CN105886661B - 子宫内膜癌的诊疗标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了子宫内膜癌的诊疗标记物，该标记物是miRNA‑3170。本发明通过QPCR证明了miRNA‑3170与子宫内膜癌的发生发展相关，同时本发明通过细胞增殖实验和细胞凋亡实验证明了抑制miRNA‑3170的表达可以抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡，从而为子宫内膜癌的靶向治疗提供了理论依据，可以指导新药的研发。

Description

子宫内膜癌的诊疗标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及子宫内膜癌的诊疗标记物，具体的该标记物为miRNA-3170。

背景技术

子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，在西方发达国家其发病率居女性生殖器官恶性肿瘤的首位，在我国，也仅次于子宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位，近年来其发病率呈上升趋势且出现年轻化趋势。子宫内膜癌的发生有比较严格的演变过程，如果在其癌前病变(如不典型性增生)期给予干预，可能会减少子宫内膜癌的发病率，因此寻找能够诊断恶性肿瘤的肿瘤标志物显的尤其重要。雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)在子宫内膜癌的发生、发展中起重要作用几乎是公认的，并且与子宫内膜癌患者的预后有关，因此可以通过测定ER，PR的表达联合肿瘤标志物的检测来协助子宫内膜癌的诊断和预后评估。

子宫内膜癌的病因和发病机制尚不明确，目前研究认为，其发生可能与长期的雌激素刺激，尤其是无孕激素拮抗的持续雌激素刺激或者肥胖、高血压、糖尿病、不孕等因素有关。现代肿瘤学认为，癌症是由遗传基因发生突变和基因表观遗传性的改变引起的。近年来研究发现，基因异常如基因表达多态性仍不足以完全解释子宫内膜癌的发生。有学者认为，CpG岛甲基化异常所导致的miRNA表达谱异常可能参与子宫内膜癌的发生。正常情况下，CpG岛以非甲基化的形式存在于基因的启动子内，异常的甲基化(过高或过低)，可引起一些抑癌基因失活或原癌基因过度激活，使正向和/或负向肿瘤调控机制紊乱，导致肿瘤的发生。

近年来研究表明，在子宫内膜癌发生发展的不同阶段miRNA表达谱明显异常，开拓了对子宫内膜癌研究的另一新的领地。据文献报道，现发现人类的miRNA已超过1000多种，调控着大约30％的人类基因。也有研究发现，约50％的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点，甲基化、基因组的丢失或扩增等可均导致miRNA在人类肿瘤中表达谱的异常，许多miRNA亦直接表现为一种原癌基因或抑癌基因的作用，调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡，参与肿瘤的生成、发展和侵袭转移。

寻找与子宫内膜癌相关的miRNA标记物在临床上具有重要的诊断和治疗价值，目前关于miRNA在子宫内膜癌中的差异性表达研究较少，提供一种有效的分子标记物对于实现疾病的精准治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种miRNA诊疗标记物，该诊治标志物为miRNA-3170。

本发明的目的之二，提供一种诊断产品，实现子宫内膜癌的早期诊断。

本发明的目的之三，提供一种治疗手段和治疗药物，实现子宫内膜癌的精准医疗和病人的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA在制备诊断子宫内膜癌的产品中的应用，所述miRNA为miRNA-3170。

进一步，所述产品通过测定miRNA-3170或其同源物的表达水平来诊断子宫内膜癌。

进一步，所述产品包括通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-3170或其同源物的水平以诊断子宫内膜癌的产品。miRNA-3170或其同源物在子宫内膜癌组织中呈高表达，当患者子宫内膜组织中的miRNA-3170显著升高时，可以判断患者患子宫内膜癌。

本发明提供了一种诊断子宫内膜癌的产品，所述产品能够通过检测miRNA-3170或其同源物的水平来诊断子宫内膜癌。

进一步，所述产品包括芯片、阵列或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述的miRNA-3170的部分或全部序列。所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-3170的表达水平的试剂。

进一步，所述检测miRNA-3170表达水平的试剂包括针对miRNA-3170的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断子宫内膜癌miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断子宫内膜癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本发明提供了miRNA-3170在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用。

进一步，所述药物包含miRNA-3170或其同源物的抑制剂。

进一步，所述miRNA-3170的抑制剂是miRNA-3170或其同源物的反义寡核苷酸或拮抗剂。根据miRNA-3170序列设计出它的特异性反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调miRNA-3170的表达。反义miRNA可包括总计5-100或10-60个核苷酸。反义miRNA还可包括总计为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。优选的，反义miRNA的序列可包括(a)至少5个与miRNA 5′端完全相同的核苷酸以及至少5-12个与所述miRNA 5′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸，或(b)至少5-12个与所述miRNA 3′端靶位点的侧翼区完全互补的核苷酸

根据miRNA-3170序列设计出它的拮抗剂，拮抗剂是经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA，将拮抗剂转移到人体后，能够高效阻断miRNA-3170的表达，下调miRNA-3170表达水平。

本发明提供了一种治疗子宫内膜癌的药物，所述药物包括包含miRNA-3170或其同源物的抑制剂。所述的miRNA-3170抑制剂能够抑制miRNA-3170的表达或者能够抑制miRNA-3170的功能。所述miRNA-3170抑制剂的抑制靶标不限于miRNA-3170本身，还包括miRNA-3170的上下游，例如：编码miRNA-3170的基因组序列，miRNA-3170靶基因、调控miRNA-3170的蛋白或者基因。

进一步，miRNA-3170抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。优选的，所述抑制剂是miRNA-3170或其同源物的反义寡核苷酸或拮抗剂。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。对于固体药物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服给药的固体药物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miRNA-3170基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01％-20％、优选按重量计算1％-10％的至miRNA-3170基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。当需要时也可包含载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。

本发明的药物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。组合物包含至少一种miRNA-3170基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和至少一种化疗剂。适用于本发明的方法的化疗剂，包括但不限于，DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。本发明的组合物试剂包括但不限于，阿糖胞苷、甲氨喋呤、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、顺铂、地塞米松、环磷酰胺、沙可来新、甲基亚硝基脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、长春碱、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利铂、伊立替康、托泊替康、亚叶酸、卡莫司汀、链佐星，CPT-11、泰素、他莫昔芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶、伊马替尼、氟达拉滨、多西他赛。

在本发明的具体实施方式中，所述miRNA-3170是成熟miRNA-3170，核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示。

应当知道，本发明的miRNA-3170包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与子宫内膜癌发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。其显示完整miRNA-3170核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-3170功能的条件下，对miRNA-3170进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miRNA-3170核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-3170主要呈单链形式，而miRNA-3170前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

根据SEQ ID NO.1所示的核酸序列，可以生成用于给定miRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于，与目标miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素3H、32P、33P、14C或35S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。

通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miRNA基因转录产物水平的精确测量。

本发明所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断子宫内膜癌的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断子宫内膜癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断子宫内膜癌miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断子宫内膜癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明的miRNA-3170可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-3170的DNA片段的载体转染细胞获得。本发明的可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

可以表达miRNA-3170的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-3170在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-3170初始miRNA的位置，在miRNA-3170初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-3170的DNA片段。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。

可通过适合将本发明所述药物递送至受试者的癌细胞的任何方法对受试者施用抑制miRNA-3170表达的化合物。例如，可通过适合于用这些化合物或用包含编码这些化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用抑制miRNA-3170表达的化合物。优选的，用包含抑制miRNA-3170基因表达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。

用于真核细胞的转染方法在本领域内熟知，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、粒子加速，磷酸钙沉淀和通过病毒载体介导的转染。

可通过任何合适的肠内或胃肠外给药途径对受试者施用抑制miRNA-3170表达的化合物。用于本方法的合适的肠内给药途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合适的胃肠外给药途径包括例如血管内给药(如至脉管系统的静脉内快速注射、静脉输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和导管滴注)、组织外周和组织内注射(如瘤周和瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)、皮下注射或沉积、对目的组织的直接施用如通过导管或其它安装装置(如视网膜弹丸剂或栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入体)以及吸入。优选的给药途径是注射、输注和直接至肿瘤的注射。

本发明所述药物可以单独施用或者与其他能够抑制子宫内膜癌的药物进行组合施用。施用有效量的miRNA-3170基因产物或其分离的变体或生物活性片段，以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。

miRNA基因产物的“生物活性片段”是指，具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，子宫内膜癌的细胞增殖过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体的实施方案中，可将分离的miRNA基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗包括但不限于，化学疗法、放射疗法以及组合(例如，放化疗)。

在本发明中，可将miRNA-3170基因产物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miRNA-3170基因产物的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。miRNA-3170基因产物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于递送此类质粒和载体至癌细胞的技术是本领域众所周知的。

脂质体用于将miRNA-3170基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。还可对用于脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有500至约40000道尔顿和优选约20000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺；聚丙烯酸；多元醇如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂。此外调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸如半乳糖醛酸、葡萄醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖；羧化多糖或低聚糖如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选的，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。

本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miRNA-3170基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miRNA基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。

在本发明中，术语“miRNA基因产物”可以是任何从miRNA基因转录得到的产物，包括初级转录产物、初级miRNA、pre-miRNA、miRNA*或成熟miRNA。

在本发明中，术语“治疗”是指改善与疾病或病症例如实体癌相关的症状，包括抑制作用，在一定程度上抑制疾病进展，其包括减缓以及完全抑制；减少疾病发作和/或症状的数量；减少病灶尺寸；抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病细胞渗透到相邻的周边器官和/或组织；抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病传播；在一定程度上缓解与疾病相关联的一种或多种症状；治疗后增加无病表现的时间长度；在治疗后的给定时间点减少死亡率；和/或治疗后无副作用。

术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。优选的，动物为人。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了一种子宫内膜癌的诊疗标记物-miRNA-3170，通过检测标记物或其同源物的水平，可以判断受试者是否患有子宫内膜癌。

本发明提供了一种诊断子宫内膜癌的产品，为子宫内膜癌早期诊断的实现提供了可能性。

本发明提供了miRNA-3170可以作为子宫内膜癌的诊治靶标，指导相关药物的研发。

附图说明

图1显示利用QPCR检测miRNA-3170在子宫内膜癌组织中的表达情况；

图2显示miRNA-3170抑制剂对子宫内膜癌细胞中miRNA-3170表达的抑制作用；

图3显示CCK8实验检测miRNA-3170对子宫内膜癌细胞增殖的影响

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1与子宫内膜癌相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集10例正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、样本总RNA的提取

使用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提前总RNA。具体步骤如下：

1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；

2)将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中；

3)加入300μl Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；

4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管中；

5)加入600μl RNase-Free Water，用漩涡器混匀；

6)加入20μl蛋白酶K，在55℃水浴锅中温浴15min，不断涡旋混匀；

7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5ml的离心管中；

8)加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀；

9)取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；弃下层，将柱子重新置于收集管中；

10)依照裂解液的容量，重复步骤9)；

11)加入400μl Wash solution，14000g离心2min；弃下层，将柱置于一新的收集管中；

12)加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min，将收集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min；

13)加入400μl Wash solution，14000g离心1min，弃下层，将柱子重新置于收集管中；

14)加入400μl Wash solution，14000g离心2min，弃收集管，把柱子放入1.7mlElution管中；

15)加入30μl Elution Buffer，200g离心2min，使溶液充分与柱结合；

16)14000g离心1min，将RNA使用无RNA去离子水溶解，待用。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

4、miRNA的提取和标记

1)用Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提获得miRNA，具体操作按照相应说明书。样品用T4 RNA连接酶标记步骤依照Thomson的方法。miRNA标记方法大致如下：1.4μg miRNA和500ng 5’-磷酸盐-胞嘧啶-尿嘧啶cy3-3’(Dharmacon，Chicago，USA)及2单位T4 RNAligase(NEB，Ipswich，USA)，于4℃孵育2小时。每份miRNA样品均设等量的相应阴性对照。

2)标记的RNA用0.3M醋酸钠和2.5倍体积的乙醇进行沉淀，再用15μl含3×SSC、0.2％SDS和15％甲酰胺的杂交液重悬，所有的杂交重复两次，杂交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保证杂交液在芯片和盖片之间均匀流动。

3)将杂交室放在杂交仪BioMixerTMII上(CapitalBio Corp，Beijing，China)于42℃水浴过夜，用洗液洗两遍。

5、miRNA芯片操作：

miRNA芯片，采用博奥生物有限公司的miRNA表达谱芯片(单通道芯片)，按照说明书的指示进行miRNA表达谱的检测。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-3170在子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织中，与正常子宫内膜组织相比，miRNA-3170的水平显著升高。

实施例2 QPCR验证差异表达的miRNA-3170

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-3170进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择子宫内膜癌组织本和正常子宫内膜组织样本各60例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。

2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。

3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。

4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miRNA-3170的引物

正向引物：CTGGGGTTCTGAGACAGACAGT(SEQ ID NO.2)

反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)

扩增U6 snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO.4)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.5)

2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

	体积
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
正向引物	1μl
		反向引物	1μl
cDNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.5μl
总体积	25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以U6snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与正常子宫内膜组织样本相比，子宫内膜癌组织中miRNA-3170的表达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。

实施例3 QPCR检测子宫内膜癌细胞中miRNA-3170的表达

1、miRNA-3170质粒的扩增及鉴定

1)根据miRNA-3170的序列信息由大连宝生物生物技术有限公司设计合成miRNA-3170抑制剂质粒和随机对照序列的阴性对照质粒。

2)质粒转化DH5α感受态菌株

①-80℃冰箱取出DH5α感受态细菌100μl于冰上融化；

②将10μl pMKITeno质粒加入100μl DH5α感受态菌液，轻弹、旋转管底混匀，冰浴放置30min；

③置于42℃水浴热休克90s后立即冰浴90s；

④加Amp-LB培养液800μl，轻轻吹打混匀，于37℃恒温摇床，100rpm振荡孵育1h，使细菌复苏；

⑤将复苏后的菌液于4℃，3000rpm离心10min；

⑥吸弃上清，使管中剩余约100μl液体，轻轻吹打混匀后将其涂于Amp-LB琼脂平板；

⑦待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37℃培养箱培养16h。

3)筛选阳性菌落

经16h孵育，固体培养基长出白色菌落。取消毒离心管8支，用消毒牙签小心挑取白色菌落8株，吸管吸取Amp-LB液体培养基，分别将其冲入相应试管，加培养液至5ml。置37℃恒温摇床，以200rpm振荡培养12h，取适量培养物送华大基因进行基因测序。

4)提取阳性菌液质粒(OMEGA公司质粒中量提取试剂盒)，按照试剂盒的说明书进行提取。

5)质粒浓度的测定

将提取的阳性菌液的质粒应用微型全波长分光光度计进行浓度的测定。

2、细胞培养

将Ishikawa细胞常规培养于含10％胎牛血清的RRMI 1640培养基中，于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。

3、细胞转染

将Ishikawa细胞分为四组，实验组即转染miRNA-3170抑制剂组，阴性对照组即转染随机对照序列组，脂质体对照组即转染LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂组，空白对照组即不转染组。运用转染试剂LipofectamineTM 2000进行转染，转染方法参照说明书。对照组和实验组组的工作浓度均为5μM。转染后48h收集各组细胞用于后续实验。

4、QPCR实验

1)细胞总RNA提取：利用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，按照说明书指示进行。

2)QPCR：步骤同实施例2。

结果如图2所示，与对照组相比，实验组的miRNA-3170的表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述表明miRNA-3170抑制剂能够有效抑制miRNA-3170的表达，

实施例4 CCK-8法检测miRNA-3170对细胞增殖的影响

细胞培养和转染按照实施例3

1、转染48h后，收集Ishikawa细胞：细胞计数后，每组细胞配成浓度为2×10⁴个/ml细胞悬液；

2、96孔板每孔0.1ml，每组细胞设6个复孔，重复铺5块96孔板，边缘孔加0.1ml无菌水或PBS；

3、细胞贴壁后，连续测第24h、48h、72h、96h时间点：加CCK-8，每孔10μl，37℃孵育4h，450nm波长测OD值，记录各组OD平均值，根据平均值画出生长曲线。

4、结果

结果如图3所示，与对照组相比，实验组Ishikawa细胞的生长速度明显低于对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明miRNA-3170的表达有利于子宫内膜癌细胞的增殖，通过下调miRNA-3170的表达可以抑制子宫内膜癌细胞的生长。

实施例5流式细胞术检测细胞凋亡

1、细胞培养 步骤同实施例3。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、步骤

1)收集转染48h后的子宫内膜癌细胞，用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞，2000rpm离心5min，弃培养基。

2)用冷PBS洗涤细胞两次，2000rpm离心5min收集细胞。

3)在50μl的Binding Buffer中加入5μl7-AAD染液，混匀。

4)在收集的细胞中加入上述7-ADD染液混匀；室温、避光、反应15min。

5)反应后再加入450μl的Binding Buffer混匀；加入1μlAnnexin V-PE混匀，室温、避光反应15min。

6)流式细胞仪检测，每组实验重复3次，计算细胞凋亡比率。

4、结果

实验组的细胞凋亡率为(15.32±0.011)％，空白对照组的细胞凋亡率为(0.56±0.03)％，转染试剂组的细胞凋亡率为(0.62±0.11)％，阴性对照组的细胞凋亡率为(0.61±0.02)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，miRNA-3170的表达不利于子宫内膜癌的存活，通过促进miRNA-3170的表达可以促进子宫内膜癌细胞的凋亡。

实施例6细胞侵袭实验

1、细胞培养 步骤同实施例3。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、细胞侵袭实验

(1)包被基底膜：用含0.5％FBS的DMEM培养液按1:6稀释50mg/L Matrigel，取60μl包被Transwell小室底部膜的上室面，放37℃、5％CO₂培养箱孵育4h，弃掉上清。

(2)将子宫内膜癌细胞Ishikawa培养至24h，去掉完全培养基，以5％FBS培养基继续培养24h。

(3)倒掉培养液，用3ml D-Hank’s solution洗涤细胞两次。

(4)加1ml Trypsin-EDTA solution，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3-5min。

(5)在加入2ml含5％FBS的MEM/DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。计数，将细胞稀释至3×10⁵细胞/ml。

(6)按1×10³细胞/孔的浓度接种于transwell小室，下室加入血清浓度为15％的培养液700μl，37℃、5％CO₂培养48h。

(7)取出小室，PBS洗一次。加入预冷的甲醇，-20℃固定10min。

(8)弃净甲醇，PBS清洗。在PBS中用棉签轻轻刮去小室上表面的Matrigel胶，用PBS洗上面3次。拿出小室倒置，风干。

(9)将小室放入一新的24孔中，加入200μl 0.1％结晶紫，使膜浸没，37℃染色30min。

(10)用ddH2O洗3次。小室风干后，放入孔中，倒置显微镜下取适当视野，高倍镜下拍照计数，计算视野的细胞平均数以代表细胞侵袭力，每组实验重复3次。

4、数据分析

应用SPSS16.0统计软件进行数据处理，计量采用±标准差表示，样本均数的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；方差不齐则采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

5、结果

实验结果如表2所示，对照组之间细胞穿膜数差别无统计学意义(P>0.05)，实验组同对照组相比，细胞穿膜数明显减少，差别具有统计学意义(P<0.05)。

表2 Ishikawa细胞穿膜数

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.miRNA在制备诊断子宫内膜癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为miRNA-3170。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过测定miRNA-3170的表达水平来诊断子宫内膜癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒选自通过使用qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测miRNA-3170的水平以诊断子宫内膜癌的试剂盒。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括针对miRNA-3170的引物和/或探针。

5.miRNA-3170在制备治疗子宫内膜癌药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包含miRNA-3170的抑制剂。