JP2012231786A - 標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】所定の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) 下記の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
(2) 被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
(3) 被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
(4) 分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
1.本発明の概要
本発明は、被験物質を摂取又は投与された被験生物から試料を採取し、その採取した試料中の遺伝子を検出して被験物質の所定の遺伝子群に対する作用を測定することで、被験生物の感受性を評価する方法、又は被験物質の機能(作用)を予測する方法である。本発明において対象となる遺伝子群を以下に示す。また、表1に標的となるタンパク質の遺伝子名、被験物質群、被験物質が標的に結合した場合に作用する機能を示している。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9
しかしながら、個体差や環境の変化により、受容体が発現しない場合がある。例えば、図1において、個体A(左パネル)と個体B(右パネル)において、成分aに対する受容体1はどちらの個体にも発現するのに対し、個体Bにおいては受容体bが発現せず、リガンドである成分bを結合することができない。従って、個体によって、受容体2を介したシグナル伝達が起こらずに、生体機能や感受性に個体差が生じることとなる。
本発明においては、所定の成分(図1では成分aや成分b)を摂取又は投与した生体から所定の遺伝子(例えば受容体1の遺伝子や受容体2の遺伝子)の発現を検出し、その検出の態様によって機能性成分の作用、あるいは機能性成分に対する被験生物の感受性などを判定することを特徴とするものである。
(1)被験物質を接触、摂取又は投与する前、又は投与等を行なった後の被験生物から試料を採取する。
(2)採取された試料を検出可能な状態へ処理し、遺伝子の検出を行う。
(3)得られた検出結果より、被験生物の感受性の評価や被験物質の機能予測を行う。
被験物質とは、被験生物に接触させる物質、被験生物が摂取する物質又は被験生物に投与する物質を意味し、食品や薬物が含まれる。
食品とはすべての飲食物のことであり、生鮮食品、加工食品、飲料、調味料材料、食品添加物などの加工材料、植物の粉砕物、植物からの抽出物、それら食品の混合物、食品成分といったものが含まれる。薬物としては医薬品、医薬部外品、薬剤候補物、薬剤混合物、化粧品、化粧品成分、香料、着色料が含まれる。
例えば生鮮食物であれば、コメ、麦、トウモロコシ、カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根、ナス、ペピーノ、トマト、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ、シロウリ、ツルレイシ、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、エダマメ、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ、スプラウト、モヤシ、かいわれ大根、イチゴ、スイカ、メロン、マクワウリ、カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ、タカナ、チシャ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス、はなっこりー、ワサビナ、アサツキ、アスパラガス、ウド、コールラビ、ザーサイ、タケノコ、ニンニク、ヨウサイ、ネギ、ワケギ、タマネギ、アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラワー、食用菊、なばな、フキノトウ、ミョウガ、サツマイモ、サトイモ、ジャガイモ、ナガイモ、ヤマノイモ、エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ、カリン、チュウゴクナシ、ナシ、マルメロ、セイヨウカリン、ジューンベリー、シポーバ、リンゴ、アメリカンチェリー、アンズ、ウメ、サクランボ、スミミザクラ、スピノサスモモ、スモモ、モモ、アーモンド、イチョウ、クリ、クルミ、ペカン、アケビ、イチジク、カキ、キイチゴ、キウイフルーツ、グミ、クワ、クランベリー、コケモモ、ザクロ、サルナシ、シーバックソーン、スグリ、ナツメ、ニワウメ、ビルベリー、フサスグリ、ブドウ、ブラックベリー、ブルーベリー、ポーポー、マツブサ、ラズベリー、ユスラウメ、柑橘類、オリーブ、ビワ、ヤマモモ、トロピカルフルーツ、イチゴ、スイカ、メロン、バナナ及びこれらの食材の可食部、葉、種子、他に牛肉、豚肉、鶏肉、卵、馬肉、羊肉、猪肉、鹿肉、魚やカニ、海老、イカ、蛸といった魚介類、海草などが挙げられる。加工食品としてはケフィア、ヨーグルト、納豆、味噌、醤油、漬物などといった発酵食品が挙げられ、他に煎茶、玉露、番茶といった緑茶や、白茶、ウーロン茶といった青茶、紅茶、黒茶、コーヒーのような飲料、前述した生鮮食品からの窄汁、塩、こしょうといった調味料などを挙げることができる。
動物は昆虫、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類の生きている動物を指す。動物はヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、ブタ、アカゲザル、コモンマーモセット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ニシツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、蚊、線虫、ショウジョウバエ、マラリア原虫などが挙げられ、植物としては、アブラナ、藻類、褐藻類などが挙げられる。
細胞は培養細胞としてU937細胞、RAW264.7細胞、RBL−2H3細胞、Jurkat細胞、HL−60細胞、MOLT−4細胞、Huh−7細胞、HepG2細胞、Hep3B細胞、Caco−2細胞、HeLa細胞、MCF−7細胞、A431細胞、S1T細胞、Su9T01細胞、HUT101細胞、PLC/PRF−5細胞、Li90細胞、HUVEC細胞、HMEC細胞、HT17細胞、NIH−3T3細胞、3T3−L1細胞、MH134細胞、dRLh−84細胞、RLN−10細胞、PC3細胞、PC12細胞、3Y1細胞、B16細胞、KU812、PANC−1細胞、U266細胞、A549細胞、RPMI8226細胞、ARH−77細胞、MKN−45細胞などヒト、マウス、ラットなど哺乳動物由来細胞株、またはこれらの細胞株から派生する細胞株、各種組織由来の初代細胞、幹細胞、ES細胞やiPS細胞を挙げることができる。菌類としては出芽酵母、分裂酵母、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、マラリア、緑膿菌、古細菌、真菌、キノコ類を挙げることができる。
被験生物から採取された試料とは、被験生物から単離又は取り出した生体試料のことをいい、血液、皮膚、粘膜、その他臓器、破砕液又はそれらより取り出された核酸のことをいう。試料中の遺伝子の検出とは採取された試料中のmRNAの量を測定することである。mRNA量測定法としては、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR法)、リアルタイムPCR法、ノーザンブロッティング及びドットブロット、核酸マイクロアレイなどの方法が挙げられる。測定のための試料の調製は各測定方法に適した方法で行う。
参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
RT−PCR法の場合、生体試料から抽出したmRNAから逆転写反応によってcDNAを合成し、測定対象の遺伝子配列に相補的な2種類のDNA断片をプライマーとしたPCR法により測定対象の遺伝子の一部配列を増幅し、増幅されたDNA断片を検出することで、mRNA量を定量することができる。使用するプライマーは、測定対象の遺伝子の塩基配列をPCR法等の核酸増幅法により増幅できるように設計・合成することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーの設計・合成は当業者に容易に実施することができる。例えば、PCR法においては、2つのプライマーの一方が測定対象遺伝子の2本鎖DNAのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが2本鎖DNA のマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。プライマーの長さとしては、例えば、少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも20塩基とする。具体的に、プライマーは、GenbankやNCBIなどのデータベースより各遺伝子のアクセッション番号により登録された1種以上の塩基配列に基づき設計し、化学合成できる。プライマーの調製は常法に従って実施できる。PCR法により増幅されたDNA断片は、アガロースゲル電気泳動の後、DNAに特異的に結合するエチジウムブロマイドやSYBER GREENなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料及び接触、摂取又は投与前またはブランク(プラセボ、溶媒のみなど)を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料を測定し、得られたmRNA量測定結果より被験物質の作用を関連付ける。測定結果で評価に使用するデータは、判定値以上の値のみを使用する。判定値はネガティブコントロールの平均値Xを用いることができ、さらにはXに標準偏差σを足した値、さらにはX+2σ、さらにはX+3σが望ましい。ネガティブコントロールとは、被験生物からの試料で検出されるはずのない遺伝子であり、例えば被験生物と異なる他種生物の遺伝子などである。得られたデータの各サンプル間の誤差をハウスキーピング遺伝子(gapdh、actin、arbp等)の値で補正し、補正したデータを用いてmRNA量の変動を判定する。mRNA量の変動は検定により統計的に判定する。各被験生物より試料をn=3以上取得し、t検定を行う。P値が0.05以下の場合に、さらには0.01以下の場合に有意に変動したと判定する。変動した遺伝子の中で被験物質の接触、摂取又は投与した場合のみで変動した遺伝子がある場合、被験物質はその遺伝子に対して作用したと判定する。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでmRNAレベルを再度データ処理し(平均値化等)、対象となる被験生物(母集団)の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、mRNAの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる(本発明の感受性評価方法、機能予測方法、及び被験物質の影響を予測する方法についても、同様に実施することができる)。
感受性の評価は、前項に記載の作用した遺伝子と表1の被験物質となる成分、被験物質となる成分が標的のタンパク質と結合した場合の機能を見て、評価を行う。例えばMYPT1のmRNA量が減少していても67LRとZAP70、BCL2のmRNA量が増加していた場合、お茶のEGCGに対して、アポトーシス誘導作用を促進する機能の点で感受性が高いと評価することが出来る。さらに、評価の方法としては被験生物と参照とを比較して行い、複数の遺伝子のmRNA量を総合的に評価することが好ましい。被験生物とは、被験物質を接触、摂取又は投与し、表1の遺伝子の発現量の変化を観測することで感受性を評価する対象者であり、参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
比較方法は被験物質を摂取した場合の生態変化(体重、血中の成分など被験物質が及ぼす効果に関するデータ)や生活習慣とmRNA量とを対応付けしたデータベースを作成し、そのデータベースと被験生物のmRNA量の測定結果とを照らし合わせて総合的に評価する。評価方法は、多変量解析による計算処理を行うのが好ましく、回帰分析、学習法、クラスター解析、相関分析などがある。まず被験生物について、被験物質摂取後の各遺伝子の発現量の値をハウスキーピング遺伝子を基準に相対値に表す、又は摂取後の値を摂取前の値又はブランクで除算した値を百分率又はLogなどで表す。参照についても同様に表し、被験生物と参照との値から計算処理を行う。このときに使用する遺伝子のデータは前項で記載した方法で変動した又は作用したと判断した遺伝子群の値を用いることが望ましい。
被験物質の機能の予測方法においては、mRNA量測定結果より各遺伝子に関連する機能からその被験物質の機能を予測することができる。複数の遺伝子の結果を用いて複合的に評価するのが好ましい。
総合的に評価する方法は以下の通りである。
例えば、ある被験物質Aの摂取前後で、67LRとZAP70、BCL2のmRNA量が増加し、eEF1AやMYPT1に変化がない場合、この被験物質Aはアポトーシス誘導作用を促進する機能が強いと予測できる。また、67LRとeEF1A、MYPT1のmRNA量が増加した場合はヒスタミン放出阻害作用を促進する機能が強いと予測できる。さらに定量的に機能の予測を行う場合は被験生物と参照又は参照群を比較する方法が好ましく、ここでいう参照は機能性が既知の試料を摂取した被験生物群が好ましい。具体的な比較方法は機能性既知試料を摂取した参照群のmRNA量とその機能性を対応付けしたデータベースを作成し、機能性未知試料を摂取した被験生物のmRNA量の測定結果を総合的に評価して機能性未知材料の機能性を予測する。総合的な評価方法は、前項に記載の方法と同様に行う。
本発明においては、被験物質に関するポジティブな機能性に加えて、副作用や毒性といったネガティブ機能性に関しても、mRNA量の変化の方向、組合せなどから、総合的に判定できるようにするのが望ましい。それにより、食材、医薬品、医薬品候補物質のポジティブな機能性だけでなく、ネガティブな機能性も併せて評価することができる。また、総合的に判断することで、他の摂取する物質への影響を評価することが出来る。例えば、治療患者の補完代替医療として用いる食品、サプリメントにおいては、その治療患者にどの食品、そのサプリメントを摂取することが良いかを評価することができ、また医薬品同士、食品成分同士を組み合わせた摂取においてもそれらの組合せによる影響を予測することもできる。
本発明は、分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、前記遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法を提供する。
この方法は、成分aが他の成分bにどのように影響するかを評価するというものである(図2)。
具体的には、以下の手法により評価する。
被験物質Xの接触、摂取又は投与前後で採取された試料のmRNA量を検出し、前述と同様にmRNAの量の変動を判定する。変動している遺伝子に結合する成分が被験物質Yとすると、XとYは影響を及ぼすと判定できる。ただし影響の効果が正に働くか(お互いの機能を高めあうか)、負に働くか(お互いの機能を打ち消しあうか)は変動の増減のみでは一様に述べることはできず、これは表1の被験物質が結合した場合の機能を参照する。例えば、X=アポトーシス誘導作用、Y=アポトーシス抑制作用の場合、被験物質Xを摂取して、Yが結合する遺伝子が増加した場合、お互いの機能を打ち消しあうと評価できる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
介入群にはやぶきた茶エキス粉末を入れたカプセルもしくはたべにふうきエキス粉末を入れたカプセルを粉末1.8g/dayとなるように計12週間投与した。対照群には実薬と外観の類似したプラセボ(デンプン粉)を12週間投与した。また、試験開始1ヶ月前から試験終了までの16週間、被験者にカテキンを含む緑茶、紅茶、ウーロン茶、サプリメント等の摂取制限をした。30〜70歳の住民249人を予備検査(血液・尿検査、身体測定)等の結果から総コレステロールやLDL−コレステロールが高い人を中心に161人を選考後、無作為に3群に分けた。摂取開始日、摂取6週間後、摂取12週間後にパクスジーンRNA採血管(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)を用いて採血し、採血した血液検体2.5mLから、PAXgene Blood RNA Kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを精製した。このTotal RNA 1μgより合成Amp II−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)を用い、添付のプロトコールに従ってaRNAの調製を行った。得られたaRNA 5μgをプラスチックチューブに入れ、Message AmpII−Biotin Enhancedキット(アプライドバイオシステムズ社製)付属の5x Array Fragmentation Buffeを4μL添加し、20μLにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液20μLに、18μLの1M Tris−HCl溶液(インビトロジェン社製)、18μLの1M NaCl溶液(ナカライテスク社製)及び15μLの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease−free waterで150μLにメスアップして、検体液を調製した。
やぶきた茶を摂取した人々においては、67LRやeEF1A、MYTP1などEGCGに関連する遺伝子、TLRファミリーが摂取期間と共に増加しているのに対し、べにふうき茶、プラセボを摂取した人々では増加していない。このことから、やぶきた茶はべにふうき茶と比較してポジティブフィードバックの効果があり、また自然免疫反応を促進する効果もあることがわかる。また、やぶきた茶を摂取した場合はFOLR3が増加したのに対して、べにふうき茶、プラセボはFOLR1、FOLR2が増加したことから、やぶきた茶とべにふうき茶で葉酸レセプターに働く作用が異なることが分かる。従って、本発明の方法は摂取者の時間経過(摂取期間)による感受性の変化を観測すること、また摂取物の機能の予測をする点で有効であるといえる。
Fragmentation Buffeを4μL添加し、20μLにメスアップしてよく混合した後、94℃で7.5分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液 20μLに、18μLの1M Tris−HCl溶液(インビトロジェン社製)、18μLの1M NaCl溶液(ナカライテスク社製)及び15μLの0.5% Tween 20溶液をそれぞれ混合し、Nuclease−free waterで150μLにメスアップして、検体液を調製した。
12週齢のオスC57BL/6Jマウス(九動株式会社)に、普通食(AIN−93G、株式会社KBTオリエンタル)または高脂肪高ショ糖食(株式会社KBTオリエンタル)を6週間制限摂食させた(4 g/day/mouse)。その後イソフルラン(アボットジャパン株式会社)麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、肝臓および大腿四頭筋を摘出した。摘出した臓器よりRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコールに従ってTotal RNAを抽出した。以下aRNAの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、データ解析は実施例1と同様に行った。
大腿四頭筋の結果を図6A及びB、肝臓の結果を図7A〜Cに示す。図中、「Control」は普通食を摂食させたマウスの結果を示し、HFHSは高脂肪高ショ糖食を摂食させたマウスの結果を示す(Mean±S.D.、*p<0.05)。
大腿四頭筋においては普通食群と比較して高脂肪高ショ糖食群では複数の遺伝子で有意な発現量の減少が観測された。大腿四頭筋で発現が有意に減少した遺伝子(P<0.05)は、Zap70、Ar、Esr1、Stx3、Clec7a、Cd11b、Gria3、Gria4、Tlr1及びTlr9であった。また、発現量が増加した遺伝子は観測されなかった。
肝臓では発現量が有意に変化した食品因子感知遺伝子は一種類であった。肝臓で発現が有意に減少した遺伝子(P<0.05)は、Cd11bであった。
これらの結果から、高脂肪高ショ糖による感受性遺伝子の変化及び臓器間で感受性遺伝子の発現量変化の違いを測定することができた。
12週齢のオスC57BL/6Jマウス(九動株式会社)を平均体重が等しくなるように群分けし、水をゾンデによって2日に一回強制投与した。投与開始から7日後、尾懸垂群(TS:Tail Suspension群、N=3)と通常群(GR:Ground群、N=3)に分け、尾懸垂試験を開始した。尾懸垂試験開始から10日後、イソフルラン(アボットジャパン株式会社)麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、各臓器及び各筋肉を摘出した。餌は固形MF食(株式会社KBTオリエンタル)を自由摂食させた。
大腿四頭筋から RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコールに従ってTotal RNAを抽出した。以下aRNAの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、解析は実施例1と同様に行った。
有意な発現量の変化があった遺伝子の結果を図8A及びBに示す。図中、「TS」は尾懸垂群を示し、「GR」は通常群を示す(Mean±S.D.、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001)。食品因子感知遺伝子の多くが廃用性筋萎縮により発現量が減少する傾向が見られ、増加した遺伝子はPpardとLgals3、Feel−2であった。この結果のように、廃用性筋萎縮状態により感受性遺伝子の発現量が低下することを該核酸マイクロアレイで測定することができた。
Claims (5)
- 下記の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9 - 被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9 - 被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9 - 分子A又は遺伝子Aを標的として作用する被験物質X、及び当該分子A又は遺伝子Aとは異なる他の分子B又は遺伝子Bを標的として作用する被験物質Yを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Xと被験物質Yとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
<遺伝子群>
67LR、ZAP70、FYN、BCL2、BCLxl、CD4、VIM、eEF1A、MYPT1、AR、ESR1、ESR2、PAPd5、ESRRB、SIRT1、ADORA3、AHR、GABRA1、GABBR1、GABBR2、PPARA、PPARD、PPARG、GPR40、GPR120、FFAR3、GPR43、GPR84、FOLR1、FOLR2、FOLR3、Folr4、CD36、STX3、TAS1R1、GPRC6A、TOP1、POLB、FABP5、CRABP2、RXRa、RXRb、RXRg、RARa、RARb、VDR、SXR、Hic2、P38IP、ADIPOR1、ADIPOR2、TRPV2、TRPA1、ADRA1A、ITLN1、TRPM8、C3、ADORA1、ADORA2A、ADORA2B、CLEC7A、CD11b、LXR、GLRA1、GLRA2、Glra3、Glra4、Glrb、NARG1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、LTB4R、LTB4R2、LGALS3、AGER、SCAF1、SCARB1、OLR1、STAB1、STAB2、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9 - 被験物質が食品又は薬物である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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