KR102099151B1 - 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치 - Google Patents

마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치 Download PDF

Info

Publication number
KR102099151B1
KR102099151B1 KR1020180025808A KR20180025808A KR102099151B1 KR 102099151 B1 KR102099151 B1 KR 102099151B1 KR 1020180025808 A KR1020180025808 A KR 1020180025808A KR 20180025808 A KR20180025808 A KR 20180025808A KR 102099151 B1 KR102099151 B1 KR 102099151B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microwell array
dna
image
microwell
well
Prior art date
Application number
KR1020180025808A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190105363A (ko
Inventor
정봉근
이종민
크리스티안 다니엘 알버그
Original Assignee
서강대학교산학협력단
재단법인 바이오나노헬스가드연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서강대학교산학협력단, 재단법인 바이오나노헬스가드연구단 filed Critical 서강대학교산학협력단
Priority to KR1020180025808A priority Critical patent/KR102099151B1/ko
Publication of KR20190105363A publication Critical patent/KR20190105363A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102099151B1 publication Critical patent/KR102099151B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0663—Stretching or orienting elongated molecules or particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N2021/1765—Method using an image detector and processing of image signal

Abstract

마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법은, PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이를 제공하는 단계, 마이크로웰 어레이에 대한 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 단계, 2종류의 이미지를 이용하여 각각 웰에 대한 DNA를 포함한다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 단계, 및 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 단계를 구비한다.

Description

마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치 {METHOD AND APPARATUS OF ANALYZING DIGITAL POLYMERASE CHAIN REACTION USING MICROWELL ARRAY}
본 발명은 마이크로웰 어레이를 이용하여 DNA 증식을 분석하기 위한 dPCR 분석방법 및 분석장치에 관한 것이다.
마이크로웰 어레이 시스템에서 dPCR(Digital Polymerase Chain Reaction)에 대한 데이터를 추출하는 방법 중 하나로, 종래에는 고정된 위치를 갖는 마이크로웰 어레이를 사용할 수 있으며, 리포터 색소의 형광 데이터는 각 웰의 정해진 자리에서 추출될 수 있다.
하지만, 이것은 많은 문제를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 종래의 분석 알고리즘은 채워지지 않은 웰의 데이터를 추출할 수 있으며, 손상(damaged) 또는 불규칙한(irregular) 모양의 웰의 데이터를 추출할 수가 있다. 게다가 마이크로웰 어레이의 먼지 입자 등에 의해서 노이즈가 추출될 수 있으며, 이는 잘못된 웰 데이터의 추가 또는 감소의 원인이 될 수 있다.
다른 방법으로서 레퍼런스 색소 및 고정 위치를 갖는 마이크로웰 어레이를 사용할 수 있다. 웰의 위치가 정해진 위치 정보에서 추출되는 동안, 레퍼런스 색소는 웰의 채워짐 또는 충전을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 채워지지 않은 또는 부분적으로 채원진 웰들은 분석에서 제거될 수 있다.
그러나, 이전의 방법과 마찬가지로, 이 역시 이미징을 위해 마이크로웰 어레이의 정확한 위치 고정을 필요로 한다. 또한 먼지 입자, 균일하지 않게 채워진 웰들 및 불규칙한 웰 형상은 이 방법에서도 여전히 문제가 된다.
실시간 PCR 검출에 관한 것으로서, 한국등록특허 제10-1302353호가 개시되어 있다. 중합효소 연쇄 반응을 통해서 DNA 칩 내의 유전자 증폭을 형광신호로 실시간 검출한다는 내용을 개시하고 있다. 하지만, 이 역시 이미지 처리에 관한 자세한 내용을 제시하지 못하며, 먼지 입자, 균일하지 않게 채워진 웰들 및 불규칙한 웰 형상에 의한 해결책을 제시하지 않고 있다.
본 발명은 PCR 프로토콜을 거친 마이크로웰 어레이에서 DNA 증식 개수나 밀도를 용이하게 측정할 수 있는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치를 제공한다.
본 발명은 DNA 증식 개수나 밀도를 측정함에 있어 먼지 입자, 균일하지 않게 채워진 웰들 및 불규칙한 웰 형상에 의한 영향을 줄일 수 있는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치를 제공한다.
본 발명은 이미지 획득 후 일일이 카운팅하지 않아도 간단하면서도 정확하게 DNA 증식 개수나 밀도를 측정할 수 있는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치를 제공한다.
상술한 본 발명의 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법은, PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이를 제공하는 단계, 마이크로웰 어레이에 대한 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 단계, 2종류의 이미지를 이용하여 각각 웰에 대한 DNA를 포함한다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 단계, 및 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 단계를 구비한다.
적어도 2종류의 이미지를 획득하는 단계에서, 제1 필터를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제1 이미지를 획득하고, 동일한 위치에 대응하여 제2 필터를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제2 이미지를 획득할 수 있으며, 제1 개수 및 제2 개수를 산출하는 단계에서, 제1 이미지를 이용하여 제2 이미지를 표준화할 수 있다.
PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이에 사용된 용액에는 PCR 중합효소, 프라이머, 샘플 DNA, 레퍼런스 색소 및 리포터 색소가 포함될 수 있으며, 여기서 제1 필터는 레퍼런스 색소에 대응하는 필터이며, 제2 필터는 리포터 색소에 대응하는 필터가 될 수 있다.
제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 단계에서, 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하고, 제1 이미지에서 각 웰의 평균 레퍼런스 강도를 산출하며, 특정된 웰의 위치 정보를 이용하여 웰의 리포터 강도를 산출하고, 각각의 웰에 대해 리포터 강도를 평균 레퍼런스 강도로 나누어 웰의 표준화 비율을 산출할 수 있다. 여기서, 이미지의 강도라 함은, 이미지 내의 특정 영역 또는 픽셀의 밝기를 의미할 수 있다.
표준화 비율에 따라 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 산출할 수 있으며, 일 예로 프아송 통계를 이용하여 산출하는 것도 가능하다.
구체적으로, 표준화 비율에 따라 히스토그램을 작성하고, DNA을 포함하는 마이크로웰과 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰을 분류하기 위한 임계값을 결정함으로써 제1 개수와 제2 개수를 결정할 수 있다.
제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 산출하는 단계에서, 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하되, 허프(Hough) 변환을 이용하여 불규칙한 형상의 웰 및 먼지 노이즈는 제외한 이후에 웰의 위치를 특정할 수가 있다.
DNA의 개수 또는 밀도를 측정하는 단계에서, 다음 식에 따라 마이크로웰 당 평균 DNA 개수(λ)를 산출할 수 있으며, 여기서, λ는 마이크로웰 당 평균 DNA 개수, N1은 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수, 및 N2는 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수일 수 있다.
Figure 112018022075616-pat00001
또한, DNA의 개수 또는 밀도를 측정하는 단계에서, 다음 식에 따라 DNA의 전체 개수(Nobject)를 산출할 수 있으며, 여기서, Nwells 는 마이크로웰의 전체 개수일 수 있다.
Figure 112018022075616-pat00002
원본 이미지로부터 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 산출하는 단계에서, 제1 이미지로부터 마이크로웰의 좌표가 특정된 피팅 이미지를 획득하고, 피팅 이미지에서 각 마이크로웰이 위치한 영역의 광 강도를 비교하여, DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출할 수 있다.
상술한 본 발명의 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이의 이미지로부터 DNA 증식 개수 또는 밀도를 분석하는 dPCR 분석장치는, 다수의 웰이 형성된 마이크로웰 어레이로부터 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 카메라, 카메라로부터 획득된 2종류의 이미지를 이용하여 DNA를 포함한다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 마이크로웰 분류부, 및 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 산출부를 구비할 수 있다.
마이크로웰 분류부는, 제1 필터를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제1 이미지를 획득하고 동일한 위치에 대응하여 제2 필터를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제2 이미지를 획득하는 이미지 생성부, 제1 이미지를 이용하여 제2 이미지를 표준화하는 광 강도 비교부, 및 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 이미지 카운팅부를 포함할 수 있다.
본 발명의 분석에 따르면, 이미지 획득 후 일일이 카운팅하지 않아도 간단하면서도 정확하게 미세 입자의 DNA의 개수나 밀도를 측정할 수 있으며, 마이크로웰을 이용하여 시료를 웰 단위로 분리하고, 분리된 웰 단위로 특성화된 특징을 이용하여 DNA의 개수나 밀도를 측정할 수 있다.
이 방법에 따라 수십 배에 이르는 수의 밀도를 가진 DNA 증식의 밀도 또는 개수를 간단하면서도 정확하게 측정할 수 있다. 마이크로웰 어레이에 의하여 샘플을 웰 단위로 분할하며, 웰의 동일한 형상 및 규칙성을 통해 같은 광 강도를 제공하는 웰에 대해서는 동일한 웰로 처리할 수 있어, 동일한 웰을 중복으로 이미징하는 것을 방지할 수 있으며, 그에 따라 웰 전체를 분석하는 과정에서 처리속도를 더 향상시킬 수가 있다.
또한 응집체 형성의 영향은 측정 결과에 따라 감소할 수 있으며, 이러한 방법은 실험실에서 사용할 수 있는 장비로 수행할 수 있으며 수동 조작이 거의 필요하지 않다.
본 발명에 따른 분석 방법을 종래의 셀 카운팅 방법과 비교하여도, 분석 속도 및 분석량이 개선되는 동시에, 분석에 대한 퀄리티 및 정확도는 실질적으로 동일하게 유지될 수 있었다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 설명하기 위해 마이크로웰 어레이, 패널 및 마이크로웰을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 수행하기 위한 분석 장치를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 설명하기 위해 마이크로웰 어레이를 촬영한 원본 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법의 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 중 형광 현미경으로 관찰한 제1 이미지의 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 중 형광 현미경으로 관찰한 제2 이미지의 사진이다.
도 8은 본 발명의 효과를 설명하기 위해 표준화를 거치지 않고 제2 이미지의 리포터 강도만 이용하여 작성한 히스토그램이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법의 효과를 설명하기 위해 표준화를 거쳐 표준화 비율을 이용하여 작성한 히스토그램이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법에 따라 산출된 DNA 농도를 측정한 농도와 비교한 그래프이다.
이하 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 참고로, 본 설명에서 동일한 번호는 실질적으로 동일한 요소를 지칭하며, 이러한 규칙 하에서 다른 도면에 기재된 내용을 인용하여 설명할 수 있고, 당업자에게 자명하다고 판단되거나 반복되는 내용은 생략될 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 설명하기 위해 마이크로웰 어레이, 패널 및 마이크로웰을 도시한 도면이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 수행하기 위한 분석 장치를 도시한 도면이며, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법을 설명하기 위해 마이크로웰 어레이를 촬영한 원본 이미지이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법의 과정을 설명하기 위한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 실시예에 따른 마이크로웰 어레이(200)는 PDMS 소재를 이용하여 형성될 수 있으며, 소프트 리소그래피 공정을 통해서 제작될 수 있다.
우선, 마이크로웰 어레이(200)를 제작하기 위해, 오토캐드와 같은 설계프로그램을 사용하여 디자인을 만들고, 설계된 디자인을 투명 필름 마스크로 옮길 수 있다.
구체적으로, SU8-50을 실리콘 웨이퍼 위에 약 25㎛ 두께로 스핀 코팅하였다. 그 다음 디자인이 표현된 필름 마스크를 통해 자외선(UV)을 조사한 후 실리콘 마스터는 SU-8 현상액을 사용하여 완성될 수 있다. 그리고, PDMS를 실리콘 마스터에 붓고 약 85℃의 오븐에서 약 6~8시간 동안 경화시켰다. PDMS는 실리콘 마스터와 매스로 절단하여 분리된 개별 장치에서 조심스럽게 벗겨 냈다.
마이크로웰 어레이(200)는 PDMS의 소수성을 감소시키기 위해 약 1분 동안 산소 플라즈마에서 표면 처리될 수 있다.
본 실시예에서, 30 x 30 웰(220)들, 즉 900개의 웰(220)이 하나의 패널(210)을 형성하며, 하나의 마이크로웰 어레이(200)에는 패널(210)들이 6 x 6으로 배열되어 총 36개가 형성되어 있다. 여기서 하나의 웰의 부피는 약 1.257 * 10-5 μL를 갖도록 설계되었으며, 90개의 웰을 포함하는 하나의 패널의 부피(30 x 30 웰)는 약 0.1μL이고, 36개의 패널에 형성된 웰들의 총 부피는 약 3.6μL 정도가 된다.
그 다음 DNA 용액을 마이크로웰 어레이의 영역에 조심스럽게 분주할 수 있다. DNA 용액은 PCR 중합효소, 프라이머, 샘플 DNA, 레퍼런스 색소 및 리포터 색소가 포함된 버퍼 용액일 수 있다.
마이크로 웰 어레이를 유리 대물 슬라이드로 덮고, 본딩을 위해 약 85 ℃의 오븐에서 1 분간 처리할 수 있다. 기리고 기존의 PCR 프로토콜을 실시했으며, 마이크로 웰 어레이의 분석장치를 통해서 각 패널의 2 개의 이미지를 가지고 형광 현미경을 사용하여 배열을 이미지화할 수 있다.
도 3을 참조하면, 본 실시예에 따른 분석 장치(100)는 마이크로웰 어레이의 원본 이미지를 획득하는 카메라(110), 제1 필터(112), 제2 필터(114), 카메라(110)로부터 획득된 이미지로부터 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 마이크로웰 분류부(120), 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 이용하여 DNA의 개수 또는 밀도를 측정하는 산출부(160)를 포함할 수 있다.
또한, 마이크로웰 분류부(120)는, 원본 이미지로부터 마이크로웰의 좌표가 특정된 제1 및 제2 이미지를 획득하는 이미지 생성부(130), 제1 및 제2 이미지에서 각 마이크로웰이 위치한 영역의 광 강도를 비교하는 광 강도 비교부(140), 및 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 이미지 카운팅부(150)를 포함할 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 분석 장치(100)의 카메라(110)는 스테이지(170) 상에 올려진 마이크로웰 어레이(200)로부터 원본 이미지를 촬영할 수 있다. 마이크로웰 어레이(200)의 원본 이미지에는 36개의 패널 및 각 패널에 형성된 900개의 웰에 대한 이미지 정보가 포함될 수 있다.
본 실시예에서, 샘플 DNA, 레퍼런스 색소 및 리포터 색소 등을 포함하는 DNA 용액이 마이크로웰 어레이에 사용될 수 있지만, 그 외에도 다른 샘플 DNA 및 그에 맞는 색소를 포함하는 용액이 사용될 수 있다.
다시 도 5를 참조하면, 마이크로웰 어레이를 이용한 DNA 증식에 대한 분석 방법은 동일한 크기를 갖는 다수의 마이크로웰에 DNA을 분주한 상태에서 진행될 수 있으며, 구체적으로 마이크로웰이 형성된 어레이의 제1 및 제2 이미지를 획득하는 단계(S110)를 포함할 수 있다. 분석 장치는 카메라(110)로부터 도 4와 같은 원본 이미지를 획득하게 되며, 제1 필터(112)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제1 이미지를 획득하고, 동일한 위치에 대응하여 제2 필터(114)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 제2 이미지를 획득할 수 있다.
마이크로웰 분류부(120)의 이미지 생성부(130)는 제1 이미지 및 제2이미지를 획득하고, 광 강도 비교부(140)는 제1 이미지에서 마이크로웰의 평균 레퍼런스 강도를 측정하고(S130), 제2 이미지에서 특정된 마이크로웰에서 리포터 강도를 측정하고(S140), 이들을 이용하여 제2 이미지의 웰 별 표준화 비율을 웰 별로 저장할 수 있다(S150). 각 패널별로 채워진 마이크로웰을 특정하고 각 웰 별로 표준화 비율을 산출하는 것은 36개의 패널 모두에 대해서 반복될 수 있다(S160).
모든 패널에 대한 광 강도가 측정되면 이미지 카운팅부(150)는 표준화 비율을 이용하여 히스토그램을 작성할 수 있으며(S170), DNA을 포함하는 마이크로웰과 그렇지 않은 마이크로웰을 분류하기 위한 임계값을 결정할 수 있다(S180).
산출부(160)는 결정된 임계값을 기준으로 제1 개수(N1)와 제2 개수(N2)를 산출할 수 있으며, 프아송 분석 방법에 따라 DNA의 밀도 또는 개수를 측정할 수 있다(S180).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 중 형광 현미경으로 관찰한 제1 이미지의 사진이며, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 중 형광 현미경으로 관찰한 제2 이미지의 사진이다.
도 6을 참조하면, 제1 필터를 통해 레퍼런스 색소에 의해서 표시된 패널의 원본 사진(a)을 확인할 수 있으며, 컴퓨터 프로그램 및 허프(Hough) 변환을 이용하여 인식된 웰의 이미지(b)를 비교할 수 있다. 식별된 웰에 대해 웰 전체 픽셀에 대한 강도를 모두 더한 후, 웰에 포함된 픽셀의 전체 개수로 나누어 웰의 평균 레퍼런스 강도를 산출할 수 있다.
도 7을 참조하면, 제2 필터를 통해 리포터 색소에 의해서 표시된 패널의 사진(c)을 확인할 수 있으며, 도 6의 (b)에서 특정된 위치의 리포터 강도를 측정할 수 있다. 그리고, 각 웰에 대한 리포터 강도를 평균 레퍼런스 강도로 나누어 웰의 표준화 비율을 산출할 수 있다.
도 8은 본 발명의 효과를 설명하기 위해 표준화를 거치지 않고 제2 이미지의 리포터 강도만 이용하여 작성한 히스토그램이며, 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법의 효과를 설명하기 위해 표준화를 거쳐 표준화 비율을 이용하여 작성한 히스토그램이다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 표준화를 거치지 않고서는 DNA를 포함한다고 평가되는 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 제2 개수(N2)를 구분하기가 어려울 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
양성 및 음성 웰을 식별하기 위한 임계값(약 0.35~0.4)은 임의 조건에 따라 히스토그램에서 작성될 수 있으며, 임계값(약 0.35~0.4)에 따라 제1 개수(N1) 및 제2 개수(N2)가 결정될 수 있다.
산출부(160)는 프아송 통계를 사용하여 계산된 평균 세포 또는 입자의 개수를 나타낼 수 있다.
구체적으로, DNA의 개수 또는 밀도를 측정하는 단계에서, 다음 식에 따라 마이크로웰 당 평균 DNA 개수(λ)를 산출할 수 있으며, 여기서, λ는 마이크로웰 당 평균 DNA 개수, N1은 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수, 및 N2는 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수일 수 있다.
Figure 112018022075616-pat00003
또한, DNA의 개수 또는 밀도를 측정하는 단계에서, 다음 식에 따라 DNA의 전체 개수(Nobject)를 산출할 수 있으며, 여기서, Nwells 는 마이크로웰의 전체 개수일 수 있다.
Figure 112018022075616-pat00004
그 근거로서, 프아송 통계를 사용하기 위해서, 프아송(Poisson) 분포에 따라 웰에 분포되는 것을 가정할 수 있다. 프아송 분포에서 웰 내부에 k 개의 입자가 있을 확률은 다음과 같다.
Figure 112018022075616-pat00005
여기서 λ는 웰 당 평균 DNA 개수이다. 따라서, 웰 내부에 입자가 없을 확률, x=0 인 웰의 확률은 다음과 같다.
Figure 112018022075616-pat00006
여기서, P (x = 0)는 단지 비어 있는 웰의 수를 전체 웰 수 (즉, 빈 웰과 모든 웰의 비율)로 나눈 비율이기 때문에 실험적으로 결정될 수 있다. 따라서 λ를 계산할 수 있고, 입자가 포함된 웰의 수를 곱함으로써 입자의 총 수를 찾을 수 있다.
이 방법에 따라 수십 배에 이르는 수의 밀도를 가진 DNA 증식에 따른 밀도 또는 개수를 정확하게 측정할 수 있다. 마이크로웰 어레이에 의하여 샘플을 웰 단위로 분할하며, 웰의 동일한 형상 및 규칙성을 통해 같은 광 강도를 제공하는 웰에 대해서는 동일한 웰로 처리할 수 있어, 동일한 웰을 중복으로 이미징하는 것을 방지할 수 있으며, 그에 따라 웰 전체를 분석하는 과정에서 처리속도를 더 향상시킬 수가 있다.
또한 응집체 형성의 영향은 측정 결과에 따라 감소할 수 있으며, 이러한 방법은 실험실에서 사용할 수 있는 장비로 수행할 수 있으며 수동 조작이 거의 필요하지 않다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법에 따라 산출된 DNA 농도를 측정한 농도와 비교한 그래프이다.
도 10을 참조하면, 본 발명에 따른 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법에 의하면 측정된 값과 동일한 값을 가지는 것을 알 수 있다. 즉, 이 방법에 따라 3 자릿수 이상의 크기(100'000 -1000 copies/㎕)에 걸친 DNA 농도를 정확하게 측정할 수 있다. 증폭을 나타내는 리포터 색소의 형광 강도의 표준화하여 증폭을 나타내지 않는 웰과 쉽게 구별할 수 있다. 또한, 레퍼런스 색소를 이용한 웰의 인식은 측정의 정확도를 높일 수 있다. 즉, 제1 이미지를 통해서 광 강도 비교부는 채워지지 않은 웰, 불규칙한 모양의 웰, 먼지 입자 등을 비교 대상에서 제거할 수 있다.
그리고 본 발명에 따른 dPCR 분석방법은 종래의 dPCR 프로토콜에서 용이하게 실시할 수 레퍼런스 염색의 추가, 새로운 화상화 단계 및 조정 이미지 분석 알고리즘을 이용하기 때문에 발명을 실현하기 위한 실시 난이도도 높지가 않다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
100 : 분석 장치 110 : 카메라
120 : 마이크로웰 분류부 130 : 이미지 생성부
140 : 광 강도 비교부 150 : 이미지 카운팅부
160 : 산출부 200 : 마이크로웰 어레이
210 : 패널 220 : 웰

Claims (20)

  1. PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이를 제공하는 단계;
    상기 마이크로웰 어레이에 대한 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 단계;
    상기 2종류의 이미지를 이용하여 각각 웰에 대한 DNA를 포함한다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 단계; 및
    상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 단계;를 구비하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 단계에서,
    제1 필터를 이용하여 상기 마이크로웰 어레이의 제1 이미지를 획득하고, 동일한 위치에 대응하여 제2 필터를 이용하여 상기 마이크로웰 어레이의 제2 이미지를 획득하며,
    상기 제1 개수 및 제2 개수를 산출하는 단계에서,
    상기 제1 이미지를 이용하여 상기 제2 이미지를 표준화하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  3. 제2항에 있어서,
    PCR 프로토콜에 따라 수행된 상기 마이크로웰 어레이에 사용된 용액에는 PCR 중합효소, 프라이머, 샘플 DNA, 레퍼런스 색소 및 리포터 색소가 포함된 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제1 필터는 레퍼런스 색소에 대응하는 필터이며, 상기 제2 필터는 리포터 색소에 대응하는 필터인 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 단계에서,
    상기 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하고, 상기 제1 이미지에서 각 웰의 평균 레퍼런스 강도를 산출하며, 특정된 상기 웰의 위치 정보를 이용하여 상기 웰의 리포터 강도를 산출하고, 각각의 상기 웰에 대해 상기 리포터 강도를 상기 평균 레퍼런스 강도로 나누어 웰의 표준화 비율을 산출하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 표준화 비율에 따라 상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 표준화 비율에 따라 히스토그램을 작성하고, 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰과 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰을 분류하기 위한 임계값을 결정하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 단계에서,
    상기 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하되, 허프(Hough) 변환을 이용하여 불규칙한 형상의 웰 및 먼지 노이즈는 제외되는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 단계에서, 다음 식에 따라 마이크로웰 당 평균 DNA 개수(λ)를 산출하며,
    Figure 112019106523371-pat00007

    상기 DNA 증식 개수(Nobject)는 다음 식에 따라 산출되며,
    Figure 112019106523371-pat00021

    여기서, λ는 마이크로웰 당 평균 DNA 개수, N1은 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수, N2는 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수, 및 Nwells 는 마이크로웰의 전체 개수인 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법.
  10. 삭제
  11. PCR 프로토콜에 따라 수행된 마이크로웰 어레이의 이미지로부터 DNA 증식 개수 또는 밀도를 분석하는 dPCR 분석장치에 있어서,
    다수의 웰이 형성된 마이크로웰 어레이로부터 적어도 2종류의 이미지를 획득하는 카메라;
    상기 카메라로부터 획득된 상기 2종류의 이미지를 이용하여 DNA를 포함한다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제1 개수(N1)와 DNA를 포함하지 않는다고 평가되는 마이크로웰의 개수인 제2 개수(N2)를 산출하는 마이크로웰 분류부; 및
    상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 이용하여 마이크로웰 어레이의 DNA 증식 개수 또는 밀도를 측정하는 산출부;를 구비하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 마이크로웰 분류부는,
    제1 필터를 이용하여 상기 마이크로웰 어레이의 제1 이미지를 획득하는 제1 이미지 생성부, 동일한 위치에 대응하여 제2 필터를 이용하여 상기 마이크로웰 어레이의 제2 이미지를 획득하는 제2 이미지 생성부, 상기 제1 이미지를 이용하여 상기 제2 이미지를 표준화하는 광 강도 비교부, 및 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수인 상기 제1 개수(N1)와 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수인 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 이미지 카운팅부를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  13. 제12항에 있어서,
    PCR 프로토콜에 따라 수행된 상기 마이크로웰 어레이에 사용된 용액에는 PCR 중합효소, 프라이머, 샘플 DNA, 레퍼런스 색소 및 리포터 색소가 포함된 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 제1 필터는 레퍼런스 색소에 대응하는 필터이며, 상기 제2 필터는 리포터 색소에 대응하는 필터인 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 광 강도 비교부는 상기 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하고, 상기 제1 이미지에서 각 웰의 평균 레퍼런스 강도를 산출하며, 특정된 상기 웰의 위치 정보를 이용하여 상기 웰의 리포터 강도를 산출하고, 각각의 상기 웰에 대해 상기 리포터 강도를 상기 평균 레퍼런스 강도로 나누어 웰의 표준화 비율을 산출하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 이미지 카운팅부는 상기 표준화 비율에 따라 상기 제1 개수(N1)와 상기 제2 개수(N2)를 산출하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 이미지 카운팅부는 상기 표준화 비율에 따라 히스토그램을 작성하고, 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰과 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰을 분류하기 위한 임계값을 결정하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 광 강도 비교부는, 상기 제1 이미지를 이용하여 웰의 위치를 특정하되, 허프(Hough) 변환을 이용하여 불규칙한 형상의 웰 및 먼지 노이즈를 제외하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 산출부는 다음 식에 따라 마이크로웰 당 평균 DNA 개수(λ)를 산출하며,
    Figure 112019106523371-pat00009

    상기 DNA 증식 개수(Nobject)는 다음 식에 따라 산출되며,
    Figure 112019106523371-pat00022

    여기서, λ는 마이크로웰 당 평균 DNA 개수, N1은 상기 DNA을 포함하는 마이크로웰의 개수, N2는 상기 DNA을 포함하지 않는 마이크로웰의 개수, 및 Nwells 는 마이크로웰의 전체 개수인 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석장치.
  20. 삭제
KR1020180025808A 2018-03-05 2018-03-05 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치 KR102099151B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180025808A KR102099151B1 (ko) 2018-03-05 2018-03-05 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180025808A KR102099151B1 (ko) 2018-03-05 2018-03-05 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190105363A KR20190105363A (ko) 2019-09-17
KR102099151B1 true KR102099151B1 (ko) 2020-04-10

Family

ID=68070291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180025808A KR102099151B1 (ko) 2018-03-05 2018-03-05 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102099151B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113308351B (zh) * 2020-02-26 2022-12-27 京东方科技集团股份有限公司 检测芯片及其制备方法、反应系统
KR20240039881A (ko) 2022-09-20 2024-03-27 한국표준과학연구원 Dna 용융을 이용한 미세유체 온도교정법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150099673A1 (en) 2009-12-15 2015-04-09 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US20170175174A1 (en) 2014-04-08 2017-06-22 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and apparatus for performing digital assays using polydisperse droplets

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2557517T (pt) * 2007-07-23 2023-01-04 Univ Hong Kong Chinese Determinação de um desequilíbrio de sequências de ácido nucleico
KR20100060614A (ko) * 2008-11-28 2010-06-07 이진호 DNA microarray의 고속 자동 분석 방법.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150099673A1 (en) 2009-12-15 2015-04-09 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US20170175174A1 (en) 2014-04-08 2017-06-22 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and apparatus for performing digital assays using polydisperse droplets

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Scientific Reports. volume 8,Article number: 2438 (2018) (2018.02.05)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190105363A (ko) 2019-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210312627A1 (en) Image analysis method, apparatus, program, and learned deep learning algorithm
JP5717647B2 (ja) 多核細胞分類および微小核点数化
US11674883B2 (en) Image-based assay performance improvement
CN104487564B (zh) 图像处理装置、图像处理方法以及图像处理系统
US20230324278A1 (en) Assay accuracy improvement
CN107977682B (zh) 基于极坐标变换数据增强的淋巴类细胞分类方法及其装置
JP4948647B2 (ja) 尿中粒子画像の領域分割方法及び装置
KR102099151B1 (ko) 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치
CN112215790A (zh) 基于深度学习的ki67指数分析方法
CZ2011154A3 (cs) Zpusob analýzy materiálu fokusovaným elektronovým svazkem s využitím charakteristického rentgenového zárení a zpetne odražených elektronu a zarízení k jeho provádení
KR102176815B1 (ko) 현미경가시성 입자 샘플의 순도 정량방법
US20200184641A1 (en) A Deep Learning Method For Predicting Patient Response To A Therapy
CN112561849A (zh) 晶圆缺陷检测方法
JP7282894B2 (ja) 粒子定量装置
JP6970112B2 (ja) 概観画像をセグメント化することにより分散オブジェクトを検査するための方法
KR102072445B1 (ko) 마이크로웰 어레이의 이미지 분석을 위한 분석 알고리즘 형성방법
JP3635762B2 (ja) 半導体基板表面欠陥の検査方法
Muresan et al. Microarray analysis at single-molecule resolution
DK201570249A1 (en) Method and system for detection of fluid inclusion
CN114300047A (zh) 一种基因测序信号强度获取的方法
Opyr et al. Extraction of indicator traces on the images obtained in the course of control with penetrating agents

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right