KR20160010277A - 산모의 무세포 dna의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법 - Google Patents

산모의 무세포 dna의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산모의 무세포 DNA의 차세대 서열분석을 통해 태아의 단일유전자 유전변이 및 이로 인한 단일유전자 질환을 비침습적으로 예측하는 방법을 제공하는 바, 본 발명의 방법은 종래 융모막융모 샘플링 또는 양수천자를 포함하는 비침습적 방법을 대체하여 태아의 산전진단에 응용될 수 있다.

Description

산모의 무세포 DNA의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법{METHOD FOR PREDICTION OF FETAL MONOGENIC GENETIC VARIATIONS THROUGH NEXT GENERATION SEQUENCING OF MATERNAL CELL-FREE DNA}
본 발명은 산모의 무세포 DNA의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 산모 혈청 DNA 서열로부터 태아의 단일유전자 유전변이 및 이로 인한 단일유전자 질환을 비침습적으로 예측하는 방법에 관한 것이다.
산모 혈청 내의 무세포 DNA(cell-free DNA; cfDNA)에서의 무세포 태아 DNA(cell-free fetal DNA; cffDNA)의 발견은 비침습적 산전 유전적 진단법을 개발하기 위한 강력한 도구를 제공하였다(Lo YM et al., Lancet 1997;350:485-7). 이러한 cffDNA의 산전 진단에의 응용은 차세대 서열분석(NGS) 중 하나인 대규모 병렬형 서열분석(massively parallel sequencing) 기술의 도입에 의해 더 가속화되었다(Chiu RW et al., Clinical chemistry and laboratory medicine : CCLM / FESCC 2013;51:197-204; Lo YM et al., Reproductive biomedicine online 2013;27:593-8). cffDNA를 이용하여 높은 민감도와 정확도로 이수성(aneuploidy)을 검출할 수 있는 산전 시험들이 이미 상업화되었다(American College of O, Gynecologists Committee on G. Committee opinion no. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstetrics and gynecology 2012;120:1532-4). 또한, 몇 가지 연구들은 전체 게놈 서열분석(WGS) 및 cffDNA의 표적 농축(target enrichment) 후 서열분석에 의해 전체 게놈에 걸쳐 태아와 산모 DNA가 균일하게 분포되어 있음을 입증하였다(Lo YM et al., Science translational medicine 2010;2:61ra91; Liao GJ et al., Clinical chemistry 2011;57:92-101; Kitzman JO et al., Science translational medicine 2012;4:137ra76). 이러한 결과들은 염색체 이수성보다 더 큰 비율을 차지하는 단일유전자 질환(monogenic disorder)으로 확장하기 위한 기초를 제공하였다.
하지만, 이수성 검출은 임상학적 실행에 빠르게 적용될 수 있는 반면, 단일유전자 질환으로의 적용은 훨씬 더 복잡하고 극복될 장애물이 여전히 많다. 기술적으로, cffDNA는 산모 혈장 내에서 그 함량이 적고 그 비율도 다양하므로, 단일 뉴클레오타이드 수준에서 태아 변이체(variant)를 신뢰성있게 검출하는 것은 용이하지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 보인자 산모의 혈청 DNA를 분석함으로써 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 비침습적 방법을 제공하는 것이다.
일 실시형태에 따라, 본 발명은 (1) 단일유전자 삽입 또는 결실 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)으로 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계; (2) 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계; (3) 상기 단계 (1) 및 (2)의 결과를 바탕으로, 태아가 상기 유전변이를 가지는 경우 단일유전자 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)의 대립유전자 빈도(allele frequency)의 예측값(θexp | aff) 및 태아가 상기 유전변이를 가지지 않는 경우 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | unaff)을 각각 계산하는 단계; (4) 산모의 혈청 DNA 서열자료로부터 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θobs)를 측정하는 단계; 및 (5) 상기 단계 (4)에서 측정된 평균 대립유전자 빈도(θobs)가 단계 (3)의 단일유전자 유전변이를 갖는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | aff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | unaff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에 따라, 본 발명은 (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)에 의해 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계; (2) 상기 보인자 산모의 혈청에서의 태아 DNA의 비율을 계산하는 단계; (3) 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)에서 계산된 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이를 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이와 비교하는 단계를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 보인자 산모의 혈청 DNA의 서열분석을 통해 태아의 출생 전(임신 6주 이후부터)에 비침습적 방법으로 태아의 단일유전자 유전변이를 예측할 수 있는바, 종래 융모막융모 샘플링 또는 양수천자를 포함하는 비침습적 방법을 대체하여 태아의 산전진단에 응용될 수 있다.
도 1은 태아 DNA 비율에 따른 대립유전자 빈도를 그래프화한 것으로서, 위쪽 직선은 단일유전자 유전변이를 갖는 태아의 대립유전자 빈도를, 아래쪽 직선은 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아의 단일유전자 빈도를 가리킨다.
본 발명은 태아의 단일유전자 유전변이, 및 이로 인한 단일유전자 질환을 예측하는 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 단일유전자 유전변이로 인한 유전질환 가족력이 있는 산모의 태아가 동일한 유전질환 유발 유전변이를 가지고 있는지를 비침습적 방법으로 예측하는 방법을 제공한다. 종래 태아의 산전진단을 위해 사용되는 융모막융모 샘플링 또는 양수천자와 같은 침습적 방법은 태아의 조산 또는 감염 위험성이 높은데 반해, 본 발명의 방법은 비침습적 방법으로 산모의 혈장을 분석하므로 전술한 위험성이 없다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법은 (1) 단일유전자 삽입 또는 결실 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)으로 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계; (2) 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계; (3) 상기 단계 (1) 및 (2)의 결과를 바탕으로, 태아가 상기 유전변이를 가지는 경우 단일유전자 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)의 대립유전자 빈도(allele frequency)의 예측값(θexp | aff) 및 태아가 상기 유전변이를 가지지 않는 경우 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|unaff)을 각각 계산하는 단계; (4) 산모의 혈청 DNA 서열자료로부터 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θobs)를 측정하는 단계; 및 (5) 상기 단계 (4)에서 측정된 평균 대립유전자 빈도(θobs)가 단계 (3)의 단일유전자 유전변이를 갖는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | aff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | unaff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 산모 혈청에서 단일유전자 유전변이로 인한 대상 질환으로서 X-연관된 질환의 유전변이에 따른 유전된 대립유전자(allele) 빈도를 분석하는 것에 기초하고 있으므로, 본 기술분야의 숙련자라면 본 발명의 방법이 X-연관된 열성(recessive) 질환 또는 상염색체 열성 질환에 적용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
상기 단일유전자 유전변이로 인한 질환의 예로는 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 근관성 근육병증(Myotubular myopathy), 로웨 증후군(Lowe syndrome), 멘케스 증후군(Menkes syndrome), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreidarsson syndrome), 척수성 근위축증(Spinal Muscular atrophy), 이염색 백색질 장애(Metachromatic leukodystrophy) 및 크라베병(Krabbe disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전자 질환을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법은 상기 단일유전자 유전변이가 중복(duplication) 돌연변이일 때, 그리고 보인자 산모가 남아를 임신하고 있을 때 적용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, '보인자(carrier) 산모'는 본 발명의 방법이 확인하고자 하는 단일유전자 유전변이를 X 염색체 상에 가지고 있는 산모를 가리키며, 상기 산모는 XX 염색체 중 하나의 X 염색체에만 열성 단일 유전자 변이(X')를 가지고 있으므로 상기 단일유전자 질환을 나타내지 않는다. 본 발명에서 보인자 산모는 태아를 임신하고 있는 산모, 바람직하게는 임신 6주 이상의 산모이다. 상기 보인자 산모의 혈청 무세포 DNA(cell-free DNA)는 무세포 태아 DNA(cell-free fetal DNA)를 포함한다.
상기 보인자 산모는 게놈 DNA 시퀀싱 후 참조 DNA 서열, 즉 단일유전자 변이를 갖는 참조 DNA 서열과 서열을 비교함으로써 보인자 여부가 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (1)은 단일유전자 삽입 또는 결실 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA를 차세대 서열분석으로 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계이다.
상기 산모는 보인자이면서 임신 중 무세포 DNA를 확보할 수 있는 산모를 대상으로 한다.
상기 NGS는 표적화된 서열분석, 예를 들면 표적 농축 후 대규모 병렬 서열분석(massively parallel sequencing)에 의해 수행에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전변이의 종류(삽입 또는 결실) 및 부위는 종래 알려진 많은 구조 변이 검출 프로그램에 의해 확인될 수 있다. 상기 구조 변이 검출 프로그램의 예로는 Delly, Pindell, BreakDancer, GASV, Hydra, CNVnator 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 유전변이의 종류 및 부위는 대규모 병렬 서열분석 후 10kb 리드 점(read point)의 윈도우 크기를 갖는 중첩 슬라이딩 윈도우에 대한 리드 깊이의 이동 평균(moving average)를 계산하는 단계; 및 CBS(circular binary segmentation) 알고리즘을 적용하는 단계를 포함하는 과정에 의해 이뤄질 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (2)는 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계이다. 상기 태아 DNA의 비율은 종래 알려진 다양한 방법에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들어 남아의 경우 ZFX(X-linked zinc finger protein) 및 ZFY(Y-linked zinc finger protein) 부위를 표적화하는 커스텀 포획 프로브(custom capture probe)를 이용하여 ZFX 및 ZFY 유전자를 포획한 후 하기 식에 의해 계산될 수 있다:
태아 DNA 비율:
Figure pat00001
상기 식에서, ZFX' 및 ZFY'는 총 맵핑된 리드의 수를 프로브의 수로 나눈 값이다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (3)은 상기 단계 (1) 및 (2)의 결과를 바탕으로, 태아가 상기 유전변이를 가지는 경우 단일유전자 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)의 대립유전자 빈도(allele frequency)의 예측값(θexp | aff) 및 태아가 상기 유전변이를 가지지 않는 경우 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|unaff)을 각각 계산하는 단계이다. 즉, 상기 단계에서는 상기 단계 (1) 및 (2)의 결과를 바탕으로, 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 태아를 임신한 경우에 대해 유전변이 영역에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)의 대립유전자 빈도(allele frequency)의 예측값(θexp | aff) 및 상기 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아를 임신한 경우에 대해 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|unaff)을 계산한다. 계산하는 식은 산모가 보인자임을 가정하며, 상염색체와 성염색체에 따라, 유전변이의 멘델유전 종류, 성염색체의 경우 태아의 성별에 따라 결정된다. 예를 들어, 태아가 남아이고, X-연관된 열성 유전질환을 갖는 경우, 예측값(θexp | aff) 및 예측값(θexp|unaff)은 각각 하기 식 1 및 2에 의해 계산될 수 있다:
<식 1>
θexp | aff = 2/(3-f)
<식 2>
θexp | unaff = 2(1-f)/3-2f
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (4)는 산모의 혈청 DNA 서열자료로부터 단일유전자 유전변이(삽입/결실 유전변이)를 갖는 DNA 부위에서 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θobs)를 측정하는 단계이다. 대립유전자 빈도는 차세대 서열분석 자료에서 samtools와 같은 기존의 프로그램을 이용하여 각 대립유전자의 개수를 계수함으로써 계산될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (5)는 상기 단계 (4)에서 측정된 평균 대립유전자 빈도(θobs)가 단계 (3)의 단일유전자 유전변이를 갖는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|aff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|unaff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 단계이다. 통계적인 유의성을 판단하기 위해 관측된 대립유전자 빈도(θobs)의 유의영역을 Binomial 분포가정하에 계산한다. 만약 유의영역이 양측의 예측값을 포함할 경우 통계적으로 유의한 판단을 할 수 없다고 결론 내릴 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 일 실시양태에 따른 방법은 산모 혈청 DNA를 차세대 서열분석에 의해 분석함으로써 산모가 임신하고 있는 태아의 단일유전자 유전변이 보유 여부를 정확하게 예측할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시양태에 따른 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법은 (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)에 의해 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계; (2) 상기 보인자 산모의 혈청에서의 태아 DNA의 비율을 계산하는 단계; (3) 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)에서 계산된 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이를 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이와 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (1)은 단일유전자 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)에 의해 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계로서, 전술한 일 실시양태에 따른 방법에서 설명한 바와 같다. 상기 방법은 중복(duplication) 및 결실(deletion) 돌연변이 모두에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (2)는 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계이다. 상기 방법은 전술한 일 실시양태에 따른 방법에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 다른 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (3)은 상기 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하는 단계이다. 서열 리드 깊이는 samtools와 같은 기존의 프로그램을 이용하여 계산될 수 있으며, 상대적 리드 깊이는 염기서열 위치별로 계산된다.
본 발명의 다른 실시양태에 따른 방법에서, 단계 (4)는 상기 단계 (3)에서 계산된 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이를 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이와 비교하는 단계이다.
산모가 단일유전자 유전변이를 갖고 남아를 임신한 경우, 태아의 단일유전자 유전변이의 종류에 따라 그리고 태아가 단일유전자 유전변이를 가지고 있는지 여부에 따라 게놈 DNA 리드 깊이에 대한 혈청 DNA의 리드 깊이의 비율(상대적 리드 깊이; γ)은 달라진다(본원 표 5 참조).
본원 표 5에서 보는 바와 같이, 태아가 결실 돌연변이를 가질 때 돌연변이 부위에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 작으며, 태아 결실 돌연변이를 가지지 않을 때 돌연변이에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 크다. 또한, 태아가 중복 돌연변이를 가질 때 돌연변이 부위에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 크며, 태아 결실 돌연변이를 가지지 않을 때 돌연변이에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 작다.
따라서, 단계 (1)에서 확인된 산모가 결실 돌연변이인 경우, 단계 (4)의 비교 결과 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 작으면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 크면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측할 수 있다. 또한, 단계 (1)에서 확인된 산모가 중복 돌연변이인 경우, 단계 (4)의 비교 결과 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 크면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 작으면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 다른 실시양태에 따른 방법을 통해, 산모의 단일유전자 유전변이의 유형이 결실인지 또는 중복인지 나눈 후, 정상 부위에서의 γ와 유전변이 부위에서의 γ를 비교함으로써 태아에게 상기 단일유전자 유전변이가 유전될지 여부, 즉 임신한 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는지 여부를 쉽게 알아낼 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 일 실시양태에 따른 방법은 산모 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 차세대 서열분석에 의해 분석함으로써 산모가 임신하고 있는 태아의 단일유전자 유전변이를 정확하게 예측할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 일 실시양태에 따른 태아의 단일유전자 유전변이의 예측
<1-1> 산모의 혈청 DNA 의 서열분석
본 실험을 위한 단일유전자 질환으로서 X-연관 열성 형질로 유전되는 단일유전자 변이 질환을 선택하였다.
임신 중인 산모 혈청 DNA에서 유전질환의 원인 유전자의 영역에서 중복(duplication)을 가정하였다.
산모의 시퀀싱 타겟 커버리지를 약 95%, 산모의 혈청 DNA의 서열 평균 리드 깊이는 100, 게놈 DNA의 서열분석 결과의 평균 리드 깊이는 약 100으로 가정하였다.
<1-2> 유전변이 종류 및 부위 확인
단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하기 위해, 리드 깊이의 이동 평균(moving average)를 계산하고 CBS 알고리즘을 적용하여 돌연변이 영역을 확인하였고, 산모가 중복 돌연변이를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
<1-3> 태아 DNA 비율의 측정
실시예 <1-1>의 과정과 유사하게 ZFX(X-linked zinc finger protein) 및 ZFY(Y-linked zinc finger protein) 부위를 표적화하는 커스텀 포획 프로브(custom capture probe)를 이용하여 ZFX 및 ZFY 유전자를 포획하여 태아 DNA 농도 비율을 측정하였다:
태아 DNA 비율 :
Figure pat00002
상기 식에서, ZFX' 및 ZFY'는 총 맵핑된 리드의 수를 프로브의 수로 나눈 값이다.
일례로 ZFX 및 ZFY 유전자를 이용한 태아 DNA 비율(f)의 예측 결과를 하기 표 1 나타내었다.
샘플 총 맵핑된 리드 예측된 태아 DNA 비율
ZFX ZFY
산모 I-2 24242485 878522 0.08604
산모 I-1 44040616 1175572 0.06484
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 산모 I-1 혈청 내 태아 DNA의 비율은 8.6%였고, 산모 II-2 혈청 내 태아 DNA의 비율은 6.4%였다.
<1-4> 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측
산모가 중복 돌연변이 보인자이고 태아가 남아이므로, 태아의 DNA 비율을 f라 할 때 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도(θexp / aff)는 하기 식 1에 의해 예측될 수 있고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도(θexp / unaff)는 하기 식 2에 의해 예측될 수 있다:
<식 1>
θexp / aff = 2/(3-f)
<식 2>
θexp / unaff = 2(1-f)/(3-2f)
상기 태아 DNA 비율에 따른 대립유전자 빈도는 도 1과 같이 그래프화될 수 있다. 도 1에서 위쪽 직선은 단일유전자 유전변이를 갖는 태아를 가리키고, 아래쪽 직선은 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아를 가리킨다. 또한 위쪽 직선 주위의 회색 영역은 돌연변이 영역에서 12개 SNP의 대립유전자 빈도로부터 계산된 신뢰 구간 및 연속적으로 6개의 SNP 및 3개의 SNP의 100회 무작위 샘플로부터 계산된 표준오차(SE)의 평균을 가리킨다.
실시예 <1-3>에서 계산된 태아 DNA 비율을 상기 식에 대입한 결과, 하기 표 2와 같이 대립유전자 빈도가 예측되었다.
산모 I-1 산모 I-2
태아 DNA 비율(f, %) 8.604% 6.484%
θexp / aff (유전변이를 갖는 경우) 0.6863512 0.6813939
θexp / unaff (유전변이를 갖지 않는 경우) 0.6463832 0.6516068
<1-5> 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θ obs )의 측정
산모의 혈청 DNA 서열의 차세대 서열분석 자료에서 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θobs)는 samtools 프로그램을 이용하여 각 대립유전자의 개수를 계수함으로써 계산할 수 있다. 실시예 자료를 이용하여 계산된 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
산모 I-1 산모 I-2
이형단일염기변이의 수 12 10
θobs (측정된 평균 대립유전자 빈도)
(95% 신뢰구간)		 0.6782778
(0.6606647-0.6958908)		 0.6826352
(0.69998752-0.6653952)
상기 표 3에서 측정된 SNP의 평균 대립유전자 빈도(θobs)는 표 2에서 계산된 유전변이를 가질 때의 θexp / aff 값에 더 가까웠으므로, 상기 산모가 임신한 태아는 단일유전자 유전변이를 갖는 태아로 예측할 수 있었다.
실시예 2: 다른 실시양태에 따른 태아의 단일유전자 유전변이의 예측
<2-1> 산모의 혈청 DNA 의 서열분석
열성유전을 하는 유전질환의 원인 유전자 내에 결실(deletion)이 있는 남아를 임신하고 있는 산모를 가정하였다.
상기 산모로부터 얻은 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 대상으로 실시예 <1-1>과 동일한 방식으로 차세대 유전자서열분석(NGS) 기술인 대규모 병렬 시퀀싱에 의해 서열을 분석한 자료를 가정하였다.
산모의 시퀀싱 타겟 커버리지는 약 97.7%였고, 산모의 혈청 DNA의 서열분석 결과의 평균 리드 깊이는 약 465 내지 약 530이었으며, 게놈 DNA의 서열분석 결과의 평균 리드 깊이는 약 1210이었다.
<2-2> 유전변이 종류 및 부위 확인
산모의 서열 리드 깊이의 이동 평균(moving average)를 계산하고 CBS 알고리즘을 적용하여 돌연변이 영역과 돌연변이임 종류를 확인할 수 있다.
<2-3> 태아 DNA 비율의 측정
실시예 <1-3>에 기재된 방법에 따라 태아 DNA 비율을 측정하였다. 상기 측정 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
샘플 총 맵핑된 리드 예측된 태아 DNA 비율
ZFX ZFY
산모 II -1 26051623 567051 0.05352
산모 II -2 29480725 888942 0.07264
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 산모 II-1 혈청 내 태아 DNA의 비율은 5.4%였고, 산모 II-2 혈청 내 태아 DNA의 비율은 7.3%였다.
<2-4> 정상 부위 및 돌연변이 부위에서 게놈 DNA 에 대한 혈청 DNA 의 상대적 리드 깊이의 계산 및 비교
산모가 단일유전자 유전변이를 갖고 남아를 임신한 경우, 태아가 단일유전자 유전변이를 가지고 있는지 여부에 따른 게놈 DNA 리드 깊이에 대한 혈청 DNA의 리드 깊이의 비율은 하기 표 5와 같이 예측될 수 있다.
돌연변이 상태 정상 결실 중복
산모 gDNA의 리드 깊이 1 0.5 1.5
cfDNA 태아 상태 태아 상태
돌연변이를 가짐 돌연변이를 가지지 않음 돌연변이를 가짐 돌연변이를 가지지 않음
산모 DNA의 리드 깊이 1-f (1-f)/2 (1-f)/2 3(1-f)/2 3(1-f)/2
태아 DNA의 리드 깊이 f/2 0 f/2 f f
cfDNA의 리드 깊이 (2-f)/2 (1-f)/2 1/2 (3-f)/2 (3-2f)/2
γ(cfDNA/gDNA) (2-f)/2
=1-(f/2)		 1-f 1 (3-f)/3
=1-(f/3)		 (3-2f)/3
=1-(2f/3)
리드 비율 비교 정상보다 작음 정상보다 큼 정상보다 큼 정상보다 작음
f: 태아 DNA 비율
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 태아가 결실 돌연변이를 가질 때 돌연변이 부위에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 작으며, 태아 결실 돌연변이를 가지지 않을 때 돌연변이에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 크다. 따라서, 산모의 단일유전자 유전변이의 유형이 결실인 경우, 정상 부위에서의 γ와 유전변이 부위에서의 γ를 비교함으로써 태아에게 상기 단일유전자 유전변이가 유전될지 여부, 즉 임신한 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는지 여부를 쉽게 알아낼 수 있다.
또한, 태아가 중복 돌연변이를 가질 때 돌연변이 부위에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 크며, 태아 결실 돌연변이를 가지지 않을 때 돌연변이에서의 γ는 정상 부위에서의 γ에 비해 작다. 따라서, 산모의 단일유전자 유전변이의 유형이 중복인 경우, 정상 부위에서의 γ와 유전변이 부위에서의 γ를 비교함으로써 태아에게 상기 단일유전자 유전변이가 유전될지 여부, 즉 임신한 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는지 여부를 쉽게 알아낼 수 있다.
이러한 예측에 기초하여, 정상 및 돌연변이 부위에서의 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이 비율을 비교하였다.
실험 결과, 산모 II-1 정상 부위에서의 상대적 리드 깊이 비율(γ)은 0.99632였고, 돌연변이 부위에서의 상대적 리드 깊이 비율(γ)은 1.06031이었다. 또한, 산모 II-2의 정상 부위에서의 상대적 리드 깊이 비율(γ)은 0.99647이었고, 돌연변이 부위에서의 상대적 리드 깊이 비율(γ)은 1.07075였다.
산모 II-1는 결실 돌연변이이며, 상기 측정 결과 돌연변이 부위에서의 상대적 리드 깊이 비율이 정상 부위보다 크기 때문에, 이로부터 태아가 정상인 것으로 예측할 수 있다.

Claims (9)

  1. (1) 단일유전자 삽입 또는 결실 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)으로 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계;
    (2) 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계;
    (3) 상기 단계 (1) 및 (2)의 결과를 바탕으로, 태아가 상기 유전변이를 가지는 경우 단일유전자 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이(heterozygous SNP)의 대립유전자 빈도(allele frequency)의 예측값(θexp | aff) 및 태아가 상기 유전변이를 가지지 않는 경우 유전변이 DNA 부위에서의 이형단일염기변이의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp|unaff)을 각각 계산하는 단계;
    (4) 산모의 혈청 DNA 서열자료로부터 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서 이형단일염기변이의 평균 대립유전자 빈도(θobs)를 측정하는 단계; 및
    (5) 상기 단계 (4)에서 측정된 평균 대립유전자 빈도(θobs)가 단계 (3)의 단일유전자 유전변이를 갖는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | aff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 태아에서의 대립유전자 빈도의 예측값(θexp | unaff)에 더 가까운 경우 보인자 산모가 임신하고 있는 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일유전자 유전변이가 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 근관성 근육병증(Myotubular myopathy), 로웨 증후군(Lowe syndrome), 멘케스 증후군(Menkes syndrome), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy), 호에랄-레이다슨 증후군(Hoyeraal-Hreidarsson syndrome), 척수성 근위축증(Spinal Muscular atrophy), 이염색 백색질 장애(Metachromatic leukodystrophy) 및 크라베병(Krabbe disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일유전자 질환을 야기하는 유전변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일유전자 유전변이가 중복(duplication) 또는 결실 (deletion) 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 보인자 산모의 혈장이 무세포(cell-free) 태아 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)의 차세대서열분석이 표적 농축 및 대규모 병렬 서열분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)이 NGS에 의해 얻은 리드 깊이(read depth)로부터 이동 평균(moving average)을 계산하고 CBS(circular binary segmentation) 알고리즘을 적용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. (1) 단일유전자 유전변이를 갖는 보인자 산모의 혈청 DNA 및 게놈 DNA를 차세대 서열분석(Next generation sequencing; NGS)에 의해 분석하여 단일유전자 유전변이의 종류 및 부위를 확인하는 단계;
    (2) 상기 보인자 산모의 혈청으로부터 분리한 DNA 중 태아 DNA의 비율(f)을 계산하는 단계;
    (3) 상기 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하고, 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 산모의 혈청 DNA에 대한 리드 깊이를 산모의 게놈 DNA에 대한 리드 깊이로 나누어 혈청 DNA의 상대적 리드 깊이를 계산하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)에서 계산된 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이를 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이와 비교하는 단계
    를 포함하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 (1)에서 확인된 산모가 결실 돌연변이인 경우, 단계 (4)의 비교 결과 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 작으면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 크면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 단계 (1)에서 확인된 산모가 중복 돌연변이인 경우, 단계 (4)의 비교 결과 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 크면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖는 것으로 예측하고, 단일유전자 유전변이를 갖는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 DNA 부위에서의 상대적 리드 깊이보다 작으면 태아가 단일유전자 유전변이를 갖지 않는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 태아의 단일유전자 유전변이를 예측하는 방법.
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