CN112760376A

CN112760376A - miRNA-3918在非小细胞肺癌检测中的应用

Info

Publication number: CN112760376A
Application number: CN202011599103.6A
Authority: CN
Inventors: 张玉
Original assignee: Qingdao Lianji Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112760376B

Abstract

本发明公开一种miRNA‑3918在制备非小细胞肺癌检测产品或抑制肺癌细胞增殖或侵袭的试剂中的应用。本发明通过高通量筛选，首次发现了miRNA‑3918表达水平与肺腺癌的发生发展相关，通过检测受试者miRNA‑3918的表达水平，可以判断受试者是否患有肺腺癌，从而指导临床医师给受试者提供相应的诊断方案，进一步，通过给予肺腺癌细胞miRNA‑3918的反义寡核苷酸，抑制miRNA‑3918的表达，实现了抑制肺腺癌细胞增殖侵袭的效果，为临床提供相应的治疗靶点。

Description

miRNA-3918在非小细胞肺癌检测中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及miRNA在非小细胞肺癌检测中的应用。

背景技术

肺癌是世界范围内的第一大恶性肿瘤，每年约有160万人死于肺癌，其中约有85％为非小细胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC)，肺腺癌和肺鳞癌是最常见的亚型。由于NSCLC早期症状比较隐匿，所以多数患者就诊时已是中晚期。近年来，随着环境和生活方式的变化，肺癌的发病率有所增加，成为世界范围内最常见的恶性肿瘤，在我国非小细胞肺癌尤其是肺腺癌的发病率也有逐年上升趋势。尽管在包括手术、放疗、化疗和靶向治疗在内的治疗方案方面取得了进展，但近年来诊断出的中晚期肺癌患者的5年生存率仍然很低，不超过 10％。复发和转移依旧是治疗失败的主要原因。肿瘤转移包括原发肿瘤细胞脱离、肿瘤扩散浸润、转送和继发性生长等环节。转移步骤为细胞脱离原发瘤群体，通过浸润和周围间质中生长并突入脉管系统或腔道并运转到靶组织，这一过程都和肿瘤本身和宿主环境种种因素的影响有关，并涉及多中miRNA的表达或缺失。

越来越多的研究表明，micro RNA(miRNA)在多种癌症中的异常表达可影响癌细胞的生物学特性。最初，microRNA是在线虫体内发现的一类长度约为 19～25个核苷酸的非编码小分子单链RNA。已知microRNA在多种癌症中的异常表达，如非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等，并影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性。通常microRNA可与靶基因的3’末端非翻译区结合(3’untranslated region，3’UTR)，从而调节靶基因的表达。因此，研究 microRNA在癌症中的作用机制具有重要的生物学意义，将为癌症诊断及治疗提供新的方向和靶点。micro RNA在肺癌中的作用机制及具体涉及的信号通路尚不清楚，仍需进一步研究和探讨。

检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在非小细胞肺癌中起重要作用。

由此可见，获得一种能够作为检测非小细胞肺癌检测和治疗靶点，为临床诊断和治疗提供相应辅助手段的miRNA分子标志物，是目前急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，发明人通过多次，反复的实验和筛选获得了能够作为检测非小细胞肺癌检测和治疗靶点，为临床诊断和治疗提供相应辅助手段的miRNA分子标志物，同时通过抑制该miRNA分子标志物可以实现抑制非小细胞肺癌增殖和侵袭的效果。

在一个实施方式中，本发明提供了一种miRNA在制备非小细胞肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述miRNA可以是初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA，所述miRNA为miRNA-3918，所述miRNA-3918在miRBase中的编号为MI0016424；所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为： acagggccgcagauggagacu。

优选的，所述miRNA-3918包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miRNA-3918核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。所示miRNA-3918核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-3918主要呈单链形式，而miRNA-3918前体是部分自互补的，以形成包含茎环的双链结构。

在一个实施方式中，本发明提供一种检测miRNA的试剂在制备非小细胞肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品为试剂盒，所述miRNA为 miRNA-3918，所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为： acagggccgcagauggagacu。

本发明的试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是，例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是，例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定miRNA表达。本领域技术人员应当理解，测定miRNA表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的miRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子 (Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA 逆转录成DNA。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern 或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNAISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本 (例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

优选的，所述试剂盒中包含检测miRNA-3918的引物、寡核苷酸探针或适配体；所述寡核苷酸探针或适配体被固定于固相载体上，被制备成检测芯片。所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列得所述芯片。

优选的，所述检测miRNA-3918的引物的序列为cagggccgcagatg和gtccagtttttttttttttttagtctc；所述寡核苷酸探针可以采用本领域常规的方法制备，例如与miRNA-3918具有互补序列的寡核苷酸探针，或者在严谨杂交条件下可以互补结合的寡核苷酸或其衍生物，例如RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

在一个实施方式中，本发明提供一种miRNA的抑制剂在制备治疗肺癌的药物中的用途，其特征在于，所述检测产品为试剂盒，所述miRNA为miRNA-3918，所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为acagggccgcagauggagacu；所述肺癌为非小细胞肺癌，优选的，所述非小细胞肺癌为肺腺癌。

所述miRNA的抑制剂可以是蛋白，小分子化合物，适配体，寡聚核苷酸片段，优选的，所述miRNA-3918的抑制剂是其反义寡核苷酸片段或其衍生物，例如RNA、DNA、PNA、LNA的形式，更优选的，所述反义寡核苷酸片段为： agtctccatctgcggccctgt，所述反义寡核苷酸片段可以抑制肺腺癌细胞的增殖或侵袭。

本发明的治疗肺癌的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制肺癌的药物进行组合施用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过高通量筛选，首次发现了miRNA-3918表达水平与肺腺癌的发生发展相关，通过检测受试者miRNA-3918的表达水平，可以判断受试者是否患有肺腺癌，从而指导临床医师给受试者提供相应的诊断方案，进一步，通过给予肺腺癌细胞miRNA-3918的反义寡核苷酸，抑制miRNA-3918的表达，实现了抑制肺腺癌细胞增殖侵袭的效果，为临床提供相应的治疗靶点。

附图说明

图1肺腺癌增殖miRNA表达量差异显示；

图2定量PCR检测miRNA-3918在肺腺癌细胞中的表达情况；

图3抑制miRNA-3918对A549细胞增殖的影响；

图4抑制miRNA-3918对A549细胞侵袭的影响，图a是转染组镜检图，图b是阴性组镜检图，图c是细胞计数比较，图d是空白组镜检图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

实施例1肺腺癌相关miRNA的筛选

1.实验材料

本实验从某医院获得肺癌患者组织样本共40例，其中肺腺癌患者组织样本 20例，肺鳞癌患者20例，并以非肺癌患者的组织样本10例作为阴性对照。上述样本均为肺癌患者或其他肺部疾病患者的手术切除标本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2.实验方法

2.1组织RNA的提取

1.每1g组织加入10mL Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。

2.加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀2分钟左右，室温下静置10 分钟。4℃，12,000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置20分钟。

3.将上述异丙醇沉淀溶液在4℃，12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70％乙醇，4℃，12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解。

4.取5μl RNA，用无核酶水稀释100倍，用紫外分光光度仪检测RNA样品在波长260nm及280nm处的吸光度，通过A260/A280的比值来检测所提取RNA的纯度及浓度。比值在1.8～2.0之间，说明RNA的纯度较高，若比值不在范围内，则重新提取RNA。用1.5％的琼脂糖凝胶进行RNA电泳，看是否出现28S、18S、5S三条明显条带，并观察出现条带的亮度和宽度，判断RNA 是否降解。

2.2miRNA的提取

1.用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。

2.样品用T4RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。

3.标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含 3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次。

4.将杂交室放在杂交仪上于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

2.3miRNA芯片杂交筛选

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

为寻找与肺腺癌相关的miRNA，根据以下几点原则筛选高通量测序结果中肿瘤组织与癌旁对照组织的差异表达miRNA:(1)在不同样本中，miRNA的表达量均较高；(2)不同样本中共同存在的差异表达miRNA，或在多个样本中共表达且异表达趋势一致；(3)差异表达倍数较高,fold change值大于等于 2(|log2(foldchange)|>l)；且差异表达具有统计学意义(qvalue<0.01)。

2.4筛选结果

分析miRNA芯片表达谱的检测结果(如图1所述)，可知miRNA-3918在肺腺癌患者组织中存在高表达，而在肺鳞癌和非肺癌患者的样本中则不存在表达差异，可见，miRNA-3918的表达量与肺腺癌的发生发展存在显著的关联。所述 miRNA-3918的成熟miRNA的序列为：acagggccgcagauggagacu。

实施例2miRNA-3918在肺腺癌细胞中差异表达的验证

1.实验材料

本实施例采用肺腺癌细胞系A549和人肺上皮细胞株BEAS-2B，购自北京协和细胞资源中心。基于miRNA-3918的序列组成信息采用miRNA primer软件设计并合成检测引物，所述引物信息如表1所述。

表1miRNA-3918扩增引物

2.实验方法

2.1细胞培养

复苏肺腺癌细胞系A549和人肺上皮细胞株BEAS-2B，用含12％胎牛血清的MEM培养基，接种于细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中，常规换液、传代、冻存。

2.2总RNA提取

1.每100ml的细胞培养液中加入10mL Trizol。

4.取5μl RNA，用无核酶水稀释100倍，用紫外分光光度仪检测RNA样品在波长260nm及280nm处的吸光度，通过A260/A280的比值来检测所提取 RNA的纯度及浓度。比值在1.8～2.0之间，说明RNA的纯度较高，若比值不在范围内，则重新提取RNA。用1.5％的琼脂糖凝胶进行RNA电泳，看是否出现 28S、18S、5S三条明显条带，并观察出现条带的亮度和宽度，判断RNA是否降解。

2.3miRNA的提取

所述miRNA的提取步骤采用miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。

2.4反转录合成cDNA

将1μg的总RNA模板与2μl miRNA RT reaction buffer、2μl dATP(10mM)、 0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性 RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μlmiRNA RT reaction buffer、1μl dNTP(10mM)，0.5μl逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

合成的cDNA反应液放置于-20℃保存；也可以直接进行下游荧光定量检测。在进行下游荧光定量检测时，为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制，得到最适的CT值(15-30之间)，将CDNS反应液稀释10-1000倍后使用。

2.5实时荧光定量PCR。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2.0μL，10mM dNTP 0.5μL，10μM F1、F2引物各0.25μL，DNA聚合酶 0.5U，ddH₂O补足至25μL。采用U6作为内参基因。

实时定量PCR结果用相对定量来表示，使用2^-ΔΔCt方法，以U6为内参基因作均一化处理。

3.实验结果

如图2所示，与人肺上皮细胞株BEAS-2B相比，肺腺癌A549细胞中miRNA-3918的表达水平显著升高，显示出miRNA-3918与肺腺癌发生相关，可以作为肺腺癌的检测靶标。

实施例3MiRNA-3918对肺腺癌细胞增殖能力的影响

1、实验材料

根据miRNA-3918的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成 miRNA-3918反义寡核苷酸(anti-miRNA-3918)，所述序列为agtctccatc tgcggccctg t。本实施例采用肺腺癌细胞系A549，购自北京协和细胞资源中心。

2、实验方法

2.1细胞培养

复苏肺腺癌细胞系A549，用含12％胎牛血清的MEM培养基，接种于细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中，常规换液、传代、冻存。

2.2细胞瞬时转染

细胞转染前24小时，收集处于对数生长期的细胞，重悬后进行细胞计数，按每孔大约4Х10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加2ml含12％胎牛血清的MEMS培养基。转染时，细胞汇合度达到70-90％。严格按照lipofectamine TM2000试剂说明书和贴壁细胞转染程序说明进行细胞瞬时转染。实验分3组：转染组(转染anti-miRNA-3918)、阴性对照组(随机寡核苷酸)、空白对照组(加入等量转染试剂lipofectamine TM2000试剂)。

2.3细胞增殖检测

采用MTT法检测细胞增殖，步骤如下：

1)制备MTT溶液：进行5mg/ml浓度的MTT工作液的制备，于遮光环境中，在0.1L的PBS内放入0.5g的MTT，待其完全溶解，借助无菌过滤器(0.2ul)，将MTT溶液所含杂质清理掉，接着进行分装，再遮光存储于-20℃冰箱内，待用；

2)将细胞均匀种植于96孔板的各孔内，各孔细胞种植量为3000-5000个(具体取决于细胞类型以及实验规定)，每组细胞设置5个复孔，每孔加入200ul的完全培养基培养，外围一周孔内加入PBS100-200ul，以防干燥；

3)将96孔板放入37℃培养箱内培养72小时，每孔加入MTT溶液20ul，继续放入培养箱内4小时，结束后将培养液吸掉，每孔避光加入200ul的DMSO，在震荡器上震荡5分钟后于450nm处测每组细胞的OD值。

3.实验结果

如图3所示，与阴性对照组(随机寡核苷酸)和空白对照组相比，miRNA-3918 抑制组(anti-miRNA-3918)光吸收值显著下降(P<0.05)。上述实验结果表明 anti-miRNA-3918能够显著抑制A549细胞增殖能力。

实施例4MiRNA-3918对肺腺癌细胞侵袭能力的影响

1、实验材料

根据miRNA-3918的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成 miRNA-3918反义寡核苷酸(anti-miRNA-3918)，所述序列为： agtctccatctgcggccctgt。本实施例采用肺腺癌细胞系A549，购自北京协和细胞资源中心。

2、实验方法

2.1细胞培养

2.2细胞瞬时转染

2.3Transwell侵袭实验

(1)首先，将Matrigel置于4℃冰箱过夜融化；实验前，提前将实验所需的枪头、RPMI-1640培养基预冷；在超净台中，打开24孔Transwell板，冰上用冷的RPMI-1640培养基按照8：1的比例稀释Matrigel；而做侵袭实验的上室中加入100μl稀释好的Matrigel溶液，将板放入37℃、5％CO₂、湿度95％细胞培养箱中孵育4～5h。

(2)吸出上室残余液体，同时加入50μl无血清RPMI-1640培养基，将培养板置于细胞培养箱中孵育30min，以水化上室中的凝胶；取对数期生长状态良好的细胞消化离心，用无血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液，Typ血/球计数板计数并调整细胞浓度至4×10⁴个/ml；用镊子取出上室，在下室中加入500μl 温热的含20％FBS RPMI-1640培养基，放回上室(注意避免产生气泡)，并在上室内加入200μl细胞悬液，做好分组标记；将培养板37℃、5％CO2、湿度95％的培养箱中孵育24h。

(3)次日，取出Transwell板，用移液器小心吸尽上室内的液体，用预冷的PBS缓冲液小心清洗3遍；取一块新的24孔板，每孔加入500μl甲醇，放入上室室温固定30min后风干；在24孔板中加入500μl0.1％结晶紫染色，放入上室染色20min；用棉签小心轻轻擦去上室上层细胞，PBS漂洗3次；待小室自然风干后，用手术刀片沿着上室聚碳酸酯膜边缘游离出膜，细胞面朝上放于载玻片上，并封片过夜。

(4)将玻片放于光学显微镜下，400倍下随机选取5个视野观察细胞并统计细胞数，采集图像并保存。

3.实验结果

如图4所示，基于Transwell实验的结果显示，miRNA-3918抑制组 (anti-miRNA-3918)(42.47±5.31个/视野)较阴性对照组(88.45±4.3个/视野)和空白对照组(92.68±6.21个/视野)，细胞侵袭穿膜个数明细减少，提示抑制 miRNA-3918后A549细胞侵袭能力减弱。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种miRNA在制备非小细胞肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述miRNA为miRNA-3918，所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为：acagggccgcagauggagacu。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌为肺腺癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

4.一种检测miRNA的试剂在制备非小细胞肺癌检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品为试剂盒，所述miRNA为miRNA-3918，所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为：acagggccgcagauggagacu。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含所述试剂盒中包含检测miRNA-3918的引物、寡核苷酸探针或适配体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸探针或适配体被固定于固相载体上，被制备成检测芯片。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测miRNA-3918的引物的序列为：cagggccgcagatg和gtccagtttttttttttttttagtctc。

8.一种miRNA的抑制剂在制备抑制肺腺癌细胞增殖或侵袭的试剂中的用途，其特征在于，所述miRNA为miRNA-3918，所述miRNA-3918的成熟miRNA的序列为：acagggccgcagauggagacu。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为miRNA-3918的反义寡核苷酸片段，其序列为：agtctccatctgcggccctgt。

10.根据权利要10所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌细胞为A549细胞系。