KR20180117171A - 비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 dna - Google Patents

비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 dna Download PDF

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Abstract

본 개시내용의 측면은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산에 관한 것이며, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재된다. 핵산을 세포에 전달하는 방법이 또한 제공된다.

Description

비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA
관련 출원
본 출원은 발명의 명칭 "비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA"로 2016년 3월 3일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/303,047, 발명의 명칭 "비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA"로 2016년 9월 14일에 출원된 62/394,720, 및 발명의 명칭 "비-바이러스 유전자 전달을 위한 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA"로 2016년 10월 11일에 출원된 62/406,913을 35 U.S.C. 119(e) 하에 우선권 주장한다. 각각의 언급된 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
현행 유전자 전달 벡터는 여러 결점을 갖는다. 바이러스 및 박테리아-유래 유전자 전달 벡터 둘 다는 환자의 선천성 및 적응성 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA (pDNA) 및 미니-서클 DNA (mcDNA) 벡터는 전형적으로 진핵 DNA에는 존재하지 않는 DNA 메틸화라는 원핵 패턴을 갖는다. 추가적으로, 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 다른 박테리아-유래 분자는 척추동물 세포에서 침습성 미생물 병원체에 반응하여 세포 유전자의 활성화를 유도하는 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP)으로서 선천성 면역 반응 패턴 인식 수용체 (PRR)에 의해 인식된다. 플라스미드 DNA는 입체형태적으로 박테리아에 고유하고; 가장 근접한 포유동물 구조는 소기관에서 구획화되어 있으며 시토졸 PRR에 노출되지 않는 미토콘드리아 게놈 또는 듀플렉스 원형 DNA이다. 또 다른 예에서, 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)는 프로세싱된 캡시드 항원에 대한 T-세포 반응을 유도할 수 있거나 또는 순환 이뮤노글로불린 및 비-Ig 당단백질에 의해 중화될 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 제한된 트랜스진 운반 능력을 가지며, 제조하기에 노동 집약적이고, 고비용이고, 시간 소모적이다. 따라서, 유전자 전달을 위한 개선된 조성물 및 방법이 필요하다.
본 개시내용은, 일부 측면에서, 특정 유형의 비대칭 말단 (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열)이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산의 복제가 비대칭 말단 (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열)의 공유 연결을 유발하고 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 신규 입체형태의 생성을 유도한다는 발견에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 다른 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 바이러스 기반 벡터)와 연관된 규모 확대 문제를 피하면서 용이하게 제조될 수 있다 (예를 들어, 다량으로). 이러한 결과는 유사한 핵산의 증식의 목적을 위해 내부 팔린드롬 영역에서 대칭이 요구된다는 보고를 고려하면 놀라운 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 다른 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산)와 비교하여 개선된 유전자 안정성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 다른 벡터 (예를 들어, 대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산)와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산의 투여는 구축물의 비대칭 성질로 인해 다른 벡터 (예를 들어, 대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산)와 비교하여 삽입 돌연변이유발을 일으킬 가능성이 더 적을 수 있다.
특정 실시양태에서, 전사체 (예를 들어, 단백질 또는 기능적 핵산을 코딩하는 전사체)를 발현하도록 조작된 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 다른 벡터 (예를 들어, 대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산)와 비교하여 개선된 발현을 가질 수 있으며, 이는 구축물의 비대칭 성질로 인해 이러한 벡터의 전사 능력을 감소시킬 수 있는 특정 효소 (예를 들어, 헬리카제, 예컨대 RecQ 헬리카제)와 세포에서 상호작용할 가능성이 더 적어지기 때문이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산의 투여는 다른 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 플라스미드 DNA 벡터 및 바이러스 벡터)의 투여와 비교하여 대상체에서 면역 반응을 유도할 가능성이 더 적다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산은 핵산에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현 및/또는 활성을 방지 또는 억제하는 실질적 면역 반응을 유도하지 않으면서 (예를 들어, 장기간 유전자 요법과 관련하여) 대상체에게 다수회 투여될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 1개의 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 파르보바이러스, 데펜도바이러스 등을 포함한 1종 이상의 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 AAV2 혈청형으로부터 유래된 제1 개재 자기-상보적 서열 및 AAV9 혈청형으로부터 유래된 제2 개재 자기-상보적 서열을 포함한다. 또 다른 비제한적 예에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산은 AAV2 혈청형으로부터의 제1 개재 자기-상보적 서열 및 파르보바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스 B19)로부터의 제2 개재 자기-상보적 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 동일한 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래되지만 상이한 길이를 갖거나, 또는 상기의 조합이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 말단절단 크로스-아암 서열이 개재된 제2 개재 자기-상보적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 145개 염기 쌍의 길이인 AAV2 혈청형으로부터 유래된 제1 자기-개재 자기-상보적 서열 및 145개 염기 쌍보다 더 짧은 길이인 AAV2 혈청형으로부터 유래된 제2 개재 자기-상보적 서열 (예를 들어, 말단절단 크로스-아암 서열)을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열(들)은 40 내지 1000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열(들)은 100 내지 160개 뉴클레오티드 범위의 길이이다.
일부 실시양태에서, 크로스-아암 서열은 -12 kcal/mol 내지 -30 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 크로스-아암 서열은 -20 kcal/mol 내지 -25 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 3 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는다.
일부 실시양태에서, 각각의 루프 부분은 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 루프 부분은 3개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시양태에서, 하나의 루프 부분은 3개의 데옥시티미딘을 갖고 다른 루프 부분은 3개의 데옥시아데노신을 갖는다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소는 Rep 결합 요소 (RBE)이다. 일부 실시양태에서, RBE는 서열 5'-GCTCGCTCGCTC-3' (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 작동적 말단 분해 부위는 서열 5'-TT-3'를 포함한다. 일부 실시양태에서, 작동적 말단 분해 부위의 3' 말단은 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소의 5' 말단으로부터 15 내지 25개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 2개의 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프를 형성한다. 일부 실시양태에서, 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프 중 하나는 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 8개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 3개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 3개 이하의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 0 kcal/mol 내지 -22 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 단백질 또는 기능적 RNA를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 유전자 편집을 위한 기재로서의 프로모터 부재 구축물이다. 일부 실시양태에서, 프로모터 부재 구축물은 TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, Cas9 및 편집 단백질을 위한 기재를 제공한다. 일부 실시양태에서, 프로모터 부재 구축물은 세포 게놈 내로의 상동 재조합을 촉진하기 위해 세포 DNA에 대한 상동성을 갖는 핵산이 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 구축물은 세포 게놈 내로의 상동 재조합을 촉진하기 위해 세포 DNA에 대한 상동성을 갖는 핵산이 플랭킹된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 500 내지 50,000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 500 내지 10,000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 1000 내지 10,000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 500 내지 5,000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 복수의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 핵산은 말단-대-말단으로 연결된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 단일 서브유닛을 포함하는 단량체 핵산; 및 2개 이상의 서브유닛을 포함하는 적어도 1개의 다량체 핵산을 포함하는 조성물이며, 여기서 단량체 핵산 및 적어도 1개의 다량체 핵산의 각각의 서브유닛은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 각각의 다량체는 적어도 1개, 및 일부 경우에 단지 1개의 자기-상보적 말단 팔린드롬을 갖는다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 다량체 핵산은 2개의 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체 핵산은 2개 이하의 서브유닛을 갖는다. 일부 실시양태에서, 2개의 서브유닛은 테일-대-테일 구성으로 또는 헤드-대-헤드 구성으로 또는 헤드-대-테일 구성으로 연결된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 핵산의 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 선택적으로 결합하는 롤링 서클 복제 단백질을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 대상체에게 전달하는 것을 포함하며, 여기서 핵산의 전달은 대상체에서 핵산에 대한 후천성 면역 반응의 도출을 유발하지 않는 것인, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 반응이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 세포성 반응이다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산은 대상체에게 다수회 전달된다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 (예를 들어, 투여되는) 횟수는 2 내지 10회의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 횟수는 매시간, 매일, 매주, 격주, 매월, 분기마다, 반면마다 또는 매년이다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 횟수는 임상 (예를 들어, 치료) 이익을 유지하는데 요구되는 바와 같은 횟수이다.
일부 측면에서 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 숙주 세포를 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 혈액 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 전구세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포, HSC), 골수성 또는 림프성 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 다수회 전달된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포가 다수회 전달되는 빈도는 숙주 세포의 반감기에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 치료 이익을 달성하기 위해 (예를 들어, 달성하고 유지하기 위해) 다수회 전달된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 (i) 적어도 1개의 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 단계; 및 (ii) 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산의 다중 카피의 생산을 개시하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 핵산의 다중 카피를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제는 핵산을 실리카 겔 수지와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 야생형 AAV Rep 78, AAV Rep 52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질의 세트는 AAV Rep 78 및 AAV Rep 68로부터 적어도 하나, 및 AAV Rep 52 및 AAV Rep 40으로부터 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 말단절단 단백질 또는 융합 단백질을 포함한 야생형 AAV Rep 단백질의 기능적 등가 유도체이다.
일부 실시양태에서, 허용 세포는 포유동물 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 허용 세포는 곤충 또는 다른 무척추동물-종 세포주, 효모 세포주 또는 박테리아 세포주이다. 일부 실시양태에서, 허용 세포는, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 유충의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 폐색 재조합 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다중 핵다각체병 바이러스 (AcMNPV)는, 예를 들어 유충에서의 단백질 생산에 대한 현행 우수 제조 관리기준 (cGMP) 과정을 통해 재조합 단백질을 생산하기 위해 에스. 프루기페르다 유충을 감염시키는데 사용되었다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 헬퍼 바이러스 벡터에 의해 코딩되고, 임의로 여기서 헬퍼 바이러스 벡터는 아우토그라파 칼리포르니카 다중 핵다각체병 바이러스 (AcMNPV) 벡터 또는 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않는 것인 단계; 및 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산을 복제하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되는 것으로 결정되었고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것으로 결정되었고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않는 것인 단계; 및 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산을 복제하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 복제된 핵산을 허용 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 허용 세포로부터 단리된 핵산 복제 산물을 포함하는 핵산 제제를 수득하는 단계이며, 여기서 허용 세포는 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않고, 여기서 롤링 서클 복제 단백질은 핵산의 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 결합하고 핵산을 복제하여 핵산 복제 산물을 생산하는 것인 단계; 및 1개 이상의 복제 산물의 생리화학적 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 핵산을 분석하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 1개 또는 각각의 자기-상보적 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 1개 이상의 복제 산물의 다량체화의 정도이다. 일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 핵산 제제 중 복제 산물의 단량체 및/또는 다량체 형태의 화학량론이다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 제한 엔도뉴클레아제에 의한 소화에 대한 1개 이상의 복제 산물의 감수성이다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 복제 산물의 이량체 형태에서의 단량체의 극성이고, 여기서 극성은 헤드-대-헤드, 헤드-대-테일 또는 테일-대-테일이다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 1개 이상의 복제 산물의 분자량 또는 복제 산물의 단편의 분자량이다. 일부 실시양태에서, 분자량은 1개 또는 각각의 자기-상보적 서열을 포함하는 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량이다. 일부 실시양태에서, 분자량은 전기영동 이동성에 기초하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 분자량은 질량 분광분석법에 기초하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 분자량은 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량이고, 분자량을 결정하기 전에 단편은 폴리머라제에 의한 프라이머 연장을 포함하는 반응에 의해 증폭된다. 일부 실시양태에서, 프라이머 연장을 포함하는 반응은 폴리머라제 연쇄 반응이다.
도 1a는 안정성을 최대화하고 깁스 자유 에너지 (ΔG, 음의 값은 자발적 형성을 나타냄)를 감소시키는 것에 기초한 AAV2 ITR의 이론적 2차 구조를 보여준다. 도 1b는 비대칭 말단을 갖는 핵산 분자를 유발하는 AAV2 ITR의 스템-영역에서의 말단절단의 여러 비제한적 예를 보여준다.
도 2a-2b는 대칭 및 비대칭 개방형 및 폐쇄형-말단 듀플렉스 DNA (ceDNA) 분자의 표현을 보여준다. 도 2a는 대칭 말단을 갖는 핵산의 여러 비제한적 예 (좌측 상자) 및 비대칭 말단을 갖는 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 여러 비제한적 예 (우측 상자)를 보여준다. 도 2b는 비대칭 말단 영역이 바이러스 복제 동안 유도된 핵산 니킹 및 가닥 분리의 변경을 유도하여, 폐쇄형-말단 듀플렉스 DNA 분자의 형성 (우측)을 유발한다는 것을 보여준다.
도 3은 한 쌍의 비대칭 ITR의 그래프 도시를 보여준다. 전장 AAV2 ITR은 상부에 보여지고 C-스템에서의 말단절단을 갖는 AAV2 ITR은 하부에 도시된다. 전장 및 말단절단 ITR 둘 다는 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다.
도 4는 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 안구 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다.
도 5는 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 혈액 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다.
도 6은 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 간 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다.
도 7은 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 폐 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다.
도 8a-8d는 ceDNA의 안구로의 전달을 보여준다. 성체 마우스를 케타민/크실라진 (100/10 mg/kg)에 의해 마취하고, 형질감염제를 1-2 μl 부피의 경공막 주사에 의해 유리체내로 전달하였다. 마우스가 회복되는 동안에 항생제 연고를 각막에 도포하여 안구가 건조되는 것을 방지하였다. 마우스가 37도에서 회복되도록 한 다음, 2주 동안 마우스 방 안에 다시 넣고, CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 망막을 박리하고, 편평 탑재물 또는 절편이 되도록 처리하였다. 형질감염된 세포를 검출하는데 어떠한 GFP 항체 염색도 필요하지 않았다. 도 8a는 마우스 망막 상의 GFP 형광의 편평 탑재물을 보여준다. 도 8b는 망막의 단면에서의 GFP 형광을 보여준다. 도 8c는 망막의 단면에서의 GFP 형광 및 신경교 세포 염색을 보여준다. 도 8d는 망막하 전기천공 (상부) 및 유리체내 주사 (하부)에 의한 ceDNA (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 ceDNA)의 전달 후에 마우스 망막에서의 GFP 형광을 보여준다.
도 9a-9c는 생체내 jetPEI로 제제화된 ceDNA-GFP (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 가지며 GFP를 코딩하는 ceDNA)의 래트 선조체 내로의 두개내 주사를 보여준다. 도 9a는 주사후 3주 및 20주에 GFP 발현에 대한 염색을 보여주며; 유사한 GFP 발현이 3주 및 20주에 관찰되었다. 도 9b 및 9c는 Iba1 (도 9b) 및 MHCII (도 9c)에 대한 항체 (Ab)를 사용한 면역조직화학 (IHC)을 보여주며; 3주에, 뇌 절편에서 어떠한 MHCII 또는 Iba1 항원도 검출되지 않았다.
도 10a-10b는 플라스미드 DNA 개재 자기-상보적 서열의 서열 분석의 결과를 보여준다. 도 10c는 ceDNA-GFP의 아가로스 겔 전기영동 분리를 보여준다. 도면의 좌측은 비절단 ceDNA-GFP 및 XhoI에 의해 소화된 ceDNA-GFP의 천연 겔 전기영동을 보여준다. 단량체 (~2.1 kb) 및 이량체 (~4.1 kb) 이형태체 산물이 천연 겔에서 관찰되고; 0.4 말단 단편이 겔의 하부에서 불순물의 형광에 의해 가려진다. 도면의 우측은 비절단 ceDNA-GFP 및 XhoI에 의해 소화된 ceDNA-GFP의 변성 겔 전기영동을 보여준다. 이량체 (~4.1 kb) 이형태체 산물이 변성 겔에서 관찰되고; 0.8 kb의 단일 가닥 DNA로서 전개된 변성된 말단 0.4 kb 산물이 또한 관찰된다.
본 개시내용은 일부 측면에서 대상체 (예를 들어, 대상체의 세포 또는 대상체의 조직)에 트랜스진의 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은, 부분적으로, 특정 유형의 비대칭 말단 서열 (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열)이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산의 복제가 비대칭 말단 서열의 공유 연결을 유발하고 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 신규 입체형태의 생성을 유도한다는 발견에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 현재 사용되는 유전자 요법 벡터와 비교하여 대상체에서 개선된 발현, 복제 (예를 들어, 생산 수율)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 포함하는 핵산의 개선된 발현은, RecQ 헬리카제 (예를 들어, RecQ1)가 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산과 비교하여 대칭 개재 자기-상보적 서열을 포함하는 핵산과 상호작용하는 것을 선호함과 관련된다.
일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열 (예를 들어, 상이한 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래되거나, 또는 동일한 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래되지만 상이한 길이를 갖거나, 또는 상기의 조합)을 갖는 핵산은 현재 사용되는 유전자 요법 벡터와 비교하여 대상체에서 감소된 삽입 돌연변이유발 가능성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산의 투여는 플라스미드 DNA 벡터에 비해 대상체에서 감소된 면역 반응을 유도하거나 또는 검출가능한 면역 반응을 유도하지 않는다.
"핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질 및 핵산은 단리된다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 인공적으로 생산된 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 핵산과 관련하여, 용어 "단리된"은 하기인 핵산을 지칭한다: (i) 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 시험관내에서 증폭되거나; (ii) 분자 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나; (iii) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분획화 또는 칼럼 크로마토그래피에 의해서와 같이 정제되거나; 또는 (iv) 예를 들어 화학적 합성에 의해 합성된 것. 단리된 핵산은 관련 기술분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 조작가능한 것이다. 따라서, 5' 및 3' 제한 부위가 공지되어 있거나 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머 서열이 개시되어 있는 벡터에 함유된 뉴클레오티드 서열은 단리된 것으로 간주되지만, 그의 자연 숙주 중에 그의 천연 상태로 존재하는 핵산 서열은 단리된 것으로 간주되지 않는다. 단리된 핵산은 실질적으로 정제될 수 있으나 정제될 필요는 없다. 예를 들어, 클로닝 또는 발현 벡터 내에 단리된 핵산은 그것이 존재하는 세포에서 물질의 단지 아주 적은 백분율을 구성할 수 있다는 점에서 순수하지 않다. 그러나, 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 핵산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 용이하게 조작가능하기 때문에 단리된 것이다. 단백질 또는 펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "단리된"은 그의 자연 환경으로부터 단리되거나 또는 (예를 들어, 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 등에 의해) 인공적으로 생산된 단백질 또는 펩티드를 지칭한다.
통상의 기술자는 또한 캡시드 단백질의 기능적 등가 변이체 또는 상동체를 제공하기 위해 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 측면에서 본 개시내용은 보존적 아미노산 치환을 유발하는 서열 변경을 포함한다. 본원에 사용된 보존적 아미노산 치환은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라, 예컨대 이러한 방법을 컴파일링한 참고문헌, 예를 들어 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견되는 바와 같이, 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D. 따라서, 본원에 개시된 단백질 및 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
개재 자기-상보적 서열
본 개시내용은, 부분적으로, 비대칭 말단 서열 (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열)을 갖는 핵산이 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA 구조 (예를 들어, ceDNA)를 형성하며, 이는 일부 실시양태에서, 현재 이용가능한 유전자 전달 벡터와 비교하여 감소된 면역원성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, ceDNA는 천연 조건 하에서는 선형 듀플렉스 DNA로서 거동하고, 변성 조건 하에서는 단일-가닥 원형 DNA로 변환된다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은, 일부 실시양태에서, 대상체에게 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진)을 전달하는데 유용하다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 스템 부분 및 루프 부분을 갖고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 핵산을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "플랭킹된"은 이종 핵산 삽입물에 대해 상류 (예를 들어, 5')에 제1 개재 자기-상보적 서열이 위치하고 이종 핵산 삽입물에 대해 하류 (예를 들어, 3')에 제2 개재 자기-상보적 서열이 위치하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 게놈은 역전된 말단 반복부 (ITR)가 "플랭킹된" rep 및 cap 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개재 자기-상보적 서열은" 비-팔린드롬 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 스트레치가 개재되어 있는 팔린드롬 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 연속 스트레치 및 그의 상보적 가닥 둘 다가 동일한 5'에서 3' 방향으로 "읽히는" 경우에 그의 상보적 가닥과 동일한 폴리뉴클레오티드의 연속 스트레치) 말단 서열을 갖는 핵산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 1개 이상의 개재 팔린드롬 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 도 1a에 도시된 AAV2 ITR 구조 및 도 2a에 도시된 예시적인 구조에 나타난 바와 같이, 그 자체가 뒤로 폴딩되어 스템-루프 구조 (예를 들어, 헤어핀 루프, "T"-형상 루프 또는 "Y"-형상 루프)를 형성한다.
일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 스템 서열 및 크로스-아암 서열을 갖는 "T"-형상 구조를 형성한다. 일부 실시양태에서, "크로스-아암 서열"은 2개의 대향하는 (예를 들어, 스템 서열에 대해), 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 스템 부분 및 루프 부분을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 도 1a에 나타난 바와 같이, 스템 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 상보적 (예를 들어, 팔린드롬) 5'- 및 3'-말단의 혼성화 ("A-A'"로 지칭됨)에 의해 형성되고, 여기서 A-A' 팔린드롬에는 각각 "B-B'" 및 "C-C'"로 표시된 한 쌍의 루프-형성 개재 팔린드롬 서열에 의해 형성된 크로스-아암 폴리뉴클레오티드 서열이 개재된다. 일부 실시양태에서, 각각의 크로스 아암의 루프 부분 (예를 들어, 개재 팔린드롬 서열 B-B' 및 C-C'에 의해 형성된 루프)은 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드 (예를 들어, 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드)로부터 형성된다. 본 개시내용에 의해 기재된 개재 자기-상보적 서열은 2개 초과 (예를 들어, 3, 4개 또는 그 초과)의 크로스-아암 서열을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다.
개재 자기-상보적 서열은 서열이 헤어핀 루프를 형성하고 핵산 복제 (예를 들어, DNA 복제)를 위한 프라이머로서 기능을 한다는 전제 하에 임의의 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 개재 자기-상보적 서열은 약 20 내지 약 2000개 뉴클레오티드 범위의 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 약 40 내지 1000개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 적어도 40 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 또는 최대 1000개 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 1000개 초과의 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 약 100 내지 160개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 뉴클레오티드는 약 115 내지 약 150개 뉴클레오티드 범위의 길이이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 3 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 뉴클레오티드의 길이인 스템 부분을 갖는다.
일반적으로, 스템-루프 구조의 루프 부분은 적어도 2개의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 루프 부분은 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 크로스-아암 서열의 각각의 루프 부분은 3개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 크로스-아암 서열의 하나의 루프 부분은 3개의 데옥시티미딘을 갖고 다른 루프 부분은 3개의 데옥시아데노신을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 핵산 삽입물에 플랭킹된 개재 자기-상보적 서열에 관한 것이며, 여기서 개재 자기-상보적 서열은 서로에 대해 비대칭이다 (예를 들어, 상이한 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래되거나, 동일한 유기체 또는 바이러스 혈청형으로부터 유래되지만 상이한 길이를 갖거나, 또는 상기의 조합). 일부 실시양태에서, 한 쌍의 비대칭 자기-상보적 서열 중 하나는 말단절단 크로스-아암 서열을 포함한다. 본원에 사용된 "말단절단 크로스-아암 서열"은 이종 핵산 서열에 플랭킹된 상응하는 자기-상보적 서열에 비해 더 짧은 길이를 갖는 크로스-아암 서열을 지칭한다. 말단절단 크로스-아암 서열은 전장 크로스-아암 서열에 비해 1 내지 50개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개)의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 전장 크로스-아암 서열에 비해 1 내지 30개의 뉴클레오티드 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 전장 크로스-아암 서열에 비해 2 내지 20개의 뉴클레오티드 결실을 함유한다.
일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 2개의 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프를 형성한다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열의 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프 중 하나는 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열의 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 8개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 3개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분을 갖는다. 일부 실시양태에서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프는 3개 이하의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는다.
일반적으로, 말단절단 크로스-아암 서열은 A 또는 A' 영역에 (예를 들어, 비-말단절단 크로스-아암 서열에 비해) 어떠한 뉴클레오티드 결실도 함유하지 않으므로, DNA 복제 (예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합, 또는 말단 분해 부위에서의 니킹)를 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 B, B', C 및/또는 C' 영역에 1개 이상의 결실을 갖는다. 말단절단 크로스-아암 서열의 여러 비제한적 예가 하기에 제시된다:
AAV2 ITR Δ C-영역은 괄호로 나타내어지고; 대괄호 내의 모든 또는 부분 결실은 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 생성하는데 사용될 수 있고; 하기, "RBE'"는 "Rep-결합 요소"를 지칭한다.
C-영역 B-영역
Δ RBE'
Figure pct00001
(서열식별번호: 2)
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(서열식별번호: 2)
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(서열식별번호: 3)
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일반적으로, 헤어핀 형성에 요구되는 핵산의 열역학적 특성 (예를 들어, 깁스 자유 에너지 (ΔG), G+C 조성, A+T 조성, 용융 온도, 각각의 가닥의 염기 조성, 상보적 서열의 길이, 듀플렉스 영역 내 쌍형성되지 않은 염기, 및 루프를 구성하는 쌍형성되지 않은 염기)은, 예를 들어 문헌 [Bosco et al., Nucl. Acids Res. (2013) doi: 10.1093/nar/gkt1089; First published online: November 12, 2013]에 개시된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 크로스-아암 서열은 -12 kcal/mol 내지 -30 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 크로스-아암 서열은 -20 kcal/mol 내지 -25 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열의 열역학적 특성은, 이들을 비대칭으로 만드는 서열 차이를 가질 수 있을지라도, 전장 크로스-아암 서열과 같을 수 있다 (예를 들어, 동일할 수 있다). 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열의 열역학적 특성은 전장 크로스-아암 서열의 것과 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 말단절단 크로스-아암 서열은 0 kcal/mol 내지 -22 kcal/mol 초과의 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "작동적"은 그의 의도된 기능을 수행하는 핵산 서열의 능력을 지칭한다. 예를 들어, "작동적 결합 영역"은 그의 의도된 표적 (예를 들어, 단백질 또는 핵산)에 대한 결합 기능을 보유하는 핵산 서열이다. 또 다른 예에서, "작동적 절단 부위"는 특정한 효소 또는 효소들에 의해 특이적으로 절단되는 능력을 보유하는 핵산 서열이다.
본 개시내용의 측면은 작동적 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 포함하는 자기-상보적 핵산 서열이 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 형성에 요구된다는 발견에 관한 것이다. 본원에 사용된 "롤링 서클 복제 단백질 결합 요소"는 롤링 서클 (예를 들어, 롤링 헤어핀) 복제를 개시하는 바이러스 비구조 단백질 (NS 단백질)인 롤링 서클 복제 단백질에 의해 인식되고 결합되는 보존된 핵산 서열 (예를 들어, 모티프)을 지칭한다. 롤링 서클 (예를 들어, 롤링 헤어핀) 복제는 문헌 [Tattersall et al. Nature 2009, 263, pp. 106-109]에 기재되어 있다. NS 단백질의 예는 AAV Rep 단백질 (예를 들어, Rep78, Rep68, Rep52, Rep40), 파르보바이러스 비구조 단백질 (예를 들어, NS2), 로타바이러스 비구조 단백질 (예를 들어, NSP1), 및 덴소바이러스 비구조 단백질 (예를 들어, PfDNV NS1)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소는 Rep 결합 요소 (RBE)이다. 일부 실시양태에서, RBE는 서열 5'-GCTCGCTCGCTC-3'를 포함한다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 선형 단일-가닥 DNA 게놈을 갖는 바이러스의 파르보비리다에(Parvoviridae) 과의 디펜도파르보바이러스 속으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 마우스 미세 바이러스, 알류산 밍크병 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, HB 파르보바이러스, H-1 파르보바이러스, 킬함 래트 바이러스, 파르보바이러스 라핀, LUIII 바이러스, 밍크 장염 바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 라쿤 파르보바이러스, RT 파르보바이러스, 종양 바이러스 X, 래트 파르보바이러스 1a, 바르바리 오리 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 햄스터 파르보바이러스, 및 류마티스 관절염 바이러스 1을 포함한 자율 파르보비리나에(Parvovirinae) 속으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 속은 파르보바이러스이다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 브레비덴소바이러스, 덴소바이러스 및 이테라바이러스를 포함한 덴소비리나에(Densovirinae) 속으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 아과 파르보비리나에 속으로부터의 것이다. 파르보비리나에 속의 예는 암도파르보바이러스(Amdoparvovirus), 아베파르보바이러스(Aveparvovirus), 보카파르보바이러스(Bocaparvovirus), 코피파르보바이러스(Copiparvovirus), 디펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus), 에리트로파르보바이러스(Erythroparvovirus), 프로토파르보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파르보바이러스(Tetraparvovirus)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 아과 덴소비리나에 속으로부터의 것이다. 덴소비리나에 속의 예는 암도파르보바이러스, 아베파르보바이러스, 보카파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 디펜도파르보바이러스, 에리트로파르보바이러스, 프로토파르보바이러스 및 테트라파르보바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질(들)은 데펜도바이러스, 예컨대 아데노-연관 바이러스 2 (AAV2), 아데노-연관 바이러스 3 (AAV3), 아데노-연관 바이러스 4 (AAV4) 또는 아데노-연관 바이러스 5 (AAV5), 또는 그의 임의의 조합으로부터의 것이다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 단일-가닥 DNA 박테리오파지 과로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 과는 미크로비리다에(Microviridae) 및 이노비리다에(Inoviridae)이다.
일부 실시양태에서, 롤링 서클 복제 단백질은 그람 양성 박테리아로부터 유래된다.
본 개시내용의 측면은 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함하는 개재 자기-상보적 핵산 서열이 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 형성에 요구된다는 발견에 관한 것이다. 전형적으로, 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV ITR)을 포함하는 핵산의 복제는 크로스-아암 (예를 들어, 헤어핀 구조)의 3' 말단으로부터 개시되고, 말단 중 하나가 공유 폐쇄된 듀플렉스 분자를 생성하고; 이어서 듀플렉스 분자의 공유 폐쇄된 말단은 말단 분해로 불리는 과정에 의해 절단되어 2개의 개별 단일-가닥 핵산 분자를 형성한다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 말단 분해의 과정은 말단 분해 부위 (trs)에서의 부위- 및 가닥-특이적 엔도뉴클레아제 절단 (예를 들어, 롤링 서클 복제 단백질, 예컨대 AAV Rep 단백질)에 의해 매개된다. trs 서열의 예는 3'-CCGGTTG-5 및 5'-AGTTGG-3' (AAV2 p5 단백질에 의해 인식됨)를 포함한다. Rep-매개 가닥 니킹은 trs 서열의 중앙 디-티미딘 ("TT") 부분 사이에서 일어나는 것으로 가설화되었다. 따라서, 일부 실시양태에서, 작동적 말단 분해 부위는 서열 5'-TT-3'를 포함한다.
본 개시내용의 측면은 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 대한 말단 분해 부위 (trs)의 위치설정에 관한 것이다. 일반적으로, trs는 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 대해 상류 (예를 들어, 5')에 위치한다. 그러나, 일부 실시양태에서는, trs가 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 대해 하류 (예를 들어, 3')에 위치한다. 일부 실시양태에서, 작동적 말단 분해 부위의 3' 말단은 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소의 5' 말단으로부터 15 내지 25개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드)이다.
일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 AAV 역전된 말단 반복부 서열이다. AAV ITR 서열은, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, 비-인간 영장류 AAV 혈청형 (예를 들어, AAVrh.10) 및 그의 변이체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 AAV 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 AAV2 ITR 또는 그의 변이체 (예를 들어, AAV2 ITR, 또는 "B 아암" 또는 "C 아암"에 결실을 갖는 말단절단 AAV2 ITR)이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열은 AAV5 ITR 또는 그의 변이체 (예를 들어, AAV5 ITR, 또는 "B 아암" 또는 "C 아암"에 결실을 갖는 말단절단 AAV5 ITR)이다. 본원에 사용된 AAV ITR의 "변이체"는 야생형 AAV ITR 서열에 대해 약 70% 내지 약 99.9% 유사성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, AAV ITR 변이체는 야생형 AAV ITR에 대해 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일하다.
AAV ITR은 2종의 입체형태: "플립" 및 "플롭"으로 존재할 수 있으며, 이는 AAV 복제의 롤링 헤어핀 메카니즘의 결과이다. "플립" 및 "플롭" 입체형태 둘 다의 개재 자기-상보적 서열 (예를 들어, AAV2 ITR)의 비제한적 예가 하기에 제시된다:
진뱅크 (>gi|110645916|ref|NC_001401.2| 아데노-연관 바이러스 - 2, 완전한 게놈)
플롭 입체형태
(서열식별번호: 4)
Figure pct00009
(서열식별번호: 5)
Figure pct00010
플립 입체형태
(서열식별번호: 6)
Figure pct00011
(서열식별번호: 7)
Figure pct00012
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 플립 입체형태의 개재 자기-상보적 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 플롭 입체형태의 개재 자기-상보적 서열을 포함한다.
본 개시내용의 측면은 본 개시내용에 의해 기재된 핵산의 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 집단은 균질 (예를 들어, 동일한 핵산의 다중 카피를 포함함) 또는 불균질 (예를 들어, 다중의 상이한 핵산을 포함함)일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 단일 서브유닛을 포함하는 단량체 핵산 (예를 들어, 단량체 핵산의 단일 종의 집단)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서브유닛은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2개 이상의 서브유닛 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 서브유닛)을 포함하는 다량체 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체 핵산의 각각의 서브유닛은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재된다. 일부 실시양태에서, 다량체 핵산은 2개의 서브유닛을 포함한다 (예를 들어, 이량체이다). 일부 실시양태에서, 각각의 다량체는 적어도 1개, 및 일부 경우에 단지 1개의 자기-상보적 말단 팔린드롬을 갖는다.
일부 실시양태에서, 다량체 핵산의 서브유닛은 콘카테머를 형성한다. 본원에 사용된 "콘카테머"는 전형적으로 시리즈로 연결된 동일한 또는 실질적으로 동일한 핵산 서열 (예를 들어, 서브유닛)의 다중 카피를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 콘카테머는 헤드-대-헤드 극성, 또는 테일-대-테일 극성으로 배향될 수 있다. 서브유닛이 RNA 전사체를 발현하도록 구성된 이종 핵산 서열을 함유하는 실시양태에서, "헤드-대-헤드" 극성은 각각의 서브유닛의 프로모터 서열에 가장 근접한 개재 자기-상보적 서열이 공유 연결된 (예를 들어, 서브유닛이 5'-말단 대 5'-말단으로 연결된) 콘카테머를 지칭한다. 이러한 실시양태에서, "테일-대-테일" 극성은 각각의 서브유닛의 프로모터 서열에 대해 원위인 개재 자기-상보적 서열이 공유 연결된 (예를 들어, 서브유닛이 5'-말단 대 5'-말단으로 연결된) 콘카테머를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2개의 서브유닛은 테일-대-테일 구성 (예를 들어, 극성)으로 연결된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 단량체 및 다량체 핵산 둘 다를 포함한다 (예를 들어, 핵산의 불균질 집단을 포함한다).
이종 핵산 삽입물
핵산의 트랜스진 서열 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)의 조성은 생성된 핵산이 사용될 용도에 좌우될 것이다. 예를 들어, 트랜스진 서열의 하나의 유형은 발현시에 검출가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 치료 단백질 또는 치료 기능적 RNA를 코딩한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은, 예를 들어 트랜스진을 보유하는 체성 트랜스제닉 동물 모델을 생성하여, 예를 들어 트랜스진 산물의 기능을 연구하기 위한 연구 목적에 사용되도록 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩한다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 질환의 동물 모델을 생성하는데 사용되도록 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩한다. 적절한 트랜스진 코딩 서열은 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
본 개시내용은, 부분적으로, AAV 벡터와 달리, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)이 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진 서열)의 크기에 대하여 제한되지 않는다는 발견에 기초한다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)은 약 10 내지 약 5,000개 염기 쌍, 약 10 내지 약 10,000개 염기 쌍, 약 10 내지 약 50,000개 염기 쌍 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)은 약 10 내지 약 50개 염기 쌍 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)은 약 20 내지 약 100개 염기 쌍 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)은 약 500 내지 약 1500개 염기 쌍 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)은 약 1000 내지 약 5000개 염기 쌍 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 트랜스진 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물)의 크기는 전통적인 AAV 벡터의 용량을 초과한다 (예를 들어, 약 4.8 kb를 초과함).
트랜스진에 제공될 수 있는 리포터 서열은, 비제한적으로, β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시페라제를 코딩하는 DNA 서열, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함한다. 발현을 유도하는 조절 요소와 회합되는 경우에, 리포터 서열은 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (RIA) 및 면역조직화학을 포함한, 효소, 방사선, 비색, 형광 또는 다른 분광사진 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정 및 면역학적 검정을 포함하는 통상적인 수단에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우에, 신호를 운반하는 벡터의 존재는 β-갈락토시다제 활성에 대한 검정에 의해 검출된다. 트랜스진이 녹색 형광 단백질 또는 루시페라제인 경우에, 신호를 운바하는 벡터는 발광측정기에서 색 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다. 이러한 리포터는, 예를 들어 핵산의 조직-특이적 표적화 능력 및 조직 특이적 프로모터 조절 활성을 검증하는데 유용할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에서 1종 이상의 유전적 결핍 또는 기능장애, 예컨대, 예를 들어 포유동물에서 폴리펩티드 결핍 또는 폴리펩티드 과잉을 예방 또는 치료하는 방법, 및 특히 세포 및 조직 중 이러한 폴리펩티드 내의 결핍과 연관된 장애 중 1종 이상을 나타내는 인간에서 결핍의 중증도 또는 정도를 치료 또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한 핵산을 제공한다. 방법은 제약상 허용되는 담체 중 1종 이상의 치료 펩티드, 폴리펩티드, siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 뉴클레오티드 등을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산)을, 장애를 앓고 있는 대상체에서 결핍 또는 장애를 치료하기에 충분한 양으로 및 충분한 기간 동안 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 1종 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산)의 전달을 포함한다. 예시적인 치료 단백질은 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 항아폽토시스 인자, 시토카인, 항당뇨병제 인자, 항아폽토시스 작용제, 응고 인자, 항종양 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 치료 단백질의 다른 비제한적 예는 BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, 고나도트로핀, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, VEGF, TGF-B2, TNF, 프로락틴, 소마토트로핀, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(187A), 바이러스 IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 및 IL-18을 포함한다.
핵산 (예를 들어, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산)은 대상체에게 전달될 (예를 들어, 그 안에서 발현될) 유전자의 감소된 발현, 발현의 결여 또는 기능장애와 연관된 질환을 치료하기 위해 상기 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 유전자 및 연관 질환 상태는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 글리코겐 저장 결핍 유형 1A와 연관된 글루코스-6-포스파타제; Pepck 결핍과 연관된 포스포엔올피루베이트-카르복시키나제; 갈락토스혈증과 연관된 갈락토스-1 포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제; 페닐케톤뇨와 연관된 페닐알라닌 히드록실라제; 메이플 시럽뇨 질환과 연관된 분지쇄 알파-케토산 데히드로게나제; 티로신혈증 유형 1과 연관된 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제; 메틸말론산혈증과 연관된 메틸말로닐-CoA 뮤타제; 중쇄 아세틸 CoA 결핍과 연관된 중쇄 아실 CoA 데히드로게나제; 오미틴 트랜스카르브아밀라제 결핍과 연관된 오미틴 트랜스카르브아밀라제; 시트룰린혈증과 연관된 아르기니노숙신산 신테타제; 가족성 고콜레스테롤혈증과 연관된 저밀도 지단백질 수용체 단백질; 크리글러-나자르 질환과 연관된 UDP-글루코우로노실트랜스퍼라제; 중증 복합 면역결핍 질환과 연관된 아데노신 데아미나제; 통풍 및 레쉬-니한 증후군과 연관된 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제; 비오티니다제 결핍과 연관된 비오티니다제; 고셔병과 연관된 베타-글루코세레브로시다제; 슬라이 증후군과 연관된 베타-글루쿠로니다제; 젤베거 증후군과 연관된 퍼옥시솜 막 단백질 70 kDa; 급성 간헐성 포르피린증과 연관된 포르포빌리노겐 데아미나제; 알파-1 항트립신 결핍 (기종)의 치료를 위한 알파-1 항트립신; 지중해빈혈 또는 신부전으로 인한 빈혈의 치료를 위한 에리트로포이에틴; 허혈성 질환의 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자, 안지오포이에틴-1 및 섬유모세포 성장 인자; 예를 들어 아테롬성동맥경화증, 혈전증 또는 색전증에서 관찰되는 바와 같은 폐색된 혈관의 치료를 위한 트롬보모듈린 및 조직 인자 경로 억제제; 파킨슨병의 치료를 위한 방향족 아미노산 데카르복실라제 (AADC) 및 티로신 히드록실라제 (TH); 울혈성 심부전의 치료를 위한 포스포람반, 근형질(내형질) 세망 아데노신 트리포스파타제-2 (SERCA2) 및 심장 아데닐릴 시클라제에 대해 안티센스인 베타 아드레날린성 수용체, 또는 그의 돌연변이체 형태; 다양한 암의 치료를 위한 종양 억제 유전자, 예컨대 p53; 염증성 및 면역 장애 및 암의 치료를 위한 시토카인, 예컨대 다양한 인터류킨 중 하나; 근육 이영양증의 치료를 위한 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 및 유트로핀 또는 미니유트로핀; 및 당뇨병의 치료를 위한 인슐린.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중추 신경계 (CNS)와 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 CNS 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: 알츠하이머병과 연관된 DRD2, GRIA1, GRIA2, GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER; 파킨슨병과 연관된 UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106β; 헌팅톤병과 연관된 IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, ATXN2, ATXN3, 아트로핀 1, FTL, TITF-1; 프리드리히 운동실조와 연관된 FXN; 카나반병과 연관된 ASPA; 근육 이영양증과 연관된 DMD; 및 척수성 근육 위축과 연관된 SMN1, UBE1, DYNC1H1. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 심혈관계와 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 심혈관 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: VEGF, FGF, SDF-1, 코넥신 40, 코넥신 43, SCN4a, HIF1α, SERCa2a, ADCY1, 및 ADCY6. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 폐 계통과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 폐 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: CFTR, AAT, TNFα, TGFβ1, SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC, HPS1, HPS3, HPS4, ADTB3A, IL1A, IL1B, LTA, IL6, CXCR1, 및 CXCR2. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 폐 계통과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물의 비제한적 예는 도 10에 도시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 간과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 간 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: α1-AT, HFE, ATP7B, 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제 (FAH), 글루코스-6-포스파타제, NCAN, GCKR, LYPLAL1, PNPLA3, 레시틴 콜레스테롤 아세틸트랜스퍼라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 및 G6PC. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 간과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물의 비제한적 예는 도 9에 도시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 신장과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 신장 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: PKD1, PKD2, PKHD1, NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, LAMB2, TRPC6, WT1, LMX1B, SMARCAL1, COQ2, PDSS2, SCARB3, FN1, COL4A5, COL4A6, COL4A3, COL4A4, FOX1C, RET, UPK3A, BMP4, SIX2, CDC5L, USF2, ROBO2, SLIT2, EYA1, MYOG, SIX1, SIX5, FRAS1, FREM2, GATA3, KAL1, PAX2, TCF2, 및 SALL1. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 안구와 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 안구 질환과 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: ABCA4, VEGF, CEP290, CFH, C3, MT-ND2, ARMS2, TIMP3, CAMK4, FMN1, RHO, USH2A, RPGR, RP2, TMCO, SIX1, SIX6, LRP12, ZFPM2, TBK1, GALC, 미오실린, CYP1B1, CAV1, CAV2, 옵티네우린 및 CDKN2B. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 안구와 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물의 비제한적 예는 도 7에 도시된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혈액 (예를 들어, 적혈구)과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 혈액 질환 및 장애와 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 폰 빌레브란트 인자 (VWF). 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 또는 그의 단편 중 1종 이상을 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 유전자 중 1종 이상의 발현을 억제하는 1종 이상의 기능적 RNA를 발현하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 혈액과 연관된 상태, 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 이종 핵산 삽입물의 비제한적 예는 도 8에 도시된다.
본 개시내용의 핵산 (예를 들어, 이종 핵산 삽입물을 갖는 핵산)은 대상체에서 발현이 감소되거나, 침묵하거나, 또는 달리 기능장애성인 유전자 (예를 들어, 암을 갖는 대상체에서 침묵한 종양 억제자)의 발현을 회복시키는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 또한 대상체에서 비정상적으로 발현되는 유전자 (예를 들어, 암을 갖는 대상체에서 발현되는 종양유전자)의 발현을 녹다운시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암과 연관된 유전자 산물 (예를 들어, 종양 억제자)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물은 암을 갖는 대상체에게 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 투여함으로써 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암과 연관된 유전자 산물 (예를 들어, 종양 억제자)의 발현을 억제하는 소형 간섭 핵산 (예를 들어, shRNA, miRNA)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산은 암을 갖는 대상체에게 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 투여함으로써 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암과 연관된 유전자 산물 (또는 암과 연관된 유전자의 발현을 억제하는 기능적 RNA)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산은 연구 목적을 위해, 예를 들어 암을 연구하거나 또는 암을 치료하는 치료제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 하기는 암의 발생과 연관된 것으로 공지된 예시적인 유전자 (예를 들어, 종양유전자 및 종양 억제자)의 비제한적 목록이다: AARS, ABCB1, ABCC4, ABI2, ABL1, ABL2, ACK1, ACP2, ACY1, ADSL, AK1, AKR1C2, AKT1, ALB, ANPEP, ANXA5, ANXA7, AP2M1, APC, ARHGAP5, ARHGEF5, ARID4A, ASNS, ATF4, ATM, ATP5B, ATP5O, AXL, BARD1, BAX, BCL2, BHLHB2, BLMH, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CANX, CAP1, CAPN1, CAPNS1, CAV1, CBFB, CBLB, CCL2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCT5, CCYR61, CD24, CD44, CD59, CDC20, CDC25, CDC25A, CDC25B, CDC2L5, CDK10, CDK4, CDK5, CDK9, CDKL1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2D, CEBPG, CENPC1, CGRRF1, CHAF1A, CIB1, CKMT1, CLK1, CLK2, CLK3, CLNS1A, CLTC, COL1A1, COL6A3, COX6C, COX7A2, CRAT, CRHR1, CSF1R, CSK, CSNK1G2, CTNNA1, CTNNB1, CTPS, CTSC, CTSD, CUL1, CYR61, DCC, DCN, DDX10, DEK, DHCR7, DHRS2, DHX8, DLG3, DVL1, DVL3, E2F1, E2F3, E2F5, EGFR, EGR1, EIF5, EPHA2, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC3, ETV1, ETV3, ETV6, F2R, FASTK, FBN1, FBN2, FES, FGFR1, FGR, FKBP8, FN1, FOS, FOSL1, FOSL2, FOXG1A, FOXO1A, FRAP1, FRZB, FTL, FZD2, FZD5, FZD9, G22P1, GAS6, GCN5L2, GDF15, GNA13, GNAS, GNB2, GNB2L1, GPR39, GRB2, GSK3A, GSPT1, GTF2I, HDAC1, HDGF, HMMR, HPRT1, HRB, HSPA4, HSPA5, HSPA8, HSPB1, HSPH1, HYAL1, HYOU1, ICAM1, ID1, ID2, IDUA, IER3, IFITM1, IGF1R, IGF2R, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IL1B, ILK, ING1, IRF3, ITGA3, ITGA6, ITGB4, JAK1, JARID1A, JUN, JUNB, JUND, K-ALPHA-1, KIT, KITLG, KLK10, KPNA2, KRAS2, KRT18, KRT2A, KRT9, LAMB1, LAMP2, LCK, LCN2, LEP, LITAF, LRPAP1, LTF, LYN, LZTR1, MADH1, MAP2K2, MAP3K8, MAPK12, MAPK13, MAPKAPK3, MAPRE1, MARS, MAS1, MCC, MCM2, MCM4, MDM2, MDM4, MET, MGST1, MICB, MLLT3, MME, MMP1, MMP14, MMP17, MMP2, MNDA, MSH2, MSH6, MT3, MYB, MYBL1, MYBL2, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYL9, MYLK, NEO1, NF1, NF2, NFKB1, NFKB2, NFSF7, NID, NINJ1, NMBR, NME1, NME2, NME3, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, NPM1, NQO1, NR1D1, NR2F1, NR2F6, NRAS, NRG1, NSEP1, OSM, PA2G4, PABPC1, PCNA, PCTK1, PCTK2, PCTK3, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDPK1, PEA15, PFDN4, PFDN5, PGAM1, PHB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIM1, PKM2, PKMYT1, PLK2, PPARD, PPARG, PPIH, PPP1CA, PPP2R5A, PRDX2, PRDX4, PRKAR1A, PRKCBP1, PRNP, PRSS15, PSMA1, PTCH, PTEN, PTGS1, PTMA, PTN, PTPRN, RAB5A, RAC1, RAD50, RAF1, RALBP1, RAP1A, RARA, RARB, RASGRF1, RB1, RBBP4, RBL2, REA, REL, RELA, RELB, RET, RFC2, RGS19, RHOA, RHOB, RHOC, RHOD, RIPK1, RPN2, RPS6KB1, RRM1, SARS, SELENBP1, SEMA3C, SEMA4D, SEPP1, SERPINH1, SFN, SFPQ, SFRS7, SHB, SHH, SIAH2, SIVA, SIVA TP53, SKI, SKIL, SLC16A1, SLC1A4, SLC20A1, SMO, SMPD1, SNAI2, SND1, SNRPB2, SOCS1, SOCS3, SOD1, SORT1, SPINT2, SPRY2, SRC, SRPX, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STC1, TAF1, TBL3, TBRG4, TCF1, TCF7L2, TFAP2C, TFDP1, TFDP2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGFBR2, TGFBR3, THBS1, TIE, TIMP1, TIMP3, TJP1, TK1, TLE1, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6, TNFSF7, TNK1, TOB1, TP53, TP53BP2, TP53I3, TP73, TPBG, TPT1, TRADD, TRAM1, TRRAP, TSG101, TUFM, TXNRD1, TYRO3, UBC, UBE2L6, UCHL1, USP7, VDAC1, VEGF, VHL, VIL2, WEE1, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WT1, XRCC1, YES1, YWHAB, YWHAZ, ZAP70, 및 ZNF9.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CNS-관련 장애와 연관된 유전자 산물을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 하기는 CNS-관련 장애와 연관된 유전자의 비제한적 목록이다: 알츠하이머병과 연관된 DRD2, GRIA1, GRIA2, GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER; 파킨슨병과 연관된 UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106β; 헌팅톤병과 연관된 IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, ATXN2, ATXN3, 아트로핀 1, FTL, TITF-1; 프리드리히 운동실조와 연관된 FXN; 카나반병과 연관된 ASPA; 근육 이영양증과 연관된 DMD; 및 척수성 근육 위축과 연관된 SMN1, UBE1, DYNC1H1.
이종 핵산 삽입물은 트랜스진으로서, 아폽토시스를 조정하는 단백질 또는 기능적 RNA를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 하기는 아폽토시스와 연관된 유전자의 비제한적 목록이고, 이들 유전자의 산물을 코딩하는 핵산 및 그의 상동체, 및 이들 유전자의 발현을 억제하는 소형 간섭 핵산 (예를 들어, shRNA, miRNA)을 코딩하는 핵산 및 그의 상동체는 본 개시내용의 특정 실시양태에서 트랜스진으로서 유용하다: RPS27A, ABL1, AKT1, APAF1, BAD, BAG1, BAG3, BAG4, BAK1, BAX, BCL10, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L10, BCL2L11, BCL2L12, BCL2L13, BCL2L2, BCLAF1, BFAR, BID, BIK, NAIP, BIRC2, BIRC3, XIAP, BIRC5, BIRC6, BIRC7, BIRC8, BNIP1, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BOK, BRAF, CARD10, CARD11, NLRC4, CARD14, NOD2, NOD1, CARD6, CARD8, CARD9, CASP1, CASP10, CASP14, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CFLAR, CIDEA, CIDEB, CRADD, DAPK1, DAPK2, DFFA, DFFB, FADD, GADD45A, GDNF, HRK, IGF1R, LTA, LTBR, MCL1, NOL3, PYCARD, RIPK1, RIPK2, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF14, TNFRSF19, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF14, TNFSF18, CD40LG, FASLG, CD70, TNFSF8, TNFSF9, TP53, TP53BP2, TP73, TP63, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5 DRD2, GRIA1, GRIA2, GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER, UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106β, IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, ATXN2, ATXN3, 아트로핀 1, FTL, TITF-1, FXN, ASPA, DMD, 및 SMN1, UBE1, DYNC1H1.
통상의 기술자는 또한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 트랜스진의 경우에, 단백질 또는 폴리펩티드의 기능적 등가 변이체 또는 상동체를 제공하기 위해 트랜스진에서 보존적 아미노산 치환을 유발하는 돌연변이가 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 측면에서 본 개시내용은 트랜스진의 보존적 아미노산 치환을 유발하는 서열 변경을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스진은 우성 음성 돌연변이를 갖는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 트랜스진은 야생형 단백질과 동일한 요소와 상호작용하여 야생형 단백질의 기능의 일부 측면을 차단하는 돌연변이 단백질을 발현할 수 있다.
유용한 트랜스진 산물은 또한 miRNA를 포함한다. miRNA 및 다른 소형 간섭 핵산은 표적 RNA 전사체 절단/분해 또는 표적 메신저 RNA (mRNA)의 번역 억제를 통해 유전자 발현 조절한다. miRNA는 전형적으로 최종 19-25개의 비-번역 RNA 산물로서 천연적으로 발현된다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역 (UTR)과의 서열-특이적 상호작용을 통해 그의 활성을 나타낸다. 이들 내인성으로 발현된 miRNA는 헤어핀 전구체를 형성하며, 이는 후속적으로 miRNA 듀플렉스로 프로세싱되고, 추가로 "성숙" 단일 가닥 miRNA 분자로 프로세싱된다. 이러한 성숙 miRNA는 다중단백질 복합체인 miRISC를 안내하며, 이는 성숙 miRNA에 대한 상보성에 기초하여 표적 mRNA의 표적 부위, 예를 들어 3' UTR 영역에서의 표적 부위를 확인한다.
miRNA 유전자 및 그의 상동체의 하기 비제한적 목록은 본 방법의 특정 실시양태에서 트랜스진으로서 또는 트랜스진에 의해 코딩되는 소형 간섭 핵산 (예를 들어, miRNA 스폰지, 안티센스 올리고뉴클레오티드, TuD RNA)에 대한 표적으로서 유용하다: hsa-let-7a, hsa-let-7a*, hsa-let-7b, hsa-let-7b*, hsa-let-7c, hsa-let-7c*, hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let-7e, hsa-let-7e*, hsa-let-7f, hsa-let-7f-1*, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-7g*, hsa-let-7i, hsa-let-7i*, hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR-101, hsa-miR-101*, hsa-miR-103, hsa-miR-105, hsa-miR-105*, hsa-miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR-106b, hsa-miR-106b*, hsa-miR-107, hsa-miR-10a, hsa-miR-10a*, hsa-miR-10b, hsa-miR-10b*, hsa-miR-1178, hsa-miR-1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR-1182, hsa-miR-1183, hsa-miR-1184, hsa-miR-1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR-1204, hsa-miR-1205, hsa-miR-1206, hsa-miR-1207-3p, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1208, hsa-miR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-1224-5p, hsa-miR-1225-3p, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1226, hsa-miR-1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa-miR-1229, hsa-miR-1231, hsa-miR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR-1236, hsa-miR-1237, hsa-miR-1238, hsa-miR-124, hsa-miR-124*, hsa-miR-1243, hsa-miR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR-1247, hsa-miR-1248, hsa-miR-1249, hsa-miR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsa-miR-1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa-miR-1255b, hsa-miR-1256, hsa-miR-1257, hsa-miR-1258, hsa-miR-1259, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-125b-1*, hsa-miR-125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR-1260, hsa-miR-1261, hsa-miR-1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR-1266, hsa-miR-1267, hsa-miR-1268, hsa-miR-1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsa-miR-1273, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-1276, hsa-miR-1277, hsa-miR-1278, hsa-miR-1279, hsa-miR-128, hsa-miR-1280, hsa-miR-1281, hsa-miR-1282, hsa-miR-1283, hsa-miR-1284, hsa-miR-1285, hsa-miR-1286, hsa-miR-1287, hsa-miR-1288, hsa-miR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR-1292, hsa-miR-1293, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-1294, hsa-miR-1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-1297, hsa-miR-1298, hsa-miR-1299, hsa-miR-1300, hsa-miR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR-1303, hsa-miR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR-1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR-130a*, hsa-miR-130b, hsa-miR-130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132*, hsa-miR-1321, hsa-miR-1322, hsa-miR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a*, hsa-miR-135b, hsa-miR-135b*, hsa-miR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsa-miR-138, hsa-miR-138-1*, hsa-miR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR-141*, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143*, hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, hsa-miR-145*, hsa-miR-146a, hsa-miR-146a*, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-147, hsa-miR-147b, hsa-miR-148a, hsa-miR-148a*, hsa-miR-148b, hsa-miR-148b*, hsa-miR-149, hsa-miR-149*, hsa-miR-150, hsa-miR-150*, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-152, hsa-miR-153, hsa-miR-154, hsa-miR-154*, hsa-miR-155, hsa-miR-155*, hsa-miR-15a, hsa-miR-15a*, hsa-miR-15b, hsa-miR-15b*, hsa-miR-16, hsa-miR-16-1*, hsa-miR-16-2*, hsa-miR-17, hsa-miR-17*, hsa-miR-181a, hsa-miR-181a*, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-181b, hsa-miR-181c, hsa-miR-181c*, hsa-miR-181d, hsa-miR-182, hsa-miR-182*, hsa-miR-1825, hsa-miR-1826, hsa-miR-1827, hsa-miR-183, hsa-miR-183*, hsa-miR-184, hsa-miR-185, hsa-miR-185*, hsa-miR-186, hsa-miR-186*, hsa-miR-187, hsa-miR-187*, hsa-miR-188-3p, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-18a, hsa-miR-18a*, hsa-miR-18b, hsa-miR-18b*, hsa-miR-190, hsa-miR-190b, hsa-miR-191, hsa-miR-191*, hsa-miR-192, hsa-miR-192*, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-193b, hsa-miR-193b*, hsa-miR-194, hsa-miR-194*, hsa-miR-195, hsa-miR-195*, hsa-miR-196a, hsa-miR-196a*, hsa-miR-196b, hsa-miR-197, hsa-miR-198, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-19a, hsa-miR-19a*, hsa-miR-19b, hsa-miR-19b-1*, hsa-miR-19b-2*, hsa-miR-200a, hsa-miR-200a*, hsa-miR-200b, hsa-miR-200b*, hsa-miR-200c, hsa-miR-200c*, hsa-miR-202, hsa-miR-202*, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-206, hsa-miR-208a, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20a*, hsa-miR-20b, hsa-miR-20b*, hsa-miR-21, hsa-miR-21*, hsa-miR-210, hsa-miR-211, hsa-miR-212, hsa-miR-214, hsa-miR-214*, hsa-miR-215, hsa-miR-216a, hsa-miR-216b, hsa-miR-217, hsa-miR-218, hsa-miR-218-1*, hsa-miR-218-2*, hsa-miR-219-1-3p, hsa-miR-219-2-3p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-22, hsa-miR-22*, hsa-miR-220a, hsa-miR-220b, hsa-miR-220c, hsa-miR-221, hsa-miR-221*, hsa-miR-222, hsa-miR-222*, hsa-miR-223, hsa-miR-223*, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23a*, hsa-miR-23b, hsa-miR-23b*, hsa-miR-24, hsa-miR-24-1*, hsa-miR-24-2*, hsa-miR-25, hsa-miR-25*, hsa-miR-26a, hsa-miR-26a-1*, hsa-miR-26a-2*, hsa-miR-26b, hsa-miR-26b*, hsa-miR-27a, hsa-miR-27a*, hsa-miR-27b, hsa-miR-27b*, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, 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hsa-miR-99b*.
miRNA는 그가 표적화하는 mRNA의 기능을 억제하고, 그 결과 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 억제한다. 따라서, miRNA의 활성을 (부분적으로 또는 총체적으로) 차단하는 것 (예를 들어, miRNA를 침묵시키는 것)은 발현이 억제되는 폴리펩티드의 발현을 효과적으로 유도 또는 회복시킬 수 있다 (폴리펩티드를 탈억제시킬 수 있다). 한 실시양태에서, miRNA의 mRNA 표적에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 탈억제는 다양한 방법 중 어느 하나를 통해 세포에서의 miRNA 활성을 억제함으로써 달성된다. 예를 들어, miRNA의 활성을 차단하는 것은 miRNA에 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 소형 간섭 핵산 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA 스폰지, TuD RNA)과 혼성화되어, miRNA와 그의 표적 mRNA와의 상호작용을 차단함으로써 달성될 수 있다. 본원에 사용된, miRNA에 실질적으로 상보적인 소형 간섭 핵산은 miRNA와 혼성화되고 miRNA의 활성을 차단할 수 있는 것이다. 일부 실시양태에서, miRNA에 실질적으로 상보적인 소형 간섭 핵산은 miRNA와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 염기를 제외한 모두에서 상보적인 소형 간섭 핵산이다. 일부 실시양태에서, miRNA에 실질적으로 상보적인 소형 간섭 핵산 서열은 miRNA와 적어도 1개의 염기에서 상보적인 소형 간섭 핵산 서열이다.
"miRNA 억제제"는 miRNA 기능, 발현 및/또는 프로세싱을 차단하는 작용제이다. 예를 들어, 이들 분자는 드로샤 복합체와의 miRNA 상호작용을 억제하는 마이크로RNA 특이적 안티센스, 마이크로RNA 스폰지, 터프 디코이 RNA (TuD RNA) 및 마이크로RNA 올리고뉴클레오티드 (이중-가닥, 헤어핀, 짧은 올리고뉴클레오티드)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 마이크로RNA 억제제는 상기 논의된 바와 같이 세포에서 핵산의 트랜스진으로부터 발현될 수 있다. 마이크로RNA 스폰지는 상보적 칠량체 시드 서열을 통해 miRNA를 특이적으로 억제한다 (Ebert, M.S. Nature Methods, Epub August, 12, 2007; ). 일부 실시양태에서, miRNA의 전체 패밀리는 단일 스폰지 서열을 사용하여 침묵될 수 있다. TuD RNA는 포유동물 세포에서 특이적 miRNA의 효율적 및 장기간 억제를 달성한다 (예를 들어, 문헌 [Takeshi Haraguchi, et al., Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 6 e43] 참조, 이 중 TuD RNA에 관한 내용은 본원에 참조로 포함됨). 세포에서 miRNA 기능을 침묵시키는 (miRNA 표적의 탈억제) 다른 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 CNS-관련 장애의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "CNS-관련 장애"는 중추 신경계의 질환 또는 상태이다. CNS-관련 장애는 척수 (예를 들어, 척수병증), 뇌 (예를 들어, 뇌병증), 또는 뇌 및 척수를 둘러싸는 조직에 영향을 미칠 수 있다. CNS-관련 장애는 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. CNS-관련 장애는 심리 상태 또는 장애, 예를 들어 주의력 결핍 과잉행동 장애, 자폐증 스펙트럼 장애, 기분 장애, 정신분열증, 우울증, 레트 증후군 등일 수 있다. CNS-관련 장애는 자가면역 장애일 수 있다. CNS-관련 장애는 또한 CNS 암, 예를 들어 뇌암일 수 있다. 암인 CNS-관련 장애는 CNS의 원발성 암, 예를 들어 성상세포종, 교모세포종 등일 수 있거나, 또는 CNS 조직으로 전이한 암, 예를 들어 뇌로 전이한 폐암일 수 있다. 추가로 CNS-관련 장애의 비제한적 예는 파킨슨병, 리소솜 축적 질환, 허혈, 신경병증성 통증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증 (MS) 및 카나반병 (CD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 심장 세포 (예를 들어, 심장 조직)에 유전자 요법을 전달하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 심혈관 장애의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "심혈관 장애"는 심혈관계의 질환 또는 상태이다. 심혈관 질환은 심장, 순환계, 동맥, 정맥, 혈관 및/또는 모세관에 영향을 미칠 수 있다. 심혈관 장애는 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 심혈관 장애의 비제한적 예는 류마티스성 심장 질환, 심장 판막 질환, 고혈압성 심장 질환, 동맥류, 아테롬성동맥경화증, 고혈압 (예를 들어, 고혈압), 말초 동맥 질환 (PAD), 허혈성 심장 질환, 협심증, 관상동맥 심장 질환, 관상 동맥 질환, 심근경색, 뇌 혈관 질환, 일과성 허혈 발작, 염증성 심장 질환, 심근병증, 심막 질환, 선천성 심장 질환, 심부전, 졸중, 및 샤가스병으로 인한 심근염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 폐 및/또는 폐 계통의 조직을 표적화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 폐 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "폐 질환"은 폐 계통의 질환 또는 상태이다. 폐 질환은 호흡에 수반되는 폐 또는 근육에 영향을 미칠 수 있다. 폐 질환은 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 폐 질환은 비소세포 폐암, 소세포 폐암 및 폐 카르시노이드 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폐암일 수 있다. 추가로 폐 질환의 비제한적 예는 급성 기관지염, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 석면증, 천식, 기관지확장증, 세기관지염, 폐쇄성 세기관지염 기질화 폐렴 (BOOP), 기관지폐 이형성증, 면폐증, 만성 기관지염, 콕시디오이데스진균증 (코쿠스), 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 잠재성 기질화 폐렴 (COP), 낭성 섬유증, 기종, 한타바이러스 폐 증후군, 히스토플라스마증, 인간 메타뉴모바이러스, 과민성 폐장염, 인플루엔자, 림프관종증, 중피종, 중동 호흡기 증후군, 비-결핵 미코박테리움, 백일해, 진폐증 (흑색 폐 질환), 폐렴, 원발성 섬모 이상운동증, 원발성 폐고혈압, 폐동맥 고혈압, 폐 섬유증, 폐 혈관 질환, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 사르코이드증, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS), 규폐증, 수면 무호흡, 영아 돌연사 증후군 (SIDS), 및 결핵을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 간 조직을 표적화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 간 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "간 질환"은 간의 질환 또는 상태이다. 간 질환은 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 간 질환은 간세포성 암종 (HCC), 섬유층판성 암종, 담관암종, 혈관육종 및 간모세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 간암일 수 있다. 추가로 간 질환의 비제한적 예는 알라질 증후군, 알파 1 항-트립신 결핍, 자가면역 간염, 담도 폐쇄증, 간경변증, 간의 낭포성 질환, 지방간 질환, 갈락토스혈증, 담석, 길버트 증후군, 혈색소증, 임신 중 간 질환, 신생아 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 포르피린증, 라이 증후군, 사르코이드증, 독성 간염, 유형 1 글리코겐 축적 질환, 티로신혈증, 바이러스성 A형, B형, C형 간염, 윌슨병, 및 주혈흡충증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 신장 조직을 표적화할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 신장 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "신장 질환"은 신장의 질환 또는 상태이다. 신장 질환은 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 신장 질환은 신세포암, 투명 세포 암, 유두상 암 유형 1, 유두상 암 유형 2, 혐색소성 암, 종양세포 세포 암, 집합관 암, 신우의 이행 세포암 및 윌름스 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신장암일 수 있다. 추가로 신장 질환의 비제한적 예는 압더할덴-카우프만-리그나크 증후군 (신병증성 시스틴축적증), 급성 신부전/급성 신장 손상, 급성 신엽염, 급성 포스페이트 신병증, 급성 세뇨관 괴사, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 결핍, 아데노바이러스 신염, 알포트 증후군, 아밀로이드증, 혈관근지방종, 진통제성 신병증, 안지오텐신 항체 및 초점성 분절성 사구체경화증, 항인지질 증후군, 항-TNF-α 요법-관련 사구체신염, APOL1 돌연변이, 외견적 미네랄코르티코이드 과잉 증후군, 아리스톨로크산 신병증, 발칸 풍토병성 신병증, 바터 증후군, 사탕무뇨, β-지중해빈혈 신질환, 담즙 원주 신병증, BK 폴리오마, C1q 신병증, 심신성 증후군, CFHR5 신병증, 콜레스테롤 색전, 처그-스트라우스 증후군, 암죽뇨, 허탈 사구체병증, CMV와 연관된 허탈 사구체병증, 선천성 신증후군, 코노레날 증후군 (메인저-살디노 증후군 또는 살디노-메인저병), 조영제 신병증, 황산구리 중독, 피질 괴사, 한랭글로불린혈증, 결정-유발 급성 신장 손상, 낭성 신장 질환, 후천성 시스틴뇨, 고밀도 침착 질환 (MPGN 유형 2), 덴트병 (X-연관 열성 신석증), 투석 불균형 증후군, 당뇨병성 신장 질환, 요붕증, EAST 증후군, 이소성 요관, 부종, 에르트하임-체스터병, 파브리병, 가족성 저칼슘뇨 고칼슘혈증, 판코니 증후군, 프레이저 증후군, 피브로넥틴 사구체병증, 원섬유성 사구체신염 및 이뮤노탁토이드 사구체병증, 프랄레이 증후군, 초점성 분절성 사구체경화증, 초점성 경화증, 초점성 사구체경화증, 갤러웨이 모와트 증후군, 지텔만 증후군, 사구체 질환, 사구체 세관 환류, 당뇨, 굿패스쳐 증후군, 용혈성 요독성 증후군 (HUS), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 식혈세포성 증후군, 출혈성 방광염, 발작성 야간 혈색소뇨 및 용혈성 빈혈과 연관된 혈철증, 간 정맥-폐쇄 질환, 동모양혈관 폐쇄 증후군, 간염 C-연관 신질환, 간신 증후군, HIV-연관 신병증 (HIVAN), 마제상 신장 (신장 융합), 휴너 궤양, 고알도스테론증, 고칼슘혈증, 고칼륨혈증, 고마그네슘혈증, 고나트륨혈증, 고옥살산뇨, 고인산혈증, 저칼슘혈증, 저칼륨혈증, 저칼륨혈증-유발 신장 기능장애, 저마그네슘혈증, 저나트륨혈증, 저인산혈증, IgA 신병증, IgG4 신병증, 간질성 방광염, 통증성 방광 증후군, 간질성 신염, 무비 증후군, 신장 결석, 신석증, 렙토스피라증 신질환, 경쇄 침착 질환, 모노클로날 이뮤노글로불린 침착 질환, 리들 증후군, 라이트우드-올브라이트 증후군, 지단백질 사구체병증, 리튬 신독성, LMX1B 돌연변이 유발 유전성 FSGS, 허리 통증 혈뇨, 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신장 질환, 루푸스 신염, 라임 질환-연관 사구체신염, 말라리아 신병증, 악성 고혈압, 연화판증, 외요도구 협착, 수질성 낭성 신장 질환, 수질성 해면 신장, 거대요관증, 멜라민 독성 및 신장, 막증식성 사구체신염, 막성 신병증, 메소아메리칸 신병증, 대사성 산증, 대사성 알칼리증, 현미경적 다발혈관염, 밀크-알칼리 증후군, 최소 변화 질환, 다낭성 이형성 신장, 다발성 골수종, 골수증식성 신생물 및 사구체병증, 손발톱-슬개골 증후군, 신석회화증, 신원성 전신 섬유증, 신하수증 (부유 신장, 신장 하수증), 신증후군, 신경원성 방광, 결절성 사구체경화증, 비-임균성, 호두까기 증후군, 구강안면수족지 증후군, 기립성 저혈압, 기립성 단백뇨, 삼투성 이뇨, 페이지 신장, 유두상 괴사, 유두신장 증후군 (신장-결손 증후군, 고립성 신장 저형성증), 복막-신장 증후군, 후요도판, 감염후 사구체신염, 스트렙토코쿠스 감염후 사구체신염, 결절성 다발동맥염, 다낭성 신장 질환, 후요도판, 전자간증, 모노클로날 IgG 침착물을 갖는 증식성 사구체신염 (나스르병), 단백뇨 (소변 중 단백질), 가성고알도스테론증, 가성부갑상선기능저하증, 폐-신장 증후군, 신우신염 (신장 감염), 화농신장, 방사선 신병증, 영양재개 증후군, 역류성 신병증, 급속 진행성 사구체신염, 신장 농양, 신주위 농양, 신장 무발생증, 신동맥 동맥류, 신동맥 협착, 신세포암, 신낭, 운동-유발 급성 신부전을 동반한 신장 저요산혈증, 신경색, 신장 골이영양증, 신세관성 산증, 리셋 삼투압조절중추, 하대정맥후 뇨관, 복막후 섬유증, 횡문근융해증, 비만치료 수술과 연관된 횡문근융해증, 류마티스성 관절염-연관 신질환, 사르코이드증 신질환, 염 소모, 신장 및 뇌, 쉼케 면역-골 이형성증, 경피증 신발증, 세르펜틴 비골-다낭성 신장 증후군, 엑스너 증후군, 겸상 적혈구 신병증, 실리카 노출 및 만성 신장 질환, 조혈 세포 이식 후 신장 질환, 줄기 세포 이식과 연관된 신장 질환, 박기저막 질환, 양성 가족성 혈뇨, 방광삼각염, 결절성 경화증, 관 이발생증, 종양 용해 증후군, 요독증, 요독성 시신경병증, 요관류, 요도 언덕, 요도 협착, 요실금, 요로 감염, 요로 폐쇄, 방광장루, 방광요관 역류, 폰 히펠-린다우병, 와파린-관련 신병증, 베게너 육아종증, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 및 분덜리히 증후군을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 안구 조직에 유전자 요법을 전달하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 안구 장애의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "안구 장애"는 안구의 질환 또는 상태이다. 안구 질환은 안구, 공막, 각막, 전방, 후방, 홍채, 동공, 렌즈, 유리체액, 망막 또는 시신경에 영향을 미칠 수 있다. 안구 장애는 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 안구 질환 및 장애의 비제한적 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 연령-관련 황반 변성, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 녹내장, 색소성 망막염, 스타르가르트병, 어셔병 및 레베르 선천성 흑암시 및 안암.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 혈액 조직 (예를 들어, 혈액 세포)에 유전자 요법을 전달하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 혈액 장애의 치료에 유용할 수 있다. 본원에 사용된 "혈액 장애"는 혈액의 질환 또는 상태이다. 혈액 장애는 유전적 기원을 가질 수 있으며, 유전성이거나 또는 체세포 돌연변이를 통한 후천성일 수 있다. 혈액 질환 및 장애의 비제한적 예는 빈혈 (예를 들어, 만성 신장 질환에서의 빈혈, 재생불량성 빈혈, 골수이형성 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈), 심부 정맥 혈전증, 혈우병 (예를 들어, A형 혈우병, B형 혈우병, C형 혈우병), 헤노흐-쉔라인 자반증, 폐 색전증, 지중해빈혈, 및 폰 빌레브란트 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 대상체에게 유전자 편집 분자 (예를 들어, 뉴클레아제)를 전달하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 뉴클레아제를 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "엔도뉴클레아제" 및 "뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 쇄 내에 포스포디에스테르 결합 또는 결합들을 절단하는 효소를 지칭한다. 뉴클레아제는 자연 발생 또는 유전자 조작된 것일 수 있다. 유전자 조작된 뉴클레아제는 게놈 편집에 특히 유용하고, 일반적으로 4종의 패밀리로 분류된다: 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 조작된 메가뉴클레아제 및 CRISPR-연관 단백질 (Cas 뉴클레아제). 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 ZFN이다. 일부 실시양태에서, ZFN은 FokI 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ZFN은 Cys2His2 폴드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALEN이다. 일부 실시양태에서, TALEN은 FokI 절단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 조작된 메가뉴클레아제이다.
용어 "CRISPR"은 염기 서열의 짧은 반복부를 함유하는 DNA 유전자좌인 "클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 팔린드롬 반복부"를 지칭한다. CRISPR 유전자좌는 외래 유전 물질에 대한 저항성을 부여하는 원핵 적응 면역계의 부분을 형성한다. 각각의 CRISPR 유전자좌에는 바이러스 게놈 물질로부터 유래된 "스페이서 DNA"의 짧은 절편이 플랭킹된다. 유형 II CRISPR 시스템에서, 스페이서 DNA는 전사활성화 RNA (tracrRNA)에 혼성화되고, CRISPR-RNA (crRNA)로 프로세싱되고, 후속적으로 CRISPR-연관 뉴클레아제 (Cas 뉴클레아제)와 회합되어 외래 DNA를 인식하고 분해하는 복합체를 형성한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR-연관 뉴클레아제 (Cas 뉴클레아제)이다. CRISPR 뉴클레아제의 예는 Cas9, Cas6 및 dCas9를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. dCas9는 표적 유전자좌에 결합하지만 상기 유전자좌를 절단하지는 않는 조작된 Cas 단백질이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas9이다. 일부 실시양태에서, Cas9는 박테리아 에스. 피오게네스로부터 유래된다 (SpCas9).
게놈 편집의 목적을 위해, CRISPR 시스템은 tracrRNA 및 crRNA를 조합하여 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 단지 (gRNA)가 되도록 변형될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 세포에서 표적 서열에 상보적이고 Cas 뉴클레아제와 회합하여 Cas 뉴클레아제를 표적 서열로 지시하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 가이드 RNA (gRNA)를 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 1 내지 30개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, gRNA는 5 내지 25개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, gRNA는 10 내지 20개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, gRNA는 14 내지 18개 뉴클레오티드 범위의 길이이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 gRNA 및 CRISPR 뉴클레아제를 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 기능적 단백질을 코딩하지 않는 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 예를 들어, 유전자 요법과 관련하여, 트랜스진 프로모터 통합은 종양유전자 활성화를 유발할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 프로모터 부재 구축물을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 관한 것이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 프로모터 부재 발현 구축물은, 일부 실시양태에서, 유전자 편집을 위한 기재로서 유용하다.
본원에 사용된 "게놈 편집"은 게놈 서열 (예를 들어, 유전자 서열)을 부가, 파괴 또는 변화시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집은 조작된 단백질 및 관련된 분자를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 게놈 편집은 표적 게놈 유전자좌를 절단하기 위한 조작된 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집은 절단된 유전자좌에서 핵산 잔기를 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단된 유전자좌에서 핵산 잔기를 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환시키는 것은 내인성 세포 메카니즘, 예컨대 상동 재조합 (HR) 및 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 통해 수행된다. 예시적인 게놈 편집 기술은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제, CRISPR/Cas 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 기술은 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 및 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, TALEN과 관련된 단백질 또는 분자이다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 기술은 Cys2His2 폴드 기를 포함하는 단백질 (예를 들어 Zif268 (EGR1)), 및 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, ZFN과 관련된 단백질 또는 분자이다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 기술은 Cas9, Cas6, dCas9, CRISPR RNA (crRNA) 및 전사활성화 crRNA (tracrRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, CRISPR/Cas 시스템과 관련된 단백질 또는 분자이다. 일부 실시양태에서, 프로모터 부재 구축물은 TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, Cas9 및 편집 단백질을 위한 기재를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 DNA 백신을 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본원에 사용된 "DNA 백신"은 숙주에서 항원에 대한 면역 반응 (예를 들어, 세포성 면역 반응 또는 체액성 면역 반응)을 자극하는 그러한 항원을 코딩하는 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 향후 감염 또는 상태에 대해 보호하는 보호 반응이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 면역 반응은 기존 감염 또는 상태를 치료한다 (예를 들어, 근절 또는 약화시킨다). DNA 백신의 예는 HL 쇄 Ig, scFv, 낙타과로부터 유래된 단일-도메인 Ig (VhH) 또는 연골 어류로부터 유래된 단일-도메인 Ig (Vnar), 나노바디, 및 다른 파라토프 인식 펩티드 및 융합 펩티드 (집합적으로 Ig (또는 Ig-유사) 분자로 지칭됨)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 Ig 또는 Ig-유사 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, Ig (또는 Ig-유사) 분자는 모노클로날 항체 서열로부터 유래된 비변형 단백질 서열이다. 일부 실시양태에서, Ig (또는 Ig-유사) 분자는 뮤린 또는 다른 포유동물 모노클로날 항체 서열로부터 유래된 비변형 단백질 서열이다.
일부 실시양태에서, Ig (또는 Ig-유사) 분자는 합성 무작위 생성 펩티드 라이브러리로부터 유래된 비변형 단백질 서열이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 나이브 척추동물 종으로부터 수득된 상보적 DNA로부터 유래되었다. 종은 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류), 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트), 유제류, 낙타류, 말, 개, 고양이, 유대류, 및 관심 농업용 동물; 닭, 오리 및 거위를 포함한 조류 종; 연골 어류, 칠성장어 및 유악 어류 종을 포함한 어류 종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산은 이뮤노글로불린 (Ig)에 대한 중쇄 및 경쇄를 코딩하여, 허용 세포에 투여되는 경우에, 조립된 Ig가 순환계로 분비되도록 한다. 일부 실시양태에서, Ig 분자는 분비되지 않고, 소위 "인트라-바디"로서 내부적으로 작용한다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 하나의 폴리펩티드에 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 조작된 단일-쇄 항체 (scFv)인 Ig 분자를 코딩한다. scFv는 표적 항원에 대한 결합력 및 특이성을 유지한다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 미생물제에 결합하고 미생물의 감염성에 영향을 미치는 Ig 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 미생물제는 원핵 유기체이다. 일부 실시양태에서, 미생물제는 리케치아, 미코플라스마 또는 다른 세포내 생명 형태이다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 에볼라 바이러스 바이러스 단백질, 인간 면역 결핍 바이러스 단백질, 유두종 바이러스 단백질, 단순 포진 1 바이러스 단백질, 단순 포진 2 바이러스 단백질, HCV A 바이러스 단백질, HCV B 바이러스 단백질, HCV C 바이러스 단백질, HCV 비-A 바이러스 단백질, HCV 비-B 바이러스 단백질, 또는 뎅기 출혈열 바이러스 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 병원성 바이러스의 바이러스 구조 단백질(들)에 결합하는 Ig 분자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물은 구제역 바이러스 및 광견병 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인수공통 병원체의 바이러스 구조 단백질(들)에 결합하는 Ig 분자를 코딩하한다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 변형된 세포, 예컨대 생체외 변형된 세포의 생산에 유용하다. 본원에 사용된 "생체외 변형된 세포"는 대상체로부터 제거되고, 유전자 변형되고 (예를 들어, 외인성 핵산으로 형질감염 또는 형질도입되거나, 또는 유전자 재프로그램화되고), 배양 또는 확장되고, 임의로 대상체 (예를 들어, 동일한 대상체 또는 상이한 대상체)로 복귀되는 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)를 지칭한다. 일반적으로, 생체외 변형된 세포는 자가 세포 요법 또는 동종 세포 요법에 유용하다. 예를 들어, 세포는 특정한 유전적 결함 (예를 들어, 특정한 단백질의 과다발현)과 연관된 질환을 갖는 대상체로부터 제거되고, 유전적 결함을 보정하는 (예를 들어, 단백질의 발현을 감소시키는) 핵산으로 형질감염되고, 대상체 내로 재도입될 수 있다. 또 다른 비제한적 예에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, 유전자 재프로그램화되고 (예를 들어, 줄기 세포로 역분화 또는 전환분화되고), 확장되고, 대상체 내로 재도입된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산으로의 형질감염에 의해 생산된 생체외 변형된 세포는 현재 이용가능한 유전자 요법 벡터에 의해 생산된 생체외 세포와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 키메라 항원 T-세포 (CART)의 생산에 유용하다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 단일 쇄 FV (scFv) 항체 모이어티를 기반으로 표적 항원에 대한 특이성을 디스플레이하는 조작된 T 세포 수용체이다. 일반적으로, CART는 CAR을 코딩하는 DNA를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 T-세포를 형질도입함으로써 생산된다. 렌티바이러스 형질도입은, 일부 실시양태에서, 암을 유도하는 삽입 돌연변이유발의 위험을 일으킨다. 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같이, 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산은 다른 유전자 요법 양식과 비교하여 감소된 삽입 돌연변이유발 가능성을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 CAR을 코딩하는 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산으로의 형질도입에 의해 생산된 CART는 렌티바이러스 형질도입에 의해 생산된 CART와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 나타낸다.
추가의 성분
핵산에 대해 상기에서 확인된 주요 요소에 추가로, 핵산은 또한 본 개시내용에 의해 기재된 핵산으로 형질감염된 세포에서 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 필요한 통상적인 제어 요소를 포함한다. 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 트랜스로 또는 거리를 두고 작용하여 관심 유전자를 제어하는 발현 제어 서열을 둘 다 포함한다.
발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증진시키는 서열 (즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 원하는 경우에, 코딩된 산물의 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함한 다수의 발현 제어 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진)은 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 코딩 서열 및 조절 서열은 이들이 핵산 서열 (예를 들어, 트랜스진)의 발현 또는 전사를 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 두는 방식으로 공유 연결되는 경우에 "작동가능하게 연결된" 것으로 언급된다. 핵산 서열 (예를 들어, 트랜스진)이 기능적 단백질로 번역될 것이 요구되는 경우에, 2개의 DNA 서열은 5' 조절 서열 내의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 유발하고 2개의 DNA 서열 사이의 연결의 성질이 (1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입을 유발하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는 경우에 작동가능하게 연결된 것으로 언급된다. 따라서, 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사에 영향을 미쳐 생성된 전사체가 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 하는 경우에 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 것일 것이다. 유사하게 2개 이상의 코딩 영역은 이들이 공통 프로모터로부터의 그의 전사가 프레임에서 번역된 2개 이상의 단백질의 발현을 유발하는 방식으로 연결되는 경우에 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 융합 단백질을 생성한다. 일부 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 기능적 RNA (예를 들어, gRNA)를 생성한다.
단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, 트랜스진)의 경우, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 트랜스진 서열 뒤에 및 3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 개시내용에 유용한 이종 핵산 삽입물 (예를 들어, 트랜스진)은 또한 바람직하게는 프로모터/인핸서 서열과 트랜스진 사이에 위치하는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고, SV-40 T 인트론 서열로 지칭된다. 사용될 수 있는 또 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)이다. IRES 서열은 단일 유전자 전사체로부터 1개 초과의 폴리펩티드를 생산하는데 사용된다. IRES 서열은 1개 초과의 폴리펩티드 쇄를 함유하는 단백질을 생산하는데 사용될 것이다. 이들 및 다른 공통 벡터 요소의 선택은 통상적이고, 많은 이러한 서열이 이용가능하다 [예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 및 그에 인용된 참고문헌, 예를 들어, 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 실시양태에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질에 포함되고; 이것은 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 제시된 소형 펩티드 (대략 18개 아미노산의 길이)이다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터 (AAV 및 레트로바이러스)를 포함한 인공 시스템에서 이전에 입증되었다 (Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; 및 Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).
숙주 세포에서 유전자 발현을 위해 필요한 조절 서열의 정확한 성질은 종, 조직 또는 세포 유형 사이에 달라질 수 있지만, 일반적으로 각각 전사 및 번역의 개시에 수반되는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 필요에 따라 포함할 것이다. 특히, 이러한 5' 비-전사 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사 제어를 위해 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 원하는 경우에 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 벡터는 임의로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및 설계는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 및 판단 내에 있다.
구성적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐) [예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 [인비트로젠]를 포함한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 급성기, 세포의 특정한 분화 상태의 존재에 의해, 또는 단지 복제 세포에서 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은, 비제한적으로, 인비트로젠, 클론테크 및 아리아드를 포함한 다양한 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되었고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인적으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라시클린-억제성 시스템 (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라시클린-유도성 시스템 ([Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 [Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정한 분화 상태에 의해, 또는 단지 복제 세포에서 조절되는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요구되는 경우에 선호될 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발달상, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야하는 경우에 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직-특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 조직-특이적 조절 서열은 하기 조직 특이적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 간-특이적 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 인슐린 프로모터, 글루카곤 프로모터, 소마토스타틴 프로모터, 췌장 폴리펩티드 (PPY) 프로모터, 시냅신-1 (Syn) 프로모터, 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터, 포유동물 데스민 (DES) 프로모터, α-미오신 중쇄 (a-MHC) 프로모터, 또는 심장 트로포닌 T (cTnT) 프로모터. 다른 예시적인 프로모터는 통상의 기술자에게 분명할 것들 중 특히, 베타-액틴 프로모터, B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)); 알파-태아단백질 (AFP) 프로모터 (Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)), 골 오스테오칼신 프로모터 (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)); 골 시알로단백질 프로모터 (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)), CD2 프로모터 (Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)); 이뮤노글로불린 중쇄 프로모터; T 세포 수용체 α-쇄 프로모터, 뉴런, 예컨대 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터 (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경필라멘트 경쇄 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 프로모터 (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함한다.
폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 생산
일부 측면에서, 본 개시내용은 (i) 적어도 1개의 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 단계; 및 (ii) 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산의 다중 카피의 생산을 개시하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계를 포함하는, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산 (예를 들어, ceDNA)을 생산하는 방법을 제공한다.
핵산의 생산으로부터 유발되는 카피의 수는 허용 세포 내로 도입된 핵산 카피의 다중의 원래 수 (예를 들어, 1, 2, 10, 100개 또는 그 초과의 원래 카피)로서 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산의 다중 카피의 생산은 허용 세포 내 핵산 카피의 수의 2배 내지 10,000배 증가를 유발한다. 일부 실시양태에서, 핵산의 다중 카피의 생산은 허용 세포 내 핵산 카피의 수의 10,000배 초과의 증가를 유발한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 세포 (예를 들어, 형질감염된 허용 세포)를 제공한다. 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하는데 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포 막 내부로 도입된 경우에 "형질감염"된 것이다. 다수의 형질감염 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 이러한 기술은 1종 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오티드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 세포 (예를 들어, 허용 세포) 내로 도입하는데 사용될 수 있다.
"허용 세포"는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산이 복제되거나 또는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산의 복제를 지지할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 허용 세포는 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않는다. 본 개시내용의 측면은, 부분적으로, 일부 실시양태에서 포유동물 세포가 본 개시내용에 의해 기재된 핵산의 복제를 위해 허용되지 않는다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 허용 세포는 비-포유동물 세포이다 (예를 들어, 허용 세포는 포유동물 세포가 아니다). 일부 실시양태에서, 허용 세포는 곤충 세포주, 효모 세포주 또는 박테리아 세포주이다.
허용 곤충 세포의 예는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (예를 들어, Sf9, Sf21), 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea), 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa), 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis), 트리코풀시아 니(Trichopulsia ni) (예를 들어, 하이-파이브 세포), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (예를 들어, S2, S3), 안테라에아 유칼립티(Antheraea eucalypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus), 아에데스 아에깁티이(Aedes aegyptii) 및 다른 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
허용 박테리아 세포의 예는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
허용 효모 세포의 예는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 폼베(Saccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 바실루스 종(Bacillus sp.), 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.), 트리코더마 종(Trichoderma sp.) 및 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) C1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
허용 식물 세포의 예는 니코티아나 종(Nicotiana sp.), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 메이스 제아(Mays zea), 솔라눔 종(Solanum sp.) 또는 렘나 종(Lemna sp.)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 허용 세포는 포유동물 세포이다. 허용 포유동물 세포의 예는 헨리에타 랙스 종양 (HeLa) 세포 및 새끼 햄스터 신장 (BHK-21) 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산은 벡터 내에 함유되고 허용 세포에 전달된다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 회합되는 경우에 복제될 수 있고 세포 사이에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함한다. 따라서, 이러한 용어는 클로닝 및 발현 비히클, 뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 절편이 프로모터의 전사 제어 하에 배치되는 그러한 벡터인 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 방법은 허용 세포에서 롤링 서클 복제 단백질 (예를 들어, 바이러스 비구조 단백질, 예컨대 AAV Rep 단백질)을 발현하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서 1종 초과 (예를 들어, 2, 3, 4종 또는 그 초과의) 롤링 서클 복제 단백질이 허용 세포에서 발현된다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 허용 세포에서 발현된 바이러스 비구조 단백질(들)은 본 개시내용에 의해 기재된 핵산의 복제를 매개한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, AAV Rep78 및 Rep52는 AAV2 ITR-기반 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 핵산을 포함하는 허용 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 비구조 바이러스 단백질은 AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서 허용 세포에서 발현된 롤링 서클 복제 단백질 (예를 들어, 바이러스 비구조 단백질, 예컨대 AAV Rep 단백질)은 헬퍼 바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 본원에 사용된 "헬퍼 바이러스 벡터"는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산의 복제에 요구되는 분자(들) (예를 들어, 1종 이상의 단백질)를 발현하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 헬퍼 바이러스 벡터는 개재 자기-상보적 핵산 서열의 RBE에 결합하고 개재 자기-상보적 핵산 서열을 포함하는 핵산의 복제를 개시하는 1종 이상의 롤링 서클 복제 단백질을 발현한다. 헬퍼 바이러스 벡터는 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어 바큘로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 시토메갈로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 및 백시니아 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)이다. 바큘로바이러스 발현 벡터는, 예를 들어 문헌 [Passer et al. Methods Mol Biol. 2007;388:55-76]에 개시된 바와 같이, 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바큘로바이러스 벡터의 예는 아우토그라파 칼리포르니카 다중 핵다각체병 바이러스 (AcMNPV) 벡터, BmNPV 및 스포도프테라 엑시구아 다중 핵다각체병바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 아우토그라파 칼리포르니카 다중 핵다각체병 바이러스 (AcMNPV) 벡터이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산을 생산하는 방법은 세포 (예를 들어, 허용 세포)로부터 핵산의 다중 카피를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 핵산 정제 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산의 다중 카피는 플라스미드 정제 키트, 예컨대 퀴아젠 미니프렙 키트, 에탄올 침전, 페놀-클로로포름 정제 등에 의해 정제된다. 그러나, 본 개시내용은, 부분적으로, 개재 자기-상보적 서열을 포함하는 핵산이 약양이온 교환 크로마토그래피 매질 (예를 들어, 디에틸아미노에틸 매질, DEAE)에 불량한 결합 효율을 나타내고, 실리카 겔 매질을 사용하는 정제가 고분자량 복합체의 형성을 감소시키면서 잘-분해된 분자 종을 생산한다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 정제는 핵산을 실리카 겔 수지와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 핵산은, 예를 들어 치료 목적을 위해 이종 삽입물을 세포에 전달하는데 사용될 수 있다. 추가로, 일부 측면에서, 본 개시내용은 치료 산물 (예를 들어, 치료 단백질, 치료 RNA)을 코딩하는 이종 삽입물을 함유하는 핵산의 대상체에게의 전달에 관한 것이다. 불순한 또는 오염된 핵산의 투여를 피하거나 또는 달리 핵산 제제의 정도 또는 순도, 품질 또는 구성을 특징화하기 위해, 이러한 제제는 사용 전에, 예를 들어 세포 또는 대상체에게의 투여 전에 품질 관리 (QC) 또는 다른 분석 절차에 적용될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 분석하는 방법은, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산 제제를 수득하고, 제제 중 1종 이상의 핵산 성분, 예를 들어 핵산 복제 산물의 생리화학적 특성을 결정하는 것을 포함한다.
결정될 수 있는 생리화학적 특성의 예는 용해도, 안정성, 구조 (예를 들어, 1차 구조, 2차 구조, 3차 구조, 4차 구조 등), 소수성, GC 함량, 분자량 (예를 들어, 예를 들어 제한 소화 후 핵산의 1개 이상의 단편 또는 부분의 분자량) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 1개 또는 각각의 자기-상보적 서열의 뉴클레오티드 서열이다 (예를 들어, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산이 말단절단 크로스-아암 서열을 포함하는지를 결정하는 것).
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산의 다량체화의 정도이다 (예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다른 다량체 또는 콘카테머). 일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 핵산 제제 중 복제 산물의 단량체 및/또는 다량체 형태의 화학량론이다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 제한 엔도뉴클레아제에 의한 소화에 대한 1개 이상의 복제 산물 (예를 들어, 핵산 제제로부터 수득됨)의 감수성이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산은 1개 이상의 제한 효소로 소화되고, 핵산의 단편은 각각의 단편의 크기를 결정하기 위해 분석된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 1개 이상의 복제 산물의 분자량 또는 복제 산물의 단편의 분자량이다. 일부 실시양태에서, 분자량은 1개 이상의 자기-상보적 서열을 포함하는 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량이다. 일부 실시양태에서, 분자량은 전기영동 이동성에 기초하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 분자량은 질량 분광분석법에 기초하여 결정된다.
일부 실시양태에서, 분자량은 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량이다. 일부 실시양태에서, 분자량은 폴리머라제에 의한 프라이머 연장을 포함하는 반응에 의해 증폭되는 복제 산물의 단편의 분자량이다. 폴리머라제-기반 연장 방법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 레콤비나제 폴리머라제 증폭, 루프 매개된 등온 증폭 (LAMP) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 생리화학적 특성은 복제 산물의 이량체 형태에서의 단량체의 극성이고, 여기서 극성은 헤드-대-헤드, 헤드-대-테일 또는 테일-대-테일이다.
일반적으로, 생리화학적 특성을 결정하기 위한 적합한 검정이 용될 수 있다. 적합한 검정은 제한 소화 분석, 겔 전기영동 (예를 들어, 천연 겔 전기영동, 변성 겔 전기영동, 고분해도 겔 전기영동), 분광측정법 (예를 들어, 질량 분광측정법, 예컨대 LC/MS, HPLC/MS, ESI-MS, MALDI-TOF 등), 및 핵산 서열분석 (예를 들어, 막삼-길버트 서열분석, 파이로시퀀싱, 쇄-종결 서열분석, 대규모 병렬 시그너쳐 서열분석, 단일-분자 서열분석, 나노포어 서열분석, 일루미나 서열분석 등)을 포함할 수 있다.
조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 핵산은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 조성물은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 1개 이상 (예를 들어, 복수)의 핵산을 포함할 수 있는 것으로 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 복수의 핵산은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 핵산이다. 일부 실시양태에서, 복수 중 각각의 1개 이상의 핵산은 공유 연결된다 (예를 들어, 말단-대-말단으로 연결된다). 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
바람직하게는 생리학상 상용성인 담체 (즉, 조성물) 중에 현탁된 핵산은 대상체, 즉 숙주 동물, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기니 피그, 햄스터, 닭, 칠면조, 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 마카크)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서 숙주 동물은 인간을 포함하지 않는다.
포유동물 대상체에게의 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 전달은, 예를 들어 근육내 주사 또는 포유동물 대상체의 혈류 내로의 투여에 의한 것일 수 있다. 혈류 내로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관 도관 내로의 주사에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 외과 기술분야에 널리 공지된 기술이며, 본질적으로 기술자가 핵산의 투여 전에 체순환으로부터 사지를 격리할 수 있게 하는 방법인 격리된 사지 관류에 의해 혈류 내로 투여된다. 미국 특허 번호 6,177,403에 기재된 격리된 사지 관류 기술의 변형은 또한, 근육 세포 또는 조직의 형질감염을 잠재적으로 증진시키기 위해 격리된 사지의 혈관계 내로 핵산(들)을 투여하기 위해 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 더욱이, 특정 경우에, 핵산(들)을 대상체의 CNS에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. "CNS"는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 의미한다. 따라서, 이러한 용어는 뉴런 세포, 신경교 세포, 성상세포, 뇌척수액 (CSF), 간질 공간, 골, 연골 등을 포함한다. 재조합 AAV는 관련 기술분야에 공지된 신경외과 기술을 사용하여, 예컨대 정위 주사에 의해, 바늘, 카테터 또는 관련 장치로, 예를 들어 심실 영역, 뿐만 아니라 선조체 (예를 들어, 선조체의 미상핵 또는 피각), 척수 및 신경근 접합부 또는 소뇌 소엽 내로의 주사에 의해 CNS 또는 뇌에 직접적으로 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조).
적합한 담체는 핵산(들)이 지시되는 적응증을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 다양한 완충 용액으로 제제화될 수 있는 염수 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수)를 포함한다. 다른 예시적인 담체는 멸균 염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩 오일, 참깨 오일, 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 개시내용을 제한하지 않는다.
임의로, 본 개시내용의 조성물은, 핵산(들) 및 담체(들)에 추가로, 다른 통상적인 제약 성분, 예컨대 보존제 또는 화학적 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
핵산(들)은 목적하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 유해 효과 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 및 제약상 허용되는 투여 경로는 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비강내 및 기관내 전달을 포함함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내, 및 다른 모 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 투여 경로는 원하는 경우에 조합될 수 있다.
특정한 "치료 효과"을 달성하는데 요구되는 핵산(들)의 용량은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 인자에 기초하여 달라질 것이다: 핵산 투여의 경로, 치료 효과를 달성하는데 요구되는 유전자 또는 RNA 발현의 수준, 치료될 특정 질환 또는 장애, 및 유전자 또는 RNA 산물의 안정성. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 언급된 인자, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 인자에 기초하여 특정한 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 핵산 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여 계획은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 여러 용량이 매일 투여되거나 또는 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 나타난 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 올리고뉴클레오티드가 세포에 투여되는지 또는 대상체에게 투여되는지 관계없이 대상 올리고뉴클레오티드의 적절한 투여 용량 및 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로, 제약상 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
전형적으로, 이들 제제는 적어도 약 0.1% 또는 그 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있지만, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 달라질 수 있고 편리하게는 총 제제의 중량 또는 부피의 약 1 또는 2% 내지 약 70% 또는 80% 또는 그 초과로 존재할 수 있다. 당연히, 각각의 치료상-유용한 조성물 중 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어지도록 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명, 뿐만 아니라 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자가 상기 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이고, 따라서 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
특정 상황에서 핵산-기반 치료 구축물을 본원에 개시된 적합하게 제제화된 제약 조성물로 피하로, 췌장내로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 척수강내로 또는 경구로, 복강내로, 또는 흡입에 의해 전달하는 것이 바람직할 것이다. 일부 실시양태에서, 미국 특허 번호 5,543,158; 5,641,515 및 5,399,363 (각각 그 전문이 본원에 참조로 구체적으로 포함됨)에 기재된 바와 같은 투여 양식이 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 투여 방식은 문맥 주사에 의한 것이다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 중 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상의 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 다수의 경우에서 형태는 멸균성이고 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성이다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용하고, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 일어날 수 있다. 다수의 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는, 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 일어날 수 있다.
주사가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성으로 만들어질 수 있다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회의 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액 중 용해되고 1000 ml의 피하주입액에 첨가되거나 또는 제시된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량에서의 일부 변경은 숙주의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어느 경우에서든 개별 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 핵산을, 필요에 따라 본원에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
본원에 개시된 핵산 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기산, 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등을 사용하여 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노기를 사용하여 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제제화시에, 용액은 투여 제제와 상용성인 방식으로 및 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 주사가능한 용액, 약물-방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다. 어구 "제약상 허용되는"은 숙주에게 투여되는 경우에 알레르기 또는 유사한 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다.
본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주 세포 내에 도입하기 위해 전달 비히클, 예컨대 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로구체, 지질 입자, 소포 등이 사용될 수 있다. 특히, 핵산은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 전달하기 위해 제제화될 수 있다.
이러한 제제는 본원에 개시된 핵산의 제약상 허용되는 제제의 도입을 위해 바람직할 수 있다. 리포솜의 형성 및 사용은 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 최근에, 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖는 리포솜이 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 추가로, 잠재적인 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 기재되었다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
리포솜은 다른 절차에 의한 형질감염에 대해 통상적으로 저항성을 갖는 다수의 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되었다. 추가로, 리포솜에는 바이러스-기반 전달 시스템에 전형적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 약물, 방사선요법제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터를 다양한 배양된 세포주 및 동물 내에 도입하기 위해 효과적으로 사용되었다. 추가로, 리포솜-매개 약물 전달의 유효성을 조사하는 여러 성공적인 임상 시험이 완결되었다.
리포솜은 수성 매질 중에 분산된 인지질로부터 형성되고, 다층 동심원 이중층 소포 (또한 다층 소포 (MLV)로도 명명됨)를 자발적으로 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어에 수용액을 함유하는, 직경이 200 내지 500 ANG. 범위인 소형 단층 소포 (SUV)의 형성을 유발한다.
일부 실시양태에서, 리포솜은 양이온성 지질을 포함한다. 용어 "양이온성 지질"은 극성 및 비극성 도메인 둘 다를 갖는 지질 및 합성 지질을 포함하며, 이는 생리학적 pH 또는 그 근처에서 양으로 하전될 수 있고, 다가음이온, 예컨대 핵산에 결합하여 세포 내로의 핵산의 전달을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 아민, 아미드 또는 그의 유도체의 포화 및 불포화 알킬 및 지환족 에테르 및 에스테르를 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 직쇄, 분지형 알킬, 알케닐 기, 또는 상기 중 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 1 내지 약 25개의 탄소 원자 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 탄소 원자)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 25개 초과의 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄 기는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 양이온성 지질은 또한, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 지환족 기를 포함할 수 있다. 지환족 기의 비제한적 예는 콜레스테롤 및 다른 스테로이드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 양이온성 지질은 1개 이상의 반대이온으로 제조된다. 반대이온 (음이온)의 예는 Cl-, Br-, I-, F-, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 술페이트, 니트라이트, 및 니트레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
양이온성 지질의 비제한적 예는 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 별형 덴드리머, 리포펙틴 (DOTMA 및 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)™ (예를 들어, 리포펙타민™ 2000), DOPE, 시토펙틴 (길리아드 사이언시스, 캘리포니아주 포스터 시티), 및 유펙틴 (JBL, 캘리포니아주 샌 루이스 오비스포)을 포함한다. 예시적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3,-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)로부터 제조될 수 있다. 핵산 (예를 들어, ceDNA)은 또한, 예를 들어 폴리 (L-리신) 또는 아비딘과 복합체화될 수 있고, 지질은 이 혼합물에 포함되거나 (예를 들어, 스테릴-폴리 (L-리신)) 또는 포함되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 미국 특허 번호 8,158,601에 기재된 양이온성 지질, 또는 미국 특허 번호 8,034,376에 기재된 바와 같은 폴리아민 화합물 또는 지질을 사용하여 전달되며, 상기 문헌 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 접합된다 (예를 들어, 공유 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 가로질러 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친지성 화합물 (예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 관통 펩티드 (CPP) (예를 들어, 페네트라틴, TAT, Syn1B 등), 및 폴리아민 (예를 들어, 스페르민)에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가의 예는, 예를 들어 문헌 [Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 중합체 (예를 들어, 중합체 분자) 또는 폴레이트 분자 (예를 들어, 폴산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,987,377에 의해 기재된 바와 같이, 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 미국 특허 번호 8,507,455에 기재된 바와 같이 폴산 분자에 접합되며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,450,467에 기재된 바와 같이, 탄수화물에 접합되며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
대안적으로, 핵산의 나노캡슐 제제가 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 물질을 안정하고 재현가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는, 예를 들어 문헌 [Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507]에 개시된 바와 같이, 이온화가능한 아미노 지질 (예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질 (폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 300 nm 미만인 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 300 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 200 nm 미만인 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 약 25 내지 약 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자 제제 (예를 들어, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는 평균 크기 (예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 보다 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 핵산은 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어 문헌 [Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083]에 의해 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유 결합될 수 있거나 또는 금 나노입자에 비-공유 결합 (예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합)될 수 있다. 일부 실시양태에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,812,334에 기재된 방법을 사용하여 제조되며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
상기 기재된 전달 방법에 추가로, 하기 기술이 또한 핵산 조성물을 숙주에게 전달하는 대안적 방법으로서 고려된다. 초음파영동 (예를 들어, 초음파)은 순환계 내로의 및 순환계를 통한 약물 투과의 비율 및 효능을 증진시키기 위한 장치로서 사용되었고 미국 특허 번호 5,656,016에 기재되었다. 고려되는 다른 약물 전달 대안은 골내 주사 (미국 특허 번호 5,779,708), 마이크로칩 장치 (미국 특허 번호 5,797,898), 안과용 제제 (Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스 (미국 특허 번호 5,770,219 및 5,783,208) 및 피드백-제어 전달 (미국 특허 번호 5,697,899)이다.
전달/투여
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 세포 (예를 들어, 숙주 세포)에 전달하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. "숙주 세포"는 관심 물질을 보유하거나 또는 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산의 수용자로서 사용될 수 있다. 이러한 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열 (예를 들어, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산)로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해, 원래 모와 형태에 있어서 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체에 있어서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 허용 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 허용 세포가 아니다. 종종 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 갖는 숙주 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산 (예를 들어, 혈액 질환-연관 트랜스진을 코딩하는 이종 핵산 삽입물을 갖는 핵산)을 포함하는 혈액 세포, 예컨대 인간 혈액 세포이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 이러한 숙주 세포의 전달은, 일부 실시양태에서, 혈액의 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
본 개시내용의 측면은 본원에 기재된 바와 같은 핵산이 현재 사용되는 바이러스 및 박테리아-유래 유전자 요법 벡터에 비해 숙주에서 감소된 면역 반응을 도출한다 (예를 들어, 면역 반응을 도출하지 않는다)는 발견에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산을 대상체에게 전달하는 것을 포함하며, 여기서 핵산의 전달은 대상체에서 핵산에 대한 면역 반응을 도출하지 않는 것인, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 체액성 반응이다. 체액성 면역 반응은 B 림프구에 의한 항원-특이적 항체의 생산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 세포성 반응이다. 세포성 면역 반응은 항체를 포함하는 것이 아니라 오히려 항원 (예를 들어, 외인성 핵산)에 의한 면역 세포 (예를 들어, 식세포, 항원-특이적 T-세포, 대식세포, 자연 킬러 세포 등)의 활성화를 포함하는 면역 반응을 지칭한다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 핵산의 투여에 의해 도출된 면역 반응의 결여는 핵산이 숙주에게 다수회 투여되도록 한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 횟수는 2 내지 10회의 범위 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회)이다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 대상체에게 10회 초과로 전달된다.
일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 역일 (예를 들어, 24-시간 기간)당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 역일당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 역주 (예를 들어, 7 역일)당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA는)의 용량은 대상체에게 2주 이하마다 (예를 들어, 2 역주 기간에 1회) 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 역월당 1회 이하로 (예를 들어, 30 역일에 1회) 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 6 역월당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, ceDNA)의 용량은 대상체에게 역년 (예를 들어, 365일 또는 윤년 366일)당 1회 이하로 투여된다.
본원에 개시된 바와 같은 핵산 (이들을 발현하는데 사용될 수 있는 DNA 발현 구축물을 포함함)은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 요법에 사용하기 위해, 유효량의 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 및/또는 다른 치료제는 작용제를 목적하는 조직, 예를 들어 근육 조직에 전달하는 임의의 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제 (예를 들어, 핵산)는 근육내로 투여된다. 다른 적합한 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥내, 복강내, 비강내, 설하, 기관내, 흡입, 피하, 안구, 질 및 직장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전신 경로는 경구 및 비경구를 포함한다. 여러 유형의 장치가 흡입에 의한 투여를 위해 정기적으로 사용된다. 이들 유형의 장치는 계량 용량 흡입기 (MDI), 호흡-작동식 MDI, 건조 분말 흡입기 (DPI), MDI와 조합된 스페이서/홀딩 챔버, 및 네뷸라이저를 포함한다.
경구 투여를 위해, 작용제는 관련 기술분야에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체와 활성 화합물(들)을 조합함으로써 용이하게 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 본 개시내용의 작용제를 치료될 대상체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화되게 할 수 있다. 경구 사용을 위한 제약 제제는 고체 부형제로서 수득될 수 있으며, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득한다. 적합한 부형제는, 특히 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 포함한 당; 셀룰로스 제제, 예컨대, 예를 들어 메이즈 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 원하는 경우에, 붕해제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다. 임의로 경구 제제는 또한 내부 산 조건을 중화시키기 위한 염수 또는 완충제 중에서 제제화될 수 있거나, 또는 임의의 담체 없이 투여될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 만들어진 푸시 피트 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질의 밀봉된 캡슐을 포함한다. 푸시 피트 캡슐은 활성 성분을 충전제, 예컨대 락토스, 결합제, 예컨대 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성제는 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해 또는 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위해 제제화된 마이크로구체가 또한 사용될 수 있다. 이러한 마이크로구체는 관련 기술분야에 널리 정의되었다. 경구 투여를 위한 제제는 전형적으로 이러한 투여에 적합한 투여량의 것이다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 작용제 (예를 들어, 핵산)는 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 스프레이 제공물의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제제화될 수 있다.
작용제 (예를 들어, 핵산)는, 이들을 전신 전달하는 것이 바람직한 경우에, 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는, 예를 들어 앰플 또는 다중-용량 용기 내에 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제제는 수용성 형태의 작용제 (예를 들어, 안티센스 핵산)의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 작용제의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 가능하도록 작용제의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 작용제 (예를 들어, 핵산)는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원 무함유 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 작용제 (예를 들어, 핵산)는 또한, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 베이스를 함유하는 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 또는 질 조성물로 제제화될 수 있다.
다른 전달 시스템은 시한-방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 작용제 (예를 들어, 안티센스 핵산)의 반복 투여를 피하여 대상체 및 의사에 대한 편의성을 증가시킬 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하다. 이들은 중합체 기반 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프롤락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및 폴리무수물을 포함한다. 전달 시스템은 또한 다음인 비-중합체를 포함한다: 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노, 디 및 트리 글리세리드를 포함한 지질; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드-기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용하는 압축 정제; 부분적으로 융합된 이식물; 및 본원에 개시된 다른 것.
실시예
실시예 1: 개재 자기-상보적 핵산 서열
도 1a는 개재 자기-상보적 핵산 서열 (이는 AAV2 ITR임)의 비제한적 예를 보여준다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 핵산은 스템 부분 (D-A-A') 및 대향하는 길이방향 스템-루프 (B-B' 및 C-C')를 갖는 크로스-아암 서열을 갖는 T-형상 헤어핀 구조를 형성한다. 개재 자기-상보적 핵산 서열의 trs 및 RBE가 또한 도시된다. 도 1b는 개재 자기-상보적 핵산 서열의 "C-아암"에서 말단절단의 여러 비제한적 예를 보여준다. 비대칭 AAV2 ITR의 한 예의 그래프 도시가 도 3에 제시된다.
비대칭 AAV ITR로부터의 ceDNA의 복제
아데노-연관 바이러스 (AAV) 게놈은 전형적으로 역전된 말단 반복부 (ITR)로 지칭되는 말단 팔린드롬이 플랭킹된 선형 단일-가닥 DNA이다 (도 2a, 좌측). 7개의 쌍형성되지 않은 염기를 제외하고, 145개 nt ITR 서열은 자기-상보적이고, 에너지적으로 안정한 "T" 형상 헤어핀을 형성한다 (ΔG
Figure pct00013
-72.4 kcal/mol, Tm >80℃) (도 1a). 바이러스 DNA 복제 동안, 세포 DNA 폴리머라제 복합체는 주형 가닥의 3'-말단에서 합성을 개시하며, 여기서 ITR에 의해 형성된 부분적 듀플렉스는 프라이머 연장을 위한 프라이머로서의 역할을 한다. 형성된 복제 중간체는 주형과의 분자내 듀플렉스이고, 신생 가닥은 ITR에 의해 공유 연결된다. 생산성 감염 동안, 말단 분해로 불리는 과정은 가닥내 ITR을 분해하여 2개의 전장 상보적 바이러스 게놈을 생성한다 (도 2b, 좌측).
AAV cap 유전자 발현의 부재 하에, 비대칭 ITR을 갖는 AAV 벡터 게놈은 비효율적 복제를 겪고, 복제 산물은 폐쇄형-말단 선형 듀플렉스 DNA (ceDNA)의 신규 입체형태로 축적된다. 비효율적 복제 (예를 들어, 불완전 말단 분해)로 인해, 분자내 중간체의 상보적 가닥은 게놈의 두 말단 상의 ITR을 통해 지금 공유 연결된다 (도 2b, 우측). 따라서, 천연 조건에서 ceDNA는 선형 듀플렉스 DNA로서 거동하지만, 변성 조건에서 ceDNA 가닥은 떨어져 용융되나 연결된 채로 남아있어, 선형 듀플렉스 분자를 단일-가닥 원형 DNA로 변환시킨다.
일부 실시양태에서, 비대칭 AAV ITR로부터의 ceDNA 생산은 하나의 말단 상의 말단절단 ITR 및 트랜스진 카세트의 대향하는 말단 상의 작동적 (예를 들어, 기능적) 야생형 (wt) 또는 wt-유사 ITR에 좌우된다. 일부 실시양태에서, 말단절단 ITR은 Sf9 세포에서 ceDNA의 복제 주기 동안 비효율적으로 프로세싱되어 복제 중간체, 듀플렉스 단량체, 듀플렉스 이량체 등의 축적을 유도한다. 구조 (캡시드) 단백질 발현의 부재 하에, Rep 78 (또는 Rep 68)은 무손상 ITR 상에서 조립되고, 말단 분해 부위에서 부위-특이적 니킹을 촉매한다. 반응은 일시적 티로신-포스포디에스테르의 형성을 유발한다 (말단 분해 부위 5'AGTTGG의 5' 티미딘에 공유 연결된 AAV2 Rep 78의 경우 Y156). 이어서, 일시적 핵단백질 복합체는 공여자 가닥을 상보적 가닥의 유리 3'-말단으로 전달한다. 따라서, ceDNA 입체형태는 벡터 게놈의 하나의 말단 상의 결함있는 ITR, 대향 말단 상의 무손상 또는 작동적 ITR, 및 p5 및 p19 Rep 단백질의 공동-발현 (여기서 적어도 하나의 p5 및 하나의 p19 Rep가 발현됨)으로부터 생성된다. 다른 파르보바이러스 "소형" Rep 또는 NS 단백질은 AAV p19 Rep 단백질을 대체할 수 있다 (Rep 52 및 Rep 40). 이들 소형 Rep 단백질은 비-진행성, 단량체 헬리카제이므로, 비-파르보비리다에 슈퍼 패밀리 2 (SF2) 헬리카제가 AAV Rep 단백질을 대체할 수 있는 것이 실현가능하다.
디펜도비리나에는 수천만년 (및 가능하게는, 수억년) 동안 비교적 변화하지 않고 존재하였다. 이들은 그의 숙주와의 항상성 또는 공생 관계를 발달시켜왔으며, 여기서 잠복 감염 세포 내 프로바이러스는 종종 인간 염색체 19q 상의 AAVS1 유전자좌로 국재화하며, 이는 숙주 세포에 대한 어떠한 유해 효과도 나타내지 않는 것으로 가설화되어 있다. 잠복 동안, AAV 유전자 발현은 세포 인자, 예를 들어 YY1에 의해, 및 서보기구로 작용하며 p5 및 p40 프로모터로부터의 발현을 음성 조절하는 p5 Rep 단백질에 의해 억제된다. 따라서, 잠복 감염 세포는 검출가능한 AAV 단백질을 거의 또는 전혀 갖지 않고, 바이러스 단백질을 합성하고 있는 세포에 대한 후천성 면역 반응을 제한한다.
실시예 2: ceDNA의 정제
플라스미드 정제 프로토콜은 전형적으로 적은 플라스미드 양 제제에 대해서는 실리카 겔을 이용하거나 또는 더 많은 양에 대해서는 음이온 교환 크로마토그래피 디에틸아미노에틸 세파로스 (예를 들어, DEAE-세파로스)를 이용한다. 대규모 pDNA 정제를 위해, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아를 소듐 도데실 술페이트 (SDS)로 용해시키고, 세포 단백질 및 게놈 DNA를 용액 중 플라스미드를 유지하는 변성 / 중화 주기에 의해 침전시킨다. 재생된 이중-가닥 pDNA는 양으로 하전된 DEAE 기에 결합하며, 세척 단계 후에, pDNA를 고 염 완충제 용액으로 이탈 및 용리시킨다. 대안적으로, 실리카 겔 막은 고 염 조건 하에 정화된 박테리아 용해물로부터의 선택적 pDNA 흡착에 사용되고 저 또는 무 등장성 완충제로 용리될 수 있다.
ceDNA는 소규모 실리카 겔-기반 방법에 의해 용이하게 정제될 수 있는 것으로 관찰되었다. 대규모 음이온 교환 프로토콜을 사용하였을 때, ceDNA 회복은 매우 비효율적이고 저수율을 유발하였다.
실리카 겔 막을 사용하는 무척추동물 Sf9 세포로부터의 대규모 ceDNA 정제 방법이 기재된다. 변형된 실리카 겔 막 (또는 크로마토그래피 매질)의 표면적을 증가시키는 것은 ceDNA의 유량, 흡착 및 회복을 개선시키기 위한 하나의 접근법이다. 표준 필터 캡슐은 0.5 cm 직경 내지 20 cm 직경 또는 그 초과 범위의 크기의 광범위한 구성에 이용가능하다. 캡슐은 화학적으로 불활성인 지지체 상의 실리카 겔 막의 단일 층, 또는 불활성 지지체에 의해 분리되어 있는 막의 스택, 또는 수평 유동 설계를 이용하는 주름형 막을 함유할 수 있다. 접선 유동 여과 (TFF) 및 중공 섬유 여과 (HFF)는 동축 유동 캡슐 여과에 대한 대안이다.
실시예 3: 질환의 치료를 위한 ceDNA 구축물
도 4는 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 안구 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다. 도 4의 제1 핵산 구축물은 스타르가르트병의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 A (ABC1), 멤버 4 (ABCA4) 단백질을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 hB글로빈 인트론 2, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 hGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 4에서의 제2 핵산 구축물은 어셔병의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 어셔린 단백질 (USH2A) 변이체 1을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 4에서의 제3 핵산 구축물은 황반 변성/신생혈관화의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 4에서의 제4 핵산 구축물은 레베르 선천성 흑암시의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 중심체 단백질 290 (CEP290)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 5는 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 혈액 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다. 도 5에서의 제1 핵산 구축물은 A형 혈우병의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 B-도메인 결실된 인자 VIII 단백질 (BDD-FVIII)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 5에서의 제2 핵산 구축물은 A형 혈우병의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 전통적인 AAV 벡터의 클로닝 용량을 초과하는, 전장 인자 VIII 단백질 (FVIII)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 5에서의 제3 핵산 구축물은 폰 빌레브란트 인자 질환의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 폰 빌레브란트 인자 (vWF)를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 6은 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 간 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다. 도 6에서의 제1 핵산 구축물은 고콜레스테롤혈증의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 레시틴 콜레스테롤 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 6에서의 제2 핵산 구축물은 페닐케톤뇨 (PKU)의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 페닐알라닌 히드록실라제 (PAH)를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 6에서의 제3 핵산 구축물은 글리코겐 축적 질환 1 (GSD1)의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 글루코스 6-포스파타제 촉매 서브유닛 (G6PC)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 7은 비대칭 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, AAV2 ITR) 및 폐 질환과 연관된 트랜스진을 갖는 핵산 구축물의 비제한적 예를 보여준다. 도 7에서의 제1 핵산 구축물은 낭성 섬유증의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR)를 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
도 7에서의 제2 핵산 구축물은 알파-1 항트립신 결핍의 치료를 위한 핵산 분자의 비제한적 예를 도시한다. 핵산은 알파-1 항트립신 (AAT)을 코딩하는 이종 핵산 삽입물에 플랭킹된 한 쌍의 비대칭 개재 자기-상보적 핵산 서열 (예를 들어, 비대칭 AAV2 ITR)을 포함한다. AAV2 ITR은 AAV2 ITR 중 하나 (우측)가 C-스템 영역에 결실을 함유하기 때문에 비대칭이다. 각각의 개재 자기-상보적 핵산 서열은 작동적 Rep-결합 요소 (RBE) 및 작동적 말단 분해 부위 (trs)를 포함한다. 핵산은 또한 이종 핵산 삽입물에 대해 5'에 위치하는 CMV 프로모터/인핸서 및 T7 프로모터, 및 이종 핵산 삽입물에 대해 3'에 위치하는 bGH 폴리(A) 신호를 코딩한다.
실시예 4: 생체내 연구: 정상 수컷 ICR 마우스에서의 네이키드 DNA의 유체역학적 전달
pDNA를 마우스 꼬리 정맥 내에 주입한 후, lacZ 발현은 이배체 게놈당 pDNA의 양에 상응하게, 24시간 내지 5주에 연속적으로 감소하였다. 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 ceDNA로 처리된 마우스 간은 24시간 내지 1주에 lacZ 활성의 어떠한 변화도 나타내지 않았지만, 발현은 5주에 실질적으로 감소하였다. 그러나, 간세포에서의 ceDNA는 5주 시점에 본질적으로 변화하지 않고 남아있었다. 티록신 결합 글로불린 프로모터 (TBG) GFP 카세트에서 유사한 결과를 얻었다: GFP 발현 및 pDNA는 10주 후에 거의 또는 전혀 검출가능하지 않았으며, 반면에 ceDNA TBG-GFP 발현 및 DNA 수준은 1 내지 10주에 변화하지 않고 남아있었다.
실시예 5: ceDNA의 안구 전달
직접적 GFP 형광이 망막의 폭에 걸쳐있는 세포에서 균일하게 관찰되었다. 도 8a-8d는 비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 ceDNA의 안구로의 전달을 보여준다. 성체 마우스를 케타민/크실라진 (100/10 mg/kg)에 의해 마취하고, 형질감염제를 1-2 μl 부피의 경공막 주사에 의해 유리체내로 전달하였다. 마우스가 회복되는 동안에 항생제 연고를 각막에 도포하여 안구가 건조되는 것을 방지하였다. 마우스가 37도에서 회복되도록 한 다음, 2주 동안 마우스 방 안에 다시 넣고, CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 망막을 박리하고, 편평 탑재물 또는 절편이 되도록 처리하였다. 형질감염된 세포를 검출하는데 어떠한 GFP 항체 염색도 필요하지 않았다. 도 8a는 마우스 망막 상의 GFP 형광의 편평 탑재물을 보여준다. 도 8b는 망막의 단면에서의 GFP 형광을 보여준다. 도 8c는 망막의 단면에서의 GFP 형광 및 신경교 세포 염색을 보여준다. 도 8d는 망막하 전기천공 (상부) 및 유리체내 주사 (하부)에 의한 ceDNA의 전달 후에 마우스 망막에서의 GFP 형광을 보여준다.
실시예 6: 생체내 연구: 래트에서의 선조체내 전달
ceDNA-GFP (비대칭 개재 자기-상보적 서열을 갖는 ceDNA)를 적절한 농도 하에 상업적으로 입수가능한 형질감염 시약, 생체내 jetPEI (폴리플러스 코포레이션)로 제제화하고, 래트 선조체 내에 두개내로 주사하였다 (도 9a). 래트를 주사후 3주 및 20주에 희생시키고, 처리 후, 뇌 절편을 GFP, MHCII 및 Iba1에 대한 항체 (Ab)에 의한 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 검사하였다. 3주 및 20주에 유사한 GFP 발현이 관찰되었다. 도 9b-9c에 제시된 바와 같이, 3주에서는 뇌 절편에서 어떠한 MHCII 또는 Iba1 항원도 검출되지 않았다.
실시예 7: ceDNA를 생산하기 위한 Sf9 감염
바크미드로의 전위
DH10Bac 적격 세포 (인비트로젠)를 얼음 상에서 해동시켰다. 50 μl의 세포를 14 ml 튜브 내로 분배하고, 50ng의 플라스미드 DNA (예를 들어, 비대칭 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 단백질-코딩 트랜스진을 포함하는 플라스미드)를 첨가하고, 완만히 혼합하였다. 본 실시예에 기재된 플라스미드의 DNA 서열은 서열식별번호: 25로 나타내어진다. 비대칭 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 단백질-코딩 트랜스진을 포함하는 플라스미드의 영역의 DNA 서열은 서열식별번호: 26으로 나타내어진다.
플라스미드 DNA 개재 자기-상보적 서열의 서열 분석은 도 10a-10b에 제시된다. 5' 자기-상보적 서열 (트랜스진의 코딩 서열의 상류인 헤드 부분으로 지칭됨)은 도 10a에 제시된다. 이것을 플라스미드 구축물의 CMV 프로모터와 상보적인 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 도 10a는 5' 자기-상보적 서열의 영역에서 플라스미드의 제한 맵을 보여준다. 2회 실행의 플라스미드 서열 결과가 야생형 AAV2 ITR 서열인 참조 서열과 정렬되어 있다.
3' 자기-상보적 서열 (트랜스진의 코딩 서열의 하류인 테일 부분으로 지칭됨)은 도 10b에 제시된다. 이것을 플라스미드 구축물의 SV40 프로모터와 상보적인 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 도 10b는 3' 자기-상보적 서열의 영역에서 플라스미드의 제한 맵을 보여준다. 2회 실행의 플라스미드 서열 결과가 야생형 AAV2 ITR 서열인 참조 서열과 정렬되어 있다. 결과는 자기-상보적 서열 내의 말단절단이 크로스-아암 구조의 하나의 아암에 상응함을 제시한다.
이들 결과는 플라스미드 DNA 구축물이 비대칭 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 트랜스진을 코딩한다는 것을 확인시켜 준다. 5' 자기-상보적 서열은 완전한 크로스-아암을 코딩하고; 반면에 3' 자기-상보적 서열은 말단절단 크로스-아암을 코딩하기 때문에, 비대칭이 일어난다.
이어서, 튜브를 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 다음, 45초 동안 42℃ 수조에서 열 충격을 가하였다. 이어서, 튜브를 2분 동안 얼음 상에서 냉각시켰다. 450 μl의 SOC 매질을 튜브에 첨가하고, 이들을 4시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 진탕시켰다. 분취물을 1:10 희석하고, 50 μl를 50 μg/ml 카나마이신, 7 μg/ml 겐타미신, 10 μg/ml 테트라시클린, 100 μg/ml 블루오-갈 및 40 μg/ml IPTG를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 또는 30℃에서 72시간 인큐베이션하였다. 단일 백색 콜로니를 고르고, 새로운 플레이트 상에 스트라이킹하여 그것이 청색 콜로니로 오염되지 않았다는 것을 확실히 한 다음, 밤새 인큐베이션하였다. 글리세롤 스톡을 생성하였다.
바크미드로부터의 DNA 제조
바크미드를 50 μg/ml 카나마이신, 7 μg/ml 겐타마이신, 10 μg/ml 테트라시클린을 갖는 10 ml LB 배지 내에서 인큐베이션하고, 밤새 37℃ 진탕 인큐베이터에서 성장시켰다. 배양물을 10분 동안 8000 rpm으로 스핀 다운시켰다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 퀴아젠 추출 키트로부터 1.5 ml의 P1 완충제 중에 재현탁시켰다. 1.5ml의 완충제 2를 첨가하고, 튜브를 4-6회 반전시켰다. 2.1 ml의 완충제 P3을 첨가하고, 튜브를 4-6회 반전시켰다. 침전제를 퀴아젠 시린지 필터에 통과시키고, 10분 동안 8000 rpm으로 원심분리하였다. 청정 용해 용액을 5 ml의 이소프로판올을 함유하는 튜브로 옮기고, 잘 혼합하고, 최대 속도로 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 3 ml의 70% 에탄올을 첨가하여 펠릿을 세척하였다. 이어서, 펠릿을 10분 동안 8000 rpm으로 스핀시켰다. 이어서, 펠릿을 세척하고 공기 건조시켰다. 이어서, DNA를 200 μl TE 완충제 중에 재현탁시켰다. 분취물을 제거하고, 260 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 판독하여 DNA 농도를 정량화하였다.
P1 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)의 생산
총 4x106개 Sf9 세포를 T25 TC 플라스크 내 5 ml의 배지에 시딩하였다. 플라스크를 세포가 균일하게 분포되도록 세포 부착 동안 수평 표면 상에 놓았다. 일반적으로, 세포는 15분 이내에 부착된다. 1 μg의 바크미드 DNA를 75 μl의 물 중에 희석하였다. 6 μl의 프로메가 퓨진 HD를 별개의 튜브 내 69 μl의 물 중에 희석하였다. 희석된 퓨진 HD를 희석된 DNA와 수회 상하로 피펫팅하여 혼합하였다. 15분 후에, DNA/지질 복합체를 Sf9 세포에 첨가하였다. P1 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)를 4일 후에 수거하였다. 간단히, 모든 배지를 5 ml 피펫을 사용하여 플라스크로부터 제거하고, 15 ml 폴리스티렌 튜브로 옮겼다. 용기를 10분 동안 1200 g로 스핀시켜 골라내었을 수 있는 임의의 세포 또는 파편을 펠릿화하였다. BEV를 새로운 15 ml 튜브 내로 경사분리하고, 바이러스를 4℃에서 저장하였다.
바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 (Biic)의 생산
50 ml의 Sf9 세포를 1 ml의 BEV로 (1:50) 2.5 x 106개 세포/ml의 농도로 감염시켰다. 세포를 계수하고, 그의 직경을 제1일에 체크하고 (예를 들어, 세포 수가 2x106개/ml에 도달하는지 및 세포가 ~15-16 μm 직경으로 측정되는지 확인하기 위해 체크함), 제2일에 체크하였다 (예를 들어, 세포 수가 4-5x106개 세포/ml에 도달하는지 및 직경이 ~18-19 μm로 측정되는지 확인하기 위해 체크함). 세포가 감염된 것으로 보일 때 이를 5분 동안 300 xg로 스핀 다운시켰다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 20 x107개 세포/ml의 최종 농도를 갖도록 동결 배지 중에 재현탁시켰다. 세포는 저장을 위해 이소프로판올과 함께 랙에 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
타이터리스 감염 바큘로바이러스 스톡 (TIPS)에 대한 감염성의 시험 효율
2.5x106개 세포/ml의 20 ml의 4개 플라스크를 준비하였다. 세포를 타이터리스 감염 바큘로바이러스 스톡 (TIPS)의 4가지 상이한 희석물, 예를 들어 1/1,000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 감염시켰다. 세포를 성장시키고, 직경, 생존율 및 세포 수를 3일 동안 평가하였다. TIPS의 효율을 결정하기 위해 어느 희석물이 3일 후에 하기 기준에 도달하였는지 스톡을 체크하였다: 생존 세포 4 내지 5 x105개 세포/ml, 생존율 85 내지 95%, 직경 18 내지 20 μm.
ceDNA의 생산:
2.5 x106개 세포/ml Sf9 세포를 Rep 단백질 및 관심 트랜스진 (예를 들어, GFP)에 대한 TIPS로 공동-감염시켰다. 4-5일 후 세포를 직경 및 생존율에 대해 관찰하였다. 펠릿의 세포를 30분 동안 4150 rpm으로의 원심분리에서 스핀 다운시킴으로써 수집하였다. 이어서, 세포를 동결시키거나, 또는 ceDNA를, 예를 들어 퀴아젠 미디 플러스 정제 프로토콜에 의해 추출하였다.
ceDNA의 분석
ceDNA를 제한 소화 하에, 천연 겔 전기영동 및/또는 변성 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 예를 들어 ITR 사이에 ceDNA 서열 대략 2/3로의 단일 절단 제한 효소를 선택하였으며, 생성된 제한 소화 산물을 아가로스 겔 상에서 전개시켰다.
도 10c는 GFP 트랜스진을 포함하는 ceDNA (ceDNA-GFP)의 ~4.5 kb를 단일-커터 XhoI를 사용한 소화 후, 천연 (좌측) 및 변성 (우측) 조건 하에 상이한 이형태체 (예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체 등)로 전기영동 분리한 것을 보여준다.
천연 겔 (도 10c, 좌측) 상에서, 단량체는 2개의 산물로 분해되었다: 2.1 kb 및 0.4 kb. 이량체는 이량체 서브유닛의 배향 (예를 들어, 테일-대-테일, 또는 헤드-대-헤드)에 따라 4.1 kb/0.4 kb 산물, 또는 4.1 kb/0.8 kb 산물로 분해되었다. 이량체의 테일-대-테일 조직화로부터 기인하는 산물은 아래를 가리키는 화살표에 의해 나타내었다. 0.4 kb 말단 단편은 겔의 하부에서 불순물의 형광에 의해 가려졌다. 위를 바라보는 화살표는 헤드-대-헤드 이량체로부터 기인하는 산물을 나타낸다. 두꺼운 선은 말단절단 ITR의 위치를 나타낸다. 단량체에서, 결실된 ITR은 ceDNA 분자의 우측 상에 있었고, 테일-대-테일 이량체에서, 말단절단 ITR은 내부에 있었다 (거울 면에서). 헤드-대-헤드 입체형태에서, 말단절단 ITR은 분자의 말단에 있을 것이다.
변성 겔 (도 10c, 우측) 상에서, 이량체 ceDNA-GFP는 4.1 kb 및 0.8 kb에서의 밴드를 생성하였다 (이는 변성된 0.4 kb 말단 산물이 0.8 kb 단일-가닥 DNA로서 겔 상에서 전개된 것과 상관관계가 있음). 상기 기재된 바와 같이, 헤드-대-헤드 ceDNA-GFP 이량체에 대한 예측된 산물은 천연 겔 상에서 0.8 kb 및 4.1 kb였고, 변성 겔 상에서 0.8 kb 및 8.2 kb였다. 변성 겔은 8.2 kb에서 어떠한 밴드도 나타내지 않으며, 따라서 ceDNA-GFP 이량체의 우세한 형태가 테일-대-테일이었다는 것을 나타낸다.
본 발명의 여러 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/거나 본원에 기재된 결과 및/또는 1종 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적 적용 또는 적용들에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험에 지나지 않는 것을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제공되고, 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 범주 내에서 본 발명은 구체적으로 기재 및 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법 중 둘 이상의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는다면, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수 용어는 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 결합된 요소, 즉, 일부 경우에는 결합하여 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다른 요소는, 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소와 유관하든 무관하든, "및/또는" 어구에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외에 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, 한 실시양태에서, B가 없는 A (임의로 B 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시양태에서, A가 없는 B (임의로 A 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B를 둘 다 (임의로 다른 요소를 포함); 등을 지칭할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우에, "또는" 또는 "및/또는"은 포함의 의미로, 즉 다수의 또는 목록의 요소 중, 적어도 하나의 포함, 뿐만 아니라 하나 초과, 및 임의로, 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석될 것이다. "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나" 또는 청구항에서 사용될 때 "로 이루어진"과 같이 달리 명백하게 나타낸 용어만이 다수의 또는 목록의 요소 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배제적 용어가 사용될 때에만 배제적 대안 (즉, "하나 또는 나머지 하나, 그러나 둘 다는 제외")을 나타내는 것으로 해석될 것이다. "로 본질적으로 이루어진"이 청구범위에 사용된 경우에, 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 통상의 의미를 가질 것이다.
하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에 있는 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하나, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것이 아님을 이해해야 한다. 이러한 정의는 또한 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소의 목록 내에 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 이들 구체적으로 확인된 요소와 유관하든 무관하든 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A (및 임의로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 A 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "가지는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는" 등은, 개방형인 것으로, 즉, 포함하나 이에 제한되지는 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다만 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌 [United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03]에 기재된 바와 같이, 각각 폐쇄형 및 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.
청구항에서 "제1," "제2," "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구항 요소를 수식하는 것은 그 자체에 의해 한 청구항 요소의 또 다른 하나의 청구항 요소에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법의 행위를 수행하는 일시적인 순서를 내포하는 것이 아니라, 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를 (서수 용어 사용을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구항 요소를 구별하기 위한 라벨로만 사용된 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Massachusetts <120> CLOSED-ENDED LINEAR DUPLEX DNA FOR NON-VIRAL GENE TRANSFER <130> U0120.70077WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2017-03-03 <150> US 62/303,046 <151> 2016-03-03 <150> US 62/394,720 <151> 2016-09-14 <150> US 62/406,913 <151> 2016-10-11 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 gctcgctcgc tc 12 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 4 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg 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tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc 7080 ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga 7140 gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca 7200 cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtc 7255 <210> 26 <211> 2651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 26 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt 180 agccatgctc tagagcggcc gcacgcgtac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 240 attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 300 tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 360 aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 420 cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 480 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 540 gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 600 tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 660 tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 720 cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg 780 tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag 840 acaccgggac cgatccagcc tccgtaccgg ttcgaacagg taagcgcccc taaaatccct 900 ttgggcacaa tgtgtcctga ggggagaggc agcgacctgt agatgggacg ggggcactaa 960 ccctcaggtt tggggcttct gaatgtgagt atcgccatgt aagcccagta tttggccaat 1020 ctcagaaagc tcctggtccc tggagggatg gagagagaaa aacaaacagc tcctggagca 1080 gggagagtgc tggcctcttg ctctccggct ccctctgttg ccctctggtt tctccccagg 1140 ttcgaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctca atcggaccga 1200 aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattccccg gagttaatcc 1260 gggaccttta attcaaccca acacaatata ttatagttaa ataagaatta ttatcaaatc 1320 atttgtatat taattaaaat actatactgt aaattacatt ttatttacaa tcaaaggaga 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Claims (69)

  1. 적어도 1개의 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 제2 개재 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 방법.
  3. 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개재 자기-상보적 서열(들)이 40 내지 1000개 뉴클레오티드 범위의 길이인 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 개재 자기-상보적 서열(들)이 100 내지 160개 뉴클레오티드 범위의 길이인 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 크로스-아암 서열이 -12 kcal/mol 내지 -30 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는 것인 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 크로스-아암 서열이 -20 kcal/mol 내지 -25 kcal/mol 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는 것인 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프가 3 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는 것인 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프가 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분을 갖는 것인 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 루프 부분이 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 루프 부분이 3개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 루프 부분이 3개의 데옥시티미딘을 갖고 다른 루프 부분이 3개의 데옥시아데노신을 갖는 것인 핵산.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소가 Rep 결합 요소 (RBE)인 핵산.
  14. 제13항에 있어서, RBE가 서열 5'-GCTCGCTCGCTC-3'를 포함하는 것인 핵산.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 작동적 말단 분해 부위가 서열 5'-TT-3'를 포함하는 것인 핵산.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 작동적 말단 분해 부위의 3' 말단이 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소의 5' 말단으로부터 15 내지 25개의 뉴클레오티드인 핵산.
  17. 제2항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 말단절단 크로스-아암 서열이 2개의 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프를 형성하는 것인 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 대향하는 길이방향-비대칭 스템-루프 중 하나가 8 내지 10개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 핵산.
  19. 제18항에 있어서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프가 8개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프가 3개 미만의 염기 쌍의 길이의 스템 부분을 갖는 것인 핵산.
  21. 제18항에 있어서, 하나의 길이방향-비대칭 스템-루프가 3개 이하의 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 핵산.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 말단절단 크로스-아암 서열이 0 kcal/mol 내지 -22 kcal/mol 초과의 범위의 생리학적 조건 하의 언폴딩의 깁스 자유 에너지 (ΔG)를 갖는 것인 핵산.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산 삽입물이 단백질 또는 기능적 RNA를 발현하도록 조작되는 것인 핵산.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산 삽입물이 유전자 편집을 위한 기재로서의 프로모터 부재 구축물인 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 프로모터 부재 구축물이 TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제, Cas9 및 다른 유전자 편집 단백질을 위한 기재를 제공하는 것인 핵산.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 500 내지 50,000개 뉴클레오티드 범위의 길이인 핵산.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폐쇄형-말단 가닥을 포함하는 핵산.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 복수의 핵산을 포함하는 조성물.
  29. 제29항에 있어서, 복수의 핵산이 말단-대-말단으로 연결되는 것인 조성물.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  32. 제31항에 있어서, 핵산의 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 선택적으로 결합하는 롤링 서클 복제 단백질을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  33. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 세포에 전달하는 방법.
  34. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵산을 대상체에게 전달하는 것을 포함하며, 여기서 핵산의 전달은 대상체에서 핵산에 대한 면역 반응을 유발하지 않는 것인, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역 반응이 체액성 반응인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 면역 반응이 세포성 반응인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 이종 핵산이 대상체에게 다수회 전달되는 것인 방법.
  38. 제34항에 있어서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 횟수가 2 내지 10회의 범위인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 이종 핵산이 대상체에게 매시간, 매일, 매주, 격주, 매월, 분기마다, 반년마다 또는 매년 전달되는 것인 방법.
  40. 제31항 또는 제32항의 숙주 세포를 대상체에게 전달하는 것을 포함하는, 이종 핵산을 대상체에게 전달하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 숙주 세포가 혈액 세포인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 숙주 세포가 다수회 전달되는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 숙주 세포가 대상체에게 매시간, 매일, 매주, 격주, 매월, 분기마다, 반년마다 또는 매년 전달되는 것인 방법.
  44. (i) 적어도 1개의 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 코딩하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 각각의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프는 5 내지 15개 염기 쌍 범위의 길이의 스템 부분 및 2 내지 5개의 쌍형성되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 루프 부분을 갖는 것인 단계; 및
    (ii) 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산의 다중 카피의 생산을 개시하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계이며, 여기서 허용 세포는 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않는 것인 단계
    를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 핵산의 다중 카피를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 정제하는 단계가 핵산을 실리카 겔 수지와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 롤링 서클 복제 단백질이 AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 허용 세포가 포유동물 세포가 아닌 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 허용 세포가 곤충 세포주, 효모 세포주 또는 박테리아 세포주인 방법.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 롤링 서클 복제 단백질이 헬퍼 바이러스 벡터에 의해 코딩되고, 임의로 여기서 헬퍼 바이러스 벡터는 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다중 핵다각체병 바이러스 (AcMNPV) 벡터 또는 바큘로바이러스 발현 벡터 (BEV)인 방법.
  51. i) 단일 서브유닛을 포함하는 단량체 핵산; 및 ii) 2개 이상의 서브유닛을 포함하는 적어도 1개의 다량체 핵산을 포함하는 조성물이며, 여기서 단량체 핵산 및 적어도 1개의 다량체 핵산의 각각의 서브유닛은 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것인 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 적어도 1개의 다량체 핵산이 2개의 서브유닛을 포함하는 것인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 2개의 서브유닛이 테일-대-테일 구성으로 연결되는 것인 조성물.
  54. (i) 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되는 것으로 결정되었고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되는 것으로 결정되었고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않는 것인 단계; 및
    (ii) 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산을 복제하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계
    를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 복제된 핵산을 허용 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  56. i) 허용 세포로부터 단리된 핵산 복제 산물을 포함하는 핵산 제제를 수득하는 단계이며, 여기서 허용 세포는 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 포함하고, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않고, 여기서 롤링 서클 복제 단백질은 핵산의 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소에 결합하고 핵산을 복제하여 핵산 복제 산물을 생산하는 것인 단계; 및
    ii) 1개 이상의 복제 산물의 생리화학적 특성을 결정하는 단계
    를 포함하는, 핵산을 분석하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 1개 또는 각각의 자기-상보적 서열의 뉴클레오티드 서열인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 1개 이상의 복제 산물의 다량체화의 정도인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 핵산 제제 중 복제 산물의 단량체 및/또는 다량체 형태의 화학량론인 방법.
  60. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 제한 엔도뉴클레아제에 의한 소화에 대한 1개 이상의 복제 산물의 감수성인 방법.
  61. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 복제 산물의 이량체 형태에서의 단량체의 극성이고, 여기서 극성은 헤드-대-헤드, 헤드-대-테일 또는 테일-대-테일인 방법.
  62. 제56항에 있어서, 생리화학적 특성이 1개 이상의 복제 산물의 분자량 또는 복제 산물의 단편의 분자량인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 분자량이 1개 또는 각각의 자기-상보적 서열을 포함하는 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 분자량이 전기영동 이동성에 기초하여 결정되는 것인 방법.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 분자량이 질량 분광분석법에 기초하여 결정되는 것인 방법.
  66. 제62항에 있어서, 분자량이 1개 이상의 복제 산물의 단편의 분자량이고, 분자량을 결정하기 전에 단편이 폴리머라제에 의한 프라이머 연장을 포함하는 반응에 의해 증폭되는 것인 방법.
  67. 제62항에 있어서, 프라이머 연장을 포함하는 반응이 폴리머라제 연쇄 반응인 방법.
  68. (i) 개재 자기-상보적 서열이 플랭킹된 이종 핵산 삽입물을 포함하는 핵산을 허용 세포 내에 도입하는 단계이며, 각각의 자기-상보적 서열은 작동적 말단 분해 부위 및 롤링 서클 복제 단백질 결합 요소를 갖고, 여기서 하나의 자기-상보적 서열에는 2개의 대향하는 길이방향-대칭 스템-루프를 형성하는 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 다른 자기-상보적 서열에는 말단절단 크로스-아암 서열이 개재되고, 여기서 허용 세포는 롤링 서클 복제 단백질을 발현하지만, 바이러스 입자 내에 핵산의 복제 카피를 패키징할 수 있는 바이러스 캡시드 단백질은 발현하지 않는 것인 단계; 및
    (ii) 허용 세포 내 롤링 서클 복제 단백질이 핵산을 복제하는 조건 하에 허용 세포를 유지하는 단계
    를 포함하는, 핵산을 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 복제된 핵산을 허용 세포로부터 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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