KR101725025B1 - 무형성골질환 진단용 miRNA 마커 - Google Patents

Abstract

본원은 miR-3680 의 무형성골질환 진단용 마커, 이를 포함하는 조성물, 상기 바이오마커 또는 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 바이오마커 또는 조성물을 사용한 무형성골질환 진단방법을 개시한다. 본원에 따른 바이오마커는 기존에는 가능하지 않았던, 무형성골질환을 분자수준에서 조기에 간편하게 진단할 수 있음을 물론 미네랄뼈질환을 예측하거나 치료제의 약효 평가에 대한 지표로서 사용될 수 있다.

Description

무형성골질환 진단용 miRNA 마커 {miRNA biomarker of diagnosing adynamic bone disease}

만성신장병의 합병증으로 나타날 수 있는 무형성골질환을 검출과 관련된 miRNA 바이오마커 기술에 관한 것이다.

미네랄뼈질환(Mineral and bone disorder, MBD)은 만성신장병(chronic kidney disease, CKD)에서 칼슘과 인 등의 미네랄 조절불능의 지속으로 인한 부갑상선의 과자극으로 초래되는 보편적으로 발현되는 합병증이다. 미네랄뼈질환은 신장성 골형성증장애, 에리스로포이에틴 저항, 혈관성 석회화 그리고 심혈관계 질환 유발과 관련되어, 만성신부전의 투석단계 환자에서 질병 이환과 사망률을 증가시키는 강력한 요소 중의 하나로서 시기적절한 치료가 필수적이다(Go AS. et al., N Engl J Med. 2004;351(13):1296-305).

미네랄뼈질환은 골전환율에 따라 고교체군(high-turnover)과 저교체군(low-turnover)로 나눌 수 있으며, 고교체군은 섬유성 골염(osteitis fibrosa cystica), 저교체군은 무형성골질환(adynamic bone disease), 골연화증(osteomalacia)이 해당되며, 골조직검사에서 저교체군과 고교체군의 특성이 혼재되어 있는 혼합형도 존재한다(Martin KJ, et al., Journal of the american sociaety of nephrology 2007; 18: 875-885).

무형성골질환은 CKD로 인해 복막 또는 혈액투석환자에서 발병 빈도가 특히 높은 것으로 나타났다(Coen G, J Nephrol. 2005; 18(2):117-22). 특히 당뇨 환자에서 무형성골질환을 포함하는 저교체성 골질환의 발병이 높다는 보고가 있어 저교체성 골질환에 대한 주의가 요구된다(Pei Y, et al., Kidney Int 1993;44:159-164).

미네랄뼈질환은 PTH, 칼슘과 인, 비타민 D, FGF-23 등 많은 경로가 관여한다. 혈중 칼슘과 인 농도는 인체의 항상성 유지를 위하여 보상작용으로 정상농도범위로 맞추어지므로, 칼슘과 인 조절이 교란되어 있다는 것은 이미 심각한 질병상태에 이른 것을 의미하므로 만성 신장병 환자에서 현재 측정되고 있는 혈중칼슘과 인농도는 인체 항상성 유지의 보상작용으로 인하여 질병위험도 예측력에 한계가 있다(Craver L. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 2007;22:1171-1176). 만성신장병에 의한 칼슘과 인 조절의 교란은 만성콩팥병에서 미네랄뼈질환(CKD-MBD)와 나아가서 심혈관계 복합질환을 야기시키므로 칼슘과 인 조절 교란의 조기진단이 필요하다.

미네랄뼈질환을 진단하기 위해서는 생화학적 지표들, 영상적 방법들, 골밀도 검사 등 여러가지 방법들이 시도되고 있지만, 가장 정확한 진단 방법은 골생검을 통한 골조직 형태계측법으로 침습적인 방법이고, 비교적 덜 침습적인 방법인 골밀도 검사, 골 스캔, 그리고, 골대사와 관련된 다양한 혈액내 생화학적 지표들을 측정하여 골조직 형태학적 계측법과 상호 연관성을 밝히려는 연구가 시도되었다(Malluche H, et al., Kidney Int 1990;38:193-211).

일부 표지자들은 골조직 형태학적 계측법과 상호연관이 잘 되었으나, 아직 아무것도 골생검을 대신할만한 방법으로 인정받지 못하고 있다.

미국 특허 9,128,107은 만성신장병의 진행을 판단하는 바이오마커에 관한 것으로, ANP (Artrial Natriuretic Pepitde) 또는 ADM (Adrenomedullin)을 만성신장병 진단의 마커로 개시하고 있으나, 만성신장병으로 유래된 무형성골진환 진단 마커에 대하여는 전혀 개시하고 있지 않다.

미국 공개공보 2014-0080894은 개선된 분포를 갖는 올리고머에 관한 것으로 miR-3680을 유전자, RNA의 활성, 발현을 조절하여 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있으나, 이의 만성신장병은 물론 미네랄뼈질환, 무형성골질환의 진단, 또는 검출 용도에 관하여는 전혀개시하고 있지 않다.

이에 따라 무형성골질환의 진단이 가능한 새로운 바이오마커들의 개발이 요구되고 있으나, 무형성골진환을 검출할 수 있는 바이오마커는 개발되어 있지 않다.

이에 따라 무형성골진환의 분자수준에서의 진단이 가능한 miRNA 바이오마커를 제공하고자 한다.

본원에서는 무형성골질환의 분자진단 또는 발생위험도 예측이 가능한 miR 바이오마커로서, miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680을 제공한다.

이런 측면에서 본원은 miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680으로부터 선택되는 miR-3680 검출용 물질을 포함하는 무형성골진단용, 검출 또는 발생위험도 예측용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 바이오마커를 검출할 수 있는 시약은 miRNA의 정량적 또는 정성적 분석을 가능하게 하는 물질로서, 핵산 증폭에 사용되는 본원에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다.

다른 측면에서 본원은 또한 무형성골질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해서, 무형성골질환의 진단이 필요한 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및 상기 시료에서 miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680으로부터 선택되는 miR-3680 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하는, miR-3680 검출방법을 제공한다.

본원에 따른 방법은 미네랄뼈질환을 갖는 CKD(Chronic Kidney Disease) 환자 또는 미네랄뼈질환이 발생하지 않은 CKD 환자, 또는 CKD 질환이 없는 사람을 포함하는 비-무형성골질환 대조군과 비교하여 상기 바이오마커의 양이 감소한 경우, 상기 대상체를 무형성골질환으로 판정 또는 발생위험도가 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 따른 방법은 정량의 수단으로서 마이크로어레이, 비드 또는 나노입자를 포함하는 교잡 또는 실시간 또는 end-point RT-PCR을 포함하는 핵산증폭 방법으로 수행될 수 있으며, 이를 위한 검출용 시약으로서 본원에 따른 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브 및/또는 프라이머와 교잡 및 증폭에 필요한 효소 및 완충액 등이 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 전혈, 혈장 또는 혈청과 같은 손쉽게 수득할 수 있는 시료를 사용하여 편리할 뿐 아니라, 골생검, 골밀도 검사, 골 스캔, 또는 골대사와 관련된 혈액내 생화학적 지표와 같은 기존의 검사 방법과 함께 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 생화학적 지표로서, 특히 헤모글로빈 및/또는 인의 농도와 함께 사용될 수 있다.

본원은 miR-3680, 특히 miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680-5p의 무형성골질환 검출, 발생 위험 예측, 또는 진단용 마커, 이를 포함하는 조성물, 상기 바이오마커 또는 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 바이오마커 또는 조성물을 사용한 무형성골질환 검출, 발생 위험 예측 또는 진단방법을 개시한다. 본원에 따른 바이오마커는 기존에는 가능하지 않았던, 무형성골질환을 분자수준에서 조기에 간편하게 검출할 수 있음을 물론, 이러한 질환의 발생 위험도를 예측하거나 치료할 수 있는 치료제의 약효 평가에 대한 지표로서 활용되어 만성신장병에 의한 미네랄뼈질환의 치료효율을 증대시킬 수 있다. 이는 결과적으로 만성신장병 환자 치료에 있어서, 임상적 및 경제적 측면에서 향상을 가져올 수 있다.

도 1은 수집된 환자의 시료중 15명(150 pg/mL 이상 8명, 150 pg/mL 미만 7명)에 대하여 miRNA microarray로 분석하여 Benjamini-Hochberg 보정을 한 FDR방법으로 통계분석하여 volcano 플롯으로 나타낸 것이다(low (<150 pg/mL)와 high (≥150 pg/mL) iPTH levels인 환자에서 적색은 1.5배 이상 과발현된 miRNA, 청색은 1.5배 이상 저발현된 miRNA).
도 2는 본 발명의 miR-3680-5p의 발현량이 iPTH 농도 (<150 pg/mL (group 1)과

150 pg/mL (group 2))에서 유의성있게 차이가 나는 것을 나타낸 것이다.

본원은 만성신장병(chronic kidney disease, CKD) 환자에서 발생하는 신장성골형성장애(renal osteodystrophy)의 일종인 무형성골질환의 정확한 조기검출을 포함하는 진단을 가능하게 하는 바이오마커로 사용될 수 있는 miRNA와 같은 비코딩 RNA 마커의 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 miR-3680-5p의 무형성골질환 검출 또는 진단용 바이오마커에 관한 것이다.

무형성골질환은 만성신장병(chronic kidney disease, CKD) 환자에서 발생하는 신장성골형성장애(renal osteodystrophy) 또는 미네랄뼈질환(Mineral Bone Disorder)의 일종으로, 현재 생화학적 임상지표는 낮은 농도의 PTH(low intact parathyroid hormone) 및 낮은 골 알카라인 포스파타제 이며, 가장 정확한 진단 방법은 골생검을 통한 골조직 형태계측법으로 침습적인 방법으로, 혈액에서 검출할 수 있는 바이오마커는 본원에서 처음으로 규명된 것이다.

무형성골질환은 PTH의 과발현으로 인해 골형성(osteoanabolic)이 감소되며, CKD와 같은 요독증에서 골격계의 PTH에 대한 저항성으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다(Bover J. et al., Semin Nephrol. 2014 Nov;34(6):626-40). 본원에서는 CKD 환자를 PTH 농도 수준에 따라 분류하고, 그 결과 차별적으로 발현되는 miRNA를 분석한 결과 miR-3680이 무형성골질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하였다.

무형성골질환은 골전환율에 따라 다른 미네랄뼈질환과 구분될 수 있으며, 저 교체군에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "miR" “miRNA” 또는 "마이크로 RNA" 또는 “마이크로알엔에이”는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본원에 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스(http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 2016년 10월 현재 miRNA 데이터베이스(21판, miRBase)에 의하면 223개 종에서 유래한 35,828개의 성숙 miRNA가 등록되어 있다.

일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt(nucleotide) 길이의 stem-loop(일차(primary) miRNA 또는 pri-miRNA) 전구체로 전사된다. 이러한 pri-miRNA는 수 개의 miRNA 전구체(precursor)를 포함할 수 있으며, 효소의 작용에 의해 헤어핀 구조를 갖는 전구체 miRNA(pre-miRNAs)로 처리된다. 이어 pre-miRNA는 핵밖으로 이동하여 세포질에서 RNase 효소(Dicer)에 의해 헤어핀 구조가 잘린다. 이 과정에서 Dicer는 헤어핀의 3‘ 말단에 결합을 하여 3’과 5‘ 암(arm)을 연결하는 루프를 자르고 불안정한 형태의 이중가닥 miRNA가 형성되고, 궁극적으로 성숙한 miR-3p 및 miR-5p가 형성된다.

본원에 따른 miR-3680-5p는 상술한 바와 같이 헤어핀 구조를 갖는 pre-miRNA miR-3680의 5p 말단으로부터 유래하고, miR-3680-3p는 pre-miRNA miR-3680의 3p 말단으로부터 유래한다. 본원에서는 특히 miR-3680-5p가 무형성골질환 군에서 차별적으로 발현하는 것을 발견하였다. 본원에 따른 miR-3680 바이오마커는 성숙한 miR-3680-5p는 물론 이를 생산할 수 있는 전구체 pre-miR-3680를 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서, miR-3680에 포함되는 서열은 인간유래로 pre-miR-3680은 서열번호 1: 5’-AAAUUUAAGGAGGGACUCACUCACAGGAUUGUGCAAAUGC AAAGUUG GCUUUUGCAUGACCCUGGGAGUAGGUGCCUCCUUAAAUUU-3, 그리고 miR-3680-5p은 서열번호 2: 5’-GACUCACUCACAGGAUUGUGCA-3‘)로 표시되고, 서열번호 1에서 밑줄친 부분은 루프를 이루는 서열이다. pre-miR-3680은 루프를 기준으로 5p 및 3p를 서열을 모두 포함하며, 검출을 위해서, 후술하는 프로브 및/또는 프라이머가 사용되는 경우에는 5p를 특이적으로 인식하도록 디자인되는 것이 바람직하다. 5’-UUUUGCAUGACCCUGGGAGUAGG-3’로 표시되는 인간유래의 miR-3680-3p는 무형성골질환에서 차별적 발현을 하지 않는 것으로 나타났다.

본원에서 용어 “바이오마커” 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 무형성 골질환이 발생한 환자의 혈액을 비-무형성골질환 자 유래의 시료, 예를 들면 CKD - 미네랄뼈질환자 또는 CKD 환자이지만 미네랄뼈질환이 발생하지 하지 않은 환자, 또는 질환이 없는 정상 대조군과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 대조군에 비하여 질환이 발생한 환자 유래의 시료에서 감소 양상을 보이는 비코딩 핵산을 포함한다.

본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 질환의 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 정량적 및/또는 정성적 분석을 통해 miRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출되어 무형성골질환의 진단에 사용될 수 있다.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 miR-3680 검출용 시약 또는 물질을 포함하는 무형성골질환 진단용 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출용 시약 또는 물질은 상술한 바와 같이 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이를 검출할 수 있는 시약 또는 물질을 포함한다.

일 구현예에서 이러한 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함한다. 프로브는 주형으로서 단일가닥의 RNA 또는 DNA에 특이적으로 상보적으로 결합하며, 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3‘말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산분자를 일컫는 것으로, 이는 주형 또는 표적에의 특이적 결합에 의해, 표적의 정성 및/또는 정량적 측정을 가능하게 하며, 후술하는 바와 같이 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 또한 증폭된 산물의 검출을 위해 후술하는 바와 같이 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 miR-3680을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브는 특히 서열번호 1 또는 2와 같은 하나 이상의 서열에 상보적으로 결합하는 핵산분자이다. 또 다른 구현예에서는 서열번호 1 또는 2와 같은 하나 이상의 서열에 상보적으로 결합하는 길이 7 base 이상의 연속적 염기 서열을 갖는 핵산분자이다.

당업자라면, 본원 및 miRBase에 개시된 miR-3680의 서열을 참조하여, 본원에 따른 프로브가 사용되는 구체적 방법에 따라 적절한 프로브 서열을 선택할 수 있을 것이다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 검출용 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 상보적으로 결합하며, 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3‘말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 프라이머이다. 프라이머는 일반적으로 핵산 증폭 반응에서 표적 핵산의 증폭 대상의 부위의 양 말단 부근에 결합하도록 고안되며, 이는 주형(또는 표적)에 특이적으로 결합하여, 주형 또는 표적 물질의 정성 및/또는 정량적 분석을 가능하게 하며, 후술하는 바와 같이 다양한 방법에 사용될 수 있다. 또한 증폭된 산물의 검출을 위해 후술하는 바와 같이 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다.

당업자라면, 본원 및 miRBase에 개시된 miR-3680의 서열을 참조하여, 본원에 따른 프로브가 사용되는 구체적 방법에 따라 적절한 프라이머 서열을 선택할 수 있을 것이다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 검출용 물질은 본원에 개시된 miRNA 또는 이의 cRNA 또는 cDNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 프라이머 쌍을 포함하며, 이 경우 상기 프로브는 상기 프라이머 쌍의 사이에 위치한다.

본원에 따른 miR-3680을 검출할 수 있는 프로브 및/또는 프라이머는 공지된 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 구체적으로 사용되는 방법에 맞추어 다양한 시약이 본원에 따른 조성물에 또한 포함될 수 있다.

이러한 방법은 예를 들면 핵산 교잡, 중합, 증폭 방법 및 교잡기반 라이게이션 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

핵산 교잡은 핵산이 고상의 지지체, 예를 들면 비드, 나노입자 또는 바이오칩 어레이(마이크로에레이)에 결합된 형태로 또는 인시츄 교잡을 이용하여 수행될 수 있다. miRNA 마이크로어레이 기술은 동시에 다수의 miRNA의 분석을 가능하게 한다. 본원에 따른 miRNA에 상보적인 뉴클레오타이드는 코팅된 고상지지체에 스폿팅되거나 또는 인시츄 합성 방법으로 고상지지체에 스폿팅될 수 있다. 실시예에서 생물학적 시료로부터 분리된 miRNA는 상기 고상지지체 상의 상보적인 서열, 예를 들면 프로브와의 교잡 후에 효소반응에 의해 검출되는 표지(예를 들면 바이오틴, 형광염료)의 혼입에 의해 검출될 수 있다. 다른 실시예에서, 생물학적 시료에서 분리된 miRNA는 형광물질로 표지되어, 상응하는 서열과 결합하고, 그 결과 방출된 형광신호는 특정 miRNA의 존재를 나타낸다. 마이크로어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA.93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 이런 경우, 검출용 물질 또는 시약은 고상의 지지체에 결합된 형태로 제공될 수 있다. 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있으며, 후술하는 바를 참조할 수 있다.

본원에 따른 miRNA의 검출에는 핵산 중합 또는 증폭 방법이 또한 사용될 수 있으며, 특히 미량으로 존재하는 miRNA 검출에 적합하다. 공지된 다양한 핵산 증폭 또는 합성 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 역전사 반응, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 RT-PCR, PCR, 실시간 PCR, 정량 RT-PCR, 정량 PCR, NASBA(Nucleic Acid Sequence-Base Amplification), LCR(Ligase Chain Reaction), 다중 연결 프로브 증폭(Multiple ligatable probe amplification), Invader 기술(Third Wave), SDA(Strand Displacement Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), 및 Eberwine RNA 증폭 등을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

전형적인 PCR 방법은 특정 표적 서열의 증폭을 위해, 주형의 변성, 포워드 및 리버스 프라이머가 표적 서열에 결합하는 어닐링 및 열안정 중합효소에 의한 신장의 단계로 구성되는 3 단계가 여러 주기 예를 들면 통상 20회 이상이 수행된다. 대안적으로 어닐링 및 신장은 동일한 단계에서 수행되기도 한다. 성숙한 miRNA는 단일가닥이기 때문에, PCR 전에 역전사 반응이 먼저 수행될 수 있다. 역전사 반응에는 프라이머와 역전사 효소의 사용을 필요로 한다.

PCR 및 정량 PCR에서는 포워드 및 리버스의 한 세트의 프라이머 또는 상기 프라이머와 함께 프로브가 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머의 길이는 교잡온도, 표적 서열의 구성, 표적 서열의 복잡성 등과 같은 다양한 요소에 따라 결정된다. 예를 들면 프로브는 7 뉴클레오타이드 이상, 프라이머의 길이는 약 10 내지 35 뉴클레오타이드, 예를 들면 15, 20, 25, 30 또는 35 뉴클레오타이드이다. 포워드 프라이머는 바이오마커 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하며, 5’쪽에 비상보적 서열을 추가로 포함할 수 있다. 리버스 프라이머의 서열은 바이오마커의 서열과는 독립적일 수 있으며, 다수의 miRNA 바이오마커가 한 종류의 리버스 프라이머로 증폭될 수 있거나, 또는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.

증폭 산물은 증폭 과정에서 또는 증폭 후에 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP(single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE(HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서는 역전사 반응 후에 실시간 정량 PCR 방법, 즉 RT-PCR이 사용되며, 이는 검체의 RNA를 분리한 후, 이로부터 프라이머, 예를 들면 stem-loop를 형성할 수 있는 stem-loop 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 이를 주형으로 하여, 여기에, 포워드 및 리버스 프라이머, 또는 포워드 및 리버스 프라이머와 프로브의 조합을 사용하여 end-point로 또는 SYBR과 같은 핵산에 결합하는 염료를 사용하여 실시간으로, 또는 형광물질로 표지된 TaqMan 방식의 프로브를 사용한 stem-loop RT 기반의 핵산증폭방법이 사용된다. 이러한 방법은 예를 들면 Schmittgen, T.D. et al(2008) Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods 44, 31.8.; 및 Chen et al., Nucleic Acids Research, 33(20):e179, 2005 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 검출용 시약은 일 구현예에서, 상술한 stem-loop RT 기반의 핵산 증폭에 사용되며, cDNA 합성용 stem-loop 역전사 프라이머는 이로 제한하는 것은 아니나, 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT GCA CAA-3′(서열번호 3), 증폭용 프라이머는 포워드 프라이머로서 5′-CGC GCA GAC TCA CTC ACA-3′(서열번호 4) 및 리버스 프라이머로서 5’-AGT GCA GGG TCC GAG GT-3′(서열번호 5)와 같이 표시될 수 있다. 하지만 본원에 따른 프라이머는 이에 한정되는 것은 아니다. 본원은 처음으로 miR-3680이 무형성골질환의 검출 또는 진단에 유용한 마커로 사용될 수 있다는 것을 개시한 것으로, miR-3680을 검출할 수 있는 다양한 서열의 프라이머 및/또는 프로브가 사용될 수 있음은 명백한 것이다.

또한 교잡에 기반한 라이게이션 기술이 miRNA의 정량 분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어있으며, 예를 들면 OLA(oligonucleotide ligation) 및 예를 들면 미국공개공보 2006-0078894에 기재된 HARP-유사 프로브를 사용한 방법과 같은 표적 핵산 서열에 결합한 검출가능한 프로브를 결합하지 않은 프로브로부터 분리해내는 방법 등을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 라이게이션을 이용한 다른 기술은 MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)(Schouten et al., Nucleic Acids Research 30:e57 (2002))을 들 수 있다. 상기 기술은 한 쌍의 프로브가 표적서열에 나란히 결합한 경우에만 라이게이션이 일어나는 방식으로 결합하며, 라이게이션된 프로브는 PCR에 의해 증폭될 수 있도록 프라이머 결합부위를 포함한다.

상술한 바와 같은 교잡, 증폭 및/또는 교잡 기반 라이게이션 반응에서 표적의 염색 또는 표지, 프라이머 또는 프로브의 염색 또는 표지를 통해 교잡 또는 증폭된 miRNA 산물을 검출할 수 있다. 검출에는 당업계의 공지의 기술이 사용될 있으며, 당업자라면 검출의 민감도 및/또는 표적의 양을 고려하여 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 검출 방법의 민감도 및/또는 표적의 양에 따라 검출 전에 증폭이 필요하지 않을 수도 있다.

또한 miRNA는 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서 miRNA는 이에 결합된 검출가능한 표지로 표지되고 이어 비드와 같은 고상지지체에 연결된 프로브에 결합된 후 표지된 miRNA를 스크리닝하여 검출된다. 대안적으로 직접 검출에 표지된 프로브가 사용될 수 있으며, miRNA와 특이적 결합 후 표지된 프로브의 스크리닝을 통해 검출된다. 실시예에서는 증폭된 miRNA는 목적하는 핵산을 캡쳐할 수 있는 프로브와 컨쥬게이션된 비드를 이용하여 검출된다. 다른 실시예에서 프로브는 형광물질로 표지될 수 있다.

간접적 검출방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면 바이오티닐화 프로브를 스트렙타비딘 컨쥬게이트된 염료를 사용하여 결합된 핵산을 검출할 수 있다. 스트렙타비딘 분자는 증폭된 miRNA의 바이오틴 표지에 결합하며, 결합된 miRNA는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료에 의해 검출된다. 이러한 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 염료는 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 Phycolink(R) Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme)이 사용될 수 있다.

검출을 위한 표지자(label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다. 형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니다 플루오레신(예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민(예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진(예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료(예를 들면 미국특허 공개특허 10-2016-0022017 5,945,526) 및 사이아나인(예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPYR6G,BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다. 형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 실시예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein (“FAM”), TET, ROX, VICTM, 또는 JOE가 사용된다. 실시예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다.

또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. “DNA and RNA Structure” in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.

miRNA 정량은 또한 다음의 문헌을 참조하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 miRNA microarrays (Calin, G.A. et al.(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101,11755.60.), SYBR-based miRNA RT-qPCR assays (Sharbati-Tehrani et al.(2008) miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complexsample. BMC Mol Biol 9, 34.), BeadArray (Chen, J. et al. (2008) Highly sensitive and specific microRNA expression profiling using BeadArray technology. Nucleic Acids Res 36, e87.), Invader Assays (Allawi, H.T. et al.(2004) Quantitationof microRNAs using a modified Invader assay. RNA 10, 1153.61.), 및 Padlock probe-based assays (Jonstrup, S.P. et al.(2006) A microRNA detection system based on padlockprobes and rolling circle amplification. RNA 12, 1747.52.)를 참조할 수 있다.

또한 프라이머와 프로브를 사용한 RT-PCR 기반의 상용화된 키트를 사용할 수 있으며, 예를 들면 Stem-loop RT based TaqMan® MicroRNA Assays (ThermoFisher Scientific, USA)가 사용될 수 있다.

따라서 본원에 따른 조성물은 상술한 방법 중 어느 하나 이상의 방법에 사용되는 시약을 포함할 수 있다.

본원에 따른 바이오마커 또는 이를 포함하는 조성물은 무형성골질환의 진단, 재발 예측 및/또는 예후 측정 및/또는 약물 치료 후 반응성 예측에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이오마커 검출용 시약 또는 물질을 포함하는 무형성골질환 진단용 키트 또는 방법에 관한 것이다.

상기 키트에 포함될 수 있는 시약 및 이를 이용한 검출은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서, 키트는 핵산 증폭에 사용되며, 특히 RT-PCR을 이용한 증폭에 사용된다. 이 경우 키트는 RT-PCR의 반응에 필요한 프라이머 세트 및/또는 프로브, 완충액, 역전사 효소, Taq 폴리머라제를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서는 단일가닥 핵산을 제거할 수 있는 뉴클리아제를 추가로 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Tris-HCl, pH 9.0 완충액이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 역전사 효소 및 Taq 폴리머라제는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 폴리머라제로 hot start 반응이 가능한 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA)와 같은 것을 사용할 수 있으며, 적절한 농도 예를 들면 1.5mM 내지 2.5mM의 MgCl2가 포함될 수 있다.

본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 miRNA를 포함하지 않는 시료, 양성대조군은 검출대상 miRNA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

이런 측면에서 본원은 또한 무형성골질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 무형성 골질환이 의심되는 대상체, 또는 무형성골질환의 진단이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 miR-3680 바이오마커의 발현량을 측정하는 단계; 상기 측정 결과를 대조군의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 발현량에 변화가 있는 경우, 이를 무형성 골질환으로 판정하는 단계를 포함하는, miR-3680 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 방법이 구현되는 구체적 수단(방법) 및 검출용 시약 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.

본원에서 “생물학적 시료”란 생물유래의 장기, 조직, 세포 또는 체액을 일컫는 것이다. 생물학적 시료의 예로는 조직 절편, 전혈, 혈장, 혈청, 소변 또는 혈액 유래의 백혈구, 적혈구 또는 혈소판, 또는 조직 또는 세포 배양물을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 하나 이상의 상기 시료가 혼합되어 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 무형성골질환이 의심되는 환자로부터 통상의 시료 수득방법에 의해 대상체로부터 직접 수득한 것이거나 또는 종전에 분리되어 보관된 것일 수 있다. 본원에 따른 실시예에서는 전혈, 혈청 또는 혈장과 같은 혈액시료가 사용된다. 실시예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 실시예에서는 무형성 골질환이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 대상체에서 수득한 혈액이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 대상체는 질환에 걸린 것으로 의심되는 포유류, 질환에 걸린 후 치료가 되었으나 재발이 의심되는 포유류, 특히 인간을 포함한다.

본원에 따른 조성물은 생물학적 시료에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현량을 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 그 발현량의 감소, 변화 정도에 따라 무형성 골질환 진단 또는 재발 또는 발생위험도를 예측할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 대조군은 무형성골질환과 차별적 발현을 나타내는 시료로서, 비-무형성골질환자 유래의 시료가 사용된다. 비-무형성골질환자는 현재 보통 임상에서는 surrogate maker로 사용되는 iPTH를 기준으로 분류할 수 있다. (KDOQI 가이드라인; Barreto FC, et al. K/DOQI-recommended intact PTH levels do not prevent low-turnover bone disease in hemodialysis patients. Kidney Int. 2008;73(6):771-7. Cannata-Andia JB, et al. Osteoporosis and adynamic bone in chronic kidney disease. J Nephrol. 2013;26(1):73-80. Souberbielle JC, et al. Parathyroid hormone measurement in CKD. Kidney Int. 2010;77(2):93-100; Wang M, et al., Relationship between intact 1-84 parathyroid hormone and bone histomorphometric parameters in dialysis patients without aluminum toxicity. Am J Kidney Dis.1995;26(5):836-44.) 예를 들면 무형성골질환의 조기 진단을 위해, 무형성골질환이 아닌, 만성신장병 미네랄뼈질환 환자 유래의 시료, 또는 정상 대조군 환자의 시료, 이는 만성신장병 환자로서 본원에 따른 실시예를 참조하여 iPTH 농도, 골생검, 생화학적 검사로 결정할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 만성신장병 미네랄뼈질환 환자 유래의 시료와 비교하여 상기 바이오마커의 양의 감소한 경우, 상기 대상체를 무형성골질환으로 판정, 또는 발생위험도가 증가 또는 높은 것으로 판단한다.

본원에 따른 바이오마커는 기존의 마커 및/또는 진단방법등과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 골생검, 골밀도 검사, 골 스캔, 그리고, 골대사와 관련된 혈액내 생화학적 지표, 예를 들면 헤모글로빈, 인 농도가 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험대상와 검체의 수집 및 miRNA 추출

본 실험의 대상자는 서울대병원 내과에서 모집하였으며, 해당 기관에서 복막투석을 받는 환자를 대상으로 하였다. 본 연구의 프로토콜은 서울대학교병원의 생명윤리심의위원회에 의해 승인되었으며, 모든 환자의 정보는 고지된 서면동의 후 수집하였다. 2015년부터 2016년까지 복막투석을 받은 환자로 iPTH (intact parathyroid hormone) 농도가 150 pg/mL 미만인 환자군(low iPTH, 시험군)과 그 이상인 환자군(high iPTH, 대조군)으로 하였다. 모집된 환자의 인구학적 특성을 표 1에 기재하였다. iPTH 농도는 무형성골질환 판단의 중요한 기준으로 본 실시예에서는 KDOQI (Kidney Disease Outcomes Quality Initiative) 가이드라인과 다음의 문헌(Barreto FC, et al. ibid; Cannata-Andia JB, et al. ibid; Souberbielle JC, et al. ibid)을 참고하여 iPTH 농도를 기준으로 150 pg/mL 미만을 무형성골질환 환자 시료로 선별하여 사용하였다.

[표 1]

유전자 분석을 위한 혈액 검체는 52명의 신장이식 환자의 말초혈액으로부터 채혈하여 PAXGene Blood miRNA Kit (PreAnalytiX, Qiagen BD, Manchester, UK)를 제조자의 방법대로 이용하여 핵산을 추출하였다. 이어 Nanodrop^TM (Thermo Fisher Scientific, USA)와 Agilent 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 RNA 농도와 순도를 측정 후 80℃에 보관하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 분석을 이용한 miRNA 바이오마커 선별

수집된 환자의 시료중 15명(150 pg/mL 이상 8명, 150 pg/mL 미만 7명)에 대하여 miRCURY LNA microRNA Array kit (Exiqon, Vedbaek, Denmark)를 제조자의 방법대로 사용하여 발현량을 분석하였다. Benjamini-Hochberg 보정을 한 FDR방법으로 165개의 miRNA를 발굴하였다. Low (<150 pg/mL)과 high (≥150 pg/mL) iPTH 농도와 상관성있는 miRNA를 도 1에 나타난 바와 같이 Low (<150 pg/mL)과 high (≥150 pg/mL) iPTH 농도와 상관성있는 miRNA에 대한 volcano plot (적색: 1.5배 이상 과발현된 miRNAs, 청색: 1.5배 이상 저발현된 miRNAs)을 나타낸다. 그 결과 miR-548b-5p, miR-3680-5p, miR-1299가 두 그룹에서 차이가 유의적 차이가 있는 것으로 나타났다.

< 실시예 3> 임상시료에서 선별된 miRNA의 실시간 정량 PCR 분석

실시예 2에서 선별된 iPTH 농도 군에서 차이가 가장 큰 3개의 miRNA(miR-548b-5p, miR-3680-5p, miR-1299)에 대하여 TaqMan MicroRNA Assay (각 miR-548b-5p, miR-3680-5p, 및 miR-1299에 해당하는 ABI assay IDs 002408, 465029_mat and 241065_mat, Thermo Scientific, USA)을 제조자의 방법대로 사용하여 52명 혈액시료에서 RT-PCR을 이용한 miRNA 분석을 실시하였다. 구체적으로 384-well high-throughput analysis를 ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Life technology, USA)을 이용하여 실시하였다. 구체적으로 10 ng RNA sample, 50 nM stem-loop RT primer, 1 × RT buffer, and 0.25 mM of each dNTP, 3.33 U/μL MultiScribe reverse transcriptase, and 0.25 U/μL RNase Inhibitor (Thermo Scientific, USA)를 이용한 역전사반응으로 cDNA를 합성하였다. 이어 cDNA는 상기 키트에 포함된 프라이머 및 프로브를 사용하여 95도 10분 동안 변성하고, 95도 30초, 60도에서 1분으로 40 사이클을 돌려 증폭하고, ABI Prism 7900 Sequence Detection System로 신호는 실시간으로 수집하여 분석하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 Low (<150 pg/mL, group 1)과 high (≥150 pg/mL, group 2) iPTH 농도차이에는 miR-3680-5p만 유의한 상관성(P<0.05)이 있는 것으로 나타났으며, 이는 miR-3680-5p의 발현이 비-무형성골질환과 비교하여 감소한 경우, 위험도 예측 또는 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.

무형성골질환의 위험도에 영향을 미치는 임상적 인자에 대한 단변량 로지스틱분석에서 인, 헤모글로빈, miRNA-3680-5p가 iPTH의 농도와 상관성이 있는 것으로 나타났다. 또한 다변량 로지스틱분석에서 임상적 인자인 헤모글로빈과 miRNA-3680-5p이 iPTH의 농도와 상관성이 있었다(P<0.05)(표 2).

[표 2]

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 무형성골질환의 발생에 따라 개체의 miRNA-3680-5p의 발현량의 차이에 따라 달라지므로 이를 예측하여 만성신장병 환자에서 정기적인 모니터링을 통한 무형성 골질환의 조기 발견에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 치료제의 사용에 대한 약물반응효과를 평가할 수 있어 환자의 생존율을 향상시킬 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> miRNA biomarker of diagnosing adynamic bone disease <130> DP201610013 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 87 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(87) <223> pre-miR-3680 <400> 1 aaauuuaagg agggacucac ucacaggauu gugcaaaugc aaaguuggcu uuugcaugac 60 ccugggagua ggugccuccu uaaauuu 87 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> miR-3680-5p <400> 2 gacucacuca caggauugug ca 22 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem-loop primer for reverse transcription <400> 3 gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactgcaca a 51 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for detecting miR-3680 <400> 4 cgcgcagact cactcaca 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for detecting miR-3680 <400> 5 agtgcagggt ccgaggt 17

Claims (11)

1. miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680으로부터 선택되는 miR-3680 바이오마커 검출용 물질을 포함하는 무형성골진단용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 검출용 물질은 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머인, 무형성골진단용 조성물.
   
3. 무형성골질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해서,
   무형성골질환의 진단이 필요한 대상체 유래의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및
   상기 시료에서 miR-3680-5p 또는 pre-miR-3680으로부터 선택되는 miR-3680 바이오마커를 검출하는 단계를 포함하는, miR-3680 검출 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 방법은 상기 검출 결과, 비-무형성골질환 대조군과 비교하여 상기 바이오마커의 양이 감소한 경우, 상기 대상체를 무형성골질환으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 대조군은 미네랄뼈질환을 갖는 CKD(Chronic Kidney Disease) 환자 또는 미네랄뼈질환이 발생하지 않은 CKD 환자, 또는 CKD 질환이 없는 사람을 포함하는 것인, 방법.
   
6. 제 3 항에 있어서,
   상기 검출하는 단계는 혼성화 또는 핵산 증폭 방법에 의한 것인, 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 혼성화는 마이크로어레이, 비드 또는 나노입자를 이용한 분석이고, 상기 핵산 증폭은 정량 RT-PCR인, 방법.
   
8. 제 3 항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청인, 방법.
   
9. 제 3 항에 있어서,
   상기 방법은 골생검, 골밀도 검사, 골 스캔, 또는 골대사와 관련된 혈액내 생화학적 지표 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 혈액내 생화학적 지표는 헤모글로빈 또는 인의 농도 중 하나 이상의 지표인, 방법.
    
    
11. 삭제

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