CN102453760A

CN102453760A - 新型miRNA在肿瘤诊断和预后判断中的应用

Info

Publication number: CN102453760A
Application number: CN2010105274387A
Authority: CN
Inventors: 侯晋; 曹雪涛; 李楠
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明涉及新型miRNA在肿瘤诊断和预后判断中的应用，具体涉及检测生物样品中微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的试剂在制备用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的试剂盒中的应用。本发明还涉及包含检测微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体的试剂的检测试剂盒、以及用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的方法。本发明的用途、方法和试剂盒可有效用于肿瘤治疗方案选择和/或预后评估，从而提供了一种新颖的肿瘤诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。

Description

新型miRNA在肿瘤诊断和预后判断中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA小分子——miR-199a/b-3p在肿瘤诊断、治疗方法选择和预后判断中的应用及其应用方法。

背景技术

微小RNA(micro RNA，简称miRNA)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18～24nt。

关于miRNA的最早报道是1993年Lee等报道的在秀丽线虫(C.elegants)体内发现的一种呈时间特异性表达的小分子RNA，即可调节线虫发育的lin-4【Lee，R.C.等，The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs withantisense complementarity to lin-14(线虫异时性基因lin-4编码与lin-14反义互补的小RNA).Cell.1993，75：843-854】。2000年，Reinhart等【Reinhart，B.J.等，The21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans(20核苷酸的let-7RNA调控新杆状线虫中的发育周期).Nature.2000，403：901-906】又发现不同时期表达的let-7。到目前，公用miRNA数据库中已收录了数百种人类miRNA序列，其中三分之二已被实验证实。

微小RNA来源于长度约为1000bp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60～80nt的具有茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)。miRNA前体转运至胞质后，被进一步加工成miRNA。

微小RNA在动植物细胞中通过对目标mRNA的切割和转录抑制发挥重要作用，参与细胞生长、组织分化和肿瘤形成等多种过程。miRNA在物种间具有高度的保守性、时续性和组织特异性。目前认为miRNA在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约30％的基因调节，与肿瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关。

在上述疾病中，miRNA与肿瘤的关系是很多研究的重点。已经发现若干miRNA通过负调控基因的表达与慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌高度相关。miRNA的正调控靶基因现象是最近的发现，具体机制还不明确。

有学者提出了“癌微小RNA”(OncomiRs)”的观点【Esquela-Kerscher，A.等，OncomiRs-microRNAs with a role in cancer(癌微小RNA-在癌症中发挥作用的微小RNA).Nat Rev Cancer.2006，6：259-269；Hammond，SM.等，MicroRNAs as oncogenes(作为癌基因的微小RNA).Curr Opin Genet.2006，16：4-9】，即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展过程中充当了类似癌基因的角色。

研究发现MicroRNA主要通过促进靶mRNA的降解或抑制其翻译过程而发挥调控作用，广泛参与细胞增殖、凋亡、代谢及分化等过程。MicroRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展及演进有着极为密切的关系。基因组不稳定性是恶性肿瘤的基本特征，在癌发生发展过程中经常伴随染色体的扩增或缺失，从而导致癌基因的激活或抑癌基因的失活。许多microRNA分子定位于癌染色体变异区内，可作为癌基因或抑癌基因而在癌变过程中发挥重要作用。近年来，miRNA以其分子量小、实验操控性强以及功能特异性等特点，使研究者们对其与肿瘤诊断、治疗和预后领域的兴趣越来越浓厚。

目前发现，microRNA的表达情况可鉴别肺癌和肺组织，也可以用于预测肺癌患者的预后。

let-7 miRNA在肺癌组织内低表达，肿瘤组织内相对低表达的患者接受根治性手术后的预后比高表达let-7的患者差，可以作为一个独立的预后因素【Takamizawa，J.等，Reduced expression of the let-7microRNAs in human lungcancers in association with shortened postoperative survival(具有缩短的术后生存期的人肺癌中的let-7微小RNA表达下降).Cancer Res.2004；64：3753-3756】。在其它肿瘤亦有许多类似的发现。

Roldo等【Roldo，C等，MicroRNA expression abnormalities in pancreaticendocrine and acinar tumors are associated with distinctive pathologic features andclinical behavior(胰分泌物和腺泡肿瘤中的微小RNA表达异常与独特的病理学特征及临床行为相关).J Clin Onco1.2006；24：4677-4684】的研究亦提示miRNA的表达情况可准确鉴别胰腺肿瘤和正常胰腺组织，且可以进一步用于不同类型肿瘤组织的鉴别，其中miR-21的表达与肿瘤细胞的增殖率和胰腺癌肝转移的发生率正相关，与肿瘤术后的预后相关。

miR-199a/b-3p表达于人基因组的3个位置，分别为miR-199a-1(19号染色体)、miR-199a-2(1号染色体)和miR-199b(9号染色体)。miRNA的表达主要由miRNA基因首先表达为miRNA前体(pri-miRNA)，pri-miRNA经转运出核后，由Dicer酶剪切成为pre-miRNA，pre-miRNA表现为典型的茎环结构，茎部序列不完全互补配对。其茎部序列经剪切后成为成熟体miRNA。5p端的序列为5p成熟miRNA，3p端的序列为3p成熟miRNA。miR-199a-1，miR-199a-2，和miR-199b三个miRNA基因所表达的miRNA成熟体具有相同的3p段序列，即miR-199a/b-3p。miR-199a/b-3p在人肝脏中的表达主要来源于基因组的miR-199a-2基因。

由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一，为了有效地治疗和预防肿瘤(如肝细胞癌)，目前人们已经越来越关注肿瘤的早期诊断和预后。

以原发性肝癌(即原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC))为例，该疾病是我国常见的恶性肿瘤，患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。根据世界卫生组织的统计，全球每年新增约60万HCC患者，而每年死于肝癌的人数也约为60万。HCC的发生是一个多步骤渐进的过程，和慢性肝炎及肝硬化紧密相关。我国约有1.2亿乙肝病毒携带者，占全球感染人数的1/3。HCC根治术后5年的复发率约为60-70％，其中术后1年的复发率所占比例高达51.4-72.3％，即使是小肝癌获根治性切除后的5年复发率也达30-40％。因此术后复发转移已经成为进一步提高肝癌治疗效果的主要障碍。

术后灌注化疗转移等治疗方法有可能降低肝癌患者术后复发率，但是一些长期研究显示采用这些术后化疗后患者的生存率反而相对与未行化疗的患者降低。这些现象提示术后具有较高复发转移风险的患者可能会受益于这些术后治疗，但术后复发转移风险较低的患者采用这些术后治疗可能会适得其反。如果能够通过有效的预测方法预测术后复发风险高的患者，就可以通过一系列的干预预防措施，降低复发率，延长患者的生存期。

因此，如何有效的诊断和干预HCC的发生并适应性地选择治疗HCC患者的方法是一个紧迫的重要问题。

用临床指标(如TNM分级、肝硬化程度)和单个分子指标(如AFP、MMP)预测肝癌复发转移的研究已经有较长的历史。但是，临床指标或者病理类型相似的患者却有截然不同的临床结局，所以用临床指标或者单独的分子标志来预测或评价患者难以取得满意的效果。对肿瘤实行个体化、预见性的治疗有助于更加深入理解临床病理学特征，改善对患者的临床处理，从而提高肿瘤患者的无瘤生存期及绝对生存期。确定肝癌相关基因及其参与肝癌发病机理，可为肝癌个体化预见性治疗提供基础，也为新的治疗方案提供靶点，从而有利于提高HCC的治愈率【Thorgeirsson，S.等，Hunting for tumor suppressor genes in livercancer(肝癌中肿瘤抑制基因的探索).Hepatology.2003；37：739-741】。

目前，由肿瘤基因表达模式所回顾的分子模拟，已经被用于确定不同的癌症类型包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和脑瘤的预后的新的分子标准。

1999年，Tamayo等率先利用基因芯片技术对急性白血病进行研究，根据肿瘤的基因表达谱对白血病进行分型，并根据所建立的模型对新的患者进行肿瘤类型预测，从而为利用基因芯片对肿瘤的分类和预测开创了先河【Tamayo，P.等，Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps：methodsand application to hematopoietic differentiation(具有自组织地图的基因表达翻译模式：造血分化的方法和应用).Proc Natl Acad Sci U S A.1999；96：2907-12】。此后，类似的方法也用于对弥漫性大B细胞淋巴瘤和乳腺癌进行分析预测。这些研究结果说明，基因芯片技术能够从分子水平对肿瘤进行更准确的分类，并预测肿瘤亚型、预后和对治疗的反应性等特性。

Van′t Veer等基于70个基因的乳腺癌预后诊断模型和相关诊断用芯片MammqaPrint被FDA批准上市，显示出基于基因表达谱模型来基因疾病分型和预后判断的良好前景。但是，基于微阵列的、由基因表达引起的HCC早期复发的预测的新近研究仅报道在一小组患者1年内的肝内复发并且使用6000个基因的基因芯片【Matoba，K.等，Tumor HLA-DR expression linked to earlyintrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma(与肝细胞癌的早期肝内复发关联的肿瘤HLA-DR表达).Int J Cancer.2005；115(2)：231-40】。这就增加了HCC预后判断的复杂度，降低了可操作性。

虽然本领域中已知某些微小RNA与肿瘤具有一定的相关性，但本领域中已知的miRNA种类繁多，功能各异，要从中筛选出与肿瘤相关且可作为发病、治疗方案选择和预后指标的特定miRNA存在较大的难度。目前，本领域中尚无miR-199a/b-3p与肿瘤相关性的研究报道。

综上所述，本领域中迫切需要寻找到可有效用于肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估的miRNA，并将其用于这些用途中。

发明内容

本发明正是从数百种已知的miRNA中筛选出了肿瘤(尤其是肝癌)表达相关性及其对肝癌生长的具有调控作用的miRNA--miR-199a/b-3p，由此本发明提供了微小RNA miR-199a/b-3p或其前体在用于对象中肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，并提供了相应的检测试剂盒。

在本发明的第一方面中，提供了检测生物样品中微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的试剂在制备用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的试剂盒中的应用。

在一个优选例中，所述miR-199a/b-3p的前体在对象体内经加工转化为miR-199a/b-3p。

在另一个优选例中，所述miR-199a/b-3p或其前体来自：人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴。

在本发明的一个实施方式中，所述miR-199a/b-3p的序列如SEQ ID NO：1所不。

在本发明的另一个实施方式中，所述试剂是对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的试剂，优选所述试剂选自：对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的探针、基因芯片、和PCR引物。

在一个优选例中，所述试剂选自：SEQ ID NOs：2-4所示的序列、miR-199a/b-3p的反义序列、寡核苷酸或引物序列。

在另一优选例中，所述试剂带有可检测标记，优选所述可检测标记选自：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)。

在本发明的另一个实施方式中，所述肿瘤选自：肝癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。

在一个优选例中，所述肿瘤为肝癌，优选肝细胞癌。

在本发明的另一个实施方式中，所述试剂盒还包含选自下组的一种或多种：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

在本发明的另一个实施方式中，所述生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液、或体液。

在一个优选例中，所述生物样品为获自所述对象的肿瘤组织或细胞、正常组织或细胞，优选肿瘤组织和非肿瘤癌旁组织。

在本发明的第二方面中，提供了一种检测试剂盒，其包含：

(i)检测有效量的检测微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的一种或多种试剂；

(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

在一个优选例中，所述试剂(i)是对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性试剂，优选所述试剂选自：对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的探针、基因芯片、或PCR引物。

在另一个优选例中，所述试剂盒还包含临床上用于对象中肿瘤治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂。

在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒用于通过选自下组的方法检测微小RNA miR-199a/b-3p或其前体：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印记法原位杂交法。

在本发明的另一个实施方式中，所述使用说明书中写明：当检测结果显示对象肿瘤组织中的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平低于正常或对照组织中的水平，则提示所述对象适于采用提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良。

在一个优选例中，所述的预后不良表现为：与微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平未降低的患者相比生存期缩短、易发肝硬化、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、门静脉癌栓出现比例增加、或TNM分级上升。

在本发明的第三方面中，提供了一种用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的方法，所述方法包括：

(a)检测对象肿瘤组织或细胞中微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平；

(b)将(a)中检测的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平与正常对照进行比较；

若所述对象的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体表达水平低于对照水平，则表明所述对象适于采用提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良。

在一个优选例中，(a)中检测的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平至少比正常对照中的水平低10-50％，优选20-40％，更优选30-35％。

在另一个优选例中，所述提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法包括：给予微小RNA miR-199a/b-3p或其前体或包含微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体的组合物。

在另一优选例中，所述对照水平选自：由该对象非肿瘤的正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的miR-199a/b-3p或其前体水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

本发明的上述技术方案中的技术特征可相互组合，以得到同样适于实现本发明的发明目的的技术方案。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：HCC中miR-199a/b-3p的表达与患者生存时间的相关性，其中：

图1A为无瘤生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；

图1B为总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线(P值使用SPSS 17.0中的log-rank test计算)。

图2：miR-199a/b-3p对HCC细胞系Hep3B的作用，其中：

图2A为细胞增殖的MTT法检测结果；

图2B和图2C分别为用流式细胞法检测的细胞凋亡和细胞周期进展结果(结果显示为平均值±标准差(n＝4)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

图3：miR-199a/b-3p在正常肝脏组织、SMMC-LTNM肿瘤以及瘤内注射miR-199a/b-3p后的表达情况的qRT-PCR检测(结果为平均值±标准差(n＝4)，**，P＜0.01)。

图4：瘤内注射miR-199a/b-3p后对肿瘤生长的影响，其中：

图4A为肿瘤生长曲线；

图4B为血清AFP含量(结果显示平均值±标准差(n＝8)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

图5：瘤内注射miR-199a/b-3p后肿瘤组织的H&E染色检测坏死肿瘤组织分析，50×图中的黑框部分为在100×图中的放大部分。

图6：为静脉注射miR-199a/b-3p腺相关病毒后对肿瘤生长的影响。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究发现：肿瘤患者的肿瘤组织中微小RNAmiR-199a/b-3p的表达会显著下调，且下调的幅度与患者的生存时间存在相关性，其低表达与患者的预后差显著相关，从而证实了miR-199a/b-3p在肿瘤进展和患者预后中起重要作用。发明人在此基础上进行进一步的研究发现：miR-199a/b-3p可在体、内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长，从而发挥抗肿瘤的作用。由此，发明人发现了miR-199a/b-3p在用于对象中肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，从而在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“分离的”或“分离纯化的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明提到的特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

miR-199a/b-3p及其前体

如本文所用，术语“miR-199a/b-3p”或“微小RNA miR-199a/b-3p”可互换使用，是指包含SEQ ID NO：1所示序列或其同源序列的微小RNA。本领域中已知各种来源的miR-199a/b-3p，例如人、黑猩猩、马、鸡等，这些同源序列均包含在本发明的术语“miR-199a/b-3p”中。本发明的术语中还包含上述天然存在的miR-199a/b-3p序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，或经过生物学化学修饰，且仍然具有抗肿瘤活性的衍生RNA。

如本文所用，术语“miR-199a/b-3p前体”是指在被施予对象的细胞内或体内可被加工成为miR-199a/b-3p的miRNA前体。本领域普通技术人员知晓获得天然存在的miR-199a/b-3p前体的方法和手段，也可基于分子和遗传学理论和手段构建所述前体，例如【Kim，S.等MicroRNA miR-199a regulates the METproto-oncogene and the downstream extracellular signal-regulated kinase 2(ERK2).(微小RNA miR-199a调控MET原癌基因和下调胞外信号调控激酶2(ERK2))JBiol Chem.2008；283：18158-18166.】。

本领域中已知miR-199a/b-3p编码基因的初始转录产物经过一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR-199a/b-3p。MiR-199a/b-3p前体只有在加工成成熟的miR-199a/b-3p后才具有相应的生物学功能，因此，本领域普通技术人员可合理预期利用miR-199a/b-3p的成熟序列及能够产生或加工成为miR-199a/b-3p的各种其它形式的核酸物质(即本发明所述的“miR-199a/b-3p前体”)均可获得本发明所需获得的效果，即起到抗肿瘤的效果，从而均可用于制备治疗或预防肿瘤的组合物。

检测试剂

如本文所用，术语“检测试剂”或“检测miR-199a/b-3p或其前体的试剂”可互换使用，均是指特异性针对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体，且可用于直接或间接检测出miR-199a/b-3p或其前体的存在和/或含量的试剂。

由于miR-199a/b-3p或其前体的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对miR-199a/b-3p或其前体的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的探针、基因芯片、或PCR引物，如miR-199a/b-3p的反义序列、本发明实施例中所用的SEQ ID NO：2-4所示的序列、或寡核苷酸或引物序列。

为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。

本发明的检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中miR-199a/b-3p或其前体的检测即可。例如，当本发明的检测试剂为核苷酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。

检测试剂盒和生物样品

本发明中还提供了一种检测试剂盒，其包含：(i)检测有效量的检测微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的一种或多种试剂；(ii)选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择和/或对预后进行评估。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测微小RNA miR-199a/b-3p或其前体：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

当然，所述试剂盒还包含临床上用于对象中肿瘤发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测miR-199a/b-3p或其前体所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。

如本文所用，术语“生物样品”或“待测样品”可互换使用，均是指获自对象且用于miR-199a/b-3p或其前体检测的样品。生物样品可以是获自对象的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液、RNA提取物等适于检测的各种形式存在，例如可在检测前抽提组织或细胞中的总RNA。

肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的方法

不受如下原理限制：本发明人经研究发现miR-199a/b-3p可在体、内外有效抑制肿瘤细胞的繁殖和生长，从而发挥抗肿瘤的作用。由此可推测miR-199a/b-3p或其前体水平的下降与肿瘤的发生(从而用于判断是否已患有肿瘤)、治疗(可针对性地提高患者miR-199a/b-3p或其前体的水平)和预后具有密切的联系，从而可用作肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估的标志物。

通常，可利用本发明的检测试剂盒，采用如下方法进行肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明检测试剂盒中的检测试剂接触；(c)检测该待测样品中miR-199a/b-3p或其前体的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估：如检测结果显示对象组织中的微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体的水平低于对照水平，则提示所述对象已患有肿瘤、适于采用提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良。

如本文所用，术语“对照水平”是指用作参照的miR-199a/b-3p或其前体的水平，其包括但不限于：由同一对象的非肿瘤正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的miR-199a/b-3p或其前体水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

可用于提示所述对象已患有肿瘤、适于采用提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良的水平差异可为：待测样品中的miR-199a/b-3p或其前体水平比对照水平低10-50％，优选20-40％，更优选30-35％。

提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法包括但不限于：给予患者有效量的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体、或包含上述活性物质的组合物。可通过如下方法(例如但不限于)将这些物质给予对象：直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒RNA法或复制缺陷腺病毒携带目的RNA法。

如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、易发肝硬化、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、门静脉癌栓出现比例增加、TNM分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合提高微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法改善患者的预后。

本发明的优点

本发明的优点主要在于：

(a)本发明揭示了miR-199a/b-3p在肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，为miR-199a/b-3p、乃至miRNA的研究和开发利用提供了新的思路和途径；

(b)本发明的miR-199a/b-3p或其前体可有效用于肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的肿瘤诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1检测试剂盒的制备

按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检测生物样品中miR-199a/b-3p的表达：

(a)装有反转录酶(200U/μl)的容器；

(b)装有RNA酶抑制剂(40U/μl)的容器；

(c)装有反转录5×缓冲液(75mM KCl，500mM Tris-Cl，pH 8.3，25℃，3mM MgCl₂，10mM DTT)的容器；

(d)装有目的miRNA反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10μM)的容器：

miR-199a/b-3p反转录引物为：

5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GATACG ACT AAC CA-3′(SEQ ID NO：2)；

定量PCR引物：

5′-GTCACAGTAGTCTGCACAT-3′(上游，SEQ ID NO：3)和

5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′(下游，SEQ ID NO：4)；

(e)装有内参反转录引物和PCR上游引物和下游引物(10μM)的容器：

内参U6小核RNA的反转录反应引物与定量PCR的下游引物相同，序列为：

5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’(SEQ ID NO：5)；

定量PCR引物为：

5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’(上游，SEQ ID NO：6)；和

5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’(下游，同上SEQ ID NO：5)；

(f)装有10×PCR缓冲液(50mM KCl，100mM Tris-Cl，pH9.0，25℃，1.0％TritonX-100)；

(g)装有dNTP(每种10mM)的容器；

(h)装有Taq DNA聚合酶(3U/μl)的容器；

(i)装有荧光染料(SYBR I)的容器；以及

(j)使用说明书。

实施例2：miR-199a/b-3p表达量与HCC的关系

采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法，用实施例1中的检测试剂盒对2002至2006年收集的共142例HCC患者的HCC组织与癌旁组织(来自东方肝胆医院标本库)中miR-199a/b-3p的表达进行了分析。

采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提组织总RNA。qRT-PCR采用实施例1的测试试剂盒在LightCycler1.5(Roche公司)实时定量PCR仪上完成。

miRNA的相对定量使用2^-ΔΔCt法计算(U6为内参)【Livak，KJ.等，Analysisof relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod.Methods.2001；25：402-408】。

qRT-PCR分析结果发现，与癌旁非肿瘤组织相比，miR-199a/b-3p在约88％(125/142)的HCC组织中表达降低(结果未显示)。

将该142例HCC患者分为两组，第一组为HCC中miR-199a/b-3p表达极低(小于其在癌旁组织中表达量的10％，计81例患者)，第二组为HCC中miR-199a/b-3p较第一组表达相对较高(大于癌旁的10％，计61例患者)。对miR-199a/b-3p的低表达与患者生存时间的性关性进行分析，P值使用SPSS 17.0中的log-rank test计算，结果分别如图1A和图1B所示。结果发现：miR-199a/b-3p的低表达与患者更低的无瘤生存时间(图1A)和总体生存时间显著相关(图1B)。

对影响HCC预后的危险因素进行Cox回归分析，危害比(95％可信区间)和P值使用SPSS 17.0中的单因素和多因素Cox回归分析计算。表1示出了影响HCC患者预后危险因素的单因素和多因素Cox回归分析结果，其中HCC患者计142例(与图1相同)。HCC中miR-199a/b-3p的表达量分组见图1。多因素分析使用了年龄性别校正。

表1影响HCC患者预后危险因素的单因素和多因素Cox回归分析

通过单因素和多因素分析发现，miR-199a/b-3p的低表达是一个显著独立的预测HCC患者较低无瘤生存时间的危险因素。

实施例3：miR-199a/b-3p体外抑制HCC细胞的生长

分别采用如下序列(由上海吉玛公司合成)在人HCC细胞系Hep3B细胞中使得miR-199a/b-3p高表达：

miR-199a/b-3p：ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA(SEQ ID NO：1)

对照RNA：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO：7，3′端加TT突出是小RNA序列合成中常用的修饰方法，对其功能没有影响，主要是起到稳定核苷酸的作用【Wilda，M.等，Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion geneby RNA interference(RNAi).(通过RNA干扰(RNAi)以BCR/ABL融合基因杀伤白细胞细胞)Oncogene.2002；21：5176-5124】)。

人HCC细胞系Hep3B细胞购自中科院上海生化细胞所。使用INTERFERin转染试剂(Polyplus公司)转染小RNA，miR-199a/b-3p转染终浓度为10nM和/或50nM，对照RNA转染浓度为50nM，步骤按说明书标准步骤操作。

细胞增殖检测：Hep3B细胞的体外增殖使用MTT法检测。将5×10³个Hep3B细胞铺入96孔板每孔并培养过夜，次日转染对照RNA或miR-199a/b-3p，并于转染后0、24、48、72小时检测。首先，弃去培养上清，换入100μl含MTT 0.5mg/ml(Sigma公司)的新鲜培养基；然后37℃孵育4小时；最后换入100μlDMSO(Sigma公司)并振荡10分钟。最终吸光度使用570nm波长检测。

细胞凋亡检测：上述Hep3B细胞转染72小时之后，使用Vybrant凋亡检测试剂盒(Invitrogen公司)对细胞进行收取、洗涤、重悬和检测。标记后的细胞使用FACSCalibur流式细胞仪检测，并用CellQuest软件分析数据(购自BectonDickinson公司)，膜联蛋白V(Annexin V)阳性且PI阴性的细胞被认为是凋亡的细胞。

细胞周期检测：使用流式细胞术检测细胞周期。上述Hep3B细胞转染72小时后，收取细胞并用PBS洗涤一遍，随后使用75％的乙醇4℃固定1小时。固定后的细胞使用PBS洗三遍，再加入1ml含40μg碘化丙啶(Sigma公司)和100μgRNA酶A(Sigma公司)的PBS。最后使用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期情况。

转染miR-199a/b-3p后对Hep3B HCC细胞系增殖的影响结果如图2A所示，对Hep3B HCC细胞凋亡的影响结果如图2B所示，对Hep3B HCC细胞周期的影响结果如图2C所示。

结果显示：在HCC细胞系Hep3B中，高表达miR-199a/b-3p能够抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制细胞周期。

实施例4：miR-199a/b-3p在裸鼠人肝癌荷瘤模型SMMC-LTNM中表达降低

按照文献方法构建人原代HCC组织皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LTNM【Tao，WZ.等，The tumor invasion and metastasis in the transplantation of transplantedhuman hepatocellular carcinoma into nude mice abdominal cavity and orthotopichepatic tissue.(将人肝细胞肿瘤移植到裸鼠腹腔和常位肝组织的移植过程中的肿瘤浸润和转移)Dier Junyi Daxue Xuebao.1998；19：54-56】。根据文献报道，与常规使用的HCC细胞系构建的裸鼠荷瘤模型相比，SMMC-LTNM与人HCC的临床进展更为相似，它能够发生局部侵袭和其它器官的转移，此外还能大量分泌甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)。

利用实施例2所述qRT-PCR方法对人正常肝脏组织(来自东方肝胆医院标本库)和SMMC-LTNM肿瘤中miR-199a/b-3p的表达情况进行检测，结果如图3所示。

结果显示，SMMC-LTNM中miR-122和miR-192表达与正常肝脏组织相同；但对miR-199a/b-3p的表达表达分析显示miR-199a/b-3p在SMMC-LTNM肿瘤中表达量显著降低(图3)。

实施例5：miR-199a/b-3p抑制HCC细胞在体内的生长

利用人原代HCC组织皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LTNM观察miR-199a/b-3p的体内抑瘤效果。

(1)胆固醇偶联的miR-199a/b-3p及胆固醇偶联的对照RNA(即SEQ ID NO：7所示的RNA)均由广州锐博公司合成(胆固醇偶联后可的miRNA可自主通过细胞膜进入细胞内，转染效率较高【Wolfrum，C.等，Mechanisms and optimization of invivo delivery of lipophilic siRNAs.(体内递送亲脂性siRNA的机制和优化)NatBiotechnol.2007；25：1149-1157.】)。体内转染RNA时，将10nmol(0.1ml)胆固醇偶联的miR-199a/b-3或胆固醇偶联的对照RNA)直接瘤内注射，每三天注射一次，持续注射两周。

利用实施例2所述qRT-PCR方法对人正常肝脏组织和SMMC-LTNM肿瘤中miR-199a/b-3p的表达情况进行检测。肿瘤体积的计算按文献操作【Qi，R.等，Notch1 signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma throughinduction of cell cycle arrest and apoptosis(Notch1信号传导通过减少细胞循环静止和凋亡而抑制人肝细胞癌).Cancer Res.2003；63：8323-8329】。血清AFP的测定使用AFP ELISA试剂盒(购自Autobio公司)。

miR-199a/b-3p瘤内注射后SMMC-LTNM肿瘤中miR-199a/b-3p的表达情况如图3所示。结果显示：通过瘤内注射胆固醇偶联的miR-199a/b-3p后，miR-199a/b-3p在SMMC-LTNM肿瘤中的表达显著增高(图3)。

miR-199a/b-3p体内对肿瘤细胞生长和血清AFP含量作用试验结果如图4A和图4B所示。结果显示：瘤内注射胆固醇偶联的miR-199a/b-3p显著抑制了肿瘤的生长和血清AFP的含量(图4)。

瘤内注射miR-199a/b-3p后肿瘤组织的H&E染色结果如图5所示。结果显示：瘤内注射胆固醇偶联的miR-199a/b-3p后显著导致了肿瘤细胞的坏死(图5)。

(2)表达miR-199a/b-3p的腺相关病毒AAV8-miR-199a/b-3p(AAV-199)以及对照病毒(ctrl AAV)由上海吉玛公司制备、包装并扩增。SMMC-LTNM人肝癌荷瘤裸鼠模型构建一周后，使用1×10¹²vg(载体基因组，vector genome)AAV8-miR-199a/b-3p经尾静脉注射。注射后3周解剖裸鼠，观察肝脏肿瘤大小。肿瘤体积的计算按文献操作【Qi，R.等，同前Cancer Res.2003；63：8323-8329】。

miR-199a/b-3p体内对肿瘤细胞生长作用试验结果如图6所示。结果显示：尾静脉注射miR-199a/b-3p显著抑制了肿瘤的生长(图6)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.检测生物样品中微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的试剂在制备用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-199a/b-3p的序列如SEQID NO：1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂是对微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的试剂，优选所述试剂选自：对微小RNA miR-199a/b-3p或其前体具有检测特异性的探针、基因芯片、和PCR引物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自：肝癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含选自下组的一种或多种：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液、或体液。

7.一种检测试剂盒，其包含：

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于通过选自下组的方法检测微小RNA miR-199a/b-3p或其前体：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印记法原位杂交法。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述使用说明书中写明：当检测结果显示对象肿瘤组织中的微小RNA miR-199a/b-3p或其前体的水平低于正常或对照组织中的水平，则提示所述对象适于采用提高微小RNAmiR-199a/b-3p或其前体的量的治疗方法来治疗肿瘤、或肿瘤预后不良。

10.一种用于对象中肿瘤治疗方案选择和/或预后评估的方法，所述方法包括：