CN108384855A - 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用 - Google Patents

非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108384855A
CN108384855A CN201810193598.9A CN201810193598A CN108384855A CN 108384855 A CN108384855 A CN 108384855A CN 201810193598 A CN201810193598 A CN 201810193598A CN 108384855 A CN108384855 A CN 108384855A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
mirna
osteosarcoma
transcription
bone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810193598.9A
Other languages
English (en)
Inventor
马翠
常鹏
石小峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201810193598.9A priority Critical patent/CN108384855A/zh
Publication of CN108384855A publication Critical patent/CN108384855A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及非编码RNA及其在骨肉瘤转移检测中的应用，更具体的涉及非编码RNA—ENSG00000233682、miR‑193b‑3p、miR‑1197及其在诊治骨肉瘤转移中的应用。发明人采用高通量测序研究骨肉瘤转移患者、原发患者及正常人群的mRNA、miRNA、lncRNA表达情况，发现ENSG00000233682、miR‑1197、miR‑193b‑3p不仅在骨肉瘤转移中组中高表达，前者和后两者之间还存在靶向关系，显示他们有望成为骨肉瘤转移临床诊断中新的分子标志物。

Description

非编码RNA及其在骨肉瘤转移检测中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及非编码RNA—ENSG00000233682、miR-193b-3p、miR-1197及其在诊治骨肉瘤转移中的应用。
背景技术
人类基因绝大部分可发生转录，但产物大多数为非编码RNA(ncRNA)，部分ncRNA可通过影响基因及表观遗传学对生命活动起调节作用，长链非编码RNA(lncRNA)与微小RNA(miRNA)是其中最重要的两类，它们在多种生命活动中扮演重要角色。
lncRNA为一类转录本长度大于200nt，缺少有效开放性阅读框，不编码蛋白质的RNA分子，可在组织器官分化过程中动态的表达与不同的剪接方式，因此lncRNA具有时间及空间特异性。目前lncRNA按转录位置的不同可分为5类:位于基因间区的lncRNA；天然反义链lncRNA；内含子区lncRNA；正义链lncRNA；双向lncRNA。
miRNA是一类不具有开放性阅读框架、长度为18-25nt的非编码短序列RNA，其广泛存在于真核生物中。成熟的miRNA 5'端有一磷酸基团3'端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来。绝大多数miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特性。
很多研究表明miRNA是lncRNA发挥作用的一个重要环节，在很多疾病的病变细胞中发现某一lncRNA与某些miRNA存在一定的数量关系，且它们的数量变化与相关疾病的发生发展密切相关(Functional interactions among microRNAs and long noncodingRNAs,Semin Cell Dev Biol，2014，34:9-14)。lncRNA与miRNA都有各自的调控网络，但是两者的调控网络并不是独立存在的，很多时候在一种疾病的发生发展中lncRNA与miRNA的调控是相互依存、相互交织的，共同形成了一个复杂的调控网络。
骨肉瘤是一种起源于间叶组织的骨骼系统恶性肿瘤，发病率和死亡率在原发性骨肿瘤中位居第一。骨肉瘤发生发展进程快，转移率高，以股骨远端和胫骨近端转移最为常见，患者预后水平低。随着肿瘤发生分子机制的不断深入研究，分子靶向治疗逐渐被认为是攻克肿瘤的突破口，尤其是探索在骨肉瘤转移中有效的分子靶点成为现今骨肉瘤研究的热点问题。
申请人之前曾采用高通量测序研究转移性骨肉瘤患者及健康人的miRNA的表达数据，发现miR-4520-3p、miR-1299和骨肉瘤转移相关(ZL2016100688631和ZL2016100686566)，本申请中，发明人进一步对骨肉瘤转移患者、原发患者及正常人群，从mRNA到miRNA到lncRNA进行多维度研究。本发明提供与骨肉瘤转移密切相关的非编码RNA—ENSG00000233682、miR-193b-3p、miR-1197，为骨肉瘤转移机制研究提供很好的思路，为骨肉瘤转移临床诊断提供新的分子标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供检测非编码RNA制剂在制备诊断骨肉瘤转移试剂中的应用，所述非编码RNA为lncRNA和/或miRNA。
进一步，lncRNA为ENSG00000233682；miRNA为miR-1197或miR-193b-3p。
ENSG00000233682的序列见序列表SEQ ID NO 1。
miR-1197的序列见序列表SEQ ID NO 2。
miR-193b-3p的序列见序列表SEQ ID NO 3。
进一步，诊断骨肉瘤转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p转录情况。
优选的，采用northern杂交方法、斑点杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的转录情况。
优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的引物；基于探针杂交方法包括与ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的核酸序列杂交的探针。
本发明的目的在于提供一种防治骨肉瘤转移试剂，包括下调miR-193b-3p的转录和/或抑制miR-193b-3p的活性的试剂，或者上调ENSG00000233682的转录和/或促进ENSG00000233682的活性的试剂，或者上调miR-1197的转录和/或促进miR-1197活性的试剂。
优选的，采用反义寡核苷酸、miRNA抑制剂、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAErasers、Target Masking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调miR-193b-3p的转录和/或阻断miR-193b-3p的活性。
优选的，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技术上调miR-1197的转录和/或促进miR-1197的活性。优选人工合成短发夹RNA或通过调控启动子上调miR-1197。
优选的，构建含ENSG00000233682的过表达载体上调ENSG00000233682的表达。
进一步，所述试剂还包含药剂学上能接受的载体。
本发明的目的在于提供上述防治骨肉瘤转移试剂在制备治疗骨肉瘤转移药物或制剂中的应用。
本发明的目的在于提供上述骨肉瘤转移诊断制剂在制备骨肉瘤转移诊断工具中的应用。
定义：
现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
(1)Northern杂交
又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。
(2)miRNA表达谱芯片
原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。
(3)核酶保护分析技术(RPA)
miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
(4)RAKE法
RAKE法(RNAprimed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。
(5)原位杂交(in situ hybridization)
原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。
(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)
是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)
荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
(8)测序法
大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。
高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(shorthairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。
基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1是RT-PCR检测各组ENSG00000233682表达情况
图2是RT-PCR检测各组miRNA表达情况
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1样品的收集及总RNA提取
3例转移性骨肉瘤患者、3例原发性骨肉瘤患者及3名健康人。转移组选取肿瘤转移病灶，转移部位为肺部，原发组选取肿瘤原发病灶，健康对照选取截肢标本。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
RNA提取标准：RNA纯度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法：Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5V/cm；时间：20min)。
lncRNA和mRNA测序要求：
样品需求量：≥200ng；样品浓度：C≥20ng/μL；样品纯度：RIN≥7.0,28S/18S≥1.0。
miRNA测序要求：
样品需求量(单次)：≥1μg；样品浓度：15ng/μL≤c≤500ng/μL；样品纯度：OD260/280＝1.8～2.2；OD260/230≥2.0；28S:18S≥1.5；RIN≥8.0。
实施例2测序及数据分析
测序：
lncRNA和mRNA测序平台：hiseq2500 125PE，完成9个人的链特异性转录组测序(lncRNA)，每个样品的产出不低于10Gb数据。
miRNA测序平台：hiseq4000 50SE,完成9个人组织样品的small RNA测序，每个样品的产生不低于10M reads数据。
mRNA和lncRNA分析：
1tophat比对到参考基因组上，参考基因组来自于Ensembl V84；
2.cuffquant定量lncRNA和mRNA的表达量并标准化输出；
3.cuffdiff包比较两组之间lncRNA和mRNA的表达差异。
miRNA分析：
1.得到原始的FASTQ数据后，对其进行质控得到高质量的测序结果(clean smallRNA)，并进行序列长度分布统计。使用软件：Fastx-Toolkit(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)。质控步骤如下：(1)剪切测序质量较低的碱基(质量值小于20)；(2)去除由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads；(3)去除含有N的reads；(4)去除小片段(小于18bp)；(5)提取长度为18-32bp的序列；(6)clean small RNA长度分布统计。
2.用bowtie把reads map到基因组上。成熟miRNA和miRNA前体序列下载自miRBase，参考基因组为GRCh38；
3.用miRDeep2定量已知miRNA的表达；
4.在R环境下用DEGseq包比较两组的表达差异。
筛选标准P<0.01，abs(log2(fold change))>2；筛选到了307个差异表达基因(106上调，201下调)；50个差异表达lncRNA(27上调，23下调)；48个差异表达miRNA(19上调，29下调)。综合分析及人工筛查后，FNDC1基因及调控其表达的非编码RNA—ENSG00000233682、miR-1197、miR-193b-3p进入我们的研究范围。FNDC1基因在转移组低表达(转移组VS原发组)，但是在原发组和健康对照组间却没有差异，显示其仅与骨肉瘤转移相关，FNDC1基因是长链非编码RNA—ENSG00000233682的nearby gene，二者共表达相关性高达97％，同时数据分析显是lncRNA的靶基因为FNDC1。在使用包括RNAhybrid，miRWalk，PICTAR2及Targetscan这些4种算法预测差异表达miRNA的靶向lncRNA，miR-1197、miR-193b-3p的靶基因均为ENSG00000233682。
实施例3Real-time PCR检测骨肉瘤样本中非编码RNA的表达情况
1样品采集：
14例转移性骨肉瘤肿瘤患者、15例原发骨肉瘤患者和20例健康对照的外周血均来自医院。
2总RNA提取：
相关实验物品的去Rnase的处理：
①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
白细胞分离
(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；
(2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；
(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；
(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min；
(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。
RNA提取
(1)先加lml Trizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-l0min；
(2)加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下1 2000转离心15min；
(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入500：1异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；
(4)4℃1 2000g离心l 0min，弃上清液，底部可见白色物质；
(5)加入lml 75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；
(6)4℃7500g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
3逆转录
lncRNA逆转录：
取1μg总RNA作为模板RNA，采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
miRNA逆转录：
RT体系的配制：1μg总RNA作为模板RNA；5×miScript HiSpec Buffer 4μl；10×Nucleics Mix 2μl；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl；灭菌水补平至20μl。ABI9700型PCR仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μlNuclease-free H2O稀释至100μl储存在-20℃冰箱备用。
4荧光定量PCR
引物设计：
ENSG00000233682
上游引物：5’-TGTCCTCGCAGAGATAAC-3’(SEQ ID NO 4)
下游引物：5’-TCAAGTTTTGGGTTGTCAT-3’(SEQ ID NO 5)
miR-1197
特异性引物：5’-TAGGACACATGGTCTACTTCT-3’(SEQ ID NO 6)
miR-193b-3p
特异性引物：5’-AACTGGCCCTCAAAGTCCCGCT-3’(SEQ ID NO 7)
lncRNA的RT-PCR体系的配制：
反应组分 浓度 体积(μl)
mix 2× 10
上游引物 10uM 0.5
下游引物 10uM 0.5
cDNA - 2
Nuclease-free H2O - 补平至25μl
mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以actin作为内参。
扩增程序为：95°10min，45个循环(95℃15s，55℃60s)。
miRNA的RT-PCR体系的配制：
miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。
扩增程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，60℃30s)。
5统计学分析
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较ENSG00000233682在骨肉瘤原发组、转移组组和正常对照组中的表达水平。结果显示：相对于原发组ENSG00000233682在骨肉瘤转移组低表达，表达量为原发组的三分之一左右，二者在原发组和对照组间差异表达无统计学意义(具体见附图1)。miR-193b-3p在骨肉瘤转移组的表达量约为原发组的4.3倍，miR-1197在骨肉瘤转移组低表达，为原发组表达水平的二分之一左右,以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
实施例4miR-193b-3p与骨肉瘤转移关系验证
一、材料准备：
(一)标本来源
人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
(二)主要试剂
LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen)。
miR-193b-3p序列发给吉玛基因公司，请其化学合成miR-193b-3p mimics、miR-193b-3p inhibitor及非特异性对照。
(三)主要溶液
1、细胞培养液
DMEM培养基+10％标准胎牛血清。
2、PBS(平衡盐溶液)
在800m1蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。
3、0.25％胰蛋白酶消化液
0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
二、实验方法
1、细胞传代
(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1m1，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；
(2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；
(3)细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数；
(4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×105个细胞浓度，分装于培养瓶中(8m1/每瓶)，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。2.miRNA瞬时转染
采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照LipofectaminTM2000试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的细胞接种到12孔板中，细胞计数约2×104，常规培养至转染当天，细胞融合度为50-60％时进行试验。将20nM/40nM/80nM miRNA mimic加入到100u1DMEM培养基中，轻柔混匀；另用100u1DMEM培养基稀释2u1LipofectaminTM2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育5min；混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养6h后更换完全培养基。其中，非特异性序列作为阴性对照，空白对照仅转染脂质体。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。
3.Transwell迁移实验
检测细胞迁移情况时，首先采用胰酶消化细胞，并加入无血清的培养基制备单细胞悬液；将1×105个细胞接种于Transwell小室内，下层内室内放置600u1含10％FBS的培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养；24h后采用棉签小心将小室内未迁移的细胞刮掉；无水甲醇固定1-5min，小室翻转晾干；采用0.1％的结晶紫染色20min；采用PBS清洗2次；将小室转移至含有PBS的24孔板内；倒置显微镜下观察细胞迁移情况，随机取6-8个视野，进行细胞计数。
过表达miR-193b-3p的MG63细胞迁移的数目显著高于空白对照组(p<0.05)，抑制miR-193b-3p表达的MG63细胞迁移数目显著低于空白对照组(p<0.05)，过表达miR-193b-3p组细胞迁移数目为241个，抑制miR-193b-3p表达组细胞迁移数目为166个，空白对照组细胞迁移数目为187个，阴性对照组(转染非特异性序列)细胞迁移数目为190个，与空白对照组无统计学差异。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 非编码RNA及其在骨肉瘤转移检测中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 532
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccuuucuuuu ccuuuuuucc ccgcugugcc ugaaucuccc gggacacuua gacggcugga 60
gccucccgac uccaaggcgg gcgacggcaa aguuaaacgc cagcgcgcug cgguccccgg 120
gcaccgaggc guccccgcuc ccgccaccca cacagggcgc caagugcccc gacccgcgag 180
ugacgaggac gcacagccug gaagccucgc ggcccuccag auggacucgg agcgccccug 240
gaggcuacag ugaccuaagc ucuaggaagg ccggguccug gacgccgcgu gcugcugucc 300
gccgccgacc gguguccucg cagagauaac cuggcugaac ucaccgccca gcgcuauguc 360
aguucucccu caugacaacc caaaacuuga ccggauuugu guucugcaga gaggaaaaaa 420
aaaagcggcc accgaacacc agugcaguag ccaggauggg ccuguggcuc uggcugcagc 480
cuccagggac accagcugga gagaaggaag ccacgcaugg agagcggcca gg 532
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uaggacacau ggucuacuuc u 21
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
aacuggcccu caaagucccg cu 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtcctcgca gagataac 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaagttttg ggttgtcat 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggacacat ggtctacttc t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aactggccct caaagtcccg ct 22

Claims (10)

1.检测非编码RNA制剂在制备诊断骨肉瘤转移试剂中的应用，所述非编码RNA为ENSG00000233682或靶向ENSG00000233682的miRNA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，miRNA为miR-1197或miR-193b-3p。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断骨肉瘤转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p转录情况。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的转录情况。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基于定量PCR方法包括特异性扩增ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的引物；基于探针杂交方法包括与ENSG00000233682、miR-1197或miR-193b-3p的核酸序列杂交的探针。
6.一种防治骨肉瘤转移试剂，包括下调miR-193b-3p的转录和/或抑制miR-193b-3p的活性的试剂，或者上调ENSG00000233682的转录和/或促进ENSG00000233682的活性的试剂，或者上调miR-1197的转录和/或促进miR-1197活性的试剂。
7.根据权利要求6所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，miRNA抑制剂、采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调miR-193b-3p的转录和/或阻断miR-193b-3p的活性。
8.根据权利要求6所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miR Mimics技术上调miR-1197的转录和/或促进miR-1197的活性。
9.根据权利要求6所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，构建含ENSG00000233682的过表达载体上调ENSG00000233682的转录和/或促进ENSG00000233682的活性的试剂。
10.权利要求6-9任意一项所述的防治骨肉瘤转移试剂在制备治疗骨肉瘤转移药物或制剂中的应用。
CN201810193598.9A 2018-03-09 2018-03-09 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用 Pending CN108384855A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810193598.9A CN108384855A (zh) 2018-03-09 2018-03-09 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810193598.9A CN108384855A (zh) 2018-03-09 2018-03-09 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108384855A true CN108384855A (zh) 2018-08-10

Family

ID=63066768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810193598.9A Pending CN108384855A (zh) 2018-03-09 2018-03-09 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108384855A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021114137A1 (zh) * 2019-12-11 2021-06-17 清华大学 长非编码rna letn作为肿瘤标志物及治疗靶点

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102080085A (zh) * 2009-12-01 2011-06-01 中国科学院上海药物研究所 人miR-193b反义核酸及其应用
CN103476947A (zh) * 2011-03-02 2013-12-25 格路福生物制药公司 寡聚体的增强的生物分布
WO2014074874A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Regents Of The University Of Minnesota Osteosarcoma diagnostic and prognostic methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102080085A (zh) * 2009-12-01 2011-06-01 中国科学院上海药物研究所 人miR-193b反义核酸及其应用
CN103476947A (zh) * 2011-03-02 2013-12-25 格路福生物制药公司 寡聚体的增强的生物分布
WO2014074874A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-15 Regents Of The University Of Minnesota Osteosarcoma diagnostic and prognostic methods

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL BAUMHOER等: "MicroRNA profiling with correlation to gene expression revealed the oncogenic miR-17-92 cluster to be up-regulated in osteosarcoma", 《CANCER GENETICS》 *
ENSEMBL: "ENSG00000233682", 《ENSEMBL》 *
吴发帅等: "长链非编码RNA在骨肉瘤中的研究进展", 《华中科技大学学报（医学版）》 *
高金鉴: "miR-193b-3p在骨肉瘤恶性行为中的作用及其机制研究", 《万方中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021114137A1 (zh) * 2019-12-11 2021-06-17 清华大学 长非编码rna letn作为肿瘤标志物及治疗靶点
JP7406278B2 (ja) 2019-12-11 2023-12-27 清華大学 腫瘍マーカー及び治療ターゲットとしての長鎖ノンコーディングｒｎａ ｌｅｔｎ

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105561341B (zh) mir-1292及其靶基因在预防和治疗骨肉瘤转移中的应用
CN103080334A (zh) 用于诊断早期结直肠癌及高级腺瘤的微rna生物标记及方法
CN109666743B (zh) 一种宫颈癌分子标志物及其应用
CN107312852A (zh) 心肌梗死诊断标志物组合物
CN107519193B (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN108624693B (zh) miR-577在制备肾病诊断标志物中的应用
CN107586842A (zh) 一种用于肾透明细胞癌诊治的生物标志物
CN107604066A (zh) miR‑518a‑3p在口腔癌诊断中的应用
CN106244688B (zh) 一种评估结肠腺癌患病风险的标志物
CN102770561B (zh) 用于诊断不同亚型肺癌的基于组织的微-rna方法
CN107058579A (zh) 肺腺癌相关的miRNA、组合物及其应用
CN107312851A (zh) 心肌梗死生物标志物miR‑1283
CN105664163B (zh) mir-5010及其成熟miRNA在制备骨肉瘤诊疗制剂的应用
CN108384855A (zh) 非编码rna及其在骨肉瘤转移检测中的应用
CN105734155B (zh) 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用
CN104774966A (zh) 肺腺癌miRNA标记物
CN105603117B (zh) miR-3613用于区分肺鳞癌转移与非转移的miRNA标志物
CN105343896B (zh) 鼻咽癌的新诊治靶点及其应用
CN105505936B (zh) 一种抗骨肉瘤转移生物制剂及其应用
CN108998532A (zh) 一种直肠腺癌的诊治标志物
CN109161596B (zh) miR-129及其靶基因在检测肺腺癌中的应用
CN107488660A (zh) 回文与互补回文小rna及其应用
CN108384856A (zh) 调控c4b基因表达的非编码rna及其用途
CN109652529B (zh) 骨质疏松特异性miRNA、组合物及其诊疗用途
CN110042164A (zh) 肺癌诊疗用lncRNA标志物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Applicant before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180810

RJ01 Rejection of invention patent application after publication