WO2021182646A1 - 色認識のための光応答性タンパク質及びその利用 - Google Patents

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竣太 重村
頌子 細島
角田　聡
秀樹 神取
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Definitions

  • Examples of eye diseases that cause blindness include retinitis pigmentosa and age-related macular degeneration.
  • retinitis pigmentosa is a genetic disease, and more than 100 kinds of causative genes have been reported.
  • Light signals from the outside world are received by rod cells and cone cells on the retina and converted into electrical signals, which further reach the retinal neurons, optic nerve, and visual cortex of the cerebral cortex and are recognized as images. Will be done.
  • Rhodopsin, opsin, or color vision substances are responsible for converting light signals into electrical signals in rod cells and pyramidal cells.
  • retinitis pigmentosa for example, a gene encoding channelrhodopsin 2 (ChR2) derived from phototactic algae, chramidopsin 2, is introduced into the remaining retinal ganglion cells to give the cells photoreceptive ability.
  • ChR2 channelrhodopsin 2
  • chramidopsin 2 is introduced into the remaining retinal ganglion cells to give the cells photoreceptive ability.
  • Studies have been conducted for the purpose of treatment that restores the visual function of patients by giving them (Patent Documents 1 and 2).
  • ChR2 is a photoreceptive cation channel (photoreceptive protein) that carries (transports) Na + and Ca 2+ from the outside of the cell to the inside of the cell or from the inside of the cell to the outside of the cell when light is sensed. That is, ChR2 is a protein capable of causing a change in membrane potential when a protein molecule alone is sensitive to light.
  • algae-derived ChR2 is not yet sufficient for the recovery of the patient's visual function.
  • the present specification provides photoresponsive proteins for visual color recognition and their use.
  • channelrhodopsin which is a certain cationic channel derived from the cryptoalga Guillardia theta (G. Theta)
  • G. Theta the cryptoalga Guillardia theta
  • the positions are 87th, 117th, 120th, 124th, 139th, 142nd, 143rd, 146th, 150th, 169th, 173rd, 177th, 217th, 218th, 238th.
  • the protein according to [1] which is one or more selected from the group consisting of positions 245 and 247.
  • the position is one or two selected from the group consisting of 53rd, 83rd, 137th, 146th, 147th, 151st, 169th, 177th, 217th, 218th and 247th.
  • the protein according to [1] which is one or more.
  • [15] The protein according to [1], wherein the position is one or more selected from the group consisting of positions 150, 169, 177, 218 and 247. [16] The position is one or two selected from the group consisting of 87th, 117th, 120th, 124th, 139th, 142nd, 143rd, 173rd, 204th, 216th and 231st.
  • [17] The protein according to any one of [1] to [16], further comprising a deletion, substitution or insertion of one or several amino acid residues.
  • the second ratio of the channel activity equivalent value at 600 nm to the channel activity equivalent value at the wavelength ( ⁇ max) at which the protein exhibits maximum channel activity is 0.4 or more.
  • the protein described in any. The protein according to any one of [1] to [21], wherein the amino acid sequence of the protein has 90% or more identity with the first amino acid sequence.
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing visual impairment which comprises the protein according to any one of [1] to [22] or a polynucleotide encoding the protein.
  • the wavelength of irradiation light and A method for screening a mutant protein which comprises a step of evaluating the relationship with channel activity.
  • [27] A method of using the protein according to any one of [1] to [22] or a polynucleotide encoding the protein to ignite muscle cells, cerebral epithelial neurons, or hippocampal neurons by irradiation with light. ..
  • FIG. 1 It is a figure which shows the maximum active wavelength ( ⁇ max act) of the visual pigment in a human rod cell, a cone cell. It represents the maximum active wavelength (498 nm) of the visual pigment (R) in the rod cell and the maximum active wavelength (420 nm, 534 nm and 564 nm, respectively) of the three visual pigments (S, M, L) in the pyramidal cell.
  • the figure (A) showing the maximum active wavelength ( ⁇ max act) of the mutant obtained in the example, the figure showing the activity spectrum of the Gt_CCR4 wild type (WT), the Y217F mutant and the Y146A / P218T mutant, and (C).
  • FIG. 1 Schematic diagram of light-opening ion channel (A), channel current measurement by light irradiation (B), channel current component (C), channel current (D) and channel opening in ND7 / 23 cells expressing ChR2 and GtCCR4, respectively. It is a figure which shows the rate (E). It is a figure which shows the measurement result of the channel current in the ND7 / 23 cell which expressed the single mutant which has a single mutation in GtCCR4.
  • Figure (A) showing the measurement results of channel activity in ND7 / 23 cells expressing wild-type ChR2, FIG.
  • GtCCR4 (hereinafter, also referred to as the first protein), which is a cationic photoresponsive protein derived from G.
  • Theta consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 found by the present inventors, is derived from conventionally known clamidmonas.
  • the finding that it exhibits excellent photoresponsiveness compared to ChR2 and the mutant in which the mutation was introduced into the first protein is from about 520 nm, which is the maximum active wavelength at which the first protein exhibits the maximum channel activity. Is also based on the finding that it has an activity spectrum different from that of the maximum active wavelength and the first protein on the low wavelength side and the long wavelength side.
  • human rod cells and pyramidal cells are provided with a rod visual substance having a maximum active wavelength of 498 nm and a pyramidal substance having a maximum active wavelength of 420 nm, 534 nm, and 564 nm in the cell membrane, respectively.
  • a rod visual substance having a maximum active wavelength of 498 nm and a pyramidal substance having a maximum active wavelength of 420 nm, 534 nm, and 564 nm in the cell membrane, respectively.
  • cone visual pigments enable color recognition of information in the outside world.
  • the variant of the first protein disclosed herein (hereinafter, also referred to as the present variant) has the largest channel at one or more wavelengths different from the first protein depending on the mutation mode. Can have activity. In other words, the variant can have a maximum activity wavelength or spectrum that differs from that of the first protein due to mutation.
  • the cell membrane of the retina such as ganglion cells and bipolar cells
  • the cell has ion permeability (transportability) peculiar to this mutant according to the wavelength of light incident on the cell membrane. ) Is given, and the channel activity based on it is exhibited.
  • the present mutants are expressed on the cell membrane, respectively, and the maximum activity of these mutant-expressing cells is different from that of the present mutant such as the first protein. It can be used in combination with one or more other mutant-expressing cells in which a protein having a wavelength and an activity spectrum is expressed on a cell membrane, respectively.
  • Examples of one or more types of cells expressing this mutant or other mutant include cells selected from cells such as ganglion cells, bipolar cells, amacrine cells and horizontal cells.
  • mutant-expressing cells and other mutant-expressing cells in addition to the mutant-expressing cells are provided in the retina, these cells may exert channel activity in the retina according to the incident light. can. As a result, the retina can finally acquire the photoresponsive ability that can contribute to the provision and improvement of color recognition in the brain.
  • This protein which is the origin of this variant, shows the expression level of this protein on the cell membrane of the retina such as ganglion cells and bipolar cells, the ion permeability (transportability) of the channel composed of this protein, and the aperture ratio of the channel. Etc. are excellent. Therefore, this mutant can also exhibit the photoresponsive ability for color recognition with high sensitivity.
  • this variant By introducing a polynucleotide such as DNA encoding this variant into retinal cells such as ganglion cells and bipolar cells using a viral vector, etc., this variant can be introduced into retinal cells such as ganglion cells and bipolar cells. It can be expressed on the cell membrane to exert a highly sensitive photoresponsive ability for color recognition.
  • this variant or the nucleotide encoding this variant is useful for visual recovery in patients with eye diseases that cause degeneration of rod cells and pyramidal cells such as retinal degenerative diseases and color vision deficiencies.
  • the "maximum active wavelength” means the wavelength of irradiation light ( ⁇ max act) in which a photoresponsive protein having a photoresponsive channel activity exhibits the maximum channel activity.
  • the “activity spectrum” refers to a spectrum of channel activity exhibited by a photoresponsive protein having photoresponsive channel activity in a wavelength range of about 400 nm to 700 nm.
  • the first protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and is characterized by the amino acid sequence.
  • the first protein is a protein consisting of 367 amino acid residues having a DTD (aspartic acid-threonine-aspartic acid) motif corresponding to the DTD motif of bacteriorhodopsin, which is a photodriven proton pump derived from eophilic paleontology. , The previously identified G. It has been found that the amino acid sequences of the cation channels rhodopsins 1-3 derived from Theta are low (33%, 34% and 39%, respectively) (Biophysics and Physicobiology, Vol. 14, pp. 57-).
  • the first protein is a protein derived from G. Theta as described above, and has been identified by the present inventors as a photoresponsive ion channel protein (ibid.).
  • the first protein can transport both Na + and H + (ibid.).
  • the DTD motifs in the first protein are at positions D116, T120 and D127.
  • the DTD motif of bacteriorhodopsin which is a light-driven proton pump, is at positions D85, T89, and D96 of the amino acid sequence.
  • the first protein also comprises this DTD motif and further at positions K113, D242 and K246. In bacteriorhodopsin, these amino acids correspond to positions R82, D212, and K216.
  • the first protein is considered to be an ion channel protein having a 7-transmembrane structure having 7 helices based on its amino acid sequence and the like.
  • the first protein is a region (outer cell region) that is located at or near a site exposed to the outside of the cell membrane from the cell membrane and constitutes the outer cell region of the ion channel, and is located inside the cell membrane of the ion channel.
  • a region constituting a permeation pathway (gate region) and a region existing on the cytoplasmic side of the cell membrane and constituting an ion channel cytoplasmic side region (cytoplasmic side region) can be provided.
  • these regions in the first protein can be assigned, for example, the positions or regions of the following amino acid residues. Since the first protein has a DTD motif, it was considered that there is a correlation with the above-mentioned bacteriorhodopsin (light-driven proton pump derived from eophilic archaea), which also has the DTD motif, in amino acid sequence and molecular structure. Therefore, based on the known molecular structure of bacteriorhodopsin, the ion permeation pathway inside the first protein is estimated.
  • the positions of the amino acid residues shown with respect to the first protein represent the positions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the outer cell region In the first protein, the outer cell region is considered to be the following amino acid sequence regions: 1-41 to 41, 92 to 115, 147 to 165, and 222 to 237.
  • the cytoplasmic region is expected to be the following amino acid sequence regions: positions 51 to 82, 125 to 138, 174 to 213, and 250 to 367.
  • the gate region is the following amino acid sequence region: 42nd to 50th position, 83rd to 91st position, 116th to 124th position, 139th to 146th position, 166th to 173rd position, 214. It is estimated to be in the ranks of 221 to 221 and 238 to 249.
  • the first protein is a protein having photoresponsive cation channel activity, which is also a light-driven proton pump.
  • photoresponsive cation channel activity When expressed on a cell membrane, for example, when irradiated with green light of 530 nm, protons (H + ) and cations are produced.
  • Channel currents are generated by the permeation of (Na +) and cell membranes.
  • the activity of generating a channel current by light irradiation is generally called channel activity.
  • the channel activity of the first protein is, for example, the expression of the first protein on the cell membrane of a suitable mammalian cell (preferably no other photoresponsive ion channel is also equipped with a light-driven proton pump).
  • a constant intensity of light having a maximum absorption wavelength of around 530 nm is irradiated for a certain period of time, it can be measured by the patch clamp method using whole cell recording.
  • the whole cell record patch clamp method is a method of measuring the total amount of ions penetrating the cell membrane of a single cell as charge transfer (current). The amount of channel current that can be measured by this method can be used as the channel activity.
  • DNA encoding the amino acid sequence of the first protein is synthesized so that the eGFP is tagged to the C-terminal side of the first protein and the first. Incorporate it into a vector plasmid for mammalian cells such as pegFP-N1 to prepare a plasmid for introduction so that a sufficient amount of protein 1 is expressed, and introduce this plasmid into mammalian cells such as ND / 723 cells by the lipofection method. And transform. The expression of the first protein-introduced cells on the cell membrane can be confirmed by the fluorescence of eGFP.
  • a patch clamp by whole cell recording is performed in a state where the first protein is stably expressed, for example, within 24-48 hours after introduction. Perform electrophysiological measurements such as the method.
  • the measurement conditions by electrophysiological measurement by the whole cell recording patch clamp method or the like are not particularly limited, but the following conditions can be adopted, for example.
  • the peak-like maximum current value (Ip) generated when cells are irradiated with light and up to a certain level during light irradiation can be used as the channel current value of the first protein, respectively.
  • Ip and / or both can be used as the channel activity of the first protein.
  • the value obtained by dividing Is by Ip can be used as the channel opening ratio described later.
  • the present variant need only have an amino acid residue different from that in the first protein at a position corresponding to one or two or more in the first amino acid sequence of the first protein, and the first one.
  • the protein may be an artificially modified protein, or may be a naturally occurring protein or a variant thereof.
  • This variant is also applied to, for example, a protein having an amino acid sequence having a certain degree of identity with the first amino acid sequence. That is, this mutant contains artificial proteins, algae derived from the same origin as the first protein, and cationic ions derived from closely related algae and microorganisms, as long as they have a certain degree of identity with the first protein. It may be a naturally occurring protein such as a channel or a variant thereof. The identity will be described later.
  • the position corresponding to one or more positions in the first amino acid sequence is the first amino acid sequence when the amino acid sequence of the present variant is aligned with the first amino acid sequence.
  • the position of one or more amino acid residues in the variant which is associated with one or more positions in.
  • the alignment is synonymous with the alignment used in the measurement of the identity of the amino acid sequence and the base sequence, which will be described later.
  • the position of this variant corresponding to the position in the first amino acid sequence is BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) or Pfam (http://pfam.xfam. It can be identified using a known amino acid sequence alignment program such as org /), for example by aligning with default parameters.
  • the variant can have a maximum active wavelength or spectrum different from that of the first protein.
  • the maximum active wavelength of the first protein is about 520 nm.
  • the maximum active wavelength is, in the method for measuring the channel activity of the first protein, the wavelength of the irradiation light is set in the range of 400 to 700 nm, for example, 410 nm to 650 nm, and from the short wavelength side, for example, 10 nm.
  • the wavelength of the light for which the maximum current value is obtained is defined as the maximum active wavelength.
  • an activity spectrum is created from the current value when the wavelength of the irradiation light is sequentially shifted from the low wavelength side to the long wavelength side.
  • the light intensity at the time of measuring the activity spectrum can be, for example, 0.1 mW / mm 2 , the light irradiation time can be 400 msec, and the recording time can be 1 sec.
  • the position of the mutation contained in this mutant that contributes to color recognition in the retina is, for example, in the first amino acid sequence, the following site: 53rd, 83rd, 87th, 117th, 120th, 124th, 137th, 139th, 142nd, 143rd, 146th, 150th, 169th, 173rd, 177th, 198th, 204th , 216th, 217th, 218th, 231st, 238th, 245th and 247th, which correspond to one or more selected from the group.
  • the maximum active wavelength can be shifted to a shorter wavelength side or a longer wavelength side than the maximum active wavelength of about 520 nm possessed by the first protein, or with the first protein. Can be given different activity spectra.
  • positions 147 and 151 in the first amino acid sequence are also mentioned.
  • substitution mode at each mutation site is as follows, for example.
  • (Mutation mode 1) Among these mutation sites, for example, one or more selected from the group consisting of 53rd, 83rd, 137th, 146th, 169th, 177th, 217th, 218th and 247th positions. Wavelengths tend to shift and / or channel activity tends to improve.
  • positions 169, 177, 217, 218 and 247 are advantageous for mutants having a ⁇ max act of, for example, less than 520 nm and, for example, 515 nm or less, at positions 53, 83, 137 and 146.
  • the positions and 218 positions are advantageous for mutants with a ⁇ max act above 530 nm.
  • the mutation at position 53 tends to shift the maximum active wavelength to the long wavelength side.
  • Examples of such a substitution mode at the 53rd position include L53N and L53A.
  • the mutation at position 83 tends to shift the maximum active wavelength to the long wavelength side. Also, such mutations tend to improve overall channel activity. Examples of such a substitution mode at the 83rd position include V83A ( ⁇ max act: 540 nm) and V83T.
  • the mutation at position 137 tends to shift the maximum active wavelength to the long wavelength side. Also, such mutations tend to improve overall channel activity.
  • Examples of the substitution mode at the 137th position include K137A ( ⁇ max act: 530 nm).
  • the mutation at position 146 tends to shift the maximum active wavelength to the long wavelength side. Also, such mutations tend to improve overall channel activity.
  • Examples of the substitution mode at the 146th position include L146A ( ⁇ max act: 530 nm).
  • the mutation at position 169 tends to shift the maximum active wavelength to the short wavelength side.
  • Examples of the substitution mode at the 169th position include G169S ( ⁇ max act: 510 nm).
  • the mutation at position 177 tends to shift the maximum active wavelength to the short wavelength side.
  • W177Y ⁇ max act: 510 nm
  • the mutation at position 217 tends to shift the maximum active wavelength to the short wavelength side.
  • Examples of the substitution mode at the 217th position include Y217F ( ⁇ max act: 475 nm) and Y217N.
  • the mutation at position 218 tends to shift the maximum active wavelength to the long wavelength side and the short wavelength side. Also, such mutations tend to improve overall channel activity.
  • the substitution mode at the 218-position include P218T ( ⁇ max act: 510 nm), P218A ( ⁇ max act: 530 nm), P218S, P218G, P218 and the like.
  • the mutation at position 247 tends to shift the maximum active wavelength to either the short wavelength side or the long wavelength side. Also, such mutations tend to improve overall channel activity.
  • Examples of the substitution mode at the 247th position include S247A ( ⁇ max act: 510 nm) and S247M ( ⁇ max act: 530 nm).
  • mutation mode 2 (Mutation mode 2) Further, among the above mutation sites, for example, one or more mutations selected from the group consisting of 137th, 146th, 150th, 177th, 198th, 245th and 247th positions have a ⁇ max act. Although it is about 520 nm or more and less than 530 nm, it is advantageous in that it has high channel activity and contributes to improvement of channel activity when it is used as an additive mutant with other mutations.
  • the mutation at position 137 is, for example, K137A
  • the mutation at position 146 is, for example, L146A
  • the mutation at position 150 is, for example, C150A
  • the mutation at position 177 is, for example, W177Y.
  • the mutation at position 198 is, for example, K198A
  • the mutation at position 245 is, for example, A245M
  • the mutation at position 247 is, for example, S247A, S247M.
  • “Mutation mode 3) Among the above mutation sites, for example, one or two or more selected from the group consisting of positions 150, 169, 177, 218 and 247 are amino acid residues that interact with the retinal contained in the first protein. It was found "for the first time” as the position of an amino acid residue that affects the configuration of an amino acid residue that is in or near a group or interacts with retinal, and has a maximum active wavelength or activity different from that of the first protein. It is advantageous for acquiring the spectrum.
  • the mutation at position 150 is, for example, C150A
  • the mutation at position 169 is, for example, G169S
  • the mutation at position 177 is, for example, W177Y
  • the mutation at position 198 is, for example, K198A.
  • the mutations at position 218 are, for example, P218A, P218S, P218G, P218T
  • the mutations at position 247 are, for example, S247A, S247M.
  • (Mutation mode 4) Among the above mutation sites, for example, one selected from the group consisting of 87th, 117th, 120th, 124th, 139th, 142nd, 143rd, 173rd, 204th, 216th and 231st positions or Two or more are considered to be the amino acid residues of the gate region that interacts with the retinal contained in the first protein or the positions in the vicinity thereof, which is advantageous for obtaining the maximum active wavelength or activity spectrum different from that of the first protein. be.
  • the mutations at position 87 are, for example, A87S, A787K, A87S
  • the mutations at position 117 are, for example, Y117A, Y117D, Y117F, Y117N
  • the mutations at position 120 are, for example, T120S, 124.
  • the mutation at position is, for example, L124C, L124T, L124A
  • the mutation at position 139 is, for example, T139A, T139D
  • the mutation at position 142 is, for example, L142A
  • the mutation at position 143 is.
  • the mutations at position 173 are F173Y, F173A, the mutations at position 204 are, for example, K204A, K204E, and the mutations at position 216 are, for example, G216S, mutations at position 231.
  • Q231L For example, Q231L.
  • the mutation at position 117 may contribute to the shift of ⁇ max act to the short wavelength side of less than 520 nm.
  • Examples of such mutations include Y117A, Y117F, and Y117N.
  • position 147 is located in the extracellular region near the gate region. Such mutations may be able to contribute to a shift in ⁇ max act below 520 nm. In some cases, the channel activity itself can be increased. In addition, it can contribute to the improvement of channel activity when it is a mutation in the gate region and is used as an additive mutant with other mutations involved in wavelength shift to ⁇ max act of less than 520 nm. Examples of the substitution mode at the 147th position include T147C.
  • the 151st position is located in the extracellular space near the gate region. Such mutations may be able to contribute to ⁇ max act below 520 nm. In some cases, the channel activity itself can be increased. In addition, it can contribute to the improvement of channel activity when it is a mutation in the gate region and is used as an additive mutant with other mutations involved in wavelength shift to ⁇ max act of less than 520 nm. Examples of the substitution mode at the 151-position include G151A.
  • the combination of mutations at positions 147 and 151 can contribute to the shift of ⁇ max act to the short wavelength side of less than 520 nm and also to the increase of channel activity.
  • mutations at positions 147 and / or 151 which are mutations in the extracellular region near the gate region
  • mutations at position 217 which are mutations in the gate region and tend to shift ⁇ max act to the short wavelength side
  • the ⁇ max act at position 217 may be further shifted to the shorter wavelength side.
  • an additive variant combining T147C and G151A with Y217F can shift ⁇ max act further beyond the maximum active wavelength of Y217F, 475 nm.
  • this mutant can include, for example, a mutation selected from the gate regions such as positions 83, 87, 146 and 216. Further, for example, mutations at positions 53, 76, 137, 198 and / or 204 of the cytoplasmic region can be appropriately combined. Furthermore, mutations at positions 230 and / or 231 in the extracellular region can be appropriately combined.
  • At least one of the mutation sites is at positions 87, 117, 120, 124, 139, 142, 143, 146, 150, 169, and 173. It is an embodiment selected from the group consisting of 177th, 217th, 218th, 238th, 245th and 247th.
  • the amino acid substitution modes at these mutation sites are as described above.
  • this mutant may be advantageous for this mutant to have an amino acid substitution mutation at the following mutation site, or to adopt the following mutation mode for the mutation site.
  • At least one mutation is selected from the mutation modes other than L53N, V83A, K137A, and K198A in the mutation mode shown in Table 4.
  • at least one mutation of this mutant is selected from mutation modes other than L53A, K204A, G549S, and Q231L in the mutation mode shown in Table 5.
  • the number of the present mutants is 1 to 30 or less, for example, 25 or less, for example, 20 or less, for example, 15 or less, for example, 10 or less, or a number, for example, at positions other than those described above.
  • this mutant can also include the following various mutations in the extracellular region, cytoplasmic region, and gate region. These mutation sites and mutation modes are viewpoints based on the improvement of channel activity and / or aperture ratio, but may overlap with the mutation sites and mutation modes for color recognition.
  • the outer cell region is considered to be at positions 1 to 41, 92 to 115, 147 to 165, and 222 to 237, and the mutation positions in these amino acid regions are, for example, 39. , 94th, 98th, 102nd, 110th, 113th, 114th, 162nd, 224th, 225th and the like. Moreover, for example, 230th place, 231st place, 235th place can be mentioned.
  • substitution mutation examples include D39N, R94M, R94K, R94Q, H98A, D102N, N110L, K113A, K113N, Y114A, R162A, S230E, and for example, T224A, E225A, E225Q, Q231L, H235A, H235N, H235. Can be mentioned.
  • the cytoplasmic region is estimated to be at positions 51 to 82, 125 to 138, 174 to 213, and 250 to 367, but the mutation positions in this amino acid region are For example, 53rd, 61st, 68th, 74th, 76th, 80th, 130th, 137th, 194th, 195th, 198th and the like can be mentioned. Further, for example, 200th place, 204th place, 205th place, 209th place, 210th place, 253rd place and 254th place can be mentioned.
  • substitution mutation examples include K61A, R74A, E76Q, S80A, K137E, K137A, K198A, R200A, K204A, K204E, and for example, L53A, L53N, E68Q, W130A, E194Q, D195N, L205A, L209A, Y210F. , L253N, L253S, L254N, L254S.
  • the gate areas are 42nd to 50th, 83rd to 91st, 116th to 124th, 139th to 146th, 166th to 173rd, 214th to 221st, and 238th to 249th. It is presumed that there are mutation positions in this amino acid region, for example, 46th, 83rd, 84th, 87th, 90th, 91st, 116th, 117th, 120th, 124th, and 139th positions. , 142nd, 143rd, 146th, 173rd.
  • Substitution mutations include, for example, L46A, V83A, V83T, V83D, V83K, N84P, N84K, A87S, A87N, A87K, T90A, Y91A, D116A, D116T, Y117A, T120S, L124C, L124T, and L124A.
  • such mutations include the substitution mutations shown in Table 6 below.
  • the substitution mutations shown in Table 7 can also be mentioned.
  • This mutant preferably has the DTD motif of the first protein. That is, it is preferable to provide amino acid residues (D, T and D, respectively) at positions corresponding to positions D116, T120 and D127 in the first amino acid sequence. Furthermore, the variant preferably comprises this DTD motif and further amino acid residues corresponding to one or more selected from positions K113, D242 and K246 in the first amino acid sequence.
  • the identity of the mutant with the first amino acid sequence is not particularly limited, but is, for example, 75% or more, for example, 80% or more, and for example, 85% or more. Also, for example, 90% or more, and for example, 95% or more, and for example, 97% or more, and for example, 98% or more, and for example, 99% or more, and for example, 99%. It is 5.5% or more.
  • the similarity is, for example, 80% or more, and is, for example, 85% or more, and is, for example, 90% or more, and is, for example, 95% or more, and is, for example, 97% or more. For example, it is 98% or more, for example, 99% or more, and for example, 99.5% or more.
  • Identity or similarity herein is the relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides, as is known in the art, determined by comparing sequences.
  • identity is an amino acid or polynucleotide sequence as determined by the alignment between amino acid or polynucleotide sequences, or, in some cases, by the alignment between a series of such sequences. Means the degree of sequence invariance between. Similarity is also between amino acid or polynucleotide sequences, as determined by the alignment between amino acid or polynucleotide sequences, or, in some cases, by the alignment between a series of partial sequences. It means the degree of correlation.
  • Similarity in the BLAST sequence homology search result described later.
  • the method of determining identity and similarity is preferably the method designed to have the longest alignment between contrasting sequences. Methods for determining identity and similarity are provided as publicly available programs. For example, the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program by Altschul et al. (For example, Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul.
  • the variant can have a variety of maximum active wavelengths. It can be used as any of the S-pyramidal, M-pyramidal, and L-pyramidal expressed in human pyramidal cells, depending on the maximum active wavelength ⁇ max act of this mutant.
  • the maximum active wavelength for substituting each cone is appropriately set. For example, if is 400 nm or more and 515 nm or less, it can be used as, for example, an S cone having a sensitivity peak at a short wavelength of human beings.
  • the maximum active wavelength ⁇ max act of this mutant is 515 nm or more and 545 nm or less, it is used as an M cone or the like. Further, for example, when the maximum active wavelength ⁇ max act is 540 nm or more and 600 nm or less, it can be used as an L cone or the like.
  • this mutant has an activity spectrum different from that of the first protein when the maximum active wavelength is shifted to the short wavelength side or the long wavelength side as compared with the first protein. Further, even if the maximum activity wavelength is the same as that of the first protein, this variant has, for example, a shoulder peak near the peak of the activity spectrum, or the sharpness (peak) of the peak of the activity spectrum of the first protein. It can be said that it has an activity spectrum different from that of the first protein even when the width is high.
  • the first ratio which is the ratio of the channel activity equivalent value at 440 nm to the channel activity equivalent value at the maximum active wavelength of this variant, and the ratio of the channel activity equivalent value at 600 nm to the channel activity equivalent value at the maximum active wavelength. Based on the ratio of 2, it is possible to compare the activity spectrum between the present variants and the activity spectrum between the present variant and the first protein.
  • the first protein has a first ratio of 0.3, a second ratio of about 0.18, a first ratio / second ratio of 1.67, and a second ratio /
  • the first ratio is 0.6.
  • the maximum active wavelength ⁇ max act is on the shorter wavelength side than the first protein.
  • the first ratio is further 3 times or more, for example, 4 times or more larger than the second ratio, there is a tendency to shift to a shorter wavelength side.
  • the first ratio is, for example, 0.4 or more, for example, 0.5 or more, for example, 0.6 or more, for example, 0.7 or more, and for example, 0.8 or more.
  • a shoulder peak or the like is further provided on the shorter wavelength side than the maximum active wavelength ⁇ max act.
  • the second ratio is, for example, 0.7 times or more, and for example, 0.8 times or more, and for example, 0.9 times or more, and for example, 1.0 times or more, or, for example, the first ratio.
  • the maximum active wavelength ⁇ max act is higher than that of the first protein.
  • the second ratio is, for example, 0.3 or more, and for example, 0.4 or more, and also, for example, 0.5 or more, and for example, 0.6 or more, and for example, 0.7 or more, and for example.
  • 0.8 or more, for example, 0.9 or more there is a high tendency to have the maximum active wavelength on the short wavelength side, and a shoulder peak or the like is further provided on the long wavelength side from the maximum active wavelength ⁇ max act.
  • a shoulder peak or the like is further provided on the long wavelength side from the maximum active wavelength ⁇ max act.
  • the color responsiveness of this mutant can be characterized by a first ratio and a second ratio that define the maximum active wavelength ⁇ max act and the activity spectrum.
  • This mutant has channel activity. Channel activity can be confirmed in the same manner as described for the first protein.
  • the mutant preferably has a certain level of channel activity or higher.
  • the pA / pF is 30 or more, and for example, the pA / pF is 40 or more, as measured by the above-mentioned evaluation method of channel activity and electrophysiological recording conditions (irradiation time 400 mS).
  • the channel activity at the maximum active wavelength is, for example, 30% or more of the channel activity pA / pF of the first protein, or, for example, when according to the above measurement method. 40% or more, and for example 50% or more, and for example 50% or more, and for example 60% or more, and for example 70% or more, for example 80% or more, and for example 90% or more, and for example. It is 100% or more.
  • the channel opening ratio of this mutant is above a certain level.
  • the channel aperture ratio (Is / Ip) as measured by the above-mentioned evaluation method of channel activity and electrophysiological recording conditions (irradiation time 400 mS) is, for example, 0.7 or more, or 0.8 or more, for example. Also, for example, 0.85 or more, for example, 0.9 or more, and for example, 0.95 or more, for example, 0.97 or more, and for example, 0.98 or more, and for example, 0.99 or more. Is preferable.
  • this mutant can also measure the channel aperture ratio in the same manner as the first protein.
  • the channel opening ratio of this mutant when the aperture ratio (Is / Ip) of the first protein is 100% is not particularly limited, but is, for example, 30% of the first protein, or 40, for example. % Or more, and for example 50% or more, and for example 50% or more, and for example 60% or more, and for example 70% or more, for example 80% or more, and for example 90% or more, and for example 100%. That is all.
  • One of ordinary skill in the art can fuse various proteins to the N-terminal and C-terminal of the first protein and the present mutant, for example.
  • the DNA encoding the amino acid sequence of the first protein was subjected to a conventional mutagenesis method, a site-specific mutagenesis method, or an error prone PCR.
  • the modified DNA can be obtained by modifying it by a molecular evolution method or the like, and can be obtained based on the modified DNA or the like.
  • Examples of the method for obtaining the modified DNA include known methods such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, or methods similar thereto. For example, mutagenesis using various commercially available site-specific mutagenesis methods. Mutations are introduced using the kit.
  • this mutant transforms a host such as P. pastoris with a DNA construct containing the modified DNA thus obtained, and the transformed cells are cultured according to a usual method known to those skilled in the art, and the cultured cells are cultured.
  • it can be obtained by recovering the present variant from the medium.
  • the variant can be isolated in combination with conventional purification techniques. Such techniques include sulfur fractionation, organic solvent treatment, centrifugation, ultrafiltration, various chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, etc.). , High Performance Liquid Chromatography (HPLC), electrophoresis and the like.
  • modified DNA fused with DNA encoding a signal protein such as GFP can be introduced into mammalian nerve cells ND7 / 23 cells and the like, expressed on the cell membrane, and obtained.
  • polynucleotide The polynucleotide disclosed herein (hereinafter, also simply referred to as the present polynucleotide) can encode the amino acid sequence of the present variant.
  • Such polynucleotides can take various forms, but the coding region of the amino acid sequence is DNA or RNA, typically DNA.
  • This polynucleotide can take a known form suitable for transformation of a plasmid, a vector, etc., in addition to a DNA fragment or an RNA fragment.
  • the polynucleotide can be obtained by artificially synthesizing it as DNA for obtaining the mutant, and as described above, it can be obtained as DNA based on the mutant acquisition method described above.
  • the vector disclosed in the present specification (hereinafter, also referred to as the present vector) can include the present polynucleotide.
  • the purpose of this vector is to express this mutant in a host cell.
  • the expression vector can take various forms depending on the type and purpose of the cell to be transformed.
  • the polynucleotide is appropriately applied, for example, with the addition of appropriate regulatory and / or target sequences, and / or the preferred codon usage frequency of the selected host of the coding sequence.
  • the target sequence targets a photoinduced ion channel at a specific site or compartment within the cell, such as a cell membrane, synapse, postsynaptic site, or axon hillock, or endoplasmic reticulum, at the N-terminus or It can encode a C-terminal extension.
  • a person skilled in the art can easily construct such a vector based on the well-known technique at the time of filing the application.
  • This vector may be suitable for gene therapy of eye diseases.
  • it can be used for virus-mediated gene transfer.
  • virus-mediated gene transfer it means that the vector can be packed into a virus and, as a result, delivered to a site or cell of interest.
  • viruses suitable for gene therapy include retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, poxvirus, alphavirus, mad dog disease virus, semuliki forest fever virus and herpesvirus.
  • Gene therapy also includes non-viral methods such as the application of naked DNA, lipoplexes and polyplexes, and dendrimers.
  • a known vector already used for intent of visual function regeneration by introducing a gene encoding such a therapeutic protein can be used.
  • an AAV-2 virus vector or the like can be used, and examples of the promoter include a CAG promoter, a human gap-conjugated protein (Conexin-36) promoter (Greenberg KP et al., 2007, In vivo Transgene Expression in ON-Type Retinal).
  • Conexin-36 human gap-conjugated protein
  • Ganglion Cells Applications to Retinal Vector. ARVO abstract, 2007
  • the mGluR6 promoter is available.
  • a promoter that can target rod bipolar cells is the Pcp2 (L7) promoter (Tomomura, M et al., 2001, Eur J Neurosci. 14: 57-63).
  • the length of the active promoter is preferably less than 2.5 Kb, so it can be packaged in an AAV virus cassette.
  • the transformed cells disclosed in the present specification carry the present polynucleotide so that the present mutant can be expressed.
  • This transformed cell can be obtained by introducing the above-mentioned vector, this polynucleotide which is naked DNA, or the like into a target cell.
  • various conventionally known methods such as calcium phosphate method, transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, electroporation method, lipofection method, lithium acetate method or other methods are used. Can be mentioned.
  • Transformed cells are also provided, for example, by introducing the nucleotide into cells by using a virus, as described above.
  • the transformed cell may be a cell in vitro, a cell in vivo, or a cell produced in vitro and transplanted in vivo, depending on the production method and use thereof. May be good.
  • the target cell as the transformed cell will be described later.
  • This protein, this polynucleotide, this vector, and this transformed cell can be used for improving visual impairment including color vision abnormality or for reproducing visual function. That is, both can be used for research and optogenetic applications for the prevention or treatment of eye diseases.
  • it is possible to improve or restore the photoresponsiveness of the retina by expressing this mutant in a predetermined retinal cell or a nerve cell which is a non-retinal cell in the vicinity of the retina by gene therapy. can.
  • the cells can be imparted with photoresponsiveness, thereby improving or regenerating vision.
  • examples of visual impairment or eye disease include retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, retinal detachment, diabetic retinitis, retinal vein occlusion glaucoma, and color vision abnormality, and retinitis pigmentosa is preferable.
  • Disease or age-related macular degeneration refers to improving or restoring the photoresponsiveness for color recognition of nerve cells or the like to a state in which cells lose their retinal function due to degeneration, death, or shedding. It aims to improve visual functions such as color vision, recover, or suppress the progression of symptoms.
  • prevention means improving or restoring the photoresponsiveness of nerve cells in a situation where the probability of cell degeneration, death or shedding progresses and the risk of developing visual impairment is increased, and further. Is intended to prevent loss of function or delay the onset of visual impairment.
  • “Pharmaceuticals for treating or preventing visual impairment, including proteins or polynucleotides encoding said proteins” disclosed herein include those used for such gene therapy.
  • the drug may be provided in the form of a vector for expressing the protein in a target tissue. In this case, it is preferable to use an expression vector having excellent cell introduction efficiency, intracellular replication maintenance, stability, expression efficiency and the like.
  • Such a vector examples include, but are not limited to, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, virus vector such as lentivirus vector, (self-sustaining replicable) plasmid, transposon and the like.
  • the protein expression vector of the present invention is, for example, Tomita H et al. , Invest Opthalmol Vis Sci. 2007 Aug; 48 (8): 3821-6; and Sugano E et al. , Invest Opthalmol Vis Sci. It can be produced according to the method described in 2005 Sep; 46 (9): 3341-8, and the gene can be introduced into cells of a target tissue or the like. This mutant is also used for research purposes such as visual regeneration or optogenetics.
  • This vector which is intended for the treatment of eye diseases such as visual regeneration, can be used, for example, in all types of ganglion cells (both ON and OFF ganglion cells), or in all types of bipolar cells (rod bipolar cells, etc.). And ON and OFF pyramidal bipolar cells) can be configured to be targeted.
  • a pharmaceutical composition containing the present variant for treating or preventing visual impairment is provided.
  • visual impairment include retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, retinal detachment, diabetic retinopathy, retinal vein occlusion, glaucoma, and color vision abnormality.
  • Gene therapy using DNA encoding a photoresponsive protein is known, and this protein and the like can also be applied to gene therapy and research applications for eye diseases according to the same method or the method.
  • this mutant is also useful for research of various neural pathways using optogenetics and for treatment of neurological diseases.
  • a potential difference voltage difference
  • the intracellular is about ⁇ 70 mV to -80 mV as compared with the extracellular. This state is called hyperpolarization.
  • Nerve cell activation or firing, excitement is triggered by activation of membrane potential-dependent sodium channels when the potential difference between the inside and outside of the cell membrane rises from -40 mV to -20 mV (called depolarization).
  • the first protein is a photoresponsive cation channel, when it is expressed on the nerve cell membrane, it transmits cations with light irradiation to generate a channel current. As a result, the cell membrane can be depolarized, and as a result, nerve cells can be activated (fired, excited).
  • a nerve cell as a target cell is transformed to express this mutant in the target cell.
  • the transformed nerve cells will generate channel currents by light irradiation.
  • a nerve that is activated in response to external light irradiation in the living body by preparing such transformed nerve cells in vitro and transplanting them into the living body, or by transforming the nerve cells in the living body with this vector or the like. You can build a route.
  • this mutant having the maximum active wavelength ⁇ max act on the long wavelength side is suitable for optogenetic applications because of its high tissue permeability.
  • muscle cells, cerebral epithelial neurons, or hippocampal neurons are irradiated with light such as blue light (430 to 440 nm) using the proteins disclosed herein or the polynucleotides encoding the proteins. Usage that causes ignition is presented.
  • Target cells of the transformed cells include, for example, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces Pombe, and Pichia pastoris.
  • examples of other target cells include mammalian cells or insect cells.
  • mammalian cells include melanoma cells (eg, BLM cell line), COS cells (produced by "African green monkey kidney CV1" cell infection), HEK cells ("human fetal kidney cells", such as HEK293 cells), BHK cells. (“Baby hamster kidney cells”) as episomatic vectors as transient expression, or CHO cells ("Chinese hamster ovary cells”), myeloma cells or MDCK cells (“Madeine-Darby canine kidney cells”).
  • examples of insect cells include Sf9 insect cells infected with baculovirus.
  • the target cells are mammalian cells: photoreceptive cells; retinal rod cells; retinal pyramidal cells; retinal ganglion cells; bipolar neurons; ganglion cells; pseudo Unipolar neurons; multipolar neurons; pyramidal neurons; Purkinje cells; or granule cells.
  • target cells include animal cells including mammalian cells.
  • Mammalian cells include, for example, neuroblastoma cells (eg, NG108-15 cells), melanoma cells (eg, BLM cell line), COS cells (produced by "African green monkey kidney CV1 cells"), HEK cells ("human”).
  • neuroblastoma cells eg, NG108-15 cells
  • melanoma cells eg, BLM cell line
  • COS cells produced by "African green monkey kidney CV1 cells”
  • HEK cells human
  • HEK293 cells eg, HEK293 cells
  • BHK-cells eg, BHK-cells
  • CHO cells CHO cells
  • myeloma cells or MDCK cells adby" -Darby canine kidney cells ").
  • Sf9 insect cells infected with baculovirus.
  • Mammalian cells are also, for example, electrically excitatory cells.
  • electrically excitable cells can also cause muscle contraction by receiving signals from sensory neurons, brain and spinal cord that respond to contact, sound, light and many other stimuli that affect sensory organ cells. It includes motor neurons that affect the glands, as well as a variety of neurons, such as intervening neurons that connect neurons within the same area of the brain or spinal cord. Further, myocardium, smooth muscle, skeletal muscle and the like can also be mentioned.
  • Target cells are also, for example, cells, tissues and organs in an individual animal, such as fertilized eggs, ES cells and iPS cells capable of finally producing an individual animal or a part thereof.
  • individual animals include flies, nematodes, mice, rats, monkeys and the like. Furthermore, as a result obtained in this way, such transformed animals or a part thereof and the like can be mentioned.
  • Target cells to be transformed are isolated (and genetically modified), maintained, and optionally at appropriate temperature and gas mixing (typically 37 ° C., 5% CO 2), skilled in the art.
  • the most common element of change in cell culture systems is the growth medium.
  • the composition for the growth medium can vary in the presence of pH, glucose concentration, growth factors, and especially other nutritional components.
  • Growth medium can be prepared according to the composition that is commercially available or available from the United States Culture Cell Lineage Preservation Agency (ATCC). Growth factors used in supplemental media are often derived from animal blood, such as fetal bovine serum. In addition, antibiotics can be added to the growth medium.
  • those performed on cultured cells are medium change and cell passage.
  • This mutant can impart photoresponsiveness to nerve cells. Therefore, this method can be applied to optogenetics as well as to implement a method of improving visual impairment or reproducing visual function. For example, by introducing a protein or polynucleotide that imparts photoresponsiveness to nerve cells existing in a region that is thought to be involved in aggression and memory formation in the mouse hippocampus, that region actually becomes aggressive and memory formation. It can be verified how it is involved (Lin, D et al., 2011, Nature.470 (7333): 221-6 and OKUYAMA et al., 2016, Science (6307) 1536-1541).
  • nerve cells in the central or peripheral areas of humans or non-human animals it is possible to impart photoresponsiveness to nerve cells in the central or peripheral areas of humans or non-human animals, and to generate a channel current by irradiation with light of a predetermined wavelength and intensity, thereby activating the nerve cells.
  • a channel current by irradiation with light of a predetermined wavelength and intensity, thereby activating the nerve cells.
  • activation of such nerve cells may restore central or peripheral neural circuits to treat neurodegenerative diseases and the like.
  • Photoresponsive cells According to the present specification, the target cell imparted with photoresponsiveness for color recognition is provided as a new photoresponsive cell (photoresponsive material). Such photoresponsive cells can be used, for example, in the field of optogenetics for studies related to activation of neural activity and the like.
  • the screening method disclosed herein comprises an amino acid residue different from the first amino acid sequence at a position corresponding to one or more positions of the first amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the subject protein can be provided with a step of evaluating the relationship between the irradiation wavelength of the irradiation light and the channel activity.
  • a mutant having channel activity for color recognition can be obtained by using the first protein as an origin.
  • the channel activity referred to here can be measured by, for example, the above-mentioned electrophysiological measurement method. Further, for the channel activity, any one or a combination of two or more of the above-mentioned Ip, Is and the channel opening ratio can be adopted.
  • the mutant that is the subject used in these screening methods can be obtained based on the above-mentioned method for producing the mutant.
  • the embodiments already described can be applied to the evaluation of channel activity.
  • Vector DNA (pEGFP-N1) was also amplified by inverse PCR. The amplified DNA fragment and the vector DNA fragment were each subjected to an In-Fusion reaction to prepare a pEGFP-GtCCR4mutant in which each DNA fragment was incorporated.
  • Primer for obtaining DNA fragment (encoding mutant derived from Gt CCR4)
  • Primer Forward Primer 5'CGAGCTCAAAGCTTATGATGACAACAAGCGCCCCTAG 3'(SEQ ID NO: 3)
  • Reverse primer 5'GACCGGTGGATCCTGAACAGCCTCAGACTCTTGCA 3'(SEQ ID NO: 4)
  • Primer for obtaining vector fragment of vector pEGFP-N1 Forward Primer 5'CATAAGCTTGAGCTCGAGATC3' (SEQ ID NO: 5)
  • ND7 / 23 cells derived from mouse nerve / rat spinal root dorsal root ganglion and derived from mouse blastoma ⁇ rat nerve were subjected to DMEM (High glucose) + FBS 5% medium at 37 ° C. in a CO 2 incubator. It was cultured. In these cells, the prepared vector was introduced into ND7 / 23 cells using a lipofection method (Lipofectamine 2000 (Thermo Fischer)). Expression of GtCCR4 mutant in ND7 / 23 cells was confirmed by GFP fluorescence.
  • Electrophysiology was measured by the whole cell record patch clamp method under the following conditions within 24 hours to 48 hours after the gene was introduced into the cells.
  • the wavelength dependence (activity spectrum) and the maximum active wavelength ⁇ max act were measured by measuring the current response while changing the wavelength of the irradiation light for each mutant.
  • the wavelength dependence (activity spectrum) is measured by irradiating light: the light intensity is always 0.1 mW / mm 2, and first irradiating light with a wavelength of 410 nm to measure the current, and then irradiating light with a long wavelength of 10 nm each. was performed, and the current response to each light irradiation was measured. It was done in the wavelength range up to 650 nm.
  • An activity spectrum was created from the steady current value (Is) obtained by light irradiation of each wavelength.
  • the wavelength of the light from which the maximum current value was obtained was defined as the maximum active wavelength ⁇ max act.
  • the maximum active wavelength ⁇ max act for each mutant is also shown in FIG.
  • FIG. 2 also shows the activity spectra of the wild type (WT) and the mutants (Y117A, Y117F, Y117N, Y217F, L146A / P218T and T147C / G151A / Y217F).
  • the relative value (ratio) of the current value at 440 nm light irradiation with respect to the current value at the maximum active wavelength is defined as the responsiveness in the blue region, and the current at the maximum active wavelength.
  • the relative value (ratio) of the current value at 600 nm light irradiation with respect to the value was defined as the responsiveness in the red region. Defined.
  • each mutant showed various maximum active wavelengths ⁇ max act depending on the mode of mutation.
  • Y117A, Y117F, Y117N, G169S, W177Y, Y217F, Y218T, S247A, and L146A / Y217F were confirmed to have improved responsiveness in the blue region with the maximum active wavelength shifted to the short wavelength side.
  • the maximum active wavelengths of L53N, V83A, L146A / P218T, and V83A / L146A / P218T were shifted to the long wavelength side, and the responsiveness in the red region was improved.
  • L146A itself has a maximum active wavelength of 530 nm, but has been found to be advantageous in combination with other mutations.
  • T147C / G151A / Y217F has the maximum active wavelength on the short wavelength side of Y217F, and the responsiveness sharply decreases on the long wavelength side, so that the short wavelength It was found to be a mutant that can respond more sensitively on the side.
  • the mutants having a large relative value of the current at 440 nm when irradiated with light are C150A, G169S, W177Y, Y217F, S247A, and L146A / Y217F. It was 0.4 or more in itself, and more than twice as large as the relative value when irradiated with light at 600 nm.
  • the mutants with a large relative value of the current at 600 nm are V83A, L146A, P218T, L146A / C150A, L146A / G169S, L146A / W177Y, L146A / P218A, L146A / P218G, L146A / P218T, V83A / L146A. It was / P218T. All of these relative values were 0.3 or more, and 0.6 times or more of the relative values at the time of light irradiation at 440 nm.
  • the L146A / P218T had two ⁇ max acts and was 510 nm / 560 nm, but obtained a 440 nm relative value at the short wavelength side peak and a 600 nm relative value at the long wavelength side.
  • Y117A, Y117F, Y117N, T147C / G151A, and T147C / G151A / Y217F were also mutants having a large relative value of the current during light irradiation at 440 nm.
  • Y117A, Y117F, and T147C / G151A they were 6 times or more, 6 times or more, and 18 times or more larger than the relative values at the time of light irradiation at 600 nm, respectively.
  • T147C / G151A / Y217F showed almost no current value at 600 nm, so it was found that the response specificity on the shorter wavelength side was superior to that of these mutants.
  • the mutant of GtCCR4, which is the first protein can provide a mutant advantageous for color recognition.
  • Example 1 Electrophysiological measurement of ND7 / 23 cells expressing GtCCR4, a cationic channelrhodopsin derived from G. Theta) Regarding the ND7 / 23 cells expressing GtCCR4 prepared in Example 1, the vector prepared in Example 1 was introduced into the ND7 / 23 cells in the same manner as in Example 1, and the cells in which the expression of GtCCR4 could be confirmed were introduced. Within 24 hours to 48 hours after that, electrophysiological measurements were performed by the whole cell recording patch clamp method under the same conditions as in Example 1.
  • Ip peak-like maximum current value
  • Is steady current value
  • GtCCR4 showed a high channel opening ratio (0.81, 0.85). All of these properties are thought to contribute to visual regeneration by imparting photoresponsiveness to ganglion cells.
  • the channel current value of Chlamydomonas-derived ChR2 of ND7 / 23 cells prepared by the same procedure was about half that of GtCCR4, and the channel opening ratio was 0.45.
  • GtCCR4 are advantageous in terms of channel activity and / or channel aperture ratio as compared with ChR2.
  • This DNA fragment was manipulated in the same manner as in Example 1 to prepare a pEGFP vector by an In-Fusion reaction, and further manipulated in the same manner as in Example 1 to transform ND7 / 23 cells. Transformed cells expressing the mutant were obtained. Furthermore, the same procedure as in Example 2 was carried out to perform electrophysiological measurements on these transformed cells. As a control, cells transformed with Chlamydomonas-derived ChR2 and wild-type GtCCR4 were also measured in the same manner. The results are shown in FIG.
  • E76Q, V83A, V83T, A87S, K137A, L146A, K198A, K204A, S230E and Q231L showed high Ip and Is.
  • E76Q, V83A, V83T, K137A, L146A, K198A, K204A and Q231L showed excellent channel activity against the wild type.
  • E76Q, V83A, V83T, K137A and L146A also had a channel aperture ratio of about 1.
  • a to D of FIG. 7 exemplify the results for Chlamydomonas-derived ChR2, wild-type GtCCR4, V83A mutant and L146A mutant, and E to F show the results for various mutants.
  • the various mutants not only have a higher channel current value than ChR2 and wild-type GtCCR4, but also have a large channel aperture ratio and suppress the channel inactivation. I was able to confirm that it was there. Suppression of inactivation is considered to be suitable for improving photoresponsiveness because the total amount of flowing channel current increases.
  • the double mutant showed about 2 to 4 times the channel activity of wild-type GtCCR4. Further, as shown in B of FIG. 8, the channel opening ratio was also about 0.9 to 1.0, which was higher than that of the wild-type GtCCR4. From the above, it was found that these single mutations are not only useful mutation positions and substitution residues individually, but also useful mutation positions and substitution residues in double mutants. Therefore, it was found that the mutation positions and substitution residues that are excellent as a single mutation are also useful as a double mutant.
  • L53A, L53N, E76Q, V83T, G216S, Q231L and the like showed high Ip and Is. All of these mutants had excellent channel opening ratios, and in particular, L53A, L53N, E76Q, V83T, and Q231L had a channel opening ratio of about 1. From the viewpoint of activity, L53A, V83T, and Q231L were excellent.
  • rat cerebral epithelial primary cultured cells expressing a photoresponsive protein on the cell membrane are irradiated with light having a wavelength that causes a response by varying the light intensity, and the cell membrane potential is measured to measure the light.
  • the light intensity dependence of the stimulus was evaluated.
  • Activation (ignition, excitement) of nerve cells by light irradiation is called light stimulation.
  • an evaluation method of light stimulation an experiment was conducted by the following electrophysiological method. That is, rat cerebral epithelial cells were isolated and cultured on a petri dish. This is called a primary cultured cell.
  • Electrophysiology such as patch clamp method by whole cell recording in a state where each protein is stably expressed within 16 days after introduction of cells in which each protein is transiently expressed on the primary cultured cell membrane in this way. Target measurement was performed.
  • the measurement procedure was as follows. The solution in the prepared cell petri dish was replaced with the extracellular solution of (6) above. Next, the cells were observed under a microscope, and cells that strongly emit eYFP fluorescence were selected. The inside of the tube of the glass pipette produced in (4) above was filled with the intracellular solution of (6) above, and the pipette was connected to the head stage attached to the current amplifier of (1). By manipulating the position of the glass pipette with the micromanipulator described in (5) above, the tip of the glass pipette was moved to about 2-3 microns above the cell.
  • the glass pipette was gradually lowered by a micromanipulator operation and moved to a position where the cells and the tip of the pipette contacted each other. After that, the pressure inside the glass pipette is reduced so that the cell membrane is completely brought into close contact with the tip of the pipette. At this time, the pipette resistance, which was 5 to 10 M ⁇ , rises to about 1 GM. Furthermore, by depressurizing the inside of the pipette, it became a whole cell mode in which whole cell recording was possible.
  • the cell membrane potential was measured by the patch clamp method current fixation method.
  • the membrane potential shows a value of -70 to -80 mV, but when cells expressing a protein with photoresponsive activity are irradiated with light, the cells depolarize and the membrane potential rises. It increased to -20 to -40 mV, after which spike-like nerve activation (excitement, firing) was observed.
  • spike-like nerve activation excitement, firing
  • GtCCR4 was found to be activated at a lower light intensity than Chr2. Comparing EC50, GtCCR4 was 0.02 mW / mm 2 and Chr2 was 0.15 mW / mm 2 , which were more than 7 times different. This means that GtCCR4 has a light sensitivity of 7 times or more that of Chr2. From these facts, if it is a variant of GtCCR4 whose activity is confirmed to be equal to or higher than that of GtCCR4, the protein can be sufficiently expressed in the membrane even with the same light intensity dependence as GtCCR4, that is, low intensity light. It was found that light stimulation is possible in the cells.
  • the positions are 87th, 117th, 120th, 124th, 139th, 142nd, 143th, 146th, 150th, 169th, 173rd, 177th, 217th, 218th, 238th.
  • the protein according to (1) which is one or more selected from the group consisting of positions 245 and 247.
  • the position is one or two or more selected from the group consisting of 53rd, 83rd, 137th, 146th, 169th, 177th, 217th, 218th and 247th.
  • the protein according to (3), wherein the position is one or more selected from the group consisting of 169th, 177th, 217th, 218th and 247th positions.
  • the position is one or two or more selected from the group consisting of 137th, 146th, 150th, 177th, 198th, 238th, 245th and 247th.
  • the protein described. (9) The protein according to (8), wherein the maximum active wavelength is 520 nm or more and less than 530 nm.
  • the position is one or two selected from the group consisting of 87th, 117th, 120th, 124th, 139th, 142nd, 143rd, 173rd, 204th, 216th and 231st.
  • the protein according to (1) which is more than one.
  • the first ratio of the channel activity equivalent value at 440 nm to the channel activity equivalent value at the wavelength ( ⁇ max) at which the protein exhibits maximum channel activity is 0.4 or more, according to (1) to (14). The protein described in any.
  • the second ratio of the channel activity equivalent value at 600 nm to the channel activity equivalent value at the wavelength ( ⁇ max) at which the protein exhibits maximum channel activity is 0.4 or more, according to (1) to (15).
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing visual impairment which comprises the protein according to any one of (1) to (17) or a polynucleotide encoding the protein.

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Abstract

配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の位置：　５３位、８３位、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３７位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、１９８位、２０４位、２１６位、２１７位、２１８位、２３１位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質を、色認識の改善等のために提供する。

Description

色認識のための光応答性タンパク質及びその利用
　本明細書は、色認識のための光応答性タンパク質又はその変異体及びその利用に関する。
（関連出願の相互参照）
　本出願は、２０２０年３月１３日に出願された日本国特許出願である特願２０２０－４４７１３の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を援用するものである。
　失明を来たす眼疾患としては、例えば網膜色素変性症、加齢黄斑変性症等がある。こうした疾患では、網膜における光受容体細胞である桿体細胞及び錐体細胞の変性ないし死滅の結果、最終的には失明に至るとされている。これらの疾患のうち、網膜色素変性症は遺伝子疾患であり、その原因遺伝子は１００種以上が報告されている。つまりこのことは、桿体細胞や錐体細胞の変性・死滅に至る作用機序が患者によって多岐にわたり臨床上の明確な治療法の確立が困難であることを意味するし、実際治療法は確立されていないのが現状である。また、加齢黄斑変性症においても遺伝的要素があるとされ複数の関連遺伝子が報告されつつある。
　外界からの光シグナルは、網膜上の桿体細胞や錐体細胞によって受信され、電気的シグナルに変換され、さらに、かかるシグナルが網膜神経細胞及び視神経、大脳皮質視覚野に到達し、画像として認知される。 
　桿体細胞や錐体細胞において光シグナルを電気シグナルへの変換を担うのはロドプシン、オプシン、または色覚視物質である。現在、網膜色素変性症等に対して、例えば走光性の藻類であるクラミドモナス由来のチャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）をコードする遺伝子を、残存する網膜神経節細胞に導入してこの細胞に光受容能を与えて患者の視機能を回復させる治療を目的に研究が行われている（特許文献１、特許文献２）。
国際公開第２００７／１３１１８０号 国際公開第２０１２／０３２１０３号
　ＣｈＲ２は、光を感じるとＮａ+やＣａ2+を、細胞外から細胞内に、または細胞内から細胞外に運び込む(輸送する)光受容カチオンチャネル(光受容タンパク質)である。すなわち、ＣｈＲ２は、タンパク質分子単独で光を感受すると膜電位変化を生じさせることができるタンパク質である。
　しかしながら、藻類由来のＣｈＲ２であっても、患者の視覚機能の回復には未だ十分ではない。例えば、視覚機能の回復としては、本来有彩色である外界情報を、より適切に、色に関する情報を伴って認識することができるようになることも重要である。
　本明細書は、視覚における色認識のための光応答タンパク質及びその利用を提供する。
　本発明者らは、クリプト藻類であるGuillardia theta（Ｇ. Theta）由来のある種のカチオンチャネルであるチャネルロドプシンの変異体が、色認識に関し有利な特性を有することを見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
［１］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の位置：
５３位、８３位、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３７位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１４７位、１５０位、１５１位、１６９位、１７３位、１７７位、１９８位、２０４位、２１６位、２１７位、２１８位、２３１位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
［２］前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、２１７位、２１８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］に記載のタンパク質。
［３］前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位、１４７位、１５１位、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］記載のタンパク質。
［４］前記位置は、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［３］に記載のタンパク質。
［５］前記位置は、２１７位である、［４］に記載のタンパク質。
［６］前記位置は、１４７位及び／又は１５１位である、［３］に記載のタンパク質。
［７］前記位置は、１４７位及び１５１位である、［６］に記載のタンパク質。
［８］最大活性波長が、５２０ｎｍ未満である、［４］～［７］のいずれかに記載のタンパク質。
［９］前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位及び２１８位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］に記載のタンパク質。
［１０］前記位置は、１４６位である、［９］に記載のタンパク質。
［１１］前記位置は、さらに、１５０位、１６９位、１７７位及び２１８位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１０］に記載のタンパク質。
［１２］最大活性波長が、５３０ｎｍ以上である、［９］～［１１］のいずれかに記載のタンパク質。
［１３］前記位置は、１３７位、１４６位、１５０位、１７７位、１９８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［１４］最大活性波長が、５２０nm以上５３０nm未満である、［１３］に記載のタンパク質。
［１５］前記位置は、１５０位、１６９位、１７７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］に記載のタンパク質。
［１６］前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１７３位、２０４位、２１６位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上である、［１］に記載のタンパク質。
［１７］さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、［１］～［１６］のいずれかに記載のタンパク質。
［１８］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、［１］～［１７］のいずれかに記載のタンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ［１９］前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、［１］～［１８］のいずれかに記載のタンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 ［２０］前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する４４０nmにおけるチャネル活性相当値である第１の比が、０．４以上である、［１］～［１９］のいずれかに記載のタンパク質。
［２１］前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する６００nmにおけるチャネル活性相当値である第２の比が、０．４以上である、［１］～［２０］のいずれかに記載のタンパク質。
［２２］前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、［１］～［２１］のいずれかに記載のタンパク質。
［２３］［１］～［２２］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜における色認識のための光応答性を改善又は回復する使用方法。
［２４］［１］～［２２］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
[２５]前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜剥離及び色覚異常からなる群から選択される、［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、照射光の波長とチャネル活性との関係を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
［２７］［１］～［２２］のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、筋細胞、大脳上皮神経細胞、または海馬神経細胞を光照射により発火を引き起こす使用方法。
ヒトの桿体細胞、錐体細胞における視物質の最大活性波長（λmax act）を示す図である。桿体細胞における視物質（Ｒ）の最大活性波長（４９８ｎｍ）と、錐体細胞における３つの視物質（Ｓ、Ｍ、Ｌ）の最大活性波長（それぞれ、４２０ｎｍ、５３４ｎｍ及び５６４ｎｍ）とを表す。 実施例で得られた変異体の最大活性波長（λmax act）を示す図（Ａ）、Ｇｔ_ＣＣＲ４野生型（WT）、Y217F変異体及びY146A/P218T変異体の活性スペクトルを示す図、及び（Ｃ）ＷＴ、Y217F変異体及びT147C/G151A/Y217F変異体の活性スペクトルを示す図を組み合わせた図である。 実施例で得られた変異体についての５３０nmの波長照射時のチャネル活性の比較結果を示す図である。 実施例で得られた変異体についての５３０nmの波長照射時のチャネル活性の比較結果と、実施例で得られた変異体についての、４４０nmにおけるチャネル活性に対する個々の変異体のλmaxにおけるチャネル活性の比と、６６０nmにおけるチャネル活性に対する個々の変異体のλmaxにおけるチャネル活性の比とを併せて示す図である。 光開閉型イオンチャンネルの模式図（Ａ）、光照射によるチャネル電流測定（Ｂ）、チャネル電流の成分（Ｃ）及びＣｈＲ２、ＧｔＣＣＲ４をそれぞれ発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流（Ｄ）及びチャネル開口率（Ｅ）を示す図である。 ＧｔＣＣＲ４において単一変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流の測定結果を示す図である。 野生型ＣｈＲ２を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ａ）、野生型ＧｔＣＣＲ４を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｂ）、ＧｔＣＣＲ４においてＶ８３Ａ変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｃ）、ＧｔＣＣＲ４においてＬ１４６Ａ変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｄ）、野生型ＧｔＣＣＲ４に比べ活性が向上した単一変異を有する単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル活性の測定結果を示す図（Ｅ、Ｆ）である。 ＧｔＣＣＲ４において二個の変異を有する二重変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流（Ａ）及びチャネル開口率（Ｂ）を示す図である。 ＧｔＣＣＲ４において単一変異を有する他の単変異体を発現したＮＤ７／２３細胞におけるチャネル電流の測定結果を示す図である。 ラット大脳上皮初代培養細胞における神経活動の光刺激実験結果（Ａ）及び（Ｂ）並びに光強度依存性の比較結果（Ｃ）を示す図である。
　本明細書の開示は、色認識のための光応答性を有する光応答性タンパク質に関する。本発明者らが見出した配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＧ. Thetaに由来するカチオン光応答性タンパク質であるＧｔＣＣＲ４（以下、第１のタンパク質ともいう。）が、従来公知のクラミドモナス由来のＣｈＲ２に比較して優れた光応答性を発揮するという知見と、第１のタンパク質に変異を導入した変異体は、第１のタンパク質が最大のチャネル活性を示す最大活性波長である約５２０nmよりも低波長側及び長波長側に最大活性波長や第１のタンパク質とは異なる活性スペクトルを有するという知見に基づく。
　例えば、図１の上段に示すように、ヒトの桿体細胞及び錐体細胞には、それぞれ最大活性波長が４９８nmの桿体視物質及び同４２０nm、５３４nm及び５６４nmの錐体物質を細胞膜に備えている。これらの３種の錐体視物質により、外界の情報の色認識が可能となっている。
　本明細書に開示される第１のタンパク質の変異体（以下、本変異体ともいう。）は、その変異態様により、第１のタンパク質とは異なる１種又は２種以上の波長において最大のチャネル活性を有することができる。換言すれば、本変異体は、変異によって第１のタンパク質とは異なる最大活性波長又は活性スペクトルを有することができる。本変異体を、神経節細胞や双極細胞など網膜の細胞膜上に発現させることにより、その細胞においては、細胞膜に対して入射する光の波長に応じて本変異体固有のイオン透過性（輸送性）が付与され、それに基づくチャネル活性が発揮される。
　例えば、１種又は２種以上の本変異体をそれぞれ細胞膜に発現させた細胞のみを用いることもできるし、こうした本変異体発現細胞と、第１のタンパク質等の本変異体とは異なる最大活性波長や活性スペクトルを有するタンパク質をそれぞれ細胞膜に発現させた１種又は２種以上の他の変異体発現細胞とを組み合わせて用いることができる。本変異体や他の変異体を発現させる１種又は２種以上の細胞としては、神経節細胞、双極細胞、アマクリン細胞及び水平細胞などの細胞から選択される細胞が挙げられる。このような本変異体発現細胞や、本変異体発現細胞に加えて他の変異体発現細胞を網膜に備えるとき、これらの細胞は、入射する光に応じたチャネル活性を網膜において発揮することができる。これにより、網膜は、最終的に脳における色認識の提供やその改善に貢献できる光応答能を獲得することができる。
　本変異体のオリジンである本タンパク質は、本タンパク質の神経節細胞や双極細胞など網膜の細胞膜上での発現量、本タンパク質で構成されるチャネルのイオン透過性（輸送性）及びチャネルの開口率などが優れている。このため、本変異体も、高い感度で色認識のための光応答能を発揮することができる。
　本変異体をコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドを、ウイルスベクターなどを用いて、例えば神経節細胞や双極細胞など網膜の細胞に導入することで、本変異体を神経節細胞や双極細胞など網膜の細胞膜で発現させて、色認識のための高感度の光応答能を発揮させることができる。
　したがって、本変異体又は本変異体をコードするヌクレオチドは、網膜変性疾患や色覚異常などの桿体細胞や錐体細胞の変性を生じる眼疾患の患者における視覚回復に有用である。
　本明細書において、「最大活性波長」とは、光応答性のチャネル活性を有する光応答性タンパク質が最大のチャネル活性を示す照射光の波長（λmax act）をいう。また、本明細書において「活性スペクトル」とは、光応答性のチャネル活性を有する光応答性タンパク質が、４００ｎｍ～７００ｎｍ程度の波長範囲において示すチャネル活性のスペクトルをいう。
　以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「色認識のための光応答性タンパク質及びその利用」を提供するために、他の特徴や開示発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
（第１のタンパク質の変異体）
（１）第１のタンパク質
　第１のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有し、当該アミノ酸配列によって特徴付けられる。第１のタンパク質は、好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのＤＴＤモチーフに相当するＤＴＤ（アスパラギン酸－トレオニン－アスパラギン酸）モチーフを有する３６７アミノ酸残基からなるタンパク質であり、それまで同定されていたＧ． Theta由来のカチオンチャネルロドプシン１～３とはアミノ酸配列の同一性が低いことがわかっている（それぞれに対して３３％、３４％及び３９％）（Biophysics and Physicobiology, Vol． １４， pp． 57-66(2017)）。また、第１のタンパク質は、既述のように、Ｇ. Thetaに由来するタンパク質であり、本発明者らより、光応答性カチオンチャネルタンパク質と同定されたものである（同上）。第１のタンパク質は、Ｎａ+とＨ+との双方を輸送させることができる（同上）。
　第１のタンパク質におけるＤＴＤモチーフは、Ｄ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７位である。なお、光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのＤＴＤモチーフは、そのアミノ酸配列のＤ８５位、Ｔ８９位及びＤ９６位である。第１のタンパク質は、また、このＤＴＤモチーフとさらに、Ｋ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位を備えている。バクテリオロドプシンにおいてはこれらのアミノ酸は、Ｒ８２位、Ｄ２１２位、Ｋ２１６位に相当する。
　また、第１のタンパク質は、そのアミノ酸配列等から、７本のヘリックスを有する７回膜貫通構造を有するイオンチャネルタンパク質であると考えられている。第１のタンパク質は、細胞膜から細胞外側に露出される部位又はその近傍し位置されてイオンチャネルの細胞外側領域を構成する領域（細胞外側領域）と、細胞膜の内部よりに位置されてイオンチャネルの透過経路を構成する領域（ゲート領域）と、細胞膜の細胞質側に存在しイオンチャネル細胞質側領域を構成する領域（細胞質側領域）と、を備えることができる。
　本発明者らによれば、第１のタンパク質におけるこれらの領域は、例えば以下のアミノ酸残基の位置又は領域を割り当てることができると考えられる。第一のタンパク質はＤＴＤモチーフを持つことから、前述した同じくＤＴＤモチーフを持つバクテリオロドプシン（好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプ）とアミノ酸配列や分子構造に相関があると考えた。そこで公知のバクテリオロドプシンの分子構造をもとに、第一のタンパク質内部のイオン透過経路を推定する。なお、本明細書において、特に断りのない限り、第１のタンパク質に関して示すアミノ酸残基の位置は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における位置を表している。
（細胞外側領域）
　第１のタンパク質においては、細胞外側領域は以下のアミノ酸配列領域：１位～４１位、９２位～１１５位、１４７位～１６５位及び２２２位～２３７位であると考えられる。
（細胞質側領域）
　また、第１のタンパク質においては、細胞質側領域は、以下のアミノ酸配列領域：５１位～８２位、１２５位～１３８位、１７４位～２１３位及び２５０位～３６７位であると予想される。
（ゲート領域）
　また、第１のタンパク質においては、ゲート領域は、以下のアミノ酸配列領域：４２位～５０位、８３位～９１位、１１６位～１２４位、１３９位～１４６位、１６６位～１７３位、２１４位～２２１位及び２３８位～２４９位であると推定される。
（チャネル活性）
　第１のタンパク質は、光駆動型プロトンポンプでもある光応答性カチオンチャネル活性を有するタンパク質であり、細胞膜上に発現させたとき、例えば、５３０ｎｍの緑色光を照射すると、プロトン（Ｈ+）とカチオン（Ｎａ+）とが細胞膜を透過することによってチャネル電流が発生する。光照射によりチャネル電流が発生するという活性は、一般にチャネル活性と称される。
　第１のタンパク質のチャネル活性は、例えば、第１のタンパク質を適当な哺乳類の細胞の細胞膜（他に光応答性カチオンチャネルも光駆動型プロトンポンプを備えないことが好ましい）に発現させた上、例えば、極大吸収波長が５３０ｎｍ近傍である一定強度の光を一定時間照射したときに、全細胞記録によるパッチクランプ法で測定することができる。全細胞記録パッチクランプ法は、単一の細胞について、その細胞膜を透過するイオン総量を電荷の移動（電流）として計測する方法である。この方法で測定できるチャネル電流量をチャネル活性とすることができる。
　具体的には、以下の方法が例示される。すなわち、第１のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（必要に応じて哺乳類のコドン用法を用いる。）を合成し、ｅＧＦＰが第１のタンパク質のＣ末端側にタグ付けされるように、かつ第１のタンパク質が十分量発現するように、ｐｅＧＦＰ－Ｎ１などの哺乳類細胞用のベクタープラスミドに組み込んで導入用プラスミドとし、このプラスミドを、ＮＤ／７２３細胞などの哺乳類細胞に、リポフェクション法を用いて導入して形質転換する。第１のタンパク質の導入細胞の細胞膜上での発現は、ｅＧＦＰの蛍光で確認することができる。
　こうして細胞膜に第１のタンパク質を一過的に発現させた細胞につき、導入後、例えば２４～４８時間以内で、第１のタンパク質が安定的に発現している状態で、全細胞記録によるパッチクランプ法などの電気生理学的測定を行う。
　全細胞記録パッチクランプ法などによる電気生理学的測定による測定条件は、特に限定するものではないが、例えば以下の条件を採用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　全細胞記録パッチクランプ法などによる電気生理学的測定法では、例えば、上記の条件で、細胞に光を照射した際に発生するピーク状の最大電流値（Ｉｐ）及び光照射中に一定レベルにまで減衰した電流値（Ｉｓ）をそれぞれ第１のタンパク質のチャネル電流値とすることができる。例えば、Ｉｐ及びＩｓのいずれかまたは双方で、第１のタンパク質のチャネル活性として用いることができる。また、ＩｓをＩｐで除した値を、後述するチャネル開口率とすることができる。
　本変異体は、第１のタンパク質の第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上に相当する位置に、第１のタンパク質におけるのとは異なるアミノ酸残基を備えていればよく、第１のタンパク質を人為的に改変したタンパク質であってよいし、天然由来のタンパク質又はその改変体であってもよい。本変異体は、例えば、第１のアミノ酸配列と一定以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質にも適用される。すなわち、本変異体は、第１のタンパク質と一定以上の同一性を有する範囲で、人工的なタンパク質のほか、第１のタンパク質と同じ由来の藻類ほか、近縁の藻類や微生物由来のカチオンイオンチャネルなどの天然由来タンパク質又はその改変体であってもよい。同一性については後段にて説明する。
　ここで、第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に相当する位置とは、第１のアミノ酸配列に対して、本変異体のアミノ酸配列をアライメントしたときに、第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置に対応付けられる、変異体における１個又は２個以上のアミノ酸残基の位置である。ここで、アライメントとは、後述する、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性の測定において用いるアライメントと同義である。例えば、第１のアミノ酸配列における位置に相当する本変異体の位置は、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）やＰｆａｍ（http://pfam.xfam.org/）などの公知のアミノ酸配列アラインメントプログラムを用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアラインメントさせることにより特定することができる。
　本変異体は、第１のタンパク質とは異なる最大活性波長又は活性スペクトルを有することができる。第1のタンパク質の最大活性波長は、約５２０nmである。また、活性スペクトルは、最大活性波長は、第１のタンパク質のチャネル活性の測定方法において、照射光の波長を、４００～７００ｎｍの範囲、例えば、４１０ｎｍから６５０ｎｍを、短波長側から、例えば、１０ｎｍなど一定波長長い波長の光を照射して、それぞれの光照射に対する電流応答を計測し、最大電流値が得られた光の波長を、最大活性波長とする。また、低波長側から長波長側に順次照射光の波長をシフトしたときの電流値から活性スペクトルを作成する。なお、活性スペクトル計測時の光強度は、例えば、０．１ｍＷ/ｍｍ2、光照射時間は、400 msec、記録時間は、1 secとすることができる。
　以下に、本変異体を構成するための、第１のアミノ酸配列における種々の変異部位を説明する。
　網膜における色認識に貢献する本変異体が備える変異の位置は、例えば、第１のアミノ酸配列において、以下の部位：
５３位、８３位、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３７位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、１９８位、２０４位、２１６位、２１７位、２１８位、２３１位、２３８位、２４５位及び２４７位
からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置である。これらの位置にアミノ酸置換変異を備えることで、第１のタンパク質が有する最大活性波長である約５２０ｎｍよりも短波長側や長波長側へとその最大活性波長をシフトさせたり、第１のタンパク質とは異なる活性スペクトルを付与させたりすることができる。
　また、第１のアミノ酸配列における１４７位及び１５１位も挙げられる。
　各変異部位における置換態様は、例えば以下のとおりである。
53位：L53A、L53Y、L53N、L53M、L53L、L53I、L53C
83位：V83A、V83L、V83I、V83N、V83T、V83D、V83K
87位：A87S、A787K、A87Ｓ
117位：Y117A、Y117D、Y117F、Y117N
120位：T120S
124位：L124Q、L124C、L124T、L124A
137位：K137A、K137E、K137R、K137H、K137D、K137C
139位：T139A、A139D
142位：L142A
143位：F143A
146位：L146A、L146M、L146I、L146V、L146Y、L146C
150位：C150A
169位：G169S
173位：F173Y、F１73A
177位：Ｗ177Ｙ
198位：K198A、K198R、K198H、K198D、K198C
204位：K204A、K204E、K204R、K204H、K1204D、K204C
216位：G216S、G216A、G216T、G216L、G216C、G216Y
217位：Y217F、Y217N
218位：P218A、P218T、P218S、P218G、P218C、P218H、P218N、P218V、P218D
231位：Q231L、Q231A、Q231D、Q231E、Q231T
238位：T238V
245位：A245M
247位：S247A、S247M
147位:T147C
151位:G151A
（変異態様1）
　これらの変異部位のうち、例えば、５３位、８３位、１３７位、１４６位、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上は、波長がシフトしやすい傾向がある及び／又はチャネル活性が向上しやすい傾向がある。例えば、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位は、例えば、５２０ｎｍ未満、また例えば、５１５nm以下のλmax actを有する変異体に有利であり、５３位、８３位、１３７位、１４６位及び２１８位は、５３０nm以上のλmax actを有する変異体に有利である。
　例えば、５３位における変異は、最大活性波長を長波長側にシフトさせやすい傾向がある。５３位におけるそのような置換態様は、L53Nのほか、L53A等が挙げられる。
　例えば、８３位における変異は、最大活性波長を長波長側にシフトさせやすい傾向がある。また、かかる変異は、チャネル活性全体を向上させやすい傾向がある。８３位におけるそのような置換態様は、V83A（λmax act：５４０nm）のほか、V83T等が挙げられる。
　例えば、１３７位における変異は、最大活性波長を長波長側にシフトさせやすい傾向がある。また、かかる変異は、チャネル活性全体を向上させやすい傾向がある。１３７位における置換態様は、K137A（λmax act：５３０nm）が挙げられる。
　例えば、１４６位における変異は、最大活性波長を長波長側にシフトさせやすい傾向がある。また、かかる変異は、チャネル活性全体を向上させやすい傾向がある。１４６位における置換態様は、L146A（λmax act：５３０nm）が挙げられる。
　例えば、１６９位における変異は、最大活性波長を短波長側にシフトさせやすい傾向がある。１６９位における置換態様は、G169S（λmax act：５１０nm）が挙げられる。
　例えば、１７７位における変異は、最大活性波長を短波長側にシフトさせやすい傾向がある。１７７位における置換態様は、W177Y（λmax act:５１０nm）が挙げられる。
　例えば、２１７位における変異は、最大活性波長を短波長側にシフトさせやすい傾向がある。２１７位における置換態様は、Y217F（λmax act:４７５nm）のほか、Y217Nが挙げられる。
　例えば、２１８位における変異は、最大活性波長を長波長側及び短波長側にシフトさせやすい傾向がある。また、かかる変異は、チャネル活性全体を向上させやすい傾向がある。２１８位における置換態様は、P218T（λmax act:５１０nm）、P218Ａ（λmax act:５３０nm）のほか、P218S、P218G、P218等が挙げられる。
　例えば、２４７位における変異は、最大活性波長を短波長側及び長波長側のいずれにもシフトさせやすい傾向がある。また、かかる変異は、チャネル活性全体を向上させやすい傾向がある。２４７位における置換態様は、S247A（λmax act:５１０nm）、S247M（λmax act:５3０nm）が挙げられる。
（変異態様2）
　また、上記変異部位のうち、例えば、１３７位、１４６位、１５０位、１７７位、１９８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上の変異は、λmax actは、５２０nm以上５３０nm未満程度であるが、チャネル活性が高い、他の変異との相加変異体としたときのチャネル活性向上に貢献するなどの点において有利である。
　１３７位における変異としては、例えば、K137Ａであり、１４６位における変異としては、例えば、L146Aであり、１５０位における変異としては、例えば、C150Aであり、１７７位における変異としては、例えば、W177Yであり、１９８位における変異としては、例えば、K198Aであり、２４５位における変異としては、例えば、A245Mであり、２４７位における変異としては、例えば、S247A、S247Mである。
（変異態様3）
　上記変異部位のうち、例えば、１５０位、１６９位、１７７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上は、第１のタンパク質が備えるレチナールと相互作用するアミノ酸残基又はその近傍にあるか又はレチナールと相互作用するアミノ酸残基の立体配置に影響するアミノ酸残基の位置として「初めて」見出されたものであり、第１のタンパク質と異なる最大活性波長又は活性スペクトルの獲得に有利である。
　１５０位における変異としては、例えば、C150Aであり、１６９位における変異としては、例えば、G169Sであり、１７７位における変異としては、例えば、W177Yであり、１９８位における変異としては、例えば、K198Aであり、２１８位における変異としては、例えば、P218A、P218S、P218G、P218Tであり、２４７位における変異としては、例えば、S247A、S247Mである。
（変異態様4）
　上記変異部位のうち、例えば、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１７３位、２０４位、２１６位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上は、第１のタンパク質が備えるレチナールと相互作用するゲート領域のアミノ酸残基又はその近傍の位置であると考えられ、第１のタンパク質と異なる最大活性波長又は活性スペクトルの獲得に有利である。
　８７位における変異としては、例えば、A87S、A787K、A87Ｓであり、１１７位における変異としては、例えば、Y117A、Y117D、Y117F、Y117Nであり、１２０位における変異としては、例えば、T120Sであり、１２４位における変異としては、例えば、L124C、L124T、L124Aであり、１３９位における変異としては、例えば、T139A、T139Dであり、１４２位における変異としては、例えば、L142Aであり、１４３位における変異としては、F143Aであり、１７３位における変異としては、F173Y、F173Aであり、２０４位における変異としては、例えば、K204A、K204Eであり、２１６位における変異としては、例えば、G216Sであり、２３１位における変異としては、例えば、Q231Lである。
　例えば、１１７位の変異は、λmax actの５２０ｎｍ未満の短波長側へのシフトに貢献することができる場合がある。かかる変異としては、例えば、Y117Ａ、Y117F、Y117Nが挙げられる。
（変異態様５）
　上記変異のうち、１４７位は、ゲート領域近傍の細胞外側領域に位置している。かかる変異は、５２０ｎｍ未満のλmax actのシフトに貢献することができる場合がある。また、チャネル活性自体を増大させることができる場合がある。また、ゲート領域における変異であって５２０ｎｍ未満のλmax actへの波長シフトに関与する他の変異との相加変異体としたときのチャネル活性向上に貢献することができる。１４７位における置換態様は、例えば、T147Cが挙げられる。
　また、１５１位は、ゲート領域近傍の細胞外領域に位置している。かかる変異は、５２０ｎｍ未満のλmax actに貢献することができる場合がある。また、チャネル活性自体を増大させることができる場合がある。また、ゲート領域における変異であって５２０ｎｍ未満のλmax actへの波長シフトに関与する他の変異との相加変異体としたときのチャネル活性向上に貢献することができる。１５１位における置換態様は、例えば、G151Aが挙げられる。
　例えば、１４７位及び１５１位の変異の組み合わせは、λmax actの５２０ｎｍ未満の短波長側へのシフトに貢献するとともに、チャネル活性の増大にも貢献することができる。
　また、ゲート領域近傍の細胞外側領域における変異である１４７位及び／又は１５１位における変異と、ゲート領域の変異であってλmax actを短波長側にシフトさせやすい傾向のある２１７位の変異とを組み合わせることができる。この相加変異体においては、２１７位の有するλmax actをさらに短波長側にシフトさせることができる場合がある。例えば、Ｔ１４７Ｃ及びＧ１５１Ａと、Ｙ２１７Ｆとを組み合わせた相加変異体は、λmax actをＹ２１７Ｆの最大活性波長である４７５ｎｍよりもさらにシフトさせることができる。
　本変異体は、チャネル活性を考慮すると、例えば、８３位、８７位、１４６位及び２１６位などのゲート領域から選択される変異を備えることができる。また、細胞質側領域の例えば、５３位、７６位、１３７位、１９８位及び／又は２０４位の変異も適宜組み合わせることもできる。さらにまた、細胞外側領域の２３０位及び／又は２３１位の変異を適宜組みあわせることができる。
　また、本変異体の好ましい態様は、変異部位の少なくとも１個が、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、２１７位、２１８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される態様である。これらの変異部位におけるアミノ酸置換態様は、既に記載したとおりである。
　本変異体は、以上のことから、例えば、以下の変異部位においてアミノ酸置換変異を有していること、又は、当該変異部位について以下の変異態様を採ることが有利な場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　本変異体は、少なくとも１個の変異が、表４に示す変異態様において、Ｌ53Ｎ、V83A、K137A、K198A以外の変異態様から選択されることが好ましい場合がある。また、本変異体は、少なくとも１個の変異が、表５に示す変異態様において、L53A、Ｋ204Ａ、G549S、Q231L以外の変異態様から選択されることが好ましい場合がある。
　なお、本変異体は、以上に記載した位置以外における１～３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異や、さらに、１～３０個以下、また例えば、２５個以下、また例えば、２０個以下、また例えば１５個以下、また例えば、１０個以下、また例えば数個以下のアミノ酸残基の置換変異、欠失変異及び／又は挿入変異を備えることもできる。
　なお、本変異体は、上記した色認識のための変異に、加えて、細胞外側領域、細胞質領域及びゲート領域において、以下の各種変異を備えることもできる。これらの変異部位及び変異態様は、チャネル活性及び／又は開口率の向上に基づく観点であるが、色認識のための変異部位及び変異態様と重複する場合もある。
（細胞外側領域における変異）
　細胞外側領域は上記のとおり、１位～４１位、９２位～１１５位、１４７位～１６５位及び２２２位～２３７位と考えられるが、これらのアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、３９位、９４位、９８位、１０２位、１１０位、１１３位、１１４位、１６２位、２２４位及び２２５位等が挙げられる。また例えば、２３０位、２３１位、２３５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｄ３９Ｎ、Ｒ９４Ｍ、Ｒ９４Ｋ、Ｒ９４Ｑ、Ｈ９８Ａ、Ｄ１０２Ｎ、Ｎ１１０Ｌ、Ｋ１１３Ａ、Ｋ１１３Ｎ、Ｙ１１４Ａ、Ｒ１６２Ａ、Ｓ２３０Ｅが挙げられ、また例えば、Ｔ２２４Ａ、Ｅ２２５Ａ、Ｅ２２５Ｑ、Ｑ２３１Ｌ、Ｈ２３５Ａ、Ｈ２３５Ｎ、Ｈ２３５Ｍが挙げられる。
（細胞質側領域における変異）
　細胞質側領域は、上記のとおり、５１位～８２位、１２５位～１３８位、１７４位～２１３位及び２５０位～３６７位であると推定されるが、このアミノ酸領域におけるにおける変異位置としては、例えば、５３位、６１位、６８位、７４位、７６位、８０位、１３０位、１３７位、１９４位、１９５位及び１９８位等が挙げられる。また例えば、２００位、２０４位、２０５位、２０９位、２１０位、２５３位及び２５４位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｋ６１Ａ、Ｒ７４Ａ、Ｅ７６Ｑ、Ｓ８０Ａ、Ｋ１３７Ｅ、Ｋ１３７Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｒ２００Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｋ２０４Ｅが挙げられ、また例えば、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ６８Ｑ、Ｗ１３０Ａ、Ｅ１９４Ｑ、Ｄ１９５Ｎ、Ｌ２０５Ａ、Ｌ２０９Ａ、Ｙ２１０Ｆ、Ｌ２５３Ｎ、Ｌ２５３Ｓ、Ｌ２５４Ｎ、Ｌ２５４Ｓが挙げられる。
（ゲート領域における変異）
　ゲート領域は、上記のとおり、４２位～５０位、８３位～９１位、１１６位～１２４位、１３９位～１４６位、１６６位～１７３位、２１４位～２２１位及び２３８位～２４９位であると推定されるが、このアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、４６位、８３位、８４位、８７位、９０位、９１位、１１６位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１７３位が挙げられる。また例えば、２１４位、２１６位、２１７位、２３８位、２４２位及び２４５位が挙げられる。置換変異としては、例えば、Ｌ４６Ａ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｖ８３Ｄ、Ｖ８３Ｋ、Ｎ８４Ｐ、Ｎ８４Ｋ、Ａ８７Ｓ、Ａ８７Ｎ、Ａ８７Ｋ、Ｔ９０Ａ、Ｙ９１Ａ、Ｄ１１６Ａ、Ｄ１１６Ｔ、Ｙ１１７Ａ、Ｔ１２０Ｓ、Ｌ１２４Ｃ、Ｌ１２４Ｔ、及びＬ１２４Ａが挙げられる。また例えば、Ｔ１３９Ａ、Ｔ１３９Ｄ、Ｌ１４２Ａ、Ｆ１４３Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｙ、Ｗ２１４Ａ、Ｗ２１４Ｙ、Ｇ２１６Ｓ、Ｙ２１７Ａ、Ｙ２１７Ｆ、Ｙ２１７Ｗ、Ｔ２３８Ａ、Ｔ２３８Ｋ、Ｔ２３８Ｄ、Ｄ２４２ＡおよびＤ２４２Ｎ、A２４５Ｎ及びA２４５Ｓが挙げられる。
　例えば、こうした変異としては、以下の表６に示す置換変異が挙げられる。また、表７に示す置換変異も挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本変異体は、第１のタンパク質が有するＤＴＤモチーフを備えていることが好ましい。すなわち、第１のアミノ酸配列におけるＤ１１６位、Ｔ１２０位及びＤ１２７位に相当する位置にアミノ酸残基（それぞれＤ、Ｔ及びＤ）を備えることが好ましい。さらに、本変異体は、このＤＴＤモチーフとさらに、第１のアミノ酸配列におけるＫ１１３位、Ｄ２４２位及びＫ２４６位から選択される１個又は２個以上に相当するアミノ酸残基を備えることが好ましい。
　本変異体が有する、第１のアミノ酸配列との同一性は、特に限定するものではないが、例えば、７５％以上であり、また例えば、８０％以上であり、また例えば、８５％以上であり、また例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９７％以上であり、また例えば、９８％以上であり、また例えば、９９％以上であり、また例えば、９９．５％以上である。また類似性は、例えば、８０％以上であり、また例えば、８５％以上であり、また例えば、９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば、９７％以上であり、また例えば、９８％以上であり、また例えば、９９％以上であり、また例えば、９９．５％以上である。
　本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で"同一性"とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸残基又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（例えば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))やUniProtKBのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProtKBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
　なお、アミノ酸配列のアラインメントは、BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）などにおけるアミノ酸配列アラインメントプログラム（blastp）を用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアラインメントさせることにより特定することができる。
（本変異体の最大活性波長λmax act等）
　例えば、図1に示すように、本変異体は、種々の最大活性波長を有することができる。本変異体の最大活性波長λmax act等に応じて、ヒトの錐体細胞に発現されているＳ錐体、Ｍ錐体及びＬ錐体のいずれかとして用いることができる。それぞれの錐体を代替する最大活性波長は、適宜設定されるが、例えば、が、４００ｎｍ以上５１５ｎｍ以下であれば、例えば、ヒトの短波長に感度ピークを有するＳ錐体などとして利用できる。また例えば、本変異体の最大活性波長λmax actが、５１５ｎｍ以上５４５ｎｍ以下のときには、Ｍ錐体などとして利用でいる。また例えば、最大活性波長λmax actが、５４０ｎｍ以上６００ｎｍ以下のときには、Ｌ錐体などとして利用できる。
　また、本変異体は、第1のタンパク質と比べて最大活性波長が短波長側又は長波長側にシフトしているとき、第1のタンパク質と異なる活性スペクトルを有しているといえる。また、本変異体は、第1のタンパク質と最大活性波長が同等であっても、例えば、活性スペクトルのピーク近傍にショルダーピークを有するときや、第１のタンパク質の活性スペクトルのピークのシャープネス（ピーク幅が狭い）が高い場合なども、第1のタンパク質と異なる活性スペクトルを有しているといえる。
　例えば、本変異体の最大活性波長におけるチャネル活性相当値に対する４４０nmにおけるチャネル活性相当値の比である第１の比及び最大活性波長におけるチャネル活性相当値に対する６００ｎｍにおけるチャネル活性相当値の比である第２の比に基づいて、本変異体間における活性スペクトルの対比及び本変異体と第１のタンパク質とにおける活性スペクトルの対比が可能となる。
　第１のタンパク質は、第１の比が０．３で、第２の比が０．１８程度であり、第１の比／第２の比が、１．６７であり、第２の比／第１の比が、０．６であるが、例えば、第１の比が第２の比の２倍以上程度であれば、最大活性波長λmax actが、第１のタンパク質よりも短波長側にシフトする傾向がある。第１の比が第２の比よりさらに３倍以上、また例えば、４倍以上大きいと、一層短波長側にシフトする傾向がある。また、第１の比が、例えば、０．４以上、また例えば、０．５以上、また例えば、０．６以上、また例えば、０．７以上、また例えば、０．８以上のときなどは、短波長側に最大活性波長を有する傾向が高くなるとともに、最大活性波長λmax actより短波長側にさらにショルダーピークなどを備える場合もある。
　一方、第２の比が第１の比の、例えば、０．７倍以上、また例えば、０．８倍以上、また例えば、０．９倍以上、また例えば、１．０倍以上、また例えば、１．１倍以上、また例えば、１．２倍以上、また例えば、１．３倍以上、また例えば、１．４倍以上であれば、最大活性波長λmax actが、第１のタンパク質よりも長波長側にシフトする傾向がある。さらに例えば、第２の比が、例えば、０．３以上、また例えば、０．４以上、また例えば、０．５以上、また例えば、０．６以上、また例えば、０．７以上、また例えば、０．８以上、また例えば、０．９以上のときなどは、短波長側に最大活性波長を有する傾向が高くなるとともに、最大活性波長λmax actより長波長側にさらにショルダーピークなどを備える場合もある。
　本変異体は、最大活性波長λmax actと活性スペクトルを規定する第１の比及び第２の比によって、その色応答性を特徴づけることができる。
　本変異体は、チャネル活性を有している。チャネル活性は、第１のタンパク質について説明したのと同様の方法で確認できる。本変異体は、一定以上のチャネル活性を有することが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、ｐA/pF３０以上、また例えば、ｐA/pFが４０以上であることが好ましい。
　また、本変異体は、チャネル活性を有するが、最大活性波長におけるチャネル活性は、上記測定方法に準じたとき、例えば、第１のタンパク質が有するチャネル活性pA/pFの、３０％以上、また例えば、４０％以上、また例えば、５０％以上、また例えば、５０％以上、また例えば、６０％以上，また例えば、７０％以上、また例えば、８０％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、１００％以上である。
　また、本変異体は、そのチャネル開口率が一定以上であることが好ましい。例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件（照射時間４００ｍＳ）で測定したときの、チャネル開口率（Ｉｓ／Ｉｐ）が，例えば、0．7以上、また例えば、０．８以上、また例えば、０．８５以上、また例えば、０．９以上、また例えば、０．９５以上、また例えば、０．９７以上、また例えば、０．９８以上、また例えば、０．９９以上であることが好ましい。
　また、本変異体は、チャネル開口率についても、第１のタンパク質と同様に測定することができる。第１のタンパク質の開口率（Ｉｓ／Ｉｐ）を１００％としたときの本変異体のチャネル開口率は、特に限定するものではないが、例えば、第１のタンパク質の３０％、また例えば、４０％以上、また例えば、５０％以上、また例えば、５０％以上、また例えば、６０％以上，また例えば、７０％以上、また例えば、８０％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、１００％以上である。
　当業者は、本明細書に開示される本変異体の変異位置及び好適な置換例に基づいて、種々の変異体及び相加体を作製、その評価を行い、意図した最大活性波長や活性スペクトル等を有する本変異体を得ることができる。
　当業者は、第１のタンパク質及び本変異体のＮ末端やＣ末端に対して、例えば、種々のタンパク質を融合することができる。
　当業者であれば、本変異体は、例えば、第１のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２）を、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって改変ＤＮＡを取得し、当該改変ＤＮＡ等に基づいて取得することができる。改変ＤＮＡを取得する手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば、商業的に入手可能な種々の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いて変異が導入される。
　例えば、本変異体は、こうして得られた改変ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物によってP. pastorisなどの宿主を形質転換し、この形質転換細胞を、当業者に公知の通常の方法に従って培養し、当該培養細胞または培地から本変異体を回収することによって得ることができる。例えば、本変異体は、慣用の精製技術を組み合わせて単離することができる。そのような技術には、硫安分画、有機溶媒処理、遠心分離、限外濾過、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動等が包含される。
　そのほか、ＧＦＰなどのシグナルタンパク質をコードするＤＮＡを融合した改変ＤＮＡを、哺乳類神経細胞ＮＤ７／２３細胞などに導入して、細胞膜に発現させて取得することもできる。
（ポリヌクレオチド）
　本明細書に開示されるポリヌクレオチド（以下、単に、本ポリヌクレオチドともいう。）は、本変異体のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるポリヌクレオチドは、種々の形態を採ることができるが、当該アミノ酸配列のコード領域は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、典型的にはＤＮＡである。
　本ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片のほか、プラスミド、ベクター等の形質転換等に適した公知の形態を採ることができる。
　本ポリヌクレオチドは、本変異体を得るためのＤＮＡとして人工的に合成することにより得ることができるほか、既述のとおり、既述の変異体取得方法に基づいてＤＮＡとして取得することができる。
（ベクター）
　本明細書に開示されるベクター（以下、本ベクターともいう。）は、本ポリヌクレオチドを備えることができる。本ベクターは、宿主細胞において本変異体を発現させることを目的とするものである。発現ベクターは、形質転換しようとする細胞の種類や目的等に応じて種々の形態を採ることができる。
　本ポリヌクレオチドは、例えば、適切な調節配列および／または標的配列の付加、および／または、コーディング配列の、選択された宿主の好ましいコドン使用頻度が適宜適用される。例えば、標的配列は、細胞膜、シナプス、ポストシナプス部位、または軸索小丘、または小胞体などの、細胞内の特定の部位または区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に光誘起イオンチャネルを標的化する、Ｎ末端又はＣ末端伸張部分をコードしうるものである。当業者であれば、このようなベクターを本願出願時の周知技術に基づいて容易に構築することができる。
　本変異体を発現するためのベクターの取得方法やその構成要素については、ＧＦＰを用いる分野やその他遺伝子工学的分野における当業者に周知である。例えば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
　本明細書に開示されるベクターは、例えば、網膜神経細胞の色認識のための光応答性を回復し視覚（色覚）を改善又は再生等するためなどに用いる場合には、以下の態様が適用される。
　本ベクターは、眼疾患の遺伝子治療に好適でありうる。特に、ウイルス媒介性の遺伝子導入に利用されうる。「ウイルス媒介性の遺伝子導入」においては、本ベクターがウイルスにパックされ、その結果、対象の部位または細胞に送達できることを意味する。遺伝子治療に好適なウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられる。なお、遺伝子治療は、裸のＤＮＡ、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用などの非ウイルス性の方法も包含するものである。
　眼疾患を意図した本ベクターとしては、例えば、既に、このような治療用のタンパク質をコードする遺伝子の導入によって視覚機能再生を意図するのに用いられている公知のベクターを用いることができる。例えば、ＡＡＶ－２ウィルスベクターなどを用いることができ、プロモーターとしては、例えば、ＣＡＧプロモーター、ヒトギャップ接合性タンパク質（コネキシン－３６）プロモーター（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＫＰら、２００７，Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＯＮ－Ｔｙｐｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ．ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ，２００７）、ｍＧｌｕＲ６プロモーターが利用可能である。
　細胞特異的なプロモーターを用いて、特定のタイプの網膜神経細胞を標的することが可能である。桿体双極細胞を標的し得るプロモーターは、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロモーターである（Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍら、２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５７～６３）。活性プロモーターの長さは好ましくは、２．５Ｋｂ未満であり、そのため、これは、ＡＡＶウイルスカセット中にパッケージングされ得る。
（標的細胞の形質転換及び形質転換細胞）
　本明細書に開示される形質転換細胞（以下、本形質転換細胞ともいう。）は、本変異体を発現可能に本ポリヌクレオチドを保持する。本形質転換細胞は、既述の本ベクターやnaked DNAである本ポリヌクレオチドなどを、標的細胞に導入することにより得ることができる。標的細胞への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。
　形質転換細胞は、また例えば、上記のとおり、ウイルスを用いることにより、本ヌクレオチドが細胞に導入されることによっても提供される。形質転換細胞は、その作製手法や用途によって、生体外の細胞であってもよいが、生体内の細胞であってもよいし、生体外で作製され、生体内に移植されるものであってもよい。なお、形質転換細胞としての標的細胞は、後段にて説明する。
（本タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本形質転換細胞の視覚の再生等への利用）
　本タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本形質転換細胞（以下、本タンパク質等ともいう。）は、色覚異常を含む視覚障害を改善又は視覚機能再生等するためなどに用いることができる。すなわち、いずれも、眼疾患の予防又は治療のための研究及び光遺伝学用途に用いることができる。特に限定するものではないが、遺伝子治療によって、本変異体を所定の網膜細胞又は網膜近傍の非網膜細胞である神経細胞等において発現させることにより、網膜の光応答性を改善又は回復させることができる。当該細胞に光応答性を付与して、これにより視覚を改善又は再生することができる。
　本明細書において、視覚障害または眼疾患としては、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病網膜症網膜静脈閉塞緑内障又は色覚異常等が挙げられ、好ましくは、網膜色素変性症又は加齢黄斑変性症が挙げられる。本明細書において治療とは、細胞が変性、死滅、脱落するなどして網膜の機能を失った状態に対して、神経細胞等の色認識のための光応答性を改善または回復させることにより、色覚などの視覚機能の改善、回復または症状の進行の抑制を図るものである。本明細書において予防とは、細胞の変性、死滅または脱落が進行する蓋然性が高くなり、視覚障害を発症する危険性の高くなった状況において、神経細胞の光応答性を改善又は回復させ、更には機能喪失を予防し、または視覚障害の発症の遅延を図るものである。本明細書に開示される「タンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬」には、このような遺伝子治療のために使用されるものが含まれる。例えば、当該医薬は、標的組織における該タンパク質発現用ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、該細胞内での複製維持、安定性、発現効率等に優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとして、これに限定されるものではないが、例えばアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。本発明のタンパク質発現用ベクターは、例えばＴｏｍｉｔａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７ Ａｕｇ；４８（８）：３８２１－６；及びＳｕｇａｎｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００５ Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１－８に記載される方法に従って製造し、標的組織の細胞等に遺伝子導入することができる。また、本変異体は、こうした視覚再生等又は光遺伝学のために研究目的にも利用される。
　視覚の再生等、眼疾患の治療を意図した本ベクターは、例えば、全てのタイプの神経節細胞（ＯＮおよびＯＦＦの両方の神経節細胞）、または全てのタイプの双極細胞（桿体双極細胞、ならびにＯＮおよびＯＦＦ錐体双極細胞）を対象とするように構成することができる。
　したがって、本明細書によれば、本変異体を含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物が提供される。なお、特に限定するものではないが、視覚障害としては、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞、緑内障又は色覚異常等が挙げられる。
　光応答性タンパク質をコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療は公知であり、本タンパク質等についても、同様の手法又は当該手法に準じて眼疾患の遺伝子治療や研究用途に適用可能である。
（本変異体の光遺伝学への利用）
　また、本変異体は、光遺伝学を用いて各種の神経経路の研究用途及び神経疾患の治療等への用途にも有用である。一般に、神経細胞の細胞内外には電位差（電圧差）が存在する。通常時（抑制時）細胞内が細胞外に比べておよそ－７０ｍＶ～－８０ｍＶ程度である。この状態を過分極という。神経細胞の活性化（または発火、興奮）は、細胞膜内外の電位差が－４０ｍＶ～－２０ｍＶまで上昇した際に（脱分極と呼ぶ）、膜電位依存性ナトリウムチャネルが活性化することで引き起こされる。第１のタンパク質は光応答性カチオンチャネルであるため、神経細胞膜に発現させると、光照射に伴い陽イオンを透過することでチャネル電流を発生させる。その結果、細胞膜を脱分極させ、結果として神経細胞を活性化（発火、興奮）させることができる。
　したがって、例えば、本ベクター又は本ベクターを組み込んだウイルスを用いて、標的細胞としての神経細胞を形質転換して、本変異体を標的細胞にて発現させる。こうすることで形質転換された神経細胞は、光照射により、チャネル電流を発生するようになる。こうした形質転換神経細胞を生体外で調製して生体に移植するかあるいは本ベクター等を生体内の神経細胞を形質転換することで、生体内に外部からの光照射に応答して活性化する神経経路を構築することができる。特に、長波長側に最大活性波長λmax actを有する本変異体は、組織浸透性が高いため、光遺伝学用途に好適である。
　したがって、本明細書に開示されるタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、筋細胞、大脳上皮神経細胞、または海馬神経細胞を、例えば、青色光（４３０～４４０ｎｍ）などの光照射により発火を引き起こす使用方法が提示される。
（標的細胞）
　形質転換細胞の標的細胞としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏ－ｍｙｃｅｓ Ｐｏｍｂｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母が挙げられる。
　また、他の標的細胞としては、哺乳動物細胞または昆虫細胞が挙げられる。例えば、哺乳類細胞としては、メラノーマ細胞（例えば、ＢＬＭ細胞株）、ＣＯＳ細胞（「アフリカミドリザル腎臓ＣＶ１」細胞感染により生成される）、ＨＥＫ細胞（「ヒト胎児腎臓細胞」例えばＨＥＫ２９３細胞）、ＢＨＫ細胞（「ベビーハムスター腎細胞」）における一時的発現としてのエピソーマルベクターで、またはＣＨＯ細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはＭＤＣＫ細胞（「Ｍａｄｉｎｅ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞」）が挙げられ、昆虫細胞としては、バキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞等が挙げられる。
　光応答性を得るための視覚再生等の観点からは、標的細胞は、哺乳動物細胞は光受容細胞；網膜桿状体細胞；網膜錐体細胞；網膜神経節細胞；双極ニューロン；神経節細胞；偽単極ニューロン；多極ニューロン；ピラミッド状ニューロン；プルキンエ細胞；または、顆粒細胞などである。
　光遺伝学等の観点からは、標的細胞としては、例えば、哺乳類細胞を含む動物細胞が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、神経芽腫細胞（例えば、NG108-15細胞）、メラノーマ細胞（例えば、BLM細胞株）、COS細胞（「アフリカミドリザル腎臓CV1細胞」より産生される）、HEK細胞（「ヒト胚性腎臓細胞」、例えば、HEK293細胞）、又はBHK-細胞（「ベビーハムスター腎臓細胞」）を用いて、あるいは、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはMDCK細胞（「Madby-Darbyイヌ腎臓細胞」）が挙げられる。また、バキュロウイルスを感染させたＳｆ９昆虫細胞内で可能である。
　哺乳類細胞は、また例えば、電気的に興奮性の細胞である。例えば、海馬細胞、双極神経細胞；神経節細胞；偽単極性神経細胞；多極神経細胞；錐体神経細胞、プルキンエ細胞；又は顆粒細胞である。電気的に興奮性の細胞には、また、接触、音、光および感覚器官の細胞に影響を及ぼすその他多くの刺激に応答する感覚神経細胞、脳および脊髄からシグナルを受けて筋肉収縮を引き起こしたり腺に影響する運動神経細胞、ならびに脳または脊髄の同じ領域内で神経細胞同士を接続する介在神経細胞などの多様な神経細胞が含まれる。さらに、心筋、平滑筋及び骨格筋等も挙げられる。
　標的細胞は、また例えば、動物の個体内における細胞、組織及び器官であり、最終的に動物個体やその一部を作製可能な受精卵、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞等である。動物個体としては、例えば、ハエ、線虫、マウス、ラット、サル等が挙げられる。さらに、こうして取得された結果として、こうした形質転換動物又はその一部等が挙げられる。
　形質転換される標的細胞は単離され（および遺伝学的に改変され）、維持され、適切な温度およびガス混合（典型的には、３７℃、５％ＣＯ2）で、任意に、当業者に既知および実施例における特定の細胞株または細胞型のために例示された、細胞培養器内で、培養され得る。培養条件は各々の細胞型により変化し得、特定の細胞型のための条件の変化は異なった表現型をもたらすことができる。温度とガス混合は別として、細胞培養系における最も一般的な変化の要素は増殖培地である。増殖培地のための組成は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、および特に他の栄養成分の存在において変化できる。増殖培地は、商業的に利用可能であるか、またはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な組成に従って、調製できる。補足培地に使用される増殖因子はしばしば子牛血清などの動物血液由来である。追加で、抗生物質が増殖培地に加えられ得る。一般的な操作の中で、培養細胞上で実施されるものは、培地変更および細胞通過である。
（神経細胞に光応答性を付与する方法)
　本変異体は、神経細胞に光応答性を付与することができる。このため、本方法は、視覚障害を改善又は視覚機能を再生する方法を実施することができるほか、オプトジェネティクスに応用可能である。例えば、マウス海馬の攻撃性や記憶形成に関与すると考えられる領域に存在する神経細胞に、光応答性を付与するタンパク質又はポリヌクレオチドを導入することで、実際にその領域が攻撃性や記憶形成にどう関与するかどうか検証することができる（Lin,Dら、2011, Nature.470(7333)：221-6及びOKUYAMAら，2016，Science (6307) 1536-1541）。
　また例えば、ヒト又は非ヒト動物の、中枢又は末梢における神経細胞に光応答性を付与し、所定の波長及び強度の光の照射によってチャネル電流を発生させることができるため、これにより神経細胞を活性化することで、当該領域の神経細胞の活性化や抑制が特定の疾患に関与しているかどうかを検証することができる。また、こうした神経細胞の活性化により、中枢又は末梢の神経回路を回復させて、神経変性疾患などを治療することができる場合がある。
（光応答性細胞）
　本明細書によれば、色認識のための光応答性が付与された上記標的細胞が、新たな光応答性細胞(光応答性材料）として提供される。かかる光応答性細胞は、例えば、光遺伝学の分野において、神経活動の活性化等が関連する研究に用いることができる。
（スクリーニング方法）
　本明細書に開示されるスクリーニング方法は、配列番号１で表される第１のアミノ酸配列の１個又は２個以上の位置に相当する位置に第１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、照射光の照射波長とチャネル活性との関係を評価する工程を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、第１のタンパク質をオリジンとして、色認識のためのチャネル活性を備える変異体を取得することができる。なお、ここでいうチャネル活性は、例えば、既述の電気生理学的測定法により測定することができる。また、チャネル活性は、既述のＩｐ、Ｉｓ及びチャネル開口率のいずれかあるいは２以上の組みあわせを採用することができる。
　これらのスクリーニング方法で用いる被験体である変異体は、既述の変異体の作製方法に基づいて得ることができる。また、チャネル活性の評価についても既に説明した態様を適用することができる。
　以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その１）
　ＧｔＣＣＲ４のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、種々の単一の変異及び多重変異を付与した変異体を設計した。既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社)により作製した。なお、変異体の置換変異の内容については、図２に示す。
　このＤＮＡ断片に関して、それぞれ、以下に示すプライマーを用いて、増幅した。また、ベクターＤＮＡ（pEGFP-N1）もインバースＰＣＲにより増幅した。増幅したＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を、それぞれ、In－Fusion反応により、それぞれ、各ＤＮＡ断片を組み込んだpEGFP-GtCCR4mutantを作製した。
ＤＮＡ断片（Gｔ ＣＣＲ４由来の変異体をコードする）を取得するためのプライマー
フォワードプライマー：
5' CGAGCTCAAGCTTATGATGACAACAAGCGCCCCTAG 3'（配列番号３）
リバースプライマー：
5' GACCGGTGGATCCTGAACAGCCTCAGACTCTTGCA 3'（配列番号４）
vector pEGFP-N1のベクター断片を取得するためのプライマーフォワードプライマー：5'CATAAGCTTGAGCTCGAGATC3'（配列番号５）
リバースプライマー：5'CAGGATCCACCGGTCGCCACC3'（配列番号６）
　次いで、マウス神経／ラット脊髄後根神経節由来であって、マウス芽細胞腫×ラット神経由来であるＮＤ７／２３細胞を、ＤＭＥＭ（High glucose）＋ＦＢＳ５％培地を用いてＣＯ2インキュベータ中３７℃で培養した。この細胞に、作製したベクターを、リポフェクション法(Lipofectamine 2000(Thermo Fischer社)を用いてプラスミドＤＮＡをＮＤ７／２３細胞に導入した。ＮＤ７／２３細胞におけるＧｔＣＣＲ４ mutantの発現は、ＧＦＰ蛍光により確認した。
　細胞への遺伝子導入後、２４時間以降４８時間以内に以下の条件で全細胞記録パッチクランプ法により電気生理学測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　電気生理学的測定においては、各変異体につき、照射光の波長を変更しつつ、電流応答を計測して、波長依存性（活性スペクトル）及び最大活性波長λmax actを測定した。
（活性スペクトル及び最大活性波長の測定）
　波長依存性（活性スペクトル）の測定は、照射光：光強度は常に０．１ｍＷ／ｍｍ2とし、まず４１０nmの波長の光を照射し電流測定を行い、その後１０ｎｍづつ波長が長い光による光照射を行い、それぞれの光照射に対する電流応答を計測した。それを６５０ｎｍまでの波長の範囲で行った。各波長の光照射で得られた定常的な電流値（Ｉｓ））から活性スペクトルを作成した。また、最大電流値が得られた光の波長を最大活性波長λmax actとした。各変異体についての最大活性波長λmax actを、図２に併せて示す。また、図２には、野生型（ＷＴ）及び変異体（Y117A、Y117F、Y117N、Y217F、L146A/P218T及びT147C/G151A/Y217F）の各活性スペクトルも併せて示す。
（青色領域及び赤色領域での光応答性の評価）
　上記の実験で得られた活性スペクトルの結果のうち、最大活性波長における電流値に対する、４４０nmの光照射における電流値の相対値（比）を青色領域における応答性と定義し、最大活性波長における電流値に対する、６００nmの光照射における電流値の相対値（比）を赤色領域における応答性とした。定義した。これらの結果を図３及び図４に示す。
　図２（Ａ）に示すように、各変異体は、変異の態様に応じて種々の最大活性波長λmax actを示した。なかでも、Y117A、Y117F、Y117N、G169S、W177Y、Y217F、Y218T、S247A、L146A/Y217Fが短波長側に最大活性波長がシフトし、青色領域での応答性の向上が確認された。また、L53Ｎ、V83A、L146A/P218T、V83A/L146A/P218Tが、長波長側に最大活性波長がシフトし、赤色領域での応答性の向上が確認された。L146Aは、それ自体の最大活性波長は５３０nmであるが、他の変異との組み合わせに有利であることがわかった。
　また、図２（Ｂ）及び同（Ｃ）に示すように、Y217F、L146A/P218T及びT147C/G151A/Y217Fは、いずれも、新たな視物質候補となり得ることがわかった。また、図2（Ｃ）に示すように、T147C/G151A/Y217Fは、最も、Y217Fよりも短波長側に最大活性波長を有するとともに、その長波長側において応答性が急減しており、短波長側でより高感度に応答できる変異体であることがわかった。
　また、図３及び図４に示すように、４４０nmの光照射時電流の相対値が大きい変異体は、C150A、G169S、W177Y、Y217F、S247A、L146A/Y217Fであり、これらの上記相対値は、それ自体が0．4以上であるとともに、６００nmの光照射時の相対値よりも、2倍以上大きかった。一方、６００nmの光照射時電流の相対値が大きい変異体は、V83A、L146A、P218T、L146A/C150A、L146A/G169S、L146A/W177Y、L146A/P218A、L146A/P218G、L146A/P218T、V83A/L146A/P218Tであった。これらの上記相対値は、いずれも、0．3以上であり、また、４４０nmの光照射時の相対値の０．６倍以上であった。なお、L146A/P218Tは、λmax actが二つあり、510ｎｍ/560ｎｍであったが、短波長側ピークで440ｎｍ相対値を、長波長側で600ｎｍ相対値を取得した。
　また、図４に示すように、Y117A、Y117F、Y117N、Ｔ147C/Ｇ151A、T147C/G151A/Y217Fも、４４０nmの光照射時電流の相対値が大きい変異体であった。Y117A、Y117F、Ｔ147C/Ｇ151Aにあっては、それぞれ、６００nmの光照射時の相対値よりも、6倍以上、6倍以上、18倍以上大きかった。また、T147C/G151A/Y217Fにあっては、６００ｎｍにおいてほとんど電流値を示さないため、これらの変異体よりも、一層短波長側での応答特異性に優れることがわかった。
　以上のことから、第１のタンパク質であるＧｔＣＣＲ４の変異体は、色認識に有利な変異体を提供できることがわかった。
（Ｇ. Theta由来のカチオンチャネルロドプシンであるＧｔＣＣＲ４を発現するＮＤ７／２３細胞の電気生理学的測定）
　実施例１で作製したＧｔＣＣＲ４を発現するＮＤ７／２３細胞について、実施例１で作製したベクターを実施例１と同様にしてＮＤ７／２３細胞へ導入し、ＧｔＣＣＲ４の発現を確認できた細胞につき、導入後２４時間以降４８時間以内に、実施例１と同一の条件で全細胞記録パッチクランプ法により電気生理学測定を行った。
　すなわち、細胞に光を照射し、細胞に４００ｍｓの時間光を照射した際に発生するピーク状の最大電流値（Ｉｐ）及び光照射中に一定レベルにまで減衰した定常的な電流値（Ｉｓ）をそれぞれ測定した。さらに、ＩｓをＩｐで除した値を、チャネル開口率とした。測定原理等について図５のＡ～Ｃに示し、測定結果を、同Ｄ、Ｅに示す。
　図５のＤ、Ｅに示すように、ＧｔＣＣＲ４は、大きなチャネル電流が発生していた。また、ＧｔＣＣＲ４は、いずれも、高いチャネル開口率（０．８１、０．８５）を示した。これらの特性は、いずれも、神経節細胞に光応答性を付与して視覚再生するのに貢献するものと考えられる。なお、同様に操作して作製したＮＤ7/23細胞のクラミドモナス由来ＣｈＲ２によるチャネル電流値は、ＧｔＣＣＲ４の約半分であり、チャネル開口率は、０．４５であった。
　以上のことから、ＧｔＣＣＲ４は、いずれも、ＣｈＲ２に比較してチャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利であることがわかった。
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その１）
　ＧｔＣＣＲ４のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計した。既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法（QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社）により作製した。なお、単変異体の置換変異の内容については、図６に併せて示す。
　このＤＮＡ断片に関して、実施例１と同様に操作して、In－Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、さらに、実施例１と同様に操作してＮＤ7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得した。さらに、実施例２と同様に操作して、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、クラミドモナス由来のＣｈＲ２及び野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても同様にして測定した。結果を図６に示す。
　図６に示すように、いくつかの変異体がチャネル電流値に関し、野生型よりも優れた結果を示した。例えば、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ａ８７Ｓ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ、Ｓ２３０Ｅ及びＱ２３１Ｌが、高いＩｐ及びＩｓを示した。これらのうち、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ及びＱ２３１Ｌは、野生型に対して優れたチャネル活性を示した。また、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｋ１３７Ａ及びＬ１４６Ａは、チャネル開口率も約１であった。
　以上のことから、上記した変異位置は、いずれも、ＧｔＣＣＲ４においてチャネル活性を制御するのに有用な変異位置であることがわかった。上記変異位置及びアミノ酸置換残基は、チャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利なアミノ酸置換変異であることがわかった。
　なお、野生型ＧｔＣＣＲ４と同等のチャネル活性を示す変異であっても、クラミドモナス由来ＣｈＲ２よりは十分に高いチャネル活性及び／又はチャネル開口率を呈しており、有用な変異位置及び置換残基であると考えられた。
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その２）
　実施例３で作製したＥ７６Ｑ、Ｖ８３Ａ、Ｋ１３７Ａ、Ｌ１４６Ａ、Ｋ１９８Ａ、Ｋ２０４Ａ及びＱ２３１Ｌの各単一変異を有する単変異体を発現させる形質転換細胞について、電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４、実施例３で作製したＶ８３Ａ変異体による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。なお、光照射条件は、図７に示すとおりとした。結果を、図７に示す。
　図７のＡ～Ｄに、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４、Ｖ８３Ａ変異体及びＬ１４６Ａ変異体についての結果を例示し、同Ｅ～Ｆに、各種変異体についての結果を示す。図７のＡ～Ｆに示すように、各種変異体はＣｈＲ２及び野生型ＧｔＣＣＲ４に比較してチャネル電流値が高いだけでなく、チャネル開口率が大きく、また、チャネルの不活性化が抑制されていることを確認できた。不活性化の抑制は、流れるチャネル電流の総量が増大することになるため、光応答性の向上に好適であると考えられる。
　以上のことから、これらの変異体は、いずれも有用性の高い変異体であり、これらの変異位置及び置換残基がチャネル活性やチャネル開口率に貢献していると考えられた。
（ＧｔＣＣＲ４の二重変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ７／２３の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定）
　実施例３及び実施例４にて確認した単一変異のうちある種の組みあわせについて、実施例１及び２に準じてベクターを作製し、実施例２と同様にして電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ＣｈＲ２、野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。結果を、図８に示す。
　図８のＡに示すように、二重変異体は、野生型ＧｔＣＣＲ４の２倍～４倍程度のチャネル活性を示した。また、図８のＢに示すように、そのチャネル開口率も、野生型ＧｔＣＣＲ４を上回って概ね０．９～１．０であった。以上のことから、これらの単一変異は、個々に有用な変異位置及び置換残基であるほか、二重変異体においても有用な変異位置及び置換残基であることがわかった。したがって、単一変異として優れた変異位置及び置換残基は、二重変異体としても有用であることがわかった。
（ＧｔＣＣＲ４変異体をコードするＤＮＡを含むベクターの作製及びＮＤ7/23の形質転換及び形質転換細胞の電気的生理学的測定その３）
　実施例３に準じて、ＧｔＣＣＲ４のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計し、既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法によりＤＮＡ断片を作製した。引き続き実施例２に準じて、In－Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、ＮＤ7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得し、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、野生型ＧｔＣＣＲ４による形質転換細胞についても同様にして測定した。単変異体の置換変異の内容及び電気生理学的測定結果を、併せて図９に示す。
　図９に示すように、いくつかの変異体がチャネル電流値に関し、野生型よりも優れた結果を示した。例えば、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ｔ、Ｇ２１６Ｓ、Ｑ２３１Ｌなどが高いＩｐ及びＩｓを示した。これらの変異体は、チャネル開口率もいずれも優れたものであり、特に、Ｌ５３Ａ、Ｌ５３Ｎ、Ｅ７６Ｑ、Ｖ８３Ｔ、Ｑ２３１Ｌは、チャネル開口率も約１であった。活性の観点からは、Ｌ５３Ａ、Ｖ８３Ｔ、Ｑ２３１Ｌが優れていた。
　また、Ｌ４６Ａ、Ｅ６８Ｑ、Ｒ９４Ｋ、Ｆ１７３Ｙ、Ｔ２２４Ａ、Ｈ２３５Ａ、Ｈ２３５Ｎの活性は、野生型と概ね同等であったが、クラミドモナス由来ＣｈＲ２よりは十分に高いチャネル活性及び／又はチャネル開口率を呈すると考えられるため、有用な変異位置及び置換残基であると考えられた。
　以上のことから、上記した変異位置は、いずれも、ＧｔＣＣＲ４においてチャネル活性を制御するのに有用な変異位置であることがわかった。上記変異位置及びアミノ酸置換残基は、チャネル活性及び／又はチャネル開口率に関して有利なアミノ酸置換変異であることがわかった。
（神経細胞光刺激実験）
　本実施例では、光応答性タンパク質を細胞膜に発現させたラット大脳上皮初代培養細胞に、光強度を種々に変えて応答を引き起こす波長の光を照射して、その細胞膜電位を測定して、光刺激における光強度依存性を評価した。
　神経細胞を光照射によって、活性化（発火、興奮）させることを光刺激という。本実施例では、光刺激の評価法としては、以下のような電気生理学的手法による実験を行った。すなわち、ラット大脳上皮細胞を単離し、シャーレ上で培養した。これを初代培養細胞と呼ぶ。この初代培養細胞にＧｔＣＣＲ４（ＷＴ）及びＣｈｒ２（ＷＴ）を実施例１、２等に準じて発現させた上、それぞれ極大吸収波長５３０ｎｍ及び４８８ｎｍで種々の強度の光を一定時間照射したときに、全細胞記録によるパッチクランプ法の電流固定法で単一の神経細胞についての興奮（脱分極）と過分極（抑制）を計測し、細胞膜電位の時間変化を計測した。
　具体的には、ＧｔＣＣＲ４及びＣｈＲ２の各アミノ酸配列をコードするＤＮＡ（哺乳類のコドン用法を用いた）を合成し、ｅＹＦＰがこれらのタンパク質のＣ末端側にタグ付けされるように、ＣＡＭＫ２プロモーターを持つ神経細胞用のベクタープラスミドに組み込んで導入用プラスミドとし、このプラスミドをラット大脳上皮初代培養細胞に、リン酸カルシウム法を用いて導入してトランスフェクションした。各タンパク質の導入細胞の細胞膜上での発現は、ｅＹＦＰの蛍光で確認することができた。
　こうして初代培養細胞膜に各タンパク質を一過的に発現させた細胞につき、導入後、１６日以内で、各タンパク質が安定的に発現している状態で、全細胞記録によるパッチクランプ法などの電気生理学的測定を行った。
　全細胞記録パッチクランプ法による電流固定法による測定条件は、以下の条件を採用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　測定手順は、以下のとおりとした。準備した細胞シャーレ内の溶液を上記（６）の細胞外溶液に交換した。次に顕微鏡下で細胞を観察し、eYFP蛍光を強く発する細胞を選んだ。上記（４）で製造したガラスピペットの管内を上記（６）の細胞内溶液で満たし、（１）の電流増幅器付属のヘッドステージに接続した。ガラスピペットの位置を上記（５）のマイクロマニュピレーターで操作することでガラスピペット先端を、細胞上部約２－３ミクロンに移動させた。さらにマイクロマニュピレーター操作により徐々にガラスピペットを降下させ、細胞とピペット先端が接触する位置に移動させた。その後ガラスピペット内を減圧することで細胞膜を完全にピペット先端に密着させる。この時５～１０ＭΩであったピペット抵抗が１ＧＭ程度まで上昇する。さらにピペット内を減圧させることで全細胞記録ができるホールセルモードとなった。
　上記の状態に達したのち、パッチクランプ法電流固定法により細胞膜電位を計測した。神経細胞が抑制された際には膜電位は－７０～－８０ｍＶの値を示すが、光応答活性を有するタンパク質を発現させた細胞に光照射を行うと細胞が脱分極を起こすので膜電位がー２０～－４０ｍＶに上昇し、その後スパイク状の神経の活性化（興奮、発火）が観察された。上記の条件で測定したときの脱分極の程度、すなわち、スパイク状の神経興奮の頻度を計測することでこれらのタンパク質の光刺激の効果を検証した。結果を図１０に示す。
　図１０の（Ａ）～（Ｃ）に示すように、ＧｔＣＣＲ４は、Ｃｈｒ２に比較して、低い光強度で活性化することがわかった。ＥＣ５０を比較するとＧｔＣＣＲ４は０．０２ｍＷ/ｍｍ2，Ｃｈｒ２は０．１５ｍＷ/ｍｍ2と７倍以上の差があった。これはＧｔＣＣＲ４はＣｈｒ２の７倍以上の光感度を有することを意味する。これらのことから、ＧｔＣＣＲ４と同等以上の活性が確認されているＧｔＣＣＲ４の変異体であれば、ＧｔＣＣＲ４と同様の光強度依存性、すなわち、低強度の光でも十分に、当該タンパク質を膜で発現している細胞において光刺激可能であることがわかった。
　なお、本明細書によれば、以下に示す開示を包含している。
（１）配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の位置：
５３位、８３位、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３７位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、１９８位、２０４位、２１６位、２１７位、２１８位、２３１位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
（２）前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、２１７位、２１８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（１）に記載のタンパク質。
（３）前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（１）に記載のタンパク質。
（４）前記位置は、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（３）に記載のタンパク質。
（５）最大活性波長が、５２０ｎｍ未満である、（４）に記載のタンパク質。
（６）前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位及び２１８位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（３）に記載のタンパク質。
（７）最大活性波長が、５３０ｎｍ以上である、（６）に記載のタンパク質。
（８）前記位置は、１３７位、１４６位、１５０位、１７７位、１９８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（１）に記載のタンパク質。
（９）最大活性波長が、５２０nm以上５３０nm未満である、（８）に記載のタンパク質。
（１０）前記位置は、１５０位、１６９位、１７７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（１）又は（２）に記載のタンパク質。
（１１）前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１７３位、２０４位、２１６位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上である、（１）に記載のタンパク質。
（１２）さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、（１）～（１１）のいずれかに記載のタンパク質。
（１３）前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、（１）～（１２）のいずれかに記載のタンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 （１４）前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、（１）～（１２）のいずれかに記載のタンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 （１５）前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する４４０nmにおけるチャネル活性相当値である第１の比が、０．４以上である、（１）～（１４）のいずれかに記載のタンパク質。
（１６）前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する６００nmにおけるチャネル活性相当値である第２の比が、０．４以上である、（１）～（１５）のいずれかに記載のタンパク質。
（１７）前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、（１）～（１６）のいずれかに記載のタンパク質。
（１８）（１）～（１７）のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜における色認識のための光応答性を改善又は回復する使用方法。
（１９）（１）～（１７）のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
（２０）前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜剥離、糖尿病網膜症、及び色覚異常からなる群から選択される、（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、照射光の波長とチャネル活性との関係を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
配列番号３～６：プライマー

Claims (27)

  1. 　配列番号１で表される第１のアミノ酸配列において以下の位置：
    ５３位、８３位、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３７位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１４７位、１５０位、１５１位、１６９位、１７３位、１７７位、１９８位、２０４位、２１６位、２１７位、２１８位、２３１位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上に相当する位置において、前記第１のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
  2. 　前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１４６位、１５０位、１６９位、１７３位、１７７位、２１７位、２１８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位、１４７位、１５１位、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 　前記位置は、１６９位、１７７位、２１７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項３に記載のタンパク質。
  5. 　前記位置は、２１７位である、請求項４に記載のタンパク質。
  6. 　前記位置は、１４７位及び／又は１５１位である、請求項３に記載のタンパク質。
  7. 　前記位置は、１４７位及び１５１位である、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 　最大活性波長が、５２０ｎｍ未満である、請求項４～７のいずれかに記載のタンパク質。
  9. 　前記位置は、５３位、８３位、１３７位、１４６位及び２１８位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１に記載のタンパク質。
  10. 　前記位置は、１４６位である、請求項９に記載のタンパク質。
  11. 　前記位置は、さらに、１５０位、１６９位、１７７位及び２１８位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 　最大活性波長が、５３０ｎｍ以上である、請求項９～１１のいずれかに記載のタンパク質。
  13. 　前記位置は、１３７位、１４６位、１５０位、１７７位、１９８位、２３８位、２４５位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  14. 　最大活性波長が、５２０nm以上５３０nm未満である、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 　前記位置は、１５０位、１６９位、１７７位、２１８位及び２４７位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１に記載のタンパク質。
  16. 　前記位置は、８７位、１１７位、１２０位、１２４位、１３９位、１４２位、１４３位、１７３位、２０４位、２１６位及び２３１位からなる群から選択される１個又は２個以上である、請求項１に記載のタンパク質。
  17. 　さらに、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、請求項１～１６のいずれかに記載のタンパク質。
  18. 　前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、請求項１～１７のいずれかに記載のタンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  19. 　前記タンパク質は、前記第１のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかの態様のアミノ酸置換を備える、請求項１～１８のいずれかに記載のタンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  20. 　前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する４４０nmにおけるチャネル活性相当値である第１の比が、０．４以上である、請求項１～１９のいずれかに記載のタンパク質。
  21. 　前記タンパク質が最大チャネル活性を示す波長（λmax）におけるチャネル活性相当値に対する６００nmにおけるチャネル活性相当値である第２の比が、０．４以上である、請求項１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
  22. 　前記タンパク質のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有する、請求項１～２１のいずれかに記載のタンパク質。
  23. 　請求項１～２２のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜における色認識のための光応答性を改善又は回復する使用方法。
  24. 　請求項１～２２のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
  25. 　前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜剥離及び色覚異常からなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 　配列番号１で表される第１のアミノ酸配列における１個又は２個以上の位置において第１のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、照射光の波長とチャネル活性との関係を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
  27. 　請求項１～２２のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、筋細胞、大脳上皮神経細胞、または海馬神経細胞を光照射により発火を引き起こす使用方法。
     
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