CN103853916A - 利用部分胎儿浓度确定核酸序列失衡 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用部分胎儿浓度确定核酸序列失衡的方法、系统和装置。选取了用于确定，例如，两个序列(或两组序列)的比率的失衡的一个或多个截止值。可以至少部分地基于含有母体核酸序列背景的诸如母体血浆的样品中胎儿DNA的百分比来确定所述截止值。还可以基于每一反应的序列的平均浓度来确定该截止值。在一方面，从估计含有特定核酸序列的信息孔的比例来确定该截止值，其中该比例基于上文所述的百分比和/或平均浓度来确定。可以利用诸如序贯概率比检验(SPRT)的许多不同类型的方法来确定该截止值。

Description

利用部分胎儿浓度确定核酸序列失衡

优先权的要求

本申请要求于2007年7月23日提交的、题目为“核酸序列失衡的测定”的第60/951438号美国临时申请(代理公司案卷号016285-005200US)的优先权，并且是所述临时申请的正式申请，该临时申请的全部内容通过引用的方式并入本文用于所有目的。

相关申请的交叉引用

本申请还涉及同时提交的、题目为“利用基因组测序诊断胎儿染色体非整倍性”的正式申请(代理公司案卷号016285-005220US)，该正式申请的全部内容通过引用的方式并入本文用于所有目的。

发明领域

本发明一般地涉及通过确定两个不同核酸序列之间的失衡对基因型和疾病进行的诊断检测，更具体地，涉及通过检测母体血液样品对胎儿的唐氏综合征、其它染色体非整倍性、突变和基因型的鉴定。本发明还涉及癌症的检测、移植的监测和传染病监测。

发明背景

遗传疾病、癌症和其它病况通常由两个对应的染色体或等位基因或其它核酸序列中的失衡导致或产生两个对应的染色体或等位基因或其它核酸序列中的失衡。也就是说，一个序列相对于另一序列的量大于或小于正常值。通常地，正常比率恰好是50/50的比率。唐氏综合征(21三体性)是具有额外的染色体21失衡的这类疾病。

21三体性的常规产前诊断方法包括通过诸如羊膜穿刺取样或绒毛膜绒毛取样的侵入性操作的胎儿物质的取样，这引起胎儿丢失的有限风险。诸如通过超声波扫描术和生化标记物的筛查的无创性方法已经用于在确定性的侵入性诊断方法前对孕妇进行风险分级(risk-stratify)。然而，这些筛查方法通常测量与21三体性有关的附带现象，而不是核心染色体异常，因此该筛查方法的诊断准确性不是最佳的，并且具有其它劣势，例如受孕龄影响大。

1997年发现的母体血浆中循环的无细胞胎儿DNA为无创产前诊断提供了新的可能性(Lo,YMD and Chiu,RWK2007Nat Rev Genet8,71-77)。尽管这种方法已经容易地应用于性连锁(Costa,JM et al.2002NEngl J Med346,1502)和某些单基因病症(Lo,YMD et al.1998N Engl JMed339,1734-1738)的产前诊断，但是该方法在胎儿染色体非整倍性的产前检测的应用表现出相当的挑战(Lo,YMD and Chiu,RWK2007,见上文)。首先，胎儿核酸与经常能够干扰分析的母体来源的核酸的高背景共同存在于母体血浆中(Lo,YMD et al.1998Am J Hum Genet62,768-775)。其次，胎儿核酸主要以无细胞形式在母体血浆中循环，这使得难以获得胎儿基因组中的基因或染色体的剂量信息。

最近实现了克服这些挑战的明显发展(Benachi,A&Costa,JM2007Lancet369,440-442)。一种方法检测母体血浆中的胎儿特异性核酸，从而克服了母体背景干扰的问题(Lo,YMD and Chiu,RWK2007,见上文)。从源自胎盘的DNA/RNA分子中的多态性等位基因的比率来推断染色体21的剂量。然而，当样品含有较低量的靶向的基因时，这种方法较不准确，并且只能应用于对靶向的多态性是杂合的胎儿，如果使用了一种多态性，则该靶向的多态性只是群体的子集。

Dhallan等人(Dhallan,R,et al.2007,见上文，Dhallan,R,et al.2007Lancet369,474-481)描述了通过向母体血浆中添加甲醛来富集循环的胎儿DNA比例的替代策略。通过评价对于染色体21上的单核苷酸多态性(SNP)遗传自父亲的胎儿特异性等位基因比非胎儿特异性等位基因的比率，来确定由母体血浆中胎儿贡献的染色体21序列的比例。类似地计算参考染色体的SNP比率。然后通过检测染色体21的SNP比率与参考染色体的SNP比率之间统计学的显著差异来推断胎儿染色体21的失衡，其中使用确定的小于0.05的p值来定义显著。为了保证高群体覆盖，靶向每个染色体多于500个的SNP。然而，对富集高比例的甲醛的有效性仍有争议(Chung,GTY,et al.2005Clin Chem51,655-658)，因此，该方法的可重复性需要进一步的评价。此外，由于每个胎儿和母亲将提供每个染色体的不同数目的SNP的信息，所以SNP比率比较的统计学检验的效能在不同个例之间是可变的(Lo,YMD&Chiu,RWK.2007Lancet369,1997)。而且，由于这些方法依赖于遗传多态性的检测，所以它们局限于对这些多态性是杂合的胎儿。

利用聚合酶链式反应(PCR)以及从21三体性胎儿和整倍体胎儿获得的羊膜细胞(amniocyte)培养物中的染色体21基因座和参考基因座的DNA定量，基于21三体性胎儿中染色体21的DNA序列的1.5倍的增加，Zimmermann等人(2002Clin Chem48,362-363)能够区分这两组胎儿。由于DNA模板浓度的2倍差异组成了只有一个阀值循环的差别(Ct)，所以1.5倍差异的鉴别已经是常规实时PCR的极限。为了实现更精细程度的定量鉴别，亟需替代的策略。因此，出于这一目的，本发明的某些实施方案使用数字PCR(Vogelstein,B et al.1999ProcNatl Acad Sci USA96,9236-9241)。

已经开发了数字PCR来检测核酸样品中偏移的等位基因比率(Chang,HW et al.2002J Natl Cancer Inst94,1697-1703)。数字PCR在临床上已经被证实对于检测肿瘤DNA样品中的杂合性丢失(LOH)是有用的(Zhou,W.et al.2002Lancet359,219-225)。对于数字PCR结果分析，以前的研究采用了序贯概率比检验(SPRT)来将实验结果分类为提示样品中存在LOH或不存在LOH(El Karoui et al.2006Stat Med25,3124-3133)。在以前的研究所用的方法中，确定LOH的截止值(cutoffvalue)使用了DNA中两个等位基因的固定参考比率，该比率为2/3。由于母体血浆中胎儿核酸的量、比例和浓度是可变的，所以这些方法对于使用母体血浆中的母体核酸背景中的胎儿核酸来检测21三体性是不合适的。

期望具有基于循环的胎儿核酸分析的胎儿21三体性(和其它失衡)检测的无创检测，特别是不依赖于遗传多态性和/或胎儿特异性标记物的使用的无创检测。还期望具有截止值和序列记数的准确测定，这能够减少准确性所需的数据孔的数目和/或母体血浆核酸分子的量，从而提供了增加的效率和成本效益。还期望该无创检测具有高灵敏度和特异性以将误诊断降至最低。

母体血浆中胎儿DNA检测的另一应用是单基因病症的产前诊断，例如β-地中海贫血症。然而，由于胎儿DNA只组成了母体血浆DNA的一小部分，所以这种方法被认为只能够检测胎儿从其父亲遗传但是其母亲没有的突变。这种突变的实例包括导致β-地中海贫血症的β-球蛋白基因的密码子41/42的4bp缺失(Chiu RWK et al.2002Lancet,360,998-1000)和导致囊性纤维化的囊性纤维化跨膜传导调节因子基因的Q890X突变(Gonzalez-Gonzalez et al.2002Prenat Diagn,22,946-8)。然而，由于β-地中海贫血症和囊性纤维化都是常染色体隐性条件的，其中在该疾病自身显现前，胎儿需要继承来自双亲中每个的突变，所以只检测遗传自父亲的突变只会使得胎儿患有该疾病的风险从25%增加至50%。这在诊断上不是理想的。因此，当胎儿能够被排除具有纯合疾病状态时，现有方法的主要诊断应用是用于在母体血浆中不能检测到遗传自父亲的胎儿突变的情况。然而，这种方法在诊断上的劣势是，结论是基于父亲突变的阴性检测做出的。因此，允许从母体血浆中确定完整的胎儿基因型(纯合正常、纯合突变体或杂合)而没有上文的限制的方法是非常理想的。

发明简述

本发明的实施方案提供了用于确定在生物样品中是否存在核酸序列失衡(例如，等位基因失衡、突变失衡或染色体失衡)的方法、系统和装置。例如，选择了用于确定两个序列(或两组序列)的量的比率的失衡的一个或多个截止值。

在一实施方案中，至少部分地基于诸如母体血浆或血清或尿的含有母体核酸序列背景的生物样品中的胎儿(临床相关的核酸)序列的百分比来确定所述截止值。在另一实施方案中，基于多个反应中的序列的平均浓度来确定所述截止值。在一方面，从估计含有特定核酸序列的信息孔的比例来确定所述截止值，其中该比例是基于上文所述的百分比和/或平均浓度来确定的。

可以使用许多不同类型的方法来确定所述截止值，例如SPRT、假发现(false discovery)、置信区间、接收器工作特性(receiver operatingcharacteristic)(ROC)。这种策略还在能够做出置信分类(confidentclassification)前将检测所要求的量降至最少。这种策略与模板的量通常是有限的血浆核酸分析是特别相关的。

根据一示例性实施方案，提供了用于确定生物样品中是否存在核酸序列失衡的方法，该方法包括：接收来自多个反应的数据，其中该数据包括：(1)表明临床相关的核酸序列的第一量的第一组定量数据；和(2)表明不同于所述临床相关的核酸序列的背景核酸序列的第二量的第二组定量数据；从这两个数据组来确定参数；从多个反应的每一个中的参考核酸序列的平均浓度导出第一截止值，其中该参考核酸序列是所述临床相关的核酸序列或所述背景核酸序列；将所述参数与所述第一截止值比较；并且，基于该比较来确定是否存在核酸序列失衡的分类。

根据另一示例性实施方案，提供了用于确定生物样品中是否存在核酸序列失衡的方法，该方法包括：接收来自多个反应的数据，其中该数据包括：(1)表明临床相关的核酸序列的第一量的第一组定量数据；和(2)表明不同于所述临床相关的核酸序列的背景核酸序列的第二量的第二组定量数据，其中，所述临床相关的核酸序列和所述背景核酸序列来自第一类型的细胞和来自一种或多种第二类型的细胞；从这两个数据集来确定参数；从得自核酸序列的量的测量的第一百分比导出第一截止值，该核酸序列来自生物样品中所述第一类型的细胞；将所述参数与所述截止值比较；并且，基于该比较来确定是否存在核酸序列失衡的分类。

本发明的其它实施方案涉及与本文所述的方法相关的系统和计算机可读取的介质。

参照下文的发明详述和附图将更好地理解本发明的特性和优势。

附图简述

图1是示出数字PCR实验的流程图。

图2A示出本发明实施方案的数字RNA-SNP和RCD方法。

图2B显示了在癌症中可频繁检测到的染色体畸变的实例的表格。

图3示出按照本发明的实施方案用于确定唐氏综合征的具有SPRT曲线的图。

图4显示了按照本发明的实施方案利用胎儿细胞百分比来确定疾病状态的方法。

图5显示了按照本发明的实施方案利用平均浓度来确定疾病状态的方法。

图6显示的表格的列出了按照本发明的实施方案对于表示为每孔的平均参考模板浓度(m_r)的一系列模板浓度而言，21三体性样品的预期数字RNA-SNP等位基因比率和P_r。

图7显示的表格列出了按照本发明的实施方案对于表示为每孔的平均参考模板浓度(m_r)的一系列模板浓度而言，21三体性样品中的10%、25%、50%和100%的部分胎儿DNA浓度的预期P_r。

图8显示的图示出了按照本发明的实施方案，数字RNA-SNP分析的0.1、0.5和1.0的m_r值的SPRT曲线的差异程度。

图9A显示了按照本发明的实施方案在96孔数字RNA-SNP分析中比较用于分类整倍体和21三体性实例的新和旧SPRT算法的有效性的表格。

图9B显示了按照本发明的实施方案在384孔数字RNA-SNP分析中比较用于分类整倍体和21三体性实例的新和旧SPRT算法的有效性的表格。

图10的表格显示了按照本发明的实施方案，对于给定的信息计数，被正确或错误分类为整倍体或非整倍体以及那些不可分类的胎儿的百分比。

图11是表格1100，显示了按照本发明的实施方案，纯(100%)胎儿DNA样品的数字RCD分析的计算机模拟。

图12是表格1200，显示了按照本发明的实施方案，m_r=0.5的数字RCD分析的准确性的计算机模拟的结果，该数字RCD分析用于对来自具有不同部分浓度的胎儿DNA的整倍体或21三体性胎儿的样品进行分类。

图13A显示了按照本发明的实施方案，整倍体妊娠和21三体性妊娠的胎盘组织的数字RNA-SNP分析的表格1300。

图13B显示了按照本发明的实施方案，来自整倍体妊娠和21三体性妊娠的母体血浆的数字RNA-SNP分析的表格1350。

图14A-14C显示的图示例了按照本发明实施方案得自RCD分析的截止曲线。

图15A显示了按照本发明的实施方案，整倍体妊娠和21三体性妊娠的胎盘组织中的数字RNA-SNP分析的表格。

图15B显示了按照本发明的实施方案，来自一个母体血浆样品的12个反应板的数字RNA-SNP数据的表格。

图15C显示了按照本发明的实施方案，来自整倍体妊娠和21三体性妊娠的母体血浆的数字RNA-SNP分析的表格。

图16A显示了按照本发明的实施方案，整倍体胎盘和18三体性胎盘的数字RNA-SNP分析的表格。

图16B显示了按照本发明的实施方案，整倍体胎盘和18三体性胎盘的数字RNA-SNP数据的SPRT解释。

图17显示了按照本发明的实施方案，整倍体妊娠和21三体性妊娠的50%胎盘/母体血液细胞DNA混合物的数字RCD分析的表格。

图18显示的SPRT曲线示例了按照本发明的实施方案，用于正确分类的判定边界(decision boundary)。

图19显示了按照本发明的实施方案，来自整倍体妊娠和21三体性妊娠的羊水样品的数字RCD分析的表格。

图20显示了按照本发明的实施方案，来自整倍体妊娠和18三体性妊娠的胎盘DNA样品的数字RCD分析的表格(E=整倍体；Tl8=18三体性)。

图21显示了按照本发明的实施方案，整倍体妊娠和21三体性妊娠的50%胎盘/母体血液细胞DNA混合物的多重数字RCD分析的表格(E=整倍体；T21=21三体性；U=未分类的)。

图22A和22B显示按照本发明的实施方案，50%整倍体或21三体性胎盘基因组DNA/50%母体血沉棕黄色层(buffy coat)DNA混合物的多重数字RCD分析的表格。Unclass表示不可分类的并且T21表示21三体性。

图23显示了雄性和雌性配偶都携带相同突变的情况。

图24A显示按照本发明的实施方案，雌性/雄性和雄性/雄性DNA混合物的数字RMD分析的表格。

图24B显示了按照本发明的实施方案，25%雌性与75%雄性DNA混合物的数字RMD分析的表格。

图25显示了按照本发明的实施方案，模拟母体血浆样品HbE突变的15%-50%DNA混合物的数字RMD分析的表格。

图26A显示了按照本发明的实施方案，模拟母体血浆样品CD41/42突变的5%-50%的DNA混合物的数字RMD分析的表格。

图26B显示了按照本发明的实施方案，模拟母体血浆样品CD41/42突变的20%的DNA混合物的数字RMD分析的表格。

图27显示了可用于本发明的实施方案的系统和方法的示例性计算机装置的方框图。

定义

本文所用的术语“生物样品”意指取自个体(例如，诸如孕妇的人)并含有一种或多种感兴趣的核酸分子的任何样品。

术语“核酸”或“多核苷酸”意指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的聚合物。除非特别地限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守地修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确地指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下的序列实现：其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧次黄苷残基取代(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、小非编码RNA、微RNA(miRNA)、Piwi-相互作用RNA以及基因或基因座编码的短发夹RNA(shRNA)可交换使用。

术语“基因”表示与产生多肽链有关的DNA的片段。其可以包括编码区之前和之后的区域(前导区和非转录尾区)以及单独的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

本文所用的术语“反应”意指与表示感兴趣的特定多核苷酸序列的存在或不存在的化学、酶或物理作用有关的任何过程。“反应”的实例是诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增反应。“反应”的另一实例是通过合成或通过连接的测序反应。“信息反应”是表明一种或多种感兴趣的特定多核苷酸序列的存在的反应，并且在一种情况下，只存在一种感兴趣的序列。本文所用的术语“孔”意指在有限的结构内的预定位置的反应，例如，PCR阵列中的孔状小管、单元或室。

本文所用的术语“临床相关的核酸序列”能够指对应于更大的基因组序列的片段的多核苷酸序列或者指更大的基因组序列自身，该多核苷酸序列的潜在失衡被检测。一个实例是染色体21的序列。其它实例包括染色体18、13、X和Y。仍然其它的实例包括胎儿遗传自其双亲中一个或两个的突变的遗传序列或遗传多态性或拷贝数变异。仍然其它的实例包括在恶性肿瘤中突变、缺失或扩增的序列，例如，发生了杂合性丢失或基因重复的序列。在某些实施方案中，多个临床相关的核酸序列或该临床相关的核酸序列等同的多个标记物能够用于提供检测失衡的数据。例如，来自染色体21上的5个不连续序列的数据能够以累加的方式用于确定可能的染色体21失衡，从而将所需的样品体积有效地减少至1/5。

本文所用的术语“背景核酸序列”意指与所述临床相关的核酸序列的正常比率是已知的核酸序列，例如，1比1的比率。作为一个实例，所述背景核酸序列和所述临床相关的核酸序列是来自相同的染色体并且由于杂合性而不同的两个等位基因。在另一实例中，所述背景核酸序列是与另一等位基因杂合的一个等位基因，所述另一等位基因是所述临床相关的核酸序列。而且，某些背景核酸序列和临床相关的核酸序列的每一个可以来自不同的个体。

本文所用的术语“参考核酸序列”意指每个反应的平均浓度是已知的或者已经被等同地测量过的核酸序列。

本文所用的术语“过度表现的(overrepresented)核酸序列”意指在生物样品中的两个感兴趣的序列(例如，临床相关的序列和背景序列)之中丰度比另一序列更高的的核酸序列。

本文所用的术语“基于”表示“至少部分地基于”，并且意指在确定另一值时所用的一个值(或结果)，例如，发生在方法的输入和该方法的输出的联系中。本文所用的术语“导出”也意指方法的输入和该方法的输出的联系，例如，当导出是公式的计算时发生。

本文所用的术语“定量数据”表示从一个或多个反应获得并且提供一个或多个数值的数据。例如，显示特定序列的荧光标记物的孔的数目是定量数据。

本文所用的术语“参数”表示表征定量数据组和/或定量数据组之间的数值联系的数值。例如，第一核酸序列的第一量与第二核酸序列的第二量之间的比率(或比率的函数)是参数。

本文所用的术语“截止值”表示用于在生物样品的两个或更多个类别状态(例如，患病和未患病)之间进行裁定(arbitrate)的数值。例如，如果参数大于截止值，将定量数据分为第一类(例如，患病状态)，或者如果该参数小于该截止值，则将定量数据分为另一类(例如，未患病状态)。

本文所用的术语“失衡”表示由临床相关的核酸序列的量中至少一个截止值所定义的与参考量的任何显著偏差。例如，该参考量能够是3/5的比率，因此如果测量的比率是1:1，则发生了失衡。

发明详述

本发明提供了方法、系统和装置，用于确定在生物样品中，与临床相关的核酸序列相对于其它非临床相关的序列的参考(例如，未患病)量比较，是否存在增加或减少(例如，染色体或等位基因失衡)。选择一个或多个截止值来确定与参考量相比是否存在变化(即，失衡)，例如，关于两个序列(或两组序列)的量的比率。检测到的参考量变化可以是临床相关的核酸序列与其它非临床相关的序列的关系的任何偏差(上升或下降)。因此，参考状态可以是任何比率或其它量(例如，除了1-1的对应)，并且表示变化的测量状态可以是任何比率或不同于由一个或多个截止值所确定的参考量的其它量。

所述临床相关的核酸序列和所述背景核酸序列可以来自第一类型的细胞和来自一种或多种第二类型的细胞。例如，源自胎儿/胎盘细胞的胎儿核酸序列存在于诸如母体血浆的生物样品中，该生物样品包含源自母体细胞的母体核酸序列的背景。因此，在一实施方案中，至少部分地基于生物样品中所述第一类型的细胞的百分比来确定截止值。注意，可以通过任何源自胎儿的基因座来测定样品中胎儿序列的百分比，并且不限于测量所述临床相关的核酸序列。在另一实施方案中，至少部分地基于诸如血浆、血清、唾液或尿的生物样品中肿瘤序列的百分比来确定截止值，该生物样品包含源自体内的非恶性细胞的核酸序列的背景。

仍然在另一实施方案中，基于多个反应中序列的平均浓度来确定截止值。在一方面，从估计含有特定核酸序列的信息孔的比例来确定所述截止值，其中该比例是基于上文所述的百分比和/或平均浓度来确定的。可以使用许多不同类型的方法来确定截止值，例如，SPRT、假发现、置信区间、接收器工作特性(ROC)。这种策略还能够在做出确信的分类前将检测所要求的量降至最少。这与模板的量通常有限的血浆核酸分析是特别相关的。尽管通过数字PCR来表现这种策略，但是也可以使用其它方法。

数字PCR包括极端稀释的核酸的多个PCR分析，从而大部分阳性扩增反映了来自单个模板分子的信号。由此数字PCR允许计数单独的模板分子。分析的PCR总数中的阳性扩增的比例允许估计原始或未稀释的样品中的模板浓度。这种技术被认为允许检测各种遗传现象(Vogelstein,B et al.1999，见上文)，并且最近被用于检测肿瘤样品(Zhou,W.et al.2002,见上文)和癌症患者血浆(Chang,HW et al.2002,见上文)中的杂合性丢失。由于通过数字PCR的模板分子定量不依赖于报道染料与核酸浓度之间的剂量反应关系，所以理论上数字PCR分析的精度应当高于实时PCR的精度。因此，数字PCR潜在地能够允许鉴别靶基因座与参考基因座之间更精细程度的定量差异。

为了对此进行检测，我们首先评价数字PCR是否能够测定母体血浆中来自染色体21的胎盘转录物，PLAC4mRNA的等位基因比率(Lo,YMD,et al.2007Nat Med13,218-223)，从而区分21三体性胎儿和整倍体胎儿。这种方法被称为数字RNA-SNP方法。我们然后评价数字PCR增加的精度是否能够允许检测胎儿的染色体非整倍性而不依赖于遗传多态性。我们将这种方法称为数字相关的染色体剂量(RCD)分析。数字RNA-SNP方法依赖于多态性，但是在定量鉴别中要求较低的精度，而数字相关的染色体剂量(RCD)分析不依赖于多态性，但是对于定量鉴别要求较高的精度。

I.数字RNA-SNP

A.概述

数字PCR能够检测DNA样品中两个等位基因的等位基因比率偏移的存在。例如，数字PCR已经用于检测肿瘤DNA样品中的杂合性丢失(LOH)。假定在DNA样品中有两个等位基因，即A和G，并且A等位基因将在细胞中随着LOH而丢失。当在肿瘤样品的50%的细胞中存在LOH时，该DNA样品中G:A的等位基因比率将是2:1。然而，如果在该肿瘤样品中不存在LOH，则G:A的等位基因比率的比率将是1:1。

图1是示出数字PCR实验的流程图。在步骤110中，将DNA样品稀释，然后分配至单独的孔中。注意，发明人已经确定在原始样品中，某些血浆核酸种类已经被充分地稀释。因此，如果某些模板已经以需要的浓度存在，则不需将它们稀释。在以前的研究中(例如，Zhouet al.2002,见上文)，将DNA样品稀释至特定的“模板DNA”的平均浓度约是每孔的两个模板中的一个模板0.5分子的程度。注意，术语“模板DNA”看起来意指A等位基因或G等位基因，并且没有为这种具体的浓度提供原理阐述。

在步骤120中，在每个孔中进行PCR过程来同时检测A等位基因和/或G等位基因。在步骤130中，在每个孔中鉴定了标记物(例如，通过荧光)，例如，A、G、A和G或者A和G都不是。在没有LOH的情况下，DNA样品中的A等位基因与G等位基因的丰度将是相同的(每孔一个拷贝)。因此，孔对该A等位基因与对该G等位基因是阳性的概率是相同的。这通过对该A等位基因或对该G等位基因是阳性的孔的数目相似反映出。然而，当在肿瘤样品的50%或更多的细胞中存在LOH时，G等位基因和A等位基因的等位基因比率将至少是2:1。以前的方法简单地假定，样品是至少50%癌性的。因此，孔对G等位基因是阳性的概率将高于对A等位基因是阳性的概率。因此，对G等位基因是阳性的孔的数目将大于对A等位基因是阳性的孔的数目。

在步骤140中，为了分类数字PCR的结果，计数对每个等位基因是阳性的，但是对另一等位基因不是阳性的孔。在上文的实例中，计数了对A等位基因是阳性，但对G等位基因是阴性的孔的数目和对G等位基因是阳性，但对A等位基因是阴性的孔的数目。在一实施方案中，表现出较少的阳性孔的等位基因被视为参考等位基因。

在步骤150中，信息孔的总数被确定为对所述两个等位基因的任一个是阳性的孔的数目的总和。在步骤160中，计算了由具有较多的阳性孔的等位基因贡献的信息孔的比例(P_r)(参数的实例)。P_r=只对具有较多阳性孔的等位基因是阳性的孔的数目/只对一个等位基因(A或G)是阳性的孔的总数。其它实施方案能够使用具有一个等位基因的全部孔除以具有至少一个等位基因的全部孔。

在步骤170中，确定P_r的值是否表示等位基因失衡。由于期望准确度和效能，所以这一任务并非简单的。确定失衡的一种方法使用了Bayesian类似然方法，序贯概率比检验(SPRT)。SPRT是允许随着数据的积累比较两种概率假设的方法。换言之，SPRT是将数字PCR结果分类为表示等位基因偏移存在或不存在的统计学方法。该方法具有将获得特定统计功效和准确度所需要分析的孔的数目减至最小的优势。

在示例性的SPRT分析中，将针对无效假设和备选假设来检验实验结果。当在样品中有等位基因比率偏移时，则接受备选假设。当在样品中没有等位基因比率偏移时，则接受无效假设。将该P_r值与两个截止值比较以接受无效假设或备选假设。如果没有接受任何一个假设，则将该样品标记为未分类的，这表示观察到的数字PCR结果不足以以期望的统计学可信度将该样品进行分类。

通常基于在假设中给出的假定下的P_r固定值来计算接受无效假设或备选假设的截止值。在所述无效假设中，假定样品没有表现出等位基因比率偏移。因此，对A等位基因和G等位基因是阳性的每个孔的概率将是相同的，因此，P_r的预期值将是1/2。在所述备选假设中，P_r的预期值是2/3，或者大约是0.5与2/3的中间值，例如0.585。并且，由于有限的实验数目，能够选择上限(.585+3/N)和表示为(.585-3/N)的下限。

B.唐氏综合征的检测

在本发明的一实施方案中，数字SNP用于从孕妇血浆中检测胎儿唐氏综合征。使用对胎儿/胎盘细胞特异性的标记物可以测量染色体21中的等位基因比率。例如，为了确定观察到的PLAC4等位基因的过度表现的程度是否是统计学显著的，使用SPRT。

根据一示例性的实施方案，数字RNA-SNP确定了位于PLAC4mRNA的A/G SNP，rs8130833的多态性等位基因比率的失衡，该mRNA是从染色体21转录并被胎盘表达的。对于杂合的整倍体胎儿，A等位基因和G等位基因应当在胎儿基因组中被相等地表现(1:1基因组比率)；而在21三体性中，三体的染色体21将与胎儿基因组中的一个SNP等位基因的额外拷贝有关，从而获得2:1的比率。数字PCR的目的是确定分析的样品中的两个PLAC4等位基因的量是否相等。因此，A PLAC4等位基因和G PLAC4等位基因都是靶模板。设计了实时PCR测定来扩增PLAC4mRNA，并且通过TaqMan荧光探针来鉴别这两个SNP等位基因。分析步骤的示意图示于图2A中。

图2A示出本发明实施方案的数字RNA-SNP方法200。在步骤210中，接收样品。在步骤220中，在提取的RNA样品中将诸如PLAC4mRNA的核酸序列定量。在一实施方案中，通过PLAC4mRNA的实时PCR来进行这种定量。在一方面，这个步骤为操作者提供在靶标达到数字PCR分析的“范围”前所需的稀释程度的概念。

在步骤230中，将样品稀释。在步骤240中，测量稀释的样品的浓度。稀释的样品浓度可以被证实为约1个模板/孔(即，参考序列或非参考序列或任何一个等位基因)。某些实施方案使用第IV部分所述的技术来进行这一测量。例如，我们将稀释的样品分配至实时PCR分析的96个孔中来保证实现了可用的稀释。如在后文中将解释的，稀释浓度也可以是未知的，从而省略这一步骤。

在步骤250中，在阵列的每个孔中进行数字PCR。例如，将相同的稀释的样品分配至实时PCR分析的384个孔中。从PCR结果中鉴定了每个核酸序列的标记物的量和信息孔的数目。信息孔被定义为仅对A等位基因或G等位基因是阳性，而不是对两个等位基因都是阳性的孔。在步骤260中，计算P_r的预期值。在后文中将更详细地讨论这些步骤。所述计算包括从步骤250所测定的值来确定参数。例如，可以计算每孔的实际平均模板浓度。

在步骤270中，可以进行SPRT或其它似然比率检验来确定是否存在失衡。对于整倍体情况，我们预期相等数目的A阳性孔和G阳性孔。然而，当分析来自21三体性胎儿的模板分子时，只含有一个等位基因的孔的数目将大于只含有另一等位基因的孔的数目。简而言之，等位基因失衡对21三体性是预期的。

如上文所述的，SPRT是Bayesian类似然方法(Bayesian-typelikelihood method)，该方法允许随数据的积累比较两个概率假设。在21三体性检测的数字PCR分析中，当存在等位基因失衡时(即，检测到21三体性)，则接受备选假设；当没有等位基因失衡时(即，没有检测到21三体性)，则接受无效假设。更多数目计数的等位基因被称为潜在地过度表现的等位基因，并且将计算该等位基因在全部信息孔中的比例(P_r)。如果该P_r表明了足够程度的对21三体性样品预期的等位基因失衡，则应用SPRT来进行确定。

可操作地，能够通过使用具有一对SPRT曲线的图来应用和解释SPRT，构建该SPRT曲线来定义接受或拒绝任何一个假设的概率边界。图3示出按照本发明的实施方案用于确定唐氏综合征的SPRT曲线的图。当能做出确信的分类时，SPRT曲线将对潜在过度表现的等位基因是阳性的信息孔的所需比例P_r(y-轴)对信息孔的给定的总数(x-轴)作图。如图3所示，上部曲线设定接受备选假设的概率边界，而下部曲线设定接受无效假设的概率边界。

将实验推导出的P_r值与预期P_r值相比较以便接受或拒绝任一假设。如果接受无效假设，则将该样品分类为从怀有整倍体胎儿的孕妇获得的样品。如果接受备选假设，则将该样品分类为从怀有21三体性胎儿的孕妇获得的样品。可选择地，如果给定数目的信息计数的P_r没有达到疾病分类所要求的统计学可信度，则不能接受任何一个假设。在有更多的可用数据以前，这些情况被视为不可分类的。如果疾病分类是不可能的，则可以进行额外的384孔板直到累积的数据可以通过SPRT来分类。

因此，对于给定水平的可信度，SPRT比其它统计学方法提供了更少的所需检测量的优势。在实践中，只要积累了所需量的数据，SPRT就允许接受或拒绝任何一个假设，从而将不需要的额外分析降至最低。这种特性与通常以低浓度存在的血浆核酸的分析特别相关，其中可用的模板的数目是有限的。除了严格的分类以外，所述分类还可以包括百分比准确度。例如，来自与截止值比较的分类可以提供表现出具有某一百分比的核酸序列失衡的可能性的样品，或者，等效地提供准确至某一百分比或其它值的确定失衡。

利用母体血浆或血清中的胎儿核酸，可以应用类似的方法来确定关于突变或遗传多态性的胎儿基因型。应当记得的是，胎儿将从其母亲遗传胎儿一半的基因组。作为示例，考虑具有两个等位基因A和B的特定遗传基因座。如果母亲是基因型为AB的杂合子，则胎儿理论上能够具有AA、BB或AB的基因型。如果胎儿的基因型为AB，即，与母亲相同，则母体血浆中将只有AB基因型的核酸(既来自母亲又来自胎儿)。因此，在母体血浆中观察到了核酸或等位基因的平衡。在另一方面，如果胎儿的基因型为AA或BB，则在母体血浆中将分别有过度表现的A等位基因或B等位基因的等位基因失衡。这种考虑还适用于导致疾病的突变(例如，导致囊性纤维化、β-地中海贫血症或脊髓型肌萎缩的那些突变)，在这种情况下，A能够被考虑为野生型等位基因，而B能够被考虑为突变体等位基因。

II.数字RCD

数字RNA-SNP的劣势是，其只能应用于被分析的SNP是杂合的个例。一个改进是，基于循环的胎儿核酸分析的检测胎儿21三体性或其它胎儿染色体非整倍性(例如，18三体性、13三体性和性染色体非整倍性)的无创检测与遗传多态性的使用无关将是理想的。因此，在一实施方案中，通过相对于位于参考染色体，即本研究中的染色体1上的基因座的非多态性的染色体21基因座的数字PCR分析来测定染色体剂量。从21三体性个例中区分整倍体胎儿基因组中染色体21比染色体1的比率偏离2:2的变化。在21三体性检测的数字PCR分析中，要比较的两个假设将是没有染色体失衡(即，没有检测到21三体性)的无效假设和存在染色体失衡(即，检测到了21三体性)的备选假设。

这种方法能够被推广至与其它染色体非整倍性有关的其它染色体，例如，18三体性中的染色体18、13三体性中的染色体13、特纳综合征中的染色体X。另外，除了染色体1，与非整倍性无关的其它染色体也能够用作参考染色体。通过分析在癌症中通常部分地缺失的染色体比参考染色体的比率的变化，能够将类似的方法应用于检测癌症。通常部分地缺失的染色体的实例包括直结肠癌中的染色体5q、肺癌中的染色体3p和鼻咽癌中的染色体9p。图2B列出了某些导致序列失衡的某些常见的与癌症有关的染色体畸变。

图2A还示出本发明实施方案的数字RCD方法205。在步骤220-230的一实施方案中，例如，通过Nanodrop技术，将提取的DNA定量，并稀释至每孔大约一个靶模板的浓度，所述靶模板来自染色体21或标准化的染色体(例如，染色体1)的。在步骤240的一实施方案中，在384孔板中使用两个TaqMan探针进行数字RCD分析前，可以进行如下证实：通过分析稀释的DNA样品来证实约37%的水平的孔是否是阴性的，该分析只通过使用96孔格式的染色体1探针的测定来进行。37%的显著性将在后面的第IV部分中进行讨论。

步骤240的检测和步骤250的结果可以用设计成扩增存在于两条染色体上的种内同源序列(paralogous sequence)(Deutsch,S.et al.2004J Med Genet41,908-915)的实时PCR测定来完成，所述染色体被通过一对TaqMan探针鉴别的平行同源序列变化所区分。在本文中，信息孔被定义为对任一染色体21或染色体1基因座是阳性的，而对这两条染色体不都是阳性的孔。对于整倍体胎儿，对任一基因座是阳性的信息孔的数目应当大致相等。对于21三体性胎儿，应当有与染色体1阳性孔相比，染色体21阳性孔的过度表现。在下文的部分中描述了过度表现的确切比例。

III.并入胎儿序列的百分比

上文所述的方法200和205的实施方案的劣势在于胎儿特异性的标记物是必需的。因此，在本发明的一实施方案中使用了非胎儿特异性的标记物。为了使用这种非胎儿特异性的标记物，本发明的实施方案测量了母体血浆(即，生物样品)中胎儿DNA的部分浓度(fractionalconcentration)。通过这些信息，可以按照如下步骤来计算更有用的P_r值。

即便对于母体血浆中胎儿DNA的小的部分百分比，21三体性胎儿将通过释放至母体血浆中的胎儿DNA的基因组当量(genome-equivalent)(GE)贡献额外剂量的染色体21序列。例如，含有50GE/ml总DNA和5GE/ml胎儿贡献的DNA(即，10%胎儿DNA部分浓度)的来自整倍体妊娠的母体血浆样品将会含有每毫升母体血浆总共100个拷贝(90个母体拷贝+10个胎儿拷贝)的染色体21序列。对于21三体性妊娠，每个胎儿GE将贡献3个拷贝的染色体21，这导致母体血浆中总共105个拷贝/ml(90个母体拷贝+15个胎儿拷贝)的染色体21序列。因此，在10%的胎儿DNA浓度时，三体妊娠母体血浆中源自染色体21的序列的量将是整倍体情况的1.05倍。因此，如果能够开发测定这种小程度的定量差异的分析方法，将实现不依赖于多态性的胎儿21三体性的无创产前诊断检测。

因此，过度表现的程度将取决于分析的DNA样品中部分胎儿DNA浓度。例如，当分析胎盘DNA时，胎儿基因组中的理论RCD比率应当是3:2，即，1.5倍的差异。然而，如上文所述的，当分析含有10%的胎儿母体血浆时，该理论RCD比率将降至1.05。通过将只对染色体21基因座是阳性的孔的数目除以信息孔的总数来计算实验导出的P_r。用计算的P_r和理论RCD比率来对实验导出的P_r进行SPRT分析。

图4表示按照本发明的实施方案，利用胎儿核酸百分比来确定疾病状态的方法400。在步骤410中，测量了胎儿物质的部分百分比。在一实施方案中，通过测量相对于非胎儿特异性标记物(即，在母亲和胎儿中都存在的基因序列)的胎儿特异性标记物(例如，Y染色体，遗传多态性标记物(例如，SNP)、胎盘外遗传特征(epigenetic signature))的量来确定所述部分百分比。通过实时PCR、数字PCR、测序反应(包括大规模平行基因组测序)或任何其它定量方法来进行实际的测量。在一方面，优选地不使用对于本测量能够潜在地处于等位基因失衡的基因靶标。

在步骤420中，进行了数字PCR或其它测量方法，包括将样品稀释，将该稀释的样品置于孔中并测量每孔中的反应。在步骤430中，将PCR结果用于鉴定不同参考核酸序列(例如染色体或等位基因)的标记物。在步骤440中，计算了过度表现的序列的实际比率(P_r)。在步骤450中，利用样品中胎儿物质的百分比来计算用于确定疾病状态的截止值。在步骤460中，从该实际P_r和该截止值来确定是否存在失衡。

在一实施方案中，将参考核酸序列的部分百分比并入数字RNA-SNP方法中。因此，当研究由于癌细胞的LOH时，能够用少于50%癌细胞的肿瘤样品来进行这一步骤。还可以将这一步骤用于多于50%的癌细胞的样品以获得更准确的P_r，并因此减少将导致错误诊断的假阳性的数目。在另一实施方案中，将胎儿核酸百分比并入数字PCR方法中以确定胎儿是否已遗传了父母的基因突变(例如，导致囊性纤维化或β-地中海贫血症或脊髓型肌萎缩的突变)或确定来自母体血浆核酸分析的多态性。

IV.并入每孔的平均浓度

以前的方法(例如，Zhou,W.et al.2002,见上文)的另一个劣势是要求每孔的平均模板浓度(m)是每孔1个。考虑到难以获得确切的浓度，这能够导致误差。而且，甚至对于每孔1个模板的确切浓度，以前的方法忽略了孔中的模板的统计学分布。在以前的方法，即，老的算法中，假定接受备选假设的P_r的预期值是等位基因比率，因此，该P_r的预期值与每孔中的模板DNA的平均浓度无关。

然而，由于稀释样品中模板的天然统计变异(statistical variation)，将不会有确切的每孔1个模板。本发明的实施方案测量至少一种序列的平均浓度，然后将该平均浓度用于计算截止值，即预期的P_r。在一方面，这种计算包括了统计学分布以确定含有不同核酸序列的孔的概率，然后将该概率用于确定预期的P_r。

在一实施方案中，获取了一种参考核酸序列的平均浓度，其在一实例中是DNA样品中较低浓度的核酸序列。在样品不具有失衡的情况下，样品中两种序列的浓度将是相同的，并且任何一种都能够被视为参考等位基因。在样品具有，例如，LOH的情况下，在癌细胞中缺失的等位基因将被视为参考等位基因。将该参考等位基因的平均浓度表示为m_r。在另一实施方案中，浓度较高的序列可以被视作参考序列。

A.数字SNP：使用SPRT和数字PCR的实例

图5显示了按照本发明的实施方案，使用平均模板浓度来确定疾病状态的方法500。在步骤510中，测量了不同序列的量。例如，可以通过计数如上文所解释的数字PCR实验中的标记物来进行这一步骤。然而，可以通过其它方法来进行这一步骤，该方法不包括扩增步骤或者不使用荧光标记物，但是能够使用其它属性，例如如同质量的物理属性、比旋光属性或碱基配对属性。

在步骤520中，测定了过度表现的序列的实际比例。如上文所述的，可以通过获取只表现出过度表现的序列的孔的数目，然后将该数目除以信息孔的数目来完成这个步骤。在步骤530中，测量了至少一种序列(参考序列)的平均浓度。在一实施方案中，所述参考序列是过度表现的序列。在另一实施方案中，所述参考序列是过少表现(underrepresented)的序列。可以通过计数在数字PCR实验中对参考序列是阴性的孔的数目来进行测量。如在下个分段中所述的，通过泊松分布(Poisson distribution)来描述阴性孔的比例与平均目标浓度之间的关系。

在步骤540中，例如，使用泊松分布来计算对不同的序列是阳性的孔的预期量。该预期量可以是每孔的序列的概率、每孔的平均序列、含有序列的孔的数目或其它合适的量。在步骤550中，从该预期的量计算预期的P_r。在步骤560中，例如，通过使用SPRT，从预期的P_r计算截止值。在步骤570中，确定了核酸序列失衡的分类。现在将描述方法500的具体方面。

1.确定序列的预期量

一旦从步骤530知道了每孔的平均浓度(反应或反应混合物)，就可以在步骤540中计算表现出该序列的孔的预期数目。这种量可以表示为%、分数值或整数值。利用具体的实例进行说明，假定每孔的参考模板的平均浓度(m_r)是每孔0.5个，并且21三体性胎儿在PLAC4SNP，rs8130833的基因型是AGG。因此，参考模板是A等位基因，并且过度表现的模板是G等位基因。

在一实施方案中，假定A等位基因在诸如数字PCR的测量方法的孔的反应混合物中的分布是泊松分布。在其它实施方案中，使用了其它分布函数，例如二项分布。

泊松方程式是：其中，n=每孔的模板分子的数目；P(n)=n个模板分子在特定的孔中的概率；并且m=特定的数字PCR实验中一个孔中的模板分子的平均数目。

因此，在0.5的平均A等位基因的浓度下，不含A等位基因的任何分子的任何孔的概率是：

$P\left(0\right)=\frac{{0.5}^0{e}^{-0.5}}{0!}=e^{-0.5}=0.6065$

因此，含有A等位基因的至少一个分子的任何孔的概率是：1-0.6065=0.3935。因此，预期约39%的孔将含有A等位基因的至少一个分子。

关于非参考核酸序列，对于21三体性胎儿的每个细胞，A比G的基因组比率将是1:2。假定在提取的RNA或DNA样品中的A比G的比率保持不变，则每孔的G等位基因的平均浓度将是A等位基因的平均浓度的2倍，即，2×0.5=1。

因此，在平均的G等位基因浓度为1的情况下，不含G等位基因的任何分子的任何孔的概率是：

$P\left(0\right)=\frac{1^0{e}^{-1}}{0!}=e^{-1}=0.3679$

因此，含有G等位基因的至少一个分子的任何孔的概率是：1-0.3679=0.6321。因此预期约63%的孔会含有G等位基因的至少一个分子。

2.确定过度表现的序列的比例

计算了预期量后，可以确定过度表现的核酸序列的比例。假定用A等位基因和G等位基因填充孔是独立的，则含有两个等位基因的孔的概率是0.3935×0.6321=0.2487。因此，预期约25%的孔将含有两个等位基因。

预期含有A等位基因，但是不含有G等位基因的孔的比例将是含有至少一个A等位基因的孔的数目减去既含有A等位基因又含有G等位基因的孔的数目：0.3935-0.2487=0.1448。类似地，预期含有G等位基因，但是不含有A等位基因的孔的比例将是0.6321-0.2487=0.3834。信息孔被定义为对A等位基因或G等位基因是阳性，但是不对两个等位基因都是阳性的孔。

因此，在数字RNA-SNP分析中，含有A等位基因的孔相对于G等位基因的孔的预期比率是0.1448/0.3834。换言之，只对G等位基因是阳性的孔的比例是只对A等位基因是阳性的孔的比例的2.65倍。这与胎儿基因组比率形成对比，其中过度表现的等位基因是另一等位基因的2倍。

对于SPRT分析，计算了对过度表现的等位基因是阳性的信息孔的比例((P_r)，并利用SPRT曲线对该比例进行解释。在本实例中，信息孔的比例是：0.1448+0.3834=0.5282。因此，在m_r为0.5时，21三体性病例的预期P_r是0.3834/0.5282=0.73。

由于平均模板浓度(m)是泊松方程式中的关键参数，所以P_r将随m而变化。图6显示了本发明实施方案的表600，该表列出了对于表示为每孔的平均参考模板浓度(m_r)的一系列模板浓度，21三体性样品的预期的数字RNA-SNP等位基因比率和P_r。表600显示了对于一系列每孔的平均参考模板浓度(m_r)，预期的等位基因比率和对过度表现的等位基因是阳性的信息孔的比例(P_r)。

P_r的预期值以非线性的方式随每孔的参考等位基因的平均浓度(m_r)而变化。如表600所示，接受备选假设的P_r的预期值随m_r而增加。由于接受无效假设的P_r的预期值固定为0.5，所以当m_r增加时，具有或不具有等位基因失衡的样品就P_r值而言将分得更开。注意，在其它实施方案中，接受无效假设的值可以不同于0.5。当正常比率不同于1:1，例如5:3时，可能发生这种情况，因此，当比率偏离5:3时，将发生失衡。将基于具体情况来确定两种不同核酸序列的量的差异。

然而，由于以前的方法(例如，Zhou,W.et al.2002,见上文)使用了LOH样品的固定的P_r预期值，所以这些方法低估了具有LOH的那些样品的P_r值(接受备选假设)。低估的程度将随m_r而增加。换言之，DNA样品中参考等位基因的平均浓度越高，旧方法就越不准确。这种接受备选假设的P_r的低估将导致既接受无效假设又接受备选假设的截止值的不准确的计算。

3.基于预期P _r 计算截止值

对于使用SPRT的实施方案，可以使用来自El Karoui等人(2006)的计算SPRT曲线的上限和下限的方程式。而且，优选接受无效假设或备选假设的统计学可信度能够通过调整方程式中的阀值似然比率而变化。在这个研究中，使用的阀值似然比率是8，因为这个值已经被证实在癌症检测的环境下提供了鉴别包含或不包含等位基因失衡的样品的令人满意的性能。因此，在一实施方案中，计算SPRT曲线的上限和下限的方程式是：

上限=[(ln8)/N-lnδ]/lnγ

下限=(ln1/8)/N-lnδ]/lnγ

其中，

δ=(1-θ₁)/(1-θ₀)

γ=-(θ₁(1-θ₀)/θ₀(1-θ₁)

θ₀=如果无效假设是真实的，含有非参考等位基因的信息孔的比例

=0.5(参见下文)

θ₁=如果备选假设是真实的，含有非参考(即，过度表现的)等位基因的信息孔的比例

N=信息孔的数目

=只对任何一个等位基因是阳性的孔的数目

(ln是表示自然对数的数学符号，即log_e)

对于接受无效假设的θ₀的测定，假定从怀有整倍体胎儿的孕妇获得样品。在这一假定下，对任一个模板是阳性的孔的预期数目将是1:1，因此含有非参考等位基因的信息孔的预期比例将是0.5。

对于接受备选假设的θ₁的测定，假定从怀有21三体性胎儿的孕妇获得样品。数字RNA-SNP分析的21三体性情况的预期P_r的计算细节列于表600中。因此，数字RNA-SNP分析的θ₁意指表600最后一列所示的数据。

4.平均浓度的测量

可以通过对本领域技术人员公知或将公知的多种方法来测量m_r。在一实施方案中，在数字PCR分析的实验过程期间确定m_r的值。由于m_r值与对参考等位基因是阳性的孔的总数的关系能够被分布所控制(例如，泊松分布)，所以能够利用下述公式，从对参考等位基因是阳性的孔的数目来计算m_r：

m_r=-ln(1-对参考等位基因是阳性的孔的比例)。

注意，ln是自然对数，即log_e。这种方法提供了用于数字PCR实验的DNA样品中m_r直接和精确的估计。

这种方法可以用于获得期望的浓度。例如，如方法200的步骤240中所做的，可以将样品中提取的核酸稀释至具体的浓度，例如，每一反应孔一个模板分子。在使用泊松分布的实施方案中，不含模板的孔的预期比例可以计算为e^-m，其中m是每孔的模板分子的平均浓度。例如，在每孔一个模板分子的平均浓度下，不含模板分子的孔的预期比例是e^-1，即0.37(37%)。剩下的63%的孔将含有一个或多个模板分子。通常，然后将计数数字PCR运行(run)中阳性孔和信息孔的数目。信息孔的定义和解释数字PCR数据的方式取决于应用。

在其它实施方案中，每孔的平均浓度m_r通过其它定量方法来测量，例如，定量实时PCR、半定量竞争PCR、利用质谱方法的实时竞争PCR(real-competitive PCR)等。

B.数字RCD

可以以与上文所述的数字SNP方法类似的方式进行使用平均浓度的数字RCD。能够通过数字PCR来确定对参考染色体(非染色体21)标记物是阳性、对染色体21标记物是阳性以及对两种标记物都是阳性的孔的数目。根据数字SNP分析的m_r计算中的泊松概率函数，能够从对参考标记物是阴性的孔的总数来计算每孔的参考标记物的平均浓度(m_r)，而不管染色体21标记物的阳性。

然后可以将SPRT分析用于将血浆样品分类为获自怀有整倍体胎儿的孕妇或者获自怀有21三体性胎儿的孕妇。当胎儿是整倍体时，接受无效假设。在这种情况下，对参考标记物和染色体21标记物是阳性的孔的预期比率将是1:1，因此，具有对染色体21标记物阳性信号的信息孔的预期比率将是0.5。当胎儿是染色体21三体时，将接受备选假设。在这种情况下，如果样品DNA只来自胎儿，则每个孔中的染色体21标记物的平均浓度将是参考标记物的平均浓度(m_r)的3/2倍。

当将数字RCD用于通过检测诸如胎盘的外遗传特征的胎儿特异性标记物来测定染色体剂量时(Chim,SSC.et al.2005Proc Natl AcadSci USA102,14753-14758)，数字RCD分析的实施方案使用非胎儿特异性的标记物。因此，当使用非胎儿特异性标记物时，将进行测量胎儿物质百分比的额外步骤。因此，每孔的染色体21标记物的平均浓度将取决于样品中胎儿DNA的比例，并且能够使用下式进行计算：m_r[(200%+胎儿DNA百分比)/200%]。

再次利用具体实例进行说明，假定每孔的参考模板、染色体1的平均浓度(m_r)是0.5，并且假定50%的DNA源自胎儿，样品中50%的DNA源自母亲。

因此，利用泊松分布，当染色体1的平均浓度是每孔0.5时，不含染色体1基因座的任何分子的任何孔的概率将是：

$P\left(0\right)=\frac{{0.5}^0{e}^{-0.5}}{0!}=e^{-0.5}=0.6065$

因此，含有染色体1基因座的至少一个分子的任何孔的概率将是：1-0.6065=0.3935。因此，预期约39%的孔将含有该基因座的至少一个分子。

对于这种三体性胎儿的每个细胞，染色体21比染色体1的基因组比率将是3:2。DNA样品中染色体21与染色体1之间的比率将取决于部分胎儿DNA浓度(胎儿DNA%)，并且是：3×胎儿DNA%+2(1-胎儿DNA%):2×胎儿DNA%+2×(1-胎儿DNA%)。因此，在这种情况下，当部分胎儿DNA浓度是50%时，该比率是：(3×50%+2×50%)/(2×50%+2×50%)=1.25。如果数字SNP方法没有使用胎儿特异性标记物，则这种计算还能够用于计算非参考序列的平均浓度。

因此，当每孔的染色体1基因座的平均浓度是0.5时，每孔的染色体21基因座的平均浓度是：1.25×0.5=0.625。因此，不含染色体21基因座的任何分子的任何孔的概率在染色体21基因座平均浓度为每孔0.625时将是：

$P\left(0\right)=\frac{{0.625}^0{e}^{-0.625}}{0!}=e^{-0.625}=0.5353$

因此，含有染色体21基因座的至少一个分子的任何孔的概率将是：1-0.5353=0.4647。因此，预期约46%的孔将含有该基因座的至少一个分子。假定用任一个基因座填充孔是独立的，则含有两个基因座的孔的概率将是：0.3935×0.4647=0.1829。因此，预期约18%的孔将含有两个基因座。

预期含有染色体1基因座，但是不含有染色体21基因座的孔的比例将是含有至少一个染色体1基因座的孔的数目减去含有两个基因座的孔的数目：0.3935-0.1829=0.2106。类似地，预期含有染色体21基因座而不是两个基因座都含有的孔的比例将是：0.4647-0.1829=0.2818。信息孔被定义为对染色体1基因座或染色体21基因座是阳性，但是不对两个基因座都是阳性的孔。

因此，数字RCD分析中预期的染色体21比染色体1的比率是0.2818/0.2106=1.34。换言之，只对染色体21基因座是阳性的孔的比例是只对染色体1基因座是阳性的孔的比例的1.34倍。这与DNA样品中1.25的比率形成对比。

对于SPRT分析，需要计算对染色体21基因座是阳性的信息孔的比例(P_r)，并使用SPRT曲线来解释该比例。在本实例中，信息孔的比例将是：0.2106+0.2818=0.4924。因此，在0.5的m_r下，具有50%胎儿DNA的21三体性个例的预期P_r是0.2818/0.4924=0.57。

由于平均模板浓度(m)是泊松方程式中的关键参数，所以P_r将随m而变化。图7显示了按照本发明实施方案的表700，其列出了在表示为每孔的平均参考模板浓度(m_r)的一系列模板浓度下，21三体性样品中10%、25%、50%和100%的部分胎儿DNA浓度的预期P_r。对于数字RCD分析，21三体性个例的预期P_r的运算详细列于表700中。因此，能够从表700中表示对应的预期P_r值的列获得胎儿DNA部分浓度变化的样品的数字RCD分析的θ₁。

C.结果

1.不同m _r 的比较

等位基因或染色体失衡的理论程度(胎儿基因组中)和实验预期程度之间的差异的基础以及确定针对一系列m_r值的实验预期程度的计算结果示于表600和700中。在21三体性样品的数字RNA-SNP分析中，当m_r=0.5时，只含有过度表现的等位基因的孔比只含有参考等位基因的孔，即数字RNA-SNP比率是2.65(表600)。在由100%的胎儿DNA组成的样品的数字RCD分析中，当m_r=0.5时，只对染色体21基因座是阳性的孔比只对染色体1基因座是阳性的孔，即数字RCD比率，是1.7(表700)(P_r=0.63，因此，数字RCD比率是0.63/(1-0.63)=1.7)。随着部分胎儿DNA浓度下降，数字RCD对相同的m_r下降。

如表600和700所示，等位基因或染色体的过度表现的程度随着m_r而增加。然而，信息孔的百分比在m_r=0.5附近时达到其最大值，并且随着m_r的进一步增加而逐渐下降。在实践中，如果不限制样品的模板分子的量，则信息孔比例的下降能够通过增加分析的孔的总数来补偿，但是额外的孔需要增加试剂成本。因此，最优的数字PCR性能是模板浓度和每个样品测试的孔的总数之间的权衡。

2.使用SPRT曲线的实例

如上文所讨论的，数字PCR实验的等位基因或染色体失衡的预期程度取决于每个反应混合物(例如，孔)的实际模板浓度。我们描述了基于参考等位基因的模板浓度，即每孔的平均参考模板浓度(m_r)。如在上文的方程式中所示，预期的P_r能够用于确定上部SPRT曲线和下部SPRT曲线的作图。由于预期的P_r相应地依赖于m_r的值，所以SPRT曲线的作图基本上取决于m_r的值。因此，在实践中，需要使用与数字PCR数据集的实际m_r相关的一组SPRT曲线来解释来自该特定运行(run)的P_r。

图8显示了图800，示例了按照本发明的实施方案，对于用于数字RNA-SNP分析的0.1、0.5和1.0的m_r值的SPRT曲线中的差异程度。每组数字PCR结果应当用与该特定运行的确切m_r值相关的具体曲线来解释。注意，由于对于数字RNA-SNP和数字RCD方法而言，等位基因或染色体失衡的预期程度是不同的(对于数字RNA-SNP为2:1，对于数字RCD为3:2)，所以两个数字PCR系统需要不同组的SPRT曲线。用通过数字PCR运行的对应m_r选择的相关SPRT曲线来解释实验导出的P_r。这与以前报道的将SPRT用于通过数字PCR的LOH的分子检测形成对比，该以前报道中使用了一组固定的曲线。

利用假设的数字RNA-SNP运行，下文示例了使用SPRT解释数字PCR数据的实施方式。每个实例的数字RNA-SNP分析后，计数了只对A等位基因是阳性的孔的数目、只对G等位基因是阳性的孔的数目或者对这两个等位基因都是阳性的孔的数目。参考等位基因被定义为具有较少数目的阳性孔的等位基因。根据泊松概率密度函数，使用对参考等位基因是阴性的孔的总数来计算m_r值，而不管其它等位基因是否是阳性。我们假设的实例的数据如下所述：

在96孔反应中，20个孔只对A等位基因是阳性的，24个孔只对G等位基因是阳性的，并且33个孔对这两个等位基因都是阳性的。将A等位基因视为参考等位基因，因为A阳性的孔少于G阳性的孔。对参考等位等位基因是阴性的孔的数目是96-20-33=43。因此，能够使用泊松方程式来计算m_r：-ln(43/96)=0.80。这种情况的实验确定的P_r是24/(20+24)=0.55。

根据表600，m_r=0.8时的21三体性样品的预期P_r是0.76。因此，这种情况的θ₁是0.76。将基于θ₁=0.76的SPRT曲线用于解释这种情况的实验导出的P_r，0.55。当将Pr=0.55拟合至相关的SPRT曲线时，数据点落在下部曲线下。因此，将这种情况分类为整倍体，参见图3。

3.与旧方法的比较

图9A显示了表900，其比较了用于分类96孔数字RNA-SNP分析中整倍体和21三体性实例的新和旧SPRT算法的有效性。图9B显示了表950，其比较了用于分类384孔数字RNA-SNP分析中整倍体和21三体性实例的新和旧SPRT算法的有效性。新的算法指选择对源自数字PCR数据的m_r特异性的SPRT曲线。旧的算法指对全部数字PCR运行使用固定组的SPRT曲线。通过如表900所示的模拟分析揭示了截止值的错误计算对分类准确度的影响。

如表900和950所示，与以前的研究中使用固定组的SPRT曲线相比，我们的研究中不可分类的数据的比例低得多。例如，使用我们的方法，在m_r=0.5时，14%和0%的三体性样品分别对96孔和384孔数字RNA-SNP分析是不可分类的，但是使用固定曲线时，62%和10%的样品分别是不可分类的(表900)。因此，我们的方法允许用较少数目的信息孔对疾病分类。

如表900所示，对于0.1至2.0的全部m_r值，新的算法在将样品分类为具有或不具有等位基因比率偏移上更准确。例如，当m_r等于1.0并且进行了96孔数字RNA-SNP运行时，新的算法分别正确地分类了88%和92%的具有或不具有等位基因比率偏移的样品，而使用旧的算法，具有或不具有等位基因比率偏移的样品的正确分类的百分比分别是19%和36%。

使用新的算法，具有或不具有等位基因比率偏移的样品的分离将随m_r而增加。因此，分类准确度将随m_r而增加。当m_r增加至大于2.0时，由于信息孔百分比的下降，两组样品分离的增加对分类准确度影响将降低。相比之下，使用旧的算法，当m_r增加时，由于预期的P值与其真实值偏离的增加，分类准确度明显地下降。

我们的实验和模拟数据表明对于21三体性检测，数字RNA-SNP是有效和准确的方法。由于母体血浆中的PLAC4mRNA完全源自胎儿，所以对于13个检测的母体血浆样品中的12个，只需要一个384孔数字PCR来进行正确的分类(图13B的表1350)。因此，这种均一的基于实时数字PCR的方法为RNA-SNP分析的基于质谱的方法提供了替代选择(Lo,YMD,et al.2007Nat Med，见上文)。除了胎盘特异性转录物以外，我们还展望，母体血浆中其它类型的胎儿特异性核酸种类能够用于基于数字PCR的胎儿染色体非整倍性检测。一个实例是胎儿外遗传标记物(Chim,SSC et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA102,14753-14758;Chan,KCA et al.(2006)Clin Chem52,2211-2218)，其最近被用于使用外遗传等位基因比率(EAR)方法的18三体性的无创产前检测(Tong,YK et al.(2006)Clin Chem52,2194-2202)。因此，我们，预测数字EAR将是可能的分析技术。

V.渐增的百分比、多个标记物和PCR替代选择

如上文所述，当胎儿DNA只组成母体血浆DNA的一小部分，并且妊娠的11周至17周之间的平均部分浓度为约3%时，本发明的实施方案应用于从母体血浆提取的DNA是复杂的。然而，如本文所示，甚至当非整倍体DNA以较少的群体存在时，数字RCD允许非整倍性检测。随着胎儿DNA部分浓度的下降，例如可以存在于早期妊娠期间，数字RCD需要较大数目的信息计数。如图12的表1200所总结的，本工作的意义是我们提供了可以在其上建立诊断测定的一组基准参数，例如所需的部分胎儿DNA和总模板分子。我们认为，对于25%的部分胎儿DNA浓度，7680的反应总数是特别有吸引力的一组基准参数。如表1200所示，这些参数应当允许正确地分类当前97%的整倍体样品和21三体性样品。

存在于单位体积的母体血浆中的血浆DNA分子的数目是有限的(Lo,YMD.et al.1998Am J Hum Genet62,768-7758)。例如，在早期妊娠中，常染色体基因座，β-球蛋白基因的中间母体血浆浓度被证实是986个拷贝/毫升，这既有来自胎儿的贡献又有来自母亲的贡献(Lo,YMD.et al.1998Am J Hum Genet62,768-7758)。为了捕获7,680个分子，需要提取约8mL的母体血浆的DNA。可以从约15mL母体血液获得的这个体积的血浆是常规实践的极限。然而，我们预测对于数字RCD分析可以组合多组染色体21和参考染色体靶标。对于5对染色体21和参考染色体靶标，只需要1.6mL的母体血浆来提供分析所需的模板分子的数目。能够进行多重单分子PCR。对于单分子单体型分析，以前已经证明了这种多重单分子分析的稳健度(Ding,C.and Cantor,CR.2003Proc Natl Acad Sci USA100,7449-7453)。

可选择地，为了实现25%的部分胎儿DNA浓度，方法可以允许选择性地富集母体血浆中的胎儿的DNA(Li,Y.et al.2004Clin Chem50,1002-1011)或抑制母体血浆中的母体DNA背景(Dhallan,R et al.2004JAMA291,1114-1119)或者既富集母体血浆中的胎儿DNA又抑制母体血浆中的母体DNA背景。除了富集胎儿DNA和抑制母体DNA的物理方法以外，还可能使用分子富集策略，例如通过靶向表现出特定DNA甲基化方式的胎儿DNA分子(Chim,SSC et al.2005Proc NatlAcad Sci USA102,14753-14758,Chan,KCA et al.2006Clin Chem52,2211-2218;Chiu,RWK et al.2007Am J Pathol170,941-950)。

另外，如进行数字PCR的目前的研究所用的，现在有许多人工进行数字实时PCR分析的替代方法。这些替代方法包括微流体数字PCR芯片(Warren,L et al.2006Proc Natl Acad Sci USA103,17807-17812;Ottesen,EA et al.2006Science314,1464-1467)、乳液PCR(Dressman,D et al.2003Proc Natl Acad Sci USA100,8817-8822)和使用例如Roche454平台、Illumina Solexa平台和Applied Biosystems的SOLiD^TM系统等的大规模平行基因组测序(Margulies,M.et al.2005Nature437,376-380)。对于后者，我们的方法也适用于单个DNA分子的大规模平行测序方法，该方法不要求扩增步骤，例如Helicos True单分子DNA测序技术(Harris TD et al.2008Science,320,106-109)、PacificBiosciences的单分子实时(SMRT^TM)技术和纳米孔测序(Soni GV andMeller A.2007Clin Chem53,1996-2001)。通过使用这些方法，能够在大量样品上快速地进行数字RNA-SNP和数字RCD，从而增强了本文提出的方法用于无创产前诊断的临床可行性。

实施例

提供下文的实施例来示例而不是不限制要求保护的发明。

I.计算机模拟

进行计算机模拟来估计使用SPRT方法的21三体性诊断的准确性。使用Microsoft Excel2003软件(Microsoft Corp.,USA)和Windows软件SAS9.1(SAS Institute Inc.,NC,USA)来进行计算机模拟。数字PCR的性能是参考模板浓度(m_r)、信息计数的数目和等位基因或染色体失衡的预期程度(P_r)之间的相互作用。对一系列这些变量的每个进行了单独的模拟。由于数字RNA-SNP和数字RCD的SPRT曲线的判定边界是不同的，所以分别进行这两个系统的模拟分析。

对模拟的每个数字PCR条件(即，m_r、胎儿DNA部分浓度、总孔数)，进行了两轮模拟。第一轮模拟的情情境是检测的样品获得自怀有整倍体胎儿的孕妇。第二轮模拟的情境是检测的样品获得自怀有21三体性胎儿的孕妇。每轮模拟检测了5000个胎儿。

A.RNA-SNP

对于数字RNA-SNP，进行了m_r=0.1至m_r=2.0的384孔实验的模拟。在每个m_r值，我们模拟了检测5000个整倍体胎儿和5000个21三体性胎儿的情境。使用对给定的m_r合适的SPRT曲线来分类所述10,000个胎儿。图10是本发明实施方案的表1000，该表1000表示正确或错误地分类为整倍体或非整倍体的胎儿，以及对于给定的信息计数不可分类的胎儿的百分比。对于0.5至2.0的m_r，诊断整倍体和非整倍体情况的准确度都是100%。当m_r=0.1时，384孔分析后，只有57%的整倍体胎儿和88%的21三体性胎儿能够被准确地分类。

按下述步骤生成模拟数据：

在步骤1中，对每个孔，利用SAS程序的随机(泊松)函数(www.sas.com/technologies/analytics/statistics/index.html)生成两个随机数来分别表示A等位基因和G等位基因。该随机(泊松)函数将生成从0开始的正整数(即，0、1、2、3....)，对于表示每孔的等位基因的平均浓度的给定的平均值，生成每个整数的概率取决于这个数根据泊松概率密度函数的概率。如果表示A等位基因的随机数大于0，则孔被视为对A等位基因是阳性的，即含有A等位基因的一个或多个分子。类似地，如果表示G等位基因的随机数大于0，则孔被视为对G等位基因是阳性的。

为了模拟怀有整倍体胎儿的孕妇的情境，使用相同的平均值来生成对于A等位基因和G等位基因的随机数。例如，在模拟m_r=0.5的数字RNA-SNP分析的分析中，将对于A等位基因或G等位基因的平均值相同地设为0.5，这表示任何一个等位基因的平均浓度是每孔0.5个分子。利用泊松方程式，在0.5的平均浓度下，对A等位基因或G等位基因是阳性的孔的比例将是相同的，并且是0.3935，参见表600。

当模拟m_r=0.5的怀有21三体性胎儿的孕妇的数字RNA-SNP分析时，预期每孔的过度表现的等位基因的平均浓度将是参考等位基因的平均浓度即1的2倍。在这种情况下，对过度表现的等位基因是阳性的孔的概率是0.6321，参见表600。

生成数字PCR孔的随机数后，该孔能够被分类为以下情况的一种：

a.对A等位基因和G等位基因都是阴性

b.对A等位基因和G等位基因都是阳性

c.对A等位基因是阳性，但是对G等位基因是阴性

d.对G等位基因是阳性，但是对A等位基因是阴性

在步骤2中，重复步骤1至生成了期望数目的孔，对当前的模拟是384个孔。计数了只对A等位基因是阳性的孔的数目和只对G等位基因是阳性的孔的数目。将具有较少阳性孔的等位基因视为参考等位基因，并且将具有较多阳性孔的等位基因视为潜在地过度表现的等位基因。信息孔的数目是对任何一个等位基因是阳性，但是不对两个等位基因都是阳性的孔的总数。然后计算了含有潜在地过度表现的等位基因的信息孔的比例(P_r)。根据本发明的实施方案，计算了接受无效假设或备选假设的相关SPRT曲线的上限和下限。

在步骤3中，对怀有整倍体胎儿或21三体性胎儿的孕妇的两种情境的每一种进行了5000个模拟。每个模拟能够被视为从孕妇获得的独立生物样品。在表1000中，正确分类的整倍体个例指接受了无效假设的那些整倍体个例，而错误分类的整倍体例指接受了备选假设的那些整倍体个例。类似地，接受备选假设的那些21三体性个例被视为正确的分类，而接受无效假设的那些21三体性个例被视为错误的分类。对于两个组，在模拟了预先指定的总数的孔后，那些既没有接受无效假设又没有接受备选假设的个例被视为不可分类的。

在步骤4中，对以0.1的增量增加的0.1至2.0的m_r，进行步骤1至步骤3。

B.RCD

图11是本发明实施方案的表1100，该表1000显示了对于从0.1至2.0的m_r，纯(100%)胎儿DNA样品的数字RCD分析的计算机模拟。随着部分胎儿DNA浓度变小，过度表现的染色体21的程度降低，因此需要用于准确的疾病分类的更多数目的信息孔。因此，还对在m_r=0.5时，384孔至7680孔的总孔数的50%、25%和10%的胎儿DNA浓度进行了模拟。

图12是本发明实施方案的表1200，该表1200显示了对于来自具有不同胎儿DNA部分浓度的整倍体胎儿或21三体性胎儿的样品的分类，在m_r=0.5时，数字RCD分析的准确度的计算机模拟的结果。数字RCD的效能对于胎儿DNA部分浓度较高的个例更好。在胎儿DNA浓度为25%并且PCR分析的总数为7680时，97%的整倍体和非整倍体个例都是可以分类的，并且没有错误的分类。剩下的3%个例在能够实现分类前，需要进一步的分析。

模拟数字RCD分析的过程类似于对数字RNA-SNP所述的那些过程。模拟的步骤如下所述：

在步骤1中，在泊松概率密度函数下产生两个随机数来表示参考等位基因座，染色体1基因座和染色体21基因座。对于怀有整倍体胎儿的个体，染色体1基因座和染色体21基因座的平均浓度是相同的。在一模拟分析中，使用了每个基因座每孔0.5的平均模板浓度。如表700所示，对于怀有21三体性胎儿的个体，这一模拟中的m_r是0.5，但是每孔的染色体21基因座的平均浓度将取决于检测样品中部分胎儿DNA浓度。通过代表各自的基因座的随机数来确定参考基因座和/或染色体21基因座向孔的分布，所述随机数是根据泊松概率密度函数，用每孔的基因座的合适的平均浓度产生的。

在步骤2中，重复步骤1至生成了期望数目的孔，例如，384孔板实验的384个孔。计数了只对染色体1是阳性的孔的数目和只对染色体21是阳性的孔的数目。信息孔的总数是对上述染色体任一条是阳性而不对两条染色体都是阳性的孔的总数。然后计算了对染色体21是阳性的信息孔的比例(P_r)。如上文关于SPRT分析的部分所述，计算了接受无效假设或备选假设的相关SPRT曲线的上限和下限。

在步骤3中，对怀有整倍体胎儿或21三体性胎儿的孕妇的两种情境的每一种进行了5000个模拟。每个模拟能够被视为从孕妇获得的独立生物样品。在表1100中，正确分类的整倍体个例指接受了无效假设的那些整倍体个例，而错误分类的整倍体个例指接受了备选假设的那些整倍体个例。类似地，接受备选假设的那些21三体性个例被视为正确分类的，而接受无效假设的那些21三体性个例被视为错误分类的。对于两个组，在模拟了预先指定的总数的孔后，那些既没接受无效假设又没接收备选假设的个例被视为不可分类的。

在步骤4中，在384至7680的总孔数下，对10%、25%、50%和100%的胎儿DNA的样品重复步骤1至步骤3。

II.21三体性检测的验证

A.PLAC4的RNA-SNP

利用染色体21上的PLAC4基因的rs8130833SNP来证明数字RNA-SNP的实际可行性(Lo,YMD et al.2007Nat Med13,218-223)。分析了来自两个整倍体杂合胎盘和两个21三体性杂合胎盘的胎盘DNA和RNA样品。用数字RNA-SNP方法来分析胎盘DNA样品，但是省略了逆转录步骤，因此基本上将该方法转变成数字DNA-SNP分析。为了达到正确的个例分类的可能性与信息孔的比例之间的平衡，我们将样品稀释旨在实现每孔一个任何类型的等位基因，并且通过96孔数字PCR分析来证实。然后，进行384孔数字RNA-SNP实验。计算了P_r和m_r，并将这个m_r值的SPRT曲线用于数据解释。

图13A显示了按照本发明的实施方案，整倍体妊娠和21三体性妊娠的胎盘组织的数字RNA-SNP分析的表1300。通过质谱测定来确定基因型。当实验获得的P_r低于不可分类的区域时，指定为“整倍体”；当实验获得的P_r高于不可分类的区域时，指定为表示21三体性的“T21”。T21即21三体性。通过一个384孔实验，既利用DNA样品又利用RNA样品正确地分类了这些个例每一个。

我们还检测了来自9个怀有整倍体胎儿的妇女和4个怀有21三体性胎儿的妇女的血浆RNA样品。图13B显示了按照本发明的实施方案，来自整倍体妊娠和21三体性妊娠的母体血浆的数字RNA-SNP分析的表1350。正确分类了全部个例。一个21三体性实例(M2272P)在一个384孔实验后，的初始结果落在SPRT曲线之间的不可分类区域中。因此，进行了另外的384孔实验。从总共768个孔汇集的数据计算了新的m_r和P_r值，并且使用基于这个m_r值选择的新的一组SPRT曲线进行了分类。然后，该个例被正确地评分为非整倍体。

我们的实验和模拟数据表明数字RNA-SNP对21三体性检测是有效且准确的方法。由于母体血浆中的PLAC4mRNA全部源自胎儿，所以对于13个检测的母体血浆样品中的12个，正确的分类只要求一个384孔数字PCR实验。因此，这种均一的基于实时数字PCR的方法提供了用于RNA-SNP分析的基于质谱的方法的替代选择。除了胎盘特异性mRNA转录物以外，我们还预测母体血浆中的其它类型的胎儿特异性核酸种类能够用于胎儿染色体非整倍性的基于数字PCR的检测。一个实例是胎儿外遗传标记物，其最近被用于利用外遗传等位基因比率(EAR)方法的18三体性的无创产前检测(Tong YK et al.2006ClinChern,52,2194-2202)。因此，我们预测数字EAR将是可能的分析技术。

B.RCD

还利用靶向染色体21和染色体1上的种内同源序列的PCR测定来研究用于检测21三体性的数字RCD的实际可行性。作为示例，本文使用了种内同源基因座(paralogous loci)。染色体21和其它参考染色体上的非种内同源序列也能够用于RCD。将来自两个整倍体胎盘和两个21三体性胎盘的胎盘DNA样品稀释至约每孔来自任何一条染色体的一个靶模板，并且通过96孔数字PCR分析来证实。通过384孔数字RCD实验来分析每个证实的样品，并且计算了P_r和m_r的值。对于数字RCD，染色体1种内同源基因(paralog)是参考模板。将这个m_r值用于选择解释数据的一组对应的SPRT曲线。如图14A所示，正确地分类了全部胎盘样品。

为了证明数字RCD方法能够用于检测与过量的整倍体DNA混合的21三体性DNA，例如母体血浆中的胎儿DNA的情境，在整倍体母体血液细胞DNA的背景下，分析了含有50%和25%的21三体性胎盘DNA的混合物。将来自10个21三体性个例和10个整倍体个例的胎盘DNA分别与等量的整倍体母体血液细胞DNA混合，从而获得20个50%的DNA混合物。图14B显示按照本发明的实施方案，示出50%胎儿DNA混合物的RCD分析的SPRT解释的图1440。类似地，将来自5个21三体性个例和5个整倍体个例的胎盘DNA分别与超出3倍的整倍体母体血液细胞DNA混合，从而获得10个25%的DNA混合物。图14C显示了示出25%胎儿DNA混合物的RCD分析的SPRT解释的图1470。如图14B和14C所示，正确地分类了全部的整倍体和非整倍体DNA混合物。

如图14B和14C所表示的，多个384孔数字PCR分析后，每个样品达到了可以分类的点。50%的DNA混合物所要求的384孔板的数目是1至5。25%的DNA混合物所要求的384孔板的数目是1至7。通过如表1200所示的计算机模拟，预测了随每个384数字PCR分析的增加，正确分类的个例的累积比例。

III.数字PCR方法

A.数字RNA-SNP

首先使用ThermoScript逆转录酶(Invitrogen)，利用基因特异性的逆转录引物，将全部RNA样品进行逆转录。逆转录引物的序列是5’-AGTATATAGAACCATGTTTAGGCCAGA-3’(SEQ ID NO:1)(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)。用于数字RNA-SNP的逆转录RNA样品(即，cDNA)随后的处理与DNA样品(例如，胎盘DNA)基本上相同。在数字PCR分析前，首先利用针对PLAC4的实时PCR测定，将DNA样品和cDNA样品定量，该测定由引物5’-CCGCTAGGGTGTCTTTTAAGC-3’(SEQ ID NO:2)、5’-GTGTTGCAATACAAAATGAGTTTCT-3’(SEQ ID NO:3)和荧光探针5’-(FAM)ATTGGAGCAAATTC(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:4)(Applied Biosystems,Foster City,CA)组成，其中FAM是6-羧基荧光素并且MGBNFQ是小沟结合非荧光猝灭剂。

通过指定扩增子的HPLC纯化的单链合成的DNA寡核苷酸(Proligo,Singapore)的连续稀释来制备校准曲线。序列是5’-CGCCGCTAGGGTGTCTTTTAAGCTATTGGAGCAAATTCAAATTTGGCTTAAAGAAAAAGAAACTCATTTTGTATTGCAACACCAGGAGTATCCCAAGGGACTCG-3’(SEQ ID NO:5)。使用2X TaqManUniversal PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行反应，反应体积为25μL。在每个反应中使用400nM的每种引物和80nM的探针。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min以及95℃、15s与60℃、1min的45个循环，在ABI PRISM7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems)中进行上述反应。然后将DNA或cDNA样品进行连续稀释，从而随后的数字PCR扩增能够在约每孔1个模板分子下进行。在这种浓度下，预期约37%的反应孔将表现出阴性扩增，并且首先通过进行96孔数字实时PCR分析来证实。然后使用一组非内含子跨越引物(non-intron spanning primer)在384孔板中进行数字RNA-SNP分析：正向引物是5’-TTTGTATTGCAACACCATTTGG-3’(SEQ ID NO:6)，基因特异性逆转录引物如上文所述。

设计了靶向PLAC4序列上的rs8130833SNP的两个等位基因的每一个的两个等位基因特异性TaqMan探针。它们对于G等位基因和A等位基因的序列分别是5’-(FAM)TCGTCGTCTAACTTG(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:7)和5’-(VIC)ATTCGTCATCTAACTTG(MGBNFQ)(SEQID NO:8)。使用2X TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)进行反应，反应体积为5μL。每个反应含有1X TaqManUniversal PCR Master Mix、572nM的每种引物、107nM的等位基因-G-特异性探针和357nM等位基因-A-特异性探针。在ABI PRISM7900HT序列检测系统中进行反应。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min以及95℃、15s与57℃、1min的45个循环。在反应期间，通过SDS2.2.2软件(Applied Biosystems)的“绝对定量”应用来收集荧光数据。该软件自动地计算基线和阀值。记录了对A等位基因或G等位基因是阳性的孔的数目，并对其进行SPRT分析。

B.数字RCD分析

首先通过NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technology,Wilmington,DE)，将在本研究中所用的全部胎盘和母体血沉棕黄色层DNA样品进行定量。利用6.6pg/细胞的换算，将DNA浓度转换成拷贝/μL。通过将DNA样品连续稀释来确定对应于约每孔一个模板的DNA的量，并通过96孔格式的实时PCR测定来证实，其中我们预期约37%的孔表现出阴性扩增。除了只添加了参考染色体的探针以外，确认板(confirmatory plate)的PCR设置和下文所述的相同。在数字RCD分析中，首先通过正向引物5’-GTTGTTCTGCAAAAAACCTTCGA-3’(SEQ ID NO:9)和反向引物5’-CTTGGCCAGAAATACTTCATTACCATAT-3’(SEQ ID NO:10)，将染色体21和染色体1上的种内同源基因座(Deutsch,S.et al.2004JMed Genet41,908-915)进行共扩增。设计了两个染色体特异性TaqMan探针来靶向染色体21和染色体1种内同源基因，并且它们的序列分别是5'’-(FAM)TACCTCCATAATGAGTAAA(MGBNFQ)-3’(SEQ IDNO:11)和5’-(VIC)CGTACCTCTGTAATGTGTAA(MGBNFQ)-3’(SEQID NO:12)。每个反应含有1X TaqMan Universal PCR Master Mix、450nM的每种引物和125nM的每种探针。总反应体积是5μL/孔。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min以及95℃、15s与60℃、1min的50个循环。在ABI PRISM7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems)中进行全部实时PCR实验，并通过SDS2.2.2软件(AppliedBiosystems)的“绝对定量”应用来收集荧光数据。使用了默认的基线和手动阀值(manual threshold)。记录了对染色体21或染色体1是阳性的孔的数目，并对其进行SPRT分析。将分析一个或多个384孔板直至疾病通过SPRT进行分类是可能的。

IV.使用基于微流体的数字PCR

A.数字RNA-SNP

本实施例证明了使用基于微流体的数字PCR的数字PCR分析的性能。本文示例了这种方法的一个变体，为了示例而不是为了限制，使用Fluidigm BioMark^TM系统。这个系统每个运行能够进行超过9000个数字PCR。

从怀有整倍体胎儿或21三体性胎儿的孕妇获得胎盘组织样品和母体外周血液样品。通过引物延伸及随后的质谱来进行胎盘DNA样品中的PLAC4基因上的rs8130833SNP的基因型分型。从胎盘样品和母体血浆样品中提取RNA。

使用ThermoScript逆转录酶(Invitrogen)，利用基因特异性逆转录引物(5’-AGTATATAGAACCATGTTTAGGCCAGA-3’;SEQ IDNO:13)，将全部RNA样品逆转录。对胎盘cDNA样品，进行连续稀释，从而随后的数字PCR扩增能够在约每孔一个模板分子下进行。

在具有12.765数字阵列(Fluidigm)的BioMark System^TM(Fluidigm)上进行数字PCR。每个数字阵列由用于容纳12个样品-测定混合物的12个板组成。每个板还分成进行7nL反应/孔的765个孔。通过正向引物(5’-TTTGTATTGCAACACCATTTGG-3’;SEQ ID NO:14)和上文所述的基因特异性逆转录引物来扩增PLAC4基因上的rs8130833SNP区域。设计了靶向rs8130833SNP的两个等位基因的每一个的两个等位基因特异性TaqMan探针。它们对G等位基因和A等位基因的序列分别是5’-(FAM)TCGTCGTCTAACTTG(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:15)和5’-(VIC)ATTCGTCATCTAACTTG(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:16)。利用2X TaqMan Universal PCR Master Mix来进行一个阵列板的反应，反应体积为10μL。每个反应含有1X TaqMan Universal PCR MasterMix、572nM的每种引物、53.5nM的等位基因-G-特异性探针、178.5nM的等位基因-A-特异性探针和3.5μL的cDNA样品。对每个胎盘cDNA样品使用一个反应板，而对每个母体血浆样品使用12个板。通过NanoFlex^TMIFC控制器(Fluidigm)，将样品-测定混合物加载至数字阵列中。在BioMark^TM系统中进行反应。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min以及95℃、15s与57℃、1min的40个循环。

在765孔反应板中分析来自一个整倍体杂合胎盘和两个T21杂合胎盘的胎盘RNA样品。对于每个样品，计数了包括对A等位基因或G等位基因是阳性(但是不对这两个等位基因都是阳性)的孔的信息孔的数目。确定了在全部信息孔中过度表现的等位基因的比例(P_r)。应用对这些运行的每孔确切的平均参考模板浓度(m_r)合适的SPRT曲线来确定实验获得的P_r是否表示了整倍体样品或T21样品。如图15A所示，利用这种方法，正确地分类了全部RNA样品。

我们还检测了来自4个怀有整倍体胎儿的妇女和1个怀有21三体性胎儿的妇女的血浆RNA样品。在12个765孔反应板中分析每个样品，即每个血浆RNA样品9180个反应。图15B表示这个血浆RNA样品的12个板的每一个的信息孔的数目。如该表中所示，血浆样品中的模板浓度被稀释至任一反应板中的信息孔的数目不足以进行SPRT分类。在将样品分类为整倍体样品前，必须将来自三个反应板的信息孔合并(图15C)。图15C表明，利用从2至12个板汇集的数据，全部血浆个例能够被正确地分类。

与进行数字PCR的手动方法相比，这种基于微流体的方法快的多，并且劳动强度小得多。能够在2个半小时内完成全部过程。

B.用于18三体性产前检测的数字RNA-SNP

在本实施例中，我们在染色体18上的胎盘表达的转录物，即丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂进化枝(clade)B(卵清蛋白)成员2(SERPINB2)mRNA上进行基于数字PCR的等位基因鉴别测定，来检测18三体性胎儿的多态性等位基因比率的失衡。如生产商的说明书所述，分别使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)和TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)从胎盘组织样品中提取DNA和RNA。提取的胎盘RNA样品进行DNase I(Invitrogen)处理以除去污染的基因组DNA。如上文所述，利用MassARRAY Compact(Sequenom,San Diego)，使用同类MassEXTEND(hME)测定(homogenousMassEXTEND assay)，在胎盘组织DNA样品中进行SERPINB2基因上的rs6098SNP的基因型分型。

使用基因特异性引物5’-CGCAGACTTCTCACCAAACA-3’(SEQID NO:17)(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)，利用ThermoScript逆转录酶(Invitrogen)，在胎盘组织RNA样品上进行SERPINB2转录物的逆转录。全部cDNA样品稀释的浓度使得随后的数字PCR扩增能够在每个反应孔一个模板分子的平均浓度下进行。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)和BiomarkTM PCR试剂(Fluidigm,San Francisco)进行数字PCR。所用的正向引物5’-CTCAGCTCTGCAATCAATGC-3’(SEQ ID NO:18)(Integrated DNA Technologies)和反向引物(与用于逆转录的基因特异性引物相同)的浓度是600nM。靶向SERPINB2序列上的rs6098SNP的A等位基因或G等位基因的两个TaqMan探针是5’-(FAM)CCACAGGGAATTATTT(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:19)和5’-(VIC)CCACAGGGGATTATTT(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:20)(Applied Biosystems)。FAM是6-羧基荧光素，MGBNFQ是小沟结合非荧光猝灭剂，并且FAM和MGBNFQ的使用浓度分别是300nM和500nM。利用NanoflexTM IFC控制器(Fluidigm)，将每个样品-试剂混合物分配至BiomarkTM12.765数字阵列上的765个反应孔。分配后，将该阵列置于BiomarkTM实时PCR系统(Fluidigm)中进行热扩增和荧光检测。在50℃下开始反应持续2min，在95℃下继续5min，然后进行95℃、15sec与59℃、1min的45个循环。扩增后，计数信息孔的数目(只对A等位基因或G等位基因是阳性的孔)和对两个等位基因都是阳性的孔的数目，并对它们进行序贯概率比检验(SPRT)分析。

对于杂合的整倍体胎儿，A等位基因和G等位基因应当在胎儿基因组中相等地表现(1:1)，而对于18三体性，将有一个等位基因的额外拷贝，从而在胎儿基因组中表现出2:1的比率。对不同样品的解释产生一系列SPRT曲线。这些曲线示出了对于分类所需的给定的信息孔总数(x轴)，对过度表现的等位基因是阳性的信息孔的预期比例P_r(y轴)。对于每个样品，将实验导出的P_r与预期的P_r值进行比较。将高于上部曲线的样品分类为18三体性，而将低于底部曲线的样品分类为整倍体。两个曲线之间的面积是不可分类的区域。

通过利用SERPINB2基因上的rs6098SNP来证明用于检测胎儿18三体性的数字RNA-SNP分析的可行性。首先通过质谱对来自具有整倍体胎儿和18三体性胎儿的个体的胎盘组织DNA样品进行基因型分型，以鉴定杂合个例。发现了9个整倍体杂合胎盘和3个18三体性杂合胎盘，并对它们进行数字RNA-SNP分析。对于每个样品，计算了P_r和m_r，并且将这个m_r值的SPRT曲线用于疾病分类。如图16A所示，正确地分类了全部样品。18三体性胎盘的P_r值高于不可分类的区域，而整倍体胎盘的P_r值则低于这个区域。

具有基于m_r=0.1、0.2和0.3的SPRT曲线的样品示于图16B中。这些数据表明数字RNA-SNP方法对18三体性妊娠是有价值的诊断工具。两个曲线描绘出不可分类区域的界限。将数据点高于上部曲线的样品分类为非整倍体，而将数据点低于底部曲线的样品分类为整倍体。

C.数字RCD分析

本实施例证明了利用基于微流体的数字PCR的数字RCD分析的效能。作为示例但不作为限制，利用Fluidigm BioMark^TM系统，在此处示例了这种方法的一个变体。这种系统的每个运行能进行超过9000个数字PCR。

从怀有整倍体胎儿或21三体性(T21)胎儿的孕妇获得胎盘组织、母体血液细胞和羊水样品。将来个10个T21个例和10个整倍体个例的胎盘DNA分别与等量的整倍体母体血液细胞DNA混合，从而获得20个50%的DNA混合物。为了保证该混合物样品中准确的胎儿比例，首先通过260nm下的光密度(OD)测量来定量提取的DNA。然后利用12.765数字阵列(Fluidigm)，通过BioMark^TM系统(Fluidigm)来数字地定量该提取的DNA。除了只使用参考染色体的探针以外，用于定量样品的测定与下文所述的相同。

通过数字PCR对相对于位于染色体1的基因座的非多态性染色体21基因座进行分析来测定50%的DNA混合物和羊水样品中的染色体剂量。首先通过正向引物5’-GTTGTTCTGCAAAAAACCTTCGA-3’(SEQ ID NO:21)和反向引物5’-CTTGGCCAGAAATACTTCATTACCATAT-3’(SEQ ID NO:22)来共扩增染色体21和染色体1上的一对种内同源基因座的101-bp的扩增子。设计了两个染色体特异性TaqMan探针来区分染色体21和染色体1的种内同源基因，且探针的序列分别是5’-(FAM)TACCTCCATAATGAGTAAA(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:23)和5’-(VIC)CGTACCTCTGTAATGTGTAA(MGBNFQ)-3’(SEQ IDNO:24)。仅作为示例在此处使用种内同源基因座。换言之，非种内同源基因座也能够用于这种分析。

为了证明数字RCD方法用于检测18三体性(T18)的，设计了靶向染色体21和染色体18上的种内同源序列的另一测定。首先通过正向引物5’-GTACAGAAACCACAAACTGATCGG-3’(SEQ ID NO:25)和反向引物5’-GTCCAGGCTGTGGGCCT-3’(SEQ ID NO:26)来共扩增染色体21和染色体18上的种内同源基因座的128-bp的扩增子。设计了两个染色体特异性TaqMan探针来区分染色体21和染色体18的种内同源基因，且探针的序列分别是5’-(FAM)AAGAGGCGAGGCAA(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:27)和5’-(VIC)AAGAGGACAGGCAAC(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:28)。仅作为示例在此处使用种内同源基因座。换言之，非种内同源基因座也能够用于这种分析。

利用12.765数字阵列(Fluidigm)，在BioMark^TM系统(Fluidigm)上进行全部实验。利用2X TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)在10μL的反应体积下进行一个板的反应。每个反应含有1X TaqMan Universal PCR Master Mix、900nM的每种引物、125nM的每种探针和3.5μL的50%胎盘/母体血液细胞DNA样品。通过NanoFlex^TMIFC控制器(Fluidigm)将样品/测定混合物加载至数字阵列。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min以及95℃、15s和57℃、1min的40个循环。

通过染色体21/染色体1(chr21/chrl)测定，在数字阵列上分析整倍体和T2150%胎盘/母体血液细胞DNA样品。对于每个样品，计数了包括只对染色体21标记物或染色体1标记物是阳性(但不对这两个标记物都是阳性)的孔的信息孔的数目。确定了在全部信息孔中过度表现的标记物的比例(P_r)。将对任一数字PCR板的每孔的确切平均参考模板浓度(m_r)合适的SPRT曲线用于确定实验获得的P_r是否表示整倍体样品或T21样品。对尚未分类的样品，从额外的板汇集数据直至能够做出判定。如图17所示，利用这种方法和所需的1个到4个板的数据，正确地分类了全部50%胎盘/母体血液细胞DNA样品。如图18所示，还将SPRT曲线作图来显示用于正确分类的判定边界(decisionboundaries)。

我们还将RCD分析应用于从23个怀有整倍体胎儿的妇女和6个怀有T21胎儿的妇女获得的羊水样品。使用染色体21/染色体1测定，在单个765孔反应板中分析了每个样品。图19显示了SPRT分类的汇总。如图19所示，正确地分类了全部29个样品。因此，数字RCD方法是在诸如羊水和绒毛膜绒毛活组织检查的用于产前诊断的多种样品类型中，利用微卫星标记物(Levett LJ,et al.A large-scale evaluation ofamnio-PCR for the rapid prenatal diagnosis of fetal trisomy(用于胎儿三体性快速产前诊断的羊膜PCR的大规模评价).Ultrasound ObstetGynecol2001;17:115-8)或单核苷酸多态性(SNP)(Tsui NB,et al.Detection of21trisomy by quantitative mass spectrometric analysis ofsingle-nucleotide polymorphisms(通过单核苷酸多态性的定量质谱分析检测21三体性).Clin Chem2005;51:2358-62)标记物或实时非数字PCR(Zimmermann B,et al.Novel realtime quantitative PCR test for21trisomy(21三体性的新实时定量PCR检测).Clin Chem2002;48:362-3)检测三体性的替代方法。

在检测T18个例的尝试中，我们将染色体21/染色体18(chr21/chrl8)测定应用于3个整倍体胎盘DNA样品和5个T18胎盘DNA样品。计算了全部信息孔中过度表现的标记物的比例(P_r)。除了一个T18个例被错误地分类为整倍体以外，正确地分类了全部样品。

结果汇总于图20中。

V.在质谱平台上使用多重数字RCD测定

每单位体积的母体血浆存在的血浆DNA分子的数目是有限的(LoYMD.et al.1998Am J Hum Genet62,768-7758)。例如，在早期妊娠中，常染色体基因座，即β-球蛋白基因的母体血浆浓度中位数被证实是986个拷贝/mL，这既有来自胎儿的贡献又有来自母亲的贡献(LoYMD.et al.1998Am J Hum Genet62,768-7758)。为了捕获7,680个分子，需要从约8mL母体血浆提取的DNA。可以从约15mL母体血液获得的这个体积的血浆是常规实践的极限。然而，我们预测对于数字RCD分析，可以组合多组染色体21和参考染色体靶标。对于5对染色体21和参考染色体靶标，只需要1.6mL的母体血浆来提供分析所需的模板分子的数目。能够进行多重单分子PCR。以前已经证明了这种多重单分子分析对于单分子单体型分析的稳健度(Ding,C.andCantor,CR.2003Proc Natl Acad Sci USA100,7449-7453)。

在一实施例中，从怀有整倍体胎儿或21三体性(T21)胎儿的孕妇获得胎盘组织和母体血液细胞样品。将5个整倍体胎盘DNA样品和5个T21胎盘DNA样品分别与等比例的母体血液细胞DNA混合，以获得10个模拟50%胎儿DNA的血浆样品的DNA混合物。为了保证混合物样品中准确的胎儿比例，首先通过260nm下的光密度(OD)测量来定量提取的DNA。然后通过384孔格式的实时PCR对提取的DNA进行数字定量。用于定量样品的测定与上文的数字RCD分析的实施例中所述的相同。

通过相对于位于染色体1上的基因座的非多态性染色体21基因座的数字PCR分析来确定50%的混合物中的染色体剂量。这种方法被称为数字相对染色体剂量(Digital Relative Chromosome Dosage，RCD)分析。通过正向引物5’-ACGTTGGATGGTTGTTCTGCAAAAAACCTTCGA-3’(SEQ IDNO:29)和反向引物5’-ACGTTGGATGCTTGGCCAGAAATACTTCATTACCATAT-3’(SEQ ID NO:30)来共扩增染色体21和染色体1上的一对种内同源基因座的121-bp的扩增子(包括每种引物上的10-mer)。设计了靶向染色体21和染色体1之间的碱基差异的延伸引物，该延伸引物的序列是5’-CTCATCCTCACTTCGTACCTC-3’(SEQ ID NO:31)。

为了证明多重数字PCR测定检测T21个例(case)的用途，设计了靶向染色体21和染色体18上的种内同源序列的另一数字RCD测定。通过正向引物5’-ACGTTGGATGGTACAGAAACCACAAACTGATCGG-3’(SEQ IDNO:32)和反向引物5’-ACGTTGGATGGTCCAGGCTGTGGGCCT-3’(SEQ ID NO:33)来共扩增染色体21和染色体18上的种内同源基因座的148-bp的扩增子(包括每种引物上的10-mer)。设计了靶向染色体21和染色体18之间的碱基差异的延伸引物，该延伸引物的序列是5’-ACAAAAGGGGGAAGAGG-3’(SEQ ID NO:34)。

利用延伸引物方案来进行多重数字RCD分析。利用GeneAmpPCR Core试剂盒(Applied Biosystems)来进行PCR反应，并且反应体积为5μL。每个反应含有1X Buffer II、2mM的MgCl₂、200μM的dNTP混合物、0.2U的AmpliTaq Gold、4种引物各200nM以及50%DNA混合物。将测定/样品混合物分配至384孔PCR板，在50℃下开始反应持续2min，然后95℃进行10min以及进行95℃、15s和57℃、1min的40个循环。

将PCR产物用虾碱性磷酸酶(SAP)处理以除去未并入的dNTP。将该混合物在37℃下孵育40min，然后在85℃下孵育5min。然后进行引物延伸反应。简而言之，向SAP处理的PCR产物中添加771nm来自染色体21/染色体1测定的延伸引物、1.54μM来自染色体21/染色体18测定的延伸引物、0.67U热测序酶(Thermosequenase)(Sequenom)以及延伸混合物(extension cocktail)中的ddCTP、ddGTP、dATP和dTTP各64μM。反应条件是94℃、2min，然后94℃、5s，50℃、5s以及72℃、5s进行80个循环。向该延伸产物中添加16μL水和3mg纯净树脂(Clean Resin)(Sequenom)来进行最后的清理。将该混合物在旋转器中混合20min至30min，然后在361g下离心5min。通过MassARRAY纳米分配器(Nanodispenser)S(Sequenom)将15nL至25nL终产物分配至SpectroCHIP中。在MassARRAY Analyzer紧凑型质谱仪(MassARRAY Analyzer Compact Mass Spectrometer)(Sequenom)进行来自SpectroCHIP的数据获取。将质谱数据输入MassARRAYTyper(Sequenom)软件进行分析。

用双重RCD测定来分析5个整倍体和5个T2150%胎盘/母体DNA样品。对于每个样品，计数了来自单独测定的信息孔的数目，该信息孔包括只对染色体21标记物或染色体1标记物或染色体18标记物是阳性的孔。对每个RCD测定，单独计算了全部信息孔中染色体21标记物的比例(P_r)。然后应用序贯概率比检验(SPRT)来确定该P_r是否表示整倍体样品或T21样品。通过进行这个步骤，由于将每个板计数了两次，所以减少了所需的孔的数目。

通常首先应用染色体21/染色体1测定。如果样品尚未分类，则加入来自染色体21/染色体18测定的值来进行进一步的计算。，对尚未分类的样品使用额外的板直至能够进行判定。如图21所示，利用单个384孔板正确地分类了全部整倍体50%混合物样品。某些T21个例需要2个或更多个板来进行正确的分类。如果只使用一个测定，则需要更多数目的板来获得实现分类所要求的信息孔的数目。例如，当只使用任何一个RCR测定时，个例N0230的数据是不可分类的。然而，当合并来自两个测定的数据时，实现了正确的分类。如果不使用二重RCD测定，则需要额外板的分析。我们预期更高水平的多重测定将进一步减少孔的数目。

在另一实施例中，我们开发了靶向染色体21上的4个不同扩增子以及和它们位于其它非染色体21的常染色体上的对应种内同源伴侣的4重(4-plex)测定。在数字RCD分析中使用这种4重测定，然后进行来自整倍体妊娠和21三体性妊娠的样品的SPRT分类。利用QIAamp组织试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从胎盘样品提取DNA。

首先通过NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technology,Wilmington,DE)来定量本研究中所用的全部胎盘和母体血沉棕黄色层DNA样品。利用6.6pg/细胞的换算将DNA浓度转换成基因组当量(GE)/μL。通过将DNA样品连续稀释来确定对应于约每孔一个模板的DNA的量。在这种条件下，我们预期约37%的孔将表现出阴性扩增。在多重数字RCD分析中，选择了4组种内同源序列靶标：通过正向引物5’-ACGTTGGATGTTGATGAAGTCTCATCTCTACTTCG-3’(SEQID NO:35)和反向引物5’-ACGTTGGATGCAATAAGCTTGGCCAGAAATACT-3’(SEQ IDNO:36)来共扩增染色体21和染色体1上的种内同源基因座，从而获得81bp的扩增子。通过正向引物5’-ACGTTGGATGGAATTTAAGCTAAATCAGCCTGAACTG-3’(SEQID NO:37)和反向引物5’-ACGTTGGATGGTTTCTCATAGTTCATCGTAGGCTTAT-3’(SEQID NO:38)来共扩增染色体21和染色体7上的种内同源基因座，从而获得82bp的扩增子。通过正向引物5’-ACGTTGGATGTCAGGCAGGGTTCTATGCAG-3’(SEQ ID NO:39)和反向引物5’-ACGTTGGATGAGGCGGCTTCCTGGCTCTTG-3’(SEQID NO:40)来共扩增染色体21和染色体2上的种内同源基因座，从而获得101bp的扩增子。通过正向引物5’-ACGTTGGATGGCTCGTCTCAGGCTCGTAGTT-3’(SEQ ID NO:41)和反向引物5’-ACGTTGGATGTTTCTTCGAGCCCTTCTTGG-3’(SEQID NO:42)来共扩增染色体21和染色体6上的种内同源基因座，从而获得102bp的扩增子。每个反应含有10X缓冲液II(AppliedBiosystems)、MgCl₂和100nM的每种引物。总反应体积是5μL/孔。在95℃下开始反应持续5min，然后95℃、30sec，62℃、30sec和72℃、30sec进行45个循环，最后在72℃下最终延伸7min。在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)上进行全部常规PCR扩增。通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理来灭活未被并入的核苷酸。每个反应含有10X SAP缓冲液(Sequenom)和SAP酶(Sequenom)。向每一PCR中添加2μL的SAP混合物。将该SAP反应在37℃下孵育40min，以及在85℃下孵育5min。SAP处理后，利用iPLEX Gold试剂盒(Sequenom)在PCR产物上进行引物延伸反应。通过延伸引物5’-GTCTCATCTCTACTTCGTACCTC-3’(SEQ ID NO:43)来询问染色体21和染色体1上的种内同源基因座上的种内同源序列错配(PSM)。通过延伸引物5’-TTTTACGCTGTCCCCATTT-3’(SEQ ID NO:44)来询问染色体21和染色体7上的种内同源基因座上的PSM。通过延伸引物5’-GGTCTATGCAGGAGCCGAC-3’(SEQ ID NO:45)来询问染色体21和染色体2上的种内同源基因座上的PSM。通过延伸引物5’-TGGGCGCGGGAGCGGACTTCGCTGG-3’(SEQ ID NO:46)来询问染色体21和染色体6上的种内同源基因座上的PSM。除了用于染色体21和染色体6上的PSM的延伸引物是1.03μM以外，每个反应含有10X iPLEX缓冲液(Sequenom)、iPLEX终止混合物(Sequenom)、iPLEX酶(Sequenom)和343nM的每种延伸引物。向5μL的PCR产物中添加2μL的iPLEX混合物。根据200-短-循环程序来循环iPLEX反应。简而言之，将样品首先在94℃下变性35sec，然后在52℃下退火5sec，并在80℃下延伸5sec。将退火和延伸循环再重复4次，总共5个循环，然后返回94℃的变性步骤保持5sec，然后再进行5个循环的退火和延伸循环。将5个退火和延伸循环与单次变性步骤重复39次，总共是40次。问在72℃下进行最终延伸3min。然后将每个PCR的iPLEX反应产物用16μL水稀释，并用6mg树脂脱盐。在分配至SpectroCHIP(Sequenom)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法MS分析(Sequenom)前，将384孔板在1600g下离心3min。

独立地记录了4个测定的每一个的只对染色体21是阳性或只对参考染色体是阳性的孔的数目。对于每个测定，计算了染色体21和参考染色体的分子的泊松(Poisson)修正数目。计算来自全部4个测定的染色体21的泊松修正分子数目的总和及参考染色体的泊松修正分子数目的总和，并将这两个总和视为4重测定的信息计数。P_r值是4重测定的染色体21计数除以4重测定的染色体21计数与参考染色体计数的总和。将实验导出的P_r进行SPRT分析。分析一个或多个384孔板直至通过SPRT进行疾病分类是可能的。分析了总共两个50%整倍体胎盘基因组DNA/50%母体血沉棕黄色层DNA混合物和两个50%21三体性胎盘基因组DNA/50%母体血沉棕黄色层DNA混合物。

将实验导出的P_r值与P_r的预期值进行比较来检验无效假设或备选假设。可选择地，如果给定数目的信息计数的P_r仍然未能达到疾病分类的统计学置信度，则既不接受无效假设也不接受备选假设。在有更多的可用数据前，将这些个例视为不可分类的。

每个样品的结果和SPRT分类列于表22A和22B中。在实现SPRT分类前，两个整倍体样品需要2个和5个384孔多重数字RCD分析。没有来自4重测定的单独成员的数据允许通过SPRT进行疾病分类。只通过一个384孔多重数字RCD分析分别正确地分类了两个21三体性样品。类似地，没有来自4重测定的单独成员的数据允许通过SPRT进行疾病分类。然而，来自4重测定的综合计数允许正确的SPRT分类。这些数据表明，通过使用多重数字RCD，与使用单重(single-plex)数字RCD测定相比，对于给定数目的数字PCR分析，信息计数的有效数目明显增加。

VI.使用数字外遗传相对染色体剂量

在此处，我们概述了称为数字外遗传相对染色体剂量(digitalepigenetic relative chromosome dosage)(数字ERCD)的方法，其中对在与染色体非整倍性有关的染色体(例如，21三体性中的染色体21)和参考染色体上表现出胎儿特异性的DNA甲基化方式或其它外遗传变化的外遗传标记物进行数字PCR分析。在从怀有正常胎儿的孕妇提取的血浆DNA中，对染色体21外遗传标记物是阳性的孔的数目与对参考染色体外遗传标记物是阳性的孔的数目的比率将为我们提供参考范围。如果胎儿具有21三体性，则预期该比率将增加。对本领域的技术人员显而易见的是，在这个分析中能够使用多于一个的染色体21标记物和多于一个的参考染色体标记物。

表现出胎儿(胎盘)特异性甲基化方式的染色体21上的基因的一个实例是羧化全酶合成酶(HLCS)基因。HLCS在胎盘中是高度甲基化的，但是在母体血液细胞中是低甲基化的，并且被第11/784499号美国专利申请所包括，该申请在此处通过引用的方式被并入。表现出胎儿(胎盘)特异性甲基化方式的参考染色体上的基因的一个实例是染色体3上的RASSFlA基因[10]。RASSFlA在胎盘中是高度甲基化的，但是在母体血液细胞中是低甲基化的，参见第11/784501号美国专利申请，该申请在此处通过引用的方式被并入。

在高度甲基化的HLCS和高度甲基化的RASSFlA在利用母体血浆来检测胎儿21三体性的数字PCR的应用中，首先收集母体外周血液。然后将该血液离心并收集血浆。然后利用本领域技术人员公知的技术来从该血浆中提取DNA，例如使用QIAamp血液试剂盒(Qiagen)。然后用一种或多种甲基化敏感的限制性内切酶来消化该血浆DNA，例如HpaII和BstUI。这些甲基化敏感的限制性内切酶将切割这些基因的母体的未甲基化的形式，而留下完整的胎儿高度甲基化的序列。然后将该消化的血浆DNA样品稀释至某种程度，即每个反应孔将检测到平均约0.2至1个分子的任何一种经限制性内切酶处理但完整的HLCS或RASSFlA序列。使用两种实时PCR系统来扩增稀释的DNA，一种系统具有两种引物和一种对HLCS基因特异性的TaqMan探针，HLCS基因包含如果序列是未甲基化的，则被限制性内切酶切割的区域；另一种系统针对RASSFlA基因，该系统类似地具有两种引物和一种TaqMan探针。对于后一种RASSFlA引物/探针组，Chan et al.2006,ClinChem52,2211-2218已经描述了一个实例。针对HLCS和RASSFlA靶标的TaqMan探针具有不同的荧光报道分子，例如分别为FAM和VIC。然后使用384孔板来进行数字PCR实验。计数只对HLCS是阳性的孔的数目和只对RASSFlA是阳性的孔的数目，并计算这些计数的比率。与怀有正常的整倍体胎儿的孕妇相比，预期取自怀有21三体性胎儿的孕妇的母体血浆的HLCS:RASSFlA比率将更高。过度表现的程度将取决于数字PCR运行中每孔的平均参考模板浓度。

评分这些结果的其它方法将是可能的，例如，计数对HLCS是阳性的孔的数目，而不论同时存在的对RASSFlA的阳性；反之对RASSFlA也是这样，而不论同时存在的对HLCS的阳性。而且，代替计算比率，HLCS和RASSFlA计数的总数或差异能够用于表示胎儿的21三体性状态。

除了在板中进行数字PCR以外，对本领域技术人员显而易见的是，能够使用数字PCR的其它变体，例如，微流体芯片、纳升PCR微板系统、乳液PCR、polony PCR和滚动循环扩增、引物延伸以及质谱等。作为示例而不作为限制来描述这些数字PCR的变体。

除了实时PCR以外，对本领域技术人员还显而易见的是，诸如质谱的方法能够用于评分数字PCR的结果。

除了利用甲基化敏感性限制性内切酶来区分HLCS和RASSFlA的胎儿与母体形式以外，对本领域技术人员显而易见的是，确定甲基化状态的其它方法也是可用的，例如，亚硫酸氢盐修饰、甲基化特异性PCR、利用甲基化的胞嘧啶的抗体的免疫沉淀、质谱等。

对本领域技术人员还显而易见的是，本实施例和本专利申请中的其它实施例中所示的方法能够用于可以发现胎儿DNA的其它体液，包括母体尿、羊水、宫颈灌洗、绒毛膜绒毛、母体唾液等。

VII.利用乳液PCR和其它策略的大规模平行基因组测序

此处，我们将描述能够将核酸分子的数字读取用于检测母体血浆中的诸如21三体性的胎儿染色体非整倍性的另一实施例。胎儿染色体非整倍性由染色体或染色体区域的异常剂量导致。无创检测具有高灵敏度和特异性以将误诊降至最低是理想的。然而，在母体血浆和血清中，胎儿DNA以低的绝对浓度存在，并表现出全部DNA序列的一小部分。因此，靶向具体基因座的数字PCR取样的数目不能在相同的生物样品中无限地增加。因此，多组具体靶基因座的分析可以用于增加从样品中获得的数据的量，而不增加进行的数字PCR取样的数目。

因此，实施方案允许通过将遗传信息的量最大化来进行胎儿染色体非整倍性的无创检测，所述遗传信息能够从在含有母体背景核酸的生物样品中以小群体存在的有限量的胎儿核酸推断出。在一方面，获得的遗传信息的量足以进行准确的诊断，但是不过度地过量，从而控制所需的输入生物样品的成本和量。

诸如可在454平台(Roche)(Margulies,M.et al.2005Nature437,376-380)、Illumina基因组分析仪(或Solexa平台)或SOLiD系统(AppliedBiosystems)或Helicos True单分子DNA测序技术(Harris TD et al.2008Science,320,106-109)、Pacific Biosciences的单分子实时(SMRT^TM)技术以及纳米孔测序(Soni GV and Meller A.2007Clin Chem53:1996-2001)上实现的大规模平行测序允许在平行模式下，以高阶的倍增来测序分离自样品的许多核酸分子(Dear Brief Funct GenomicProteomic2003;1:397-416)。这些平台的每个测序了克隆扩增的或者甚至未扩增的单分子核酸片段。

由于在每个运行中，从每个样品产生了十万至百万或者甚至可能亿至十亿级的大量测序读数，得到的测序的读数形成了原始样品中核酸种类的混合物的代表性谱。例如，测序读数的单元型、转录物组、甲基化谱与原始样品的那些(Brenner et al.Nat Biotech2000;18:630-634;Taylor et al.Cancer Res2007;67:8511-8518)类似。由于每个样品的序列的大量取样，相同序列的数目，诸如以几倍的覆盖率或高冗余度从核酸池的测序产生的那些，也是原始样品中特定核酸种类或基因座的计数的好的定量表现方式。

在一实施方案中，对存在于孕妇血浆中的DNA片段进行随机测序，并获得最初来自胎儿或母亲的基因组序列。随机测序包括存在于生物样品中的核酸分子的随机部分的取样(测序)。由于测序是随机的，所以可以在每个分析中测序核酸分子的不同子集(部分)(并且因此基因组)。甚至当这个子集随样品变化和随分析变化时，这甚至可以在使用相同的样品时发生，实施方案也起作用。该部分的实例是基因组的约0.1%、0.5%或1%。在其它实施方案中，所述部分是这些值的至少任意一个。

然后可以用生物信息学方法将这些DNA序列的每一个定位于人基因组上。可能地，将从随后的分析中排除这些序列的比例，因为它们存在于人基因组的重复区域中，或存在于发生了个体间变异(inter-individual variation)的区域中，例如拷贝数变异。因此，可以测定感兴趣的染色体的量和一个或多个其它染色体的量。

在一实施方案中，则能够由生物信息学方法的结果来计算潜在地涉及诸如染色体21或染色体18或染色体13的染色体非整倍性的染色体参数(例如，部分表现(fractional representation))。可以基于全部序列(例如，全部染色体的某些测量)或染色体的特定子集(例如，除了被检测的染色体之外的仅一个其它染色体)的量来获得部分表现。

然后将该部分表现与在涉及正常(即，整倍体)胎儿的妊娠中建立的参考范围进行比较。可能地，在所述方法某些变体中，根据特定的母体血浆样本中的胎儿DNA的部分浓度(f)来调整该参考范围。能够从测序数据集来确定f的值，例如，如果胎儿是男性，则使用可被定位到Y染色体的序列。还可以在单独的分析中确定f的值，例如，使用胎儿外遗传标记物(Chan KCA et al.2006Clin Chem52,2211-8)的分析或通过单核苷酸多态性的分析。

在一方面，甚至当样品中的核酸池以小于100%的基因组覆盖率进行测序，并且捕获的核酸分子的比例中，大部分的每个核酸种类只测序了一次时，也能够定量地确定特定基因座或染色体的剂量失衡。换言之，从所述基因座在样品的全部可被定位的(mappable)测序的标签中的表现百分比来推断该基因座或染色体的剂量失衡。

在大规模平行基因组测序方法的一方面，可以同时生成全部染色体的代表性数据。不提前选择特定片段的来源。随机地进行测序，然后进行数据库检索来发现特定片段的出处。这与扩增来自染色体21的一个具体片段和来自染色体1的另一具体片段的情况形成对比。

在一实施例中，这种序列的比例将来自与非整倍性有关的染色体，例如示例性实施例中的染色体21。这种测序应用的其它的序列将源自其它染色体。考虑到染色体21与其它染色体的相对大小，能够获得来自这种测序应用的染色体21特异性序列的参考范围内的标准化频率(normalized frequency)。如果胎儿具有21三体性，则来自这种测序应用的源自染色体21的序列的标准化频率将增加，从而能够检测出21三体性。标准化化频率的变化程度将取决于分析的样品中胎儿核酸的部分浓度。

在一实施方案中，我们使用了用于人基因组DNA样品和人血浆DNA样品的单末端测序的Illumina基因组分析仪。该Illumina基因组分析仪测序了被捕捉在称为流动池(flow cell)的固体表面的克隆扩增的单个DNA分子。每个流动池具有用于测序8个单独样品或样品池的8条道。每条道能够生成约200Mb的序列，这只是人基因组序列的30亿个碱基对的一部分。利用流动池的一条道来测序每个基因组DNA样品或血浆DNA样品。将生成的短序列标签与人参考基因组进行比对，并且记录染色体来源。将与每条染色体比对的单独测序的标签的总数列成表，并将其与预期来自参考人基因组或非疾病代表性样品的每条染色体的相对大小进行比较。然后鉴定了染色体增加或减少。

所述方法只是目前描述的基因/染色体剂量策略的一个示例。可选择地，能够进行配对末端测序。不是如Campbell等人所述(Nat Genet2008;40:722-729)将测序的片段长度与参考基因组中预期的片段长度进行比较，而是根据染色体位置计数和分类比对的测序的标签的数目。通过将标签计数与参考基因组中的预期染色体大小或与非疾病代表性样品中的预期染色体大小进行比较来确定染色体区域或完整染色体的增加或减少。

在另一实施方案中，将运行中测序的核酸池部分进行另外的子选择(subselect)，然后进行测序。例如，能够将诸如寡核苷酸阵列的基于杂交的技术用于首先从某些染色体对核酸序列进行子选择，例如，潜在的非整倍体染色体和与检测的非整倍性无关的其它染色体。另一实例是，在测序前，将来自样品池的核酸序列的某些亚群进行子选择或富集。例如，据报道母体血浆中的胎儿DNA分子由比母体背景DNA分子短的片段组成(Chan et al.Clin Chem2004;50:88-92)。因此，根据分子大小，可以使用对本领域技术人员公知的一种或多种方法来将样品中的核酸序列分级，例如，通过凝胶电泳或尺寸排除柱，或者通过基于微流体的方法。仍然，可选择地，在分析母体血浆中无细胞胎儿DNA的实例中，能够通过抑制母体背景的方法来富集胎儿核酸部分，例如，通过添加甲醛(Dhallan et al.JAMA2004;291:1114-9)。

能够在这种应用中类似地使用其它单分子测序策略，例如，Roche454平台、Applied Biosystems SOLiD平台、Helicos True单分子DNA测序技术、Pacific Biosciences的单分子实时(SMRT^TM)技术以及纳米孔测序。

可以在同时提交的申请“DIAGNOSING FETALCHROMOSOMAL ANEUPLOIDY USING GENOMIC SEQUENCING(利用基因组测序来诊断胎儿染色体非整倍性)”中找到结果的实例和进一步的讨论(例如，对于测序和计算参数)(代理公司案卷号016285-005220US)，该申请通过引用的方式被并入。注意，当反应是例如本部分所述的测序时，可以实施用于确定截止值的本文所述的方法。

还能够与测序运行分开地进行母体血浆中胎儿DNA的部分浓度的确定。例如，能够利用实时PCR、微流体PCR或质谱来预确定Y染色体DNA浓度。实际上，能够利用Y染色体以外的基因座来测定胎儿DNA浓度，并且适用于女性胎儿。例如，Chan等人表明源自胎儿的甲基化的RASSFlA序列会在源自母体的未甲基化的RASSFlA序列的背景下的孕妇血浆中检测出(Chan et al.Clin Chem2006;52:2211-8)。因此，能够通过用甲基化的RASSFlA序列的量除以总RASSFlA(甲基化的和未甲基化的)序列的量来确定部分胎儿DNA浓度。

对于实施我们的发明，预期母体血浆比母体血清优选，因为在血液凝固中，从母体血液细胞中释放了DNA。因此，如果使用血清，预期母体血浆中的胎儿DNA的部分浓度将低于母体血清中的浓度。换言之，如果使用母体血清，与同时从相同孕妇获得的血浆样品相比，预期将需要生成更多的序列来诊断胎儿染色体非整倍性。

测定胎儿DNA的部分浓度的仍然另一替代方法是通过孕妇与胎儿之间的多态性差异的定量(Dhallan R,et al.2007Lancet,369,474-481)。这种方法的实例是靶向孕妇是纯合而胎儿是杂合的多态性位点。能够将胎儿特异性等位基因的量与共同等位基因的量进行比较以确定胎儿DNA的部分浓度。

与检测染色体畸变的现有技术相比，大规模平行测序不依赖于预定或预定义的组的DNA序列的检测或分析，所述现有技术包括比较基因组杂交、微阵列比较基因组杂交、检测并定量一种或多种特异性序列的定量实时聚合酶链式反应，。测序了来自样品池的DNA分子的随机代表性部分。在含有或不含有肿瘤DNA的样品之间比较与各种染色体区域比对的不同序列标签的数目。通过与样品中任何给定的染色体区域比对的序列的数目(或百分比)的差异来揭示染色体畸变。

在另一实施例中，可以使用血浆无细胞DNA的测序技术来检测血浆DNA中的染色体畸变，以检测具体的癌症。不同的癌症具有一组典型的染色体畸变。可以使用多个染色体区域的变化(扩增和缺失)。因此，将有增加比例的与扩增区域比对的序列，和降低比例的与减少的区域比对的序列。能够将每条染色体的百分比表现与表示为相对于全基因组的任何给定的染色体的基因组表现的百分比的参考基因组中每条对应染色体的大小进行比较。还可以使用与参考染色体的直接比较或比较。

VIII.突变检测

母体血浆中的胎儿DNA以较小的群体存在，并且母体血浆DNA由胎儿贡献的平均为3%至6%。由于这一原因，本领域中以前的大部分工作集中于检测胎儿从父亲遗传的DNA靶标，其可以与母体血浆中的占多数的母体DNA背景区分开。这种以前检测的靶标的实例包括Y染色体上的SRF基因(Lo YMD et al.1998Am J Hum Genet,62,768-775)和当母亲是RhD阴性时的RHD基因(Lo YMD et al.1998NEngl J Med,339,1734-1738)。

对于胎儿突变检测，利用母体血浆的以前的策略局限于父亲是携带者的常染色体显性状态，当父亲和母亲携带不同的突变时，通过直接突变检测来排除常染色体隐性疾病，或者通过连锁分析来排除常染色体隐性疾病(Ding C.et al.2004Proc Natl Acad Sci USA101,10762-10767)。这些以前的策略具有明显的局限性。例如，对于雄性和雌性配偶都携带相同突变的情况，则不可能通过母体血浆中的直接突变检测来进行有意义的产前诊断。

这种情境示于图23中。在该情境中，有3个可能的胎儿基因型：NN、NM和MM，其中N表示正常等位基因，M表示突变体等位基因。突变体等位基因的实例包括那些导致囊性纤维化、β-地中海贫血症、α-地中海贫血症、镰形细胞贫血、脊髓型肌萎缩、先天性肾上腺增生等的突变体等位基因。能够在在线人类孟德尔遗传(OMIM)www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=OMIM&itool=toolbar找到这些病症的其它实例。在母体血浆中，大部分DNA来自母亲，并且是NM的。对于3种胎儿基因型的任一种，将不会有允许在母体血浆中被独特地检测出的任何独特的胎儿等位基因。因此，不能在此处应用常规策略。

本文所述的实施方案允许处理这种情境。在母亲和胎儿都是NM的情境下，N等位基因和M等位基因将是等位基因平衡的。然而，如果母亲是NM而胎儿是NN，则将在母体血浆中有等位基因失衡，并且N等位基因是过度表现的。在另一方面，如果母亲是NM而胎儿是MM，则将在母体血浆中有等位基因失衡，并且M等位基因是过度表现的。因此，对于胎儿突变检测，无效假设指当胎儿的基因型是NM时，没有等位基因失衡。备选假设指存在等位基因失衡，并且取决于N等位基因或M等位基因是否是过度表现的，胎儿的基因型能够是NN或MM。

能够通过利用本文所述的实施方案的数字PCR来确定存在或不存在等位基因失衡。在第一种情境下，特定体积的母体血浆含有从100个细胞释放的DNA，其中50个细胞来自母亲，50个细胞来自胎儿。因此，在这个体积的血浆中的胎儿DNA的部分浓度是50%。当母亲的基因型是NM时，则母亲将贡献50个N等位基因和50个M等位基因。如果胎儿的基因型是NM，则胎儿将贡献50个N等位基因和50个M等位基因。因此，N等位基因和M等位基因之间没有等位基因失衡，并且每个等位基因总共各100个拷贝。在另一方面，如果胎儿的基因型是NN，则在这个体积的血浆中将有100个源自胎儿的N等位基因。因此，总共有150个N等位基因和50个M等位基因。换言之，在N与M之间存在等位基因失衡，并且N是过度表现的，N与M的比率为3:1。

在相反的情况下，如果胎儿的基因型是MM，则在这个体积的血浆中将有100个源自胎儿的M等位基因。因此，将有150个M等位基因和50个N等位基因。换言之，在N等位基因与M等位基因之间存在等位基因失衡，并且M是过度表现的，M与N的比率是3:1。能够通过数字PCR来测量这种等位基因失衡。将具有较少数目的阳性孔的等位基因视为参考模板。与数字RNA-SNP和数字RCD分析类似，数字PCR实验中等位基因的实际分布将受泊松概率密度函数控制。因此，由于本情境中等位基因失衡的理论程度是3:1，所以等位基因失衡的预期程度将取决于数字PCR分析中每孔的平均模板浓度。因此，需要将对每孔的平均参考模板浓度(m_r)适合的诸如用于SPRT分析的解释截止值用于对个例进行分类。

而且，需要测量的等位基因失衡的程度取决于部分胎儿DNA浓度。与上文的实施例对比，让我们考虑含有从100个细胞中释放的DNA的特定体积的母体血浆，其中90个细胞来自母亲而10个细胞来自胎儿。因此，这个体积的血浆中的胎儿DNA的部分浓度是10%。当母亲的基因型是NM时，则母亲将贡献90个N等位基因和90个M等位基因。如果胎儿的基因型是NM，则胎儿将贡献10个N等位基因和10个M等位基因。因此，在N等位基因与M等位基因之间不存在等位基因失衡，并且每个等位基因总共各100个拷贝。在另一方面，如果胎儿的基因型是NN，则在这个体积的血浆中将有20个源自胎儿的N等位基因。因此，总共有110个N等位基因和90个M等位基因。

换言之，N等位基因与M等位基因之间存在等位基因失衡，并且N等位基因是过度表现的。在相反的情况下，如果胎儿的基因是MM，则在这个体积的血浆中将有20个源自胎儿的M等位基因。因此，将有110个M等位基因和90个N等位基因。换言之，N等位基因与M等位基因之间存在等位基因失衡，并且M是过度表现的。当胎儿DNA部分浓度是10%时，等位基因失衡的理论程度是110:90，这不同于上文的实施例所示的，有50%的胎儿DNA时的比率3:1。因此，需要将对胎儿DNA部分浓度适合的解释截止值用于对个例进行分类，例如，用于SPRT分析的解释截止值。

因此，提取血浆DNA。定量血浆样品中母体DNA和胎儿DNA的量，例如，通过以前建立的实时PCR测定(Lo,et al.1998Am J HumGenet62,768-775)或对本领域技术人员公知的其它类型的量标(quantifier)，例如SNP标记物(Dhallan R et al.2007Lancet,369,474-481)和胎儿外遗传标记物(Chan KCA et al.2006Clin Chem,52,2211-2218)。将计算胎儿DNA百分比。然后制备定量的血浆DNA样品(例如，稀释的或浓缩的)，从而在数字PCR分析中，每个反应孔平均含有1个模板分子(能够是N等位基因或M等位基因)。利用一对引物加两个TaqMan探针来进行数字PCR分析，其中一个TaqMan探针对N等位基因是特异性的，而另一个TaqMan探针对M等位基因是特异性的。计数只对M等位基因是阳性的孔的数目和只对N等位基因是阳性的孔的数目。将这些孔的比率用于确定是否有等位基因失衡的证据。能够通过对本领域技术人员公知的方法来寻找等位基因失衡的统计证据，例如利用SPRT。在该分析的一个变体中，还可能计数只对M等位基因是阳性的孔的数目或对M等位基因和N等位基因是阳性的孔的数目；并计数只对N等位基因是阳性的孔的数目或对M等位基因和N等位基因是阳性的孔的数目，并导出这些计数的比率。再次地，能够通过对本领域技术人员公知的方法来寻找等位基因失衡的统计证据，例如利用SPRT。

利用雌性/雄性(XX/XY)DNA混合物来验证称为数字相对突变体剂量(RMD)的胎儿基因突变的剂量测定。如图24A所示，将来自雄性和雌性的血液细胞DNA分别与雄性DNA混合，从而分别在部分浓度为25%和50%时获得XY的背景下的XX基因型或XY基因型的样品，部分浓度分别为25%和50%的。

另外，还从12个雄性个体和12个雌性个体获得血液细胞样品。将雌性血液细胞DNA(基因型XX)分别与3倍的过量雄性血液细胞DNA(基因型XY)混合，从而获得75%XY基因型的DNA背景下的25%XX基因型的DNA的12个DNA混合物，并且结果示于图24B中。

SPRT的目的在于确定背景DNA中存在的少数基因型。在75%的XY DNA的背景下的25%的XX DNA的DNA混合物中，少数等位基因是源自75%的DNA的Y。由于该样品中25%的DNA的基因型是XX，因此如果在该样品中共有200个分子的DNA，则150个分子将源自XY个体。因此，预期Y等位基因的数目是75。雄性部分DNA(基因型XY)贡献的X等位基因的数目也是75。雌性(基因型XX)贡献的X等位基因的数目是50(2乘以25)。因此，X比Y的比率是125/75=(1+25%)/(1-25%)=5/3。

对于这个研究的第二部分，从在β-球蛋白基因，即血红蛋白，β(HBB)基因上携带HbE(G→A)和CD41/42(CTTT/-)突变的雄性和雌性个体获得血液细胞样品。为了模拟从怀有具有全部可能的基因型(MM、MN或NN)的雄性胎儿的杂合母亲(MN，其中M=突变体并且N=野生型)获得的母体血浆样品，将来自对野生型等位基因是纯合(NN)，或对两个突变中的一个是杂合(MN)的雄性的血液细胞DNA分别与从对相同的突变是杂合(MN)的雌性收集的血液细胞DNA样品混合。从而获得各种部分雄性/突变体DNA浓度的DNA混合物。还将来自对CD41/42缺失是纯合(MM)的雌性的血液细胞DNA样品用于制备DNA混合物。为了保证用于SPRT分类的准确雄性比例，利用ZFY/X测定来确定每种DNA混合物的部分雄性DNA浓度。

将数字ZFY/X测定用于验证SPRT，以及用于确定DNA混合物中部分雄性DNA浓度。通过数字PCR分析来测定染色体X(ZFX)和染色体Y(ZFY)上的锌指蛋白序列的剂量。首先通过正向引物5’-CAAGTGCTGGACTCAGATGTAACTG-3’(SEQ ID NO:47)和反向引物5’-TGAAGTAATGTCAGAAGCTAAAACATCA-3’(SEQ IDNO:48)来共扩增ZFX基因座和ZFY基因座的87-bp的扩增子。设计了两个染色体特异性TaqMan探针来区分染色体X和染色体Y种内同源基因，且探针的序列分别是5’-(VIC)TCTTTAGCACATTGCA(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:49)和5’-(FAM)TCTTTACCACACTGCAC(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:50)。

通过正常等位基因相对于突变体等位基因的数字PCR分析来确定DNA混合物中的突变体剂量。对于HbE突变，首先通过正向引物5’-GGGCAAGGTGAACGTGGAT-3’(SEQ ID NO:51)和反向引物5’-CTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAA-3’(SEQ ID NO:52)来共扩增正常等位基因和突变体等位基因的87-bp的扩增子。设计了两个等位基因特异性Ta_qMan探针来区分正常(G)等位基因和突变体(A)等位基因，且探针的序列分别是5'’-(VIC)TTGGTGGTGAGGCC(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:53)和5’-(FAM)TTGGTGGTAAGGCC(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:54)。HbE突变的结果示于图25中。

对于CD41/42缺失突变，首先通过正向引物5’-TTTTCCCACCCTTAGGCTGC-3’(SEQ ID NO:55)和反向引物5’-ACAGCATCAGGAGTGGACAGATC-3’(SEQ ID NO:56)来分别共扩增正常等位基因和突变体等位基因的87-bp和83-bp的扩增子。设计了两个等位基因特异性TaqMan探针来区分正常(无缺失)等位基因和突变体(有缺失)等位基因，且探针的序列分别是5’-(VIC)CAGAGGTTCTTTGAGTCCT(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:57)和5’-(FAM)AGAGGTTGAGTCCTT(MGBNFQ)-3’(SEQ ID NO:58)。HbE突变的结果示于图26A和26B中。

利用12.765数字阵列(Fluidigm)，在BioMark^TM系统(Fluidigm)上进行这些实验。利用2X TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)进行一个板的反应，并且反应体积是10_μL。对于CD41/42和ZFY/X测定，每个反应含有1X TaqMan Universal PCR Master Mix、900nM的每种引物、125nM的每种探针和3.5μL1ng/μL的DNA混合物。对于HbE测定，添加分别靶向正常(G)等位基因和突变体(A)等位基因的250nM和125nM的探针。通过NanoFlex^TMIFC控制器(Fluidigm)将样品/测定混合物加载至数字阵列。在用于信号检测的BioMark^TM系统上进行反应。在50℃下开始反应持续2min，然后95℃、10min，以及95℃、15s和57℃(对于ZFY/X和CD41/42)或56℃(对HbE)、1min的进行50个循环。每一个例至少使用一个反应板，对尚未可分类的样品从额外的板汇集数据直至能够做出判定。

对本领域技术人员还显而易见的是，能够利用对本领域技术人员公知的方法来进行数字PCR，例如，微流体芯片、纳升PCR微板系统、乳液PCR、polony PCR和滚动循环扩增、引物延伸以及质谱。

IX.癌症的实施例

在一实施方案中，可以进行本发明来将样品分类为具有或不具有在肿瘤中可能发生的等位基因比率偏移。在一方面，对于每一个例，通过数字PCR来确定只对A等位基因、只对G等位基因和对两个等位基因都是阳性信号的孔的数目。参考等位基因定义为具有较少数目阳性孔的等位基因。(在不大可能的情况下，即两个等位基因都具有相同数目的阳性孔，则任何一个等位基因都能够用作参考等位基因)。根据泊松概率密度函数，利用对参考等位基因是阴性的孔的数目来计算每孔的参考等位基因的推断的平均浓度(m_r)，而不论其它等位基因是否是阳性的。我们使用假设的实例来对计算进行说明。

在96孔反应中，20个孔对A等位基因是阳性的，24个孔对G等位基因是阳性的，并且28个孔对两个等位基因都是阳性的。将A等位基因视为参考等位基因，因为对这个等位基因是阳性的孔较少。对参考等位基因是阴性的孔的数目是96-20-28=48。因此，能够利用泊松分布来计算m_r，并且m_r是-ln(48/96)=0.693。

在LOH检测的情况下，无效假设指假定没有由存在一个等位基因缺失导致的等位基因比率偏移的样品。在这个假定下，两个等位基因的阳性孔数目的预期比率将是1:1，因此，含有潜在地过度表现的等位基因的信息孔(只对一个等位基因是阳性的孔)的预期比例将是0.5。

在LOH检测的情况下，备选假设指假定具有由样品的50%的细胞中存在一个等位基因缺失而导致的等位基因比率偏移的样品。由于过度表现的等位基因与参考等位基因之间的等位基因比率是2:1，所以每孔过度表现的等位基因的平均浓度将是参考等位基因的平均浓度的2倍。然而，对该过度表现的等位基因是阳性的孔的数目并不简单地是对该参考等位基因是阳性的孔的数目的2倍，而是服从泊松分布。

信息孔被定为对A或G等位基因是阳性的，但对A和G不都是阳性的孔。对于具有等位基因比率偏移的样品，含有过度表现的等位基因的孔的数目的预期比例的计算与表600所示的相同。在上文的实施例中，如果在50%的肿瘤细胞中存在LOH，则每孔的G等位基因的平均浓度将是2×0.693=1.386。如果在多于50%的肿瘤细胞中存在LOH，则每孔的G等位基因的平均浓度将根据下述公式来计算：1/[1-(LOH的比例)]×m_r。

对G等位基因是阳性的孔的预期比例将是1-e^-1.386=0.75(即75%或72个孔)。假定对于A等位基因或G等位基因，孔的阳性是独立的，则0.5×0.75=0.375的孔将对A等位基因和G等位基因都是阳性的。因此，0.5-0.375=0.125的孔只对A等位基因是阳性的，而0.75-0.375=0.375的孔只对G等位基因是阳性的。因此，信息孔的比例是0.125+0.375=0.5。携带G等位基因的信息孔的预期比例是0.375/0.5=0.75。然后将P_r的这个预期值用于构建合适的SPRT曲线来确定样品中是否存在等位基因比率偏移(即，这种情况下的LOH)。

然后将通过数字PCR分析实验确定的携带非参考等位基因的信息孔的实际比例用于确定是否接受无效假设或备选假设，或者确定是否需要更多孔的进一步分析。基于阀值似然比率8来计算接受无效假设或备选假设的P_r的判定边界，因为这个值已经被证实在癌症检测的情况下提供了鉴别具有或不具有等位基因失衡的样品的令人满意的性能(Zhou,W,et al.(2001)Nat Biotechnol19,78-81;Zhou et al.2002,见上文)。在上文的实施例中，信息孔的数目是20+24=44，而实验获得的P_r是24/44=0.5455。接受无效假设的判定边界是≤0.5879而接受备选假设的判定边界是≥0.6739。因此，将这个实施例中的样品分类为不具有等位基因比率偏移。

综上所述，我们描述了在样品中检测序列失衡的方法。在一实施方案中，本发明能够通过分析母体血浆中的胎儿核酸用于诸如21三体性的胎儿染色体非整倍性的无创检测。这种方法还能够应用于其它含有胎儿核酸的生物材料，包括羊水、绒毛膜绒毛样品、母体尿、宫颈样品、母体唾液等。首先，我们证明了本发明在怀有21三体性胎儿的妇女的母体血浆中，用于确定PLAC4mRNA即染色体21上的胎盘表达的转录物上的SNP的等位基因失衡的用途。其次，我们证明，通过相对染色体剂量(RCD)分析，我们的发明能够用作用于21三体性的无创产前检测的基于非多态性的方法。这种基于数字RCD的方法包括直接评价含有胎儿DNA样品中的染色体21的总拷贝数相对于参考染色体是否是过度表达的。甚至不需要复杂的仪器，数字RCD允许在含有25%胎儿DNA的样品中检测21三体性。我们应用序贯概率比检验(SPRT)来解释数字PCR数据。计算机模拟分析证实了疾病分类算法的高准确性。

我们还描述了能够用于确定染色体非整倍性以外的其它形式的核酸序列失衡的方法，例如，用于胎儿突变检测的方法，或用于母体血浆中多态性检测的方法，以及通过血浆中源自肿瘤的核酸的分析来检测恶性肿瘤细胞基因组中的区域增加或减少的方法。

本申请中所述的任何软件组分或函数可以作为通过使用任何合适的计算机语言的处理器运行的软件代码来执行，所述计算机语言诸如例如Java、C++或使用例如常规或面向对象技术的Perl。所述软件代码可以保存为用于储存和/或传送的计算机可读取的介质上的一系列的指令或命令，合适的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、诸如硬盘或软盘的磁性介质、诸如光盘(CD)或DVD(数字多用光盘)的光学介质、闪速存储器等。计算机可读取的介质可以是这些储存或传送装置的任何组合。

还可以利用适合通过有线、光和/无线网络传送的载波信号来编码和传送这些程序，所述网络符合包括因特网在内的各种协议。这样，可以利用这些程序编码的数据信号来产生本发明实施方案的计算机可读取的介质。用所述程序代码编码的计算机可读取的介质可以用兼容的装置来包装或与其它装置分开提供(例如，通过因特网下载)。任何这种计算机可读取的介质可以位于单个计算机程序产品(例如，硬盘或整个计算机系统)上或在产品内，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机程序产品上或在产品内。计算机系统可以包括监视器、打印机或用于向使用者提供本文所述的任何结果的其他合适的显示器。

计算机系统的实例示于图27中。图27所示的子系统通过系统总线2775互相连接。显示了另外的子系统，例如打印机2774、键盘2778、固定磁盘2779、与显示适配器2782连接的监视器2776等。与I/O控制器2771连接的外设和输入/输出(I/O)装置能够通过本领域已知的多种方式来与该计算机系统连接，诸如串行端口2777。例如，能够使用串行端口2777或外部界面2781来将所述计算机设备与诸如因特网的广域网络、鼠标输入装置或扫描仪相连接。通过系统总线的相互连接允许中央处理器2773与每个子系统通讯并控制来自系统内存2772或固定磁盘2779的指令的执行，以及子系统之间的信息交换。系统内存2772和/或固定磁盘2779可以包括计算机可读取的介质。

出于示例和说明的目的，上文描述了本发明的示例性的实施方案。并不意图穷尽本发明或将本发明局限于所述的精确形式，并且根据上文的教导，许多修饰和变化是可能的。选择并描述实施方案以最好地解释本发明的原理和及其实践应用，从而允许本领域其他技术人员在各种实施方案中最好地利用本发明，并且可以作出适用于所包括的特定用途的各种修饰。

本文引用的全部出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文用于所有目的。

Claims (20)

1.计算机程序产品，其包括被编码的具有多个指令的计算机可读取的介质，所述指令用于控制计算机系统以执行确定生物样品中是否存在核酸序列失衡的操作，所述指令包括：

接收来自多个反应的数据，其中所述数据包括：

(1)表示临床相关的核酸序列的第一量的第一组定量数据；和

(2)表示不同于所述临床相关的核酸序列的背景核酸序列的第二量的第二组定量数据，其中所述临床相关的核酸序列和所述背景核酸序列来自第一类型的细胞和来自一种或多种第二类型的细胞；

从所述两个数据组确定参数；

从由核酸序列的量的测量产生的第一百分比导出第一截止值，所述核酸序列来自所述生物样品中的所述第一类型的细胞；

将所述参数与所述第一截止值比较；以及

基于所述比较，确定是否存在核酸序列失衡的分类。

2.如权利要求1所述的计算机程序产品，其中所述序列失衡与肿瘤中获得或失去部分染色体有关。

3.如权利要求1所述的计算机程序产品，其中所述第一类型的细胞来自第一有机体，并且所述第二类型的细胞来自第二有机体。

4.如权利要求3所述的计算机程序产品，其中所述第一有机体是怀有胎儿的女性个体，所述胎儿是第二有机体，其中所述确定第一百分比包括定量所述女性个体与所述胎儿之间的多态性差异。

5.如权利要求3所述的计算机程序产品，其中所述第一有机体是怀有胎儿的女性个体，所述胎儿是第二有机体，其中所述胎儿是男性，并且其中所述确定生物样品中胎儿DNA的部分浓度包括：

确定Y染色体DNA浓度。

6.如权利要求3所述的计算机程序产品，其中所述第一有机体是怀有胎儿的女性个体，所述胎儿是第二有机体，其中所述确定生物样品中胎儿DNA的部分浓度包括：

将在第一基因座处表现出胎儿特异性甲基化方式的DNA分子的量与所述第一基因座处DNA分子的总量比较。

7.如权利要求6所述的计算机程序产品，其中所述源自胎儿的DNA分子是高度甲基化的，而源自母体的DNA分子是低甲基化的。

8.如权利要求1所述的计算机程序产品，其中所述导出第一截止值包括：

确定每个反应的参考核酸序列的第一平均浓度，其中所述参考核酸序列是过少表现的所述临床相关的核酸序列或所述背景核酸序列；以及

将所述第一平均浓度乘以从所述第一百分比导出的因子来获得不是所述参考核酸序列的核酸序列的第二平均浓度。

9.如权利要求8所述的计算机程序产品，其还包括：

利用将从所述参考核酸序列的数据导出的值作为输入的概率分布的逆函数，来确定所述多个反应的每一个中的所述参考核酸序列的平均浓度。

10.确定怀有胎儿的女性个体的生物样品中胎儿DNA的部分浓度的方法，所述生物样品包括来自所述女性个体和来自所述胎儿的核酸分子，并且其中所述女性个体在第一基因座处的第一等位基因是纯合的，而所述胎儿在所述第一基因座处的第一等位基因和不同于所述第一等位基因座的第二等位基因是杂合的，所述方法包括：

接收来自第一多个反应的第一数据，所述反应包括来自所述生物样品的核酸分子，其中所述反应指示存在或缺失感兴趣的多个多核苷酸序列，其中所述第一数据包括：

(1)表示对第一等位基因阳性的反应的第一数目的第一组定量数据；和

(2)表示对第二等位基因阳性的反应的第二数目的第二组定量数据；以及

比较第一数目与第二数目以确定胎儿DNA的部分浓度。

11.如权利要求10所述的方法，其中利用所述第一数目和所述第二数目以百分比来确定所述胎儿DNA的部分浓度。

12.如权利要求10所述的方法，其还包括：

接收来自第二多个反应的第二数据，所述反应包括来自所述生物样品的核酸分子，其中所述第二数据包括：

(1)表示一个或多个临床相关的核酸序列的第三量的第三组定量数据，所述临床相关的核酸序列不包括所述第一基因座；和

(2)表示不同于一个或多个临床相关的核酸序列的一个或多个背景核酸序列的第四量的第四组定量数据，其中所述临床相关的核酸序列和所述背景核酸序列来自核酸分子，所述核酸分子来自所述女性个体和来自所述胎儿；

从所述第三和第四数据组确定参数，其中所述参数提供所述第三和第四量之间的相对量；

从胎儿DNA的部分浓度导出第一截止值；

将所述参数与所述第一截止值比较；以及

基于比较，确定是否存在核酸序列失衡的分类。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述序列失衡是染色体非整倍性。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述临床相关的核酸序列中的一个是遗传多态性的等位基因，并且所述背景核酸序列中的一个是所述遗传多态性的另一等位基因。

15.如权利要求12所述的方法，其还包括：

在进行第二多个反应之前，富集生物样品中所述一个或多个临床相关的核酸序列和所述一个或多个背景核酸序列。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述富集生物样品中所述一个或多个临床相关的核酸序列和所述一个或多个背景核酸序列包括：

利用寡核苷酸阵列通过杂交来选择所述一个或多个临床相关的核酸序列和所述一个或多个背景核酸序列。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述富集生物样品包括：

扩增来自所述一个或多个临床相关的核酸序列和所述一个或多个背景核酸序列的DNA。

18.如权利要求12所述的方法，其中在确定参数之后确定所述胎儿DNA的部分浓度。

19.如权利要求12所述的方法，其中所述第一多个反应与所述第二多个反应相同。

20.如权利要求10所述的方法，其中所述反应是测序反应或扩增反应。

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