CN108085316A - 一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞体外扩增的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞的体外扩增的方法。微小核糖核酸miR‑449a‑5p是一段长度为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其编码DNA序列位于小鼠13号染色体上。视网膜前体细胞是一类具有自我更新能力，并具有分化为视网膜神经元及神经胶质潜能的细胞。通过合成miR‑449a‑5p的反义链，利用碱基互补配对原则来实现干涉内源性miR‑449a‑5p的水平，可以有效的在体外促进视网膜前体细胞的扩增。由于视网膜前体细胞是成熟神经视网膜中感光细胞的发育来源，其有效的体外扩增方法可促进基于干/前体细胞移植的细胞疗法。

Description

一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞体外 扩增的方法

技术领域：

本发明属于干细胞应用领域，具体涉及一种miR-449a-5p抑制物序列可促进小鼠视网膜前体细胞在体外扩增。视网膜前体细胞在视网膜疾病的损伤修复中具有重要的应用潜能，因此本扩增方法可应用于各种视网膜损伤及变性模型的治疗研究。另由于小鼠与人源性miR-449a序列相同，该方式有望应用于人源性视网膜前体细胞体外扩增的尝试。

背景技术：

microRNA是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。参与转录后修饰，调控靶mRNA的表达。它可以通过促使mRNA的降解或阻止mRNA的翻译而下调蛋白的表达水平。

microRNA基因由RNA聚合酶II转录产生长的初级转录物(pri-miRNAs)，其形成发夹结构。然后，pri-miRNA由含有RNA酶III Drosha的蛋白质复合物处理，产生具有3'突出端的60-70个核苷酸的茎/环结构(pre-miRNAs)。进一步可以通过编辑过程对pre-miRNAs进行基础修饰。然后通过GTP依赖过程及Exportin-5的参与将pre-miRNAs输出到细胞质。在那里，pre-miRNAs被Dicer-TRBP复合物进一步处理产生21-24个核苷酸长度的miRNA双链体分子。最后，成熟的单链miRNA被加入到包含有Argonaute蛋白的RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中。

miRNA通过成熟miRNA的5'区域(称为种子序列)和靶标mRNA的3'UTR碱基部分配对结合，抑制对应靶蛋白的表达。已有研究表明，miRNA在干细胞生物学中扮演着重要角色，例如调控自我更新，增殖，分化等特性。此外，通过条件敲除调控miRNA成熟的Dicer酶，已经证实miRNA是调控神经视网膜发育的关键因素，影响着视网膜中各类细胞的功能。

视网膜前体细胞(retinal progenitor cells，RPCs)是一类具有分化为各型视网膜细胞潜能的未分化细胞，具有干细胞特征。RPCs不仅在视网膜发育中起重要作用，还有望移植入病变的视网膜来修复替代损伤的视细胞，从而达到治疗视网膜疾病的目的。视网膜退行性病变是一类以视网膜细胞损伤为主的疾病，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)及视网膜色素变性(RP)等，这类疾病往往预后不佳，缺少有效疗法。近年有多个研究组先后利用RPCs移植入视网膜退行性变模型中，发现植入组相较于对照组有更好的视力恢复及视网膜形态维持，包括感光细胞层的厚度及组织学特性等。但是，上述移植疗法面临的瓶颈问题主要是生物安全性，以及获取充足的RPCs数量。

RPCs来源于胚胎期视网膜，数量少，且存在取材上的伦理限制。因此，在体外建立有效的扩增RPCs的方法，将会有效的解决细胞移植的数量问题。鉴于前期研究揭示的miRNA对于视网膜发育的重要调控作用，我们尝试发现一种miRNA来特异促进RPCs的自我更新和增殖，实现有效的RPCs体外扩增。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种通过抑制微小核糖核酸miR-449a-5p可促进小鼠视网膜前体细胞(RPCs)的体外扩增的方法。通过将化学合成的具有抑制微小核糖核酸miR-449a-5p作用的核苷酸序列，经由脂质体介导转染入原代培养的RPCs中，来促进小鼠RPCs的体外生长。

本实施所述的抑制miR-449a-5p的核糖核苷酸序列促进RPCs扩增的特性包括：增强RPCs的自我更新能力，促进RPCs的增殖能力，以及降低RPCs的凋亡水平。

为达到上述目的，本发明的技术方案具体是这样实现的：

一种核糖核苷酸序列，其特征是：包含有与miR-449a-5p碱基序列No.1互补的抑制物No.2序列；

No.1碱基序列为uggcaguguauuguuagcuggu；

No.2碱基序列为accgucacauaacaaucgacca。

化学合成该抑制物序列后，利用脂质体转染试剂，转入视网膜前体细胞，可与细胞内源性miR-449a-5p结合并降低其含量。

通过抑制物结合来阻遏miR-449a-5p在视网膜前体细胞中发挥的生理功能，促进视网膜前体细胞在体外扩增。

一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞的体外扩增的方法，通过化学合成具有抑制微小核糖核酸miR-449a-5p作用的核苷酸序列，将该核苷酸序列经由脂质体介导转染入原代培养的RPCs中，来促进小鼠RPCs的体外生长。

所述核糖核苷酸序列用于增强体外培养的视网膜前体细胞的自我更新能力。

所述核糖核苷酸序列用于促进体外培养的视网膜前体细胞的增殖能力。

所述核糖核苷酸序列用于降低体外培养的视网膜前体细胞的凋亡比例。

有益效果：

通过合成miR-449a-5p的反义链，利用碱基互补配对原则来实现干涉内源性miR-449a-5p的水平，可以有效的在体外促进视网膜前体细胞的扩增。由于视网膜前体细胞是成熟神经视网膜中感光细胞的发育来源，其有效的体外扩增方法可促进基于干/前体细胞移植的细胞疗法，并有望应用于以感光细胞凋亡为主要表现的视网膜退行性病变，例如年龄相关性黄斑变性，色素性视网膜炎等。

附图说明：

图1、实施流程图，首先合成miR-449a-5p抑制物。通过转染将抑制物导入视网膜前体细胞，继而与miR-449a-5p结合降低其含量。通过干性增殖检测发现其促进视网膜前体细胞体外扩增的作用。

图2、克隆球(Sphere)形成实验，转入miR-449a-5p inhibitor(抑制物)后sphere数目较对照组增多，将miR-449a-5p mimic(模拟物)转入RPC后，sphere数目较对照减少(A)，统计结果(B)。(*P<0.05，n＝3)

图3、qRT-PCR检测Ki67mRNA含量。在转染miR-449a-5p inhibitor后收取RNA检测。发现抑制miR-449a-5p后，Ki67mRNA含量上升。(*P<0.05，n＝3)

图4、视网膜前体细胞Ki67染色。在转染miR-449a-5p inhibitor后进行Ki67染色。红色信号为Ki67阳性细胞，蓝色为hoechst染细胞核(A)。统计结果显示，抑制组Ki67阳性细胞比例较对照组多(B)。(*P<0.05，n＝4)

图5、视网膜前体细胞TUNEL染色。在转染miR-449a-5p inhibitor后进行TUNEL染色。红色信号为TUNEL阳性细胞，蓝色为hoechst染细胞核(A)。统计结果显示，抑制组TUNEL阳性细胞比例较对照组少(B)。(**P<0.01，n＝4)

图6、qRT-PCR检测干性标志物mRNA含量。在转染miR-449a-5p inhibitor后收取RNA检测。发现抑制miR-449a-5P后，Pax6，Chx10，CD133，Nestin，Sox2等mRNA含量上升。(*P<0.05，**P<0.01，n＝3)

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1.原代培养过程：准备孕17.5天的C57孕鼠，剖出胎鼠，将胎鼠移入超净台中，放置在无菌PBS溶液中。在显微镜下，剥离胎鼠眼球，将眼球放入预先准备好的PBS液滴中。用眼科镊将收集的眼球撕开，取出视网膜组织放入新鲜的PBS液滴中。收集视网膜组织于1.5ml离心管中。800rpm/min离心5min后，弃上清液。加入含有EDTA的胰蛋白酶消化液，37℃消化10min，加入Neurobasal培养液终止消化。1300rpm/min转速离心5min后，弃上清液。使用Neurobasal完全培养液重悬细胞沉淀，并铺于细胞培养皿中。在Neurobasal培养液中加入2％体积的B27，1％体积N-2，1％体积青-链霉素双抗，1％体积L-Glu及终浓度为5ug/ml的肝素，20ng/ml的EGF，20ng/ml的bFGF来配制Neurobasal增殖培养液。

2.化学合成抑制微小核糖核酸miR-449a-5p的化合物(抑制物No.2序列)。

3.脂质体转染过程：将RPCs消化散单后铺于细胞皿中，每24孔板孔中铺入40×10⁴细胞。通过LTX及PLUS助转系统，将阴性对照(negative control，NC)及miR-449ainhibitor转入细胞内。在24孔板每孔中转染，将1.5ul LTX，1.5ul PLUS与100ul opti-MEM混合加入1.5ml离心管中，静置5min。将1.5ul NC或1.5ul miR-449a inhibitor加入离心管中混合，静置10min。随后用opti-MEM换液，每孔弃除原培养液，并加入300ul opti-MEM。最后将混合液均匀加入培养孔中，6h后换液。所有离心管，枪头及培养液都无RNA酶沾染。

4.RPCs克隆球形成实验：RPC培养5天后，转染miR-449a inhibitor，与对照NC。转染24h后，做sphere形成实验。将消化成单细胞的RPC计数后，铺于低粘附24孔板中，每孔铺4000个细胞。在增殖培养液中生长5天后，计数sphere数目。(图2)

5.检测RPC的增殖能力

5.1qPCR检测：RPC增殖培养液中培养5天后，分别转染miR-449a inhibitor和NC，在48h后收集细胞，提总RNA。反转录为cDNA，qRT-PCR检测增殖分子Ki67表达量。(图3)

5.2Ki67染色计数：RPC增殖培养液中培养5天后，分别转染miR-449a inhibitor和NC，48h后对RPC进行免疫细胞荧光染色。预先在24孔板中加入玻片，包被多聚赖氨酸，将消化的单细胞铺于玻片。待细胞爬片后，4％PFA固定。孵育抗Ki67抗体，后用荧光二抗孵育。Hoechst染核后75％甘油封片。荧光显微镜拍照后计数Ki67阳性细胞比例。(图4)

6.Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling(TUNEL)检测RPC凋亡水平：RPC增殖培养液中培养5天后，分别转染miR-449ainhibitor和NC，48h后对RPC进行TUNEL染色。预先在24孔板中加入玻片，包被多聚赖氨酸，将消化的单细胞铺于玻片。待细胞爬片后，4％PFA固定，0.1％Triton-X-100与0.1％柠檬酸三钠水溶液孵育20min。每孔加入1x terminal transferase buffer 200ul，再加入2ulterminal deoxynuleotidyl transferase recombinant和2ul biotin-16-dUTP。37℃孵育1h。PBS洗涤后孵育Avidin-cy3溶液1h。Hoechst染核后75％甘油封片。荧光显微镜拍照后计数TUNEL阳性细胞比例。(图5)

7.qPCR检测干性标志物水平：RPC增殖培养液中培养5天后，分别转染miR-449ainhibitor和NC，在48h后收集细胞，提总RNA。反转录为cDNA，qRT-PCR检测增殖分子Pax6，Chx10，CD133，Nestin，Sox2表达量。(图6)

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明使用较佳实施例展示如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内，利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例；但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种核糖核苷酸序列，其特征是：包含有与miR-449a-5p碱基序列No.1互补的抑制物No.2序列；

No.1碱基序列为uggcaguguauuguuagcuggu；

No.2碱基序列为accgucacauaacaaucgacca。

2.根据权利要求1所述的一种核糖核苷酸序列，其特征是：化学合成该抑制物序列后，利用脂质体转染试剂，转入视网膜前体细胞，可与细胞内源性miR-449a-5p结合并降低其含量。

3.根据权利要求1所述核糖核苷酸序列的促进小鼠视网膜前体细胞的体外扩增的方法，其特征是：通过抑制物结合来阻遏miR-449a-5p在视网膜前体细胞中发挥的生理功能，促进视网膜前体细胞在体外扩增。

4.一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞的体外扩增的方法，其特征是：通过化学合成具有抑制微小核糖核酸miR-449a-5p作用的核苷酸序列，将该核苷酸序列经由脂质体介导转染入原代培养的视网膜前体细胞中，来促进小鼠视网膜前体细胞的体外生长。

5.根据权利要求1所述的一种核糖核苷酸序列的用途，其特征是：所述核糖核苷酸序列用于增强体外培养的视网膜前体细胞的自我更新能力。

6.根据权利要求1所述的一种核糖核苷酸序列的用途，其特征是：所述核糖核苷酸序列用于促进体外培养的视网膜前体细胞的增殖能力。

7.根据权利要求1所述的一种核糖核苷酸序列的用途，其特征是：所述核糖核苷酸序列用于降低体外培养的视网膜前体细胞的凋亡比例。