KR20190015827A - 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법 - Google Patents

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KR20190015827A
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천재희
김원호
이민구
김한상
정은석
이지현
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대한민국 (식품의약품안전처장)
연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하여 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법은 단일염기다형성 만을 확인하여 약물유해반응으로 인한 환자의 고통 및/또는 위험 부담을 현저히 감소시킬 수 있기 때문에 약물 처치 전에 저비용, 단기간의 확인 만으로 안전하게 약물 유해반응을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법{Method of providing the information for predicting adverse drug reaction}
본 발명은 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하여 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응을 예측하는 방법에 관한 것이다.
염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)은 통상적으로 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)과 크론병(Crohn's disease; CD)으로 대별되는 특발성 염증성 장 질환을 지칭하며 장에 발생하는 원인 불명의 만성적인 염증이다. 크론병의 발병에 기여하는 유전자로 NOD2/CARD15가 발견되고, 그 후 유전체 전체 연관성 분석(GWAS)은 염증성 장 질환에서 적응면역과 선천면역, 자가소화작용의 기작과 연관된 크론병과 궤양성 대장염에 대한 여러 유전적 좌를 밝혀왔다. 또한, 최근 GWAS의 메타분석은 71, 47 위치에서 많은 크론병, 궤양성 대장염 감수성 유전자좌를 확인하였다. 염색체 5q33.1 위치의 immunity-related GTPase family M(IRGM)은 세포내에 들어온 새롭게 확인된 병원균을 제거하는 메커니즘에 관여하는 p47 IRGs 패밀리의 하나이다.
이러한 염증성 장질환의 치료방법으로는 티오퓨린계 약물 투여가 가장 많이 사용되는 방법이나, 이에 대한 약물유해반응으로서 골수 감소, 백혈구 감소 등이 발병되어 환자의 수명을 단축시키는 부작용이 종종 발생하며, 이러한 부작용은 유럽인 보다는 동아시아인에서 더욱 빈번히 발생되는 것으로 알려져있다(J. Clin. Gastroenterol. (2010) 44:e242-8).
따라서, 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응으로 인한 환자의 고통 및 위험부담을 감소시키기 위해서는 저비용으로 단시간 내에 약물유해반응의 유발 위험을 예측할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하여 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응을 예측하는 방법 및 이를 이용한 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에 있어서, "약물유해반응(adverse drug reaction)"이란 특정 약물에 의한 의도하지 않은 반응을 의미하는 광의의 개념을 말한다. 바람직하게는 골수억제(myelosuppression), 백혈구 감소증(leukopenia) 등 일 수 있으나, 염증성 장질환 환자에서 티오퓨린계 약물로 인해 유발될 수 있는 부작용이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "생물학적 시료"란 환자 유전자의 단일염기다형성을 확인할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나, 단일염기다형성을 확인할 수 있는 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "키트"란 단일염기다형성을 확인하여 티오퓨린계 약물로 인해 유발될 수 있는 약물유해반응을 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 단일염기다형성을 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 단일염기다형성인 rs79206939에 특이적으로 결합하는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer) 세트를 포함할 수 있으며, 상기 "프로브 또는 프라이머"는 rs79206939에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드(oliogonucleotide)를 의미할 수 있으나, 특정 단일염기다형성을 확인할 수 있는 프로브 또는 프라이머 세트라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 있어서, “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”이란 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예:AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 변이성(variation)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다. 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
인간의 DNA 서열 상의 변이성은 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 반응하는 가에 영향을 미칠 수 있다. 또한, SNP는 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 도구(key enabler)로 생각된다. 무엇보다도, 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNP는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).
본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단일염기다형성은 바람직하게는 FTO의 인트론 부위의 단일염기다형성이며, 더욱 바람직하게는 rs79206939 단일염기다형성이나, FTO 유전자 내에 존재하는 단일염기다형성이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 정보제공방법은 단일염기다형성인 rs16957920 및/또는 rs2834826을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단일염기다형성은 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응이 유발될 수 있다고 알려져있는 단일염기다형성이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 환자는 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease) 환자이며, 상기 염증성 장질환은 크론병, 궤양성대장염, 베체트 장염 등이며 염증 반응을 동반한 장질환이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 티오퓨린(thiopurine)계 약물은 바람직하게는 아자티오프린(Azathioprine; AZA), 6-머캅토퓨린((6-Mercaptopurine, 6-MP) 등 일 수 있으나, 염증성 장질환 환자에게 사용될 수 있는 티오퓨린 구조를 전체 또는 일부 포함하고 있는 약물이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약물유해반응은 골수억제(myelosuppression), 백혈구 감소증(leukopenia) 등 일 수 있으나, 염증성 장질환 환자에서 티오퓨린계 약물로 인해 유발될 수 있는 부작용이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 정보제공방법은 동아시아인(East-Asian)을 대상으로 하는 것이 바람직하나, 상기 단일염기다형성인 rs79206939에 의해 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응을 예측할 수 있는 인종이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으나, 환자의 DNA를 포함하고 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자 내 단일염기다형성인 rs79206939에 대하여 상보적인 프라이머(primer) 또는 프로브(probe) 세트를 포함하는, 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키트는 단일염기다형성인 rs16957920 및/또는 rs2834826에 대한 상보적인 프라이머 또는 프로브 세트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하여 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법은 단일염기다형성 만을 확인하여 약물유해반응으로 인한 환자의 고통 및/또는 위험 부담을 현저히 감소시킬 수 있기 때문에 약물 처치 전에 저비용, 단기간의 확인 만으로 안전하게 약물 유해반응을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 디스커버리 코호트에서의 FTO p.A134T의 전장유전체연관분석에 관한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 연관된 한국인의 유전자형에 대한 FTO 변이체에 대하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 티오퓨린에 의한 혈액학적 특징을 FTO 야행형과 변이체에서 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 FTO 야생형과 변이체의 탈메틸 활성을 측정 및 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Fto와 티오퓨린에 의한 부작용과의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 전장유전체연관분석
티오퓨린(thiopurines)에 대한 민감성을 가진 새로운 유전자 변이를 확인하기 위하여 디스커버리 코호트(discovery cohort, n=267)에서 전장유전체연관분석(Genome-wide association study; GWAS)을 실시하였다. 디스커버리 코호트에는 1998년 7월부터 2012년 1월까지 세브란스 병원을 내원한 환자 중 염증성장질환으로 티오퓨린을 투여받은 환자를 포함하였다. 전장유전체연관분석은 Axiom Genome-Wide ASI 1 Array Chip(Affymetrix)를 이용하여 측정하였으며, 동아시아 인구에서 희소한 변이에 대한 커버리지를 최대한으로 할 수 있도록 디자인하였다. 그리고 획득된 자료에 대한 품질관리는 PLINK software V.1.07를 이용하였다. 전장유전체연관분석은 allelic χ2 test 및 로지스틱 회귀 분석법을 이용하였고, p < 5X10-6 이하인, 통계학적으로 강한 유의성을 보이는 단일염기다형성을 선택하여 실험을 진행하였다. 이종성(heterogeneity)은 Breslow-Day 분석법을 이용하였고, 서브세트(subset)에 대한 연관관계 분석은 Cochran-Mantel-Haenszel 분석법을 이용하였다. 또한, 연관 불균형 관계 블록(Linkage disequilibrium block; LD block)은 Haploview 4.2를 이용하여 측정하였고, 통계학적인 분석은 Student's t-test, log-rank test 또는 Kaplan-Meier method를 이용하였고, p값이 0.05 이하일 때 유의성이 있다고 판단하였다. 디스커버리 코호트에 대한 기본적인 의학정보는 표 1에 나타내었다. 염증성장질환(inflammatory bowel disease; IBD)을 가진 환자들은 크론병(Crohn's disease; CD)으로 진단된 환자가 59%, 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)으로 진단된 환자가 26%, 베체트병(Behcet's desease)으로 진단된 환자가 15%였다. 티오퓨린 치료를 시작한 중위 연령은 32세였고, 백혈구 감소증(leukopenia)이 발병한 환자는 총 113명으로 42.3%였다. 그리고 백혈구 감소증이 발병한 환자와 발병하지 않은 환자의 초기 백혈구(WBC) 수치는 차이가 없는 것을 확인하였다. 백혈구 감소증에 대한 진단은 백혈구(WBC)의 수치가 3,000/mm3 이하로 티오퓨린의 투여 후에 수치가 감소된 경우를 포함하였다.
[표 1]
Figure pat00001
전장유전체연관분석은 단일염기다형성(single nucleotide sequence; SNP)의 품질 관리에 적용하기 위하여 505,014개의 마커에 대하여 수행하였다. 유전자 팽창 인자(genomic inflation factor; λ)는 1.00078였고, p 값에 대한 분위수-분위수 도표(quantile-quantile plot)는 기대귀무분포(expected null distribution)에 대하여 조직적 편차(systematic deviation)를 보이지 않았다. 대립형질 χ2 분석법을 이용하여 전장유전체연구분석을 수행하였고, 유의성 있는 임계점(threshold, p < 5X10-6)을 나타내는 10개의 단일염기다형성을 확인하였다. 그 결과는 표 2 및 도 1A에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00002
연관 불균형 관계 블록(Linkage disequilibrium block; LD block)에서 2p24에 두 개의 단일염기다형성이, 16q12에 두 개의 단일염기다형성이, 21q22에 다섯 개의 단일염기다형성이 존재하였으므로, 전장유전체연관분석 자료세트(dataset)로부터 연관 불균형(LD)에 기초하여 전지(pruning)한 이후에도 네 개의 독립적인 좌위(loci)가 중요성을 나타내었다. 또한, 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 이용하여 전장유전체연관분석을 수행하였고, 비교할만한 결과를 나타내었다. RUNX1(rs2834826, p=5.8×108)과 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 인트론 지역(rs16952570, p=1.3×106)에서 가장 낮은 연관 p 값을 나타내었고, 이 두 유전자에 대하여 추가 분석을 시행하였다. 두 개의 다른 유전자간(intergenic) 좌위인 rs1969003과 rs7605946는 가장 근접한 유전자로부터 멀리 존재하였다. rs1969003은 GADL1으로 부터는 472kb만큼, STT3B로부터는 167kb만큼 떨어져 있었으며, rs7605946은 LOC645949으로부터 1Mb만큼, KLHL29으로부터는 563kb만큼 떨어져 있었다. 상기 결과들을 통하여, 단백질 코딩 부위에 대한 고효율 염기분석법(high-throughput sequencing)에서는 제외된 새로운 유전자 좌위들을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, 기존의 고효율 염기분석법으로는 밝혀지지 않았던 백혈구 감소증과 관련된 신규한 유전자들을 전장유전체연관분석법을 통하여 확인하였다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 염기서열분석
실시예 1의 267명을 포함하여 디스커버리 코호트(n=331, 백혈구 감소증 환자는 132명, 백혈구 감소증이 아닌 대조군은 199명)에서 기존에 알려져 있던 마커인 티오퓨린 대사와 관련되어진 16개의 유전자, 퓨린 또는 티오구아닌 수송과 관련된 14개의 유전자와 실시예 1에서 확인된 두 개의 주요 마커에 대한 코딩 유전자에 대하여 고효율염기서열분석법(high throughput sequencing)을 실시하였다. 혈액 시료로부터 타겟에 대한 농축은 Human In-solution Hybrid Capture Kit(Celemics)를 이용하였으며, 페어-엔드 염기서열분석(paired-end sequencing, 2X150bp)은 Illumina HiSeq 2500 sequencing platform을 이용하여 수행하였다.
또한, 디스커버리 코호트와 외적 타당성 코호트에서의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에 대한 유전형질분석(genotyping)은 rs79206939, rs16952570, rs2834826 및 rs116855232를 TaqMan SNP genotyping assay(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 실시하였고, 내적 타당성 코호트에서는 rs16952570, rs2834826 및 rs116855232에 대하여는 SNaPshot assay(Thermo Fisher Scientific)를 이용하였고, rs79206939는 Sanger 염기서열분석법을 이용하여 유전형질을 분석하였다.
분석결과, 커버리지의 median depth는 421배였고, 표적으로 하는 지역의 97% 이상이 20배 이상 포함되는 것을 확인하였고, 273개의 코딩 변이체로부터 mean allele frequency(MAF) 값이 1 이상인 48개의 비동의 코돈(non-synonymous codon)을 확인하였다. 확인된 코딩 변이체 중에서 FTO(c.400 G>A; p.Ala134Thr; rs79206939)의 미스센스 변이체(missense variant)가 티오퓨린에 의해 유발된 백혈구 감소증과 높은 연관관계를 나타내는 것을 확인하였다(p=0.0013; OR=6.3). D' 분석법을 기초로 하여, FTO p.A134T(rs79206939)는 FTO 인트론의 3개의 변이체(rs16952570)를 포함하는 단일 LD 블럭 안에 존재하였으며, rs79206936 변이체를 포함하는 모든 시료는 rs16952570을 가지고 있는 것을 확인하였다(D'=1.0, 도 1B). 그러나 r2 값은 0.06으로 낮았는데, 이는 rs79206939(MAF=0.023)의 대립유전자 빈도(allele frequency)가 rs16952570(MAF=0.296) 보다 매우 작기 때문인 것을 확인할 수 있었다. 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증을 경험한 환자의 FTO p.A134T의 유전형 빈도(genotype frequency)는 9.0%였으나, 백혈구 감소증이 아닌 대조군에서의 빈도는 1.5% 밖에 되지 않는 것을 확인하였다(도 1C). FTO p.A134T를 가진 개개인에서 백혈구 감소증이 발생하는 중앙 시간(median time)은 6개월(95% CI, 3.5 to 6.5 months) 이었으나, FTO 야생형을 가진 개개인의 관찰기간인 36개월 동안 중앙 시간이 관찰되지 않는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 FTO p.A134T를 가진 사람과 비교하여 야생형을 가진 사람은 상대적으로 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증이 유발된 가능성이 낮은 것을 확인할 수 있었다(log-rank p<0.001, 도 1D).
1,000개의 Genomes Database에서 FTO p.A134T 변이체는 동아시아 혈통에서만 관찰되었으며(MAF, 2.2%), 건강한 한국인에서 FTO p.A134T 변이체는 5.1%의 빈도로 관찰되었다(842명 중 43명, 도 2A). 또한, FTO 코딩 변이체의 유전형 빈도(genotype frequency)는 한국인에서 1% 미만으로 확인되었다. 예를 들어, 두 번째로 빈도가 높은 비동의 변이체인 FTO D144N은 백혈구 감소증이 아닌 대조군에서 단 한 명만이 관찰되었다(도 2B). 표 1에 나타난 바와 같이, 인구 통계학(demographic characteristics)을 이용하여 다변량 분석을 수행한 결과, 성별, 초기체중, 초기 헤모글로빈 수치 등의 단변량 분석과 FTO p.A134T 및 RUNX1 rs2834826의 유전형에서 유의성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 표 3에 나타난 바와 같이, FTO와 RUNX1의 유전자형은 인구 통계학적인 면보다 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증을 진단하는데 더 높은 유의성을 가지는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, FTO와 RUNX1의 유전자형을 티오퓨린 민감성 또는, 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증을 예측하는데 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
[표 3]
Figure pat00003
실시예 3: 진단 신뢰성 확인
rs79206939(FTO p.A134T)와 티오퓨린에 의한 민감성과의 연관성 여부를 재확인하기 위하여, 두 개의 추가적인 반복 코호트에서 반복 실험을 진행하였다. 외적 타당성 코호트(external validation cohort)로는 2002년 4월부터 2015년 9월까지 일본의 도호쿠 대학 병원 또는 크론 임상연구 네트워크(Crohn's Disease Research network)에 내원한 437명의 환자를 포함하였으며, 내적 타당성 코호트(internal validation cohort)로는 2011넌 12월부터 2015년 3월까지 세브란스 병원을 내원한 330명의 환자를 포함하였다. 반복 실험에서는 최근에 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 연관되어져 있다고 알려진 rs116855232(NUDT15 p.R139C)도 함께 비교하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure pat00004
표 4에 나타난 바와 같이, 외적 타당성 코호트(제1반복 코호트: 124명의 백혈구 감소증 환자와 313명의 대조군)에서는 28.4%로 백혈구 감소증이 발병하였으며, 내적 타당성 코호트(제2반복 코호트: 121명의 백혈구 감소증 환자와 209명의 대조군)에서는 36.7%가 발병되었음을 확인하였다.
첫번째 실험과 두번째 반복 실험들을 통합하여, 기존에 알려져있던 rs11685523와 더불어 rs79206939가 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 높은 연관관계를 나타내는 것을 확인하였으며, 동형 접합 변이체(homozygous variant)를 포함하여 백혈구 감소증이 발병된 환자에서 FTO p.A134T의 유전형 빈도는 9 내지 12%이며, 백혈구 감소증이 발병되지 않은 대조군에서는 3% 미만인 것을 확인할 수 있었다. 반대로 FTO p.A134T 유전형을 가진 시료군에서는 66.7%로 백혈구 감소증이 발병하였고, FTO 야생형을 가진 대조군에서는 32.4%로 백혈구 감소증이 발병하였다.
또한 염증성장질환에 따라 분석한 결과, 백혈구 감소증은 염증성장질환에 관계 없이 FTO p.A134T 변이체를 가진 군에서 더 높은 빈도로 발병되는 것을 확인하였다. 특별히, 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 더불어 빈혈, 혈소판 감소증과 같은 혈액형학적인 특징과 FTO p.A134T 유전형이 관계를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 디스커버리 코호트와 반복군 코호트 모두에서 rs16952570(FTO 인트론 3) 및 rs2834826(RUNX1 intergenic)이 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 연관관계를 나타내는 것을 확인하였으며, 조건부 로지스틱 회귀 분석 결과는 FTO, NUDT15, 및 RUNX1이 모두 독립적으로 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 연관관계를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, NUDT15 p.R139C 또는 rs2834826 (RUNX1 intergenic)과 FTO p.A134T를 결합하면, 백혈구 감소증의 위험도가 각각 73% 또는 17%로 증가되는 것을 확인하였다.
[표 5]
Figure pat00005
상기 결과들을 통하여, FTO 단독으로 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증을 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 마커들과 결합하여 백혈구 감소증에 대한 예측 정확성을 높일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: FTO p.A134T의 탈메틸효소 활성 확인
FTO는 Fe(II)/2OG(2-oxoglutarate)-dependent 탈메틸효소(demethylase)를 코딩하는 핵단백질로서, 포유류의 AlkB 유사 ABH1 및 ABH2와 연관관계를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. FTO의 크리스탈 구조분석 결과는 N-말단의 활성 도메인(catalytic domain) 및 C-말단의 기능이 알려지지 도메인으로 구성되어 있으며, FTO A134는 N-말단의 활성 도메인 내의 알파-나선(alpha-helix) 구조 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). 또한, 도 4B에 나타난 바와 같이, FTO A134는 포유류 간에 매우 유사한 구조를 가지고 있는 것을 확인하였으며, 단백질 예측 알고리즘으로 확인해본 결과, p.A134T 돌연변이는 FTO 단백질의 기능에 영향을 미칠 것이라는 것을 예측할 수 있었고, 이를 통하여 p.A134T 변이가 FTO의 구조 또는 기능에 영향을 미칠 것이라고 예측하였다.
그리고 이를 확인하기 위하여, 첫번째로는 p.A134T 변이가 세포 내에 FTO의 발현 정도에 영향을 미치는지 확인하였으나, Jurkat 인간 림프구 세포에서는 FTO 발현에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 4C). 다음으로는 FTO의 탈메틸 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, p.A134T 재조합 단백질, 야생형 FTO 단백질(양성대조군), 그리고 FTO p.R316Q(rs121918214)(음성대조군)를 이용하여 탈메틸 활성을 측정하였다. 탈메틸 활성 측정을 위하여, FTO 야생형 그리고 FTO p.A134T 변이체에 대한 재조합 단백질을 각각 제조하였다. FTO의 DNA 전체 서열과 A134T 변이된 전체 서열을 각각 pET28a 벡터에 삽입하고, cDNA가 삽입된 벡터는 대장균 BL21 Star(DE3)에 형질전환 시킨 후에 50mg/mL 카나마이신이 첨가됨 LB 플레이트에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 그리고 선별된 대장균을 이용하여 단백질을 생산하고, 이를 Ni-NTA 크로마토크래피(GE Healthcare) 및 gel filtration column(GE Healthcare)를 이용하여 분리하였다. 탈메틸 활성은 14C-labelled 3-methylthymidinelabelled DNA 기질 100mM에 75uM Fe(NH4)2(SO4)2, 2mM ascorbate, 50ug/ml BSA 및 RNase를 50mM Tris/HCl buffer(pH 7.0)에서 혼합한 후에 520nm 또는 530nm에서 FAM(6-carboxyfluorescein) 방출을 30분간 측정하였다(Biochem. J. (2012) 444: 183-187). 그 결과는 도 4D에 나타내었다.
도 4D에 나타난 바와 같이, FTO p.A134T 변이 단백질은 FTO 야생형과 비교하여 탈메틸 활성이 65% 이하로 감소됨을 확인하였으며, 음성대조군인 FTO p.R316Q 변이 단백질은 탈메틸 활성이 전혀 관찰되지 않는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 이전 실험들을 통하여 이형접합 FTO p.A134T 변이체는 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증과 연관관계를 가지고 있다는 것을 확인하였으므로, FTO p.A134T 변이 단백질이 FTO 야생형 단백질의 효소 활성을 억제할 수 있는지를 확인하였다. FTO 변이체가 FTO 야생형의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해서는, FTO p.A134T 변이체와 FTO 야생형 재조합 단백질을 동량 혼합한 후에 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 4E에 나타내었다.
도 4E에 나타난 바와 같이, FTO p.A134T 변이 단백질은 FTO 야생형 단백질의 효소 활성에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, p.A134T는 FTO에 대한 정상하위대립인자(hypomorphic) 변이체이며, FTO 야생형 단백질에 대하여 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: Fto -/- 마우스에서의 티오퓨린 처리
Fto+/- 마우스와 Fto-/- 마우스를 이용하여 FTO의 기능이 티오퓨린에 의한 골수억제(myelosuppression)에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 마우스에 AZA(30mg/kg, 1일 1회 구강 투여) 또는 6-MP(10mg/kg, 1일 1회 복강내 투여)를 2주 동안 투여하고, 이후 말초혈액의 총혈액측정(peripheral blood complete blood counts)과 골수검사(bone marrow examinations)를 시행하였다(실험군당 n=6). 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5A 및 5B에 나타난 바와 같이, AZA를 이주간 투여하고 투여하지 않았던 마우스에서의 기본 백혈구 수치(baseline)과 비교한 결과, Fto+/- 마우스에서는 말초혈액의 백혈구 수치가 42%로 감소되었으며(p<0.05), Fto-/- 마우스에서는 31%로 감소된 것을 확인하였다(p<0.01). 또한, 6-MP를 투여한 실험군에서도 Fto+/- 마우스에서는 기본 백혈구 수치와 비교하여 말초혈액의 백혈구 수치가 53%로 감소되었으며(p<0.01), Fto-/- 마우스에서는 40%로 감소된 것을 확인하였다(p<0.01). 상기 결과들을 통하여, FTO의 기능은 티오퓨린에 의한 백혈구 감소증에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5C 내지 5F에 나타난 바와 같이, FTO의 기능 저하는 백혈구 수치 뿐만 아니라, 골수세포충실성(bone marrow cellularity) 감소에도 영향을 미치는 것을 확인하였다. AZA를 투여한 실험군에서 투여하지 않았던 마우스에서의 기본 골수세포충실성(baseline)과 비교한 결과, Fto+/- 마우스에서는 수치가 38% 감소되었으며(p<0.01), Fto-/- 마우스에서는 50% 감소된 것을 확인하였다(p<0.01). 그리고 6-MP를 투여한 실험군에서 Fto+/- 마우스에서는 수치가 19% 감소되었으며(p<0.05), Fto-/- 마우스에서는 31% 감소된 것을 확인하였다(p<0.01).
상기 결과들을 통하여, Fto의 기능 저하, 또는 Fto의 부족은 티오퓨린에 의한 골수억제에 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였으며, 이를 통하여, FTO의 발현 정도, 기능성 정도를 확인하여 티오퓨린에 의한 골수억제를 예측하는데 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, FTO 단백질의 변이에 의한 기능저하는 FTO 야생형 단백질의 기능에 영향을 미치지 못하므로, FTO 야생형 단백질의 투여를 통하여, FTO 기능저하를 회복시킬 수 있으며, 이를 통하여 티오퓨린에 의한 골수억제를 감소, 예방 또는 치료에 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자의 단일염기다형성을 확인하는 단계를 포함하는, 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응 예측에 관한 정보제공방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단일염기다형성은 rs79206939인, 정보제공방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 단일염기다형성인 rs16957920 및/또는 rs2834826을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 정보제공방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 환자는 염증성 장질환(Inflammatory bowel disease) 환자인, 정보제공방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 티오퓨린(thiopurine)계 약물은 아자티오프린(Azathioprine; AZA) 또는 6-머캅토퓨린((6-Mercaptopurine, 6-MP)인, 정보제공방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 약물유해반응은 골수억제(myelosuppression) 또는 백혈구 감소증(leukopenia)인, 정보제공방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 동아시아인(East-Asian)을 대상으로 하는 것인, 정보제공방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인, 정보제공방법.
  9. FTO(fat mass and obesity-associated) 유전자 내 단일염기다형성인 rs79206939에 대하여 상보적인 프라이머(primer) 또는 프로브(probe) 세트를 포함하는, 티오퓨린계 약물에 의한 약물유해반응 예측용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 키트는 단일염기다형성인 rs16957920 및/또는 rs2834826에 대한 상보적인 프라이머 또는 프로브 세트를 추가로 포함하는, 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20220160443A (ko) 2021-05-27 2022-12-06 권대철 전기 자동차용 직교류 전열교환기를 장착한 폐열회수 환기 시스템

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