KR20240039881A - Dna 용융을 이용한 미세유체 온도교정법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DNA 용융을 이용한 미세유체 온도교정법에 관한 것으로, 본 발명의 DNA 용융을 이용한 미세유체 온도교정법은 용융 온도(melting temperature, Tm)의 정확도가 매우 높으며, 이를 통해 미세유체시스템 등에 대한 측정 온도의 정확성을 판단하기 위한 쉬우면서도 정확한 방법이다.
Description
본 발명은 DNA 용융을 이용한 미세유체 온도교정법에 관한 것이다.
최근, 미세유체 시스템(microfluidic system)을 기반으로 하는 다양한 종류의 정밀 의료제품이 개발되고 있으며, 특히 마이크론(um) 크기의 웰(마이크로웰)에 시료를 분산시킨 후 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 디지털 PCR 기술은 절대적 정량이 가능한 차세대 유전자 검출 방법으로 각광받고 있다.
중합효소연쇄반응(PCR) 증폭 시, 온도의 영향이 크기 때문에 마이크로웰의 온도 제어가 정확하게 이루어질 수 있어야 신뢰성이 있는 분석이 가능하다. 따라서, 정확한 온도인지를 평가하기 위한 온도 측정방법이 요구된다.
그러나, 미세유체 시스템은 크기가 작고 복잡한 구조를 가지기 때문에, 써모커플(thermocouple)과 같은 비침습적 측정방법은 적용할 수 없고, 새로운 방법의 개발이 필요한 상황이다.
본 발명자들은 새로운 방법에 대해 연구하던 중, 마이크로웰과 같은 좁은 온도의 영역에서 재현성 있게 발생하는 DNA 용융(DNA melting) 현상을 이용하여, 정확한 온도를 측정함으로써, 온도 정확성을 평가하는 방법을 새롭게 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서는 좁은 온도의 영역에서 정확한 온도를 측정하기 위해, 재현성 있게 발생하는DNA 용융 현상을 이용하여, 측정 온도의 정확성을 평가하는 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명의 측정 온도 정확도 평가방법은 프로브 설계 단계; 프로브 주형에 염료(dye) 및 소광자(quencher)를 라벨링하는 단계; 프로브를 이용하여 qPCR을 수행하고, 용융 곡선을 생성하는 단계; 측정된 용융 온도(Tm)에 따른 측정 온도 차이를 계산하는 단계; 및 측정 온도 차이로부터 온도 측정 정확성 여부를 판별하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 프로브는 dsDNA(double strand DNA)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 염료는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7dichlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine),텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 소광자는 답실(Dabcyl; dimethylaminoazobenzenesulfonic acid), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1,딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher)및 탐라 퀀처(TAMRA quencher)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 용융 곡선은 온도를 증가시키면서 형광 세기를 측정하여 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 형광 세기는 30 내지 85℃에서 1도 간격으로 온도를 증가시키면서 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 측정 온도 정확도 평가방법에 있어서, 상기 측정 온도 차이가 0.5℃ 이하인 경우, 측정 온도 정확도가 높은 것으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 DNA 용융을 이용한 미세유체 온도교정법은 용융 온도(melting temperature, Tm)의 정확도가 매우 높으며, 이를 통해 미세유체시스템 등에 대한 측정 온도의 정확성을 판단하기 위한 쉬우면서도 정확한 방법이다.
도 1은 (a) DNA-DNA, PNA-DNA, LNA-DNA 및 Triplex DNA를 이용한 프로브의 구조 및 (b) 각 프로브 사슬의 서열을 나타낸 것이고,
도 2는 용융 곡선을 이용하여 적합한 프로브를 선정하기 위한 용융 온도의 측정 결과이고,
도 3은 dsDNA의 길이에 따른 용융 온도의 변화를 평가하기 위한 Probe_medium(프로브 1), Probe_short(프로브 5) 및 Probe_long(프로브 6)의 사슬의 서열 및 용융 온도 측정 결과를 나타낸 것이고,
도 4는 dsDNA 샘플 농도에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 5는 PCR 버퍼의 염의 농도 변화에 따른 dsDNA 프로브의 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 6은 dsDNA 샘플 부피에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 7은 96 웰 플레이트의 위치에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 8은 디지털 PCR 장치의 웰어레이칩에서 용융 곡선 및 온도 별로 측정한 형광 이미지를 나타낸 것이고,
도 9는 dsDNA의 길이에 따른 접시 표면 온도(IR 측정 결과)와 DNA 용융 시약의 온도 차이를 나타낸 결과이다.
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도 3은 dsDNA의 길이에 따른 용융 온도의 변화를 평가하기 위한 Probe_medium(프로브 1), Probe_short(프로브 5) 및 Probe_long(프로브 6)의 사슬의 서열 및 용융 온도 측정 결과를 나타낸 것이고,
도 4는 dsDNA 샘플 농도에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 5는 PCR 버퍼의 염의 농도 변화에 따른 dsDNA 프로브의 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 6은 dsDNA 샘플 부피에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 7은 96 웰 플레이트의 위치에 따른 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
도 8은 디지털 PCR 장치의 웰어레이칩에서 용융 곡선 및 온도 별로 측정한 형광 이미지를 나타낸 것이고,
도 9는 dsDNA의 길이에 따른 접시 표면 온도(IR 측정 결과)와 DNA 용융 시약의 온도 차이를 나타낸 결과이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 DNA 용융을 이용한 미세유체 온도교정법에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
제 1, 제 2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
이때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의되지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명의 측정 온도 정확도 평가방법은 프로브 설계 단계; 프로브 주형에 염료(dye) 및 소광자(quencher)를 라벨링하는 단계; 프로브를 이용하여 qPCR을 수행하고, 용융 곡선을 생성하는 단계; 측정된 용융 온도(Tm)에 따른 측정 온도 차이를 계산하는 단계; 및 측정 온도 차이로부터 온도 측정 정확성 여부를 판별하는 단계;를 포함한다.
용융 곡선을 이용한 온도 측정을 위해 프로브를 설계하는 데 있어서, 프로브 설계에 필요한 요소는 정방향 및 역방향 사슬(strand)를 이루는 구성 요소로, 본 발명의 온도 측정 정확성을 판별하는 데 사용될 수 있다면 그 종류 및 정방향 및 역방향 사슬의 구성 요소는 특별히 제한되지는 않으나, 본 발명의 일 실시예에로부터, 상기 프로브는 바람직하게 dsDNA(double strand DNA), 즉 DNA-DNA일 수 있다.
상기 dsDNA의 각 사슬에 염료 및 소광자를 각각 부착하면, 형광 신호를 이용하여, 용융 곡선(melting curve)를 얻을 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 50, 64 및 75℃의 3가지 온도를 타겟으로 하는 프로브를 설계한 후, 해당 프로브의 용융을 시중에 판매하는 qPCR 장비로 측정한 결과, 결정된 용융 온도(melting temperature, Tm)의 정확도가 ±0.2℃로 매우 높은 것을 확인하였다.
상기 염료(dye)는 본 발명의 온도 측정 정확성을 판별하는 데 사용될 수 있다면 특별히 한정되는 것은 아니나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7dichlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine),텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료 등으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein)을 들 수 있으며, 상기 염료를 사용하는 경우, 소광자와의 동시 사용을 통해 형광을 보다 명확하게 확인할 수 있어 바람직하다.
상기 소광자(quencher)는 본 발명의 온도 측정 정확성을 판별하는 데 사용될 수 있다면 특별히 한정되는 것은 아니나, 답실(Dabcyl; dimethylaminoazobenzenesulfonic acid), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1,딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher)및 탐라 퀀처(TAMRA quencher) 등으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ) 또는 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ)을 들 수 있으며, 상기 소광자를 사용하는 경우, 소광자와의 동시 사용을 통해 형광을 보다 명확하게 확인할 수 있어 바람직하다..
상기 용융 곡선을 획득하는 방법은 특별히 한정된느 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예와 같이 온도를 증가시키면서 형광 세기를 측정하여 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것일 수 있으며, 이를 통해 보다 정확한 용융 곡선을 확보할 수 있어 바람직하다.
이 때, 상기 형광 세기를 측정하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 일예로 30 내지 85℃, 좋게는 40 내지 80℃, 더욱 좋게는 50 내지 에서 75℃에서 1도 간격으로 온도를 증가시키면서 측정하는 것일 수 있으며, 이를 통해 보다 정확한 용융 곡선을 확보할 수 있어 바람직하다.
미세유체에 대한 온도 측정 결과에 있어서, 본 발명의 용융 곡선을 이용한 방법과, 해당 미세유체를 이용한 장치의 측정 온도 차이가 0.5℃ 이하, 좋게는 ±0.4℃, 더욱 좋게는 ±0.3℃, 가장 좋게는 ±0.2℃ 이내의 범위인 경우, 측정 온도 정확도가 높은 것으로 판별할 수 있으며, 상기 범위를 만족하는 경우, 장치의 온도 제어 정확도가 높은 것으로 판단할 수 있어, 장비의 신뢰성을 높게 평가할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[균주, 시약, 재료 및 실험 프로토콜]
-
본 발명에서, 중합효소연쇄반응(PCR), DNA 클로닝, 형질전환 등을 위해 사용된 시약, 재료 및 프로토콜은 다음과 같으며, 이는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 있어 자명할 것이다.
-
dsDNA, LNA-DNA 및 Triplex DNA는 IDT Korea(Integrated DNA Technologies, Inc. Korea)에서, PNA는 파나진(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
-
그 외의 시약은 Sigma-Aldrich (USA) 등에서 구입하여 사용하였다.
[제조예 1] 프로브 선별
1-1. 프로브의 설계 및 합성
각 프로브는 정방향 및 역방향 사슬의 서열이 하기 표 1과 같이 되도록 각각 합성하여 사용하였다.
| 번호 | 프로브 종류 | 프로브 명칭 | 서열 | 길이 (base) |
| 1 | dsDNA | Tm-DNA | 5'-/56-FAM/TTC AAC TAC ATA TCA CGA CTC C-3' | 22 |
| Tm-DNA_Comp-1 | 5'-GGA GTC GTG ATA TGT AGT TGA A/3IABkFQ//-3' | |||
| 2 | PNA-DNA | PNA | N-ter-/FAM/ATC ACG ACT CC-C ter | 11 |
| PNA_LNA_Comp-1 | 5'-CGA GTC CTG AT/3IABkFQ//-3' | |||
| 3 | LNA-DNA | Tm-LNA | 5'-/56-FAM/+AT+CA+CGA+CT+C+C-3' | 11 |
| PNA_LNA_Comp-1 | 5'-GGA GTC GTG AT/3IABkFQ//-3' | |||
| 4 | Triplex DNA | Clamp Switch | 5'-/56-FAM/ATTTTCTTTTCCCCCCAGTTATTATT CCCCCCTTTTCTTTTG/3IABkFQ/-3' |
42 |
| Clamp stabilizer 15 | 5'-AAAAGAAAAGGGGGG-3' |
1-2. 용융 곡선 측정
상기 프로브 1~4에 대해 상용 qPCR 장비인 StepOnePlus(Applied Biosystems)를 이용하여 이하의 방법으로 용융 곡선을 측정하였다.
FAM-strand 기준 250 nM 농도의 프로브 용액 20 μL, PCR 버퍼(10 mM Tris(pH 8.9), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2)를 사용하였고, 염료와 소광자는 1:1 및 1:5의 두 가지 비율에 대해 측정하였다. 용융 곡선은 30~85℃ 구간에 대해 1℃ 간격으로 측정된 데이터를 사용하여 도출하였다.
용융 온도(Tm)는 측정된 데이터를 Origin(OriginLab, MA, USA)으로 읽어, 배경 수정(background correction) 및 정규화(normalization)를 거친 후, Sigmoidal 함수로 회귀 곡선을 결정하였다. 이 때, Origin 소프트웨어의 Fitting Function에서 Slogistic1을 선택하였다.
용융 전이(melting transition)가 날카롭고(sharp), 재현성이 높을수록 용융 온도의 정확도가 증가하는데, 측정 결과 상기 프로브 1에 대해 상기 염료와 소광자의 혼합 비율을 1:5로 하여 측정하였을 때 용융 전이가 가장 날카롭게 나타난 것으로 나타난 반면, 프로브 2, 3의 하이브리드 프로브는 용융 곡선의 기울기가 너무 완만하여, 프로브 1 대비 정밀도가 좋지 않으며, 프로브 4의 경우, 과도하게 넓은 범위에서 용융 전이가 발생하여 온도 프로브로서 사용하기 어려운 것으로 판단하였다.
상기 결과로부터, 이후 실험은 프로브 1과 같이 dsDNA를 이용하여 제작한 프로브를 사용하여 수행하였다.
[제조예 2] dsDNA를 이용한 측정 조건에 따른 프로브 용융 온도 변화 측정
2-1. dsDNA 길이에 따른 변화
상기 프로브 1의 dsDNA의 길이에 따른 온도 영역 조정을 위해, 프로브 1의 dsDNA 서열과 길이가 상이한 프로브 5, 6을 하기 표 2에 기재한 바와 같이 제작하고, 상기 방법으로 용융 온도를 측정하였다.
| 번호 | 프로브 명칭 | 서열 | 길이 (base) | 측정 용융 온도 |
| 1 | Tm-DNA | 5'-/56-FAM/TTC AAC TAC ATA TCA CGA CTC C-3' | 22 | 64.1 |
| Tm-DNA_Comp-1 | 5'-GGA GTC GTG ATA TGT AGT TGA A/3IABkFQ//-3' | |||
| 5 | Tm-ShortDNA | 5'-/56-FAM/TTC AAC TAC ATA TCA-3' | 15 | 50.2 |
| Tm-ShortDNA_Comp | 5'-TGA TAT GTA GTT GAA/3IABkFQ//-3' | |||
| 6 | Tm-longDNA | 5'-/56-FAM/TTC AAC TAC ATA TCA CGA CTC CAG GGC TAC GTC G-3' | 34 | 74.6 |
| Tm-LongDNA_Comp | 5'-CGA CGT AGC CCT GGA GTC GTG ATA TGT AGT TGA A/3IABkFQ//-3' |
2-2. 샘플 농도에 따른 변화
상기 표 2의 프로브 1, 5 및 6에 대해, 염료와 소광자의 비율은 1:5로 고정한 채, FAM strand 기준 100, 250 및 500 nM의 세 가지 프로브 농도에서 각각 용융 온도를 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 4에 도시하였다.
이로부터, 샘플 농도가 증가함에 따라 용융 온도가 증가하였으며, 변화폭은 ±1.5℃임을 확인하였다.
2-3. PCR 버퍼의 염(salt) 농도에 따른 변화
상기 표 2의 프로브 1, 5 및 6에 대해, 염화칼륨(KCl) 및 염화마그네슘(MgCl2)의 농도를 각각 50, 100 mM 및 1.5, 3.0 mM로 변경시키면서 용융 온도를 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 5에 도시하였다.
이로부터, 염의 농도 증가에 따라 듀플렉스(duplex)가 안정화되어, 용융 온도가 높아지고, 변화폭은 1.5~6℃인 것을 확인하였다. 또한, 프로브 1, 5 및 6 중 프로브 1의 경우가 용융 온도의 변화폭이 가장 큰 것을 확인하였다.
2-4. 샘플 부피에 따른 변화
상기 표 2의 프로브 1, 5 및 6에 대해, 각 프로브 샘플의 부피를 각각 10, 20 및 50 μL로 변화시키며 용융 온도를 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과를 도 6에 도시하였다.
이로부터 상기 프로브 샘플의 부피에 따른 용융 온도는 편차가 ±0.16℃로 대체적으로 변화가 없는 것을 확인하였다.
2-5. 96웰 플레이트 상의 위치에 따른 변화
상기 표 2의 프로브 1, 5 및 6에 대해, 도 7에 도시된 디지털 PCR 장치에 장착되는 96 웰 플레이트에서 서로 다른 부위에 대해 용융 온도를 측정하였다.
각 프로브에 대한 측정 웰의 위치는 하기 표 3에 기재하였다.
| 프로브 번호 | 웰 번호 |
| 1 | A1, A12, D7, H1, H12 |
| 5 | A1, A12, E6, H1, H12 |
| 6 | B1, B12, E7, G1, G12 |
그 결과를 도 7에 함께 도시하였다.이로부터, 상기 96 웰 플레이트의 위치에 따른 용융 온도는 편차가 ±0.17℃로 대체적으로 변화가 없는 것을 확인하였다.
상기 2.2~2.5의 측정 조건의 변화에 따른 결과로부터, 용융 온도의 정확도에 변화를 줄 수 있는 변수로는 프로브 샘플 농도 및 PCR 버퍼 염의 농도인 것을 확인하였다.
[시험예 1] 마이크로웰 타입 디지털 PCR 시스템의 온도 정확도 평가
1-1. 프로브 1을 이용한 온도 정확도 평가
상용 디지털 PCR 시스템 DigiQuark(레보스케치, 대한민국)에 본 발명의 온도 측정법을 적용하여, 온도 정확도를 평가하였다.
먼저, 온도 프로브 1의 샘플 용액을 도 8에서와 같이 분주하고, 50에서 온도를 증가시키며 각 마이크로웰에서의 형광을 측정하였다. 이 때, 웰어레이칩(well-array chip)의 200 μm 크기의 18,000개 마이크로웰을 상단, 중단 및 하단으로 구분하고, 각 부분에 대해 측정된 값을 평균하여 용융 곡선을 얻은 후, 용융 온도에 대한 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 8에 도시하였다.
이로부터, 용융이 일어나지 않는 50℃의 온도에서는 형광이 낮게 발생하는 반면, 온도가 증가함에 따라 마이크로웰의 형광이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
상기 과정을 통해 얻은 용융 곡선에서의 용융 온도(Tm)은 61℃로, 장치 자체의 레퍼런스 값 대비 3.0℃ 낮은 것을 확인하였다. 이는 웰어레이 표면 온도와 내부 용액 간의 온도 차이가 큰 것을 의미하는 것이다.
또한, 상단, 중단 및 하단으로 구분한 위치에 있어서, 동일한 온도에서도 온도의 차이가 발생하는 것을 확인하였다. 상기 도 8의 형광 이미지에서도 확인할 수 있는 바와 같이 61℃의 마이크로웰에서 상단 웰은 밝은 반면 하단 웰은 어두운 것을 알 수 있다.
1-2. 프로브 1, 5 및 6을 모두 이용한 온도 정확도 평가
프로브 1, 5 및 6에 대해 상기 시험예 1-1과 같은 방법으로 웰어레이칩 상단, 중단 및 하단의 온도를 측정한 후, 접시 표면의 온도와 프로브를 이용한 온도의 측정한 결과를 도 9에 도시하였다.
이로부터, 프로브의 길이에 따라, 상단, 중단 및 하단에서 장비 자체에서 IR로 측정된 온도와의 온도 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 도 9에 기재된 수치 범위의 온도 차이는 온도 제어의 정확도를 개선해야 할 필요가 있을 정도로 온도 정확도가 높지 않음을 의미한다.
상기 결과로부터, 본 발명의 DNA 용융을 이용한 온도 측정법이 다양한 미세유체칩의 온도 제어 정확도를 평가하기 위해 활용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 프로브 설계 단계;
프로브 주형에 염료(dye) 및 소광자(quencher)를 라벨링하는 단계;
프로브를 이용하여 qPCR을 수행하고, 용융 곡선을 생성하는 단계;
측정된 용융 온도(Tm)에 따른 측정 온도 차이를 계산하는 단계; 및
측정 온도 차이로부터 온도 측정 정확성 여부를 판별하는 단계;
를 포함하는, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 1항에 있어서,
상기 프로브는 dsDNA(double strand DNA)인, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 1항에 있어서,
상기 염료는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7dichlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine),텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 1항에 있어서,
상기 소광자는 답실(Dabcyl; dimethylaminoazobenzenesulfonic acid), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher), Qxl 퀀처(Qxl quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ), IRDye QC-1,딥 다크 퀀처(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 이클립스 퀀처(ECLIPSE Quencher)및 탐라 퀀처(TAMRA quencher)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 1항에 있어서,
상기 용융 곡선은 온도를 증가시키면서 형광 세기를 측정하여 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것인, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 5항에 있어서,
상기 형광 세기는 30 내지 85℃에서 1도 간격으로 온도를 증가시키면서 측정하는 것인, 측정 온도 정확도 평가방법. - 제 1항에 있어서,
상기 측정 온도 차이가 0.5℃ 이하인 경우, 측정 온도 정확도가 높은 것으로 판별하는 것인, 측정 온도 정확도 평가방법.
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