KR102520656B1 - 무세포 dna를 이용한 태아의 유전 정보 분석 방법 - Google Patents

무세포 dna를 이용한 태아의 유전 정보 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자의 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 대한 발명이다.

Description

무세포 DNA를 이용한 태아의 유전 정보 분석 방법{Method for analyzing fetal genetic information using cell free DNA}
본 발명은 무세포 DNA를 이용한 태아의 유전 정보 분석 방법에 관한 것이다.
Glucokinase (GCK)는 포도당을 포도당-6-인산염으로 전환하는 속도 제한 효소이며 췌장 β 세포에서 포도당 센서 역할을 합니다. GCK 유전자에서 돌연변이를 비활성화하는 것은 소아 성인형 당뇨병(Maturity Onset Diabetes of the Young, MODY)의 가장 흔한 원인이며 공복 포도당의 경미한 지속적인 상승을 특징으로 한다. 분자유전적 진단이 없는 경우 GCK-MODY는 성인이 되기 전에 고혈당증을 보이는 경우가 많기 때문에 일반적으로 1 형 또는 2 형 당뇨병으로 오진된다. 그러나 이는 당뇨병성 미세 혈관 및 대혈관 합병증의 위험을 증가시키지 않으며 일반적으로 치료가 필요하지 않다.
GCK-MODY의 치료가 고려되는 유일한 임상 상황은 임신 중이다. GCK-MODY는 임신성 당뇨병의 약 1 %를 차지한다. 임신 중에 태아 고인슐린 혈증을 유발하는 모성 고혈당증은 태아 과잉 성장과 거대 염의 주요 결정 요인이다. 그러나 GCK-MODY에 의해 복잡한 임신에서 태아 성장은 태아 GCK 유전자형에 의해 영향을 받는다.
그럼에도 불구하고 태아 GCK 유전자형을 산전에서 결정하는 비침습적 방법은 없었다. 현재 전문가 가이드 라인에서는 태아 초음파를 사용하여 2 주마다 태아 성장을 모니터링하고 태아의 복부 둘레가 75 번째 백분위 수 이상이면 치료를 계속할 것을 제안하는 방법을 사용한다.
최근에는 비침습적 산전 검사(NIPT)가 크게 발전하고 있다. NIPT는 현재 태아 이수성을 결정하는데 널리 사용되며 단일 염기쌍에서 돌연변이의 유전을 감지하기 위한 방법으로 발전하고 있다.
본 발명은 비침습적으로 태아 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자의 변이의 유전 여부를 판단하기 위한 정보 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 적어도 1명은 소아 성인형 당뇨병을 가진 부모 중, 산모의 분리된 혈장에서 얻어진 무세포 DNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하는 단계;
상기 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻는 단계; 및
상기 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율을 계산하는 단계를 포함하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 보유 여부, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP의 이형 또는 동형접합 여부, 및 상기 태아 유래 DNA의 비율에 따라 얻어진 제 1 기준값 보다 높으면 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
3. 위 1에 있어서, 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 이를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP를 포함하는 제 1 반수체 및 야생형 SNP를 포함하는 제 2 반수체로 분류하는 단계를 더 포함하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
4. 위 3에 있어서, 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 부계 gDNA의 상기 SNP의 염기를 상기 제 1 반수체의 염기와 동일한 제 1 SNP 또는 제 2 반수체의 염기와 동일한 제 2 SNP로 분류하는 단계를 더 포함하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 무세포 DNA에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻는 단계는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 제 1 비율 및 제 2 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 제 2 비율을 각각 얻는 것인, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
6. 위 5에 있어서, 상기 제 1 비율과 제 2 비율을 태아 유래 DNA의 비율 및 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 유전 여부에 따라 얻어진 각각의 제 2 기준값과 비교하는 단계를 더 포함하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 제 1 비율과 제 2 비율이 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 경우의 제 3 기준값과 그렇지 않은 경우의 제 4 기준값 중 제 3 기준값에 가까우면 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
8. 위 1에 있어서, 상기 소아 성인형 당뇨병은 제 2 형 소아 성인형 당뇨병이고 상기 당뇨병 유발 유전자 변이는 GCK(glucokinase) 유전자 변이인, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
본 발명에 의해 비침습적으로 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부를 판단할 수 있다.
본 발명에 의해 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부에 대한 정확도를 높일 수 있다.
도 1은 무세포 DNA 및 단일 원인 유전자 변이 정보를 사용한 태아 유전형 예측을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 무세포 DNA 및 직접적인 반수체(Haplotype) 정보를 사용한 태아 유전형 예측을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 태아 유전자형을 예측하는 방법에 대한 흐름도이다.
도 4는 αSNP 및 βSNP에 대한 Haplotype 용량 불균형의 SPRT 값을 나타낸 그래프이다.
도 5는 αSNP 및 βSNP에 대한 Haplotype 용량 불균형의 SPRT 값을 나타낸다.
도 6은 산모와 태아의 GCK 변이 여부에 따른 태아의 출생 체중을 예상한 모식도이다.
도 7은 산모와 태아의 GCK 변이 여부에 따른 태아의 출생 체중을 나타낸다.
도 8은 GCK 변이를 동반한 산모에서 태아의 복부 둘레에 따른 임신성 당뇨 치료 방법을 나타낸다.
도 9는 GCK-MODY의 병리생리학 및 MODY 전사요소에 따른 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 임신당뇨병(gestational diabetes mellitus, GDM)의 병리생리학적 특성을 나타낸다.
도 11은 수정 페데르센 가설(Modified Pedersen's hypothesis)을 나타낸 모식도이다.
도 12는 10X Genomics 회사의 단일 DNA 분자 염기서열 분석 방법 (Single DNA Sequencing)에 대한 모식도이다.
도 13은 태아의 DNA 비율(Fetal DNA concentration)을 구하는 방법을 나타낸다.
도 14는 실험의 범위(Depth of coverage)를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적인 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 의미를 따른다.
본 발명은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법에 대한 것이다.
본 발명의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법은 적어도 1명은 소아 성인형 당뇨병을 가진 부모 중, 산모의 분리된 혈장에서 얻어진 무세포 DNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하는 단계; 상기 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻는 단계; 및 상기 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율을 계산하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 소아 성인형 당뇨병(maturity-onset diabetes of young, MODY)은 제 1 형 MODY(HNF4A 유전자 관련), 제 2 형 MODY(GCK 유전자 관련), 제 3 형 MODY(TCF1 유전자 관련), 제 4 형 MODY(IPF1 (PDX1) 유전자 관련), 제 5 형 MODY(TCF2 유전자 관련), 제 6 형 MODY(NeuroD1, or BETA2 유전자 관련)를 포함할 수 있으며, 구체적으로 제 2 형 MODY일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 제 2 형 MODY란 GCK-MODY라고도 하며, GCK(glucokinase) 유전자 변이에 의한 소아 성인형 당뇨병을 의미한다.
본 발명에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이란 소아 성인형 당뇨병에 관여하는 유전 정보 중 일부가 돌연변이(mutation)를 일으킨 경우를 말한다. 예를 들어, 소아 성인형 당뇨병 유발에 관여하는 유전 정보 중 특정 위치의 SNP에서 염기가 변이될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이는 GCK 변이일 수 있다. 구체적으로, GCK 발현에 관여하는 유전 정보 (인간 표준 유전체 hg19/GRCh37 버전으로 염색체 7번 4418,3859번 염기부터 4423,7779번 염기까지) 중 특정 위치의 SNP에서 염기가 변이될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, GCK 변이란 7번 염색체 상의 4418,5121 번 염기의 변이를 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 반수체를 구축하는 단계는 적어도 1명은 소아 성인형 당뇨병을 가진 부모 중, 산모의 분리된 혈장에서 얻어진 무세포 DNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하여 수행될 수 있다.
태아의 부모 중 적어도 1명이 소아 성인형 당뇨병을 가지는 경우를 대상으로 하는 것으로서, 부, 모, 또는 2명 다 소아 성인형 당뇨병을 가지는 경우를 대상으로 할 수 있고, 소아 성인형 당뇨병을 가지는 경우 유전자 변이를 homo 또는 hetero로 가지는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않으며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 homo로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않으며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 hetero로 가지는 경우, 부모 중 모계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않으며, 부계가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지지 않는 경우가 있을 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 산모의 분리된 혈장에서 얻어진 무세포 DNA는 태아 유래 DNA(무세포 태아 DNA, cffDNA(cell free fetal DNA)) 및 산모 유래 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명에서 태아 유래 DNA의 비율은 모체 혈장 무세포 DNA 총량의 5% 내지 25%일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
반수체 구축은 예를 들면 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자를 포함하는 염색체의 유전자형을 분석하여 정보 분석에 이용하기 위한 반수체로 구축하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 무세포 DNA에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻는 단계는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 분석하고, 얻어진 반수체의 비율을 합산함으로써 수행될 수 있다.
구체적으로, 특정 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 가지는 SNP 하나를 분석할 수 있고, 또는 다수개의 SNP를 분석할 수 있다. 하나의 SNP를 분석하는 경우에 비해서 다수개의 SNP를 분석하는 경우 반수체의 비율의 신뢰도가 향상될 수 있다.
본 발명에서 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율을 계산하는 단계는 전체 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 분획을 구하여 계산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아 유래 DNA의 비율은 하기 계산식을 이용하여 계산될 수 있다.
[계산식 1]
f = Σ 2p / Σ (p + q)
(p: 모계에서 존재하지 않으며 부계로부터 유전된 태아 특이적 대립 유전자 판독 수, q: 임산부와 태아가 공유한 모계 동형접합 대립 유전자 판독 수).
무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율을 계산하는 단계의 수행 순서는 특별히 한정되지 않으며, 반수체 구축 전, 구축된 반수체에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻기 전 또는 상기 단계들 후에 수행될 수 있다.
본 발명에서 DNA 분석 방법은 관련 기술분야에서 일반적으로 사용하는 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 구체적으로, 상대적 반수체 용량(relativie haplotype dosage, RHDO) 분석, 대량 병렬 염기서열 분석(Massive parallel sequencing), 연결 읽기 염기서열 분석(linked-read sequencing) 및 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing) 중 적어도 하나를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법을 이용하여 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 보유 여부, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP의 이형 또는 동형접합 여부 및 상기 태아 유래 DNA의 비율에 따라 얻어진 제 1 기준값 보다 높은 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
본 발명에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율은 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 보유 여부, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP의 이형 또는 동형접합 여부 및 상기 태아 유래 DNA의 비율에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이러한 사항에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 태아에게 유전될 수 있으므로, 부모 중 1명만 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 보유하는 경우에 비해 부모 모두가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 경우에 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 증가할 수 있다.
또한, 예를 들어, 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP가 이형접합인 경우에 비해 동형접합인 경우 태아가 유전 받을 수 있는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 증가하므로 그 반수체의 비율이 증가할 수 있다.
또한, 예를 들어, 혈장 무세포 DNA의 전체 비율 중, 태아 유래 DNA의 비율을 제외하여 모계 gDNA의 비율을 계산할 수 있다. 구체적으로, 태아 유래 DNA의 비율이 20%인 경우, 모계 gDNA의 비율은 80%일 수 있다. 혈장 무세포 DNA의 전체 비율 중, 태아 유래 DNA의 비율이 10%인 경우, 모계 gDNA의 비율은 90%일 수 있다.
본 발명에서 상기 제1 기준값은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 보유 여부, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP의 이형 또는 동형접합 여부 및 태아 유래 DNA의 비율에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이러한 사항에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았을 경우 cffDNA 중 모계 유래 GCK 변이 배수체 cffDNA의 비율은 (1-fetal fraction)/2 이며, 태아 유래 GCK 변이 배수체 cffDNA의 비율은 (fetal fraction)/2 일 수 있다. 따라서 총 GCK 변이 배수체 cffDNA의 비율은 50%에 근사하게 되며 이 값을 제 1 기준값으로 사용할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 기준값은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 일 수 있다. 구체적으로 제 1 기준값은 40% 일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 기준값이 40%인 경우, 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 40% 보다 높은 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다. 구체적으로, 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 50%에 수렴하는 경우 상기 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 기준값이 40%인 경우, 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 40%에 수렴하는 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받지 않았다고 진단할 수 있다.
본 발명의 방법은 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 이를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP를 포함하는 제 1 반수체 및 야생형 SNP를 포함하는 제 2 반수체로 분류하는 단계를 더 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 모계 gDNA는 산모의 세포, 혈장 등의 염기서열 분석을 통해 분석될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하는 단계는 연결 읽기 염기서열 분석 또는 단일 세포 DNA 염기서열 분석 기술을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 단수개 또는 복수개를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP는 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열, 4418,5758 번째 염기서열, 4418,6328 번째 염기서열, 4419,2260 번째 염기서열, 4419,7583 번째 염기서열, 4419,9142 번째 염기서열, 4420,3912 번째 염기서열, 4421,3222 번째 염기서열, 4421,3726 번째 염기서열, 4421,6754 번째 염기서열, 4421,7126 번째 염기서열, 4421,9074 번째 염기서열, 4422,1581 번째 염기서열, 4422,2471 번째 염기서열, 4422,3479 번째 염기서열, 4422,3721 번째 염기서열, 4422,3942 번째 염기서열, 4422,6101 번째 염기서열, 4422,9068번째 염기서열일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP를 포함하는 제 1 반수체 및 야생형 SNP를 포함하는 제 2 반수체로 분류하는 단계는 상기 구축된 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체에서 각 SNP의 염기서열의 변이 여부에 따라 반수체를 분류하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 제 1 반수체(Haplotype Ⅰ, HpaⅠ)란 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기서열이 변이된 모계의 반수체를 말한다.
본 발명에서 제 2 반수체(Haplotype Ⅱ, HpaⅡ)란 야생형 SNP를 포함하는 모계의 반수체를 말한다. 구체적으로, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기서열이 변이되지 않은 모계의 반수체를 말한다.
본 발명의 일 실시예에서, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP 중 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열에 변이가 일어난 경우에 제 1 반수체로 분류할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 모계 반수체 정보 및 무세포 DNA의 상대적 용량(dosage)를 분석하여 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 유전 여부를 판단할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 부계 gDNA의 상기 SNP의 염기를 상기 제 1 반수체의 염기와 동일한 제 1 SNP 또는 제 2 반수체의 염기와 동일한 제 2 SNP로 분류하는 단계를 더 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 부계 gDNA는 산모의 세포, 혈장 등의 염기서열 분석을 통해 분석될 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 부계 gDNA의 유전자형(genotype)은 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하는 단계는 연결 읽기 염기서열 분석 또는 단일 세포 DNA 염기서열 분석 기술을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 단수개 또는 복수개를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP는 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열, 4418,5758 번째 염기서열, 4418,6328 번째 염기서열, 4419,2260 번째 염기서열, 4419,7583 번째 염기서열, 4419,9142 번째 염기서열, 4420,3912 번째 염기서열, 4421,3222 번째 염기서열, 4421,3726 번째 염기서열, 4421,6754 번째 염기서열, 4421,7126 번째 염기서열, 4421,9074 번째 염기서열, 4422,1581 번째 염기서열, 4422,2471 번째 염기서열, 4422,3479 번째 염기서열, 4422,3721 번째 염기서열, 4422,3942 번째 염기서열, 4422,6101 번째 염기서열, 4422,9068번째 염기서열일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 부계 gDNA의 상기 SNP의 염기를 상기 제 1 반수체의 염기와 동일한 제 1 SNP 또는 제 2 반수체의 염기와 동일한 제 2 SNP로 분류하는 단계는 상기 구축된 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기서열을 분석하여 각 SNP를 분류하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 제 1 SNP란 알파 SNP(αSNP)라고도 하며, 부계 gDNA의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 반수체의 염기와 동일한 SNP 를 말한다.
본 발명에서 제 2 SNP란 베타 SNP(βSNP)라고도 하며, 부계 gDNA의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 2 반수체의 염기와 동일한 SNP 를 말한다.
본 발명의 일 실시예에서, 부계 gDNA의 SNP 중 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열이 모계의 제 1 반수체의 염기와 동일한 경우 제 1 SNP로 분류할 수 있다. 또한, 부계 gDNA의 SNP 중 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열이 모계의 제 2 반수체의 염기와 동일한 경우 제 2 SNP로 분류할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법이 모계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 이를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP를 포함하는 제 1 반수체 및 야생형 SNP를 포함하는 제 2 반수체로 분류하는 단계 및 부계 gDNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하고, 부계 gDNA의 상기 SNP의 염기를 상기 제 1 반수체의 염기와 동일한 제 1 SNP 또는 제 2 반수체의 염기와 동일한 제 2 SNP로 분류하는 단계를 더 포함하는 경우, 상기 무세포 DNA에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 얻는 단계를 통해 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 제 1 비율 및 제 2 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 제 2 비율을 각각 얻을 수 있다.
본 발명에서 제 1 비율이란 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 말한다.
예를 들어, 부계 gDNA의 SNP 중 4418,6328 번째 염기서열, 4420,3912 번째 염기서열, 4421,3222 번째 염기서열, 4421,6754 번째 염기서열, 4421,7126 번째 염기서열, 4421,9074 번째 염기서열, 4422,1581 번째 염기서열, 4422,3721 번째 염기서열, 4422,3942 번째 염기서열, 4422,6101 번째 염기서열, 4422,9068번째 염기서열이 모계의 제 1 반수체의 염기와 동일한 경우의 비율을 합산하여 제 1 비율을 구할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제 1 비율은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 SNP의 염기와 동일한 경우의 야생형 반수체의 비율을 이용하여 구할 수 있다.
본 발명에서 제 2 비율이란 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 2 SNP의 염기와 동일한 경우의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율을 말한다.
예를 들어, 부계 gDNA의 SNP 중 7번 상염색체의 4418,5121번째 염기서열, 4418,5758 번째 염기서열, 4419,2260 번째 염기서열, 4419,7583 번째 염기서열, 4419,9142 번째 염기서열, 4421,3726 번째 염기서열, 4422,2471 번째 염기서열, 4422,3479 번째 염기서열이 모계의 제 1 반수체의 염기와 동일한 경우의 비율을 합산하여 제 2 비율을 구할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제 2 비율은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 2 SNP의 염기와 동일한 경우의 야생형 반수체의 비율을 이용하여 구할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아 DNA 비율이 20%, 태아가 모계 GCK 변이를 받은 경우, 제 1 SNP의 제 1 반수체(Hap1) 비율은 60%, 제 2 SNP의 제 1 반수체(Hap1) 비율은 50%일 수 있다. 반대로 태아 DNA 비율이 20%, 태아가 모계 GCK 변이를 받지 않은 경우, 제 1 SNP의 제 1 반수체(Hap1) 비율은 50%,　제 2 SNP의 제 1 반수체(Hap1) 비율은 60%일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 제 1 비율과 제 2 비율을 태아 유래 DNA의 비율 및 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 유전 여부에 따라 얻어진 각각의 기준값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 제 1 비율 및 제 2 비율과 비교하는 태아 유래 DNA의 비율 및 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 유전 여부에 따라 얻어진 각각의 기준값은 제 2 기준값, 제 3 기준값 또는 제 4 기준값일 수 있다.
본 발명에서 제 2 기준값, 제 3 기준값 및 제 4 기준값은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 보유 여부, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 SNP의 이형 또는 동형접합 여부 및 태아 유래 DNA의 비율에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이러한 사항에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 부모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 태아에게 유전될 수 있으므로, 부모 중 1명만 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 보유하는 경우에 비해 부모 모두가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 경우에 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 증가할 수 있다.
또한, 예를 들어, 혈장 무세포 DNA의 전체 비율 중, 태아 유래 DNA의 비율을 제외하여 모계 gDNA의 비율을 계산할 수 있다. 구체적으로, 태아 유래 DNA의 비율이 20%인 경우, 모계 gDNA의 비율은 80%일 수 있다. 혈장 무세포 DNA의 전체 비율 중, 태아 유래 DNA의 비율이 10%인 경우, 모계 gDNA의 비율은 90%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았을 경우 cffDNA 중 모계 유래 GCK 변이 배수체 cffDNA의 비율은 (1-fetal fraction)/2 이며, 태아 유래 GCK 변이 배수체 cffDNA의 비율은 (fetal fraction)/2 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 2 기준값, 제 3 기준값 및 제 4 기준값은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 일 수 있다. 구체적으로 제 2 기준값, 제 3 기준값 또는 제 4 기준값은 40% 일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 2 기준값이 40%인 경우, 제 1 비율과 제 2 비율이 40% 보다 높은 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다. 구체적으로, 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율이 50%에 수렴하는 경우 상기 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 2 기준값이 40%인 경우, 제 1 비율과 제 2 비율이 40%에 수렴하는 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받지 않았다고 진단할 수 있다.
본 발명에서 제 3 기준값은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 경우의 값일 수 있다. 본 발명에서 제 4 기준값은 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 아닌 경우일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 1 비율과 제 2 비율이 제 3 기준값과 제 4 기준값 중 제 3 기준값에 가까우면 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
예를 들어, 제 3 기준값이 40%이고 제 4 기준값이 60%인 경우, 제 1 비율이 40%에 가까운 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
예를 들어, 제 3 기준값이 40%이고 제 4 기준값이 60%인 경우, 제 2 비율이 40%에 가까운 경우 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 진단할 수 있다.
본 발명에서 유전 형질의 발현 정도는 유전기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법이라면 제한 없이 사용하여 확인할 수 있다. 구체적으로, 순차적 확률비 테스트(The sequential probability ratio test, SPRT)를 이용할 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 SPRT 분석은 해당 기술분야에서 이용되는 모든 방법을 제한 없이 이용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, SPRT에 의하여 태아의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 유전 여부를 판단할 수 있다. 예를 들어, 제 1 SNP의 경우, SPRT를 통해 제 1 반수체 발현이 증가한 경우에 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전한 것으로 판단할 수 있다. 제 2 SNP의 경우, 제 1 반수체 발현이 동등 또는 유사한 경우에 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, αSNP의 경우 태아가 어머니로부터 HapI를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 동형 접합이 되고 HapI에서 αSNP 대립 유전자가 과도하게 나타날 수 있다. 반대로 태아가 산모로부터 HapII를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 이형 접합이 되고 HapI는 동등하게 표현될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, βSNP의 경우 태아가 어머니로부터 HapI를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 이형 접합이 되고 HapI가 동일하게 표시될 수 있다. 반대로 태아가 산모로부터 HapII를 물려 받았다면 HapII의 대립 유전자에 대해 동형 접합이 되고 HapI는 과소 표현될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, SPRT의 귀무 가설은 용량 불균형이 없다는 것일 수 있다. 이 경우 αSNP의 경우 HapI의 과대 표현이 없었으며 HapI와 HapII 사이에 용량 불균형이 없다는 귀무 가설을 뒷받침할 수 있다. 반면, βSNP의 경우 HapI에 대한 유의미한 표현이 있었고 용량 불균형이 없다는 귀무 가설을 뒷받침하지 못할 수 있다. 이는 태아가 HapII에 연결된 GCK 야생형을 물려 받았음을 시사할 수 있다.
본 발명에서 SPRT는 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자를 포함하는 반수체에 존재하는 유전자 변이의 total cumulative coverage (total read count) 정보와 cumulative fraction of Hap1 정보를 바탕으로 계산할 수 있다. Beta SNP의 경우 모든 beta SNP의 read count를 순차적으로 더하면서 이 때 누적된 cumulative fraction of Hap1이 기준 값 범위를 벗어나는지 통계적으로 검정할 수 있다. 또한, SNP를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 1개만 사용하는 것이 아니라 배수체에 존재하는 보다 많은 수의 beta SNP 정보를 이용하여 통계적 검정의 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명에서 제 1 SNP(Alpha SNP)의 경우도 모든 제 1 SNP(Alpha SNP)의 read count를 순차적으로 더하면서 이 때 누적된 cumulative fraction of Hap1이 기준 값 범위를 벗어나는지 통계적으로 검정할 수 있다. 만약 태아가 산모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 배수체를 받지 않았다면 cumulative fraction of HapI은 기준값인 50%에 근사할 수 있다. 이 때 SNP를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 1개만 사용하는 것이 아니라 배수체에 존재하는 보다 많은 수의 beta SNP 정보를 이용하여 통계적 검정의 신뢰도를 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아가 산모의 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이 배수체를 받지 않았다면 cumulative fraction of HapI은 기준 값인 50% 보다 통계적으로 유의하게 작을 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
1. 연구 설계 및 참가자
본 발명은 개념 증명 연구였습니다. 이 연구에는 GCK-MODY를 가진 임산부, 남성 파트너 및 그들의 자손으로 구성된 한 가족 트리오가 참여했습니다. 서울 대학교 병원에서 모집되었습니다. 무세포(무세포) 태아 DNA 및 gDNA에 대한 혈액 샘플은 임신한 여성의 임신 24 주에 채취되었습니다. 임산부와 파트너는 서면 동의를 제공했습니다. 서울 대학교 병원 생명 의학 연구소 기관 심의위원회 (H-1807-185-962)는 연구 프로토콜을 승인했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었습니다.
2. 태아 유전자형 예측의 워크 플로우(도면 3 참조)
태아 유전자형은 제 1 반수체 및 산모 혈장 DNA에서 제 2 반수체의 대립 유전자에 대한 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 대립 유전자의 상대적 계수를 측정하는 상대 반수체 용량(relative haplotype dosage, RHDO) 접근법을 사용하여 예측되었습니다. GCK-MODY 임산부로부터 혈장 무세포 DNA를 추출하고 표적화된 대규모 병렬 염기서열 분석을 수행했습니다. 모체 gDNA는 10X 게놈 연결 읽기 염기서열 분석 기술을 활용하여 직접적인 반수체 정보를 분석하는 데 사용되었습니다. 아버지 gDNA는 표적 대량 병렬 염기서열 분석에 사용되었습니다. 모체 DNA에서는 이형 접합이고 부계 DNA에서는 동형 접합인 SNP를 사용하여 RHDO를 추정했습니다. 제 1 반수체의 과대 표현 또는 과소 표현은 순차적 확률비 테스트(SPRT)로 테스트되었습니다. 또한, 자손의 제대혈 DNA 또는 타액 DNA를 사용하여 예측된 GCK 유전자형을 확인했습니다.
3. DNA 추출
모체 혈장 무세포 DNA를 추출하기 위해 임신 24 주차에 GCK-MODY 임산부로부터 총 10ml 혈장 샘플을 준비했습니다. 순환 무세포 DNA 추출은 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, 카탈로그 번호 55114 (QIAGEN, Venlo, 네덜란드)로 수행되었습니다. 부계 gDNA는 QIAamp DNA Mini Kit, 카탈로그 번호 51304 (QIAGEN, Venlo, Netherlands)를 사용하여 말초 혈액 백혈구에서 추출되었습니다. 자손의 유전형은 제대혈에서 추출한 DNA로 Sanger 염기서열 분석을 사용하여 수행되었습니다.
4. 대상 대규모 병렬 염기서열 분석(Targeted Massive Parallel Sequencing)
대상 대규모 병렬 염기서열 분석을 수행했습니다. 캡처 프로브는 GCK 유전자의 프로모터, 엑손 및 번역되지 않은 영역을 포함하도록 맞춤 설계되었습니다(GDK 유전자 위치 chr7 hg19/GRCh37 human genome coordinate 기준 base-position 44,183,859-44,237,779). Agilent SureDesign (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) 소프트웨어를 프로브 설계에 사용하고 SureSelectXT Custom Kit (Agilent Technology)를 사용하여 캡처했습니다. 캡처된 DNA 단편은 제조업체의 지침에 따라 Macrogen, Inc. (대한민국 서울)의 Illumina HiSeq 2,500 Sequencing System (Illumina Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 페어 드 엔드(paired-end sequenced) 염기서열 분석되었습니다.
5. 연결 읽기 염기서열 분석(Linked-Read Sequencing)
10X Genomics ChromiumTM 라이브러리 (Pleasanton, CA, USA)를 사용하여, 모체 고분자량 gDNA에서 바코드 DNA 분자를 획득했습니다. 10X 기술은 미세 유체 장치를 사용하여 단일 gDNA 분자를 GEM이라고하는 오일로 둘러싸인 개별 젤 비드로 분할합니다. 동일한 GEM의 모든 조각은 고유하고 구별 가능한 바코드로 태그가 지정되어 단일 보석 내에 유전자 라이브러리 환경을 만듭니다. 바코드 판독은 GCK 용 맞춤형 표적 캡처 키트를 사용하여 캡처되었습니다. 그런 다음 Illumina HiSeq 2500 염기서열 분석 시스템 (San Diego, CA, USA)을 사용하여 바코드 및 강화 된 판독을 염기서열 분석했습니다.
6. 무세포 DNA의 태아 비율(Fetal fraction of plasma cell-free DNA)
산모와 남성 파트너의 서로 다른 대립 유전자에 대해 동형 접합인 변이체를 사용하여 형질 무세포 DNA의 태아 비율(f)을 추정했습니다. 태아 비율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.
[계산식 1]
f = Σ 2p / Σ (p + q),
(p: 모계에서 존재하지 않으며 부계로부터 유전된 태아 특이적 대립 유전자 판독 수, q: 임산부와 태아가 공유한 모계 동형접합 대립 유전자 판독 수)
특정 유전좌위에서 모계는 AA 동형 접합이고 부계는 AT 이형접합이면서 태아가 부계 T allele을 받은 경우 태아는 AT 이형접합이며 cffDNA에서 T allele의 비율은 fetal fraction의 절반에 해당하였습니다. 따라서 Fetal fraction은 모계는 동형접합이며 부계는 이형접합인 변이가 태아에게 유전되었을 경우 그 판독수의 2배에 해당하였습니다.
7. Direct 반수체 위상(Direct Haplotype Phasing)
GCK 영역의 모계 반수체 정보는 연결 읽기 sequencing 결과를 사용하여 직접 해결되었습니다. 바코드 시퀀스 판독은 Long Ranger 소프트웨어 버전 2.2.2를 사용하여 선형으로 연결되었습니다. 바코드 판독의 정렬은 참조 인간 게놈 빌드 GRCh37과 함께 10X LariatTM을 사용하여 수행되었습니다. 동일한 바코드 정보를 가진 읽기는 동일한 단일 DNA 분자에서 시작되므로 이러한 읽기를 연결하여 반수체 블록을 직접 재구성 할 수 있습니다. Long Ranger에서 FreeBayes 메서드로 변형 호출이 수행되었습니다. GCK 병원성 대립 유전자가 있는 반수체를 제 1 반수체로 지정하고 다른 반수체를 제 2 반수체로 지정했습니다.
8. 태아 유전형 예측(Fetal Genotype Prediction)
태아 유전형 예측은 RHDO 분석을 기반으로 했습니다. 모체 gDNA에서는 이형 접합이고 부계 gDNA에서는 동형 접합인 SNP를 선택했습니다. HapI에서 대립 유전자와 동일한 부계 대립 유전자를 갖는 SNP는 αSNP로 표시되었습니다. HapII의 대립 유전자와 동일한 부계 대립 유전자를 가진 SNP는 βSNP로 표시되었습니다.
αSNP의 경우 태아가 어머니로부터 HapI를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 동형 접합이 되고 HapI에서 αSNP 대립 유전자가 과도하게 나타났습니다. 반대로 태아가 산모로부터 HapII를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 이형 접합이 되고 HapI는 동등하게 표현되었습니다. βSNP의 경우 태아가 어머니로부터 HapI를 물려 받았다면 HapI의 대립 유전자에 대해 이형 접합이 되고 HapI가 동일하게 표시되었습니다. 반대로 태아가 산모로부터 HapII를 물려 받았다면 HapII의 대립 유전자에 대해 동형 접합이 되고 HapI는 과소 표현되었습니다.
태아의 대립 유전자 불균형과 반수체 유전은 SPRT에 의해 통계적으로 추론될 수 있습니다(도 4 참조).
9. 연구 참가자의 임상적 특성 및 결과
임신 9주차에 명백한 당뇨병을 앓고 있는 40 세 임산부를 대상으로 하였습니다. 산모는 두 번째 임신이었고, 3년 전 첫 번째 임신 중에 GDM 진단을 받았습니다. 첫 임신 기간 동안 그녀는 하루 총 48 단위를 투여하는 basal-bolus insulin therapy로 치료를 받았습니다. 그녀는 임신 38 주에 출생 체중이 2480g(10 번째 백분위 수)인 건강한 아기를 출산했으며 나중에 GCK 돌연변이가 유전된 것으로 밝혀졌습니다. 산후 2 개월 75g 경구 포도당 내성 검사(OGTT)는 공복 포도당 장애 및 포도당 내성 장애(공복 포도당 123 mg / dL, 2 시간 포도당 197 mg / dL)를 나타냈습니다. 산후 6 개월의 Hba1c는 6.9 %였습니다. 산모는 GDM을 경험 한 두 자매가 있었습니다. 두 번째 임신 기간 동안 자가 모니터링 혈당 수치는 115-130 mg / dL였습니다. GCK MODY가 의심되었고 표적 패널 염기서열 분석은 GCK 유전자(NM_000162)에 병원성 돌연변이 (chr7: 44185121: C> T, c.G1228A, pG410S)가 있을 가능성이 있음을 보여주었습니다.
임신 24 주차에 혈장 무세포 DNA와 gDNA 분석을 위해 혈액 샘플을 수집했습니다. 처리 시간은 6 주였습니다. 형질 무세포 DNA의 태아 비율은 21.8 %였다. 표 1과 같이 정보를 제공하는 변종은 총 19 개 (부계 gDNA의 경우 동형 접합, 모체 gDNA의 이형 접합)가 있었습니다. 이 중 11 개는 αSNP이고 8 개는 βSNP이었습니다.
αSNP의 경우 누적 HapI 주파수가 51.4 %로 수렴되어 거의 50 %에 가까웠습니다. βSNP의 경우 누적 HapI 주파수가 40.0 %로 수렴되었습니다. αSNP에 대한 SPRT에서는 HapI가 과도하게 표현되지 않았으며 HapI와 HapII간에 용량 불균형이 없다는 귀무 가설을 뒷받침하였습니다(도면 4 참조). 이것은 태아가 HapI를 상속하지 않았음을 시사하였습니다. 반대로, βSNP의 경우 HapI에 대한 유의미한 표현이 있었고 용량 불균형이 없다는 귀무 가설을 뒷받침하지 못했습니다. 이것은 태아가 HapII를 물려 받았음을 시사합니다. 이러한 결과를 종합하여 우리는 태아가 GCK 돌연변이를 유전 받지 못한다고 예측했습니다.
GCK 돌연변이를 물려받지 않은 태아가 인슐린의 과잉 분비로 산모의 고혈당증에 반응할 것이므로 우리는 임신 30 주차부터 basal-bolus insulin으로 산모를 치료하기로 결정했습니다. 환자는 엄격한 혈당 조절을 받았고, 임신 38주에 2980g (25 번째 백분위 수)의 건강한 아기를 출산했습니다. 태아의 출생 후 태반 제대혈 이용한 생어 염기서열 분석을 통해 태아가 GCK 돌연변이를 유전하지 않는다는 예측을 확인했습니다.
Variant Chr:position chr7:44185121
(Culprit Mutation) 		chr7:44185758 chr7:44186328 chr7:44192260 chr7:44197583 chr7:44199142 chr7:44203912 chr7:44213222 chr7:44213726 chr7:44216754 chr7:44217126 chr7:44219074 chr7:44221581 chr7:44222471 chr7:44223479 chr7:44223721 chr7:44223942 chr7:44226101 chr7:44229068
Maternal gDNA (Heterozygous) HapI
(Mutant-linked)		 T G C A T T G T T T T C C A G G G C C
HapII
(Wild-type-linked)		 C C T C G C A A C C C T A G A A A T T
Paternal gDNA (Homozygous) Genotype CC CC CC CC GG CC GG TT CC TT TT CC CC GG AA GG GG CC CC
αSNP
(Identical to HapI)		 - - Yes - - - Yes Yes - Yes Yes Yes Yes - - Yes Yes Yes Yes
βSNP
(Identical to HapII)		 Yes Yes - Yes Yes Yes - - Yes - - - - Yes Yes - - - -
Plasma 무세포 DNA αSNP
(Paternal allele identical to HapI) 		HapI Count - - 123 - - - 220 81 - 522 423 478 412 - - 399 441 107 450
HapII Count - - 146 - - - 183 83 - 495 397 503 405 - - 320 399 107 422
Cumulative HapI Count - - 123 - - - 343 424 - 946 1369 1847 2259 - - 2658 3099 3206 3656
Cumulative HapI Frequency (%) - - 45.7 - - - 51.0 50.7 - 51.1 51.2 50.5 50.5 - - 51.2 51.4 51.3 51.4
Plasma 무세포 DNA βSNP
(Paternal allele identical to HapII) 		HapI Count 235 79 - 6 92 312 - - 36 - - - - 319 302 - - - -
HapII Count 378 101 - 12 150 459 - - 69 - - - - 455 450 - - - -
Cumulative HapI Count 235 314 - 320 412 724 - - 760 - - - - 1079 1381 - - - -
Cumulative HapI Frequency (%) 38.3 39.6 - 39.5 39.1 39.7 - - 39.4 - - - - 39.9 40.0 - - - -
(모계 반수체 정보는 linked-read sequencing에 의해 직접 해결되었습니다. 유익한 총 19 개의 변종 (부계 gDNA의 경우 동형 접합, 모계 gDNA의 경우 이형 접합)을 분석했습니다. 범인 병원성 돌연변이(The culprit pathogenic mutation)는 chr7: 4418,5121입니다. αSNP 및 βSNP에 대한 부모 배수체형 정보 및 누적 HapI 빈도가 추정되었습니다.)

Claims (8)

  1. (a) 적어도 1명은 소아 성인형 당뇨병을 가진 부모 중, 산모의 분리된 혈장에서 얻어진 무세포 DNA에서 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축하는 단계;
    (b) 모계 gDNA를 단일 세포 DNA 서열 분석하여 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP를 포함하는 반수체를 구축한 후, 이를 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생한 SNP를 포함하는 제 1 반수체 및 야생형 SNP를 포함하는 제 2 반수체로 분류하는 단계;
    (c) 부계 gDNA에서 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기를 상기 제 1 반수체의 염기와 동일한 제 1 SNP 또는 상기 제 2 반수체의 염기와 동일한 제 2 SNP로 분류하는 단계; 및
    (d) 상기 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율을 계산한 후,
    i)부계 gDNA에서 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 1 SNP인 경우 상기 (a) 단계의 상기 무세포 DNA에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율(제1 비율)을 구하고,
    ii) 부계 gDNA에서 상기 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이가 발생하는 위치의 SNP의 염기가 제 2 SNP인 경우 상기 (a) 단계의 무세포 DNA에서 구축된 반수체 중 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 갖는 반수체의 비율(제2 비율)을 구하는 단계;를 포함하는,
    소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 SNP는 모계 gDNA에서는 이형 접합이고 부계 gDNA에서는 동형 접합인, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 무세포 DNA에서 태아 유래 DNA의 비율은 하기 수학식 1로 계산되는 것인, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법:
    [수학식 1]
    (태아 유래 DNA의 비율)= Σ 2p / Σ(p + q),
    (p: 모계에서 존재하지 않으며 부계로부터 유전된 태아 특이적 대립 유전자 판독 수, q: 모계와 태아가 공유한 모계 동형접합 대립 유전자 판독 수).
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 비율 및 제2 비율이 40% 보다 높으면 태아가 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이를 유전 받았다고 판단하는, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 소아 성인형 당뇨병은 제 2 형 소아 성인형 당뇨병이고 상기 당뇨병 유발 유전자 변이는 GCK(glucokinase) 유전자 변이인, 소아 성인형 당뇨병 유발 유전자 변이의 유전 여부 진단에 필요한 정보 제공 방법.
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