CN117136077A - 用于治疗脆性x综合征的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

使用编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(人FMRP)的腺相关病毒(AAV)9病毒颗粒来缓解脆性X综合征(FXS)患者的症状的方法。本文还提供了确定用于FXS患者以缓解至少一种与FXS相关的症状的AAV9病毒颗粒的合适剂量的方法，以及用于监测治疗功效的方法。

Description

用于治疗脆性X综合征的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月17日提交的美国临时申请号63/053,461的申请日的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
背景技术
脆性X综合征(FXS)是一种由脆性X精神发育迟滞蛋白(FMR1)基因中的CGG重复的扩增引起的单基因综合征，其导致基因产物脆性X精神发育迟滞蛋白(FMRP)的丧失并且是遗传性智力残疾的主要原因。患有FXS的个体IQ低，发育迟缓，言语和非言语交流有障碍(通常符合ASD标准)，并且患有神经元过度兴奋，表现为对声音和光线过度敏感以及癫痫发作。
患有FXS的个体需要终身护理并且不可独立生活，从而降低了患病个体及其护理人员的生活质量。需要开发用于治疗FXS的新疗法。
发明内容
本公开至少部分基于导致FMRP在体内成功表达的AAV载体的开发以及由AAV9病毒颗粒介导的低水平FMRP表达在小鼠模型中成功改善脆性X综合征(FXS)的主要行为症状的意外发现。还发现脑电图(EEG)、行为评估、认知神经康复评估或它们的组合可用作诊断和/或预后生物标志物，例如，用于确定携带FMR1的AAV9病毒颗粒在缓解个体FXS患者的症状和/或评估治疗功效时的合适剂量(个性化剂量)。
因此，本公开的一个方面提供了一种用于治疗人类患者的FXS的方法，其通过向患有FXS的人类患者施用有效量的多种腺相关病毒(AAV)9病毒颗粒来实现。AAV9病毒颗粒可以包括单链AAV DNA载体，其可包含与启动子可操作地连接的编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(人FMRP)的核苷酸序列。AAV DNA载体可以是标准AAV载体。可替代地，AAVDNA载体可以是自互补AAV(scAAV)载体。在感染本文公开的AAV9病毒颗粒后，AAV DNA载体可在人类患者的脑中表达野生型人FMRP。
在一些实施方案中，野生型人FMRP可以是人FMRP同种型1。在其他实施方案中，人FMRP可以是野生型人FMRP的片段(例如，同种型1)，其可包含1-297个氨基酸残基的N末端片段或由其组成。
在一些实施方案中，启动子可以是鸡b-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体。在其他实施方案中，启动子可以是人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
在一些实施方案中，AAV DNA载体还可包含调控人FMRP表达的一种或多种调控元件。例如，一种或多种调控元件包括人β-珠蛋白内含子序列、一种或多种polyA信号传导序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或它们的组合。在一些实例中，一种或多种polyA信号传导序列包括人β-珠蛋白polyA信号传导序列、SV40 polyA信号传导序列或它们的组合。在一些实例中，AAV DNA载体不包含WPRE。
在具体实例中，AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体、WPRE和处于编码人FMR1的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列。
在其他具体实例中，AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体，以及处于编码人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列。在一些情况下，AAV DNA载体不包含WPRE。
在其他具体实例中，AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子、处于编码人FMRP的核苷酸序列上游的人β-珠蛋白内含子序列，以及处于编码人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列和人β-珠蛋白polyA信号传导序列。在一些情况下，AAV DNA载体不包含WPRE。
在一些实施方案中，AAV DNA载体还包含对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制野生型FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。在一些实例中，一个或多个MTS可以是miR-122的MTS、miR-208a的MTS、miR-208b-3p的MTS、miR-499a-3p的MTS或它们的组合。
在一些实施方案中，本文公开的AAV9病毒颗粒可以通过静脉内注射、脑室内注射、小脑延髓池内注射、实质内注射或它们的组合施用于人类患者。在一些实例中，AAV9病毒颗粒可以通过至少两种施用途径施用于人类患者。在一些实例中，至少两种施用途径可以是脑室内注射和静脉内注射；鞘内注射和静脉内注射；小脑延髓池内注射和静脉内注射；或实质内注射和静脉内注射。
在一些实施方案中，在施用本文公开的AAV9病毒颗粒之前，可对人类患者进行脑电图(EEG)、行为和/或认知神经康复评估或它们的组合，以确定疾病的表型严重程度。在一些实例中，所述方法还可以包括，在施用步骤之前，对人类患者进行脑电图(EEG)、行为和/或认知神经康复评估或它们的组合。在一些实例中，所述方法还可以包括，基于EEG分析、行为和/或认知评估或它们的组合来确定AAV9病毒颗粒的剂量和/或递送途径。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于已经进行或正在进行治疗的人类患者，所述治疗包括GABA受体激动剂、PI3K同种型选择性抑制剂、MMP9拮抗剂或它们的组合。在一些实例中，本文公开的方法还可以包括向人类患者施用有效量的GABA受体激动剂、PI3K同种型选择性抑制剂、MMP9拮抗剂或它们的组合。
本公开的另一方面提供了用于在受试者诸如人类FXS患者中表达FMRP的腺相关病毒(AAV)载体和包含单链形式的这种载体的AAV颗粒，以及包含此类AAV病毒颗粒的药物组合物。
在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可包括AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和3’ITR；编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(FMRP)的核苷酸序列；与编码野生型人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的启动子；以及对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制野生型FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。在一些实例中，本文公开的AAV载体可以是自互补AAV载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种标准腺相关病毒(AAV)载体，其包含：(I)AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和3’ITR；(ii)编码野生型人脆性X精神发育迟滞1蛋白(FMRP)的核苷酸序列；(iii)与(ii)可操作地连接的启动子；以及
(iv)调控FMRP表达的一种或多种调控元件。
在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体。在其他实施方案中，启动子是人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。可替代地或除此之外，一种或多种调控元件包括人β-珠蛋白内含子序列、一种或多种polyA信号传导序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或它们的组合。在一些情况下，一种或多种polyA信号传导序列包括人β-珠蛋白polyA信号传导序列、SV40 polyA信号传导序列或它们的组合。在一些情况下，AAVDNA载体不包含WPRE。
在一些实例中，AAV载体包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体、WPRE和处于编码人FMRP的核苷酸序列下游的SV40polyA信号传导序列。
在其他实例中，AAV载体包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体，以及处于编码人FMRP的核苷酸序列下游的SV40polyA信号传导序列，并且其中AAV DNA载体不包含WPRE。
在其他实例中，AAV载体包含与编码人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子、处于编码人FMRP的核苷酸序列上游的人β-珠蛋白内含子序列，以及处于编码人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列和人β-珠蛋白polyA信号传导序列，并且其中AAV DNA载体不包含WPRE。
如本文所公开的用于治疗人类患者的FXS的AAV9颗粒以及AAV9颗粒用于制备用于治疗FXS的药物的用途也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面，通过参考附图并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解这些方面。
图1A和1B包括描绘能够产生人FMRP的自互补AAV(scAAV)载体的图。图1A：该图描绘了scAAV9-CB-FMR1的scAAV质粒结构–一种基于scAAV骨架的构建体，其包含处于杂合CMV增强子/β-肌动蛋白启动子CB控制下的人FMR1编码序列。图1B：图像描绘了用渐增浓度的scAAV病毒基因组转导的原代培养的小鼠皮质神经元中的蛋白质表达的蛋白质印迹分析，所述基因组包含全长人FMRP、带有flag标签的全长人FMRP或GFP。上图描绘了FMRP蛋白的表达，中图描绘了flag蛋白的表达，并且下图描绘了GFP蛋白的表达。
图2A-2C包括描绘能够产生人FMRP的AAV(AAV)载体的图。图2A：该图描绘了AAV-CAG-FMR1的AAV质粒结构–一种基于AAV骨架的构建体，其包含处于CAG启动子控制下的人FMR1编码序列。图2B：图像描绘了用渐增浓度的AAV病毒基因组转导的原代培养的小鼠海马神经元中的蛋白质表达的蛋白质印迹分析，所述基因组包含全长人FMRP或GFP。上图描绘了FMRP蛋白的表达，中图描绘了GFP蛋白的表达，并且下图描绘了β-肌动蛋白的表达(上样对照)。图2C：图表描绘了用渐增浓度的AAV病毒基因组转导的原代培养的小鼠海马神经元中的mRNA表达的RT-PCR分析，所述基因组包含全长人FMRP或GFP。左图描绘了FMRP mRNA的表达并且右图描绘了GFP mRNA的表达。
图3A-3C包括描绘小鼠皮质和海马神经元中由病毒表达的FMRP或GFP的图。图3A：图像描绘了在脑室内(ICV)注射scAAV9-CB-GFP病毒基因组两周后的小鼠脑中的GFP表达。图3B和3C：图像描绘了在ICV注射50μm(图3B)和100μm(图3C)的AAV-CAG-FMRP病毒基因组两周后的小鼠脑中的FMRP表达。NeuN用作神经元细胞的免疫组织化学标志物。
图4A和4B包括在对小鼠进行AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP病毒基因组的ICV注射10周后，从野生型和Fmr1敲除(KO)小鼠中收获的脑切片中的AAV-CAG-FMR1和AAV-CAG-GFP的总蛋白表达的蛋白质印迹分析的图像。图4A：GFP。图4B：hFMRP。
图5包括描绘在AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP施用后，在Fmr1 KO和野生型小鼠中进行行为和功能评估研究的10周时间线的图像。
图6A-6C包括描绘在通过ICV注射施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP后，在Fmr1 KO和野生型小鼠中进行的嵌套测定的图。图6A：图像示出在将新鲜的方形棉(nestlet)提供给注射AAV-CAG-GFP的野生型小鼠(左图)和注射AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO小鼠(右图)两小时后撕碎的方形棉。图6B：图表示出在AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP施用后被Fmr1 KO和野生型小鼠撕碎的方形棉的百分比，其中筑巢测定在AAV注射后每四周进行一次。图6C：图表示出在注射AAV两周和四周后，与注射AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠相比，注射AAV-CAG-FMRP的Fmr1KO和野生型小鼠的筑巢行为的改善百分比。
图7A-7C包括描绘在通过ICV注射施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP后，在Fmr1 KO和野生型小鼠中进行的弹珠掩埋测定(marble burying assay)的图。图7A：图像示出注射AAV-CAG-GFP的野生型小鼠和注射AAV-CAG-GF的Fmr1 KO小鼠的弹珠掩埋行为的实例。图7B：图表示出在施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP后，Fmr1 KO和野生型小鼠中开始掩埋弹珠的潜伏期。图7C：图表示出Fmr1 KO和野生型小鼠在施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP 15分钟后掩埋弹珠的量。
图8A-8C包括描绘在通过ICV注射施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP六周后，在Fmr1 KO和野生型小鼠中进行的莫氏水迷宫测定(Morris Water Maze assay)的图。图8A：图像示出如本文所公开进行的莫氏水迷宫测定的图。图8B：图表示出正式包含隐藏平台的象限中的条目数量。图8C：图表示出在施用AAV-CAG-FMRP或AAV-CAG-GFP后，Fmr1 KO和野生型小鼠进入前平台位置的潜伏期。
图9包括描绘注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠在测量多动和/或焦虑的开阔场地活动测定(open field activity assay)期间处于开放中心的总时间量的图表。
图10包括描绘注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠之间对新物体的偏好差异的图表，其中通过用与新物体互动所用的时间除以探索新物体和熟悉物体的时间量来计算偏好。
图11A和11B包括描绘在通过ICV注射施用AAV后10周，由注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠的脑制备的海马切片的长时程增强的电生理学测量的图表。图11A：图表示出在60分钟内测量的由θ短阵脉冲刺激(theta-burst stimulation)诱导的长时程增强。图11B：图表示出在70分钟内测量的由θ短阵脉冲刺激诱导的长时程增强。
图12A和12B包括描绘在通过ICV注射施用AAV后10周，由注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠收获的脑制备的皮质切片中的蛋白质合成速率的图。图12A：图像示出在用媒介物(对照)或嘌呤霉素处理皮质切片后，探测新生肽链中的嘌呤霉素掺入的蛋白质印迹分析。图12B：图表描绘了通过蛋白质印迹分析评估的嘌呤霉素丰度的β-微管蛋白归一化的密度测定。
图13包括描绘与野生型(WT)小鼠相比Fmrl KO中的增加的γ功率的图表，其中通过连续EEG测量的γ功率针对6天内的5分钟时间段进行计算(n＝3，RM双因素方差分析，*p<0.05)。
图14A-14D包括描绘脆性X综合征(FXS)中的伽马(y)功率相关异常的人类数据的评估的图。图14A：FXS中的y功率过多。相对y功率的地形图，包括显著的组间差异(p<0.05校正)。图14B：听觉皮质y功率与行为高度相关。在FXS中，较高的y与较低的听觉注意任务表现相关。图14C：y与θ和α功率的关系高度区分FXS(灰色)与HC(黑色)。图14D：来自鼠EEG分析的定制分析软件的EEG功率分析输出。
图15是描绘CAGWPRE载体的质粒图谱的图。
图16是描绘CAGdelWPRE载体的质粒图谱的图。
图17是描绘hPGK载体的质粒图谱的图。
图18A和18B包括示出通过载体CAGWPRE(图18A)和CAGdelWPRE(图18B)表达FMRP的照片。
图19是示出通过CAGWPRE载体、CAGdelWPRE载体和hPGK载体表达FMRP的照片。
图20A-20G包括示出在施用携带AAV-CAG-FMR1载体的AAV颗粒后，各种组织中针对GAPDH归一化的FMRP和eGFP表达的图。结果通过RT-PCT测定获得。图20A：皮质。图20B：海马。图20C：中脑。图20D：小脑。图20E：心脏。图20F：肝脏。图20G：肾。
具体实施方式
脆性X综合征(FXS)也称为马丁-贝尔综合征(Martin-Bell syndrome)或埃斯卡兰特综合征(Escalante's syndrome)，是一种由X染色体上的FMR1基因中的CGG三核苷酸重复的扩增引起的遗传病症。负责FXS的扩增的CGG三核苷酸重复位于编码正常神经发育所需的脆性X精神发育迟滞蛋白(FMRP)的FMR1基因的5’非翻译区(UTR)。通常在5’UTR中存在6-53个拷贝的三核苷酸重复(CGG)；然而，患有FXS的个体通常具有CGG密码子的55-230个重复，这导致FMR1启动子甲基化、基因沉默，并且不能产生FMRP。
FMRP与数百种mRNA缔合，调控其翻译和稳定性，并且还可以通过结合突触处的离子通道而直接影响神经元兴奋性。因此，FMRP的丧失导致大量分子、细胞和结构缺陷，所述缺陷难以(如果不是不可能的话)用单一药物策略在人体中进行校正。在不存在FMRP的情况下产生的所得缺陷可能导致认知障碍、交流缺陷、社交技能缺陷、感觉敏感性、注意力不集中、适应性行为缺陷、焦虑、自主系统失调和癫痫发作。
本公开旨在开发用包含用于表达功能性(例如，野生型)人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(FMRP)的核酸的AAV9病毒颗粒治疗FXS，以改善与FXS相关的行为和功能症状。
本公开报道了使得FMRP在小鼠模型中成功表达的各种AAV载体的开发。令人惊讶的是，通过将编码FMRP的AAV9病毒颗粒递送到FXS动物模型的CNS中，低水平的FMRP表达成功缓解了在FXS小鼠模型中观察到的与FXS相关的症状。此外，本公开报道了脑电图(EEG)、行为、认知神经康复评估或它们的组合可以用作诊断和/或预后生物标志物，例如，以用于评估个体FXS患者的编码FMRP的AAV9病毒颗粒的适当剂量。此外，此类生物标志物可以用于评估治疗功效。
本公开在FXS与年龄和性别匹配的对照的强有力的样本中建立了皮质兴奋性增高的证据。通过对密集阵列EEG数据进行源定位，确定了三个重大发现：(i)功能性静息状态网络和皮质区域内的局灶性γ振荡增加，(ii)低频功率和耦合关系的明显改变，以及(iii)独立于病例-对照对比，来自默认模式网络的源估计γ功率高度预测疾病特异性智力残疾。这些发现支持将FXS内的异质性解析为“网络疾病”和皮质兴奋过度的有效方法，并提供了测量这些变化和与FXS中的智力残疾的临床相关性的可行方法，其可用作生物标志物来鉴定适于治疗的患者和/或监测治疗功效。
因此，本文提供了用于表达FMRP的AAV9病毒载体和颗粒以及其在缓解FXS患者的FXS症状中的用途。本文还提供了用于制备所公开的AAV9病毒颗粒和使用本文公开的一种或多种行为特征作为生物标志物来确定个体FXS患者的AAV9病毒颗粒的合适剂量(个性化剂量)的方法。
I.用于表达FMR1蛋白的AAV病毒颗粒
在一个方面，本公开提供了AAV病毒颗粒(例如，AAV9病毒颗粒)，以用作用于将FMRP递送至需要治疗FXS的受试者的媒介物。
腺相关病毒(AAV)，一种细小病毒家族的成员，是一种小的无包膜病毒。此处的AAV颗粒可包括由衣壳蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成的AAV衣壳，其包封着单链DNA基因组。非致病性、广泛范围的宿主感染性(包括非分裂细胞)和缺乏整合的特性使得AAV成为有吸引力的基因递送媒介物。
如本文所用，AAV病毒颗粒包含被病毒衣壳蛋白包封的AAV DNA载体。根据其血清型，AAV病毒颗粒能够感染某些组织和细胞。请参见下面的描述。AAV DNA载体(或AAV载体)是指病毒颗粒中携带的DNA分子，其包括编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(FMRP)的核苷酸序列，以及任选地，用于控制FMRP表达的调控元件。可以选择调控元件来调节FMRP的表达水平和/或改善安全性。例如，FMR1编码序列可以与驱动FMRP表达的合适启动子可操作地连接。在一些情况下，AAV DNA载体可包含调控FMRP表达的一种或多种调控元件，例如，一个或多个miRNA结合位点、增强子、转录因子结合位点、polyA信号传导元件或它们的组合。
(A)FMRP蛋白
本文公开的AAV病毒颗粒诸如AAV9病毒颗粒携带用于表达功能性FMRP的AAV载体。FMR1是一种mRNA结合蛋白，其在脑中高度表达，在其中它将某些mRNA从细胞核转运至神经元突触。在不存在FMRP的情况下，突触无法恰当形成，从而导致认知能力下降和与FXS相关的发育障碍。
在一些实施方案中，本文公开的FMRP可以是天然存在的FMRP。天然存在的FMRP或亚基可来自合适的物种，例如，来自哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猪、非人灵长类动物或人类。在一些实例中，FMRP是野生型人蛋白。来自各种物种的天然存在的FMRP是本领域众所周知的并且它们的序列可以从公共基因数据库诸如GenBank中检索。
天然存在的人FMRP的结构包含多个保守的功能结构域。例如，FMRP的功能结构域由两个都铎(tudor)结构域、核定位信号(NLS)、三个K同源结构域(KH0、KH1、KH2)、核输出信号(NES)和从N末端到C末端的精氨酸-甘氨酸-甘氨酸结构域(RGG)组成。都铎、KH和RGG结构域主要参与RNA结合，但是它们也有蛋白质相互作用伴侣。
FMR1基因是由跨越大约38kb基因组DNA的17个外显子组成的高度保守基因。FMR1基因经历广泛的可变剪接，产生不同的FMR1转录同种型，从而导致几种FMRP同种型。FMR1转录同种型可以根据它们的外显子结构分为几组，如以下表1所示。
表1.FMR1转录同种型的剪接模式分组
组 外显子
A 9、10、11、12、13、14、15、16、17
B 9、10、11、12、13、15、16、17
C 9、10、11、13、14、15、16、17
D 9、10、11、13、15、16、17
E 9、10、15、16、17
F 外显子的不同组合
作为可变剪接的结果，人FMR1基因可以产生总共11种FMRP同种型。这些FMRP同种型共享～400个残基的高度保守的N末端片段和具有不同的mRNA结合亲和力的可变C末端序列。FMR1的任何剪接同种型都可以用于本公开。在一些实例中，本文所用的人FRMP是FRMP同种型1。人FMRP同种型1的氨基酸序列提供如下(SEQ ID NO:1)
FMRP的示例性编码序列可以在GenBank登录号NM_002024下找到。
在一些实施方案中，待由本文公开的AAV颗粒产生的FMRP可以是天然存在的人FMRP的功能片段。这种功能片段可包括本文公开的FMRP功能结构域中的一个或多个。在一些情况下，功能片段包含野生型FMRP的长～400个氨基酸的N末端保守结构域。在一些实例中，FMRP的片段可包含N末端1-297个氨基酸残基(例如，由其组成)。可替代地或除此之外，功能片段可包含至少一个都铎结构域、至少一个NLS、至少一个KH、至少一个NES、至少一个RGG或它们的组合。在一些实例中，相对于野生型对应物，功能片段可在N末端具有截短。在其他实例中，相对于野生型对应物，功能片段可在C末端具有截短。在一些情况下，相对于野生型对应物，功能片段可在N末端和C末端均具有截短。
在一些实施方案中，待由本文公开的AAV颗粒产生的FMRP可以是天然存在的FMR1的功能变体(例如，人FMR1同种型1的功能变体)。这种功能变体与天然存在的FMR1对应物(例如，SEQ ID NO:1)享有高度序列同源性(例如，至少85％、至少90％、至少95％或以上)，并且具有与天然存在的FMR1对应物基本上相似的生物活性(例如，与野生型对应物相比至少80％的生物活性)。
使用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990,在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中改进的算法确定两个氨基酸序列的“百分比同一性”。这种算法被并入Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序、得分(score)＝50、字长(wordlength)＝3来进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以利用Gapped BLAST，如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997所述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(，例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本文公开的任何功能变体可包含野生型FMRP的功能结构域中的一个或多个，诸如本文所述的那些，例如，N末端保守结构域、都铎结构域、KH结构域和/或RGG结构域，并且在一个或多个非功能结构域中包含一种或多种变异。可替代地，功能变体相对于野生型对应物可包含保守氨基酸残基取代，例如，在一个或多个功能结构域中，和/或在一个或多个非功能结构域中。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。变体可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法来制备，所述方法诸如见于汇编此类方法的参考文献，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,J.Sambrook等人编,第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols in MolecularBiology,F.M.Ausubel等人编,John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守取代包括在下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
在一些实例中，由本文公开的任何AAV载体中的转基因编码的FMRP可在N末端包含信号肽，其将从宿主细胞中分泌FMRP。此类信号肽的实例包括来自白蛋白、β-葡糖醛酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白的信号肽。
在其他实施例中，本文公开的FMRP可以是包含本文公开的载体的融合蛋白，所述载体可包括与改善FMRP分泌的蛋白质基序融合的核酸转基因，所述蛋白质基序例如蛋白质转导结构域(PTD)，诸如来自Tat或VP22的PTD。
(B)AAV载体
AAV载体包含衍生自病毒的野生型基因组的必需遗传元件(病毒骨架元件)，使得载体可以被包装到病毒颗粒中并在宿主细胞中表达其中携带的一种或多种转基因。此外，本文公开的AAV载体包含本文公开的FMRP的编码序列，以及与编码序列可操作地连接的合适的启动子。在一些实例中，本文公开的AAV载体还可以包含调控所编码的FMRP的表达和/或分泌的一个或多个调控序列。实例包括但不限于增强子、内含子序列、聚腺苷酸化信号位点、内部核糖体进入位点(IRES)、微RNA靶位点、转录后调控元件(PRE；例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))或它们的组合。可能引起安全性问题的元件可被排除在外。
在一些实例中，AAV载体可以是包含单链核酸的常规(标准)AAV载体。参见，例如，图2A和图15-17作为例子。在其他实例中，本文公开的AAV载体可以是能够在其中包含双链部分的自互补AAV载体。参见例如，图1A作为一个例子。
(1)病毒骨架元件
本文公开的AAV载体包含一个或多个AAV基因组衍生的骨架元件，其是指AAV载体的生物活性所需的最少AAV基因组元件。例如，AAV基因组衍生的骨架元件可包含待组装到AAV病毒颗粒中的AAV载体的包装位点、载体复制和/或其中包含的转基因在宿主细胞中表达所需要的元件。在一些实例中，此处可使用可商购获得的AAV载体(例如，从Addgene)。例如，可使用由Addgene提供的AAV载体(例如，Addgene质粒#28014)，并且其中包含的GFP基因可用FMR1的编码序列替换。
用于AAV载体的病毒衍生元件是本领域众所周知的。典型地，AAV载体将包含一个或两个衍生自野生型AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列。在一些实例中，本文公开的AAV载体中的ITR序列可以是野生型的。在其他实例中，AAV载体中使用的ITR序列可以是野生型ITR的修饰型式(例如，截短型式)。用于构建AAV载体(包括野生型或修饰型式)的ITR也是本领域众所周知的。参见，例如，Daya等人,Clinical Microbiology Reviews,21(4):583-593(2008)，其相关公开内容通过引用并入以用于本文所引用的主题和目的。在一些实例中，可使用AAV2 ITR。
在一些实例中，本文公开的病毒主链元件可包括至少一个反向末端重复(ITR)序列，例如两个ITR序列。在一些实例中，一个ITR序列在FMRP编码序列的5’。在其他实例中，一个ITR序列在编码序列的3’。在一些实例中，在本文公开的AAV载体中，编码FMRP的多核苷酸序列侧接着两个ITR序列。在一些实例中，在本文公开的AAV载体中，编码FMRP的多核苷酸序列可以侧接着两个填充序列(stuffer sequence)。
(2)自互补AAV病毒载体
在一些实施方案中，本文公开的AAV载体是自互补AAV(scAAV)载体。自互补AAV(scAAV)载体包含互补序列，当进入感染细胞时，所述互补序列能够自发退火(自身重新折叠形成双链基因组)，因此避免了使用细胞的DNA复制机制转化单链DNA载体的需要。自互补AAV载体是本领域已知的。参见，例如，美国专利号6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及Wang Z.等人,(2003)GeneTher 10:2105-2111，其中的每一个的相关公开内容通过引用并入本文以用于本文引用的目的和主题。包含自互补基因组的AAV可以凭借其部分互补序列(例如，转基因的互补的编码链和非编码链)快速形成双链DNA分子，从而快速产生所编码的蛋白质。
在一些实施方案中，本文公开的scAAV病毒载体可包含第一异源多核苷酸序列(例如，FMR1编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如，FMR1非编码或反义链)，它们形成链内碱基对。在一些实例中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列连接；例如，以形成发夹DNA结构。
在一些实例中，scAAV载体在进入细胞时的二聚体结构可以通过两个末端解链位点(trs)之一的突变或缺失来稳定。由于trs是包含在每个ITR内的Rep结合位点，此类trs的突变或缺失可防止scAAV载体的二聚体结构被AAV Rep蛋白切割形成单体。
在一些实例中，本文公开的scAAV病毒载体可包括截短的5’反向末端重复序列(ITR)、截短的3’ITR或两者。在一些实例中，本文公开的scAAV载体可包含截短的3’ITR，其中D区或其部分(例如，其中的末端解链序列)可缺失。这种截短的3’ITR可位于上述第一异源多核苷酸序列与第二异源多核苷酸序列之间。
(3)启动子
在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可以包括一个或多个合适的启动子，其与FMR1编码序列可操作地连接，以用于控制所编码的FMRP在合适的宿主细胞诸如人类脑细胞中的表达。这种启动子可以是遍在的、组织特异性的、强的、弱的、受调控的、嵌合的等，以允许在宿主细胞中有效且合适地产生蛋白质。启动子与所编码的蛋白质可以是同源的或异源的，包括细胞、病毒、真菌、植物或合成启动子。在一些实例中，本文公开的任何AAV载体中使用的启动子在人类细胞中是具有功能的，例如，在脑细胞中是具有功能的。遍在启动子的非限制性实例包括病毒启动子，特别是CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等，以及细胞启动子，诸如PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子(例如，人PGK启动子)。
在一些实例中，本文公开的AAV载体可包含用于控制FMR1转基因在其中的表达的脑特异性启动子。这种脑特异性启动子可驱动转基因在脑组织中以比在非脑细胞中高至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的速率表达。在其他实例中，启动子可以是内皮细胞特异性启动子，诸如VE-钙粘蛋白启动子。在其他实例中，启动子可以是类固醇启动子或金属硫蛋白启动子。优选地，该启动子是人启动子。
在一些实例中，本文公开的AAV载体可包含与FMRP的编码序列可操作地连接的巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些情况下，CMV启动子是野生型CMV启动子。在其他实例中，AAV载体可包含鸡β-肌动蛋白基因启动子。在具体实例中，AAV载体可包含杂合CMV/鸡β-肌动蛋白启动子。例如，AAV载体可包含合成的CAG启动子，其包含CMV早期增强子元件、启动子、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子，以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体。CAG启动子的核苷酸序列提供如下：
修饰的CAG序列(SEQ ID NO:2)：
在其他实例中，本文公开的AAV载体可包含PGK启动子，诸如人PGK启动子。下文提供了一个实例：
hPGK启动子序列(SEQ ID NO:3)
(4)微RNA靶位点
在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可包括至少一个miRNA靶位点(MTS)。如本文所用，“miRNA靶位点”或“miRNA靶序列”是指miRNA特异性结合的核酸序列。当相应的miRNA结合miRNA靶位点时，由包含一个或多个miRNA结合位点的AAV载体转录的mRNA的翻译通常被阻断(沉默)，这可能导致mRNA的不稳定。miRNA靶位点可包含与相应的miRNA互补(完全或部分)的核苷酸序列，使得miRNA可以在miRNA靶位点处形成碱基对。在一些实例中，一个或多个miRNA靶位点位于FMR1编码序列的3’下游。在这种情况下，所得到的mRNA将在3’非翻译区(3’UTR)处包含miRNA靶序列。
在一些实例中，本文公开的AAV载体可包括对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。在一些实例中，与缺乏MTS的载体相比，至少一个MTS可以至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍地抑制非脑组织中的FMRP。在一些实例中，AAV载体可包含至少一个MTS，其可以被对非脑器官诸如肝、肺、胰腺、肾、心脏等具有特异性的miRNA结合，以便阻断FMR1在此类器官中的表达。
在一些实例中，本文公开的AAV载体可包含对miR122具有特异性的MTS。miR122在肝脏中富集，并且还在甲状腺、脾和肺中表达。在胰腺、肾和动脉中观察到miR122的低水平表达。在其他实例中，本文公开的AAV载体可包含对miR-208a或miR-208b-3p具有特异性的MTS，其在心肌、肌肉中富集，在甲状腺中也以较低水平表达。在其他实例中，本文公开的AAV载体可包含对miR-499a-3p具有特异性的MTS，其在心肌、肌肉以及甲状腺、前列腺和骨中富集。用于在本文公开的AAV载体中使用的另外的合适的MTS是本领域已知的，例如，提供于Luwig等人,Nucleic Acid Res.44(8):3865-3877(2016)中，其相关公开内容通过引用并入以用于本文引用的主题和目的。在具体实例中，本文公开的AAV载体可包含组织特异性miRNA靶位点(诸如本文公开的那些)的组合。
(5)基因表达的其他调控元件
在一些实施方案中，本文公开的AAV载体还可包括一种或多种调控元件，其可以可操作地连接至转基因(编码FMRP)，以用于调控FMRP在脑细胞中的表达。示例性的调控元件包括但不限于转录起始位点和/或终止位点、增强子序列；有效RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强编码产物分泌的序列。大量的表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的，是本领域已知的，并且可在本公开中使用。
例如，AAV载体可包含聚腺苷酸化序列，诸如SV40聚腺苷酸化序列或牛生长激素的聚腺苷酸化序列。在一些情况下，AAV载体可包含一个或多个内含子序列、一种或多种polyA信号传导序列，和/或一种或多种转录后调控元件。在一些情况下，可能引起安全性问题的元件，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，可被排除在外。
(6)AAV载体的示例性实例
在一些实例中，本文公开的AAV载体可包含(a)AAV病毒骨架，其可包含5’反向末端重复(ITR)和3’ITR；(a)编码功能性人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)(例如，人FMR1同种型1)蛋白(FMRP)的核苷酸序列；(c)与FMRP编码序列可操作地连接的启动子，以及(d)一个或多个微RNA靶位点(MTS)。在一些情况下，启动子可以是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子(例如，CAG启动子)的杂合体。可替代地或除此之外，一个或多个组织选择性miRNA靶位点可对存在于非脑组织但不存在于脑细胞中(或仅以非常低的水平存在，使得FMRP的表达不会受到显著影响)的一种或多种miRNA具有特异性。示例性的MTS包括对miR-122、miR-208a、miR-208b-3p、miR-499a-3p或它们的组合具有特异性的那些。这种AAV载体还可包含一种或多种本文公开的调控元件。
在其他实例中，本文提供的AAV载体是自互补AAV(scAAV)载体，其包含(a)5’反向末端重复(ITR)和3’ITR，其中的一者或两者被截短；(b)编码野生型人FMR1同种型1蛋白的核苷酸序列；(c)与编码FMRP的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些情况下，启动子是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体(例如，CAG启动子)。在一些情况下，scAAV还可包含一个或多个微RNA靶位点(MTS)，其可对存在于非脑组织但不存在于脑细胞中(或仅以非常低的水平存在，使得FMRP的表达不会受到显著影响)的一种或多种miRNA具有特异性。示例性的MTS包括对miR-122、miR-208a、miR-208b-3p、miR-499a-3p或它们的组合具有特异性的那些。这种scAAV载体还可包含一种或多种本文公开的调控元件。
scAAV载体通常被已知为具有有限的插入能力。因此，这种类型的AAV载体通常被认为不适合大的转基因。此处，使用scAAV载体成功克隆了全长人FMR1同种型1的编码序列并表达了所编码的FMR1同种型1蛋白(FMRP同种型1)。该数据表明，scAAV载体将适用于递送用于基因疗法目的的大的全长FMR1同种型1蛋白(FMRP同种型1)。
在一些实例中，本文提供的AAV载体可以是标准(常规)AAV载体，其包含：AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和3’ITR；(ii)编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白的核苷酸序列；(iii)与(ii)可操作地连接的启动子；以及(iv)调控FMRP表达的一种或多种调控元件。启动子可以是如本文所公开的CAG启动子。可替代地，启动子可以是也如本文所公开的PGK启动子。在一些情况下，AAV载体包含一种或多种调控元件，其可为一个或多个内含子序列(例如，人β-珠蛋白内含子序列)、一种或多种polyA信号传导序列(例如，SV40polyA信号传导序列、人β-珠蛋白polyA信号传导序列或它们的组合)、一种或多种转录后调控元件(例如，WRPE)或它们的组合。在其他情况下，本文提供的AAV载体可不含WRPE等以改善安全性。
本文公开的AAV载体的具体实例在下面的实施例1中提供。
(C)AAV病毒颗粒的血清型
AAV病毒颗粒可以是能够感染脑细胞的合适血清型。迄今为止，鉴定出11种AAV病毒血清型。这些血清型在它们感染的细胞类型上有所不同。在一些实施方案中，本文公开的AAV病毒颗粒可以是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8或AAV9，它们都能够感染脑细胞。在一些实例中，AAV病毒颗粒是AAV9。
在一些实例中，AAV病毒颗粒可以是包含来自一种血清型的基因组元件和来自至少另一种血清型的衣壳的杂合AAV。例如，AAV载体可包含来自AAV2(例如，AAV2 ITR，野生型或修饰型式)的基因组元件和来自能够感染脑细胞的血清型之一(例如，AAV9)的衣壳。
在一些实施方案中，本文公开的AAV病毒颗粒可包括经修饰的衣壳，例如通过非病毒蛋白或肽或通过结构修饰，以改变AAV病毒颗粒的嗜性，使得其将能够感染脑细胞。例如，衣壳可包括脑细胞受体的配体(例如，脑细胞特异性受体)，使得包含所述配体的AAV病毒颗粒可以靶向并感染脑细胞。
(D)制备AAV颗粒的方法
本文公开的AAV DNA载体构建体可使用已知技术制备，例如重组技术。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel.,F.等人编,Wiley and Sons,NewYork 1995)。在一些情况下，可以设计转基因和调控元件的大小，以便满足AAV颗粒的包装能力。如果需要，可以将“填充”DNA序列添加到构建体中，以保持标准AAV基因组大小，以用于比较目的。这种片段可来源于本领域技术人员已知且可获得的非病毒来源。
可将AAV DNA载体包装到病毒颗粒中，这可以用于将转基因递送至宿主细胞以进行表达。例如，可以将如本文所公开的AAV载体转染到能够产生病毒蛋白诸如AAV病毒体包装所必需的衣壳蛋白的生产细胞系(包装细胞)中。
包装细胞系可通过建立稳定转染了用于AAV颗粒产生的所有必需组分(例如AAVrep和cap基因)以及任选的选择性标志物(诸如新霉素抗性基因)的细胞系来产生。参见，例如，Samulski等人,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081。在一些情况下，在产生AAV病毒颗粒时，包装细胞系可以被辅助病毒诸如腺病毒感染。该方法的优点是细胞是可选择的并且适用于rAAV的大规模生产。合适方法的其他实例采用腺病毒或杆状病毒，而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。rAAV生产的一般原理综述于例如Carter,1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539；和Muzyczka,1992,Curr.Topics in Microbial.and Immunol.,158:97-129)。各种方法描述于Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人,Mo1.Cell.Biol.5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,1988Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)中。Samulski等人(1989,J.Virol.,63:3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人(1995)Vaccine 13:1244-1250；Paul等人(1993)HumanGene Therapy 4:609-615；Clark等人(1996)Gene Therapy 3:1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595。
II.药物组合物
本文公开的任何AAV病毒颗粒(例如，AAV9病毒颗粒)可配制形成药物组合物，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。待用于本发明方法中的任何药物组合物可以包含冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
药物组合物中的载剂必须是“可接受的”，从某种意义上说，它与组合物的活性成分相容，并且优选地，能够稳定活性成分并且对待治疗的受试者无害。例如，“药学上可接受的”可以指包含它们的组合物在施用给哺乳动物(例如，人类)时在生理上可耐受且通常不产生不良反应的分子实体和其他成分。在一些实例中，本文公开的药物组合物中使用的“药学上可接受的”载剂可以是由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出可用于哺乳动物且更尤其是人类的那些。
药学上可接受的载剂，包括缓冲剂，是本领域中众所周知的，并且可包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水性聚合物；单糖；二糖；以及其他碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见，例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins编辑K.E.Hoover。
在一些实施方案中，药物组合物或制剂用于肠胃外施用，诸如静脉内、脑室内注射、小脑延髓池内注射、实质内注射或它们的组合。此类药学上可接受的载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液以及葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可以用作液体载剂，特别是用于注射溶液。本文公开的药物组合物还可包含附加成分，例如防腐剂、缓冲剂、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文所述的药物组合物可以包装成单一单位剂量或多剂量形式。
用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括助悬剂和增稠剂。水溶液可以被适当地缓冲(优选至3至9的pH)。通过本领域技术人员熟知的标准药物技术，很容易地实现在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂。
待用于体内施用的药物组合物应是无菌的。这通过例如通过无菌滤膜过滤来容易地完成。通过根据需要将所需量的AAV颗粒与以上列举的各种其他成分一起掺入到适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将经过灭菌的活性成分掺入到包含基础分散介质和来自以上列举的那些的所需的其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
本文公开的药物组合物还可包含其他成分，诸如稀释剂和佐剂。可接受的载剂、稀释剂和佐剂对接受者无毒，并且优选地在所使用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如吐温(Tween)、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇。
III.用产生FMRP的AAV颗粒治疗FXS
如本文所公开的携带编码FMRP的病毒载体的任何AAV颗粒均可用于将编码FMRP的转基因递送至脑细胞以进行FMRP表达，以缓解一种或多种与FXS相关的症状。因此，在一些方面，本公开提供了用于在需要治疗的受试者中缓解一种或多种症状和/或治疗FXS的方法、多种AAV颗粒诸如本文公开的AAV9颗粒，以及包含所述颗粒的药物组合物。为了执行本文所公开的方法，可将有效量的AAV颗粒或包含所述颗粒的药物组合物以如本文所公开的合适量通过合适的途径(例如，静脉内、脑室内注射、小脑延髓池内注射或实质内注射)施用于需要治疗的受试者。
如本文所用，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用于例如具有目标疾病或病症、疾病/病症的症状，或疾病/病症的倾向的需要治疗的受试者，目的是治愈、疗愈、缓解、减轻、改变、补救、改良、改善或影响病症、疾病的症状，或疾病或病症的倾向。
缓解目标疾病/病症包括延缓疾病的发展或进程，或降低疾病严重程度。缓解疾病不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延缓”目标疾病或病症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推延疾病的进展。这种延缓可取决于病史和/或所治疗个体而具有不同的时间长度。“延缓”或缓解疾病发展或延缓疾病发作的方法是如下方法，在与不使用所述方法相比时，其在给定时间范围内降低疾病的一种或多种症状发展的可能性和/或在给定时间范围内降低症状的程度。此类比较通常基于临床研究，使用足以给出具有统计显著性的结果的大量受试者。
疾病的“发展”或“进展”是指疾病的初始表现和/或随后进展。使用本领域众所周知的标准临床技术可以检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法察觉的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
待通过本文公开的任何方法治疗的受试者可以是患有FXS的人类患者，其可以通过常规医学检查，例如，实验室测试、器官功能测试、行为测试、CT扫描、脑电图和/或磁共振成像(MRI)来鉴定。FXS患者通常在FMR1基因上有一个或多个基因突变，这通常产生一种被称为脆性X精神发育迟滞蛋白(FMRP)的蛋白质，也称为FMRP。几乎所有脆性X综合征的病例都是由突变引起的，其中被称为CGG三联体重复的DNA区段在FMR1基因内扩增。通常，该DNA区段重复5至约40次。在患有FXS的患者中，CGG区段重复超过200次。异常扩增的CGG区段关闭(沉默)FMR1基因，从而阻止该基因产生FMRP。具有CGG区段的55至200个重复的男性和女性被认为具有FMR1基因前突变。大多数具有这种前突变的人们智力正常。然而，在一些情况下，具有前突变的个体的FMRP低于正常量。因此，他们可能具有在FXS中观察到的身体特征的温和版本。FXS以X连锁显性模式遗传。如果每个细胞中一个拷贝的经改变基因足以导致该情况，那么遗传是显性的。X连锁显性意味着在女性(具有两条X染色体)中，每个细胞中两个拷贝的基因中的一个的突变足以导致该病症。在男性中(仅具有一条X染色体)，每个细胞中唯一的基因拷贝的突变导致该病症。在大多数情况下，男性比女性经历更严重的病症症状。
在一些实施方案中，受试者可以是人类儿童FXS患者。在一些实施方案中，受试者可以是男性人类儿童FXS患者。这样的儿童患者可小于16岁。在一些实例中，儿童患者的年龄可小于12岁，例如小于10岁、8岁、6岁、4岁或2岁。在一些实例中，儿童患者是婴儿，例如，小于12个月，例如等于或小于6个月。可替代地，受试者可以是人类青少年患者(例如，16-20岁)或患有FXS的人类成年患者。
可替代地或除此之外，在本文公开的方法中待治疗的FXS患者可在FMR1基因内携带扩增的CGG区段。在一些实例中，FXS患者可在FMR1基因内携带重复超过200次的扩增的CGG区段。在一些实例中，FXS患者可以是在FMR1基因中具有X连锁突变的男性患者。在一些实施方案中，可用本文公开的方法治疗怀疑患有具有至少一个FMR1基因排列的FXS或有此风险的患者。可以使用常规世代测序方法对候选受试者进行基因测试，包括但不限于下一代测序、焦磷酸测序、Sanger测序、全外显子组测序、全基因组测序等。
可替代地或除此之外，一种或多种本文公开的生物标志物(例如，EEG)可用于鉴定适合本文公开的治疗的FXS患者。
在本文公开的任何方法中，可以将有效量的AAV病毒颗粒给予FXS患者，以缓解一种或多种与FXS相关的症状。在一些情况下，与FXS相关的症状可以是行为、认知神经康复或它们的组合。在一些实例中，FXS的症状可以是焦虑相关且持续性的行为、社交行为、学习、记忆或它们的组合。
当然，此类量将取决于所治疗的特定病状、病状的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、协同治疗的性质(如果有的话)、特定的施用途径以及健康从业者的知识和专业技能范围内的类似因素。有效量也可以变化，这取决于患有FXS的受试者之间的表型变异性和/或涉及的基因突变。本文中的AAV病毒颗粒的滴度可在每毫升约1×106、约1×107、约1×108、约1×109、约1×1010、约1×1011、约1×1012、约1×1013至约1×1014或更多的DNA酶抗性颗粒(DRP)的范围内。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表示。剂量也可基于对患有FXS的人类施用的定时而变化。在成人中，这些AAV载体的剂量可在每千克体重约1×1011vg/kg、约1×1012、约1×1013、约1×1014、约1×1015、约1×1016或更多病毒基因组的范围内。对于新生儿，AAV载体的剂量可在每千克体重约1×1011、约1×1012、约3×1012、约1×1013、约3×1013、约1×1014、约3×1014、约1×1015、约3×1015、约1×1016、约3×1016或更多病毒基因组的范围内。这样的量可以由本领域技术人员按照常规实践来确定，例如，在施用后的多个时间点检查病毒的血液水平以确定剂量是否合适。
在一些情况下，AAV病毒颗粒可通过多个剂量给予受试者。在一些实例中，可以必然地通过相同途径或不同途径向受试者施用多个剂量。在其他实例中，可以通过不同途径例如本文公开的那些，向受试者同时施用多个剂量。
医药领域普通技术人员已知的常规方法可以用于将含有AAV9颗粒的药物组合物施用给FXS受试者。例如，该药物组合物也可以例如通过静脉注射、脑室内注射、小脑延髓池内注射、实质内注射或它们的组合来肠胃外施用。在一些实施方案中，含有AAV颗粒的药物组合物可以通过至少两种施用途径施用于人类患者。在一些实例中，施用途径的组合可以是脑室内注射和静脉内注射。在一些实例中，施用途径的组合可以是鞘内注射和静脉内注射。在一些实例中，施用途径的组合可以是小脑延髓池内注射和静脉内注射。在一些实例中，施用途径的组合可以是实质内注射和静脉内注射。
在一些实施方案中，待通过本文所述的方法治疗的受试者可以是已经进行或正在进行另一抗FXS疗法的人类患者。先前的抗SFXS疗法可完成。可替代地，抗FXS疗法可仍在进行中。在其他实施方案中，FXS患者可进行包括本文公开的AAV9颗粒疗法和第二抗FXS疗法的组合疗法。抗FXS治疗包括但不限于治疗行为异常、癫痫发作、语言疗法、物理疗法等。示例性的抗FXS治疗包括但不限于包含GABA受体激动剂、PI3K同种型选择性抑制剂、MMP9拮抗剂或它们的组合的治疗。其他可用的剂和疗法可以见于Physician's Desk Reference,59thedition,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人编Remington's TheScience and Practice of Pharmacy 20th edition,(2000),Lippincott Williams andWilkins,Baltimore Md.；Braunwald等人编Harrison'sPrinciples of InternalMedicine,15th edition,(2001),McGraw Hill,NY；Berkow等人编The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy,(1992),Merck Research Laboratories,Rahway N.J.。
在一些实施方案中，可基于FXS患者对治疗的反应来调整AAV颗粒诸如AAV9颗粒或其药物组合物的剂量。例如，如果FXS患者表现出一种或多种行为特征的恶化(例如，行为和/或认知活动)，则可以减少AAV颗粒的剂量。可替代地，如果FXS患者未表现出FXS症状的明显改善，则可增加AAV颗粒的剂量。关于使用行为特征作为生物标志物来评估AAV9颗粒在个体FXS患者中的合适剂量和/或治疗功效，参见下文的描述。
IV.使用EEG和行为特征生物标志物来确定个体FXS患者的AAV9颗粒的个性化剂量
在本文公开的任何治疗方法中，本文公开的一种或多种生物标志物可用于鉴定合适的患者，以用于确定个性化的AAV颗粒剂量，和/或用于评估治疗功效。如本文所用的术语“生物标志物”是指提供关于FXS患者临床特征的信息的指标(一个因素或因素的组合)，所述临床特征例如，疾病的表型严重程度、患者对治疗的反应性等。示例性的生物标志物包括EEG(例如，长时程增强或LTP)、一种或多种行为特征(例如，激越或记忆缺失)，或它们的组合。FMRP是一种突触蛋白，并且其水平和/或分布与脑中的神经活动水平相关。FMRP的丧失导致LTP阈值的增加，从而导致异常的神经活动，其可以使用EEG来测量和记录。因此，EEG可以用于监测FMRP的水平和/或分布，从而有益于FXS患者诊断和治疗功效的评估。
在一些实施方案中，通过脑电图(EEG)评估的长时程增强(LTP)模式可以用作生物标志物，以用于评估和确定AAV颗粒(诸如本文公开的AAV9颗粒)的合适剂量，以用于治疗FXS的方法中。在一些实例中，在施用初始剂量的AAV颗粒之后，可使用EEG来监测FXS患者的LTP模式。如果AAV9颗粒的初始剂量未显示出对FXS患者的LTP模式的影响，则可维持或增加AAV9颗粒的剂量。
在其他实施方案中，激越可以用作生物标志物，以评估和确定用于在本文公开的方法中使用的AAV9颗粒的合适剂量，或用于评估治疗功效。激越是指一种焦虑或神经兴奋的状态，表现为焦虑相关的且持续性的行为。在施用初始剂量的AAV颗粒后，可按照常规实践或本文提供的方法监测FXS患者的激越的发展和/或进展。如果FXS患者出现激越、激越进展，或焦虑感增强，则可以减少AAV颗粒的剂量。可替代地，如果初始剂量的AAV颗粒没有导致FXS患者出现激越或缓解/减少激越，这表明初始剂量的AAV9颗粒是有效的。可保持或增加AAV颗粒的剂量。
在其他实施方案中，记忆缺陷可以用作生物标志物，以评估和确定用于在本文公开的方法中使用的AAV9颗粒的合适剂量，或用于评估治疗功效。记忆缺陷是指FXS患者无法学习，表现为短期记忆。在施用初始剂量的AAV颗粒后，可按照常规实践或本文提供的方法监测FXS患者的记忆缺陷的发展和/或进展。如果FXS患者出现记忆缺陷或记忆缺陷进展，则可以减少AAV颗粒的剂量。可替代地，如果初始剂量的AAV颗粒没有导致出现记忆缺陷或没有改善FXS患者的记忆缺陷，这表明初始剂量的AAV9颗粒是有效的。可保持或增加AAV颗粒的剂量。
使用一种或多种本文公开的EEG和/或行为特征生物标志物，可为个体FXS患者确定AAV颗粒的合适剂量。
一种或多种本文公开的EEG和/或行为特征生物标志物也可以用于评估本文公开的涉及AAV颗粒的治疗的治疗功效。这种评估可帮助确定进一步的治疗策略，例如，继续AAV介导的FMR1基因疗法、改良AAV介导的FMR1基因疗法(改变剂量、给药间隔等)、将AAV介导的FMR1基因疗法与另一抗FXS疗法组合，或终止AAV介导的FMR1基因疗法。
V.用于FXS治疗的试剂盒
本公开还提供了用于治疗如本文所述的FXS的试剂盒。如本文所述的用于治疗用途的试剂盒可包括一个或多个容器，所述容器包含配制在药物组合物中的AAV颗粒，诸如如本文所述的AAV9颗粒。
在一些实施方案中，试剂盒可以另外包括在本文所述的任何方法中使用AAV颗粒的说明书。所包括的说明书可包含向受试者施用AAV颗粒或包含所述颗粒的药物组合物以在受试者中实现预期活性的描述。试剂盒还可包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适于治疗的受试者的描述。在一些实施方案中，说明书包括向患有或疑似患有FXS的受试者施用雷帕霉素化合物或包含所述化合物的药物组合物的描述。
与如本文所述的AAV颗粒的使用相关的说明书通常包括关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。在一些实施方案中，说明书包括使用一种或多种行为特征作为生物标志物，例如，本文所述的那些，优化患有FXS的受试者的雷帕霉素剂量的描述。容器可以是单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书。标签或包装插页表明药物组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解受试者的疾病或病症。
本文提供的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装等。还设想了与特定装置诸如吸入器、经鼻施用装置或输注装置组合使用的包装。试剂盒可具有无菌接入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌接入口。
试剂盒任选地可提供另外的组分，诸如缓冲液和解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。在一些实施方案中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
在一些实施方案中，试剂盒包括一种或多种本文公开的AAV载体。在一些实例中，试剂盒可以另外包含一种或多种辅助载体，以用于与本文公开的AAV载体组合使用。在一些实例中，试剂盒可包括适用于与本文公开的AAV载体一起使用的宿主细胞。试剂盒还可以包括根据如本文所述的方法使用AAV载体的说明书。
一般技术
除非另外指明，本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分解释，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1989)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编1993-8)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编):GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编1987)；PCR:The PolymeraseChain Reaction,(Mullis等人编1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonalantibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编HarwoodAcademic Publishers,1995)；DNA Cloning:A practical Approach,第I卷和第II卷(D.N.Glover编1985)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985》；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编(1984>>；Animal CellCulture(R.I.Freshney编(1986>>；Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986>>；以及B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)。
无需进一步阐述，相信本领域技术人员可以基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例
虽然已经参考其具体实施方案对本公开进行了描述，但是本领域技术人员应理解，在不脱离本公开的真正精神和范围的情况下可作出各种改变并可替换等效方案。此外，可以进行许多修改，以便使特定的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或步骤适应本公开的目标、精神和范围。所有此类修改旨在处于本公开的范围内。
实施例1.表达FMRP的AAV载体的开发
脆性X综合征(FXS)是一种由脆性X精神发育迟滞蛋白(FMR1)基因中的CGG重复的扩增引起的单基因综合征，其导致基因产物脆性X精神发育迟滞蛋白(FMRP)的丧失并且是遗传性智力残疾的主要原因。由于单基因病症是基因疗法的特别有吸引力的目标，其中在理论上，校正单个基因可拯救整个生物体，开发腺相关病毒(AAV)来恢复FXS患者的FMRP表达可以是一种有用的治疗策略。
设计并克隆了能够产生人FMRP(同种型1)的靶向CNS的AAV载体。具体地，开发了表达FMRP或GFP(作为对照的绿色荧光蛋白)的两种不同病毒载体：(1)自互补AAV载体(scAAV；避开了DNA合成的需要)(图1A)，以及(2)常规AAV载体(图2A)。scAAV载体scAAV9-CB-FMR1基于scAAV骨架并且包含处于杂合CMV增强子/β-肌动蛋白启动子CB控制下的人FMR1编码序列(图1A)。常规AAV载体AAV-CAGFMR1包含处于CB启动子(又名CAG启动子)控制下的人FMR1编码序列(图2A)。产生病毒以赋予AAV9嗜性，以用于前脑神经元的最佳转导，并且FMR1插入片段大小为约为3千碱基(kb)。
两种载体都在原代海马和/或皮质小鼠神经元中进行测试，并显示出以剂量依赖性方式表达全长FMRP蛋白。具体地，在第八次细胞分裂时用1、2、5或10μl的scAAV9-CB-FMR1、scAAV9-CB-GFP或scAAV9-CBflag-FMR1病毒颗粒转导原代培养的小鼠皮质神经元。在第13次细胞分裂后，收获细胞并进行蛋白质印迹分析。图1B示出带有flag标签的FMR1和未加标签的FMRP的剂量依赖性表达。此外，用每毫升3、1.5、0.8或0.4个病毒基因组(vg/ml)的AAV-CAGFMR1或AAV-CAG-GFP转导原代培养的小鼠海马神经元，然后进行蛋白质印迹分析。图2B示出FMRP和对照GFP蛋白分别在AAV-CAGFMR1和AAV-CAG-GFP转导细胞中的剂量依赖性表达。
还在用每毫升3、1.5或0.3个病毒基因组(vg/ml)的AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP转导的原代培养的小鼠海马神经元中测量了FMR1和GFP的mRNA表达。图2C示出FMR1 mRNA和对照GFP mRNA分别在AAV-CB-FMR1和AAV-CB-GFP转导细胞中的剂量依赖性表达。
为了优化FMR1的表达和安全性，开发了三种另外的载体。为了构建这些另外的载体，将FMR1转基因克隆到携带卡那霉素抗性基因的载体骨架中。此外，转基因侧接填充序列，这减少了细菌序列对质粒骨架的包装，否则其可能被包装。使用该载体产生的构建体如下：(1)pTR130-mCAG-huFMRP-WPRE-SV40pA(下文称为“CAGWPRE”载体)(参见图15)(SEQ IDNo:4)，其在上述载体骨架中包含与AAV-CAGFMR1中相同的转基因；(2)pTR130-mCAG-huFMRP-SV40pA(下文称为“CAGdelWPRE载体”)(参见图16)(SEQ ID No:5)，其在上述载体骨架中相对于CAGWPRE构建体缺少WPRE；以及(3)pTR130-hPGK-hBGin-huFMRP-hBGpA+SV40pA-3'sCHIMin(下文称为“hPGK载体”)(参见图17)(SEQ ID No:6)，其在上述载体骨架中含有驱动FMRP表达的hPGK启动子，以及充当mRNA转录稳定元件的3’hβ-珠蛋白聚(A)信号(参见图17)和小嵌合内含子序列。选择这些修饰以促进转基因在体内的最佳表达，并且另外改善构建体的安全性。
为了比较CAGWPRE和CAGdelWPRE载体的FMRP表达效率，用载体转导CHO-Lec2细胞，并通过蛋白质印迹评估表达。用CAGdelWPRE载体转导的细胞表达FMRP，但观察到的表达低于在用CAGWPRE载体转导的细胞中观察到的表达。图18A和18B。
为了比较hPGK载体与CAGWPRE和CAGdelWPRE载体在神经元细胞中的表达效率，将E17培养的小鼠皮质神经元在DIV14下用载体转导，并允许表达载体5天，然后在DIV19下收获。随后对收获的神经元进行蛋白质印迹分析。相对于在用CAG驱动的载体转导的神经元中观察到的情况，在hPGK载体中使用hPGK启动子导致神经元中的FRMP表达减少。图19。
表2.示例性质粒的序列
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实施例2.优化给药、定时和递送途径以用于FMRP表达AAV载体
为了确定表达FMRP的AAV载体的最佳递送途径，以及针对FMRP的CNS特异性表达而优化的给药和定时，在小鼠模型中进行了使用scAAV9-CB-FMR1和AAV-CAG-FMR1的体内研究。
为了评估使用scAAV进行转导和重组基因表达的定时，将～2000万vg scAAV-GFP脑室内(ICV)注射到6周龄的野生型小鼠中。ICV递送使全身免疫反应和副作用降至最低，同时保证在脑内广泛施用。病毒注射施用后两周，对小鼠进行经心脏灌注(4％多聚甲醛)，并且将脑后固定(postfix)过夜，在30％蔗糖中冷冻保护，并快速冷冻。将脑切片安装在显微镜载玻片上进行处理，并使用共聚焦显微镜成像。图3A示出注射scAAV-GFP的野生型小鼠脑的皮质和海马区中的scAAV-GFP表达。
此外，将～2000万vg AAV-CAG-FMR1 ICV注射到6周龄的野生型小鼠中。病毒注射后两周，对小鼠进行经心脏灌注(4％多聚甲醛)，并且将脑后固定(postfix)过夜，在30％蔗糖中冷冻保护，并快速冷冻。将脑切片安装在显微镜载玻片上进行处理，并进行荧光免疫染色，类似于Gross等人,Cell Rep.2015；11(5):681-688中所述的方法。2015；11(5):681-688，其公开内容整体并入引入。图3B和3C示出两周之后FMRP蛋白表达增加的皮质和海马神经元(用免疫荧光标志物NeuN标记)。AAV-CAG-FMR1和AAV-CAG-GFP的总蛋白表达也在从ICV注射小鼠收集的包含皮质、海马、中脑和小脑的脑切片中进行评估。简单来说，将～4000万vg AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP ICV注射到6-7周龄的野生型小鼠和6-7周龄的Fmr1敲除(KO)小鼠中。病毒注射后十周，收获大脑，收集脑切片并进行处理以用于蛋白质印迹分析。图4示出在皮质和海马中通过蛋白质印迹可清楚地检测到GFP，而在注射含有处于CAG启动子下的FMRP或GFP的常规AAV的小鼠中，FMRP低于检测限。脑切片的蛋白质印迹和免疫组织化学分析还评估了注射小鼠中的细胞死亡和胶质增生，有助于鉴定导致中度FMRP表达(70-110％)而没有细胞死亡或胶质增生迹象的剂量。
实施例3：优化给药、定时和递送途径以用于FMRP表达AAV载体
为了进一步优化表达FMRP的AAV载体的给药、定时和递送途径，将所述载体施用给Fmr1敲除(KO)小鼠，并评估功能和生理结果。
在P21下通过静脉内(IV)或组合(IV+ICV)施用途径向小鼠施用载体，例如CAGWPRE、CAGdelWPRE或hPGK。对照组包括通过组合施用接受媒介物的WT和KO小鼠。实验组中的小鼠接受低剂量(例如，1E13-5E13vg/kg)或高剂量(例如，8E13-2E14vg/kg)的施用载体。所有组的小鼠在给药后60天进行行为测试。行为测试包括筑巢行为的评估、莫氏水迷宫任务表现的评估，以及使用脑电图(EEG)的功能性神经生理学评估。对所有组中的小鼠进行生物分布的最终评估。每个实验组和对照组由大约10只小鼠组成。
在另一项研究中，在P21(“小儿”)或P42(“年长者”)下通过静脉内(IV)或组合(IV+ICV)施用途径向小鼠施用载体，例如CAGWPRE、CAGdelWPRE或hPGK。对照组包括在P21或P42下通过IV或IV+ICV施用接受媒介物的WT和KO小鼠。实验组中的小鼠接受一系列剂量(例如，1E13-2E14 vg/kg)的施用载体之一。所有组的小鼠在给药后90天进行行为测试。行为测试包括筑巢行为的评估、莫氏水迷宫任务表现的评估，以及使用脑电图(EEG)的功能性神经生理学评估。对所有组中的小鼠进行生物分布的最终评估。每个实验组和对照组由大约10只小鼠组成。
对以上实验的结果进行分析，以确定哪种给药方案、定时和施用途径能更好地将转基因递送至脑和身体的所有部分，以及更好地拯救Fmr1 KO小鼠的功能和行为缺陷。鉴于FMR1基因在组织中普遍表达，预计通过一种或多种所测试的施用条件可实现的校正性转基因的广泛分布将有益于脆性X综合征的治疗。
实施例4.施用表达FMRP的AAV载体后的FXS小鼠模型的行为分析
Fmr1敲除(KO)小鼠不表达FMRP，并复制与FXS相关的人类表型，包括脑兴奋过度以及行为和认知缺陷。这表明，Fmr1 KO小鼠不仅是优异的FXS模型，而且在Fmr1 KO小鼠中测试前额皮质功能的行为范式可以用于评估通过AAV基因疗法拯救FXS的认知障碍的治疗策略的潜力。
以如Gross等人,Cell Rep.2015；11(5):681-688中描述的类似方式产生Fmr1 KO小鼠，所述文献的公开内容整体并入本文。简单来说，通过将雌性Fmr1HET小鼠与雄性Pik3cb杂合小鼠杂交产生Fmr1 KO小鼠，并通过PCR进行基因分型。将敲除小鼠品系与C57BL/6J背景回交至少四次(Pik3cbHET)或多于十次(Fmr1HET)。
根据图5所示的时间线，在施用AAV后，对Fmr1 KO小鼠和野生型对照小鼠进行行为和功能评估。简单来说，向Fmr1 KO小鼠和野生型小鼠ICV注射每只小鼠4000-6000万个AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP病毒基因组。注射时的小鼠介于6-7周龄之间。小鼠在病毒注射后保持存活约10周，并在此期间进行多种行为测定(筑巢、弹珠掩埋、开阔场地活动、新物体识别和莫氏水迷宫)。
从病毒注射后一周开始，每周评估筑巢，持续4周。简单来说，在实验开始时，将小鼠放在具有标准垫料的新鲜笼子中，并补充3克新鲜方形棉。2小时后，使用如Gross等人,Cell Rep.2015；11(5):681-688中描述的评分系统对巢进行评估，所述文献的公开内容整体并入本文。图6A示出野生型小鼠和Fmr1 KO小鼠在接受新鲜方形棉2小时后撕碎方形棉材料的实例。更多的撕碎指示“家笼行为(home cage behavior)”，其转化为人类的“社交行为”。图6B显示，总体而言，Fmr1 KO小鼠撕碎的方形棉较少。注射AAV-CAG-FMR1的Fmr1 KO小鼠在2周与4周之间撕碎了增加量的方形棉，而注射AAV-CAG-GFP的小鼠没有改善，表明了FMRP表达的积极作用(图6C)。这些测试还显示，所有小鼠都在筑巢，这证实了它们的整体健康没有受到病毒载体的影响。
过度弹珠掩埋表明小鼠的持续性或焦虑相关的行为，并且在Fmr1 KO小鼠中有所改变。AAV施用四周后，对Fmr1 KO和野生型小鼠进行弹珠掩埋测定。简单来说，将小鼠放在笼子中，所述笼子里具有20个蓝色的小玻璃珠，它们在新鲜的垫料上排列成5×4的网格(大约8cm深)。15分钟后，移走小鼠，并且覆盖50％或更多的弹珠被评分为“被掩埋”。在这15分钟内，还测量了开始挖掘以掩埋弹珠的潜伏期。在下午12点与3点之间测试小鼠，并在弹珠掩埋之前测试其筑巢行为。图7A示出小鼠弹珠掩埋行为的实例。左图示出放入小鼠之前的弹珠排列，并且右图示出放入小鼠之后的弹珠位置。与野生型小鼠相比，注射GFP的Fmr1 KO小鼠(代表Fmr1 KO小鼠，因为GFP对Fmr1 KO小鼠没有影响)平均具有减少的开始掩埋潜伏期并且掩埋更多弹珠；表达FMRP的AAV载体的注射拯救了减少的潜伏期(图7B和7C)。
注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠在AAV注射后6-8周进行莫氏水迷宫测定。莫氏水迷宫通常用于确定海马在空间学习中的作用程度。图8A示出如本文所公开进行的莫氏水迷宫测定的图。在莫氏水迷宫的训练(习得)试验中，将小鼠置于水中，面向墙壁，在六个起点中的一个处，由图8A中的棕色标记指示。允许小鼠游泳最多至60秒或直到它找到平台。到达平台的时间(潜伏期)以秒为单位测量。在探测性试验中，将小鼠在水池中放置在已被移除的平台的对侧象限(OP)中。在探测试验中，测量在每个象限和平台交叉(platform crosses)中花费的时间。象限TQ是目标象限，即平台所在的水池区域。OP是TQ的对侧象限。当俯视水池时，AR和AL是目标象限的相邻左右象限。所有组以相似速率完成任务，并且能够在训练结束时找到隐藏的平台。在逆转任务中，当隐藏平台的位置移动到迷宫的对侧象限时，注射GFP的Fmr1 KO小鼠进入前象限的次数较少(图8B)，并且到达前平台位置的潜伏期增加(图8C)，这表明注射GFP的Fmr1 KO小鼠对平台位置的记忆不太准确，这与记忆缺陷相符。注射FMRP10的Fmr1 KO小鼠与野生型小鼠无法区分(图8B和8C)，表明这种记忆缺陷得到改善。
注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠在AAV注射后6-8周进行开阔场地活动测定。开阔场地活动测定测量多动和/或焦虑。简单来说，在开始测试前，使小鼠在实验房间中适应30分钟。将小鼠放入透明树脂玻璃(Plexiglas)(40×40×30)cm开阔场地竞技场的中心，并允许其探索15分钟。照明由竞技场内部的顶灯(～800勒克斯)提供，并且实验在55分贝(dB)的白噪声存在下进行。通过Digiscan光学动物活动系统控制，以2分钟的间隔收集数据。将数据汇集以用于计算机指定的外周和中央扇区，并表示为每个基因型的平均值。这些研究表明，注射GFP的Fmr1KO小鼠在开阔场地竞技场的中心花费更多时间(双因素方差分析，基因型的效应p＝0.02)；然而，在注射GFP的野生型与Fmr1 KO小鼠之间没有观察到差异(图9)。总体来说，病毒表达的hFMRP不显著影响开阔场地活动的改变。
注射AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP的Fmr1 KO和野生型小鼠在AAV注射后6-8周进行新物体识别测定。新物体识别测定依赖于小鼠相对于熟悉物体探索新物体的先天偏好，推测这在Fmr1 KO小鼠中受损。此处，无生命的、木制和中性颜色的物体用于本实施例公开的新物体识别测试中。首先使用独立的野生型小鼠的幼稚队列(cohort)测试物体的中性偏好强度，丢弃引起强烈吸引或厌恶反应的物体。第一天，使小鼠适应圆形的白色竞技场(直径30cm)30分钟。第二天，将小鼠暴露于有若干等间距物体的竞技场中，持续15分钟。计算每只小鼠与每个物体的互动时间，并且在接下来两天的测试中，使用两个引起中等反应的物体作为“熟悉”物体。在第三天和第四天，在竞技场的特定区域(用于展示物体的平衡位置)内向小鼠展示熟悉物体，持续15分钟。在第五天，用第四“新”物体替换一个“熟悉”物体，并且持续15分钟测试小鼠的互动行为。当小鼠暴露于四个物体(三个熟悉的和一个新的)时，记录整个15分钟的互动时间。互动参数定义为与物体接触(仅排除尾巴)或面对物体(距离<2cm)。偏好指数(PI)通过用与新物体互动所花费的时间除以探索新物体和熟悉物体的时间量来计算。记录所有实验，然后由两名对基因型和处理组不知情的观察者评分。如图10所示，所有小鼠均表现出对新物体的偏好，并且各组之间没有显著差异。
总的来说，在本实施例中进行的大多数行为测定显示出注射GFP的Fmr1 KO小鼠与野生型小鼠之间的差异，这表明了FXS的行为表型。注射FMR1的Fmr1 KO小鼠表现出与野生型小鼠更相似的行为，这表明，令人惊讶地，即使将少量FMRP重新引入成年小鼠的皮质和海马中也能改善行为。结果表明，病毒表达的FMRP具有改善至少家笼/社交行为(筑巢)、焦虑相关和持续性行为(弹珠掩埋)以及学习和记忆(莫氏水迷宫)的潜力。
实施例5.在施用表达FMRP的AAV载体后从FXS的小鼠模型中收获的脑切片的功能分析
向Fmr1 KO小鼠和野生型小鼠ICV注射每只小鼠4000-6000万个AAV-CAG-FMR1或AAV-CAG-GFP病毒基因组。注射时的小鼠介于6-7周龄之间。如图5所示的时间线所示，小鼠在注射病毒后保持存活约10周，并在此期间进行多个行为测定。在最后一次行为测定后至少5天(手术后～10周)，从所有小鼠中收集脑组织并用于切片的功能测定(例如，使用多电极阵列(MEA))测量长时程增强(LTP)和蛋白质合成测定)以及表达分析(免疫组织化学和蛋白质印迹)。
(i)长时程增强(LTP)
长时程增强是刺激后突触连接增强的一种持久形式，是学习和记忆的细胞关联。简单来说，在冰冷的人工CSF(ACSF)(以mm计：124NaCl、3KCl、1.25KH2PO4、3.4CaCl2、2.5MgSO4、26NaHCO3和10右旋糖，pH 7.35)中用振动切片机制备穿过中隔颞海马的横向海马切片(300μm)。同时运行来自基因型和处理组的切片。切片在界面记录腔室中保持在31±1℃下，切片表面暴露于温暖湿润的95％ O2/5％ CO2中，并以60–70ml/h的速率进行连续ACSF灌注。在开始记录之前，将切片在腔室中平衡至少1小时。孵育后，选择一个切片并将其放置在MED64探针上，其方式使得整个HF被8×8阵列完全覆盖。一旦切片稳定下来，小心地在切片上设置网压载物(U形铂丝，具有规则间隔的发片)来固定它。对于电生理记录，将具有固定切片的探针连接至MED64的刺激/记录部件。借助于蠕动泵，以2-3ml/min的速率用充氧的新鲜ACSF连续灌注切片。在切片恢复20分钟后，从64个开关的盒中选择64个可用平面微电极中的一个用于刺激，随后通过连接至倒置显微镜的电耦装置照相机进行视觉观察。当未指定时，将由数据采集软件产生的单极双相恒流脉冲(30-199μA，持续时间0.1ms)以0.1Hz施加于PP。在其余部位诱发的场电位由64通道主放大器放大，然后以20kHz的采样率数字化。数字化的数据显示在监视器屏幕上，并储存在微型计算机的硬盘上。
五个连续的反应通过记录系统实时地自动求平均。通过测量引发足够幅度的fEPSP的阈值，在不同组的记录过程中切片的活力保持恒定。对于LTP诱导，使用TBS方案，其由10个脉冲组成，每个脉冲包含4个100Hz的脉冲，脉冲间间隔为200ms。广泛接受的是，这种方案类似于体内条件，并且已被建议作为在人工与天然突触活动之间建立联系的方法。此外，由这种刺激诱导的LTP似乎比通过其他手段诱导的更强健和稳定。为了使不同实验中的致强直作用强度标准化，将TBS强度设定为引起几乎一半的最大fEPSP幅度的强度。TBS后，每10分钟一次重复递送测试刺激(强度与基线相同)，持续2小时以上，以允许观察LTP幅度和持续时间的任何变化。
TBS-LTP显示为在Fmr1 KO海马中受损。此处，记录了注射表达FMRP的AAV的f5Fmr1 KO小鼠、注射表达GFP的AAV的7只Fmr1 KO小鼠、注射表达FMRP的AAV的6只野生型小鼠和注射表达GFP的AAV的5只野生型小鼠的LTP。对每组中2-3只小鼠的数据分析表明，如所报道的那样，与注射GFP的野生型切片相比，注射GFP的Fmr1 KO切片略有不足，并且在注射FMRP后，两种基因型的LTP总体增加(图11A)。在相同条件下重复该测定，除了收集持续70分钟的测量结果以评估晚期LTP。图11B示出晚期LTP(最小30-70，紫色三角形)在注射GFP的Fmr1 KO小鼠中受损。此外，FMRP注射增强了Fmr1 KO小鼠的LTP，但在注射FMRP的野生型小鼠中没有增强(图11B)。这些功能分析支持实施例3中公开的数据，其表明了海马依赖性莫氏水迷宫学习测定的改善(图8B-8C)。
(ii)蛋白质合成
长期突触可塑性，诸如学习和记忆，取决于神经元对刺激做出反应合成新蛋白质的能力。FXS小鼠模型和来自FXS患者的细胞中的蛋白质合成速率已经显示为增大且刺激不敏感，即，在可塑性诱导刺激后没有增强。此外，增强和失调的蛋白质合成速率是FXS(和一般自闭症)的关键特征，并被认为是行为和认知缺陷的基础。因此，FXS的治疗策略可以是“治疗性的”，如果它拯救了FXS中的蛋白质合成缺陷。为了评估注射表达GFP或FMRP的AAV的野生型和Fmr1 KO小鼠中的蛋白质合成速率，接着将被制备用于LTP电生理学的皮质和海马切片用于蛋白质合成测定，使用嘌呤霉素掺入新生肽链，随后进行蛋白质印迹分析，该方法始终显示Fmr1 KO脑中的蛋白质合成速率增加。在注射表达FMRP的AAV的2只Fmr1 KO小鼠、注射表达GFP的AAV的5只Fmr1 KO小鼠、注射表达FMRP的AAV的5只野生型小鼠和注射表达GFP的AAV的4只野生型小鼠中进行嘌呤霉素化(Puromycinylation)测定。图12A和12B示出与注射GFP的野生型切片相比，注射GFP的Fmr1 KO切片中蛋白质合成5速率增加的皮质切片。此外，图12A和12B示出注射FMRP的Fmr1 KO切片中降低的蛋白质合成速率。这些结果表明，FMRP再表达使Fmr1 KO小鼠的蛋白质合成速率正常化，这种分子缺陷被认为是突触可塑性、学习和记忆改变的基础。总的来说，本文进行的细胞和分子功能测定表明低FMRP再表达在成年Fmr1 KO小鼠中的有益效果。
(iii)定量脑电图仪(EGG)
本文提供的数据显示，定量脑电图学(EEG)可以用作FXS疾病严重程度和治疗反应(静息状态和听觉事件相关电位)的生物标志物。图14A示出人类中的相对γ功率的地形图，包括显著的组间差异(p<0.05校正)，表明了在FXS患者中观察到的过度γ功率。听觉皮质γ功率与行为功能高度相关，其中在FXS患者中，较高的γ功率与听觉注意力任务的较低表现相关(图14B)。用θ和α功率观察到的γ关系在FXS和健康人类受试者之间进行高度区分(图14C)。总的来说，升高的静息γ功率被认为是人类皮质兴奋过度的强有力的可量化的生物标志物。
在FXS小鼠模型中鉴定可比较的EEG生物标志物可以促进临床前到临床的治疗管道。为了确定Fmr1 KO小鼠是否也表现出升高的静息γ功率，使用30通道小鼠多电极阵列(MEA)系统来记录和分析野生型和Fmr1 KO小鼠的静息和刺激引发的EEG信号。使用该系统，在Fmr1 KO小鼠中观察到稳健的MEA衍生的表型，包括更高的静息EEG功率、改变的事件相关电位(ERP)以及对听觉啁啾刺激的试验间相位相干性的降低，这与在患有FXS的人类中报道的那些非常相似。图13示出与WT小鼠相比Fmrl KO中的增加的γ功率，其中通过连续EEG测量的γ功率针对6天内的5分钟时间段进行计算(n＝3，RM双因素方差分析，*p<0.05)。因此，使用皮质EEG记录在Fmr1 KO小鼠中复制在人类中发现的静息γ功率增加的EEG生物标志物(图13)。
为了将小鼠EEG生物标志物的变化与人EEG生物标志物相关联，使用基于Matlab的分析方法将小鼠数据与人类数据平行。图14D示出使用基于Matlab的分析方法执行和自动化的γ功率分析，其与使用人类数据获得的FXS异常相关。鼠EEG数据的另外分析可以评估频带特异性EEG功率以及小鼠中的γ/θ耦合，从而能够直接比较人类和鼠的表型，并建立FXS的定量和转化的EEG生物标志物。所述数据可表明，FXS的人EEG生物标志物可以用作FXS治疗的发展和优化的客观度量。
实施例6.评价施用表达FMRP的AAV载体后FXS小鼠体内的表达和生物分布
本实施例报道了在Fmr1 KO或Fmr1 WT小鼠中，使用以上实施例1中描述的AAV-CAGFMR1(又名AAV-CB-FMR1)或AAV-GFP(作为对照)对FMR1基因疗法的探索性临床前研究。另外参见图2A。本研究使用9.5-11周龄的雄性小鼠。通过尾静脉向每只小鼠注射5x1013 vg/kg的病毒颗粒。30分钟至6小时后，对小鼠进行双侧脑室内(ICV)手术，并将5×1010vg病毒颗粒递送至每个半球。12-14天后，将小鼠处死；收集血液样品和组织样品(例如，脑、肌肉、心脏、肺、肾、肝和脊髓样品)。一半的脑样品通过免疫染色(多聚甲醛后固定)进行分析。将另一半脑样品解剖成海马、皮质、中脑和小脑(快速冷冻)。通过免疫染色分析所有脑样品，以评价FMRP的表达和分布。将两组其他组织样品(例如，肝脏样品)切片，一组用于检测GFP表达(切割后直接成像，无需染色以确认GFP表达)，并且另一组用于通过免疫染色检测FMRP表达。免疫染色测定中使用的抗FMRP抗体对人FMRP具有特异性，其在WT小鼠中具有低特异性染色。这项研究的结果表明人FMRP的神经元表达，主要在皮质中。
此外，对脑和组织样品进行RT-PCR以检测不同组织样品中hFMR1转录物的水平。eGFP用作对照。将结果针对GAPDH归一化，并提供于图20A-20G中。在脑的不同区域(例如，皮质)以及不同器官(例如，心脏和肝脏)中检测到hFMR1的表达。
实施例7.评价施用表达FMRP的AAV载体后FXS小鼠体内的表达和生物分布
本研究的目标是进一步测试含有编码人FMRP的cDNA的三种不同病毒载体(hPGK、CAGWPRE和CAGdelWPRE)在Fmr1敲除(KO)小鼠中的分布和表达。以上实施例1中提供了这三种载体的细节。将病毒载体脑室内(ICV)或静脉内(IV，尾静脉)递送至5-7周龄的小鼠。4周后(+/-3天)，收获血液和器官，通过RT-qPCR测试Fmr1RNA表达，并且通过蛋白质印迹和/或免疫组织化学(IHC)测试FMRP表达。在孵育期间，监测小鼠的整体健康状况和任何不良反应。
通过RT-qPCR分析从小鼠收获的脑组织的Fmr1 RNA表达，并且通过IHC和蛋白质印迹分析FMRP表达。通过RT-qPCR分析其他组织的Fmr1 RNA表达，并且通过蛋白质印迹分析FMRP表达。其他组织包括背侧神经节(DRG)、肝、肺、心脏、脊髓、肾、性腺和小腿肌肉。
对以上实验的结果进行分析，以确定哪些载体向脑和身体的所有部分提供转基因的优异表达和递送。鉴于FMR1基因在组织中普遍表达，预计通过一种或多种所测试的载体可实现的校正性转基因的广泛分布将有益于脆性X综合征的治疗。
实施例8.ICV施用表达FMRP的AAV载体后的FXS模型小鼠的功能分析：癫痫发作易感性
本研究的目标是进一步评估三种不同的病毒载体在通过ICV施用而施用的表达FMRP的AAV载体治疗后的脆性X综合征模型小鼠中降低癫痫发作易感性的有效性。表达FMRP的AAV载体包括CAGWPRE、CAGdelWPRE和hPGK载体。
Fmr1敲除(KO)小鼠在1-3日龄(P1-3)时通过ICV施用，以6e9 vg/心室的剂量施用表达FMRP的AAV载体。对照Fmr1 KO小鼠在相同年龄施用媒介物。在20-23日龄(P20-23)，对小鼠进行听源性癫痫发作(AGS)测试。将P20-P23小鼠每两个一组放置在具有常规垫料但没有食物漏斗的笼子中。连接至A/C电力电缆的个人警报器(120dB)附接至笼盖内部。声音精确播放2分钟，然后是1分钟的静默和另外2分钟的声音。在整个测试的持续过程中观察小鼠。在两次声音暴露期间对行为和癫痫发作进行评分。行为按0-4分制评分，如下所述：
0＝无变化
1＝疯狂奔跑
2＝阵挛发作
3＝强直发作
4＝死亡
将存活下来的小鼠放在最多4个笼子里，按性别分开。在八周龄时，将在AGS测试中存活的小鼠用CO2或戊巴比妥实施安乐死。通过眶后出血将血液收集到含有EDTA的管中。然后用无菌PBS经心脏灌注小鼠。从小鼠中收获各种器官和组织，并进行生物分布分析。对脑组织进行RT-qPCR以确定Fmr1 RNA表达，并进行IHC以探测FMRP的表达。此外，对背根神经节(DRG)、肝、肺、心脏、肾、性腺和小腿肌肉组织进行处理，并进行RT-qPCR以测定Fmr1 RNA表达水平。
分析以上实验的结果，以确定哪些载体在Fmr1 KO小鼠中提供转基因的优异递送和表达以及高癫痫易感性的优异拯救。鉴于FMR1基因在组织中普遍表达，预计通过一种或多种所测试的载体可实现的校正性转基因的广泛分布将有益于脆性X综合征的治疗。
实施例9.ICV、IV和组合(IV+ICV)施用表达FMRP的AAV载体后的FXS模型小鼠的功能分析
本研究的目标是进一步评估用表达FMRP的AAV载体治疗后脆性X综合征模型小鼠的功能性神经生理学缺陷的拯救情况。表达FMRP的AAV载体包括CAGWPRE、CAGdelWPRE和hPGK载体。该研究分两个阶段进行(2个队列)。队列分布参见表3。
组1至组6中的小鼠在5周龄时接受测试AAV载体候选物的注射。测试并比较了不同的施用途径(IV、ICV和组合的IV+ICV)。在9周龄时，测试所有治疗组的小鼠的自发活动(locomotor activity)和听源性癫痫发作易感性(AGS)。
对于每个队列，存在7个由40只小鼠组成的测试组(参见表1)，
连续两天对其进行测试(AGS测试时间为12:00-4:45)。此外，
每个测试组的笼子更换时间表是标准化的且错开的。具体来说，每个测试组在测试前一天更换笼子。
在测试日，
在自发活动(LMA)测试中的开阔场地腔室中进行评估之前15分钟向组1至7中的小鼠施用盐水(IP)。30分钟LMA测试后，立即对小鼠进行AGS测试。然后，将小鼠转移至干净的笼子中，并单独运送到AGS测试室。
(i)自发活动(LMA)测试
在将小鼠放入LMA腔室前15分钟，向其给予盐水(IP，10mL/kg)。使用自动活动监测系统(MedAssociates)在30分钟的开阔场地分析(OFA)中对小鼠进行评估。在LMA测试开始前30分钟使小鼠适应房间。捕获以下参数：
·水平移动距离、总走动时间和走动计数
·竖直活动(时间和计数)
(ii)听源性癫痫发作(AGS)测试
在LMA程序后，使小鼠适应AGS测试室1分钟。
然后将小鼠放在吸音腔室中，其中具有发出高强度音调的扬声器
。将小鼠(一次1只)放在透明的圆柱形树脂玻璃腔室中，
该腔室放置在吸音腔室内部。警报器安装在树脂玻璃
腔室的顶部。小鼠的行为由
对基因型状态和药物治疗不知情的实验人员实时评分(参见以下评分)，以及对其进行录影以用于
进一步分析。
癫痫发作的诱发如下进行：
LMA测试后，将小鼠放入具有附接的警报器的测试腔室中。在
适应1分钟后，启动警报器，并在2分钟警报激发期间记录动物行为。根据动物的行为对它们进行评分。评分如下：
0＝无反应
1＝疯狂奔跑
2＝阵挛发作(侧卧，抽搐)
3＝强直发作(侧卧，静止)
4＝呼吸停止/死亡。
在t＝3分钟时。关闭警报器，使动物恢复1分钟。恢复后，重新启动警报器，并如上所述在另外2分钟内(从t＝4分钟到t＝6分钟)对小鼠进行记录和评分。记录后，立即将小鼠移出腔室。
根据上述量表，数据表示为癫痫发作事件的程度。癫痫发作严重程度评分–计算并分析每组每只小鼠的最高癫痫发作评分的平均值。此外，计算定义为在2分钟的时间段内癫痫发作评分为2或更高的癫痫发作小鼠的百分比(癫痫发作发生率)。
在AGS测定后，立即用异氟烷麻醉动物，并将血液收集到涂有K2EDTA的管中。
通过
冷冻离心机中旋转沉淀血液(13,000rpm，4℃下3分钟)来制备血浆样品。在
血液收集后，如果适用，立即取出脑并解剖不同区域(例如，额皮质、纹状体、海马、小脑、脑干)。将血浆转移到单独的1.5mL Eppendorf管中，冷冻，并进行生物分析。可将脑快速冷冻或在固定剂中浸入固定。还可支付额外费用在取出脑之前用盐水和固定剂灌注动物。任选地，可收集另外的器官(例如，心脏、肝、性腺等)并快速冷冻以用于分析。
对以上实验的结果进行分析，以确定哪种施用途径能更好地将转基因递送至脑和身体的所有部分，以及更好地拯救Fmr1 Ko小鼠的行为缺陷和高癫痫发作易感性。鉴于FMR1基因在组织中普遍表达，预计通过一种或多种施用可实现的校正性转基因的广泛分布将有益于该疾病的治疗。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。因此，除非另外明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列一般的等效或类似特征的实例。
从以上描述，本领域的技术人员可容易地探知本发明的必需特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适于各种用法和条件。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。
等效方案
虽然本文已经描述和说明了若干发明性实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文描述的一个或多个优点的多种其他装置和/或结构，并且每个这样的变型和/或修改被认为是在本文描述的发明性实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将易于认识到，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都旨在为示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。本领域技术人员将认识到或将能够确定仅使用至多常规实验，就能实现本文所描述的具体的发明性实施方案的许多等效方案。因此，应理解，前述实施方案仅通过实例的方式给出，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，发明性实施方案可以不同于具体描述和要求保护的方式实践。本公开的发明性实施方案针对本文描述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。
如本文所定义和使用的所有定义应理解为优于字典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或所定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均相对于引用每一个所针对的主题通过引用并入，在一些情况下，可涵盖整个文件。
如本文在说明书和权利要求中所使用的不定冠词“一个”和“一种”，除非有相反的明确说明，应理解为意指“至少一个/种”。
如本文在说明书和权利要求中所使用的短语“和/或”应理解为是指这样结合的元素中的“一者或两者”，即，在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即“一个或多个/一种或多种”这样结合的元素。除了通过“和/或”子句具体标识的元素之外，可任选地存在其他元素，无论与那些具体标识的元素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施方案中可以仅指A(任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的元素)；在另一个实施方案中，指A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，“或”应理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为是包含性的，即包括多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括其中的多于一个，以及(任选地)另外的未列出项目。只有明确指出相反的术语，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或在权利要求中使用时，“由...组成”将指包括多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，在前面有排他性术语，诸如“任一”、“其中的一个”、“其中的仅一个”或“其中的恰好一个”时，如本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性替代方案(即“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由…组成”，当在权利要求中使用时，应具有如专利法领域中使用的其普通含义。
术语“约”或“大约”表示在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于该值如何测量或确定，即，测量系统的极限。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。可替代地，“约”可以指给定值的至多±20％，优选地至多±10％，更优选地至多±5％，并且更优选地至多±1％的范围。可替代地，尤其是就生物系统或工艺而言，该术语可以表示在值的一个数量级之内，优选地2倍之内。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”暗示或在此上下文中是指在特定值的可接受误差范围之内。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，短语“至少一个”在提及一个或多个元素的列表时，应理解为是指选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每一个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的元素列表中具体标识的元素之外的元素可任选地存在，无论是与那些具体标识的元素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指，在一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个A，不存在B(并且任选地包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个B，不存在A(并且任选地包括除A之外的元素)；在另一个实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个A，以及至少一个，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他元素)；等等。
还应该理解的是，除非有相反的明确说明，否则在本文要求保护的任何包括多于一个步骤或动作的方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定局限于所列举的所述方法的步骤或动作的顺序。
序列表
<110> 儿童医院医疗中心(Children's Hospital Medical Center)
<120> 用于治疗脆性X综合征的方法和组合物
<130> 112149-0232-70043WO00
<140> 尚未指定
<141> 随附
<150> US 63/053,461
<151> 2020-07-17
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 632
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 1
Met Glu Glu Leu Val Val Glu Val Arg Gly Ser Asn Gly Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Phe Val Lys Asp Val His Glu Asp Ser Ile Thr Val Ala Phe
20 25 30
Glu Asn Asn Trp Gln Pro Asp Arg Gln Ile Pro Phe His Asp Val Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Pro Val Gly Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Glu
50 55 60
Val Glu Val Tyr Ser Arg Ala Asn Glu Lys Glu Pro Cys Cys Trp Trp
65 70 75 80
Leu Ala Lys Val Arg Met Ile Lys Gly Glu Phe Tyr Val Ile Glu Tyr
85 90 95
Ala Ala Cys Asp Ala Thr Tyr Asn Glu Ile Val Thr Ile Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Ser Val Asn Pro Asn Lys Pro Ala Thr Lys Asp Thr Phe His Lys
115 120 125
Ile Lys Leu Asp Val Pro Glu Asp Leu Arg Gln Met Cys Ala Lys Glu
130 135 140
Ala Ala His Lys Asp Phe Lys Lys Ala Val Gly Ala Phe Ser Val Thr
145 150 155 160
Tyr Asp Pro Glu Asn Tyr Gln Leu Val Ile Leu Ser Ile Asn Glu Val
165 170 175
Thr Ser Lys Arg Ala His Met Leu Ile Asp Met His Phe Arg Ser Leu
180 185 190
Arg Thr Lys Leu Ser Leu Ile Met Arg Asn Glu Glu Ala Ser Lys Gln
195 200 205
Leu Glu Ser Ser Arg Gln Leu Ala Ser Arg Phe His Glu Gln Phe Ile
210 215 220
Val Arg Glu Asp Leu Met Gly Leu Ala Ile Gly Thr His Gly Ala Asn
225 230 235 240
Ile Gln Gln Ala Arg Lys Val Pro Gly Val Thr Ala Ile Asp Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Thr Cys Thr Phe His Ile Tyr Gly Glu Asp Gln Asp Ala Val
260 265 270
Lys Lys Ala Arg Ser Phe Leu Glu Phe Ala Glu Asp Val Ile Gln Val
275 280 285
Pro Arg Asn Leu Val Gly Lys Val Ile Gly Lys Asn Gly Lys Leu Ile
290 295 300
Gln Glu Ile Val Asp Lys Ser Gly Val Val Arg Val Arg Ile Glu Ala
305 310 315 320
Glu Asn Glu Lys Asn Val Pro Gln Glu Glu Glu Ile Met Pro Pro Asn
325 330 335
Ser Leu Pro Ser Asn Asn Ser Arg Val Gly Pro Asn Ala Pro Glu Glu
340 345 350
Lys Lys His Leu Asp Ile Lys Glu Asn Ser Thr His Phe Ser Gln Pro
355 360 365
Asn Ser Thr Lys Val Gln Arg Val Leu Val Ala Ser Ser Val Val Ala
370 375 380
Gly Glu Ser Gln Lys Pro Glu Leu Lys Ala Trp Gln Gly Met Val Pro
385 390 395 400
Phe Val Phe Val Gly Thr Lys Asp Ser Ile Ala Asn Ala Thr Val Leu
405 410 415
Leu Asp Tyr His Leu Asn Tyr Leu Lys Glu Val Asp Gln Leu Arg Leu
420 425 430
Glu Arg Leu Gln Ile Asp Glu Gln Leu Arg Gln Ile Gly Ala Ser Ser
435 440 445
Arg Pro Pro Pro Asn Arg Thr Asp Lys Glu Lys Ser Tyr Val Thr Asp
450 455 460
Asp Gly Gln Gly Met Gly Arg Gly Ser Arg Pro Tyr Arg Asn Arg Gly
465 470 475 480
His Gly Arg Arg Gly Pro Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Asn Ser Glu Ala
485 490 495
Ser Asn Ala Ser Glu Thr Glu Ser Asp His Arg Asp Glu Leu Ser Asp
500 505 510
Trp Ser Leu Ala Pro Thr Glu Glu Glu Arg Glu Ser Phe Leu Arg Arg
515 520 525
Gly Asp Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gln Gly Gly Arg
530 535 540
Gly Arg Gly Gly Gly Phe Lys Gly Asn Asp Asp His Ser Arg Thr Asp
545 550 555 560
Asn Arg Pro Arg Asn Pro Arg Glu Ala Lys Gly Arg Thr Thr Asp Gly
565 570 575
Ser Leu Gln Ile Arg Val Asp Cys Asn Asn Glu Arg Ser Val His Thr
580 585 590
Lys Thr Leu Gln Asn Thr Ser Ser Glu Gly Ser Arg Leu Arg Thr Gly
595 600 605
Lys Asp Arg Asn Gln Lys Lys Glu Lys Pro Asp Ser Val Asp Gly Gln
610 615 620
Gln Pro Leu Val Asn Gly Val Pro
625 630
<210> 2
<211> 899
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 2
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240
taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360
gggggggggg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc 420
tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg 480
cgcggcgggc gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct 540
cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg 600
gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt 660
ggctgcgtga aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg 720
ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc 780
tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc 840
ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaatt 899
<210> 3
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 3
ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60
tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120
cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180
tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240
ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300
gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360
cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420
gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480
cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511
<210> 4
<211> 9239
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tacatctaga tgtcgacacc ggtggccggc ccagccctga ctgctatgga cttttagtgc 480
ttgtgcactg ctaccagcca tgccctgagt gcacagggtt accctggctg gggcctggaa 540
gcatataaaa gaagctcaga gtcacatcca ggtacacctt tcacctgggc cagcttcatt 600
cagaaggcca ggaggggggg attttgccat gtctgaagtt ccagttatag gcacacagtt 660
gcatcttact aggtctggtc tagggatcac cagtgacttc cagcctctaa ttccacactg 720
ttcagcaggc acctgttgtg gcaggctggt cttagttagc tagggcaggg tttcttcact 780
gggagtcctg gcattcagaa tgattaaggg ctccctctgc ctacctatcc ccagtcaacc 840
agccccaggt gtgtagctct agtctgagac tcatatatcc agggtcacct cctgggatca 900
agtgcatgag cccaagctgg gatctttccc cagttacata tttctggaca gtagggctca 960
gagtctccag tgccagtcct gtttcagagt atggaaaaag taaccattgt tacagccaca 1020
gtccttgggt tagccctaac tcagctaatc cagcaggccc aaggacacct gaatatccaa 1080
ggtatgagtg tgaggccctg taaggtaatt ctagcccctt atgcctaact tgattatcaa 1140
gaccaagcta tatcagggat gaaccagagg ctccatgaca ccccagccac ctagctaaac 1200
ttgggggttg ggtacaagtt agcccagaac ataccttata gaattgcctc tctagggtga 1260
gcaagggcca acctgcctat ttgccctctc acccccattg caatagcttt ggctcccagt 1320
acctcttccc tggcttcatt agcagatggc acccagcaga taaaggtcta tacccctgac 1380
aagggaaaca tggaaagtat caggaccaac atggtccaca gcagaagtgt ctggagtcca 1440
tcctgcatgg ccttgagtcc aggcacagga gtctccagtg agggtaaacc ccaatcattg 1500
tccatccagg ttttgccata agacttgggc cagggtagct aaagcagatt tacccctgca 1560
aggagacacc tcattggaaa ctgaaagaga ctccccacca gcttgaaagg ccagtcatgc 1620
ttttgcctga ctcctgctct ctatgcagtg gcaatctaag tgggaggtct gttcttccca 1680
agagaggacc aagtttctgt cccaaggcaa taatcctgtt atcattggct cctagctgcc 1740
attgttctga ttgagggttt aaactccgga atttaaatcc tgcaggcagc tgcgcgctcg 1800
ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 1860
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctt 1920
gcaggcctcc taggcttgca tgcagtacta ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 1980
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 2040
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 2100
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 2160
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc 2220
ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 2280
ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggg ggcggggcga ggcggagagg 2340
tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg 2400
gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct 2460
tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc 2520
gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt 2580
ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga 2640
gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg 2700
ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg 2760
ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg 2820
tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atccccgggt accggtgcca ccatggagga 2880
gctggtggtg gaagtgcggg gctccaatgg cgctttctac aaggcatttg taaaggatgt 2940
tcatgaagat tcaataacag ttgcatttga aaacaactgg cagcctgata ggcagattcc 3000
atttcatgat gtcagattcc cacctcctgt aggttataat aaagatataa atgaaagtga 3060
tgaagttgag gtgtattcca gagcaaatga aaaagagcct tgctgttggt ggttagctaa 3120
agtgaggatg ataaagggtg agttttatgt gatagaatat gcagcatgtg atgcaactta 3180
caatgaaatt gtcacaattg aacgtctaag atctgttaat cccaacaaac ctgccacaaa 3240
agatactttc cataagatca agctggatgt gccagaagac ttacggcaaa tgtgtgccaa 3300
agaggcggca cataaggatt ttaaaaaggc agttggtgcc ttttctgtaa cttatgatcc 3360
agaaaattat cagcttgtca ttttgtccat caatgaagtc acctcaaagc gagcacatat 3420
gctgattgac atgcactttc ggagtctgcg cactaagttg tctctgataa tgagaaatga 3480
agaagctagt aagcagctgg agagttcaag gcagcttgcc tcgagatttc atgaacagtt 3540
tatcgtaaga gaagatctga tgggtctagc tattggtact catggtgcta atattcagca 3600
agctagaaaa gtacctgggg tcactgctat tgatctagat gaagatacct gcacatttca 3660
tatttatgga gaggatcagg atgcagtgaa aaaagctaga agctttctcg aatttgctga 3720
agatgtaata caagttccaa ggaacttagt aggcaaagta ataggaaaaa atggaaagct 3780
gattcaggag attgtggaca agtcaggagt tgtgagggtg aggattgagg ctgaaaatga 3840
gaaaaatgtt ccacaagaag aggaaattat gccaccaaat tcccttcctt ccaataattc 3900
aagggttgga cctaatgccc cagaagaaaa aaaacattta gatataaagg aaaacagcac 3960
ccatttttct caacctaaca gtacaaaagt ccagagggtg ttagtggctt catcagttgt 4020
agcaggggaa tcccagaaac ctgaactcaa ggcttggcag ggtatggtac catttgtttt 4080
tgtgggaaca aaggacagca tcgctaatgc cactgttctt ttggattatc acctgaacta 4140
tttaaaggaa gtagaccagt tgcgtttgga gagattacaa attgatgagc agttgcgaca 4200
gattggagct agttctagac caccaccaaa tcgtacagat aaggaaaaaa gctatgtgac 4260
tgatgatggt caaggaatgg gtcgaggtag tagaccttac agaaataggg ggcacggcag 4320
acgcggtcct ggatatactt caggaactaa ttctgaagca tcaaatgctt ctgaaacaga 4380
atctgaccac agagacgaac tcagtgattg gtcattagct ccaacagagg aagagaggga 4440
gagcttcctg cgcagaggag acggacggcg gcgtggaggg ggaggaagag gacaaggagg 4500
aagaggacgt ggaggaggct tcaaaggaaa cgacgatcac tcccgaacag ataatcgtcc 4560
acgtaatcca agagaggcta aaggaagaac aacagatgga tcccttcaga tcagagttga 4620
ctgcaataat gaaaggagtg tccacactaa aacattacag aatacctcca gtgaaggtag 4680
tcggctgcgc acgggtaaag atcgtaacca gaagaaagag aagccagaca gcgtggatgg 4740
tcagcaacca ctcgtgaatg gagtaccctg ataagaattc gatatcaagc ttatcgataa 4800
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 4860
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 4920
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 4980
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 5040
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 5100
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 5160
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 5220
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 5280
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 5340
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg 5400
acccgggcgg ccgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 5460
aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 5520
tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt tagatctgtg tgttggtttt ttcttaaggt 5580
gtgattaatg agctaccagg tctcgaggag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 5640
tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 5700
tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggt tataacctgc 5760
aggttaatta agccttgtag tctagccagg gtgtataacc cctccagccc atgttcaaag 5820
agctgtcttg cctagccagt tgcacataca aagtgataaa tgggagctgg cattgtgccc 5880
ttggaggcac tctgaaggat caccagtgaa cccagcagca aagatacata ggctcttaat 5940
tcatgccagg atctcagaga ggcaatggct tgcacaatca ggggttattc tgacagcatg 6000
aactctggtg ccagacaatt ttatgtatca ggcaatgtgc attacttgag gtggattaca 6060
gacccagtga gtaacccagg accaggagta aacaggccct aatcccagct tgattgacac 6120
caggcttgaa gatccttacc attatgaaaa cagcacatgg tctgttgaca attacttgta 6180
gcataggtag cccaggcaga gtggcagaca gggtactgat agtagttaga gaacctccca 6240
gataagctac ctgaccttct ctaatcttga gttctgtggg caaccagccc agtgagcatc 6300
ttgggttctt ggaaatccag accctactca cctgagtata aatggggcag ccacccaccc 6360
agactgatcc atcctacctt tgaggctacc catgaggtaa ttaggccaga atgtgaaagg 6420
gaggagccca gagcattgtt ccttgtatta ccattgggaa ccttgttaga tggggaggaa 6480
tgcacttcag ccaccctaga ggagttgagt cattagaaga agaaggctgc ttccccatca 6540
ggagaagatc cagccagtaa gtatataggt tacaactgcc aggtactatg ggcttctcca 6600
gacccttcct acccaggaac tagaaggttg gagcctaaag tcccctaccc atgtgctgac 6660
tgatccagag ttacactccc tcagactcat cctccagaca gggttcccag ttattaggat 6720
tgcaataacc atccagttcc caaactattc cagcttccta tccagtaata agcccttatt 6780
ctttaacctc tgaagaaacc ctgagtgaac aggctgtgca gggctcctgt cacttctgtc 6840
agcccagata ggtatgaaat ctcttcaaat gtattgccaa tgacattgcc aggcacagat 6900
tctcccagtt acccaaccag gaacaccagc tagtgtcaaa cagtcaatgc ccttctacca 6960
gccatttgag acactaccag gcaggcaaag ccaagtggct tcactcctta tttatattag 7020
ctcagaggag ccatctaaca gctcttactc aactagacta gctgcatgaa cagtgtacag 7080
ctagctgcgc aatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggtg 7140
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 7200
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 7260
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 7320
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 7380
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 7440
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 7500
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 7560
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 7620
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 7680
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 7740
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 7800
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 7860
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 7920
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7980
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 8040
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 8100
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 8160
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 8220
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaagccca 8280
atctgaataa tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa 8340
atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt 8400
ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg 8460
gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat 8520
aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag 8580
tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc 8640
actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg 8700
atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc 8760
cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt 8820
ttttccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt 8880
gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac 8940
atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc 9000
atacaagcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc 9060
atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gacgtttccc gttgaatatg 9120
gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg ttcatgatga 9180
tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacgggcc agagctgca 9239
<210> 5
<211> 8650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成
<400> 5
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tacatctaga tgtcgacacc ggtggccggc ccagccctga ctgctatgga cttttagtgc 480
ttgtgcactg ctaccagcca tgccctgagt gcacagggtt accctggctg gggcctggaa 540
gcatataaaa gaagctcaga gtcacatcca ggtacacctt tcacctgggc cagcttcatt 600
cagaaggcca ggaggggggg attttgccat gtctgaagtt ccagttatag gcacacagtt 660
gcatcttact aggtctggtc tagggatcac cagtgacttc cagcctctaa ttccacactg 720
ttcagcaggc acctgttgtg gcaggctggt cttagttagc tagggcaggg tttcttcact 780
gggagtcctg gcattcagaa tgattaaggg ctccctctgc ctacctatcc ccagtcaacc 840
agccccaggt gtgtagctct agtctgagac tcatatatcc agggtcacct cctgggatca 900
agtgcatgag cccaagctgg gatctttccc cagttacata tttctggaca gtagggctca 960
gagtctccag tgccagtcct gtttcagagt atggaaaaag taaccattgt tacagccaca 1020
gtccttgggt tagccctaac tcagctaatc cagcaggccc aaggacacct gaatatccaa 1080
ggtatgagtg tgaggccctg taaggtaatt ctagcccctt atgcctaact tgattatcaa 1140
gaccaagcta tatcagggat gaaccagagg ctccatgaca ccccagccac ctagctaaac 1200
ttgggggttg ggtacaagtt agcccagaac ataccttata gaattgcctc tctagggtga 1260
gcaagggcca acctgcctat ttgccctctc acccccattg caatagcttt ggctcccagt 1320
acctcttccc tggcttcatt agcagatggc acccagcaga taaaggtcta tacccctgac 1380
aagggaaaca tggaaagtat caggaccaac atggtccaca gcagaagtgt ctggagtcca 1440
tcctgcatgg ccttgagtcc aggcacagga gtctccagtg agggtaaacc ccaatcattg 1500
tccatccagg ttttgccata agacttgggc cagggtagct aaagcagatt tacccctgca 1560
aggagacacc tcattggaaa ctgaaagaga ctccccacca gcttgaaagg ccagtcatgc 1620
ttttgcctga ctcctgctct ctatgcagtg gcaatctaag tgggaggtct gttcttccca 1680
agagaggacc aagtttctgt cccaaggcaa taatcctgtt atcattggct cctagctgcc 1740
attgttctga ttgagggttt aaactccgga atttaaatcc tgcaggcagc tgcgcgctcg 1800
ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 1860
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctt 1920
gcaggcctcc taggcttgca tgcagtacta ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 1980
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 2040
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 2100
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 2160
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc 2220
ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 2280
ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggg ggcggggcga ggcggagagg 2340
tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg 2400
gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgcgctgcct 2460
tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc 2520
gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt 2580
ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga 2640
gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg 2700
ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg 2760
ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg 2820
tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atccccgggt accggtgcca ccatggagga 2880
gctggtggtg gaagtgcggg gctccaatgg cgctttctac aaggcatttg taaaggatgt 2940
tcatgaagat tcaataacag ttgcatttga aaacaactgg cagcctgata ggcagattcc 3000
atttcatgat gtcagattcc cacctcctgt aggttataat aaagatataa atgaaagtga 3060
tgaagttgag gtgtattcca gagcaaatga aaaagagcct tgctgttggt ggttagctaa 3120
agtgaggatg ataaagggtg agttttatgt gatagaatat gcagcatgtg atgcaactta 3180
caatgaaatt gtcacaattg aacgtctaag atctgttaat cccaacaaac ctgccacaaa 3240
agatactttc cataagatca agctggatgt gccagaagac ttacggcaaa tgtgtgccaa 3300
agaggcggca cataaggatt ttaaaaaggc agttggtgcc ttttctgtaa cttatgatcc 3360
agaaaattat cagcttgtca ttttgtccat caatgaagtc acctcaaagc gagcacatat 3420
gctgattgac atgcactttc ggagtctgcg cactaagttg tctctgataa tgagaaatga 3480
agaagctagt aagcagctgg agagttcaag gcagcttgcc tcgagatttc atgaacagtt 3540
tatcgtaaga gaagatctga tgggtctagc tattggtact catggtgcta atattcagca 3600
agctagaaaa gtacctgggg tcactgctat tgatctagat gaagatacct gcacatttca 3660
tatttatgga gaggatcagg atgcagtgaa aaaagctaga agctttctcg aatttgctga 3720
agatgtaata caagttccaa ggaacttagt aggcaaagta ataggaaaaa atggaaagct 3780
gattcaggag attgtggaca agtcaggagt tgtgagggtg aggattgagg ctgaaaatga 3840
gaaaaatgtt ccacaagaag aggaaattat gccaccaaat tcccttcctt ccaataattc 3900
aagggttgga cctaatgccc cagaagaaaa aaaacattta gatataaagg aaaacagcac 3960
ccatttttct caacctaaca gtacaaaagt ccagagggtg ttagtggctt catcagttgt 4020
agcaggggaa tcccagaaac ctgaactcaa ggcttggcag ggtatggtac catttgtttt 4080
tgtgggaaca aaggacagca tcgctaatgc cactgttctt ttggattatc acctgaacta 4140
tttaaaggaa gtagaccagt tgcgtttgga gagattacaa attgatgagc agttgcgaca 4200
gattggagct agttctagac caccaccaaa tcgtacagat aaggaaaaaa gctatgtgac 4260
tgatgatggt caaggaatgg gtcgaggtag tagaccttac agaaataggg ggcacggcag 4320
acgcggtcct ggatatactt caggaactaa ttctgaagca tcaaatgctt ctgaaacaga 4380
atctgaccac agagacgaac tcagtgattg gtcattagct ccaacagagg aagagaggga 4440
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ctgcaataat gaaaggagtg tccacactaa aacattacag aatacctcca gtgaaggtag 4680
tcggctgcgc acgggtaaag atcgtaacca gaagaaagag aagccagaca gcgtggatgg 4740
tcagcaacca ctcgtgaatg gagtaccctg ataagaattc gatatcaagc ttatcgatat 4800
cgataccgtc gacccgggcg gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt 4860
ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 4920
attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttagatctgt gtgttggttt 4980
tttcttaagg tgtgattaat gagctaccag gtctcgagga ggaaccccta gtgatggagt 5040
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 5100
gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 5160
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catgttcaaa gagctgtctt gcctagccag ttgcacatac aaagtgataa atgggagctg 5280
gcattgtgcc cttggaggca ctctgaagga tcaccagtga acccagcagc aaagatacat 5340
aggctcttaa ttcatgccag gatctcagag aggcaatggc ttgcacaatc aggggttatt 5400
ctgacagcat gaactctggt gccagacaat tttatgtatc aggcaatgtg cattacttga 5460
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cagtgagcat cttgggttct tggaaatcca gaccctactc acctgagtat aaatggggca 5760
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caggcacaga ttctcccagt tacccaacca ggaacaccag ctagtgtcaa acagtcaatg 6360
cccttctacc agccatttga gacactacca ggcaggcaaa gccaagtggc ttcactcctt 6420
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ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 6660
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cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 6840
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gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 7140
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tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 7980
aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 8040
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<400> 6
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
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tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
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ttcagcaggc acctgttgtg gcaggctggt cttagttagc tagggcaggg tttcttcact 780
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gagtctccag tgccagtcct gtttcagagt atggaaaaag taaccattgt tacagccaca 1020
gtccttgggt tagccctaac tcagctaatc cagcaggccc aaggacacct gaatatccaa 1080
ggtatgagtg tgaggccctg taaggtaatt ctagcccctt atgcctaact tgattatcaa 1140
gaccaagcta tatcagggat gaaccagagg ctccatgaca ccccagccac ctagctaaac 1200
ttgggggttg ggtacaagtt agcccagaac ataccttata gaattgcctc tctagggtga 1260
gcaagggcca acctgcctat ttgccctctc acccccattg caatagcttt ggctcccagt 1320
acctcttccc tggcttcatt agcagatggc acccagcaga taaaggtcta tacccctgac 1380
aagggaaaca tggaaagtat caggaccaac atggtccaca gcagaagtgt ctggagtcca 1440
tcctgcatgg ccttgagtcc aggcacagga gtctccagtg agggtaaacc ccaatcattg 1500
tccatccagg ttttgccata agacttgggc cagggtagct aaagcagatt tacccctgca 1560
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agagaggacc aagtttctgt cccaaggcaa taatcctgtt atcattggct cctagctgcc 1740
attgttctga ttgagggttt aaactccgga atttaaatcc tgcaggcagc tgcgcgctcg 1800
ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 1860
ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctt 1920
gcaggcctcc taggcttgca tgcagtactg gggttggggt tgcgcctttt ccaaggcagc 1980
cctgggtttg cgcagggacg cggctgctct gggcgtggtt ccgggaaacg cagcggcgcc 2040
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acccttgtgg gccccccggc gacgcttcct gctccgcccc taagtcggga aggttccttg 2160
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gacggacagc gccagggagc aatggcagcg cgccgaccgc gatgggctgt ggccaatagc 2280
ggctgctcag cagggcgcgc cgagagcagc ggccgggaag gggcggtgcg ggaggcgggg 2340
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ccggagcgca cgtcggcagt cggctccctc gttgaccgaa tcaccgacct ctctccccag 2460
gtgagtctat gggacccttg atgttttctt tccccttctt ttctatggtt aagttcatgt 2520
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ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc aatagcaata tttctgcata 2760
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tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg ataaggctgg attattctga 2880
gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc ccacaggaat 2940
tcaggtacct gagctctgag gatccttatc agccaccatg gaggagctgg tggtggaagt 3000
gcggggctcc aatggcgctt tctacaaggc atttgtaaag gatgttcatg aagattcaat 3060
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gggtgagttt tatgtgatag aatatgcagc atgtgatgca acttacaatg aaattgtcac 3300
aattgaacgt ctaagatctg ttaatcccaa caaacctgcc acaaaagata ctttccataa 3360
gatcaagctg gatgtgccag aagacttacg gcaaatgtgt gccaaagagg cggcacataa 3420
ggattttaaa aaggcagttg gtgccttttc tgtaacttat gatccagaaa attatcagct 3480
tgtcattttg tccatcaatg aagtcacctc aaagcgagca catatgctga ttgacatgca 3540
ctttcggagt ctgcgcacta agttgtctct gataatgaga aatgaagaag ctagtaagca 3600
gctggagagt tcaaggcagc ttgcctcgag atttcatgaa cagtttatcg taagagaaga 3660
tctgatgggt ctagctattg gtactcatgg tgctaatatt cagcaagcta gaaaagtacc 3720
tggggtcact gctattgatc tagatgaaga tacctgcaca tttcatattt atggagagga 3780
tcaggatgca gtgaaaaaag ctagaagctt tctcgaattt gctgaagatg taatacaagt 3840
tccaaggaac ttagtaggca aagtaatagg aaaaaatgga aagctgattc aggagattgt 3900
ggacaagtca ggagttgtga gggtgaggat tgaggctgaa aatgagaaaa atgttccaca 3960
agaagaggaa attatgccac caaattccct tccttccaat aattcaaggg ttggacctaa 4020
tgccccagaa gaaaaaaaac atttagatat aaaggaaaac agcacccatt tttctcaacc 4080
taacagtaca aaagtccaga gggtgttagt ggcttcatca gttgtagcag gggaatccca 4140
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cagcatcgct aatgccactg ttcttttgga ttatcacctg aactatttaa aggaagtaga 4260
ccagttgcgt ttggagagat tacaaattga tgagcagttg cgacagattg gagctagttc 4320
tagaccacca ccaaatcgta cagataagga aaaaagctat gtgactgatg atggtcaagg 4380
aatgggtcga ggtagtagac cttacagaaa tagggggcac ggcagacgcg gtcctggata 4440
tacttcagga actaattctg aagcatcaaa tgcttctgaa acagaatctg accacagaga 4500
cgaactcagt gattggtcat tagctccaac agaggaagag agggagagct tcctgcgcag 4560
aggagacgga cggcggcgtg gagggggagg aagaggacaa ggaggaagag gacgtggagg 4620
aggcttcaaa ggaaacgacg atcactcccg aacagataat cgtccacgta atccaagaga 4680
ggctaaagga agaacaacag atggatccct tcagatcaga gttgactgca ataatgaaag 4740
gagtgtccac actaaaacat tacagaatac ctccagtgaa ggtagtcggc tgcgcacggg 4800
taaagatcgt aaccagaaga aagagaagcc agacagcgtg gatggtcagc aaccactcgt 4860
gaatggagta ccctaatgac acattgtgtg atatctctag gatgctcgct ttcttgctgt 4920
ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac tactaaactg ggggatatta 4980
tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac atttattttc attgcaatga 5040
tgtatttaaa ttatttctga atattttact aaaaagggaa tgtgggaggt cagtgcattt 5100
aaaacataaa gaaatgaaga gctagttcaa accttgggaa aatacactat atcttaaact 5160
ccatgaaaga aggtgaggct gcaaacagct aatgcacatt ggcaacagcc cctgatgcct 5220
atgccttatt catccctcag aaaaggattc aagtagaggc ttgatttgga ggttaaagtt 5280
ttgctatgct gtattttaag atctgtgtta agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 5340
actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 5400
gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt atgcatggac atgtttgatc atggttgtaa 5460
gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga 5520
gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc 5580
tctccacaga gatctgtgtg ttggtttttt cttaaggtgt gattaatgag ctaccaggtc 5640
tcgaggagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 5700
ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 5760
gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggtta taacctgcag gttaattaag ccttgtagtc 5820
tagccagggt gtataacccc tccagcccat gttcaaagag ctgtcttgcc tagccagttg 5880
cacatacaaa gtgataaatg ggagctggca ttgtgccctt ggaggcactc tgaaggatca 5940
ccagtgaacc cagcagcaaa gatacatagg ctcttaattc atgccaggat ctcagagagg 6000
caatggcttg cacaatcagg ggttattctg acagcatgaa ctctggtgcc agacaatttt 6060
atgtatcagg caatgtgcat tacttgaggt ggattacaga cccagtgagt aacccaggac 6120
caggagtaaa caggccctaa tcccagcttg attgacacca ggcttgaaga tccttaccat 6180
tatgaaaaca gcacatggtc tgttgacaat tacttgtagc ataggtagcc caggcagagt 6240
ggcagacagg gtactgatag tagttagaga acctcccaga taagctacct gaccttctct 6300
aatcttgagt tctgtgggca accagcccag tgagcatctt gggttcttgg aaatccagac 6360
cctactcacc tgagtataaa tggggcagcc acccacccag actgatccat cctacctttg 6420
aggctaccca tgaggtaatt aggccagaat gtgaaaggga ggagcccaga gcattgttcc 6480
ttgtattacc attgggaacc ttgttagatg gggaggaatg cacttcagcc accctagagg 6540
agttgagtca ttagaagaag aaggctgctt ccccatcagg agaagatcca gccagtaagt 6600
atataggtta caactgccag gtactatggg cttctccaga cccttcctac ccaggaacta 6660
gaaggttgga gcctaaagtc ccctacccat gtgctgactg atccagagtt acactccctc 6720
agactcatcc tccagacagg gttcccagtt attaggattg caataaccat ccagttccca 6780
aactattcca gcttcctatc cagtaataag cccttattct ttaacctctg aagaaaccct 6840
gagtgaacag gctgtgcagg gctcctgtca cttctgtcag cccagatagg tatgaaatct 6900
cttcaaatgt attgccaatg acattgccag gcacagattc tcccagttac ccaaccagga 6960
acaccagcta gtgtcaaaca gtcaatgccc ttctaccagc catttgagac actaccaggc 7020
aggcaaagcc aagtggcttc actccttatt tatattagct cagaggagcc atctaacagc 7080
tcttactcaa ctagactagc tgcatgaaca gtgtacagct agctgcgcaa tcggatcccg 7140
ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggtgta atcatggtca tagctgtttc 7200
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 7260
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ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7380
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 7440
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7500
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 7560
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 7620
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 7680
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 7740
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 7800
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 7860
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 7920
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 7980
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 8040
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 8100
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 8160
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 8220
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 8280
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caagcccaat ctgaataatg ttacaaccaa 8340
ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 8400
tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 8460
ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 8520
acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 8580
ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact 8640
tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta 8700
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caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca 8820
cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt ttccggggat cgcagtggtg 8880
agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat 8940
tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg 9000
ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaagcgata gattgtcgca 9060
cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg 9120
gaatttaatc gcggcctcga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc ccttgtatta 9180
ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc ttgtgcaatg 9240
taacatcaga gattttgaga cacgggccag agctgca 9277

Claims (47)

1.腺相关病毒(AAV)9病毒颗粒的用途，用于制备治疗脆性X综合征(FXS)的组合物，其中所述AAV9病毒颗粒包含单链AAV DNA载体，所述单链AAV DNA载体包含编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(人FMRP)的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列与启动子可操作地连接，并且其中所述AAV DNA载体在被所述AAV9病毒颗粒感染后的所述患有FXS的人类患者的脑中表达所述野生型人FMR1。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体是自互补AAV载体。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体是标准AAV载体。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述启动子是人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体还包含调控人FMRP的表达的一种或多种调控元件。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述一种或多种调控元件包括人β-珠蛋白内含子序列、一种或多种polyA信号传导序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或它们的组合。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述一种或多种polyA信号传导序列包括人β-珠蛋白polyA信号传导序列、SV40 polyA信号传导序列或它们的组合。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体不包含WPRE。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体、WPRE和处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体，以及处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列，并且其中所述AAVDNA载体不包含WPRE。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体是标准AAV载体，其包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子、处于编码所述人FMRP的核苷酸序列上游的人β-珠蛋白内含子序列，以及处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列和人β-珠蛋白polyA信号传导序列，并且其中所述AAV DNA载体不包含WPRE。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV DNA载体还包含对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制所述野生型FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述一个或多个MTS包括miR-122的MTS、miR-208a的MTS、miR-208b-3p的MTS、miR-499a-3p的MTS或它们的组合。
15.如权利要求1所述的用途，其中所述野生型人FMRP是人FMRP同种型1。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述人FMRP是包含N末端1-297个氨基酸残基的野生型人FMRP的片段。
17.如权利要求1所述的用途，其中所述AAV9病毒颗粒通过静脉内注射、脑室内注射、小脑延髓池内注射、实质内注射或它们的组合施用于所述人类患者。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述AAV9病毒颗粒通过至少两种施用途径施用于所述人类患者。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述至少两种施用途径选自由以下组成的组：
(a)脑室内注射和静脉内注射；
(b)鞘内注射和静脉内注射；
(c)小脑延髓池内注射和静脉内注射；以及
(d)实质内注射和静脉内注射。
20.如权利要求17所述的用途，其中在所述施用之前，对所述人类患者进行脑电图(EEG)、行为和/或认知神经康复评估或它们的组合，以确定所述疾病的表型严重程度。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述用途还包括，在所述施用步骤之前，对所述人类患者进行脑电图(EEG)、行为和/或认知神经康复评估或它们的组合。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述用途还包括基于所述EEG分析、所述行为和/或认知评估或它们的组合来确定所述AAV9病毒颗粒的剂量和/或递送途径。
23.如权利要求17所述的用途，其中所述人类患者已经进行或正在进行包括GABA受体激动剂、PI3K同种型选择性抑制剂、MMP9拮抗剂或它们的组合的治疗。
24.如权利要求23所述的用途，还包括向所述人类患者施用有效量的GABA受体激动剂、PI3K同种型选择性抑制剂、MMP9拮抗剂或它们的组合。
25.如权利要求20所述的用途，还包括在施用所述AAV9病毒颗粒后对所述人类患者进行EEG以监测治疗功效。
26.如权利要求20所述的用途，还包括对所述人类患者进行行为和/或认知神经康复。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述神经康复在所述AAV9病毒颗粒的施用后进行。
28.如权利要求17所述的用途，其中所述人类患者是人类儿童。
29.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含：
(i)AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和3’ITR；
(ii)编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白的核苷酸序列；
(iii)与(ii)可操作地连接的启动子；以及
(iv)对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制所述野生型FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。
30.如权利要求29所述的AAV载体，其为自互补AAV载体。
31.如权利要求29或权利要求30所述的AAV载体，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体。
32.如权利要求29所述的AAV载体，其中所述一个或多个MTS包括miR-122的MTS、miR-208a的MTS、miR-208b-3p的MTS、miR-499a-3p的MTS或它们的组合。
33.如权利要求29所述的AAV载体，其中所述野生型人FMRP是人FMRP同种型1。
34.一种自互补的腺相关病毒(AAV)载体，其包含:
(v)AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和截短的3’ITR，其中的任一者或两者被截短；
(vi)编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白(人FMRP)的核苷酸序列，其中所述野生型FMRP是FMRP同种型1；以及
(vii)与(ii)可操作地连接的启动子。
35.如权利要求34所述的自互补AAV载体，其还包含对一种或多种组织选择性微RNA具有特异性以抑制所述野生型FMRP在非脑组织中的表达的一个或多个微RNA靶位点(MTS)。
36.如权利要求34或权利要求35所述的自互补AAV载体，其中所述启动子是鸡b-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体。
37.如权利要求35所述的自互补AAV载体，其中所述一个或多个MTS包括miR-122的MTS、miR-208a的MTS、miR-208b-3p的MTS、miR-499a-3p的MTS或它们的组合。
38.一种标准腺相关病毒(AAV)载体，其包含：
(i)AAV骨架，其包含5’反向末端重复序列(ITR)和3’ITR；
(ii)编码野生型人脆性X精神发育迟滞1(FMR1)蛋白的核苷酸序列；
(iii)与(ii)可操作地连接的启动子；以及
(iv)调控所述FMRP的表达的一种或多种调控元件。
39.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体或人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
40.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述一种或多种调控元件包括人β-珠蛋白内含子序列、一种或多种polyA信号传导序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)或它们的组合。
41.如权利要求40所述的AAV载体，其中所述一种或多种polyA信号传导序列包括人β-珠蛋白polyA信号传导序列、SV40 polyA信号传导序列或它们的组合。
42.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV DNA载体不包含WPRE。
43.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体、WPRE和处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列。
44.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的鸡β-肌动蛋白启动子和CMV启动子的杂合体，以及处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列，并且其中所述AAV DNA载体不包含WPRE。
45.如权利要求38所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含与编码所述人FMRP的核苷酸序列可操作地连接的人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子、处于编码所述人FMRP的核苷酸序列上游的人β-珠蛋白内含子序列，以及处于编码所述人FMRP的核苷酸序列下游的SV40 polyA信号传导序列和人β-珠蛋白polyA信号传导序列，并且其中所述AAV DNA载体不包含WPRE。
46.一种腺相关病毒(AAV)9病毒颗粒，其包含包封单链AAV DNA载体的AAV9衣壳，其中所述AAV DNA载体如权利要求29、或权利要求34、或权利要求38所述。
47.一种药物组合物，其包含AAV9病毒颗粒和药学上可接受的载剂。
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