JP7492777B2 - 光応答性タンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年9月14日に出願された日本国特許出願である特願2018-172990の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容をここに援用するものである。
(1)39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位、225位、230位、231位及び235位、
(2)53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位、198位、200位、204位、205位、209位、210位、253位及び254位並びに
(3)46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位、214位、216位、217位、238位、242位及び245位
からなる群から選択される1個又は2個以上に相当する位置において、前記第1のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
[2]さらに、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、[1]に記載のタンパク質。
[3]前記チャネル活性は、以下からなる群から選択される1種又は2種以上を満たす、[1]又は[2]に記載のタンパク質。
(a)チャネル活性(Ip)が1000pA以上である
(b)チャネル活性(Is)が800pA以上である
(c)チャネル開口率(Is/Ip)が0.85以上である
[4]前記1個又は2個以上の位置は、前記第1のタンパク質のゲート領域、細胞外側領域及び細胞質側領域からなる群から選択される少なくとも1種である、[1]~[3]のいずれかに記載のタンパク質。
[5]前記1個又は2個以上の位置は、第1のアミノ酸配列における53位、76位、83位、87位、137位、146位、198位、204位、216位、230位及び231位からなる群から選択される1個又は2個以上の位置に相当する位置である、[1]~[4]のいずれかに記載のタンパク質。
[6]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列において前記1個又は2個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、[1]~[5]のいずれかに記載のタンパク質。
[7]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列において前記1個又は2個以上に相当する位置に備えられる以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかの異なるアミノ酸残基を備える、[1]~[5]のいずれかに記載のタンパク質。
[8]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、[1]~[7]のいずれかに記載のタンパク質。
[9]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、[1]~[7]のいずれかに記載のタンパク質。
[10]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における前記1個又は2個以上に相当する位置において、L53A、L53N、E76Q,V83A,V83T、A87S、K137A,L146A,K198A,K204A、G216S、S230E及びQ231Lからなる群から選択される1個又は2個以上のアミノ酸置換を備える、[1]~[9]のいずれかに記載のタンパク質。
[11]前記タンパク質のアミノ酸配列は、第1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有する、[1]~[10]のいずれかに記載のタンパク質。
[12]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と90%以上の同一性を有するタンパク質であってチャネル活性を有するタンパク質を含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
[13]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列において、以下の(1)~(3):
(1)39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位、225位、231位及び235位、
(2)53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位、198位、200位、204位、205位、209位、210位、253位及び254位、並びに
(3)46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位、214位、216位、217位、238位、242位及び245位
からなる群から選択される1個又は2個以上に相当する位置において、前記第2のアミノ酸配列において備えられるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
[14]前記タンパク質のアミノ酸配列は、前記第2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有する、[13]に記載のタンパク質。
[15][1]~[11]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[16][15]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[17][12]~[14]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[18][17]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[19][1]~[14]のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜の光応答性を回復する使用方法。
[20][1]~[14]のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
[21]前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、[20]に記載の医薬組成物。
[22]配列番号1で表される第1のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置において第1のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
[23]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置において第1のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
(第1のタンパク質)
第1のタンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる。第1のタンパク質は、好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのDTDモチーフに相当するDTD(アスパラギン酸-トレオニン-アスパラギン酸)モチーフを有する367アミノ酸残基からなるタンパク質であり、それまで同定されていたG. Theta由来のカチオンチャネルロドプシン1~3とはアミノ酸配列の同一性が低いことがわかっている(それぞれに対して33%、34%及び39%)(Biophysics and Physicobiology, Vol. 14, pp. 57-66(2017))。また、第1のタンパク質は、既述のように、G. Thetaに由来するタンパク質であり、本発明者らより、光応答性カチオンチャネルタンパク質と同定されたものである(同上)。第1のタンパク質は、Na+とH+との双方を輸送させることができる(同上)。
第1のタンパク質においては、細胞外側領域は以下のアミノ酸配列領域:1位~41位、92位~115位、147位~165位及び222位~237位であると考えられる。
また、第1のタンパク質においては、細胞質側領域は、以下のアミノ酸配列領域:51位~82位、125位~138位、174位~213位及び250位~367位であると予想される。
また、第1のタンパク質においては、ゲート領域は、以下のアミノ酸配列領域:42位~50位、83位~91位、116位~124位、139位~146位、166位~173位、214位~221位及び238位~249位であると推定される。
第1のタンパク質は、光駆動型プロトンポンプでもある光応答性カチオンチャネル活性を有するタンパク質であり、細胞膜上に発現させたとき、例えば、530nmの緑色光を照射すると、プロトン(H+)とカチオン(Na+)とが細胞膜を透過することによってチャネル電流が発生する。光照射によりチャネル電流が発生するという活性は、一般にチャネル活性と称される。
チャネル開口率は、イオンチャネルタンパク質としての、光応答性カチオンチャネルの有用な特徴である。チャネル開口率が十分に大きければ、全体としてチャネル電流量が増大するからである。
第1のタンパク質の変異体(以下、単に、第1の変異体ともいう。)は、配列番号1で表される第1のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置に相当する位置において、第1のタンパク質とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有するタンパク質である。
細胞外側領域は上記のとおり、1位~41位、92位~115位、147位~165位及び222位~237位と考えられるが、これらのアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位及び225位等が挙げられる。また例えば、230位、231位、235位が挙げられる。置換変異としては、例えば、D39N、R94M、R94K、R94Q、H98A、D102N、N110L、K113A、K113N、Y114A、R162A、S230Eが挙げられ、また例えば、T224A、E225A、E225Q、Q231L、H235A、H235N、H235Mが挙げられる。
細胞質側領域は、上記のとおり、51位~82位、125位~138位、174位~213位及び250位~367位であると推定されるが、このアミノ酸領域におけるにおける変異位置としては、例えば、53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位及び198位等が挙げられる。また例えば、200位、204位、205位、209位、210位、253位及び254位が挙げられる。置換変異としては、例えば、K61A、R74A、E76Q、S80A、K137E、K137A、K198A、R200A、K204A、K204Eが挙げられ、また例えば、L53A、L53N、E68Q、W130A、E194Q、D195N、L205A、L209A、Y210F、L253N、L253S、L254N、L254Sが挙げられる。
ゲート領域は、上記のとおり、42位~50位、83位~91位、116位~124位、139位~146位、166位~173位、214位~221位及び238位~249位であると推定されるが、このアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位が挙げられる。また例えば、214位、216位、217位、238位、242位及び245位が挙げられる。置換変異としては、例えば、L46A、V83A、V83T、V83D、V83K、N84P、N84K、A87S、A87N、A87K、T90A、Y91A、D116A、D116T、Y117A、T120S、L124C、L124T、及びL124Aが挙げられる。また例えば、T139A、T139D、L142A、F143A、L146A、F173A、F173Y、W214A、W214Y、G216S、Y217A、Y217F、Y217W、T238A、T238K、T238D、D242AおよびD242N、L245N及びL245Sが挙げられる。
Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))やUniProtKBのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProtKBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
(第2のタンパク質)
第2のタンパク質は、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる。第2のタンパク質は、好塩性古細菌由来の光駆動型プロトンポンプであるバクテリオロドプシンのDTDモチーフに相当するDTD(アスパラギン酸-トレオニン-アスパラギン酸)モチーフを有する371アミノ酸残基からなるタンパク質であり、それまで同定されていたG. Theta由来のカチオンチャネルロドプシン1~3とはアミノ酸配列の同一性が低い(それぞれに対して33%、34%及び39%)一方、第1のタンパク質とのアミノ酸配列の同一性は、85%である。
第2のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置:
1位~41位、92位~115位、147位~165位、222位~237位が細胞外側領域であると考えられる。
また、第2のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置:51位~82位、125位~138位、174位~213位、250位~371位が細胞質側領域であると考えられる。
また、第2のタンパク質においては、例えば、そのアミノ酸配列の以下の位置:
42位~50位、83位~91位、116位~124位、139位~146位、166位~173位、214位~221位、238位~249位がゲート領域であると考えられる。
第2のタンパク質も、第1のタンパク質と同様、チャネル活性を有しており、第1のタンパク質に関して記載したのと同様の方法でIp、Is及びチャネル開口率を測定することができる。第2のタンパク質は、例えば、既述のチャネル活性の評価方法及び電気生理学記録条件(照射時間400mS)で測定したときの、Ipが500pA以上及び/又はIsが400pA以上、また例えば、Ipが750以上及び/又はIsが650以上であることが好ましい。
第2のタンパク質の変異体(以下、単に、第2の変異体ともいう。)は、配列番号3で表される第2のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置に相当する位置において、第2のタンパク質とは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有するタンパク質である。
第2のタンパク質における細胞外側領域は1位~41位、92位~115位、147位~165位、222位~237位であると考えられるが、これらのアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位及び225位等が挙げられる。また例えば、230位、231位、235位が挙げられる。置換変異としては、例えば、D39N、R94M、R94K、R94Q、H98A、D102N、N110L、K113A、K113N、Y114A、R162A、S230Eが挙げられ、また例えば、T224A、E225A、E225Q、Q231L、H235A、H235N、H235Mが挙げられる。
第2のタンパク質における細胞質側領域は、51位~82位、125位~138位、174位~213位及び250位~371位であると推定されるが、このアミノ酸領域におけるにおける変異位置としては、例えば、53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位及び198位等が挙げられる。また例えば、200位、204位、205位、209位、210位、253位及び254位が挙げられる。置換変異としては、例えば、K61A、R74A、E76Q、S80A、K137E、K137A、K198A、R200A、K204A、K204Eが挙げられ、また例えば、L53A、L53N、E68Q、W130A、E194Q、D195N、L205A、L209A、Y210F、L253N及びL253S、L254N、L254Sが挙げられる。
第2のタンパク質におけるゲート領域は、42位~50位、83位~91位、116位~124位、139位~146位、166位~173位、214位~221位及び238位~249位であると推定されるが、このアミノ酸領域における変異位置としては、例えば、46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位が挙げられる。また例えば、214位、216位、217位、238位、242位及び245位が挙げられる。置換変異としては、例えば、L46A、V83A、V83T、V83D、V83K、N84P、N84K、A87S、A87N、A87K、T90A、Y91A、D116A、D116T、Y117A、T120S、L124C、L124T、及びL124Aが挙げられる。また例えば、T139A、T139D、L142A、F143A、L146A、F173A、F173Y、W214A、W214Y、G216S、Y217A、Y217F、Y217W、T238A、T238K、T238D、D242A、D242N、L245N及びL245Sが挙げられる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチド(以下、単に、本ポリヌクレオチドともいう。)は、本タンパク質のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるポリヌクレオチドは、種々の形態を採ることができるが、当該アミノ酸配列のコード領域は、DNA又はRNAであり、典型的にはDNAである。
本明細書に開示されるベクター(以下、本ベクターともいう。)は、本ポリヌクレオチドを備えることができる。本ベクターは、宿主細胞において本タンパク質を発現させることを目的とするものである。発現ベクターは、形質転換しようとする細胞の種類や目的等に応じて種々の形態を採ることができる。
本明細書に開示される形質転換細胞(以下、本形質転換細胞ともいう。)は、本タンパク質を発現可能に本ポリヌクレオチドを保持する。本形質転換細胞は、既述の本ベクターやnaked DNAである本ポリヌクレオチドなどを、標的細胞に導入することにより得ることができる。標的細胞への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。
本タンパク質、本ポリヌクレオチド、本ベクター及び本形質転換細胞(以下、本タンパク質等ともいう。)は、視覚障害を改善又は視覚機能再生等するためなどに用いることができる。すなわち、いずれも、眼疾患の予防又は治療のための研究及び光遺伝学用途に用いることができる。特に限定するものではないが、遺伝子治療によって、本タンパク質を所定の網膜細胞又は網膜近傍の非網膜細胞である神経細胞等において発現させることにより、網膜の光応答性を改善又は回復させることができる。当該細胞に光応答性を付与して、これにより視覚を改善又は再生することができる。
Vis Sci.2007 Aug;48(8):3821-6;及びSugano E et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.2005 Sep;46(9):3341-8に記載される方法に従って製造し、標的組織の細胞等に遺伝子導入することができる。また、本タンパク質等は、こうした視覚再生等又は光遺伝学のために研究目的にも利用される。
また、本タンパク質等は、光遺伝学を用いて各種の神経経路の研究用途及び神経疾患の治療等への用途にも有用である。一般に、神経細胞の細胞内外には電位差(電圧差)が存在する。通常時(抑制時)細胞内が細胞外に比べておよそ-70mV~-80mV程度である。この状態を過分極という。神経細胞の活性化(または発火、興奮)は、細胞膜内外の電位差が-40mV~-20mVまで上昇した際に(脱分極と呼ぶ)、膜電位依存性ナトリウムチャネルが活性化することで引き起こされる。第1のタンパク質は光応答性カチオンチャネルであるため、神経細胞膜に発現させると、光照射に伴い陽イオンを透過することでチャネル電流を発生させる。その結果、細胞膜を脱分極させ、結果として神経細胞を活性化(発火、興奮)させることができる。
形質転換細胞の標的細胞としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharo-myces Pombe)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母が挙げられる。
本タンパク質等は、神経細胞に光応答性を付与することができる。このため、本方法は、視覚障害を改善又は視覚機能を再生する方法を実施することができるほか、オプトジェネティクスに応用可能である。例えば、マウス海馬の攻撃性や記憶形成に関与すると考えられる領域に存在する神経細胞に、光応答性を付与するタンパク質又はポリヌクレオチドを導入することで、実際にその領域が攻撃性や記憶形成にどう関与するかどうか検証することができる(Lin,Dら、2011,Nature.470(7333):221-6及びOKUYAMAら、2016,Science (6307) 1536-1541)。
本明細書によれば、光応答性が付与された上記標的細胞が、新たな光応答性細胞(光応答性材料)として提供される。かかる光応答性細胞は、例えば、光遺伝学の分野において、神経活動の活性化等が関連する研究に用いることができる。
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、配列番号1で表される第1のアミノ酸配列の1個又は2個以上の位置に相当する位置に第1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備えることができる。また、本明細書に開示される他のスクリーニング方法は、配列番号3で表される第2のアミノ酸配列の1個又は2個以上の位置に相当する位置に第2のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備えることができる。これらのスクリーニング方法によれば、第1のタンパク質及び第2のタンパク質について、より優れたチャネル活性を備える変異体を取得することができる。なお、ここでいうチャネル活性は、例えば、既述の電気生理学的測定法により測定することができる。また、チャネル活性は、既述のIp、Is及びチャネル開口率のいずれかあるいは2以上の組みあわせを採用することができる。いずれのチャネル活性に基づいてあるいはどのような組みあわせで被験体タンパク質のチャネル活性を評価するかは、変異体を取得する目的等によって適宜選択される。
(1)39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位、225位、230位、231位及び235位、
(2)53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位、198位、200位、204位、205位、209位及び210位、並びに
(3)46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位、214位、216位、217位、238位及び242位
からなる群から選択される1個又は2個以上に相当する位置において、前記第1のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
[2]さらに、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備える、[1]に記載のタンパク質。
[3]前記チャネル活性は、以下から選択されるいずれかを満たす、[1]又は[2]に記載のタンパク質。
(a)チャネル活性(Ip)が1000pA以上である
(b)チャネル活性(Is)が800pA以上である
(c)チャネル開口率(Is/Ip)が0.85以上である
[4]前記1個又は2個以上の位置は、前記第1のタンパク質のゲート領域、細胞外側領域及び細胞質側領域から選択される、[1]~[3]のいずれかに記載のタンパク質。
[5]前記1個又は2個以上の位置は、第1のアミノ酸配列における76位、83位、87位、137位、146位、198位、204位、230位及び231位からなる群から選択される1個又は2個以上の位置に相当する位置である、[1]~[4]のいずれかに記載のタンパク質。
[6]前記タンパク質は、前記1個又は2個以上に相当する位置における前記第1のアミノ酸配列における以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかのアミノ酸残基を備える、[1]~[5]のいずれかに記載のタンパク質。
[7]前記タンパク質は、前記1個又は2個以上に相当する位置における前記第1のアミノ酸配列における以下のアミノ酸残基に対して、以下のいずれかのアミノ酸残基を備える、[1]~[5]のいずれかに記載のタンパク質。
[8]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、[1]~[7]のいずれかに記載のタンパク質。
[9]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における以下の位置に相当する位置において、以下のいずれかのアミノ酸置換を備える、[1]~[7]のいずれかに記載のタンパク質。
[10]前記タンパク質は、前記第1のアミノ酸配列における前記1個又は2個以上に相当する位置において備える異なるアミノ酸残基は、E76Q,V83A,V83T、A87S、K137A,L146A,K198A,K204A、S230E及びQ231Lからなる群から選択される1個又は2個以上を備える、[1]~[9]のいずれかに記載のタンパク質。
[11]前記タンパク質のアミノ酸配列は、第1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有する、[1]~[10]のいずれかに記載のタンパク質。
[12]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と90%以上の同一性を有するタンパク質であってチャネル活性を有するタンパク質を含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
[13]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列において、以下の(1)~(3):
(1)39位、94位、98位、102位、110位、113位、114位、162位、224位、225位、231位及び235位、
(2)53位、61位、68位、74位、76位、80位、130位、137位、194位、195位、198位、200位、204位、205位、209位及び210位、並びに
(3)46位、83位、84位、87位、90位、91位、116位、117位、120位、124位、139位、142位、143位、146位、173位、214位、216位、217位、238位及び242位
からなる群から選択される1個又は2個以上に相当する位置において、前記第2のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備え、チャネル活性を有する、タンパク質。
[14]前記タンパク質のアミノ酸配列は、前記第2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有する、[13]に記載のタンパク質。
[15][1]~[11]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[16][15]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[17][12]~[14]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[18][17]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[19][1]~[14]のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、網膜の光応答性を回復する使用方法。
[20][1]~[14]のいずれかに記載のタンパク質又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
[21]前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、請求項[20]に記載の医薬組成物。
[22]配列番号1で表される第1のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置において第1のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
[23]配列番号3で表される第2のアミノ酸配列における1個又は2個以上の位置において第1のアミノ酸配列におけるのとは異なるアミノ酸残基を備える被験体タンパク質について、チャネル活性を評価する工程を備える、変異体タンパク質のスクリーニング方法。
配列番号1及び3でそれぞれ表されるGtCCR4及びGtCCR5のアミノ酸配列を、哺乳類での発現に適したコドン用法を用いて、それぞれ配列番号5及び6で表される塩基配列でコードするオリゴヌクレオチドDNA/4及びDNA/5を化学合成により取得した。
フォワードプライマー:5' CGAGCTCAAGCTTATGATGACAACAAGCGCCCCTAG 3'(配列番号7)
リバースプライマー:5' GACCGGTGGATCCTGAACAGCCTCAGACTCTTGCA 3'(配列番号8)
DNA/5(Gt CCR5)を取得するためのプライマー
フォワードプライマー:5'CGAGCTCAAGCTTATGGCCACATCTGCCCCTAGCCTG3'(配列番号9)
リバースプライマー:5'GACCGGTGGATCCTGCATTCTCTCGTCGTCCTGCAG3'(配列番号10)
vector pEGFP-N1のベクター断片を取得するためのプライマーフォワードプライマー:5'CATAAGCTTGAGCTCGAGATC3'(配列番号11)
リバースプライマー:5'CAGGATCCACCGGTCGCCACC3'(配列番号12)
マウス神経/ラット脊髄後根神経節由来であって、マウス芽細胞腫×ラット神経由来であるND7/23細胞を、DMEM(High glucose)+FBS5%培地を用いてCO2インキュベータ中37℃で培養した。この細胞に、実施例1で作製したベクターを、リポフェクション法(Lipofectamine 2000(Thermo Fischer社)を用いてプラスミドDNAをND7/23細胞に導入した。ND7/23細胞におけるGtCCR4及びGtCCR5の発現は、GFP蛍光により確認した。
GtCCR4のアミノ酸配列(配列番号1)に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計した。既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社)により作製した。なお、単変異体の置換変異の内容については、図2に併せて示す。
実施例3で作製したE76Q、V83A、K137A、L146A、K198A、K204A及びQ231Lの各単一変異を有する単変異体を発現させる形質転換細胞について、電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ChR2、野生型GtCCR4、実施例3で作製したV83A変異体による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。なお、光照射条件は、図3に示すとおりとした。結果を、図3に示す。
実施例3及び実施例4にて確認した単一変異のうちある種の組みあわせについて、実施例1及び2に準じてベクターを作製し、実施例3と同様にして電気生理学的測定を行った。また、同時に、クラミドモナス由来ChR2、野生型GtCCR4による形質転換細胞についても電気生理学的測定を行った。結果を、図4に示す。
GtCCR5のアミノ酸配列(配列番号3)に基づいて、3種の単一の変異を付与した単変異体を設計し、既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, アジレントテクノロジー株式会社)により作製した。なお、単変異体の内容については、図5に併せて示す。
実施例3に準じて、GtCCR4のアミノ酸配列(配列番号1)に基づいて、種々の単一の変異を付与した単変異体を設計し、既述のコドン用法を用いてそれらをコードする塩基配列を決定し、QuickChange法によりDNA断片を作製した。引き続き実施例3に準じて、In-Fusion反応により、pEGFPベクターを作製し、ND7/23細胞を形質転換して、各単変異体を発現する形質転換細胞を取得し、これらの形質転換細胞につき電気生理学的測定を行った。なお、対照として、野生型GtCCR4による形質転換細胞についても同様にして測定した。単変異体の置換変異の内容及び電気生理学的測定結果を、併せて図6に示す。
本実施例では、光応答性タンパク質を細胞膜に発現させたラット大脳上皮初代培養細胞に、光強度を種々に変えて応答を引き起こす波長の光を照射して、その細胞膜電位を測定して、光刺激における光強度依存性を評価した。
Claims (11)
- 配列番号1で表される第1のアミノ酸配列において、L53A、L53N、E76Q,V83A,V83T、A87S、K137A,L146A,K198A,K204A、G216S、S230E及びQ231Lからなる群から選択される1個又は2個以上のアミノ酸置換を備え、
さらに、D116位、T120位及びD127位からなるDTDモチーフを備えるとともに、前記アミノ酸置換及び前記DTDモチーフ以外の位置に1個又は2個のアミノ酸残基の欠失、置換又は挿入を備えていてもよいアミノ酸配列であって、第1のアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、チャネル活性を有する、タンパク質。 - 前記第1のアミノ酸配列において、L53A、L53N、E76Q,V83A,V83T、A87S、K137A,L146A,K198A,K204A、G216S、S230E及びQ231Lからなる群から選択される1個又は2個のアミノ酸置換を備える、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記アミノ酸置換及び前記DTDモチーフ以外の位置に1個又は2個のアミノ酸置換を備えていてもよい、請求項2に記載のタンパク質。
- 前記チャネル活性は、以下からなる群から選択される1種又は2種以上を満たす、請求項1~3のいずれかに記載のタンパク質。
(a)チャネル活性(Ip)が1000pA以上である
(b)チャネル活性(Is)が800pA以上である
(c)チャネル開口率(Is/Ip)が0.85以上である - 前記チャネル活性(Is)又は(Ip)が、前記第1のアミノ酸配列からなるタンパク質のチャネル活性の120%以上である、請求項1~4のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記チャネル開口率が、前記第1のアミノ酸配列からなるタンパク質のチャネル開口率の120%以上である、請求項1~5のいずれかに記載のタンパク質。
- 請求項1~6のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項1~6のいずれかに記載のタンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、網膜に対する光応答性の回復剤。
- 請求項1~6のいずれかに記載のタンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、視覚障害を治療又は予防するための医薬組成物。
- 前記視覚障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜剥離である、請求項10に記載の医薬組成物。
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