JP2019013245A - 核酸配列の不均衡性の決定 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IMBALANCE」と題された、2007年7月23日に出願された米国仮出願第60/951438号(代理人整理番号016285−005200US)からの優先権を主張し、そして当該仮出願の正規の出願であり、当該仮出願の全ての内容は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
本出願はまた、「DIAGNOSING FETAL CHROMOSOMAL ANEUPLOIDY USING GENOMIC SEQUENCING,」と題された、同時に出願された正規の出願(代理人整理番号016285−005220US)に関し、そしてその全ての内容は全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般的には、異なる核酸配列間における不均衡を決定することによる、遺伝子型及び疾患の診断的検査に関し、そしてより詳細には、母体血液試料の検査を通じての、胎児のダウン症候群、他の染色体の異数性、突然変異、及び遺伝子型に関する。また、本発明は、癌の検出、移植のモニタリング、及び感染性疾患のモニタリングに関する。
本発明の態様は、生体試料中に核酸配列の不均衡(例えば、対立遺伝子の不均衡、突然変異の不均衡、又は染色体の不均衡)が存在するか否かを決定する方法、システム、及び装置を提供する。例えば2つの配列(又は二つのセットの配列)の量の比率等の、不均衡を決定する1つ以上のカットオフ値が選択される。
生体試料内の核酸配列中の不均衡の存否を決定する方法であり、該方法は;
複数の反応からデータを取得し、ここで、該データが、
(1)臨床関連核酸配列の第一の量を示す第一のセットの定量データ;及び
(2)臨床関連核酸配列ではない基準核酸配列の第二の量を示す第二のセットの定量データ;
を含み;
該二つのセットのデータからパラメーターを決定し;
複数の反応それぞれにおける参照核酸配列の平均濃度から第一のカットオフ値を導き出し、ここで、該参照核酸配列は、臨床関連核酸配列又は基準核酸配列のいずれかであり;
該パラメーターと該第一のカットオフ値とを比較し;続いて、
該比較に基づき、核酸配列に不均衡が存在するか否かの分類を決定する;
ことを含む。
生体試料内の核酸配列中の不均衡の存否を決定する方法であり、該方法は;
複数の反応からデータを取得し、ここで、該データが、
(1)臨床関連核酸配列の第一の量を示す第一のセットの定量データ;及び
(2)臨床関連核酸配列ではない基準核酸配列の第二の量を示す第二のセットの定量データ;
を含み、ここで、該臨床関連核酸配列及び該基準核酸配列が、第一の種類の細胞及び1つ以上の第二の種類の細胞に由来し;
該二つのセットのデータからパラメーターを決定し;
生体試料中の第一の種類の細胞に由来する核酸配列の量の測定に由来する第一のパーセンテージから第一のカットオフ値を導き出し;
該パラメーターと該カットオフ値とを比較し;続いて、
該比較に基づき、核酸配列に不均衡が存在するか否かの分類を決定する;
ことを含む。
本明細書において使用される用語「生体試料」は、対象(例えば、妊娠女性のようなヒト)から採取される任意の試料のことであり、そして1つ以上の目的の核酸分子を含む。
本発明は、生体試料中に存在する、臨床関連核酸配列の量が、他の非臨床関連核酸配列との関連で、参照(例えば正常体)と比較して増大したか又は減少したか(例えば、染色体又は対立遺伝子の不均衡)を判定する方法、システム、及び装置を提供する。参照量と比較して、例えば2つの配列の量の比率等に関して変化が存在する(即ち不均衡)か否かを判定するために、1つ以上のカットオフ値が決定される。参照量において検出される変化は、臨床関連核酸配列と、他の非臨床関連配列との関係における任意の偏差(上向きまたは下向き)であり得る。したがって、基準状態は、任意の比または他の量(例えば1−1対応以外)であり得、そして変化を示す測定された状態は、一つ以上のカットオフ値によって決定される基準量とは異なる任意の比または他の量であり得る。
A.概要
デジタルPCRは、DNA試料において2つの対立遺伝子における存在比の非対称性を検出することができる。例えば、腫瘍DNA試料におけるヘテロ接合性の消失(LOH)の検出の使用されている。DNA試料中に2つの対立遺伝子A及びGが存在しているとする。そして、対立遺伝子Aが、LOH細胞において消失し得るとする。LOHが腫瘍試料中の細胞の50%の発生するとき、該DNA試料における対立遺伝子比G:Aは、2:1となり得る。しかしながら、腫瘍試料でLOHが発生しない場合、対立遺伝子比G:Aは、1:1となり得る。
本発明の一つの態様において、妊婦血漿から胎児のダウン症候群を検出するために、デジタルSNPが使用される。胎児/胎盤細胞に特異的なマーカーを使用して、第21番染色体中の対立遺伝子の比率が測定され得る。例えば、観察されたPLAC4対立遺伝子の過剰出現の度合が統計的に有意か否かを決定するために、SPRTが使用される。
デジタルRNA-SNPの短所は、解析されるSNPにおいてヘテロ接合性である場合に限り適用され得ることである。循環性胎児核酸解析に基づく、胎児トリソミー21又は他の胎児染色体異数性(例えば、トリソミー18、13、及び性染色体異数性等)用の非侵襲性検査が、遺伝的多形の使用と独立しているのが理想的であり得る点が改善点である。従って、一つの態様において、参照染色体(本文中では、第1番染色体と称する)上に位置する遺伝子座に対する非多型第21番染色体遺伝子座のデジタルPCR解析により、染色体量が決定される。第21番染色体と第1番染色体との比率は、正倍数体胎児のゲノムにおいては2:2であるが、トリソミー21の場合、これが変化する。トリソミー21検出用デジタルPCR解析において、比較されるべき2つの仮説は、染色体不均衡が存在しない(即ちトリソミー21が検出されない)帰無仮説、及び染色体不均衡が存在する(即ちトリソミー21が検出される)対立仮説であり得る。
上記方法200及び205の態様の短所は、胎児特異的なマーカーが必要なことである。従って、本発明の1つの態様において、非胎児特異的マーカーが使用される。そのような非胎児特異的マーカーを使用するために、本発明の態様は、母体血漿(即ち生体試料)中の胎児DNAの分別濃度(fractional concentration)を測定する。この情報を用いて、後述のように、Prのより有用な数値が計算される。
従来の方法(例えば、上記Zhou, W. et al. 2002を参照されたい)のもう一つの短所は、鋳型の濃度を、1ウェルに1個となるようにする必要があることである。正確な濃度を求めるのが困難である場合、これは誤差を生じる場合がある。更に、ウェルあたり鋳型1個となるように正確な濃度に調整しても、従来の方法、即ち古いアルゴリズムでは、対立仮説を許容するために予想されたPr値は、対立遺伝子の比率であり、ウェルあたりの平均の鋳型濃度から独立している。
図5は、本発明の一つの態様における、平均鋳型濃度を使用した、病態判定方法500を示す。工程510において、異なる複数の配列の量が測定される。これは、例えば、上記の如く、デジタルPCR実験においてマーカーを計数すること等によりなされ得る。しかしながら、本方法は、増幅工程を含まない、又は蛍光マーカーを使用せず、質量等の物理的特性、特定の光学的特性、又は塩基対特性等の他の特性を使用することが出来る他の方法によりなされ得る。
工程530からウェルあたりの平均濃度が知られれば、工程540において、その配列を示すウェルの予想される個数が計算される。この量は、%、少数値、又は整数値で表現され得る。説明のため、参照鋳型配列の平均濃度(mr)が0.5であり、PLAC4 SNP、rs8130833におけるトリソミー21の胎児の遺伝子型はAGGとする。故に、参照鋳型は対立遺伝子Aとし、過剰出現鋳型は対立遺伝子Gとする。
予想量が計算された後、過剰出現核酸配列の割合が決定され得る。ウェルに充填された対立遺伝子A及びBは独立であると仮定すると、両方の対立遺伝子を含有するウェルの確率は、0.3935x0.6321=0.2487となる、よって、約25%のウェルが、両方の対立遺伝子を含有すると予想される。
SPRTを使用する態様において、El Karoui at al. (2006)のSPRT曲線の境界の上端及び下端を計算するための方程式を使用し得る。更に、帰無仮説又は対立仮説を許容するために好ましい統計的信頼性のレベルは、それらの方程式の閾値尤度比(threshold likelihood ratio)を調整することにより変化し得る。本文中、閾値尤度比は8とする。なぜなら、この値は、癌検出において、対立遺伝子の不均衡の有無で試料を峻別するのに良好な成績を提供することが示されているからである。故に、一つの態様において、SPRT曲線の境界の上端及び下端を計算するための方程式は:
境界上端=[(ln8)/n-lnδ]/lnγ
境界下端=[(ln1/8)/n-lnδ]/lnγ
で表され、式中、
δ=-(1-θ1)/(1-θ0)
γ=-(θ1(1-θ0)/θ0(1-θ1)
θ0=帰無仮説が真であるときの非参照対立遺伝子を含む情報的ウェルの割合=0.5(下記参照)
θ1=対立仮説が真であるときの、非参照(即ち過剰出現)対立遺伝子を含む情報的ウェルの割合
N=情報的ウェルの個数=いずれか1つの対立遺伝子のみが陽性であるウェルの個数
で表される。ここで、lnは、自然対数、即ちlogeを表す数学記号である。
mrの測定は、当業者に知られる、又は今後知られ得る様々なメカニズムを通じて実行され得る。一つの態様において、mrの値は、デジタルPCR解析の実験プロセスの間に決定される。mrの値と参照対立遺伝子が陽性であるウェルの総数との間の関係は分布(例えばポアソン分布)により支配されるので、mrは、参照対立遺伝子が陽性であるウェルの個数から計算され得て、ここで、mr=-ln(1-参照対立遺伝子が陽性であるウェルの割合)の計算式が使用される。ここで、lnは、自然対数、即ちlogeを表す数学記号である。このアプローチは、デジタルPCR実験に使用されるDNA試料におけるmrの直接的かつ正確な見積もりを提供する。
平均濃度を使用するデジタルRCDは、上記デジタルSNP法と同様の方式で実行され得る。参照染色体(第21番染色体ではない)マーカー、第21番染色体マーカー、及びそれら両マーカーが陽性であるウェルの個数が、デジタルPCRにより決定され得る。ウェルあたりの参照マーカーの平均濃度(mr)は、デジタルSNP解析におけるmrの計算の場合と同じく、ポアソン分布の関数に従い、第21番染色体マーカーの陽性と無関係に、参照マーカーが陰性であるウェルの総数から計算される。
1.異なるmrの比較
対立遺伝子又は染色体の不均衡を理論的(胎児ゲノム中の如く)に導き出した場合と実験的に予想した場合との間の程度の違いの基準、及びその後者の場合のmr値を決定する計算を、表600及び表700に示す。トリソミー21試料のデジタルRNA-SNP解析において、mr=0.5のとき、参照対立遺伝子のみを含むウェルに対する、過剰出現対立遺伝子のみを含むウェルの比率、即ちデジタルRNA-SNP比率は、2.65となる(表600)。100%胎児検体からなる検体のデジタルRCD解析において、mr=0.5のとき、第1番染色体遺伝子座のみが陽性であるウェルに対する、第1番染色体遺伝子座のみが陽性であるウェルの比率、即ちデジタルRCD比率は、0.63/(1-0.63)=1.7).となる。分別胎児DNA濃度が低下すると、mrが同一となるまでデジタルRCD比率も低下する(表700)
上に考察したように、デジタルPCR実験のための対立遺伝子又は染色体の不均衡の予想される程度は、反応混合物(例えばウェル)あたりの実際の鋳型濃度に依存する。発明者らは、参照対立遺伝子に基づく鋳型濃度、即ちウェルあたりの平均参照鋳型濃度(mr)を記載する。上記公式に示されるように、予想されるPrは、上方及び下方のSPTR曲線を描画するのに使用され得る。同じく、予想されるPrは、mrの値に依存し、SPRT曲線の描画は、本質的に、mrの値に依存し得る。よって、実際には、特定の実験から得られたPrを解釈するのに、デジタルPCRデータセットの実際のmrに関連するSPRT曲線のセットを使用する必要があろう。
図9Aは、96ウェルデジタルRNA-SNP解析における正倍数体及びトリソミー21の検体を分類するための、新旧のSPRTアルゴリズムの有効性を比較する、表900を示す。図9Bは、384ウェルデジタルRNA-SNP解析における正倍数体及びトリソミー21の検体を分類するための、新旧のSPRTアルゴリズムの有効性を比較する、表950を示す。新しいアルゴリズムは、デジタルPCRデータから導き出されたmrに対して特異的なSPRT曲線を選択することを意味する。古いアルゴリズムは、全てのデジタルPCR反応に対して固定されたセットのSPRT曲線を使用することを意味する。分級精度におけるカットオフ値の計算が不正確であることの効果は、表900に示すシミュレーション解析により明らかにされる。
上記のように、本発明の態様を母体血漿から抽出したDNAに応用することは、妊娠11週〜17週の、母体血漿中の胎児DNAの分別濃度が約3%という僅かな割合でしか存在しないとき、複雑なものとなり得る。しかしながら、本明細書中に記載されるように、デジタルRCDは、異数性DNAが少数集団として存在するときであっても、異数性検出を可能とする。妊娠初期の如く胎児DNAの分別濃度が低いものほど、デジタルRCDにより多数の情報的カウントが必要となる。本研究の重要性は、図12の表1200に要約したように、発明者らが、診断的実験の基礎となる、例えば分別胎児DNA及び全鋳型分子等のベンチマークパラメーターのセットを提供したことである。発明者らの見解では、分別胎児DNA濃度が25%のとき、総数で7680の反応が、ベンチマークパラメーターの特に魅力的なセットである。これらのパラメーターによれば、表1200に示すように、分別胎児DNA濃度が25%のとき、正倍数体及びトリソミー21試料を、97%の正確性で分類することが可能となる。
I.コンピューターシミュレーション
SPRTアプローチを使用してのトリソミー21診断の精度を見積もるために、コンピューターシミュレーションを実行した。このコンピューターシミュレーションは、Microsoft Excel 2003ソフトウェア(Microsoft Corp., USA)及びSAS 9.1 for Windows(登録商標)ソフトウェア(SAS Institute Inc., NC, USA)を用いて行われた。デジタルPCRの性能は、参照鋳型濃度(mr)、情報的カウントの個数と、対立遺伝子又は染色体の不均衡の推定される程度(Pr)との間の相互作用である。これらの変数を各々、様々に変化させてシミュレーションを実行した。デジタルRNA-SNPとデジタルRCDとでSPRT曲線の決定境界が異なるため、それら2つのシミュレーション解析は別個に実行された。
デジタルRNA-SNPにおいて、mr=0.1〜mr=2.0である384ウェル実験のシミュレーションを実行した。各mr値で、発明者らは、正倍数体胎児5000人及びトリソミー21胎児5000人を試験したというシナリオを想定した。10000人の胎児を分類するために、所定のmrに適したSPRT曲線を使用した。図10は、本発明の態様における所定の情報的カウントにより、正倍数体又は異数体として正しく及び誤って分類された、並びに分類不能であった胎児のパーセンテージを示す、表1000である。mrが0.5〜2.0の場合、性倍数体と異数体の診断の正確性は、いずれも100%である。mr=0.5のとき、384ウェルの解析後に正確に分類できた性倍数体及びトリソミー21胎児は、それぞれ僅か57%及び88%である。
a.対立遺伝子A及びGのいずれも陰性
b.対立遺伝子A及びGのいずれも陽性
c.対立遺伝子Aは陽性であるがGは陰性
d.対立遺伝子Gは陽性であるがAは陰性
図11は、本発明の一つの態様における、mrが0.1〜2.0の範囲で、純粋(100%)な胎児DNA試料についてなされるデジタルRCDのコンピューターシミュレーションを示す、表1100である。分別胎児DNA濃度が低下するに従い、第21番染色体の過剰出現の度合は低下し、それにより疾患分類を確定するのにより多数の情報的ウェルが必要となる。故に、シミュレーションは、mr=0.5で、384〜7680ウェルのウェル総数の範囲において、50%、25%、及び10%の胎児DNA濃度において、更に実行された。
A.PLAC4用RNA-SNP
第21番染色体上のPLAC4のrs8130833 SNP(Lo, YMD et al. 2007 Nat Med 13, 218-223)を使用して、デジタルRNA-SNPの実際の実行可能性を実証した。2つの正倍数体及び2つのトリソミー21ヘテロ接合体の胎盤に由来する胎盤DNA及びRNAを解析した。これらの胎盤DNA試料を、デジタルRNA-SNPプロトコールを用いて分析したが、逆転写工程を省略したので、本質的には、その手順を、デジタルDNA-SNP解析に転換したものであった。検体を正しく分類する可能性と情報的ウェルの割合との間のバランスを取るために、発明者らは、ウェルあたり任意の種類の対立遺伝子が1個入るように試料を希釈し、そしてそれを96ウェルデジタルPCR解析により検証した。これは、384ウェルデジタルRNA-SNP実験により追認された。Pr及びmrが計算され、このmrに対するSPRT曲線が、データ解釈に使用された。
また、トリソミー21を検出するためのデジタルRCDの実際の実行可能性は、第21番染色体及び第1番染色体上のパラロガス配列を標的にするPCRアッセイを使用して調査された。パラロガス遺伝子座は、実施例の方法により、ここで使用された。第21番染色体上の非パラロガス配列、及び他の任意の参照配列も、RCDに使用され得る。2つの正倍数体及び2つのトリソミー21胎盤に由来する胎盤DNA試料を、いずれかの染色体由来の標的鋳型がウェルあたりに約1個入る濃度に希釈し、それを、96ウェルデジタルPCR解析により確認した。確認された各試料を、384ウェルデジタルRCD実験で解析し、そしてPr及びmrの値を計算した。デジタルRCDにおいて、第1番染色体のパラログが、参照鋳型であった。このmr値を、データ解釈のための対応するセットのSPRT曲線の選択に使用した。図14Aに示されるように、全ての胎盤試料が正しく分類された。
A.デジタルRNA-SNP
全てのRNA試料は、まず、ThermoScript逆転写逆転写酵素(Invitrogen)を使用して、遺伝子特異的逆転写プライマーを用いて逆転写された。逆転写プライマーの配列は、5'-AGTATATAGAACCATGTTTAGGCCAGA-3'(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)であった。以後、デジタルRNA-SNPのための逆転写されたRNA(即ちcDNA)試料とDNA試料(例えば胎盤DNA)とは、本質的に同じ処理がされる。デジタルDNA解析に先立ち、DNA及びcDNA試料は、まず、PLAC4に付いてのリアルタイムPCRアッセイを使用して定量された。ここで、プライマーとして、5'-CCGCTAGGGTGTCTTTTAAGC-3'、5'-GTGTTGCAATACAAAATGAGTTTCT-3'、及び蛍光プローブとして、5'-(FAM)ATTGGAGCAAATTC(MGBNFQ)-3'が用いられた(Applied Biosystems, Foster City, CA)。なお、FAMは、6-カルボキシフルオレセインであり、MGBNFQは、無蛍光クエンチャーが結合するマイナーグルーブである。
本研究で使用された全ての胎盤及び母体軟膜のDNA試料は、まずNanoDrop分光光度計(NanoDrop Technology, Wilmington, DE)により定量された。DNA濃度は、6.6pg/細胞の転換を使用して、コピー/mlに転換される。ウェルあたり約1個の鋳型が入る濃度に相当するDNA濃度は、DNA試料の連続希釈により決定され、そして96ウェルフォーマットのリアルタイムPCRで、約37%のウェルが増幅において陽性であることにより確認された。確認プレート用のPCRは、参照染色体のプローブのみが添加される点を除いて、下記と同様に準備された。デジタルRCD解析において、第21番及び第1番染色体上のパラロガス遺伝子座(Deutsch, S. et al. 2004 J Med Genet 41, 908-915)を、最初に、順プライマー5'-GTTGTTCTGCAAAAAACCTTCGA-3'及び逆プライマー5'-CTTGGCCAGAAATACTTCATTACCATAT-3'により、同時に増幅させる。2つの染色体特異的TaqManプローブは、第21番及び第1番染色体パラログを標的にするように設計されており、それらの配列は、それぞれ、5'-(FAM)TACCTCCATAATGAGTAA A(MGBNFQ)-3'及び5'-(VIC)CGTACCTCTGTAATGTGTAA(MGBNFQ)-3'である。各反応は、1xTaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、各プライマー450nM、及び各プローブ125nMを含んでいた。反応体積の合計は、5μL/ウェルであった。この反応は、50℃2分で始まり、そして95℃10分、更に50サイクルの95℃15秒及び60℃1分が続く。リアルタイムPCR実験は全て、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)で遂行され、蛍光データは、SDS 2.2.2ソフトウェア(Applied Biosystems)の「Absolute Quantification」アプリケーションで収集した。既定の基準値及び手入力の閾値が使用された。第21番又は第1番のいずれかの染色体が陽性であるウェルの個数が記録され、そしてSPRT解析の用に供された。SPRTにより疾患分類が可能となるまでに、1枚以上の384ウェルプレートが解析されるべきである。
A.デジタルRNA-SNP
本実施例は、マイクロ流体工学に基づくデジタルPCRを使用した、デジタルPCR解析の性能を明示する。本章には、ここに示される一つの方法はFluidigm BioMark(商標)システムを使用するが、これは例示を目的としており、限定を目的とするものではない。このシステムは、1回の反応で9000個以上のデジタルPCRを実行することが可能である。
本実施例において、第18番染色体中胎盤で発現する転写産物である、セルピンプロテアーゼ阻害剤クレードB(オボアルブミン)メンバー2(SERPINB2)mRNAに関する、デジタルPCRに基づく対立遺伝子区別アッセイを使用して、トリソミー18胎児の多型対立遺伝子の比率の不均衡を検出した。胎盤組織試料からのDNA及びRNAの抽出は、QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、取扱説明書に従い遂行された。抽出されたRNA試料は、ゲノムDNAのコンタミネーションを排除するために、DNA分解酵素I(Invitrogen)処理に付された。SERPINB2遺伝子上のrs6098 SNPのジェノタイピングは、上記のように、MassARRAY Compact(Sequenom, San Diego)を使用した均質MassEXTEND (hME)アッセイで、胎盤組織DNA試料において遂行された。
本実施例は、マイクロ流体工学に基づくデジタルPCRを使用するデジタルRCD解析の効率を明示する。Fluidigm BioMark(商標)Systemを使用するこのアプローチの一種がここに記載されるが、これは例示を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。このシステムは、1回の反応でデジタルPCRを9000回以上実行することが出来る。
単位体積の母体血漿あたりに存在する血漿DNA分子の数は限られている(Lo YMD. et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-7758)。例えば、妊娠早期において、常染色体遺伝子座、β-グロビン遺伝子の中間母体血漿濃度は、母子両方由来のものを合わせても、986コピー/mlであることが示されている(Lo YMD. et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-7758)。7680分子を確保するためには、約8mlの母体血漿からDNAを抽出することが必要な場合がある。この血漿の体積は、約15mlの母体血液から取得される量であり、この量は日常的な実施の限界に近い。しかしながら、発明者らは、福数のセットのchr21及び参照染色体標的が、デジタルRCD解析に組み合わせられ得ることを想定する。5ペアのchr21及び参照染色体標的において、解析に必要な鋳型分子の個数を提供するのに必要となり得る母体血漿は、僅か1.6mlである。多重単一分子PCRが遂行され得る。この多重単一分子解析のロバストネスは、以前単一分子ハプロタイピングにおいて明示されている(Ding, C. and Cantor, CR. 2003 Proc Natl Acad Sci USA lW, 7449-7453)。
第21番及び第1番の染色体上の一対のパラロガス遺伝子座の121bp(各プライマー上の10bpを含む)のアンプリコンを、まず、順プライマー5'-ACGTTGGATGGTTGTTCTGCAAAAAACCTTCGA-3'及び逆プライマー5'-ACGTTGGATGCTTGGCCAGAAATACTTCATTACCATAT-3'により同時に増幅した。第21番染色体と第1番染色体との間の塩基の相異を標的にする延長プライマーが設計され、その配列は、
5'-CTCATCCTCACTTCGTACCTC-3'であった。
5'-ACAAAAGGGGGAAGAGG-3'であった。
第21番及び第1番染色体上のパラロガス遺伝子座は、順プライマー5'-ACGTTGGATGTTGATGAAGTCTCATCTCTACTTCG 3'及び逆プライマー5'-ACGTTGGATGCAATAAGCTTGGCCAGAAATACT-3'により同時に増幅され、81bpのアンプリコンが生じる。
第21番及び第7番染色体上のパラロガス遺伝子座は、順プライマー5'-ACGTTGGATGGAATTTAAGCTAAATCAGCCTGAACTG-3'及び逆プライマー5'-ACGTTGGATGGTTTCTCATAGTTCATCGTAGGCTTAT-3'により同時に増幅され、82bpのアンプリコンが生じる。
第21番及び第2番染色体上のパラロガス遺伝子座は、順プライマー5'-ACGTTGGATGTCAGGCAGGGTTCTATGCAG-3'及び逆プライマー5'-ACGTTGGATGAGGCGGCTTCCTGGCTCTT-3'により同時に増幅され、101bpのアンプリコンが生じる。
第21番及び第6番染色体上のパラロガス遺伝子座は、順プライマー5'-ACGTTGGATGGCTCGTCTCAGGCTCGTAGTT-3'及び逆プライマー5'-ACGTTGGATGTTTCTTCGAGCCCTTCTTGG-3'により同時に増幅され、102bpのアンプリコンが生じる。
各反応は、10x緩衝剤II(Applied Biosystems)、MgCl2、及び100nMの各プライマーを含んでいた。反応体積の合計は、5μL/ウェルであった。この反応は、95℃5分で始まり、そして45サイクルの95℃30秒、62℃30秒及び72℃30秒が続き、最後に72℃7分が追加された。公知のPCR増幅は全て、GeneAmp PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems)で遂行された。遊離ヌクレオチドは、シュリンプアルカリホスファターゼ(SAP)により不活性化された。各反応は、10xSAP緩衝剤(Sequenom)及びSAP酵素(Sequenom)を含むものであった。各PCRに、2μlのSAP混合物が添加された。このSAP反応物は、37℃で40分、及び85℃で5分インキュベートされた。SAP処理の後、iPLEX Gold kit (Sequenom)を使用して、PCR生産物のプライマー伸長反応が行われた。第21番及び第1番染色体上のパラロガス配列ミスマッチ(PSM)が、伸長プライマー5'-GTCTCATCTCTACTTCGTACCTC-3'により探索(interrogate)された。第21番及び第7番染色体上のPSMは、伸長プライマー5'-TTTTACGCTGTCCCCATTT-3'により探索された。第21番及び第2番染色体上のPSMは、伸長プライマー5'-GGTCTATGCAGGAGCCGAC-3'により探索された。第21番及び第6番染色体上のPSMは、伸長プライマー5'-TGGGCGCGGGAGCGGACTTCGCTGG-3'により探索された。各反応は、10xPLEX緩衝剤(Sequenom)、iPLEX停止混合物(Sequenom)、iPLEX酵素(Sequenom)及び343nMの各伸長プライマーを含むものであった。但し、第21番及び第6番染色体上のPSMに対する伸長プライマーは、1.3μMで使用した。2μlのiPLEX混合物が5μlのPCR線産物に添加された。このiPLEX反応は、200ショートサイクルプログラムに従いサイクル反応に付された(cycled)。要するに、前記試料は、まず94℃で35秒変性し、続いて52℃で5秒アニーリングし、そして80℃で5秒伸長した。アニーリング及び伸長サイクルは、5サイクルが4回以上反復され、それから94℃5秒の変性工程に戻り、その後、再び前記5サイクルのアニーリング及び伸長ループに戻された。前記5回のアニーリング及び伸長サイクル及び1回の変性工程が、合計40と成るように39回繰り返された。最後に、72℃で3分、伸長が行われた。iPLEX反応生産物は、16μlの水で希釈され、各PCRのために、6mgの樹脂で脱塩した。384ウェルを1600gで3分間遠心して、SpectroCHIP (Sequenom)に分注して、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-飛行時間(MALDI-TOF)質量分析MS Analysis (Sequenom)に付した。
ここで、発明者らは、デジタルエピジェネティック相対的染色体量(デジタルERCD)と称されるアプローチを紹介する。ERCDにおいて、染色体の異数性に関与する染色体(例えばトリソミー21における第21番染色体)及び参照染色体上に、胎児特異的DNAメチル化パターン又は他のエピジェネティックな変化を呈するエピジェネティックマーカーが、デジタルPCR解析に供される。正常な胎児を妊娠した妊婦から抽出した血漿DNA中の、第21番染色体エピジェネティックマーカーが陽性であるウェルの数と、参照染色体エピジェネティックマーカーが陽性であるウェルの数との比率は、参照範囲(reference range)を提供し得る。この比率は、胎児がトリソミー21を有すると増大するものと予想される。この解析において、1つ以上の第21番染色体マーカー及び1つ以上の参照染色体マーカーが使用され得ることは、当業者に明らかである。
ここで、発明者らは、核酸分子のデジタル読出しが、母体血漿中のトリソミー21等の胎児染色体異数性の検出に使用され得るというもう一つの例を記載する。胎児染色体の異数性は、染色体又は染色体領域の量が異常であることにより引き起こされる。誤診断を最少化するために、非侵襲的検査は、高い感受性及び特異性を有することが望ましい。しかしながら、胎児DNAは母体血漿及び血清中で絶対的に低濃度で存在し、全てのDNA中ごく一部を占めるに過ぎない。よって、特定の遺伝子座を標的とするデジタルPCRサンプリングの数は、同一の標本中で無限に増大させることは出来ない。故に、実行されるデジタルPCRサンプリングの数を増大させずに、1つの標本から取得され得るデータの量を増大させるのに、特異的な標的遺伝子座の複数のセットの解析が用いられ得る。
母体血漿中の胎児DNAは、母体血漿DNAの平均3〜6%を占める、胎児由来の少数の集団として存在する。そのため、当該技術分野の従来技術は、胎児が父親から受け継いで、母体血漿における大勢の母体DNAバックグラウンドから区別できるDNA標的の検出に焦点を当てていた。そのような従来検出されていた標的の例として、Y染色体上のSRF遺伝子(Lo YMD et al. 1998 Am J Hum Genet, 62, 768-775)、及び母親がRhD陰性であればRHD遺伝子(Lo YMD et al. 1998 N Engl J Med, 339, 1734- 1738)が挙げられる。
一つの態様において、本発明は、癌性腫瘍において生じ得る、対立遺伝子比率の歪みの有無で試料を分類するために実行され得る。一つの態様において、各検体における、対立遺伝子Aのみ、対立遺伝子Gのみ、及びそれらの対立遺伝子両方の陽性シグナルを有するウェルの数が、デジタルPCRにより決定された。参照配列は、陽性ウェルの数がより少ない対立遺伝子として定義された(万が一両対立遺伝子の陽性ウェル数が同一であった場合は、両方とも参照対立遺伝子として使用される)。ウェルあたりの参照対立遺伝子の推定平均濃度(mr)は、ポアソン確率密度関数に従い、他方の対立遺伝子が陽性か否かにかかわらず、参照対立遺伝子が陰性であるウェルの合計を使用して計算された。発明者らは、この計算を説明するため、一つの仮想的な例を使用する。
Claims (31)
- 生体試料内の核酸配列中の不均衡の存否を決定する方法であり、該方法が;
複数の反応からデータを取得し、ここで、該データが、
(1)臨床関連核酸配列の第一の量を示す第一のセットの定量データ;及び
(2)臨床関連核酸配列ではない基準核酸配列の第二の量を示す第二のセットの定量データ;
を含み;
該二つのセットのデータからパラメーターを決定し;
複数の反応それぞれにおける参照核酸配列の平均濃度から第一のカットオフ値を導き出し、ここで、該参照核酸配列は、臨床関連核酸配列又は基準核酸配列のいずれかであり;
該パラメーターと該第一のカットオフ値とを比較し;続いて、
該比較に基づき、核酸配列に不均衡が存在するか否かの分類を決定する;
ことを含む前記方法。 - 前記第一のセットのデータが、それぞれが反応中の臨床関連核酸配列の一部の存在を検出する1つ以上の第一のマーカーから取得され、更に、前記第二のセットのデータが、それぞれが反応中の基準核酸配列の一部の存在を検出する1つ以上の第二のマーカーから取得される、請求項1に記載の方法。
- 更に:
参照核酸配列のデータから得られた数値の入力を有する確率分布の逆数を使用した、複数の反応それぞれにおける参照核酸配列の平均濃度の決定
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記臨床関連核酸配列が21番染色体由来であり、そして前記基準核酸配列が21番染色体以外の染色体由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記臨床関連核酸配列が18番又は13番染色体由来であり、そして前記基準核酸配列が18番又は13番染色体以外の染色体由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記臨床関連核酸配列が遺伝的多形の一つの対立遺伝子であり、そして前記基準核酸配列が該遺伝的多形のもう一つの対立遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 前記臨床関連核酸配列が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子、ベータグロビン遺伝子、又はアルファグロビン遺伝子の突然変異コピーであり、前記基準核酸配列が、対応する遺伝子の野生型コピーである、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が、母体血漿又は血清である、請求項1に記載の方法。
- 前記反応が増幅反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記反応がデジタルPCRプロセスの一部である、請求項1に記載の方法。
- 前記反応がシークエンシング反応である、請求項1に記載の方法。
- 臨床関連核酸配列及び基準核酸配列の第一の部分が第一の個体に由来し、そして臨床関連核酸配列及び基準核酸配列の第二の部分が第二の個体に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記カットオフ値が、前記第一の部分の1つの測定値、又は前記第二の部分の1つの測定値に基づく、請求項12に記載の方法。
- 更に、前記パラメーターを第二のカットオフ値と比較することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分類が、病態(disease state)、非病態(non-disease state)、及び分類不能(non-classifiable)を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記分類が、ホモ接合、ヘテロ接合、及び分類不能を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記第二のカットオフ値が、非病態における第二の基準核酸配列の量に対する、第一の臨床関連核酸配列の量の比率に基づく、請求項14に記載の方法。
- 前記パラメーターが、第二の基準核酸配列の量に対する、第一の臨床関連核酸配列の量の比率に基づく、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のカットオフ値の計算が:逐次確率比の検定、誤検出比(false discovery rate)、信頼区間、及び受信者動作特性曲線(receiver operating characteristic curve)の少なくとも1つの使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 第一のカットオフ値の導出が:
過剰出現(overrepresented)核酸配列を含む情報的反応(informative reaction)の比率P1を決定し、ここで該核酸配列が前記参照又は非参照核酸配列のいずれかであり;そして
第一の比率P1から第一のカットオフ値を計算する
ことを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記比率P1の決定が:
少なくとも1つの過剰出現核酸配列を含む反応の第一の確率を決定し;
反応が情報的である第二の確率を計算し;そして
該第一及び第二の確率を使用して前記比率P1を計算する
ことを含む、請求項20に記載の方法。 - 前記第一の確率が、参照核酸配列の平均濃度に、非参照核酸配列に対する予測割合を乗算することにより決定される、請求項21に記載の方法。
- 前記第一の確率が、複数の反応のそれぞれにおける過剰出現核酸配列の平均濃度を有するポアソン分布をインプットとして使用して決定される、請求項21に記載の方法。
- 更に:
少なくとも1つの過剰出現核酸配列を含む反応の第三の確率を決定する
工程を含み、ここで、該反応が情報的である第二の確率の計算が、第一の確率と第二の確率とが独立であると仮定することを含む、請求項21に記載の方法。 - 生体試料内の核酸配列中の不均衡の存否を決定する方法であり、該方法が;
複数の反応からデータを取得し、ここで、該データが、
(1)臨床関連核酸配列の第一の量を示す第一のセットの定量データ;及び
(2)臨床関連核酸配列ではない基準核酸配列の第二の量を示す第二のセットの定量データ;
を含み、ここで、該臨床関連核酸配列及び該基準核酸配列が、第一の種類の細胞及び1種又は2種以上の第二の種類の細胞から取得されたものであり;
二つのセットのデータからパラメーターを決定し;
該生体試料中の該第一の種類の細胞から取得された核酸配列の量の測定により得られた第一のパーセンテージから第一のカットオフ値を導き出し;
該パラメーターと該第一のカットオフ値とを比較し;続いて、
該比較に基づき、核酸配列に不均衡が存在するか否かの分類を決定する;
ことを含む前記方法。 - 前記第一の種類の細胞が第一の生体に由来し、そして前記第二の細胞が第二の生体に由来する、請求項25に記載の方法。
- 第一のカットオフ値の導出が:
反応あたりの参照核酸配列の第一の平均濃度を決定することを含み、ここで、該参照核酸配列が、過小出現臨床関連核酸配列又は基準核酸配列であり;そして
前記第一のパーセンテージにより導き出された要素により、第一の平均濃度を増大させ、前記参照核酸配列ではない核酸配列の第二の平均濃度を取得する
ことを含む、前記方法。 - 更に:
参照核酸配列のデータから導きだした数値のインプットを有する確率分布の逆数を使用して、複数の反応それぞれにおける参照核酸配列の平均濃度を決定する
ことを含む、請求項27に記載の方法。 - 前記確率分布がポアソン分布である、請求項28に記載の方法。
- 定量的リアルタイムPCR、デジタルPCR、半定量競合PCR、真競合PCR、又は質量分析を使用して、胎児特異的マーカーの量を決定することにより前記パーセンテージが測定される、請求項25に記載の方法。
- コンピュータープログラム製品であり、生体試料中に核酸配列の不均衡が存在するか否かを決定する処理を実行する電子計算システムをコントロールする複数の指令がコードされた読取り可能な媒体を含み、該処理が:
複数の反応からデータを受信し、ここで該データが:
(1)臨床関連核酸配列の第一の量を示す第一のセットの定量データ;及び
(2)臨床関連核酸配列ではない基準核酸配列の第二の量を示す第二のセットの定量データ;
を含み;
該二つのセットのデータからパラメーターを決定し;
複数の反応それぞれにおける参照核酸配列の平均濃度から第一のカットオフ値を導き出し、ここで、該参照核酸配列は、臨床関連核酸配列又は基準核酸配列のいずれかであり;
該パラメーターと該第一のカットオフ値とを比較し;続いて、
該比較に基づき、核酸配列に不均衡が存在するか否かの分類を決定する;
ことを含む前記コンピュータープログラム製品。
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