ES2792802T3 - Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica - Google Patents

Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica Download PDF

Info

Publication number
ES2792802T3
ES2792802T3 ES12173422T ES12173422T ES2792802T3 ES 2792802 T3 ES2792802 T3 ES 2792802T3 ES 12173422 T ES12173422 T ES 12173422T ES 12173422 T ES12173422 T ES 12173422T ES 2792802 T3 ES2792802 T3 ES 2792802T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequenced
chromosome
sequences
chromosomal region
parameter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12173422T
Other languages
English (en)
Inventor
Yuk-Ming Dennis Lo
Rossa Wai Kwun Chiu
Kwan Chee Chan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese University of Hong Kong CUHK
Original Assignee
Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39798126&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2792802(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chinese University of Hong Kong CUHK filed Critical Chinese University of Hong Kong CUHK
Application granted granted Critical
Publication of ES2792802T3 publication Critical patent/ES2792802T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Un método implementado por ordenador de análisis de una muestra biológica de un organismo para deleciones o amplificaciones en una o más regiones cromosómicas asociadas con cáncer, incluyendo la muestra biológica moléculas de ADN sin células que se originan a partir de células no malignas y potencialmente de células tumorales asociadas con cáncer, comprendiendo el método: recibir etiquetas secuenciadas obtenidas de una secuenciación aleatorizada de moléculas de ADN contenidas en la muestra biológica, siendo la muestra biológica plasma, suero, saliva u orina; alinear una pluralidad de las etiquetas secuenciadas con un genoma humano de referencia; determinar una primera cantidad de las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con una primera región cromosómica que es parte de un primer cromosoma; determinar una segunda cantidad de etiquetas secuenciadas como alineaciones con una o más segundas regiones cromosómicas; determinar un primer parámetros a partir de la primera cantidad y de la segunda cantidad, en donde el parámetro incluye una proporción entre la primera cantidad y la segunda cantidad, en donde una anomalía en el primer parámetro para la primera región cromosómica se asocia con cáncer; y comparar el primer parámetro con uno o más valores umbral para determinar una clasificación de si la primera región cromosómica presenta una deleción y/o una amplificación asociada con cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica
La presente invención se refiere, en líneas generales, al ensayo del diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal determinando desequilibrios entre diferentes secuencias de ácidos nucleicos, y más particularmente, a la identificación de trisomía 21 (síndrome de Down) y otras aneuploidías cromosómicas mediante ensayo de una muestra materna (por ejemplo, sangre).
La aneuploidía cromosómica fetal es el resultado de la presencia de una o varias dosis anómalas de un cromosoma o región cromosómica. Las dosis anómalas pueden ser anormalmente altas, por ejemplo, presencia de un cromosoma 21 o región cromosómica extra, en la trisomía 21, o anormalmente bajas, por ejemplo, ausencia de una copia del cromosoma X, en el síndrome de Turner.
Los métodos de diagnóstico prenatales convencionales de una aneuploidía cromosómica fetal, por ejemplo, trisomía 21, implican el muestreo de material fetal a través de procedimientos invasivos, tales como amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas, que constituyen un riesgo finito de pérdida fetal. Para estratificar a las gestantes según el riesgo se han utilizado procedimientos no invasivos tales como exploración por ultrasonido y marcadores bioquímicos, antes de los procedimientos de diagnóstico invasivos definitivos. Sin embargo, estos métodos de exploración miden normalmente fenómenos epigenéticos asociados con aneuploidías cromosómicas, por ejemplo, trisomía 21, en lugar de anomalías cromosómicas principales, y por tanto tienen una precisión de diagnóstico limitada y otras desventajas, tales como estar muy influenciadas por la edad gestacional.
El descubrimiento en 1977 de ADN fetal libre circulando en el plasma materno ofrece nuevas posibilidades al diagnóstico prenatal no invasivo (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007 Nat Rev Genet 8, 71-77). A pesar de que este método se ha aplicado fácilmente al diagnóstico prenatal de trastornos ligados al sexo (Costa, JM et al. 2002 N Engl J Med 346, 1502) y a determinados trastornos genéticos sencillos (LO, YMD et al. 1998 N Engl J Med 339, 1734-1738), su aplicación a la detección prenatal de aneuploidías cromosómicas fetales ha sido un reto considerable (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007, citado anteriormente). En primer lugar, los ácidos nucleicos fetales co-existen en el plasma materno con un alto fondo de ácidos nucleicos de origen materno que, con frecuencia, pueden interferir con el análisis de ácidos nucleicos fetales (Lo, YMD et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-775). En segundo lugar, los ácidos nucleicos fetales circulan en el plasma materno predominantemente en una forma libre, dificultando la obtención de información sobre la dosificación de genes o cromosomas dentro del genoma fetal.
Recientemente se han realizado desarrollos significativos que superan estos retos (Benachi, A & Costa, JM 2007 Lancet 369, 440-442). Una estrategia detecta ácidos nucleicos específicos fetales en el plasma materno, superando así el problema de la interferencia con el fondo materno (Lo, YMD y Chiu, RWK 2007, citado anteriormente). La dosificación del cromosoma 21 se dedujo a partir de las proporciones de alelos polimórficos en las moléculas de ADN/ARN derivadas de placenta. Sin embargo, este método es menos preciso cuando las muestras contienen menos cantidad de ácido nucleico diana y solo pueden aplicarse a fetos que son heterocigotos para polimorfismos diana, lo cual es solo un subconjunto de la población si se usa un polimorfismo.
Dhallan et al (Dhallan, R, et al. 2007, citado anteriormente Dhallan, R, et al. 2007 Lancet 369, 474-481) describen una estrategia alternativa de enriquecimiento de la proporción de ADN fetal circulante añadiendo formaldehído al plasma materno. La proporción de secuencias del cromosoma 21 aportadas por el feto en el plasma materno se determinó evaluando la razón de alelos específicos fetales heredados por vía paterna con respecto a alelos específicos no fetales para polimorfismos mononucleotídicos, (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) en el cromosoma 21. De manera similar, se calcularon las razones SNP para un cromosoma de referencia. Después, se dedujo un desequilibrio del cromosoma fetal 21 detectando una diferencia estadísticamente significativa entre las razones SNP para el cromosoma 21 y las del cromosoma de referencia, en la que el significante se definió utilizando un valor fijo de p s 0,05. Para garantizar una alta cobertura de la población, se definieron más de 500 SNP por cromosoma. Sin embargo, ha habido controversias con respecto a la eficacia del formaldehído para enriquecer el ADN fetal a una alta proporción (Chung, GTY, et al. 2005 Clin Chem. 51, 655-658) y por tanto la reproducibilidad del método requiere evaluarse adicionalmente. Además, como cada feto y madre sería informativo para un número diferente de SNP para cada cromosoma, el poder del ensayo estadístico para la comparación de razones SNP variaría en cada caso (Lo, YMD y Chiu, rWk . 2007 Lancet 369, 1997). Además, dado que estas estrategias dependen de la detección de polimorfismos genéticos, se limitan a fetos heterocigotos para estos polimorfismos. La utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la cuantificación de ADN de un locus de cromosoma 21 y de un locus de referencia en cultivos de amniocitos, obtenidos de fetos con trisomía 21 y euploides, Zimmermann et al (2002 Clin Chem. 48, 362-363) pudo diferenciar los dos grupos de fetos basándose en el aumento de 1,5 veces en las secuencias de ADN del cromosoma 21 en el primero de ellos. Dado que una diferencia de 2 veces en la concentración del molde de ADN constituye una diferencia de un solo ciclo de umbral (Ct), la discriminación de una diferencia de 1,5 veces ha sido el límite de la PCR en tiempo real convencional. Para conseguir grados de discriminación cuantitativa más refinados, se requieren estrategias alternativas.
La PCR digital se ha desarrollado para la detección de la desviación de la razón alélica en muestras de ácidos nucleicos (Chang, HW et al. 2002 J Natl Cancer Inst. 94, 1697-1703). La PCR digital es una amplificación basada en técnicas de análisis de ácidos nucleicos que requiere la distribución de un espécimen que contenga ácidos nucleicos en una multitud de muestras distintas donde cada muestra contiene un promedio no mayor de aproximadamente una secuencia diana por muestra. Las dianas específicas de ácidos nucleicos se amplifican con cebadores específicos de secuencia para generar amplicones específicos por PCR digital. Los loci de ácidos nucleicos diana y las especies de o un panel de cebadores específicos de secuencia a incluir en las reacciones se determinan o se seleccionan antes del análisis de ácidos nucleicos.
Clínicamente, se ha demostrado que es útil para la detección de pérdida de heterocigosidad (LOH, Lost Of Heterozygosity) en muestras de ADN tumoral (Zhou, W. et al. 2002 Lancet 359, 219-225). Para el análisis de resultados de PCR digital, estudios previos han adoptado un ensayo de razón de probabilidad secuencial (SPRT, Sequential Probability Ratio Testing) para clasificar los resultados experimentales ya que sugieren la presencia de LOH en una muestra o no (El Karoui et al. 2006 Star Med 25, 3124 a 3133).
En métodos utilizados en los estudios previos, la cantidad de datos obtenidos de la PCR digital es muy pequeña. Por lo tanto, la precisión puede verse comprometida debido a la poca cantidad de puntos de datos y de fluctuaciones estadísticas típicas.
Por tanto, es deseable que los ensayos no invasivos tengan una alta sensibilidad y especificidad para minimizar negativos falsos y positivos falsos, respectivamente. Sin embargo, el ADN fetal está presente a una baja concentración absoluta y representa una pequeña parte de todas las secuencias de ADN en el plasma y suero materno. Por lo tanto, también es deseable tener métodos que permitan la detección no invasiva de aneuploidía cromosómica fetal maximizando la cantidad de información genética que podría deducirse de la cantidad limitada de ácidos nucleicos fetales que existe como una población más pequeña en una muestra biológica que contenga ácidos nucleicos maternos de fondo.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método implementado por ordenador de análisis de una muestra biológica que incluye moléculas de a Dn sin células que provienen de células no malignas y potencialmente de células tumorales asociadas con cáncer, comprendiendo el método: recibir etiquetas secuenciadas obtenidas de una secuenciación aleatorizada de moléculas de ADN contenidas en la muestra biológica, siendo la muestra biológica de plasma, suero, saliva u orina; alinear una pluralidad de las etiquetas secuenciadas a un genoma humano de referencia; determinar una primera cantidad de etiquetas secuenciadas como la alineación con una primera región cromosómica que es parte de un primer cromosoma; determinar una segunda cantidad de etiquetas secuenciadas identificadas como la alineación con una o más segundas regiones cromosómicas; determinar un primer parámetro a partir de la primera cantidad y de la segunda cantidad, en donde el parámetro incluye una proporción entre la primera cantidad y la segunda cantidad, en donde una anomalía en el primer parámetro para la primera región cromosómica se asocia con cáncer: y comparar el primer parámetro con uno o más valores umbrales para determinar una clasificación de si las primeras regiones cromosómica presentan una deleción y/o una amplificación asociada con el cáncer.
Puede obtenerse un mejor entendimiento de la naturaleza y ventajas de la presente invención con referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.
La FIG. 1 es un flujograma de un método 100 para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológica obtenida de una gestante de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 2 es un flujograma de un método 200 para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal usando secuenciación aleatoria de acuerdo con una realización de la presente invención. La FIG. 3 A muestra una representación gráfica del porcentaje de secuencias del cromosoma 21 en muestras de plasma materno que implican trisomía 21 o fetos euploides de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 3B muestra una correlación entre concentraciones de ADN fetal fraccional de plasma materno determinada por secuenciación masiva en paralelo y PCR digital de microfluidos de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 4A muestra una representación gráfica del porcentaje de secuencias alineadas por cromosoma de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 4B muestra una representación gráfica de diferencia (%) en porcentaje por cromosoma entre el caso de trisomía 21 y el caso euploide mostrado en la FIG. 4A.
La FIG. 5 muestra una correlación entre el grado de sobre-representación en secuencias del cromosoma 21 y las concentraciones de ADN fetal fraccional en plasma materno que implica fetos con trisomía 21 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 6 muestra una tabla de una parte del genoma humano que se analizó de acuerdo con una realización de la presente invención. T21 indica una muestra obtenida de una gestante que lleva un feto con trisomía 21.
La FIG. 7 muestra una tabla de diversas secuencias necesarias para diferenciar fetos euploides de trisomía 21 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 8A muestra una tabla de las diez primeras posiciones de partida de etiquetas secuenciadas alineadas con el cromosoma 21 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 8B muestra una tabla de las diez primeras posiciones de partida de etiquetas secuenciadas alineadas con el cromosoma 22 de acuerdo con una realización de la presente invención.
La FIG. 9 muestra un diagrama de bloque de un equipo informático a modo de ejemplo que puede usarse con el sistema y los métodos de acuerdo con realizaciones de la presente invención.
La expresión “muestra biológica”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra extraída de un sujeto {por ejemplo, un ser humano, tal como una gestante) y contiene una o más moléculas de ácido nucleico de interés.
La expresión “ácido nucleico" o “polinucleótido" se refiere a un ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) y a un polímero de los mismos en forma mono- o bicatenaria. Salvo que se limite específicamente, la expresión incluye ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. Salvo que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes conservativamente modificadas de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden conseguirse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de bases y/o desoxiinosina mixtos (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al, Mol Cell Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, ARN pequeño no codificante, micro ARN (miRNA), ARN de interacción con Piwi y ARN corto en horquilla (shRNA) codificado por un gen o locus.
El término “gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica. Este puede incluir regiones anteriores y posteriores a la región codificante (líder y remolque) así como a secuencias de intervención (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
El término “reacción", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proceso que implique una acción química, enzimática o física que sea indicativa de la presencia o ausencia de una secuencia de polinucleótidos de interés particular. Un ejemplo de una “reacción" es una reacción de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otro ejemplo de una “reacción" es una reacción de secuenciación, por síntesis o por ligamiento. Una “reacción informativa" es una que indica la presencia de una o más secuencias de polinucleótidos de interés particular, y en un caso en la que solo está presente una secuencia de interés. El término “bien" como se usa en el presente documento se refiere a una reacción en un lugar predeterminado dentro de una estructura confinada, por ejemplo, un vial, célula o cámara bien conformados en una matriz PCR.
La expresión “secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante", como se usa en el presente documento, puede referirse a una secuencia de polinucleótidos correspondiente a un segmento de una secuencia genómica más grande cuyo posible desequilibrio va a someterse a ensayo o a la propia secuencia genómica más grande. Un ejemplo es la secuencia del cromosoma 21. Otros ejemplos incluyen el cromosoma 18, 13, X e Y. Incluso otros ejemplos incluyen secuencias genéticas mutadas o polimorfismos genéticos o variaciones en el número de copias que un feto puede heredar de uno de sus padres o de ambos. Incluso otros ejemplos incluyen secuencias que están mutadas, delecionadas o amplificadas en un tumor maligno, por ejemplo, secuencias en las que se produce pérdida de heterocigosidad o duplicación génica. En algunas realizaciones, pueden usarse secuencias múltiples de ácido nucleico clínicamente relevantes, o marcadores equivalentemente múltiples de la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante para proporcionar datos para detectar el desequilibrio. Por ejemplo, pueden usarse datos de cinco secuencias no consecutivas en el cromosoma 21 de una manera aditiva para la determinación de un posible desequilibrio del cromosoma 21, reduciendo eficazmente la necesidad de que el volumen de la muestra sea de 1/5. La expresión “secuencia de ácido nucleico de fondo", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico cuya razón normal con respecto a la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante se conoce, por ejemplo, una razón de 1 a 1. Como un ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de fondo y la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante son dos alelos del mismo cromosoma que se diferencian debido a la heterocigosidad. En otro ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de fondo es un alelo que es heterocigoto con respecto a otro alelo que es la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante. Además, algo de cada una de la secuencia de ácido nucleico de fondo y la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante puede proceder de diferentes individuos.
La expresión “secuencia de ácido nucleico de referencia" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico cuya concentración promedio por reacción se conoce o se ha medido de manera equivalente.
La expresión “secuencia de ácido nucleico sobre-representada" como se usa en el presente documento se refiere a la secuencia de ácido nucleico entre dos secuencias de interés (por ejemplo una secuencia clínicamente relevante y una secuencia de fondo) que es más abundante que la otra secuencia en una muestra biológica.
La expresión “basándose en" como se usa en el presente documento significa “basándose al menos en parte en" y se refiere a un valor (o resultado) que se usa en la determinación de otro valor, tal como se produce en la relación de una entrada de un método y la salida de ese método. El término “deriva" como se usa en el presente documento también se refiere a la relación de una entrada de un método y la salida de ese método, tal como se produce cuando la derivación es el cálculo de una fórmula.
La expresión “datos cuantitativos" como se usa en el presente documento significa datos que se obtienen de una o más reacciones y que proporcionan uno o más valores numéricos. Por ejemplo, el número de pocillos que presenta un marcador fluorescente para una secuencia particular sería un dato cuantitativo.
El término “parámetro" como se usa en el presente documento significa un valor numérico que caracteriza un conjunto de datos cuantitativo y/o una relación numérica entre conjuntos de datos cuantitativos. Por ejemplo, un parámetro es una razón (o función de una razón) entre una primera cantidad de una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda cantidad de una segunda secuencia de ácido nucleico.
La expresión “valor de límite" como se usa en el presente documento significa un valor numérico cuyo valor se usa para arbitrar entre dos o más estados (por ejemplo, enfermo y no enfermo) de clasificación de una muestra biológica. Por ejemplo, si un parámetro es mayor que el valor de límite, se realiza una primera clasificación del dato cuantitativo (por ejemplo, estado enfermo); o si el parámetro es menor que el valor de límite, se realiza una clasificación diferente de los datos cuantitativos (por ejemplo, estado no enfermo).
La expresión “desequilibrio” como se usa en el presente documento significa cualquier desviación significativa definida por al menos un valor de límite en una cantidad de la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante de una cantidad de referencia. Por ejemplo, la cantidad de referencia podría ser una razón de 3/5 y por tanto podría producirse un desequilibrio si la razón medida es de 1:1.
La expresión “aneuploidía cromosómica”, como se usa en el presente documento, significa una variación en la cantidad cuantitativa de un cromosoma a partir de la de un genoma diploide. La variación puede ser una ganancia o una pérdida. Esto puede implicar todo un cromosoma o una región de un cromosoma.
La expresión “secuenciación aleatoria”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuenciación mediante la cual los fragmentos de ácido nucleico secuenciados no se han identificado o seleccionado específicamente antes del procedimiento de secuenciación. No se precisan cebadores específicos de secuencia para los locus de genes específicos diana. Los grupos de ácidos nucleicos secuenciados varían entre muestras e incluso entre análisis para la misma muestra. Las identidades de los ácidos nucleicos secuenciados solo se revelan a partir del resultado de secuenciación generado. En algunas realizaciones de la presente invención, la secuenciación aleatoria puede comenzar con procedimientos para enriquecer una muestra biológica con poblaciones particulares de moléculas de ácido nucleico que comparten determinadas características comunes. En una realización, cada uno de los fragmentos en la muestra biológica tiene una misma probabilidad de ser secuenciado. La expresión “fracción del genoma humano" o “parte del genoma humano" como se usa en el presente documento se refiere a menos del 100 % de las secuencias de nucleótidos en el genoma humano que comprenden unos 3 billones de pares de bases de nucleótidos. En el contexto de secuenciación, esto se refiere a menos de una cobertura de 1 vez de las secuencias de nucleótidos en el genoma humano. El término puede expresarse como un porcentaje o número absoluto de nucleótidos/pares de bases. Como un ejemplo de uso, el término puede usarse para hacer referencia a la cantidad real de secuenciación realizada. Las realizaciones pueden determinar el valor mínimo requerido para la fracción secuenciada del genoma humano para obtener un diagnóstico preciso. Como otro ejemplo de su uso, el término puede referirse a la cantidad de datos secuenciados usados para derivar un parámetro o cantidad para una clasificación de enfermedad.
La expresión “etiqueta secuenciada", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena de nucleótidos secuenciada desde cualquier parte o toda una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una etiqueta secuenciada puede ser una cadena corta de nucleótidos secuenciada a partir de un fragmento de ácido nucleico, una cadena corta de nucleótidos en ambos extremos de un fragmento de ácido nucleico, o la secuenciación de todo el fragmento de ácido nucleico que existe en la muestra biológica. Un fragmento de ácido nucleico es cualquier parte de una molécula de ácido nucleico más grande. Un fragmento (por ejemplo, un gen) puede existir independientemente (es decir, no conectado) con respecto a las otras partes de la molécula de ácido nucleico más grande.
Descripción detallada
Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos, sistemas y aparatos para determinar si existe un aumento o una disminución (estado enfermo) de una región cromosómica clínicamente relevante en comparación con un estado no enfermo. Esta determinación puede realizarse usando un parámetro de una cantidad de una región cromosómica clínicamente relevante en relación con otras regiones cromosómicas no clínicamente relevantes (regiones de fondo) dentro de una muestra biológica. Las moléculas de ácido nucleico de la muestra biológica se secuencian, de tal manera que una fracción del genoma se secuencia, y la cantidad se puede determinar a partir de los resultados de la secuenciación. Uno o más valores de límite se seleccionan para determinar si existe un cambio en comparación con una cantidad de referencia (por ejemplo un desequilibrio), por ejemplo, con respecto a la razón de cantidades de dos regiones (o conjuntos de regiones) cromosómicas
El cambio detectado en la cantidad de referencia puede ser cualquier desviación (positiva o negativa) en la relación de la secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante con las otras secuencias no clínicamente relevantes. Por lo tanto, el estado de referencia puede ser cualquier razón u otra cantidad (por ejemplo distinta de una correspondencia 1-1) y un estado medido que significa un cambio puede ser cualquier razón u otra cantidad que difiera de la cantidad de referencia determinada por uno o más valores de límite.
La región cromosómica clínicamente relevante (denominada también secuencia de ácido nucleico clínicamente relevante) y la secuencia de ácido nucleico de fondo pueden proceder de un primer tipo de células y de uno o más segundos tipos de células. Por ejemplo, en una muestra biológica, tal como plasma materno, están presentes secuencias de ácido nucleico fetal, originadas de células fetales/placentarias, que contiene un fondo de secuencias de ácido nucleico materno originado de células maternas. En una realización, el valor de límite se determina basándose al menos en parte en un porcentaje del primer tipo de células en una muestra biológica. Obsérvese que el porcentaje de secuencias fetales en una muestra puede determinarse mediante cualquier loci derivado del feto y no limitarse a medir las secuencias de ácido nucleico clínicamente relevantes. En otra realización, el valor de límite se determina, al menos en parte, sobre el porcentaje de secuencias tumorales en una muestra biológica, tal como plasma, suero, saliva u orina, que contiene un fondo de secuencias de ácido nucleico derivadas de células no malignas dentro del organismo.
I. MÉTODO GENERAL
La FIG. 1 es un diagrama de flujo de un método 100 para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra biológica obtenida de una gestante de acuerdo con una realización de la presente invención.
En la etapa 110, se recibe una muestra biológica de la gestante. La muestra biológica puede ser plasma, orina, suero, o cualquier otra muestra adecuada. La muestra contiene moléculas de ácido nucleico del feto y de la gestante. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico pueden ser fragmentos de cromosomas.
En la etapa 120, al menos una parte de una pluralidad de las moléculas de ácido nucleico contenida en la muestra biológica se secuencia. La parte secuenciada representa una fracción del genoma humano. En una realización, las moléculas de ácido nucleico son fragmentos de cromosomas respectivos. Puede secuenciarse un extremo (por ejemplo, 35 pares de bases (pb)), ambos extremos, o todo el fragmento. Puede secuenciarse todas las moléculas de ácido nucleico en la muestra o solo un subconjunto. Este subconjunto se puede seleccionar aleatoriamente, como se describirá más adelante con más detalle.
En una realización, la secuenciación se realiza usando secuenciación masiva en paralelo. La secuenciación masiva en paralelo, tal como la que puede obtenerse en la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), Illumina Analyzer Genome (o plataforma Solexa) o SOLiD System (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de ADN Helicos True Single Molecule (Harris TD et al. 2008 Science, 320, 106-109), la tecnología de molécula sencilla, en tiempo real (SMRT™) de Biosciences Pacific, y secuenciación por nanoporos (Soni GV y Meller A. 2007 Clin Chem 53: 1996-2001), permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácido nucleico aisladas de un espécimen a altos grados de formación de complejos múltiples de una manera paralela (Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003; 1: 397-416). Cada una de estas plataformas secuencian moléculas sencillas clonalmente expandidas o incluso no amplificadas de fragmentos de ácido nucleico.
Como a partir de cada muestra en cada proceso se genera un alto número de lecturas de secuenciación, en el orden de cientos de miles a millones, o incluso posiblemente, de cientos de millones o billones, las lecturas secuenciadas resultantes forman un perfil representativo de la mezcla de especies de ácido nucleico en el espécimen original. Por ejemplo, el haplotipo, trascriptoma y perfiles de mutilación de las lecturas secuenciadas se asemejan a las del espécimen original (Brenner et al Nat. Biotech 2000; 18: 630-634; Taylor et al Cancer Res. 2007; 67: 85118518). Debido al gran muestreo de secuencias de cada espécimen, el número de secuencias idénticas, tales como las generadas a partir de la secuenciación de un grupo de ácido nucleico a diversas veces de cobertura o alta redundancia, es también una buena representación cuantitativa del recuento de una especie de ácido nucleico particular o locus en la muestra original.
En la etapa 130, basándose en la secuenciación (por ejemplo, datos procedentes de la secuenciación), se determina una primera cantidad de un primer cromosoma (por ejemplo, el cromosoma clínicamente relevante). La primera cantidad se determina a partir de secuencias identificadas como originadas a partir del primer cromosoma. Por ejemplo, después puede utilizarse un procedimiento bioinformático para localizar cada una de estas secuencias de ADN en el genoma humano. Es posible que una proporción de dichas secuencias se descarte de un análisis posterior debido a que están presentes en las regiones repetidas del genoma humano, o en regiones sometidas a variaciones inter-individuales, por ejemplo, variaciones en el número de copias. Por tanto, puede determinarse una cantidad del cromosoma de interés y uno o más cromosomas distintos.
En la etapa 140, basándose en la secuenciación, se determina una segunda cantidad de uno o más segundos cromosomas a partir de secuencias identificadas como originadas a partir de uno de los segundos cromosomas. En una realización, los segundos cromosomas son todos los otros cromosomas además del primero (es decir, el sometido a ensayo). En otra realización, el segundo cromosoma es precisamente un solo cromosoma distinto.
Existen diversas maneras de determinar las cantidades de los cromosomas, incluyendo, pero sin limitación, recuento del número de etiquetas secuenciadas, del número de nucleótidos (pares de bases) secuenciados o las longitudes acumuladas de nucleótidos secuenciados (pares de bases) que se originan a partir de uno o más cromosomas o regiones cromosómicas particulares.
En otra realización, pueden imponerse normas sobre los resultados de la secuenciación para determinar los recuentos conseguidos. En un aspecto, puede obtenerse una cantidad basándose en una proporción del resultado secuenciado. Por ejemplo, después del análisis bioinformático, podría seleccionarse el resultado de secuenciación correspondiente a fragmentos de ácido nucleico de un intervalo de tamaño especificado. Son ejemplos de los intervalos de tamaño aproximadamente < 300 pb, < 200 pb o < 100 pb.
En la etapa 150, se determina un parámetro a partir de la primera y segunda cantidad. El parámetro puede ser, por ejemplo, una simple razón de la primera cantidad con respecto a la segunda cantidad, o de la primera cantidad con respecto a la segunda cantidad más la primera cantidad. En un aspecto, cada cantidad podría ser un argumento con respecto a una función o funciones distintas, en el que después una razón puede sustraerse de estas funciones distintas. Un experto en la técnica apreciará el número de diferentes parámetros adecuados.
En una realización, un parámetro (por ejemplo, una representación fraccional) de un cromosoma posiblemente implicado en una aneuploidía cromosómica, por ejemplo, cromosoma 21 o cromosoma 18 o cromosoma 13, puede después calcularse a partir de los resultados del procedimiento bioinformático. La representación fraccional puede obtenerse basándose en una cantidad de todas las secuencias (por ejemplo, alguna medición de todos los cromosomas incluyendo el cromosoma clínicamente relevante) o un subconjunto particular de cromosomas (por ejemplo, precisamente el otro cromosoma sometido a ensayo).
En la etapa 150, el parámetro se compara con uno o más valores de límite. Los valores de límite pueden determinarse a partir de cualquiera de las diversas formas adecuadas. Dichas formas incluyen el método de probabilidad Bayesiano, el ensayo de razón de probabilidad secuencial (SPRT), el descubrimiento de falsos, el intervalo de confianza, las características operativas receptoras (ROC).
En una realización, el parámetro (por ejemplo, la representación fraccional del cromosoma clínicamente relevante) se compara después con un intervalo de referencia establecido en gestantes que llevan fetos normales (es decir, euploides). Es posible que, en algunas variantes del procedimiento, el intervalo de referencia (es decir, los valores de límite) se ajusten de acuerdo con la concentración fraccional del ADN fetal (f) en una muestra de plasma materno particular. El valor de f puede determinarse a partir del conjunto de datos de secuenciación, utilizando, por ejemplo, secuencias mapeables con respecto al cromosoma Y si el feto es de sexo masculino. El valor de f también puede determinarse en un análisis distinto, utilizando, por ejemplo, marcadores epigenéticos fetales (Chan KCA et al 2006 Clin Chem. 52, 2211-8) o a partir de análisis de polimorfismos mononucleotídicos.
En la etapa 160, basándose en la comparación, se determina una clasificación de si existe una aneuploidía cromosómica fetal para el primer cromosoma. En una realización, la clasificación es un sí o no definitivo. En otra realización, una clasificación puede ser no clasificable o dudosa. En otra realización, la clasificación puede ser una puntuación que debe interpretar, por ejemplo, un médico, a última instancia.
ll SECUENCIACIÓN, ALINEAMIENTO Y CANTIDADES DE DETERMINACIÓN
Como se ha mencionado anteriormente, solo se secuencia una fracción del genoma. En un aspecto, incluso cuando se secuencia un grupo de ácidos nucleicos en un espécimen a < 100 % de cobertura genómica en lugar de a diversas veces de cobertura, y entre la proporción de moléculas de ácido nucleico capturadas, la mayoría de cada especie de ácido nucleico solo se secuencia una vez. Además, el desequilibrio de dosificación de un cromosoma o regiones cromosómicas particulares puede determinarse cuantitativamente. En otras palabras, el desequilibrio de dosificación del cromosoma o de las regiones cromosómicas se deduce del porcentaje de representación de dicho locus entre otras etiquetas mapeables secuenciadas del espécimen.
Esto discrepa de situaciones en las que el mismo grupo de ácidos nucleicos se secuencia varias veces para conseguir alta redundancia o diversas veces de cobertura mediante lo cual cada especie de ácido nucleico se secuencia varias veces En dichas situaciones, el número de veces que una especie de ácido nucleico particular se ha secuenciado con respecto al de otra especie de ácido nucleico se correlaciona con concentraciones relativas en la muestra original. El coste de secuenciación aumenta con el número de veces de cobertura necesarios para conseguir una representación exacta de la especie de ácido nucleico.
En un ejemplo, una proporción de dichas secuencias sería a partir del cromosoma implicado en una aneuploidía tal como el cromosoma 21 en este ejemplo ilustrativo. Incluso otras secuencias a partir de dicho ejercicio de secuenciación derivarían de otros cromosomas. Teniendo en cuenta el tamaño relativo del cromosoma 21 en comparación con otros cromosomas, podría obtenerse una frecuencia normalizada, dentro de un intervalo de referencia, de secuencias específicas del cromosoma 21 a partir de dicho ejercicio de secuenciación. Si el feto tiene trisomía 21, entonces la frecuencia normalizada de las secuencias derivadas del cromosoma 21, a partir de dicho ejercicio de secuenciación, aumentará, permitiendo por tanto la detección de la trisomía 21. El grado de cambio en la frecuencia normalizada dependerá de la concentración fraccional de los ácidos nucleicos fetales en la muestra analizada.
En una realización, se utilizó el Illumina Genome Analyzer para secuenciar un solo extremo de ADN genómico humano y muestras de ADN de plasma humano. Las secuencias del Illumina Genome Analyzer expanden clonalmente moléculas de ADN sencillas capturadas en una superficie sólida denominada célula de flujo. Cada célula de flujo tiene 8 carriles para la secuenciación de 8 especímenes individuales o conjunto de especímenes. Cada carril puede generar ~ 200 Mb de secuencias que es solo una fracción de los 3 billones de pares de bases de secuencias en el genoma humano. Cada muestra de ADN genómico o ADN plasmático se secuenció usando un carril de una célula de flujo. Las etiquetas de secuencias cortas generadas se alinearon con la secuencia del genoma de referencia humano y se anotó el origen cromosómico. El número total de etiquetas secuenciadas individuales alineadas con cada cromosoma se tabuló y se comparó con el tamaño relativo de cada cromosoma como se espera a partir del genoma humano de referencia o especímenes representativos sin enfermedad. Después, se identificaron las ganancias o pérdidas cromosómicas.
La estrategia descrita es solo un ejemplo de la estrategia de dosificación de gen/cromosoma descrita en el presente documento. Como alternativa, podría realizarse secuenciación de extremos emparejados. En lugar de comparar la longitud de los fragmentos secuenciados a partir de lo esperado en el genoma de referencia, como describen Campbell et al (Nat. Genet 2008; 40: 722-729), se contó el número de etiquetas secuenciadas alineadas y se clasificó de acuerdo con la localización cromosómica. Las ganancias o pérdidas de regiones cromosómicas o cromosomas completos se determinaron comparando los recuentos de etiquetas con el tamaño de cromosoma esperado en el genoma de referencia o con el de un espécimen representativo sin enfermedad. Como la secuenciación de extremos emparejados solo permite deducir el tamaño del fragmento de ácido nucleico original, un ejemplo es enfocarse en el recuento del número de etiquetas secuenciadas emparejadas correspondientes a los fragmentos de ácido nucleico de un tamaño específico, tal como < 300 pb, < 200 pb o < 100 pb.
En otra realización, la fracción del conjunto de ácido nucleico que se secuencia en un proceso se sub-selecciona adicionalmente antes de la secuenciación. Por ejemplo, podrían utilizarse técnicas basadas en hibridación, tales como, matriz de oligonucleótidos, para subseleccionar primero secuencias de ácido nucleico de determinados cromosomas, por ejemplo, un cromosoma posiblemente aneuploide y otro cromosoma (o cromosomas) no implicados en la aneuploidía ensayada. Otro ejemplo es que una determinada subpoblación de secuencias de ácido nucleico del conjunto de muestras se subseleccione o se enriquezca antes de la secuenciación. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, se ha publicado que las moléculas de ADN fetal en plasma materno comprenden fragmentos más cortos que las moléculas de ADN de fondo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). Por tanto, para fraccionar las secuencias de ácido nucleico en la muestra de acuerdo con el tamaño molecular, pueden usarse uno o más métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por electroforesis en gel o columnas de exclusión por tamaño o estrategias basadas en microfluidos. Incluso, como alternativa, en el ejemplo de analizar ADN fetal libre en plasma materno, la parte de ácido nucleico fetal podría enriquecerse mediante un método que suprima el fondo materno, tal como mediante la adición de formaldehído (Dhallan et al JAMA 2004; 291: 1114-9). En una realización, una parte o subconjunto del grupo de ácido nucleico preseleccionado se secuencia aleatoriamente.
En la presente solicitud podrían utilizarse, de manera similar, otras estrategias de secuenciación de moléculas sencillas, tales como la plataforma 454 de Roche, la plataforma SOLID de Applied Biosystems, la tecnología de secuenciación de ADN de Helicos True Single Molecule, la tecnología de molécula sencilla, en tiempo real (SMRT™) de Biosciences Pacific, y la secuenciación por nanoporos.
III. DETERMINACIÓN DE CANTIDADES DE CROMOSOMAS A PARTIR DE RESULTADOS DE SECUENCIACIÓN Después de una secuenciación masiva en paralelo, se realizó un análisis bioinformático para localizar el origen cromosómico de las etiquetas secuenciadas. Después de este procedimiento, las etiquetas identificadas como originadas a partir del cromosoma posiblemente aneuploide, es decir, el cromosoma 21 en este estudio, se compararon cuantitativamente con todas las etiquetas secuenciadas o con etiquetas que se originaban a partir de uno o más cromosomas no implicados en la aneuploidía. La relación entre el resultado de la secuenciación del cromosoma 21 y otros cromosomas que no son el cromosoma 21, para un espécimen de ensayo, se comparó con valores de límite deducidos con los métodos descritos en la sección anterior, para determinar si el espécimen se obtuvo de una gestante portadora de un feto euploide o con trisomía 21.
Diversas cantidades diferentes que incluyen, pero sin limitación, lo siguiente podrían deducirse de las etiquetas secuenciadas. Por ejemplo, las diversas etiquetas secuenciadas, es decir, recuento absoluto, alineadas con un cromosoma particular podría compararse con el recuento absoluto de etiquetas secuenciadas alineadas con otros cromosomas. Como alternativa, el recuento fraccional de la cantidad de etiquetas secuenciadas del cromosoma 21 con referencia a todas o algunas otras etiquetas secuenciadas podría compararse con la de uno o más cromosomas no aneuploides. En el presente experimento, dado que se secuenciaron 36 pb de cada fragmento de ADN, el número de nucleótidos secuenciado a partir de un cromosoma particular podría deducirse fácilmente de 36 pb multiplicado por el recuento de etiquetas secuenciadas.
Adicionalmente, cada espécimen de plasma materno se secuenció únicamente usando una célula de flujo que solo podría secuenciar una fracción del genoma humano, por estadística, la mayoría de especies de fragmento de ADN plasmático materno podrían solamente haberse secuenciado para generar un recuento de etiqueta secuenciada. En otras palabras, los fragmentos de ácido nucleico presentes en el espécimen de plasma materno se secuenciaron menos de 1 vez de cobertura. Por tanto, el número total de nucleótidos secuenciados para cualquier cromosoma particular correspondería principalmente a la cantidad, proporción o longitud de la parte de dicho cromosoma que se ha secuenciado. Así pues, la determinación cuantitativa de la representación del cromosoma posiblemente aneuploide podría derivar de una fracción del número o longitud equivalente de nucleótidos secuenciados de ese cromosoma con referencia a una cantidad derivada de manera similar de otros cromosomas.
IV. ENRIQUECIMIENTO CON GRUPOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA SECUENCIACIÓN
Como anteriormente se ha mencionado y establecido en la siguiente sección de ejemplos, solo se necesita secuenciar una parte del genoma humano para diferenciar casos de trisomía 21 de euploides. Por tanto, sería posible y rentable enriquecer el grupo de ácidos nucleicos a secuenciar antes de la secuenciación aleatoria de una fracción del grupo enriquecido. Por ejemplo, las moléculas de ADN fetales en el plasma materno comprenden fragmentos más cortos que las moléculas de ADN de fondo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). Por lo tanto, para fraccionar las secuencias de ácido nucleico en la muestra de acuerdo con el tamaño de la molécula, pueden usarse uno o más métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante estrategias de electroforesis en gel o columnas de exclusión por tamaño o basadas en microfluidos.
Incluso, como alternativa, en el ejemplo de analizar ADN fetal libre en plasma materno, la parte de ácido nucleico fetal podría enriquecerse mediante un método que suprima el fondo materno, tal como por la adición de formaldehído (Dhallan et al JAMA 2004; 291: 1114-9). La proporción de secuencias derivadas fetales podría enriquecerse en el grupo de ácido nucleico comprendido por fragmentos más cortos. De acuerdo con la FIG. 7, el número de etiquetas secuenciadas necesario para diferenciar casos euploides de trisomía 21 podría reducirse a medida que aumenta la concentración de ADN fetal fraccional.
Como alternativa, secuencias originadas a partir de un cromosoma posiblemente aneuploide y uno o más cromosomas no implicados en la aneuploidía podrían enriquecerse mediante técnicas de hibridación, por ejemplo, sobre micromatrices de oligonucleótidos. Los grupos de ácidos nucleicos enriquecidos podrían después someterse a secuenciación aleatoria. Esto permitiría reducir costes de secuenciación.
V. SECUENCIACIÓN ALEATORIA
La FIG. 2 es un flujograma de un método 200 para realizar el diagnóstico prenatal de una aneuploidía cromosómica fetal usando secuenciación aleatoria de acuerdo con una realización de la presente invención. En un aspecto para la estrategia de secuenciación masiva en paralelo, pueden generarse datos representativos de todos los cromosomas al mismo tiempo. El origen de un fragmento particular no se selecciona con antelación. La secuenciación se realiza aleatoriamente y después puede realizarse una búsqueda en la base de datos para ver cuando se origina un fragmento particular. Esto difiere de situaciones en las que se amplifica un fragmento específico del cromosoma 21 y otro del cromosoma 1.
En la etapa 210, se recibe una muestra biológica de una gestante. En la etapa 220, el número N de secuencias a analizar se calcula para una precisión deseada. En una realización, primero se identifica un porcentaje de ADN fetal en la muestra biológica. Esto puede realizarse mediante cualquier medio adecuado bien conocido por un experto en la técnica. La identificación puede ser simplemente la lectura de un valor que se mide mediante otra entidad. En esta realización, el cálculo del número N de secuencias a analizar se basa en el porcentaje. Por ejemplo, el número de secuencias necesario para analizar podría aumentarse cuando el porcentaje de ADN fetal disminuye, y podría disminuir cuando el ADN fetal aumenta. El número N puede ser un número fijo o un número relativo, tal como un porcentaje. En otra realización, podría secuenciarse un número N que se sabe que es adecuado para un diagnóstico de enfermedad preciso. El número N podría ser constante incluso en gestantes con concentraciones de ADN fetal que están en el límite inferior del intervalo normal.
En la etapa 230, al menos N de una pluralidad de las moléculas de ácido nucleico contenidas en la muestra biológica se secuencian aleatoriamente. Una característica de esta estrategia descrita es que los ácidos nucleicos a secuenciar no se identifican o seleccionan específicamente antes del análisis de la muestra, es decir, secuenciación. Para la secuenciación, no se requieren cebadores específicos de secuencia para dirigir loci génicos específicos. Los conjuntos de ácidos nucleicos secuenciados varían de una muestra a otra e incluso de un análisis a otro para la misma muestra. Además, a partir de las descripciones indicadas a continuación (FIG. 6) la cantidad de resultados de secuenciación necesaria para el diagnóstico de casos podría variar entre los especímenes sometidos a ensayo y la población de referencia. Estos aspectos difieren notablemente con la mayoría de las estrategias de diagnóstico molecular, tales como las basadas en hibridación in situ por fluorescencia, PCR de fluorescencia cuantitativa, PCR cuantitativa en tiempo real, PCR digital, hibridación genómica comparativa, hibridación genómica comparativa de micromatriz, etc., en las que el loci génico a dirigir requiere determinación previa, siendo por tanto necesario el uso de conjuntos de cebadores o sondas específicos de locus o paneles de los mismos.
En una realización, la secuenciación aleatoria se realiza en fragmentos de ADN que están presentes en el plasma de una gestante, y se obtienen secuencias genómicas que originalmente podrían provenir del feto o de la madre. La secuenciación aleatoria implica el muestreo (secuenciación) de una parte aleatoria de las moléculas de ácido nucleico presentes en la muestra biológica. Como la secuenciación es aleatoria, en cada análisis puede secuenciarse un subconjunto (fracción) diferente de las moléculas de ácido nucleico (y por tanto el genoma). Las realizaciones se llevarán a cabo incluso cuando este subconjunto varíe de una muestra a otra y de un análisis a otro, lo que puede producirse incluso usando la misma muestra. Ejemplos de la fracción son aproximadamente el 0,1 %, 0. 5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 20 % o 30 % del genoma. En otras realizaciones, la fracción es al menos uno cualquiera de estos valores.
Las etapas 240-270 restantes pueden continuar de una manera similar al método 100.
VI. SELECCIÓN POST-SECUENCIACIÓN DE GRUPOS DE ETIQUETAS SECUENCIADAS
Como se describe en los siguientes ejemplos II y III, un subconjunto de los datos secuenciados es suficiente para diferenciar los casos de trisomía 21 de casos euploides. El subconjunto de datos secuenciados podría ser la proporción de etiquetas secuenciadas que pasan determinados parámetros de calidad. Por ejemplo, en el ejemplo II, se utilizaron las etiquetas secuenciadas que están únicamente alineadas con el genoma humano de referencia oculto con repetición. Como alternativa, se puede secuenciar un grupo representativo de fragmentos de ácido nucleico de todos los cromosomas pero centrándose en la comparación entre datos relevantes con el cromosoma posiblemente aneuploide y datos relevantes con un número de cromosomas no aneuploides.
Incluso, como alternativa, durante el análisis post-secuenciación, podría sub-seleccionarse un subconjunto de los resultados de secuenciación que incluye etiquetas secuenciadas generadas de los fragmentos de ácido nucleico correspondientes a una ventana de tamaño específico en el espécimen original. Por ejemplo, usando el Illumina Genome Analyzer, podría usarse secuenciación de extremos emparejados que se refiere a la secuenciación de dos extremos de fragmentos de ácidos nucleico. Los datos secuenciados de cada extremo emparejado se alinean después con la secuencia genómica humana de referencia. Después, podría deducirse la distancia o el número de nucleótidos que se extiende entre los dos extremos. La longitud completa del fragmento de ácido nucleico original también podría deducirse. Como alternativa, las plataformas de secuenciación, tales como la plataforma 454 y posiblemente algunas de las técnicas de secuenciación de una molécula sencilla, pueden secuenciar la longitud completa de fragmentos cortos de ácidos nucleicos, por ejemplo de 200 pb. De esta manera, la longitud real del fragmento de ácido nucleico se sabría de un modo inmediato a partir de los datos secuenciados.
Dicho análisis de extremos emparejados también es posible usando otras plataformas de secuenciación, por ejemplo, el sistema de Applied Biosystems SOLiD. Para la plataforma 454 de Roche, debido a su longitud de lectura aumentada en comparación con otros sistemas de secuenciación masiva en paralelo, también es posible determinar la longitud de un fragmento a partir de su secuencia completa.
La ventaja de enfocar los análisis de datos sobre el subconjunto de etiquetas secuenciadas corresponde a fragmentos de ácido nucleico cortos en el espécimen de plasma materno original debido a que el subconjunto de datos podría enriquecerse eficazmente con secuencias de ADN derivadas del feto. Esto es porque las moléculas de ADN fetal en el plasma materno comprenden fragmentos más cortos que las moléculas de ADN de fondo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). De acuerdo con la FIG. 7, el número de etiquetas secuenciadas necesario para diferenciar casos euploides de trisomía 21 se reduciría a medida que aumenta la concentración de ADN fetal fraccional.
La selección post-secuenciación de subconjuntos de grupos de ácido nucleico es diferente de otras estrategias de enriquecimiento de ácidos nucleicos que se realizan antes del análisis de especímenes, tales como el uso de electroforesis en gel o columnas de exclusión por tamaño para la selección de ácidos nucleicos de tamaños particulares, que requieren la separación física del grupo enriquecido del grupo de ácidos nucleicos de fondo. Los procedimientos físicos introducirían más etapas experimentales y pueden ser propensos a problemas tales como contaminación. La selección post-secuenciación por ordenador de subconjuntos de resultados de secuenciación permitiría también variar la selección dependiendo de la sensibilidad y especificidad requerida para la determinación de la enfermedad.
Las estrategias bioinformáticas, informatizadas y estadísticas usadas para determinar si se obtiene un espécimen de plasma materno de una gestante que concibe un feto con trisomía 21 o euploide podrían recopilarse en un producto de programa informatizado usado para determinar parámetros de resultados de secuenciación. El funcionamiento del programa informático implicaría la determinación de una cantidad cuantitativa a partir del cromosoma posiblemente aneuploide así como una o más cantidades de uno o más del resto de cromosomas. Un parámetro podría determinarse y compararse con valores de límite apropiados para determinar si existe una aneuploidía cromosómica fetal para el cromosoma posiblemente aneuploide.
Ejemplos
Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
1. DIAGNÓSTICO PRENATAL DE TRISOMIA 21 FETAL
En este estudio participaron ocho gestantes. Todas las gestantes estaban en el 1er o en el 2° trimestre de gestación y con un embarazo de feto único. Cuatro de ellas gestaban un feto con trisomía 21 y las otras cuatro gestaban un feto euploide. Se extrajeron veinte mililitros de sangre venosa periférica de cada mujer. El plasma materno se recogió después de centrifugar a 1600 x g durante 10 minutos y se centrifugó adicionalmente a 16000 x g durante 10 minutos. Después, se extrajo ADN de 5-10 ml de cada muestra plasmática. Después, el ADN plasmático materno se usó para secuenciación masiva en paralelo mediante el Analyzer Illumina Genome de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los técnicos que realizaban la secuenciación desconocían los diagnósticos fetales durante los análisis de secuenciación y datos de secuencias.
En resumen, se usaron aproximadamente 50 ng de ADN plasmático materno para preparar una biblioteca de ADN. Es posible comenzar con menores cantidades, tales como 15 ng o 10 ng de a Dn plasmático materno. Los fragmentos de ADN plasmático materno se enromaron, se ligaron a adaptadores Solexa y se seleccionaron fragmentos de 150-300 pb por purificación en gel. Como alternativa, los fragmentos de ADN plasmático materno enromados y ligados a adaptadores podrían pasarse a través de columnas (por ejemplo AMPure, Agencourt) para eliminar adaptadores no ligados sin selección por tamaño antes de la generación de grupos. El ADN ligado a adaptador se hibridó a la superficie de células de flujo y se generaron grupos de ADN usando la estación de grupos Illumina, seguido de 36 ciclos de secuenciación en el Analyzer Illumina Genome. El ADN de cada espécimen de plasma materno se secuenció por una célula de flujo. Las lecturas secuenciadas se compilaron usando Solexa Analysis Pipeline. Después, todas las lecturas se alinearon con la secuencia genómica humana de referencia oculta con repeticón, ensamblaje NCBI 36 (números de entrada a GenBank: NC_000001 a NC_000024), usando la aplicación Eland.
En este estudio, para reducir la complejidad de los análisis de los datos, solo se consideraron secuencias adicionales que se habían mapeado en una sola localización en la referencia del genoma humano oculto con repetición. Como alternativa, podrían usarse otros subconjuntos, o todo el conjunto, de, los datos secuenciados. Se contó el número total de secuencias únicamente mapeables para cada espécimen. El número de secuencias únicamente alineadas con el cromosoma 21 se expresó como una proporción con respecto al recuento total de secuencias alineadas para cada espécimen. Como el plasma materno contiene ADN fetal entre un fondo de ADN de origen materno, el feto con trisomía 21 contribuiría a originar etiquetas extra secuenciadas del cromosoma 21 debido a la presencia de una copia extra del cromosoma 21 en el genoma fetal. Por tanto, el porcentaje de secuencias de cromosoma 21 en el plasma materno de una gestante portadora de un feto con trisomía 21 sería ser mayor que el de una gestante con un feto euploide. El análisis no requiere la selección de secuencias específicas de feto. Tampoco requiere la separación física previa de ácidos nucleicos fetales de maternos. Tampoco requiere la necesidad de diferenciar o identificar secuencias fetales de maternas después de la secuenciación.
La FIG. 3A muestra el porcentaje de secuencias mapeadas en el cromosoma 21 (porcentaje de representación del cromosoma 21) para cada una de las 8 muestras de ADN de plasma materno. El porcentaje de representación del cromosoma 21 fue significativamente superior en el plasma materno de embarazos con trisomía 21 que en el de embarazos euploides. Estos datos sugieren que podría conseguirse un diagnóstico prenatal no invasivo de aneuploidía fetal determinando el porcentaje de representación del cromosoma aneuploide en comparación con el de una población de referencia. Como alternativa, la sobre-representación del cromosoma 21 podría detectarse comparando el porcentaje de representación del cromosoma 21 obtenido experimentalmente con el porcentaje de representación de las secuencias de cromosoma 21 esperadas para un genoma humano euploide. Esto podría realizarse ocultando o no las regiones repetidas en el genoma humano.
Cinco de las ocho gestantes eran portadoras de un feto de sexo masculino. Las secuencias mapeadas en el cromosoma Y serían específicas de feto. El porcentaje de secuencias mapeadas en el cromosoma Y se usó para calcular la concentración de ADN fetal fraccional en el espécimen de plasma materno original. Además, la concentración de ADN fetal fraccional también se determinó usando PCR digital de microfluidos que implica los genes parálogos de proteínas de dedos de cinc, asociados al cromosoma X (ZFX) y al cromosoma Y (ZFY).
La FIG.3B muestra la correlación de las concentraciones de ADN fetal fraccional deducida por el porcentaje de representación del cromosoma Y por secuenciación y determinada por PCR digital de microfluidos para ZFY/ZFX. Hubo una correlación positiva entre las concentraciones de ADN fetal fraccional en el plasma materno determinada por estos dos métodos. El coeficiente de correlación (r) fue de 0,917 en el análisis de correlación de Pearson.
En la FIG. 4A se muestran los porcentajes de secuencias de ADN plasmático materno alineados con cada uno de los 24 cromosomas (22 autosomas y cromosomas X e Y) para dos casos representativos. Una gestante portaba un feto con trisomía 21 y la otra un feto euploide. El porcentaje de representación de las secuencias mapeadas en el cromosoma 21 es mayor en la gestante portadora de un feto con trisomía 21 cuando se compara con el de la gestante portadora de un feto normal.
Las diferencias (%) del porcentaje de representación por cromosoma entre los especímenes de ADN de plasma materno de los dos casos anteriores se muestran en la FIG. 4B. El porcentaje de diferencia para un cromosoma particular se calcula usando la siguiente fórmula:
Porcentaje de diferencia (%) = (P21 - Pe)/Pe x 100 %,
donde
P21 = porcentaje de secuencias de ADN plasmático alineado con el cromosoma particular en la gestante portadora de un feto con trisomía 21 y;
Pe = porcentaje de secuencias de ADN plasmático alineado con el cromosoma particular en la gestante portadora de un feto euploide.
Como se muestra en la FIGURA 4B, hay una sobre-representación de secuencias de cromosoma 21 del 11 % en el plasma de la gestante portadora de un feto con trisomía 21 cuando se compara con la gestante portadora en un feto euploide. Para las secuencias alineadas con otros cromosomas, las diferencias entre los dos casos estaban dentro de 5 %. Como el porcentaje de representación para el cromosoma 21 está aumentado en la trisomía 21 en comparación con las muestras de plasma materno euploides, la diferencia (%) podría referirse alternativamente al grado de sobre-representación en las secuencias del cromosoma 21. Además de las diferencias (%) y diferencias absolutas entre la representación del porcentaje de cromosoma 21, también podrían calcularse razones de los recuentos procedentes de muestras de ensayo y de referencia y serían indicativas del grado de sobrerepresentación del cromosoma 21 en trisomía 21 en comparación con muestras euploides.
Para las cuatro mujeres gestantes, cada una de ellas portadora de un feto euploide, se alineó una media de 1,345 % de sus secuencias de ADN plasmático con el cromosoma 21. En las cuatro gestantes portadoras de un feto con trisomía 21, tres de sus fetos eran de sexo masculino. El porcentaje de representación del cromosoma 21 se calculó para cada uno de estos tres casos. La diferencia (%) en el porcentaje de representación del cromosoma 21 para cada uno de estos tres casos de trisomía 21 del porcentaje de representación medio del cromosoma 21 derivado de valores de los cuatro casos euploides se determinó como se ha descrito anteriormente. En otras palabras, la media de los cuatro casos portadores de un feto euploide se usó como la referencia en este cálculo. Las concentraciones de ADN fetal fraccional de estos tres casos de fetos de sexo masculino con trisomía 21 se dedujeron de su porcentaje de representación respectivo de secuencias del cromosoma Y.
En la FIG. 5 se muestra la correlación entre el grado de sobre-representación para secuencias del cromosoma 21 y las concentraciones de ADN fetal fraccional. Hubo una correlación positiva significativa entre los dos parámetros. El coeficiente de correlación (r) fue de 0,898 en el análisis de correlación de Pearson. Estos resultados indican que el grado de sobre-representación de secuencias del cromosoma 21 en plasma materno está relacionado con la concentración de ADN fetal fraccional en la muestra de plasma materno. Por lo tanto, para identificar embarazos que conlleven fetos con trisomía 21, podrían determinarse los valores de límite en el grado de sobre-representación relevante para secuencias del cromosoma 21 con las concentraciones de ADN fetal fraccional.
La determinación de la concentración de ADN fetal fraccional en plasma materno también puede realizarse de manera distinta al proceso de secuenciación. Por ejemplo, la concentración de ADN del cromosoma Y podría predeterminarse usando PCR en tiempo real, PCR de microfluidos o espectrometría de masas. Por ejemplo, en la FIG. 3B se ha demostrado que hay buena correlación entre las concentraciones de ADN fetal estimadas basándose en el recuento de cromosoma Y generado durante el proceso de secuenciación y la razón ZFY/ZFX generada externa al proceso de secuenciación. De hecho, la concentración de ADN fetal podría determinarse usando loci distintos del cromosoma Y y aplicables a fetos de sexo femenino. Por ejemplo, Chan et al mostraron que las secuencias FASSF1A metiladas derivadas de feto se detectarían en el plasma de gestantes en el fondo de secuencias FASSF1A no metiladas derivadas de la madre (Chan et al, Clin Chem 2006; 52:2211-8). La concentración de ADN fetal fraccional puede por tanto determinarse dividiendo la cantidad de secuencias FASSF1A metiladas entre la cantidad de secuencias FASSF1A totales (metiladas y no metiladas).
Se espera que el plasma materno se prefiera sobre el suero materno para la realización práctica de la invención ya que el ADN se libera de células sanguíneas maternas durante la coagulación sanguínea. Por tanto, si se usa suero, se espera que la concentración de ADN fetal fraccional será más baja en plasma materno que en suero materno. En otras palabras, si se usa suero materno, se espera que se necesitan más secuencias para generar un diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal, cuando se compara con una muestra de plasma obtenida al mismo tiempo de la misma gestante.
Incluso otra forma alternativa de determinar la concentración de ADN fetal fraccional sería a través de la cuantificación de diferencias polimórficas entre la gestante y el feto (Dhallan R, et al. 2007 Lancet, 369, 474-481). Un ejemplo de este método sería dirigirse a sitios polimórficos en los que la gestante es homocigota y el feto es heterocigoto. La cantidad de alelo específico de feto puede compararse con la cantidad de alelo común para determinar la concentración del ADN fetal fraccional.
A diferencia de las técnicas existentes para detectar aberraciones cromosómicas, incluyendo hibridación genómica comparativa, hibridación genómica comparativa por micromatriz, reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real, que detectan y cuantifican una o más secuencias específicas, la secuenciación masiva en paralelo no depende de la detección o análisis de secuencias predeterminadas o de un conjunto predefinido de secuencias de ADN. Se secuencia una fracción representativa aleatoria de moléculas de ADN del conjunto del espécimen. El número de etiquetas secuenciadas diferentes alineadas con diversas regiones cromosómicas se compara entre especímenes que contienen o no la especie de ADN de interés. Se manifestarían aberraciones cromosómicas por diferencias en el número (o porcentaje) de secuencias alineadas con cualquier región cromosómica determinada en los especímenes.
En otro ejemplo, la técnica de secuenciación en ADN libre en plasma puede usarse para detectar las aberraciones cromosómicas en el ADN plasmático para la detección de un cáncer específico. Diferentes cánceres tienen un grupo de aberraciones cromosómicas típicas. Pueden usarse cambios (amplificaciones y deleciones) en regiones cromosómicas múltiples. Por tanto, habría una proporción aumentada de secuencias alineadas con las regiones amplificadas y una proporción disminuida de secuencias alineadas con regiones disminuidas. El porcentaje de representación por cromosoma podría compararse con el tamaño de cada cromosoma correspondiente en un genoma de referencia expresado como porcentaje de representación genómica de cualquier cromosoma determinado en relación con el genoma completo. También pueden usarse comparaciones directas o comparaciones con un cromosoma de referencia.
II. SECUENCIACIÓN EXCLUSIVA DE UNA FRACCIÓN DEL GENOMA HUMANO
En el experimento descrito en el Ejemplo I anterior, el ADN plasmático materno de cada espécimen individual se secuenció usando solo una célula de flujo. El número de etiquetas secuenciales generadas de cada uno de los especímenes ensayados por el proceso de secuenciación se muestra en la FIG.6. T21 indica una muestra obtenida de una gestante portadora de un feto con trisomía 21.
Como se secuenciaron 36 pb de cada una de los fragmentos de ADN plasmático materno, el número de nucleótidos/pares de bases secuenciado de cada espécimen podría determinarse por 36 pb multiplicado por el recuento de etiquetas secuenciadas y también se muestra en la FIG. 6. Dado que en el genoma humano hay aproximadamente 3 billones de pares de bases, la cantidad de datos de secuenciación generada de cada espécimen plasmático materno representa solo una fracción, que varía del 10 % al 13 %.
Adicionalmente, en este estudio, solo se usaron las etiquetas únicamente secuenciadas mapeables, denominadas U0 en la nomenclatura del programa informático Eland, para demostrar la presencia de la sobre-representación en la cantidad de las secuencias de cromosoma 21 en los especímenes de plasma materno de gestantes que portaban cada una un feto con trisomía 21, como se describe en el ejemplo I anterior. Como se muestra en la FIG. 6, las secuencias U0 solo representan un subconjunto de todas las etiquetas secuenciadas generadas de cada espécimen y adicionalmente representan una proporción homogénea más pequeña, sobre el 2 %, del genoma humano. Estos datos indican que la secuenciación de solo una parte de las secuencias del genoma humano presente en el espécimen ensayado es suficiente para conseguir el diagnóstico de aneuploidía fetal.
III. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE SECUENCIAS NECESARIO
En este análisis se utilizó el resultado de la secuenciación del ADN plasmático de una gestante portadora de un feto de sexo masculino euploide. El número de etiquetas secuenciadas que puede mapearse sin desapareamientos con respecto a la secuencia genómica humana de referencia fue de 1.990.000. Los subconjuntos de secuencias se seleccionaron aleatoriamente a partir de estas 1.990.000 etiquetas y el porcentaje de secuencias alineadas con el cromosoma 21 se calculó dentro de cada subconjunto. El número de secuencias en los subconjuntos varió de 60.000 a 540.000 secuencias. Para cada tamaño del subconjunto, se reunieron múltiples subconjuntos del mismo número de etiquetas secuenciadas por selección aleatoria de las etiquetas secuenciadas del conjunto total hasta ninguna otra combinación posible. El porcentaje medio de secuencias alineadas con el cromosoma 21 y su desviación típica (DT) se calculó después a partir de los subconjuntos múltiples dentro de cada tamaño del subconjunto. Estos datos se compararon a través de diferentes tamaños de subconjuntos para determinar el efecto del tamaño de subconjunto sobre la distribución del porcentaje de secuencias alineadas con el cromosoma 21. Los percentiles 5 y 95 de los porcentajes se calcularon después de acuerdo con media y la DT.
Cuando una gestante es portadora de un feto con trisomía 21, las etiquetas secuenciadas alineadas con el cromosoma 21 deben sobre-representarse en el plasma materno debido a una dosis extra de cromosoma 21 procedente del feto. El grado de sobre-representación depende del porcentaje de ADN fetal en la muestra de ADN plasmático materno según la siguiente ecuación:
PerT21 = PerEu x (1 f/2)
donde
PerT21 representa el porcentaje de secuencias alineadas con el cromosoma 21 en una gestante con un feto con trisomía 21; y
PerEu representa el porcentaje de secuencias alineadas con el cromosoma 21 en una gestante con un feto euploide; y
f representa el porcentaje de ADN fetal en el ADN plasmático materno.
Como se muestra en la FIG. 7, la DT para los porcentajes de secuencias alineadas con el cromosoma 21 disminuye cuando aumenta el número de secuencias en cada subconjunto. Por lo tanto, cuando el número de secuencias en cada subconjunto aumenta, el intervalo entre el percentil 5 y 95 disminuye. Cuando el intervalo del 5 % - 95 % para los casos euploides y de trisomía 21 no se solapa, entonces la diferenciación entre los dos grupos de casos sería posible con una precisión > 95 %.
Como se muestra en la FIG. 7, el tamaño del subconjunto mínimo para la diferenciación de casos de trisomía 21 de euploides depende del porcentaje de ADN fetal. Los tamaños de subconjunto mínimo para la diferenciación de casos de trisomía 21 de euploides fueron 120.000, 180.000 y 540.000 secuencias para porcentajes de ADN fetal del 20 %, 10 % y 5 %, respectivamente. En otras palabras, el número de secuencias necesario a analizar sería de 120.000 para determinar si un feto tiene trisomía 21 cuando una muestra de ADN plasmático materno contiene ADN fetal al 20 %. El número de secuencias necesario a analizar debería aumentar a 540.000 cuando el porcentaje de ADN fetal disminuye al 5 %.
Dado que los datos se generaron usando una secuenciación de 36 pares de bases, 120.000, 180.000 y 540.000 secuencias corresponden al 0,14 %, 0,22 % y 0,65 % del genoma humano, respectivamente. Dado que se indicó que el intervalo más bajo de concentraciones de ADN fetal en el plasma materno obtenido de embarazos tempranos era del 5 % (Lo, YMD et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-775), la secuenciación de aproximadamente 0,6 % del genoma humano puede representar la cantidad mínima de secuenciación necesaria para el diagnóstico con una precisión de al menos el 95 % en la detección de aneuploidía cromosómica fetal para cualquier embarazo.
IV. SECUENCIACIÓN ALEATORIA
Para ilustrar que los fragmentos de ADN secuenciados se seleccionaban aleatoriamente durante el proceso de secuenciación, se obtuvieron las etiquetas secuenciadas generadas a partir de las ocho muestras de plasma materno analizadas en el ejemplo I. Para cada espécimen de plasma materno, se determinaron las posiciones de partida en relación con la secuencia genómica humana de referencia, ensamblaje NCBI, 36 de cada uno de los 36 pb secuenciados que se alineaban únicamente con el cromosoma 21 sin emparejamientos erróneos. Después se ordenó, en orden ascendiente, el número de posición de partida de los grupos de etiquetas secuenciadas alineadas de cada espécimen. Para el cromosoma 22 se realizó un análisis similar. Con fines ilustrativos, en las FIG. 8A y 8B, respectivamente, se muestran las diez primeras posiciones de partida del cromosoma 21 y 22 de cada uno de los especímenes de plasma materno. Como puede apreciarse a partir de estas Tablas, los conjuntos de fragmentos de a Dn secuenciado no eran idénticos entre las muestras.
Cualquiera de los componentes informáticos o funciones descritas en esta solicitud pueden implementarse como código de programación para ejecutar por un procesador usando cualquier lenguaje informático adecuado tal como, por ejemplo, Java, C+ o Perl usando, por ejemplo, técnicas convencionales orientadas a objeto. El código de programación puede almacenarse como una serie de instrucciones o comandos en un medio legible por ordenador para almacenamiento y/o transmisión, los medios adecuados incluyen memoria de acceso aleatorio (RAM), o memoria solo de lectura (ROM), un medio magnético, tal como, un disco duro o un disquete, o un medio óptico tal como un disco compacto (CD) o un DVD (disco versátil digital), memoria flash, y similar. El medio legible por ordenador puede ser cualquier combinación de dichos dispositivos de almacenamiento o transmisión.
Dichos programas también pueden codificarse y transmitirse usando señales de transmisión adaptadas para la transmisión mediante redes alámbricas, ópticas y/o inalámbricas que conforman una variedad de protocolos incluyendo el de Internet. Como tal, un medio legible por ordenador de acuerdo con una realización de la presente invención puede crearse usando una señal de datos codificada con dichos programas. Los medios legibles por ordenador codificados con el código de programación pueden empaquetarse con un dispositivo compatible o proporcionarse por separado de otros dispositivos (por ejemplo, descarga vía Internet). Cualquier medio legible por ordenador puede residir sobre o dentro de un solo producto de programa informático (por ejemplo, un disco duro o todo un sistema informatizado) y puede estar presente sobre o dentro de productos de programas informáticos diferentes dentro de un sistema o red. Un sistema informatizado puede incluir un monitor, una impresora u otra pantalla adecuada para proporcionar a un usuario cualquiera de los resultados mencionados en el presente documento.
En la FIG. 9. se muestra un ejemplo de un sistema informatizado. Los subsistemas mostrados en la FIGURA 9 están interconectados mediante un bus de sistema 975. Se muestran subsistemas adicionales, tales como una impresora 974, un teclado 978, un disco duro 979, un monitor 976, que está acoplado a un adaptador de pantalla 982 y otros. Los dispositivos periféricos y de entrada/salida (E/S), acoplados al controlador E/O 971 pueden conectarse al sistema informatizado mediante cualquiera de los diversos medios conocidos en la técnica, tal como un puerto en serie 977. Por ejemplo, el puerto en serie 977 o interfaz externa 981 pueden usarse para conectar el aparato de ordenador a una red de área amplia tal como Internet, un dispositivo de entrada de ratón o un escáner. La interconexión mediante el bus del sistema permite que al procesador central 973 comunicar con cada subsistema y controlar la ejecución de instrucciones desde la memoria del sistema 972 o del disco duro 979, así como el intercambio de información entre subsistemas. La memoria del sistema 972 y/o el disco duro 979 pueden representar un medio legible por ordenador.
La descripción anterior de realizaciones ejemplares de la invención se ha presentado con fines ilustrativos y descriptivos. No pretende ser exhaustiva o limitar la invención a la forma precisa descrita, y son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores. Las realizaciones se eligieron y describieron para explicar mejor los principios de la invención y sus aplicaciones prácticas para permitir a otros expertos en la técnica utilizar mejor la invención en diversas realizaciones y con diversas modificaciones que sean adecuadas para el uso particular contemplado.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método implementado por ordenador de análisis de una muestra biológica de un organismo para deleciones o amplificaciones en una o más regiones cromosómicas asociadas con cáncer, incluyendo la muestra biológica moléculas de ADN sin células que se originan a partir de células no malignas y potencialmente de células tumorales asociadas con cáncer, comprendiendo el método:
recibir etiquetas secuenciadas obtenidas de una secuenciación aleatorizada de moléculas de ADN contenidas en la muestra biológica, siendo la muestra biológica plasma, suero, saliva u orina;
alinear una pluralidad de las etiquetas secuenciadas con un genoma humano de referencia;
determinar una primera cantidad de las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con una primera región cromosómica que es parte de un primer cromosoma;
determinar una segunda cantidad de etiquetas secuenciadas como alineaciones con una o más segundas regiones cromosómicas;
determinar un primer parámetros a partir de la primera cantidad y de la segunda cantidad, en donde el parámetro incluye una proporción entre la primera cantidad y la segunda cantidad, en donde una anomalía en el primer parámetro para la primera región cromosómica se asocia con cáncer; y
comparar el primer parámetro con uno o más valores umbral para determinar una clasificación de si la primera región cromosómica presenta una deleción y/o una amplificación asociada con cáncer.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la clasificación incluye si la primera región cromosómica se amplifica, y en donde se hace una clasificación de la amplificación cuando el primer parámetro es más de un primer valor umbral de los uno o más valores umbrales.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la clasificación incluye si la primera región cromosómica tiene una deleción, y en donde se hace una clasificación de la deleción cuando el primer parámetro es menos de un primer valor umbral de los uno o más valores umbrales.
4. El método de la reivindicación 1, que además comprende:
determinar una tercera cantidad de etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con una tercera región cromosómica, en donde una anomalía en la tercera región cromosómica se asocia con cáncer;
determinar un segundo parámetro para una tercera región cromosómica, en donde el segundo parámetro incluye una proporción entre la tercera cantidad y la segunda cantidad;
comparar el segundo parámetro con uno o más valores umbral para determinar una clasificación de si la tercera región cromosómica presenta una deleción y/o una amplificación asociada con cáncer; y usar las clasificaciones de la primera y tercera región cromosómica para detectar si el organismo tiene cáncer.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el primer parámetro se calcula a partir de una proporción que incluye la primera cantidad.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la proporción proporciona un porcentaje de las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con la primera región cromosómica entre las etiquetas secuenciadas.
7. El método de la reivindicación 5, en donde la proporción se obtiene a partir de uno cualquiera o más de un recuento fraccionado del número de etiquetas secuenciadas, un número fraccionado de nucleótidos secuenciados, y una longitud fraccionada de las secuencias acumuladas.
8. El método de la reivindicación 5, en donde las secuencias que se usan para determinar la primera cantidad se seleccionan para que sean menos de un número específico de bases.
9. El método de la reivindicación 1, en donde las moléculas de ADN de la muestra se han enriquecido para secuencias que se originan a partir de la primera región cromosómica.
10. El método de la reivindicación 1, en donde la proporción alineada representa al menos una fracción predeterminada del genoma humano de referencia, en donde la fracción representa al menos el 0,1% del genoma humano de referencia.
11. El método de la reivindicación 1, en donde al menos uno de los valores umbral es un valor de referencia establecido en una muestra biológica normal, y en donde el al menos un valor umbral se determina a partir de una media del valor del primer parámetro en una pluralidad de muestras biológicas normales.
12. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
identificar una cantidad de ADN del tumor en la muestra biológica; y
calcular un número N de secuencias que se van a analizar basándose en una precisión deseada, en donde al menos uno de los valores umbrales proviene de un porcentaje de células tumorales en la muestra biológica.
13. El método de la reivindicación 1, en donde las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con la primera región cromosómica únicamente se alinean con la primera región cromosómica, y en donde las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con las una o más segundas regiones cromosómicas únicamente se alinean con solo una de las segundas regiones cromosómicas.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, en donde la primera cantidad se determina basándose en un grupo de etiquetas secuenciadas que se alinean con una pluralidad de posiciones de la primera región cromosómica, en donde no se predetermina qué parte del genoma humano de referencia que se corresponde a las etiquetas secuenciadas se alinea con la primera región cromosómica.
15. El método de la reivindicación 1, en donde el primer parámetro es una representación fraccionada de las etiquetas secuenciadas identificadas como alineación con la primera región cromosómica, siendo la representación fraccionada una medida de una proporción de moléculas de ADN en la muestra biológica que son de la primera región cromosómica y en donde los uno o más valores umbrales tienen en cuenta un tamaño de la primera región cromosómica en relación con un tamaño de las una o más segundas regiones cromosómicas.
16. Un programa de ordenador que comprende un código de programa informático capaz de ejecutarse mediante un procesador de un sistema informático, estando el programa de ordenador configurado, cuando se ejecuta mediante el procesador, para provocar que el procesador realice un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
ES12173422T 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica Active ES2792802T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95143807P 2007-07-23 2007-07-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2792802T3 true ES2792802T3 (es) 2020-11-12

Family

ID=39798126

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12180122T Active ES2933486T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un desequilibrio de la secuencia de ácido nucleico
ES12173422T Active ES2792802T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica
ES12180133T Active ES2820866T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un genotipo de un feto
ES12180138T Active ES2869347T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un desequilibrio de la secuencia de ácido nucleico
ES08776043T Active ES2441807T5 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica
ES12175754T Active ES2571738T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12180122T Active ES2933486T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un desequilibrio de la secuencia de ácido nucleico

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12180133T Active ES2820866T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un genotipo de un feto
ES12180138T Active ES2869347T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Determinación de un desequilibrio de la secuencia de ácido nucleico
ES08776043T Active ES2441807T5 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica
ES12175754T Active ES2571738T3 (es) 2007-07-23 2008-07-23 Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal utilizando secuenciación genómica

Country Status (26)

Country Link
US (10) US8706422B2 (es)
EP (15) EP2557520B1 (es)
JP (16) JP5519500B2 (es)
KR (23) KR102339760B1 (es)
CN (11) CN106676188A (es)
AU (1) AU2008278839B2 (es)
BR (1) BRPI0814670B8 (es)
CA (10) CA2694007C (es)
CY (3) CY1114773T1 (es)
DK (6) DK2557520T3 (es)
EA (6) EA035451B9 (es)
ES (6) ES2933486T3 (es)
FI (1) FI2557517T3 (es)
HK (5) HK1177768A1 (es)
HR (4) HRP20230033T3 (es)
HU (3) HUE030510T2 (es)
IL (2) IL203311A (es)
LT (2) LT2557517T (es)
MX (3) MX341573B (es)
NZ (2) NZ582702A (es)
PL (4) PL2183693T5 (es)
PT (3) PT2557517T (es)
SG (1) SG183062A1 (es)
SI (4) SI2514842T1 (es)
WO (2) WO2009013496A1 (es)
ZA (1) ZA201000524B (es)

Families Citing this family (270)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8024128B2 (en) * 2004-09-07 2011-09-20 Gene Security Network, Inc. System and method for improving clinical decisions by aggregating, validating and analysing genetic and phenotypic data
ATE406463T1 (de) 2005-04-06 2008-09-15 Maurice Stroun Methode zur krebsdiagnose mittels nachweis von dna und rna im kreislauf
US20090317798A1 (en) * 2005-06-02 2009-12-24 Heid Christian A Analysis using microfluidic partitioning devices
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) * 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US20070027636A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Matthew Rabinowitz System and method for using genetic, phentoypic and clinical data to make predictions for clinical or lifestyle decisions
US8532930B2 (en) * 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US8515679B2 (en) 2005-12-06 2013-08-20 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US20070178501A1 (en) * 2005-12-06 2007-08-02 Matthew Rabinowitz System and method for integrating and validating genotypic, phenotypic and medical information into a database according to a standardized ontology
PL1981995T5 (pl) * 2006-02-02 2019-10-31 Univ Leland Stanford Junior Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) * 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
HUE030510T2 (hu) 2007-07-23 2017-05-29 Univ Hong Kong Chinese Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
US7888127B2 (en) 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
WO2009105531A1 (en) * 2008-02-19 2009-08-27 Gene Security Network, Inc. Methods for cell genotyping
US8709726B2 (en) * 2008-03-11 2014-04-29 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
DE102008019132A1 (de) * 2008-04-16 2009-10-22 Olympus Life Science Research Europa Gmbh Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe
WO2009146335A1 (en) * 2008-05-27 2009-12-03 Gene Security Network, Inc. Methods for embryo characterization and comparison
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
CN104732118B (zh) * 2008-08-04 2017-08-22 纳特拉公司 等位基因调用和倍性调用的方法
EP2318552B1 (en) 2008-09-05 2016-11-23 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
AU2015202167B2 (en) * 2008-09-20 2017-12-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US20100112575A1 (en) 2008-09-20 2010-05-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive Diagnosis of Fetal Aneuploidy by Sequencing
US8563242B2 (en) * 2009-08-11 2013-10-22 The Chinese University Of Hong Kong Method for detecting chromosomal aneuploidy
US20120185176A1 (en) 2009-09-30 2012-07-19 Natera, Inc. Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling
CA2778926C (en) 2009-10-26 2018-03-27 Lifecodexx Ag Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy
WO2011053790A2 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Fluidigm Corporation Assay of closely linked targets in fetal diagnosis and coincidence detection assay for genetic analysis
CA2779695C (en) * 2009-11-05 2016-05-24 The Chinese University Of Hong Kong Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
CN102712954A (zh) 2009-11-06 2012-10-03 小利兰·斯坦福大学托管委员会 器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断
EP3406737B1 (en) 2009-11-06 2023-05-31 The Chinese University of Hong Kong Size-based genomic analysis
WO2011074960A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
EP3088532B1 (en) 2009-12-22 2019-10-30 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
EP3382037B1 (en) * 2010-01-19 2021-02-17 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
AU2015203579B2 (en) * 2010-01-19 2017-12-21 Verinata Health, Inc. Sequencing methods and compositions for prenatal diagnoses
AU2011207561B2 (en) 2010-01-19 2014-02-20 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
AU2015204302B2 (en) * 2010-01-19 2017-10-05 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
KR20120107512A (ko) * 2010-01-26 2012-10-02 엔아이피디 제네틱스 리미티드 태아 이수성의 비침해성 출생전 진단을 위한 방법과 조성물
JP5934657B2 (ja) * 2010-02-12 2016-06-15 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド デジタル検体分析
CN102753703B (zh) * 2010-04-23 2014-12-24 深圳华大基因健康科技有限公司 胎儿染色体非整倍性的检测方法
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
WO2013052557A2 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Natera, Inc. Methods for preimplantation genetic diagnosis by sequencing
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
AU2011255641A1 (en) 2010-05-18 2012-12-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA2802111A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20130040375A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20120077185A1 (en) * 2010-08-06 2012-03-29 Tandem Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities and infectious disease
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
EP2604700B1 (en) * 2010-08-13 2015-07-22 BGI Diagnosis Co., Ltd. A method for analyzing cell chromosomes
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
CN103534591B (zh) * 2010-10-26 2016-04-06 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 通过测序分析进行的非侵入性胎儿遗传筛选
CN108899091B (zh) * 2010-11-30 2022-04-15 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
WO2012078792A2 (en) 2010-12-07 2012-06-14 Stanford University Non-invasive determination of fetal inheritance of parental haplotypes at the genome-wide scale
AU2011348100B2 (en) 2010-12-22 2016-08-25 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
AU2012204748C1 (en) * 2011-01-05 2021-12-23 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal genotyping of fetal sex chromosomes
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US20120190021A1 (en) * 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
AU2011358564B9 (en) * 2011-02-09 2017-07-13 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2902500B1 (en) * 2011-02-09 2017-01-11 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
CA3160848A1 (en) * 2011-02-24 2013-03-28 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
WO2012129436A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Life Technologies Corporation Identification of linkage using multiplex digital pcr
US9260753B2 (en) 2011-03-24 2016-02-16 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
US20150065358A1 (en) * 2011-03-30 2015-03-05 Verinata Health, Inc. Method for verifying bioassay samples
DK3567124T3 (da) 2011-04-12 2022-03-07 Verinata Health Inc Opløsning af genomfraktioner ved anvendelse af polymorfisme-optællinger
GB2484764B (en) * 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
CN103717750B (zh) 2011-04-29 2017-03-08 塞昆纳姆股份有限公司 少数核酸物质的定量
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
MY172864A (en) 2011-06-29 2019-12-13 Bgi Shenzhen Co Ltd Noninvasive detection of fetal genetic abnormality
US20140141997A1 (en) * 2011-06-30 2014-05-22 National University Of Singapore Foetal nucleated red blood cell detection
US20130157875A1 (en) * 2011-07-20 2013-06-20 Anthony P. Shuber Methods for assessing genomic instabilities
EP2563937A1 (en) * 2011-07-26 2013-03-06 Verinata Health, Inc Method for determining the presence or absence of different aneuploidies in a sample
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
CN104160391A (zh) * 2011-09-16 2014-11-19 考利达基因组股份有限公司 确定异质样本的基因组中的变异
WO2013040773A1 (zh) * 2011-09-21 2013-03-28 深圳华大基因科技有限公司 确定单细胞染色体非整倍性的方法和系统
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
AU2012318371B2 (en) 2011-10-06 2018-03-22 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2764458B1 (en) 2011-10-06 2021-04-07 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
DK2766496T3 (en) 2011-10-11 2017-05-15 Sequenom Inc METHODS AND PROCESSES FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN102329876B (zh) * 2011-10-14 2014-04-02 深圳华大基因科技有限公司 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法
ES2651612T3 (es) 2011-10-18 2018-01-29 Multiplicom Nv Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal
US9845552B2 (en) 2011-10-27 2017-12-19 Verinata Health, Inc. Set membership testers for aligning nucleic acid samples
EP2602733A3 (en) * 2011-12-08 2013-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biological cell assessment using whole genome sequence and oncological therapy planning using same
AU2013209499B2 (en) 2012-01-20 2018-05-10 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
EP3757210B1 (en) 2012-03-02 2022-08-24 Sequenom, Inc. Methods for enriching cancer nucleic acid from a biological sample
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
AU2013240088B2 (en) 2012-03-26 2017-02-02 The Johns Hopkins University Rapid aneuploidy detection
EP2834376B1 (en) * 2012-04-06 2017-03-15 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing
EP3741871A3 (en) 2012-04-19 2021-02-17 The Medical College of Wisconsin, Inc. Highly sensitive surveillance using detection of cell free dna
EP2852682B1 (en) 2012-05-21 2017-10-04 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
ES2772029T3 (es) 2012-05-21 2020-07-07 Sequenom Inc Métodos y procesos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas
US11261494B2 (en) * 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2878979C (en) * 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
AU2013292287A1 (en) 2012-07-19 2015-02-19 Ariosa Diagnostics, Inc. Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10706957B2 (en) 2012-09-20 2020-07-07 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of tumor from plasma
KR20230145530A (ko) 2012-09-20 2023-10-17 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 혈장으로부터 태아 또는 종양 메틸롬의 비침습적 결정
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US20150275300A1 (en) * 2012-09-26 2015-10-01 Agency For Science, Technology And Research Biomarkers for down syndrome prenatal diagnosis
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA3120521A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
DK2728014T3 (en) * 2012-10-31 2016-01-25 Genesupport Sa A non-invasive method for the detection of fetal chromosomal aneuploidy
US10643738B2 (en) 2013-01-10 2020-05-05 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
JP6542676B2 (ja) * 2013-02-20 2019-07-10 バイオナノ ジェノミクス、 インコーポレイテッド ナノフルイディクスにおける分子の特性解析
SG10201609080WA (en) 2013-02-28 2016-12-29 Univ Hong Kong Chinese Maternal plasma transcriptome analysis by massively parallel rna sequencing
WO2014133369A1 (ko) * 2013-02-28 2014-09-04 주식회사 테라젠이텍스 유전체 서열분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 진단 방법 및 장치
US20130189684A1 (en) 2013-03-12 2013-07-25 Sequenom, Inc. Quantification of cell-specific nucleic acid markers
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
AU2014231358A1 (en) 2013-03-15 2015-09-24 The Chinese University Of Hong Kong Determining fetal genomes for multiple fetus pregnancies
FI2981921T3 (fi) 2013-04-03 2023-03-09 Sequenom Inc Menetelmiä ja prosesseja geneettisten variaatioiden ei-invasiiviseen arviointiin
WO2014182726A2 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Sequenom, Inc. Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
KR20230082691A (ko) 2013-05-24 2023-06-08 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
WO2014200579A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
KR102447079B1 (ko) 2013-06-21 2022-09-23 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
CN104520437B (zh) * 2013-07-17 2016-09-14 深圳华大基因股份有限公司 一种染色体非整倍性检测方法及装置
US10174375B2 (en) 2013-09-20 2019-01-08 The Chinese University Of Hong Kong Sequencing analysis of circulating DNA to detect and monitor autoimmune diseases
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
WO2015048535A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Natera, Inc. Prenatal diagnostic resting standards
EP4258269A3 (en) 2013-10-04 2024-01-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN111863131A (zh) 2013-10-07 2020-10-30 塞昆纳姆股份有限公司 用于非侵入性评估染色体改变的方法和过程
EP3061021B1 (en) * 2013-10-21 2023-05-10 Verinata Health, Inc. Method for improving the sensitivity of detection in determining copy number variations
WO2015089726A1 (zh) * 2013-12-17 2015-06-25 深圳华大基因科技有限公司 一种染色体非整倍性检测方法及装置
JP6571665B2 (ja) 2013-12-28 2019-09-04 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN106460070B (zh) 2014-04-21 2021-10-08 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
RU2602366C2 (ru) * 2014-05-21 2016-11-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Тестген" Способ получения днк-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной пцр-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины и диагностический набор для ее осуществления
KR101663171B1 (ko) * 2014-05-27 2016-10-14 이원 다이애그노믹스 게놈센타(주) 다운증후군 진단을 위한 바이오마커 및 그의 용도
WO2016003047A1 (ko) * 2014-07-01 2016-01-07 바이오코아 주식회사 디지털 ｐｃｒ을 이용하여 임부의 혈액 또는 혈장으로부터 태아의 유전자 정보를 분석하는 방법
WO2016010401A1 (ko) * 2014-07-18 2016-01-21 에스케이텔레콘 주식회사 산모의 혈청 dna를 이용한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법
US11062789B2 (en) 2014-07-18 2021-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of tissues in a DNA mixture
KR20160010277A (ko) * 2014-07-18 2016-01-27 에스케이텔레콤 주식회사 산모의 무세포 dna의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법
US20160026759A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Yourgene Bioscience Detecting Chromosomal Aneuploidy
JP2017522908A (ja) 2014-07-25 2017-08-17 ユニヴァーシティ オブ ワシントン セルフリーｄｎａを生じる組織及び／又は細胞タイプを決定する方法、並びにそれを用いて疾患又は異常を識別する方法
WO2016019042A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3230469B1 (en) 2014-12-12 2019-04-03 Verinata Health, Inc. Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
ES2908347T3 (es) 2015-02-10 2022-04-28 Univ Hong Kong Chinese Detección de mutaciones para cribado de cáncer y análisis fetal
CN104789686B (zh) * 2015-05-06 2018-09-07 浙江安诺优达生物科技有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
CN104789466B (zh) * 2015-05-06 2018-03-13 安诺优达基因科技(北京)有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US10395759B2 (en) 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
EP3666902A1 (en) 2015-05-22 2020-06-17 Nipd Genetics Public Company Limited Multiplexed parallel analysis of targeted genomic regions for non-invasive prenatal testing
CN104951671B (zh) * 2015-06-10 2017-09-19 东莞博奥木华基因科技有限公司 基于单样本外周血检测胎儿染色体非整倍性的装置
WO2016207647A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Oxford Biodynamics Limited Epigenetic chromosome interactions
EP3118323A1 (en) 2015-07-13 2017-01-18 Cartagenia N.V. System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
EP3636777A1 (en) 2015-07-13 2020-04-15 Agilent Technologies Belgium NV System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
EP3325663B1 (en) 2015-07-20 2020-08-19 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of haplotypes in tissues in dna mixture
ES2960201T3 (es) 2015-07-23 2024-03-01 Univ Hong Kong Chinese Análisis de los patrones de fragmentación del ADN acelular
IL285795B (en) 2015-08-12 2022-07-01 Univ Hong Kong Chinese Sequencing a single molecule of DNA. plasma
WO2017044609A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Cold Spring Harbor Laboratory Genetic copy number determination using high throughput multiplex sequencing of smashed nucleotides
US10774375B2 (en) 2015-09-18 2020-09-15 Agena Bioscience, Inc. Methods and compositions for the quantitation of mitochondrial nucleic acid
WO2017051996A1 (ko) * 2015-09-24 2017-03-30 에스케이텔레콤 주식회사 비침습적 태아 염색체 이수성 판별 방법
CN105132572B (zh) * 2015-09-25 2018-03-02 邯郸市康业生物科技有限公司 一种无创产前筛查21‑三体综合征试剂盒
KR101848438B1 (ko) * 2015-10-29 2018-04-13 바이오코아 주식회사 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법
EP3390668A4 (en) 2015-12-17 2020-04-01 Guardant Health, Inc. METHODS OF DETERMINING THE NUMBER OF TUMOR GENE COPIES BY ACELLULAR DNA ANALYSIS
GB201522665D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Premaitha Ltd Detection of chromosome abnormalities
KR101817180B1 (ko) * 2016-01-20 2018-01-10 이원다이애그노믹스(주) 염색체 이상 판단 방법
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
KR101879329B1 (ko) * 2016-06-13 2018-07-17 충북대학교 산학협력단 유전자 차별 발현 분석을 위한 RNA-seq 발현량 데이터 시뮬레이션 방법 및 이를 기록한 기록매체
CA3030890A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
CA3037366A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Myriad Women's Health, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
US20200013482A1 (en) 2016-09-30 2020-01-09 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
EP3535415A4 (en) 2016-10-24 2020-07-01 The Chinese University of Hong Kong TUMOR DETECTION METHODS AND SYSTEMS
KR20230062684A (ko) 2016-11-30 2023-05-09 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US20200255896A1 (en) * 2017-01-11 2020-08-13 Quest Diagnostics Investments Llc Method for non-invasive prenatal screening for aneuploidy
WO2018140521A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
SG11201906397UA (en) 2017-01-25 2019-08-27 Univ Hong Kong Chinese Diagnostic applications using nucleic acid fragments
EP3585889A1 (en) 2017-02-21 2020-01-01 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
CA3067637A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Assessing transplant complication risk with total cell-free dna
LT3658689T (lt) 2017-07-26 2021-06-25 Trisomytest, S.R.O. Neinvazinis prenatalinis vaisiaus chromosomos aneuploidijos nustatymo būdas iš motinos kraujo remiantis bajeso tinklu
EP3662479A1 (en) 2017-08-04 2020-06-10 Trisomytest, s.r.o. A method for non-invasive prenatal detection of fetal sex chromosomal abnormalities and fetal sex determination for singleton and twin pregnancies
US11519024B2 (en) 2017-08-04 2022-12-06 Billiontoone, Inc. Homologous genomic regions for characterization associated with biological targets
WO2019028462A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Billiontoone, Inc. TARGET-ASSOCIATED MOLECULES FOR CHARACTERIZATION ASSOCIATED WITH BIOLOGICAL TARGETS
SK862017A3 (sk) 2017-08-24 2020-05-04 Grendar Marian Doc Mgr Phd Spôsob použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri určovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní
WO2019043656A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Genus Plc METHODS AND SYSTEMS FOR ASSESSING AND / OR QUANTIFYING POPULATIONS OF SPERMATOZOIDS WITH SEXUAL ASYMMETRY
US20200299677A1 (en) 2017-10-27 2020-09-24 Juno Diagnostics, Inc. Devices, systems and methods for ultra-low volume liquid biopsy
US11168356B2 (en) 2017-11-02 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Using nucleic acid size range for noninvasive cancer detection
CN112365927B (zh) * 2017-12-28 2023-08-25 安诺优达基因科技(北京)有限公司 Cnv检测装置
PT3735470T (pt) 2018-01-05 2024-01-31 Billiontoone Inc Modelos de controlo de qualidade para garantir a validade dos ensaios baseados em sequenciamento
CN108282396B (zh) * 2018-02-13 2022-02-22 湖南快乐阳光互动娱乐传媒有限公司 一种im集群中的多级消息广播方法及系统
KR102099151B1 (ko) * 2018-03-05 2020-04-10 서강대학교산학협력단 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치
CA3095292A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
EP3775278A1 (en) 2018-04-02 2021-02-17 Illumina Inc. Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing
CA3105349A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 The Chinese University Of Hong Kong Size-tagged preferred ends and orientation-aware analysis for measuring properties of cell-free mixtures
WO2019232435A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Grail, Inc. Convolutional neural network systems and methods for data classification
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
JP2021534803A (ja) * 2018-09-04 2021-12-16 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム
CA3107467A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Sequenom, Inc. Methods, and systems to detect transplant rejection
WO2020076474A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Nantomics, Llc Prenatal purity assessments using bambam
JP2022512848A (ja) * 2018-10-31 2022-02-07 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド エピジェネティック区画アッセイを較正するための方法、組成物およびシステム
CN109545379B (zh) * 2018-12-05 2021-11-09 易必祥 基于基因大数据的治疗系统
US11581062B2 (en) 2018-12-10 2023-02-14 Grail, Llc Systems and methods for classifying patients with respect to multiple cancer classes
JP2020108548A (ja) * 2019-01-04 2020-07-16 株式会社大一商会 遊技機
JP6783437B2 (ja) * 2019-01-04 2020-11-11 株式会社大一商会 遊技機
CN113661249A (zh) 2019-01-31 2021-11-16 夸登特健康公司 用于分离无细胞dna的组合物和方法
WO2020172164A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Sequenom, Inc. Compositions, methods, and systems to detect hematopoietic stem cell transplantation status
KR20200109544A (ko) * 2019-03-13 2020-09-23 울산대학교 산학협력단 공통 유전자 추출에 의한 다중 암 분류 방법
CA3130810A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11931674B2 (en) 2019-04-04 2024-03-19 Natera, Inc. Materials and methods for processing blood samples
RU2717023C1 (ru) * 2019-04-24 2020-03-17 Общество с ограниченной ответственностью "ГЕНОТЕК ИТ" Способ определения кариотипа плода беременной женщины на основании секвенирования гибридных прочтений, состоящих из коротких фрагментов внеклеточной ДНК
CA3110884A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Determination of base modifications of nucleic acids
TWI724710B (zh) * 2019-08-16 2021-04-11 財團法人工業技術研究院 建構數位化疾病模組的方法及裝置
WO2021067417A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Myome, Inc. Polygenic risk score for in vitro fertilization
CN114585749A (zh) * 2019-10-16 2022-06-03 斯蒂拉科技公司 核酸序列浓度的确定
WO2021137770A1 (en) 2019-12-30 2021-07-08 Geneton S.R.O. Method for fetal fraction estimation based on detection and interpretation of single nucleotide variants
JP2023510318A (ja) * 2020-01-08 2023-03-13 ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン 無細胞試料の二末端ｄｎａ断片タイプおよびその用途
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US20230120825A1 (en) 2020-02-28 2023-04-20 Laboratory Corporation Of America Holdings Compositions, Methods, and Systems for Paternity Determination
US20220254153A1 (en) * 2020-05-11 2022-08-11 Nec Corporation Determination device, determination method, and recording medium
US20220245934A1 (en) 2020-05-11 2022-08-04 Nec Corporation Determination device, determination method, and recording medium
WO2021237105A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 Invitae Corporation Methods for determining a genetic variation
CN114645080A (zh) * 2020-12-21 2022-06-21 高嵩 一种利用多态性位点和靶位点测序检测胎儿遗传变异的方法
WO2022246291A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Invitae Corporation Methods for determining a genetic variation
CN113981062B (zh) * 2021-10-14 2024-02-20 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司 以非生父和母亲dna评估胎儿dna浓度的方法及应用
WO2024058850A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Myriad Women's Health, Inc. Rna-facs for rare cell isolation and detection of genetic variants

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641628A (en) * 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
AU2765992A (en) * 1991-10-03 1993-05-03 Indiana University Foundation Method for screening for alzheimer's disease
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US20010051341A1 (en) * 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
GB9704444D0 (en) * 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
US6143496A (en) * 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6558901B1 (en) * 1997-05-02 2003-05-06 Biomerieux Vitek Nucleic acid assays
US6566101B1 (en) * 1997-06-16 2003-05-20 Anthony P. Shuber Primer extension methods for detecting nucleic acids
US20030022207A1 (en) * 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6613513B1 (en) * 1999-02-23 2003-09-02 Caliper Technologies Corp. Sequencing by incorporation
AUPQ008799A0 (en) * 1999-04-30 1999-05-27 Tillett, Daniel Genome sequencing
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6440706B1 (en) * 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
KR20020064298A (ko) * 1999-10-13 2002-08-07 시쿼넘, 인코포레이티드 다형성 유전 마커를 동정하기 위한 데이타베이스 및 이의제조 방법
GB0009784D0 (en) * 2000-04-20 2000-06-07 Simeg Limited Methods for clinical diagnosis
GB0016742D0 (en) * 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
US6664056B2 (en) * 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US8898021B2 (en) * 2001-02-02 2014-11-25 Mark W. Perlin Method and system for DNA mixture analysis
US20060068433A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 Godfrey Tony E Multiple mode multiplex reaction quenching method
US20020164816A1 (en) * 2001-04-06 2002-11-07 California Institute Of Technology Microfluidic sample separation device
WO2002081729A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
US7118907B2 (en) * 2001-06-06 2006-10-10 Li-Cor, Inc. Single molecule detection systems and methods
US20050037388A1 (en) * 2001-06-22 2005-02-17 University Of Geneva Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances
US6927028B2 (en) * 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
GT200200183A (es) * 2001-09-28 2003-05-23 Procedimiento para preparar derivados de heterocicloalquilsulfonil pirazol
WO2003030823A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Combinatorx, Incorporated Combinations for the treatment of immunoinflammatory disorders
JP2005509871A (ja) * 2001-11-20 2005-04-14 エグザクト サイエンシーズ コーポレイション 自動化サンプル調製方法および装置
US7691333B2 (en) * 2001-11-30 2010-04-06 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
JP4355210B2 (ja) 2001-11-30 2009-10-28 フルイディグム コーポレイション 微小流体デバイスおよび微小流体デバイスの使用方法
US20030180765A1 (en) 2002-02-01 2003-09-25 The Johns Hopkins University Digital amplification for detection of mismatch repair deficient tumor cells
NZ535045A (en) 2002-03-01 2008-04-30 Ravgen Inc Rapid analysis of variations in a genome
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7442506B2 (en) * 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
KR100500697B1 (ko) 2002-10-21 2005-07-12 한국에너지기술연구원 다단계 열회수형 물유동층 열교환기
US7704687B2 (en) * 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
EP1583846B1 (en) 2003-01-17 2011-11-16 The Chinese University Of Hong Kong Circulating mrna as diagnostic markers for pregnancy-related disorders
JP2006521086A (ja) 2003-02-28 2006-09-21 ラブジェン， インコーポレイテッド 遺伝子疾患の検出方法
US8394582B2 (en) * 2003-03-05 2013-03-12 Genetic Technologies, Inc Identification of fetal DNA and fetal cell markers in maternal plasma or serum
WO2004081183A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna
WO2004083816A2 (en) 2003-03-14 2004-09-30 John Wayne Cancer Institute Loss of heterozygosity of the dna markers in the 12q22-23 region
WO2004089810A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Fluidigm Corp. Microfluidic devices and methods of using same
US7604965B2 (en) * 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US7476363B2 (en) * 2003-04-03 2009-01-13 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods of using same
US20040197832A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-07 Mor Research Applications Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
US20050145496A1 (en) * 2003-04-03 2005-07-07 Federico Goodsaid Thermal reaction device and method for using the same
RU2249820C1 (ru) * 2003-08-18 2005-04-10 Лактионов Павел Петрович Способ ранней диагностики заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки
EP2354253A3 (en) * 2003-09-05 2011-11-16 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
US20050282213A1 (en) * 2003-09-22 2005-12-22 Trisogen Biotechnology Limited Partnership Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number
WO2005035725A2 (en) 2003-10-08 2005-04-21 The Trustees Of Boston University Methods for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities
EP1524321B2 (en) * 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
WO2005039389A2 (en) * 2003-10-22 2005-05-06 454 Corporation Sequence-based karyotyping
WO2005044086A2 (en) * 2003-10-30 2005-05-19 Tufts-New England Medical Center Prenatal diagnosis using cell-free fetal dna in amniotic fluid
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US20100216153A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20100216151A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7709194B2 (en) 2004-06-04 2010-05-04 The Chinese University Of Hong Kong Marker for prenatal diagnosis and monitoring
DE102004036285A1 (de) * 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
CN1779688A (zh) * 2004-11-22 2006-05-31 寰硕数码股份有限公司 交互式医疗信息系统及方法
CN101137761B (zh) * 2005-03-18 2010-12-08 香港中文大学 产前诊断和监测的标记
US7645576B2 (en) * 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US20090317798A1 (en) 2005-06-02 2009-12-24 Heid Christian A Analysis using microfluidic partitioning devices
WO2007001259A1 (en) * 2005-06-16 2007-01-04 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and materials for identifying polymorphic variants, diagnosing susceptibilities, and treating disease
US20070059680A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-15 Ravi Kapur System for cell enrichment
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
US20070184511A1 (en) * 2005-11-18 2007-08-09 Large Scale Biology Corporation Method for Diagnosing a Person Having Sjogren's Syndrome
AU2006318425B2 (en) * 2005-11-26 2013-05-02 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and using data to make predictions
PL1981995T5 (pl) * 2006-02-02 2019-10-31 Univ Leland Stanford Junior Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej
DK1996728T3 (da) 2006-02-28 2011-08-15 Univ Louisville Res Found Detektering af føtale chromosomale abnormiteter under anvendelse af tandem-enkeltnukleotid-polymorfismer
US20080038733A1 (en) * 2006-03-28 2008-02-14 Baylor College Of Medicine Screening for down syndrome
US8058055B2 (en) * 2006-04-07 2011-11-15 Agilent Technologies, Inc. High resolution chromosomal mapping
US7754428B2 (en) 2006-05-03 2010-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Fetal methylation markers
US7901884B2 (en) * 2006-05-03 2011-03-08 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis and monitoring
WO2008111990A1 (en) * 2006-06-14 2008-09-18 Cellpoint Diagnostics, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
EP2029778B1 (en) 2006-06-14 2018-05-02 Verinata Health, Inc Diagnosis of fetal abnormalities
US20080050739A1 (en) * 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8137912B2 (en) * 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) * 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
EP2589668A1 (en) * 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
WO2009035447A1 (en) * 2006-06-14 2009-03-19 Living Microsystems, Inc. Diagnosis of fetal abnormalities by comparative genomic hybridization analysis
EP3406736B1 (en) 2006-06-14 2022-09-07 Verinata Health, Inc. Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
JP2009540802A (ja) * 2006-06-16 2009-11-26 セクエノム， インコーポレイテッド サンプルからの核酸を増幅、検出および定量するための方法および組成物
WO2008014516A2 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 Living Microsystems, Inc. Selection of cells using biomarkers
KR101489310B1 (ko) * 2007-01-30 2015-02-04 인터디지탈 테크날러지 코포레이션 Ｌｔｅ＿활성 모드에서 암묵적 ｄｒｘ 싸이클 길이 조절 제어
WO2008098142A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
EP2153361A4 (en) * 2007-05-04 2010-09-29 Genes It Software Ltd SYSTEM, METHOD AND DEVICE FOR COMPLETE INDIVIDUALIZED GENETIC INFORMATION OR GENETIC CONSULTATION
CA2688032C (en) 2007-05-24 2015-11-03 Apceth Gmbh & Co. Kg Cd34 stem cell-related methods and compositions
HUE030510T2 (hu) 2007-07-23 2017-05-29 Univ Hong Kong Chinese Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
US20090053719A1 (en) 2007-08-03 2009-02-26 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of nucleic acids by digital pcr
EP3103463B1 (en) 2007-09-19 2020-01-01 Pluristem Ltd. Adherent cells from adipose or placenta tissues and use thereof in therapy
US20100112575A1 (en) * 2008-09-20 2010-05-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive Diagnosis of Fetal Aneuploidy by Sequencing
EP3406737B1 (en) * 2009-11-06 2023-05-31 The Chinese University of Hong Kong Size-based genomic analysis

Also Published As

Publication number Publication date
EP2514842B1 (en) 2016-02-24
JP6522554B2 (ja) 2019-05-29
EP2514842A2 (en) 2012-10-24
JP6629940B2 (ja) 2020-01-15
EP3892736A1 (en) 2021-10-13
JP2016185162A (ja) 2016-10-27
HRP20230033T3 (hr) 2023-03-03
EP2557517A3 (en) 2014-11-05
EA201000231A1 (ru) 2010-06-30
CA3076142C (en) 2023-01-03
JP6151739B2 (ja) 2017-06-21
EP2183692A1 (en) 2010-05-12
CN103902809B (zh) 2017-11-28
NZ582702A (en) 2012-07-27
ES2933486T3 (es) 2023-02-09
IL233261A (en) 2016-07-31
JP7457399B2 (ja) 2024-03-28
KR102443163B1 (ko) 2022-09-14
CN103853916A (zh) 2014-06-11
DK2183693T5 (en) 2019-02-18
JP2010534068A (ja) 2010-11-04
EP2557519A3 (en) 2014-07-23
US20190136323A1 (en) 2019-05-09
EA017966B1 (ru) 2013-04-30
EA039167B1 (ru) 2021-12-13
CN103853916B (zh) 2018-07-27
KR20160113145A (ko) 2016-09-28
US11725245B2 (en) 2023-08-15
HK1177768A1 (zh) 2013-08-30
CA3176319A1 (en) 2009-01-29
EA201600280A1 (ru) 2016-07-29
JP2017148073A (ja) 2017-08-31
CN101971178A (zh) 2011-02-09
SI2183693T1 (sl) 2014-02-28
JP2022103371A (ja) 2022-07-07
EP2183693B2 (en) 2018-11-14
PT2183693E (pt) 2014-01-14
EP2557520B1 (en) 2021-04-07
EP3745405A1 (en) 2020-12-02
JP6695392B2 (ja) 2020-05-20
CY1124357T1 (el) 2022-07-22
KR102147626B1 (ko) 2020-08-24
KR102076438B1 (ko) 2020-02-11
ES2441807T5 (es) 2019-04-25
CA3009992C (en) 2021-10-19
EP2557517B1 (en) 2022-10-26
CN101849236A (zh) 2010-09-29
US20140045181A1 (en) 2014-02-13
CA2900927C (en) 2018-08-14
CA2693081A1 (en) 2009-01-29
JP2023178477A (ja) 2023-12-14
HUE061020T2 (hu) 2023-05-28
EP2557518B1 (en) 2017-03-15
DK2183693T4 (en) 2019-02-11
EP4134960A1 (en) 2023-02-15
HK1182195A1 (zh) 2013-11-22
KR102222378B1 (ko) 2021-03-04
KR102197512B1 (ko) 2021-01-04
MX346069B (es) 2017-03-06
EP3656870A1 (en) 2020-05-27
KR20160113147A (ko) 2016-09-28
HRP20160493T1 (hr) 2016-07-15
LT2557520T (lt) 2021-05-25
CN106834474A (zh) 2017-06-13
DK2527471T3 (da) 2020-05-18
CY1114773T1 (el) 2016-12-14
CN106886688B (zh) 2020-07-10
CA3076142A1 (en) 2009-01-29
HK1199067A1 (en) 2015-06-19
CA2694007C (en) 2019-02-26
SI2557520T1 (sl) 2021-08-31
HUE054639T2 (hu) 2021-09-28
EP2557520A2 (en) 2013-02-13
CA3076159A1 (en) 2009-01-29
KR20210028263A (ko) 2021-03-11
EP2183693A1 (en) 2010-05-12
KR20180100713A (ko) 2018-09-11
ZA201000524B (en) 2011-03-30
CA3029497C (en) 2023-08-08
CA3200589A1 (en) 2009-01-29
EP2527471A2 (en) 2012-11-28
CA3029497A1 (en) 2009-01-29
ES2869347T3 (es) 2021-10-25
EP2514842A3 (en) 2012-12-26
AU2008278843A1 (en) 2009-01-29
KR102060911B1 (ko) 2019-12-30
JP7081829B2 (ja) 2022-06-07
HRP20210983T1 (hr) 2021-09-17
US20140256559A1 (en) 2014-09-11
CA3009992A1 (en) 2009-01-29
KR20170127073A (ko) 2017-11-20
JP2020115887A (ja) 2020-08-06
KR20210130269A (ko) 2021-10-29
KR101829564B1 (ko) 2018-02-14
CA2694007A1 (en) 2009-01-29
PL2514842T3 (pl) 2016-08-31
KR20100075826A (ko) 2010-07-05
CN103902809A (zh) 2014-07-02
DK2557517T3 (da) 2022-11-28
US20140256560A1 (en) 2014-09-11
HRP20140009T1 (hr) 2014-03-14
EA201791612A3 (ru) 2018-03-30
EA202192446A1 (ru) 2022-01-31
LT2557517T (lt) 2023-01-10
KR101916456B1 (ko) 2018-11-07
BRPI0814670A2 (pt) 2015-02-18
KR20180121695A (ko) 2018-11-07
EA035451B1 (ru) 2020-06-18
EA201791612A2 (ru) 2017-11-30
ES2441807T3 (es) 2014-02-06
KR101896167B1 (ko) 2018-09-07
KR20200055151A (ko) 2020-05-20
EA201300072A1 (ru) 2014-11-28
US20090029377A1 (en) 2009-01-29
JP2020031663A (ja) 2020-03-05
KR102339760B1 (ko) 2021-12-14
KR20100058503A (ko) 2010-06-03
NZ600407A (en) 2013-12-20
US20140329696A1 (en) 2014-11-06
JP7381116B2 (ja) 2023-11-15
KR102112438B1 (ko) 2020-06-04
CN103849684A (zh) 2014-06-11
US10208348B2 (en) 2019-02-19
AU2008278839B2 (en) 2013-04-04
CN106834481A (zh) 2017-06-13
SG183062A1 (en) 2012-08-30
US8706422B2 (en) 2014-04-22
PL2183693T5 (pl) 2019-04-30
EP2527471A3 (en) 2012-12-26
EP2557519A2 (en) 2013-02-13
US8972202B2 (en) 2015-03-03
JP6383837B2 (ja) 2018-08-29
KR20160113148A (ko) 2016-09-28
CN106834474B (zh) 2019-09-24
EA028642B1 (ru) 2017-12-29
CN106676188A (zh) 2017-05-17
SI2514842T1 (sl) 2016-06-30
KR20190143494A (ko) 2019-12-30
IL233261A0 (en) 2014-08-31
PL2183693T4 (pl) 2015-11-30
SI2183693T2 (sl) 2019-02-28
EP2557520A3 (en) 2015-04-29
HK1144024A1 (en) 2011-01-21
KR101966262B1 (ko) 2019-04-08
KR20190114039A (ko) 2019-10-08
JP2022040312A (ja) 2022-03-10
KR20160030404A (ko) 2016-03-17
KR102516709B1 (ko) 2023-04-03
KR101829565B1 (ko) 2018-03-29
US9051616B2 (en) 2015-06-09
WO2009013492A1 (en) 2009-01-29
CN101971178B (zh) 2014-03-26
JP2010534069A (ja) 2010-11-04
EP3067807A1 (en) 2016-09-14
DK2514842T3 (en) 2016-05-30
US20230323462A1 (en) 2023-10-12
PL2557520T3 (pl) 2021-10-11
DK2183693T3 (da) 2014-01-20
JP2024056078A (ja) 2024-04-19
KR20190114041A (ko) 2019-10-08
JP2015142588A (ja) 2015-08-06
CN106886688A (zh) 2017-06-23
WO2009013496A1 (en) 2009-01-29
KR101972994B1 (ko) 2019-04-29
JP5519500B2 (ja) 2014-06-11
CA3076159C (en) 2022-05-24
EP2557519B1 (en) 2020-08-19
KR102128960B1 (ko) 2020-07-02
SI2557517T1 (sl) 2023-03-31
PL2557517T3 (pl) 2023-03-06
HRP20140009T4 (hr) 2019-03-08
EP2183692B1 (en) 2017-08-23
CA2900927A1 (en) 2009-01-29
US20200056242A1 (en) 2020-02-20
CA3127930A1 (en) 2009-01-29
CN107083425A (zh) 2017-08-22
JP2019013245A (ja) 2019-01-31
EP2183693B1 (en) 2014-01-01
EP3540739A1 (en) 2019-09-18
HK1224033A1 (zh) 2017-08-11
KR20230117256A (ko) 2023-08-07
EA201201551A1 (ru) 2013-08-30
KR20220127377A (ko) 2022-09-19
KR20160113146A (ko) 2016-09-28
MX341573B (es) 2016-08-25
BRPI0814670B1 (pt) 2019-10-01
ES2820866T3 (es) 2021-04-22
JP5736170B2 (ja) 2015-06-17
KR20220146689A (ko) 2022-11-01
EP2557518A2 (en) 2013-02-13
PT2557520T (pt) 2021-05-06
FI2557517T3 (fi) 2022-11-30
EP2527471B1 (en) 2020-03-04
CY1117525T1 (el) 2017-04-26
US20090087847A1 (en) 2009-04-02
JP2019000113A (ja) 2019-01-10
KR101646978B1 (ko) 2016-08-09
EP2557518A3 (en) 2014-10-08
KR102458210B1 (ko) 2022-10-24
DK2557519T3 (da) 2020-09-21
KR20230047215A (ko) 2023-04-06
EP2557517A2 (en) 2013-02-13
CN107083424A (zh) 2017-08-22
US20140329695A1 (en) 2014-11-06
BRPI0814670B8 (pt) 2021-07-27
JP2022173465A (ja) 2022-11-18
EA035451B9 (ru) 2020-09-09
DK2557520T3 (da) 2021-05-31
JP2014073134A (ja) 2014-04-24
KR20200100860A (ko) 2020-08-26
KR20210006468A (ko) 2021-01-18
ES2571738T3 (es) 2016-05-26
JP2020031664A (ja) 2020-03-05
KR102561664B1 (ko) 2023-07-28
KR20180114251A (ko) 2018-10-17
PL2183693T3 (pl) 2014-03-31
MX2010000846A (es) 2010-04-21
PT2557517T (pt) 2023-01-04
HUE030510T2 (hu) 2017-05-29
AU2008278839A1 (en) 2009-01-29
EP3770275A1 (en) 2021-01-27
CA2693081C (en) 2016-01-26
JP7026303B2 (ja) 2022-02-28
IL203311A (en) 2014-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2792802T3 (es) Diagnóstico de cáncer utilizando la secuenciación genómica
US10619214B2 (en) Detecting genetic aberrations associated with cancer using genomic sequencing
AU2013203077B2 (en) Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
AU2013200581B2 (en) Diagnosing cancer using genomic sequencing
AU2008278843B2 (en) Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing