达SDF的STRO-1^亮细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TSCC表达CXCR4。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述STRO-1^亮细胞已被修饰以实现SDF-1的过表达。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述TSCC在高于5％的STRO-1^亮细胞存在下进行培养。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述TSCC和STRO-1^亮细胞在选自由血小板源生长因子(PDGF)、干细胞因子(SCF)、Fit3配体(FL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、1α，25-二羟维生素D3(1，25D)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及白介素-1β(IL-1β)组成的组中的刺激因子存在下进行培养。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述TSCC和STRO-1^亮细胞在分化偏向于一种特异性组织类型的条件下进行培养。