CN109593860A - Tmsb10在诊治胶质瘤中的应用 - Google Patents

Tmsb10在诊治胶质瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供TMSB10在诊治胶质瘤中的应用。具体的，经研究发现，TMSB10表达随胶质瘤恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。U87MG和U251细胞系中TMSB10沉默抑制增殖、侵袭和迁移(MMP‑9和N‑Cadherin)；诱导细胞凋亡(Bcl‑2和Bax)；通过PI3K‑AKT/ERK信号通路(PI3K、p‑AKT、p‑ERK)抑制体外细胞周期(p21、CDK4、cyclin D1)；降低体内致瘤性。表明TMSB10是一种参与胶质瘤发生发展的致癌基因，可作为胶质瘤的生物标记物和治疗靶点。

Description

TMSB10在诊治胶质瘤中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及TMSB10在诊治胶质瘤中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
神经胶质瘤是最常见的原发中枢神经系统(CNS)性恶性肿瘤，全世界每年约有21万人被诊断为胶质瘤，5年生存率低于10％。根据其来源和世界卫生组织定义，胶质瘤有三种类型，包括星形细胞瘤(星形细胞瘤分级I级、II级)、III级(间变性星形细胞瘤)和IV级(GBM)。由于胶质瘤的细胞增殖和侵袭不受控制的特点，尽管在安全切除、放疗和化疗方面取得了进展，但剩余的胶质瘤细胞一般会继续生长并产生耐药性。同时，由于对胶质瘤发生发展的分子机制认识不足，对胶质瘤患者的治疗效果不理想。因此，更好地了解介导胶质瘤发生发展的关键分子机制，将有助于开发新的、有效的治疗方法。
胸腺素，最初是从胸腺中识别出来的，是胸腺素的亚科。胸腺素家族主要包括胸腺素-4(TMSB4)、胸腺素-10(TMSB10)和胸腺素-15(TMSB15)，并作为肌动蛋白隔离蛋白，抑制肌动蛋白聚合，破坏F-actin10的形成。TMSB10是β-thymosin家族的一员，这是广泛分布在许多组织，展示了生物活动作为一个肌动蛋白隔离motility蛋白参与细胞。TMSB10主要定位于细胞质，与肌动蛋白(肌动蛋白单体)有很高的亲和力。该蛋白在许多炎症条件和肿瘤发生过程中也有表达，包括细胞增殖、抗凋亡和血管生成。然而，发明人发现，TMSB10与肿瘤转移的功能相关性存在争议。TMSB10在甲状腺和皮肤恶性肿瘤转移瘤中有高水平的表达，而低水平的TMSB10表达与转移性宫颈癌有关。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供TMSB10在诊治胶质瘤中的应用。具体的，经研究发现，TMSB10表达随胶质瘤恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。U87MG和U251细胞系中TMSB10沉默抑制增殖、侵袭和迁移(MMP-9和N-Cadherin)；诱导细胞凋亡(Bcl-2和Bax)；通过PI3K-AKT/ERK信号通路(PI3K、p-AKT、p-ERK)抑制体外细胞周期(p21、CDK4、cyclin D1)；降低体内致瘤性。表明TMSB10是一种参与胶质瘤发生发展的致癌基因，可作为胶质瘤的生物标记物和治疗靶点。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供TMSB10基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用。
进一步的，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。
所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、胶质瘤细胞周期阻滞、胶质瘤细胞凋亡和/或胶质瘤细胞集落形成；
其中，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；
且相关研究证实，TMSB10蛋白上调表达与胶质瘤WHO分级升高呈正相关；
其中，所述TMSB10基因及其表达产物均可为人源。
本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况的物质。
优选采用Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；采用ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况；
更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物。
本发明的第三个方面，提供抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a)-(f)至少一种中的应用：
(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
(d)促进胶质瘤细胞周期阻滞，或者制备用于促进胶质瘤细胞周期阻滞的产品；进一步的，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
(e)促进胶质瘤细胞凋亡，或者制备用于促进胶质瘤细胞凋亡的产品；
(f)抑制胶质瘤细胞集落形成，或者制备用于促进胶质瘤细胞集落形成的产品。
所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；
本发明的第四个方面，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质；
对于抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括TMSB10蛋白特异的抗体、针对TMSB10mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；进一步的，所述抗体为人抗体。
在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、集落形成、促进胶质瘤细胞周期阻滞和/或胶质瘤细胞凋亡。
进一步的，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞。
进一步的，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。
优选的，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
进一步优选的，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
本发明有益效果：本发明提供了TMSB10在诊治胶质瘤中的应用。试验证明，TMSB10表达随胶质瘤恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。U87MG和U251细胞系中TMSB10沉默抑制增殖、侵袭和迁移(MMP-9和N-Cadherin)；诱导细胞凋亡(Bcl-2和Bax)；通过PI3K-AKT/ERK信号通路(PI3K、p-AKT、p-ERK)抑制体外细胞周期(p21、CDK4、cyclin D1)；降低体内致瘤性。表明TMSB10是一种参与胶质瘤发生发展的致癌基因，可作为胶质瘤的生物标记物和治疗靶点，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
图1为TMSB10不同表达情况与总生存率的相关关系图。图1A为通过TCGA数据库中检索TMSB10表达在LGG中表达情况，通过分析证实，高表达TMSB10患者较低表达患者总生存率明显下降；图1B为TCGA数据库GBM组TMSB10表达情况与总生存分析结果，显示高表达TMSB10组患者总生存率较低表达组明显下降；图1C为TMSB10在正常脑组织及原发性肿瘤中的mRNA表达水平；
图1D为LGG与GBM中TMSB10的mRNA表达水平；图1E为代表性免疫化学图像；图1F为使用Quickscore方法进行图像定量，显示相同样本中TMSB10免疫染色。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图2为验证TMSB10沉默的有效性和通过TMSB10沉默抑制胶质瘤细胞增殖系列图。图2A为PCR检测胶质瘤U87MG和U251细胞株敲除效率；图2B为胶质瘤U87MG和U251细胞株Western blot沉默效率评价；图2C为U87MG和U251细胞系TMSB10敲除后集落形成的代表性图像；图2D为细胞计数试剂盒(CCK-8)检测siRNA转染后24、48、72h U87MG和U251细胞的细胞增殖情况；图2E为EdU测定U87MG和U251细胞系细胞增殖率图，其中左侧图为实验图，右侧图为柱状分析图。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图3为TMSB10沉默抑制各组转染后U87MG和U251细胞系胶质瘤细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达系列图。图3A为胶质瘤U87MG和U251细胞系细胞迁移实验图和柱状分析图；图3B为划痕试验评价胶质瘤U87MG和U251细胞系的侵袭实验图和柱状分析图；图3C为与迁移和侵袭相关蛋白的表达图；图3D为与迁移和侵袭相关蛋白的统计分析图。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图4为各组转染后U87MG和U251细胞凋亡、细胞周期分期及相关蛋白表达水平相关图。图4A为各组U87MG和U251细胞凋亡的流式细胞结果图及柱状分析图；图4B为各组U87MG和U251细胞周期分期的流式细胞结果图及柱状分析图；图4C为各组U87MG和U251细胞凋亡蛋白表达水平图；图4D为各组U87MG和U251细胞细胞周期相关蛋白表达水平图。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图5为TMSB10在体内影响胶质瘤进展图。图5A为NC和si-TMSB10转染裸鼠的生物发光图像；图5B为NC组与si-TMSB10组的总生存时间图；图5C为NC组与si-TMSB10组在不同时间点的体重图；图5D为H&E染色显示NC组和si-TMSB10组肿瘤大小图；图5E为KI67、MMP-9、Bcl-2、TMSB10在NC组肿瘤组织中的表达与si-TMSB10组比较图。
图6为各组U87MG和U251细胞中PI3K-p-AKT/p-ERK信号通路中TMSB10基因及相关基因表达情况系列图。图6A、图6C分别为Western blot检测U87MG细胞中相关蛋白表达图和柱状分析图；图6B、图6D分别为Western blot检测U251细胞中相关蛋白的表达图和柱状分析图。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中术语解释和说明：
miRNA表达谱芯片：原理是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。
核酶保护分析技术(RPA)：miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高。
RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)：是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析。
原位杂交(in situ hybridization)：原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。
高通量测序(High-throughput sequencing)：又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
免疫检测方法：是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，胶体金免疫层析法等。
酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中硝化纤维膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。硝化纤维膜可捕获一定量的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、硝化纤维膜和吸水纸依次固定于PVC板，即成试纸条。
基于RNA的microRNA功能获得性技术：即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(shorthairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。
基因特异性miR Mimics技术：该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。
目前尚未有TMSB10在胶质瘤中的表达的现有文献报道，且TMSB10促进胶质瘤进展的潜在机制尚未得到充分阐明。
有鉴于此，利用Cox比例危险度模型和肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库；免疫组织化学检测肿瘤组织中TMSB10蛋白阳性表达率；同时研究TMSB10在U87MG和U251细胞系中的表达，并通过小干扰RNA或慢病毒转导沉默了TMSB10的表达。选取胶质瘤细胞株U87MG和U251，研究TMSB10表达改变增殖、迁移、划痕实验、克隆实验、细胞周期和细胞凋亡检测、体内致瘤性的影响。将U87MG和U251细胞株分为Mock、阴性对照(NC)和siRNA-TMSB10组。
结果表明TMSB10表达随胶质瘤恶性程度的增加而增加，且与生存率呈负相关。U87MG和U251细胞系中TMSB10沉默抑制增殖、侵袭和迁移(MMP-9和N-Cadherin)；诱导细胞凋亡(Bcl-2和Bax)、集落形成；通过PI3K-AKT/ERK信号通路(PI3K、p-AKT、p-ERK)抑制体外细胞周期(p21、CDK4、cyclin D1)；降低体内致瘤性。
基于上述研究，本发明的一个具体实施方式中，提供TMSB10基因及其表达产物在作为胶质瘤分子标志物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。
所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、胶质瘤细胞周期阻滞、胶质瘤细胞凋亡和/或胶质瘤细胞集落形成；
本发明的又一具体实施方式中，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；
且相关研究证实，TMSB10蛋白上调表达与胶质瘤WHO分级升高呈正相关；
其中，所述TMSB10基因及其表达产物均可为人源。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况的物质。
本发明的又一具体实施方式中，采用液相杂交、Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；采用ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况；
本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物。
本发明的又一具体实施方式中，提供抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a)-(f)至少一种中的应用：
(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
(d)促进胶质瘤细胞周期阻滞，或者制备用于促进胶质瘤细胞周期阻滞的产品；进一步的，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
(e)促进胶质瘤细胞凋亡，或者制备用于促进胶质瘤细胞凋亡的产品；
(f)抑制胶质瘤细胞集落形成，或者制备用于促进胶质瘤细胞集落形成的产品。
所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质；
对于抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括TMSB10蛋白特异的抗体、针对TMSB10 mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；进一步的，所述抗体为人抗体。
在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、集落形成、促进胶质瘤细胞周期阻滞和/或胶质瘤细胞凋亡。
本发明的又一具体实施方式中，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
实施例
1、材料和方法
1.1 Cox比例危险度模型和TCGA数据库分析
使用Cox比例危险模型来选择与患者生存相关的基因，并为未来的预测建立一个预测模型。结果时间定义为总体生存率以月为单位，无病生存率以月为单位。选取N个基因构建Cox回归模型；对于每个基因Gj(j＝1,2，…，N)，建立了以下Cox模型，用于t时刻生命状态或死亡的危险。
其中为基因Gj的基线危险函数，X1、X2、…、XP为协变量。调整的协变量包括种族、年龄、性别、KPM(Karnofsky performance)评分、肿瘤状态和新辅助肿瘤的历史。从癌症基因组图谱(TCGA,http://cancergenome.nih.gov)中发掘出与神经胶质相关的TMSB10的转录丰度。总之，分析来自TCGA数据库的702例胶质瘤病例，包括低级别胶质瘤(LGG,n＝529)和胶质母细胞瘤(GBM,n＝173)。
1.2临床组织样本
收集了6个来自严重脑外伤后接受内减压手术患者脑组织。140例人胶质瘤组织(HGT)来自山东大学齐鲁医院神经外科，其中低级别胶质瘤55例(I级肿瘤20例，II级肿瘤35例)，高等级胶质瘤85例(III级肿瘤30例，IV级肿瘤55例)。两名经验丰富的临床病理学家根据世界卫生组织(世卫组织)肿瘤标准分类对胶质瘤标本进行了验证和分类。所有参加者同意及签署有关研究用途的组织捐赠的知情同意书。实验程序是按照《赫尔辛基宣言》进行的。所有患者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院神经外科伦理委员会批准。
1.3细胞培养、转染及分组
人胶质瘤细胞株(U87MG、U251)购自中国科学院细胞库。所有细胞株均在Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)与10％的血清,4mM谷氨酰胺和1％青霉素和链霉素混合湿室有95％O2/5％二氧化碳在37℃。将细胞分为三组:Mock(未转染细胞)、阴性对照组(NC，空载体或慢病毒转染细胞)和siRNA-TMSB10组(转染siRNA-TMSB10或表达荧光素酶的慢病毒细胞)。通过qRT-PCR或Western blot分析选择转染效率。核序列如下：TMSB10-siRNA:5′-CGACCAAAGAGACCAUUGATT-3′(SEQ ID NO.1)和NC控制序列:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(SEQ ID NO.2)。细胞转染使用lipofectamine 3000(Invitrogen，美国)，根据说明进行。NC慢病毒的序列是5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′(SEQ ID NO.3)，和TMSB10-siRNA慢病毒5′-CGACCAAAGAGACCATTGA-3′(SEQ ID NO.4)。
1.4细胞迁移试验
将感染TMSB10 siRNAs、NC和Mock的细胞株进行胰蛋白酶化，作为单细胞悬液重新悬浮。总共1x105细胞0.2毫升的无血清DMEM被接种在8-μm-pore聚碳酸酯膜Boyden室中插入Transwell装置。接下来，600μL DMEM和10％的血清。孵化24h后37℃，细胞使用棉签,没有被迁移,迁移的细胞在低表面固定,沾1毫升0.1％结晶紫10分钟,洗两次与PBS和在室温下干燥。用伊红染色15分钟，在显微镜下计数(Olympus,Japan)。在显微镜下计数迁移细胞的数量，数据显示为相对于对照组(模拟组和NC组)的折叠变化。采用5个随机视图对细胞进行计数，独立实验重复3次。
1.5划痕实验
稳定细胞被接种到6-well板(1.5x106细胞/)和孵化5％二氧化碳在37℃24h,抑制细胞增殖,所有的细胞都是使用5μg/毫升丝裂霉素C对3h之前刮线。使用无菌吸管尖在融合单分子膜表面形成创口，然后与DMEM培养基孵育，培养基中添加10％胎牛血清。沿着刮线观察不同时间点的细胞迁移情况，拍摄每个细胞系情况。实验一式三份，重复两项独立实验。
1.6 5-乙炔-20-脱氧尿苷(EdU)试验
细胞增殖采用EdU检测试剂盒(RiboBio，中国)。转染48h后，将每孔5x103个细胞接种到96孔板中，培养24h。每个试验一式三份。
1.7细胞计数kit-8(CCK-8)试验
细胞增殖也根据试剂步骤通过细胞计数kit-8(CCK-8)检测。简单地说，细胞接种到96孔板，密度为1x104细胞/孔，并孵育24h。然后，细胞转染siRNA-TMSB10和siRNA-NC24h,48h,72h。10μL CCK-8工作液加到96孔板孔中，在37℃、95％氧气、5％二氧化碳中孵化2h。利用微板阅读器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测量了450nm波长下的光密度。
1.8集落形成实验
对细胞形成进行检查。转染48h后，细胞以500细胞/孔密度接种于6孔板中。含10％胎牛血清的DMEM每3天更换一次培养。15天后，用多聚甲醛固定，用结晶紫染色15分钟，并对集落定量。每个试验一式三份。
1.9细胞凋亡及细胞周期分布的流式细胞仪分析
转染的细胞用预冷PBS洗涤两次，用0.25％的胰蛋白酶消化，用DMEM调节密度至1x106细胞/mL。用70％预冷酒精固定24h后，1000r/min离心5min,PBS洗涤2次。接下来，1毫升propidium碘(PI)(Sigma-Aldrich化学公司，圣路易斯密苏里州,美国)含有核糖核酸酶在黑暗条件下添加并在4℃培养。采用Accuri C6流式细胞仪(BD，中国)检测细胞周期。每组重复三次，每一过程重复三次。采用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡。接下来,100μL 1x106细胞/毫升细胞悬液膜联蛋白的添加到5μL V-FITC(美国BD)和5μL将培养物在室温下黑暗中培养15分钟，PBS洗涤2次。细胞凋亡分析采用流式细胞仪，激发波长488nm。数据采用FlowJo软件进行分析。每个实验一式三份。
1.10蛋白定量实验
采用1％苯基甲基磺酰氟作为RIPA缓冲液(Beyotime，中国江苏省海门市)，从组织和细胞中提取总蛋白，并采用biinchoninic acid(BCA)法(Beyotime)测定蛋白浓度。将等量的蛋白质装入10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。接下来,墨迹都孵化主要抗体在一夜之间在4℃。用TBST洗涤后，室温下用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h，增强化学发光(ECL；使用ECL检测系统(ThermoScientific，北京，中国)。采用TMSB10(1:1000,Abcam)；MMP9(1:1000,CST)；N-Cadherin(1:1000,CST)；伯灵顿(1:1000,CST)；bcl-2(1:1000,CST)；P21(1:1000,CST)；到(1:1000,CST)；cyclinD1(1:1000,CST)；蛋白激酶(1:1000Abcam)；p-AKT(1:1000Abcam)；ERK(1:1000Abcam)；p-ERK(1:1000,Abcam)和GAPDH(1:1000,CST)。以GAPDH蛋白为对照，测定相对综合密度值。
1.11实时定量PCR(RT-qPCR)
使用TRIzol试剂(Invitrogen)根据制造商的协议从细胞中分离出总RNA。使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)对用于miRNA检测的cDNA进行逆转录。利用M-MLV逆转录酶(BioTeke，北京，中国)对cDNA进行逆转录以检测mRNA。RT-qPCR采用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行，使用ABI 7500real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行。U6和GAPDH分别作为内控，使TMSB10表达正常化。引物序列如下：TMSB10，
F:5′-CTTATCGAAGCTGGCGATTT-3′(SEQ ID NO.5)和R:5′-AGTGGGAGCACCAGGATCT-3′(SEQ ID NO.6)；GADPH F:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′(SEQ ID NO.7)和R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′(SEQ ID NO.8)。使用2-ΔΔCt相对基因表达计算方法如前所述。
1.12颅内小鼠模型
采用6周龄裸鼠(中国医学科学院肿瘤研究所)建立颅内神经胶质瘤异种移植，以U87MG细胞为细胞模型。在此之前，U87MG细胞通过阴性对照(NC)载体或敲低TMSB10(U87-siTMSB10)和荧光素酶转导。根据颅内注射U87MG细胞是否转染NC慢病毒或TMSB10慢病毒(Lenti-siTMSB10)，将原位胶质瘤模型分为两组。如前所述，每只小鼠体内注射30万个细胞。采用生物发光成像技术检测颅内肿瘤在第7天和第10天的生长情况。这些数据被归一化为每只动物开始治疗时检测到的生物发光。图中所示的误差条表示标准差(SD)。Kaplan-Meier生存曲线绘制为生存时间。
1.13组织学和免疫组织化学
取原位肿瘤，PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定。组织石蜡包埋和切片到5μm厚度部分。脱蜡后，用苏木精进行组织学和伊红(H&E)染色。对Ki67(1:1000,CST)、MMP-9(1:1000,CST)、Bcl-2(1:1000,CST)、TMSB10(1:1000,Abcam)和山羊抗兔(1:500,CST)抗体的一次抗体进行抗原回收后，免疫组化检测裸鼠脑瘤组织中Ki67、MMP-9(1:1000,CST)、Bcl-2(1:1000,CST)和TMSB10(1:1000,Abcam)的表达。根据各组3个随机区域的图像分析Ki67、MMP-2、Bcl-2、TMSB10的表达情况。
1.14统计分析
使用GraphPad Prism6进行统计分析。通过未配对独立样本t检验，分析两组体外研究的差异有统计学意义。采用Wilcoxon符号秩检验比较胶质瘤组织与正常脑组织TMSB10的表达情况。采用卡方检验探讨胶质瘤患者TMSB10表达与临床病理参数的关系。采用Kaplan和Meier生存曲线检测TMSB10高表达组与TMSB10低表达组的生存时间差异，采用log-rank检验进行比较。P值<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 TMSB10的高表达水平与胶质瘤的分级和患者的总生存时间有关
使用cox比例风险模型选择与胶质瘤患者生存相关的TMSB10基因(表1)。为了探究TMSB10在胶质瘤患者中的预后价值，分析了一个队列，从TCGA数据库中选取了702例胶质瘤患者，包括低级别胶质瘤(LGG,n＝529)和胶质母细胞瘤(GBM,n＝173)。发现高表达TMSB10的胶质瘤患者比低表达TMSB10的胶质瘤患者在LGG(P<0.001，图1A)和GBM(P＝0.0433，图1B)中总生存时间短。类似的，研究比较了正常脑组织和原发肿瘤之间TMSB10mRNA表达水平(P＝0.0185，图1C)、LGG和GBM(P<0.001，图1D)。人胶质瘤组织切片免疫组化检测显示，高级别胶质瘤(WHO III、IV)组织标本中TMSB10蛋白表达水平较正常脑组织和低级别胶质瘤(WHO I、II)组织中TMSB10蛋白表达水平上调，见图1E。统计学分析证实TMSB10蛋白表达水平与人胶质瘤组织学分级显著正相关(图1F)，说明TMSB10在胶质瘤恶性肿瘤中的重要作用。分析了TMSB10表达是否与这些特征相关(表2)。TMSB10高表达与低表达(中值)与患者年龄、KPS、WHO分级、TCGA亚型、IDH1状态、MGMT启动子、ATRX状态有统计学意义(均P<0.001，表2)，性别(P＝0.493)、TERT表达(P＝0.493)与TMSB10表达无显著相关性。
表1 Cox比例危险模型选择与患者生存相关的TMSB10基因
基因 回归系数 P值 生存时间
TMSB10 0.503127906 0.000281887 总生存月数
TMSB10 0.396827971 0.00035624 无瘤生存月数
表2胶质瘤患者TMSB10表达及临床病理特征的关系
2.2验证TMSB10在胶质瘤细胞中的沉默效率和下调TMSB10对胶质瘤细胞增殖的抑制作用
为了评估TMSB10在胶质瘤恶性生物学特性中的作用，构建了siRNA-TMSB10来沉默胶质瘤细胞系U87MG和U251中TMSB10的表达。si-TMSB10在U87MG和U251胶质瘤细胞中转染效率为>80％(图2A)。Western blot分析证实转染si-TMSB10后TMSB10蛋白水平较NC组明显降低(图2B)。这些结果进一步证实了si-TMSB10在胶质瘤细胞体外功能实验中下调TMSB10的有效性。TMSB10对细胞增殖的影响采用集落形成、CCK-8和EdU测定。在胶质瘤U87和U251细胞系中，TMSB10的下调与相应的Mock和NC相比，显著抑制了集落的形成(图2C)。接下来，使用CCK-8检测TMSB10对人胶质瘤细胞系的生长影响。与模拟组和NC组相比，siRNA组的细胞存活率明显降低，且呈时间依赖性(图2D)。此外，使用EdU试验也证实了对细胞增殖的类似影响。采用体外培养阳性细胞与总细胞核的比值测定细胞增殖率。结果显示，在胶质瘤U87MG和U251细胞系中，siRNA组细胞增殖率明显低于Mock和NC组(图2E)。
2.3 siRNA-TMSB10对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响
评价TMSB10在胶质瘤U87MG和U251细胞系细胞迁移和侵袭生物学特性中的作用。如图3所示，与Mock和NC组相比，siRNA组U87MG和U251细胞的迁移和侵袭能力下降(P均<0.05，图3A,B)。同时，评价了与迁移和侵袭相关蛋白的表达；siRNA组MMP-9和N-cadherin明显低于Mock组和NC组(P<0.05，图3C,D)。这些结果表明TMSB10基因沉默可以抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。
2.4 siRNA-TMSB10对胶质瘤细胞凋亡、细胞周期及相关蛋白表达的影响
为进一步研究TMSB10对细胞凋亡的影响，转染48h后采用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。与模拟组和NC组相比，siRNA下调TMSB10可显著诱导U87MG和U251胶质瘤细胞株凋亡(P<0.05，图4A)。Western blot分析显示凋亡相关蛋白Bcl-2明显减少，Bax增加(图4C)。结果表明，TMSB10基因沉默可促进胶质瘤细胞凋亡。同样，在细胞周期中，siRNA-TMSB10组与Mock和NC组相比，G1期细胞数量增加，S期细胞数量减少(P均<0.001，图4B)。Western blot分析细胞周期相关蛋白，发现siRNA组CDK4、cyclin D蛋白表达明显降低，p21表达量较Mock和NC组增加(图4D)。这些数据表明TMSB10基因沉默可以通过调控细胞周期相关基因的表达，在G1期阻滞胶质瘤细胞。
2.5 TMSB10对颅内肿瘤进展的影响
神经胶质瘤的进展是基于生物发光成像(BLI)的价值测定使用IVIS。si-TMSB10组与NC组相比，在14天内荧光强度和范围显著降低(图5A)。NC组总生存时间短于si-TMSB10组(P＝0.0027，图5B)。两组最终体重均明显减轻(图5C,P＝0.032)。H&E染色也显示NC组和si-TMSB10组肿瘤体积减小(图5D)。敲除TMSB10可抑制KI67、MMP-9、Bcl-2、TMSB10表达水平(图5E)。这些结果表明KI67、MMP-9和Bcl-2表达水平可能参与TMSB 10诱导的肿瘤体内迁移和进展的减少。
2.6 TMSB10基因通过PI3K-p-AKT/p-ERK信号通路调控U87MG和U251细胞的应答性
最后，验证影响胶质瘤细胞发生和发展的通路。如图6中所示，没有统计学意义的观察TMSB10基因及相关基因的表达在PI3K/AKT信号通路U87MG U251细胞在模拟和NC组(图6)。模拟和NC组相比,TMSB10的表达水平,PI3K,p-AKT p-ERK都降低；然而，AKT和ERK在U87MG和U251胶质瘤细胞系中无统计学意义。这些结果提示TMSB10基因沉默可以抑制PI3K-p-AKT/p-ERK信号通路的激活。
综上，本实施例结果证明了TMSB10通过胶质瘤细胞中PI3K p-AKT/p-ERK信号通路发挥致癌功能，有助于未来胶质瘤的治疗。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> TMSB10在诊治胶质瘤中的应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgaccaaaga gaccauugat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gttctccgaa cgtgtcacgt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cgaccaaaga gaccattga 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cttatcgaag ctggcgattt 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agtgggagca ccaggatct 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gcaccgtcaa ggctgagaac 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tggtgaagac gccagtgga 19

Claims (10)

1.TMSB10基因及其表达产物在制备胶质瘤分子标志物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、胶质瘤细胞周期阻滞、胶质瘤细胞凋亡和/或胶质瘤细胞集落形成；
优选的，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
优选的，所述胶质瘤包括低级别胶质瘤(I-II级)和高级别胶质瘤(III-IV级)；
优选的，所述TMSB10基因及其表达产物均可为人源。
4.一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其特征在于，包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；或基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况的物质。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，采用Northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交检测胶质瘤样品中TMSB10的转录；采用ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片检测胶质瘤样品中TMSB10表达产物情况。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物。
7.抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(a)-(f)至少一种中的应用：
(a)抑制胶质瘤细胞的增殖，或者制备用于抑制胶质瘤细胞增殖的产品；
(b)抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；
(c)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；
(d)促进胶质瘤细胞周期阻滞，或者制备用于促进胶质瘤细胞周期阻滞的产品；进一步的，所述胶质瘤细胞周期阻滞为胶质瘤细胞G1/S细胞周期的阻滞；
(e)促进胶质瘤细胞凋亡，或者制备用于促进胶质瘤细胞凋亡的产品；
(f)抑制胶质瘤细胞集落形成，或者制备用于促进胶质瘤细胞集落形成的产品。
8.一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其特征在于，包含抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，对于抑制TMSB10基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括TMSB10蛋白特异的抗体、针对TMSB10mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA；优选的，所述抗体为人抗体。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料；
优选的，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂；
优选的，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒。
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