JP2020203924A - ロドプシン拡散のインビボ送達による視覚応答の回復 - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝的な盲目疾患に対して有効な、新規視覚回復治療方法の提供。【解決手段】網膜に対する光感受性を回復する方法であって：（ａ）網膜神経細胞に対して、該神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシン又は光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸発現ベクターを送達する工程であって、該ベクターは該ロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、それに対して作動可能に連結されたプロモーター配列、及び必要に応じて転写調節配列を含む、工程と、（ｂ）該神経細胞中で該ベクターを発現する工程と、を包含し、これによって、光感受性を回復する、方法。【選択図】図７

Description

連邦政府に支援された研究の下でなされた発明に対する権利の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金（Ｅ
Ｙ１２１８０、ＥＹ−０４０６８、ＥＹ１６０８７、ＥＹ１７１３０およびＥＹ１１５２
２）による助成金によって、一部資金援助された。このことにより、米国合衆国政府は、
本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
発明の分野
分子生物学および医薬の分野における本発明は、光受容体変性網膜において内網膜神経
細胞を光感受性細胞へ変換し、それによって視覚認知および視覚の種々の局面を回復する
、ライト・ゲートの（ｌｉｇｈｔ−ｇａｔｅｄ）陽イオン選択性膜チャネル、チャネルロ
ドプシン−２（Ｃｈｏｐ２）のような、微生物型のロドプシンの使用に関する。

（背景技術の説明）
視覚は通常、光受容体とも呼ばれる桿体および錐体が光シグナルを電気的シグナルに変
換し、次いでこれが第二および第三次の網膜神経細胞および視神経を通じて外側膝状核に
、次いで視覚皮質にリレーされ、ここで視覚画像が形成されるとき、始まる（Ｂａｙｌｏ
ｒ，Ｄ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５６０〜５
６５；Ｗａｓｓｌｅ，Ｈ，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：７４７〜
５７）。光受容体の消失に起因する視覚障害の患者については、視覚認知は、特定の障害
の性質に依存してこれらの顆粒の神経位置の１つで電気的刺激を提供することによって誘
発され得る。

光受容体細胞の重篤な損失は、網膜色素変性症（ＲＰ）のような先天性の網膜変性症に
よって生じ得（Ｓｕｎｇ，ＣＨら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８８：６４８１〜８５；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｐら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：８０４−８；Ｗｅｌｅｂｅｒ，ＲＧら、ｉｎ：ＳＪ Ｒｙａｎ編，Ｒｅｔｉｎ
ａ，Ｍｏｓｂｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ（１９９４），ｐｐ．３３５〜４６６）、そして完全
な盲目を生じ得る。加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）はまた、視野の中央に位置する最高の視
覚領域内の重篤な視覚障害を生じ得る、光受容体細胞の変性および死滅の結果である。

げっ歯類もヒトも両方とも、進行性に盲目になる。なぜなら、桿体および錐体が失われ
るにつれて脳へ送られるシグナルは少なくなるかまたはなくなるからである。部分的また
は全体的な盲目を生じる遺伝性の網膜変性は、世界中で３０００人に１人に影響する。ア
ッシャー症候群に罹患している患者は、網膜変性に加えて進行性の難聴を発症する。現在
これらの状態について有効な処置も治療もない。

網膜変性についてのアプローチに対する基礎的研究は、長らく２つのアプローチに分類
されている：（１）網膜変性疾患を有する患者において残留する光受容体を保存するため
の処置、および（２）光受容体消失を網膜変性に置き換えるための方法。網膜疾患に罹患
している患者は、しばしば、彼ら自身を、その視覚減退の消失を遅らせるための方法を探
索する患者、および、遺伝性の眼の疾患または外傷のせいで光受容体を失っている、既に
法的に盲目である患者（「光の知覚なし」）に分類する。

最初のアプローチについては、神経栄養因子での神経保護（ＬａＶａｉｌ，ＭＭら、１
９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１２４９〜５３）お
よび劣性のヌル変異についての野性型遺伝子のウイルスベクターに基づく送達（Ａｃｌａ
ｎｄ，ＧＭら、２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２〜９５）は、第Ｉ／ＩＩ相の
臨床試験の観点に対して最も遠くなっており（Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，ＷＷ，２００５，Ｒ
ｅｔｉｎａ ２５，Ｓ６０；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＃０４１０−６
７７，Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ：ｗｅｂｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ
／ｎｉｈｏｂａ／１６＿ｊｕｎ＿２００５．ｈｔｍｌ）、網膜変性の特異的な形態である
、レーバーの先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ’ｓ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｍａｕｒｏｓｉ
ｓ）（ＬＣＡ）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性遺伝子置換療法について米国で承
認を受けている。不幸にも、網膜変性の進行段階にある患者では、このアプローチは適用
不能であり、そして光受容体細胞が置換されなければならない。

置換について、一つのアプローチは、疾患の網膜に対する正常な組織または細胞の移植
（置換）に関与する。別のアプローチは、失われた光受容性細胞の代わりに網膜移植片を
介した残留非視覚的神経細胞の電気的刺激を包含する（補綴的置換）。しかし、両方の方
法とも、多くの基本的な障害に直面する。例えば、首尾よい移植のためには、移植された
組織または細胞は、宿主の網膜内に機能的に組み込まれなければならない。電気的な刺激
アプローチは、機械的困難性および技術的困難性、ならびに移植された生体工学デバイス
の長期生体適合性の欠失に関する問題に悩まされる。めとめると、遺伝的な盲目疾患の有
効な視覚回復治療は存在しない。

本明細書に開示される本発明者らのストラテジーは、適切な分子「光センサー（ｌｉｇ
ｈｔ−ｓｅｎｓｏｒ）」を要する。前の研究では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのロドプシンの
異種発現（非特許文献１）、そしてさらに最近では、内因性の光感受性網膜神経節細胞の
推定の感光色素であるメラノプシン（ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ）が報告されている（非特許
文献２；非特許文献３；非特許文献４）。しかしこれらの感光色素は、Ｇタンパク質シグ
ナル伝達カスケードを介して膜チャネルにカップリングされ、そしてそれらの発色団とし
てレチンアルデヒド（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ）のｃｉｓ−イソ型を用いる。結果と
して、複数の遺伝子の発現は、光感受性をもたらす必要がある。さらに、それらの光応答
動態は、むしろ緩徐である。時間分解能を改善することを目的とした近年の研究では、光
感受性のＫ^＋チャネルの操作を記載している（非特許文献５）が、これには、外因性の「
分子拘束（「ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｔｈｅｒ」の誘導およびこのチャネルをブロック
しないためのＵＶ光の使用を必要とした。この操作されたチャネルは、変性網膜における
光感度を回復するために強力に有用であると提唱されたが、網膜神経細胞におけるその発
現および機能は未知のままである。

本発明は、バクテリオロドプシンと類似の微生物型ロドプシンを利用し（Ｏｅｓｔｅｒ
ｈｅｌｔ，Ｄら、，１９７３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：
２８５３〜７）、その構造変化は、レチンアルデヒドのオール・トランス（ａｌｌ−ｔｒ
ａｎｓ）イソ型である、それらの発色団群の可逆性の光異性化によって生じ、そして膜を
通じてイオン運動に直接カップリングされる（Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ，Ｄ．，１９９８，
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：４８９〜５００）。２つの微生物型
オプシンである、チャネルオプシン（ｃｈａｎｎｅｌｏｐｓｉｎ）−１および−２（Ｃｈ
ｏｐｌおよびＣｈｏｐ２）は現在Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
からクローニングされており（Ｎａｇｅｌ，Ｇ．ら、２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６
：２３９５〜８；Ｓｉｎｅｓｈｃｈｅｋｏｖ，ＯＡら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：８６８９〜９４；Ｎａｇｅｌ，Ｇ．ら、２００３，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，１３９４０〜４５）、そしてオ
ール・トランスレチナールの存在下でＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの卵母細胞またはＨ
ＥＫ２９３細胞で発現される場合、直接ライト・ゲートの膜チャネルを形成することが示
されている。７回膜貫通ドメインタンパク質であるＣｈｏｐ２は、発色団オール・トラン
スレチナールに結合した場合、光で切り換え可能になる。Ｃｈｏｐ２は特に誘引性である
。なぜならその機能的な光感受性チャネル、発色団が結合されたチャネルロドプシン−２
（ＣｈＲ２と略されるＣｈｏｐ２レチンアリデン（ｒｅｔｉｎａｌｉｄｅｎｅ））は、生
理学的な陽イオンに浸透性である。１１−ｃｉｓ高次構造にのみ結合する動物のロドプシ
ンと異なり、Ｃｈｏｐ２はオール・トランスレチナール異性体に結合し、脊椎動物の視覚
サイクルによって供給されるオール・トランスから１１−シスの異性化反応の必要性を省
く。しかし、一般にインビボで天然の神経細胞においてＣｈＲ２を発現する長期適合性、
および詳細には網膜神経細胞におけるＣｈＲ２媒介性の光応答の特性は本発明までは未知
のままであった。

本発明のストラテジーは実現可能である、なぜなら組織学的な研究では、光受容体変性
の動物モデルにおいて（Ｃｈａｎｇ，Ｂ．ら、２００２，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ．４２：
５１７〜２５；Ｏｌｓｈｅｖｓｋａｙａ，ＥＶら、２００４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２
４：６０７８〜８５）、およびＲＰに起因するほぼ完全な光受容体喪失を有する死後患者
の眼において（Ｓａｎｔｏｓ，ＡＨら、１９９７，Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１
１５：５１１〜１５；Ｍｉｌａｍ，ＡＨら、１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ
Ｒｅｓ．１７：１７５〜２０５）、その両方で、かなりの数の内網膜神経細胞の保存が報
告されたからである。

網膜遺伝子療法は、人にとって可能な治療オプションを考慮している。例えば、米国特
許第５，８２７，７０２号は、外因性の核酸が発現のための細胞に取り込まれる条件下で
細胞とこの外因性核酸とを接触させることによって、遺伝子操作された眼細胞を操作する
ための方法について言及する。この外因性核酸は、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルスまたはプラスミドとして記載される。また、ＷＯ ００／１５８２２（
２０００年３月２３日）およびＷＯ ９８／４８０９７（１９９８年１０月２９日）を参
照のこと。

このような遺伝子療法における労力は、一次光受容体疾患のげっ歯類モデルにおいて網
膜変性を遅らせることに対して主に集中している。光受容体に送達された正常な遺伝子お
よび変異特異的なリボザイムは、そうでなければアポトーシス性の細胞死に運命づけられ
たこれらの細胞の寿命を延長している（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．，ら、１９９６ Ｎａｔ．
Ｍｅｄ．２，６４９〜５４；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．，ら、１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ ５，１１５６−６４；Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ，Ｒら、１９９８ Ｈｕｍ．Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．７，１８９３〜９００；Ｌｅｗｉｎ，ＡＳら、１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅ
ｄ．４，９６７〜７１；Ａｌｉ，Ｒら、２０００，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５，３０６〜
１０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ら、，１９９９，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３，７８１２〜６
；Ｌａｕ，Ｄ．ら、２０００，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．
４１，３６２２〜３３；およびＬａＶａｉｌ，ＭＭ，ら、２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，１１４８８〜９３）。

組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いる、レポーター遺伝子である緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）の網膜遺伝子移入は、正常な霊長類で実証された（Ｂｅｎｎｅｔｔ
，Ｊ ら、１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，９９２０
〜２５）。しかし、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および／または光受容体細胞における遺伝子
欠損によって生じる、動物、詳細にはヒトおよび他の哺乳動物での盲目疾患における視覚
の回復は達成されていない。Ｊｅａｎ Ｂｅｎｎｅｔｔおよび共同研究者は、ＲＰ６５遺
伝子の変異および変異遺伝子を置換または取って代わる正常遺伝子での置換療法を用いる
光受容体の急速な変性のモデルにおける、遺伝子治療を用いる光受容体の救済を記載して
いる。例えば、Ａｃｌａｎｄ，Ｂｅｎｎｅｔｔおよび共同研究者の特許文献１を参照のこ
と。この療法によって、網膜変性の重篤な疾患の天然に存在するイヌモデル（ヒトＬＣＡ
に類似である、ＲＰＥ６５変異体イヌ）でのいくつかの成功が示された。

本発明のアプローチの利点としては、内因性細胞および組織または物理的デバイスを誘
導する必要がなく、従って、既存のアプローチによって遭遇される多くの障害を回避する
という事実が挙げられ；本発明は、多くの網膜変性疾患によって生じる失明または盲目の
逆転に適用可能である。ウイルスベースの遺伝子治療法によって、疾患状態の網膜の生存
している網膜神経細胞において、光感受性の膜チャネルまたは分子を発現することによっ
て、本発明は、視覚回復のための高い空間および時間の分解能をともなう失明または盲目
の永続的な治療を生じ得る。

上述の刊行物または他の刊行物における任意の特定の開示が、本発明の任意の一般的局
面を予測すると考えられ得る程度まで、本発明の開示は、前に開示された任意のこのよう
な種を放棄することを除外する条項を包含することが理解されるべきである。このような
刊行物の開示によって予測されない本発明の局面はまた、本明細書において開示されるか
または主張される予期されない優れた結果に対して少なくとも一部は起因して、これらの
刊行物の開示からは不明である。

米国特許出願公開２００４／００２２７６６号明細書

Ｚｅｍｅｌｍａｎ，ＢＶら、２００２，Ｎｅｕｒｏｎ ３３：１５〜２２ Ｍｅｌｙａｎ，Ｚ．ら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ ４３３：７４１〜５ Ｐａｎｄａ，Ｓ．ら、２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７：６００〜６０４ Ｑｉｕ，Ｘ．ら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ ４３３：７４５〜９ Ｂａｎｇｈａｒｔら、２００４，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１３８１〜６

（発明の要旨）
本発明は、網膜における、生きている光非感受性内網膜神経細胞（ここでは光受容体は
変性されているかまたは既に死滅している）の、直接の光感受性神経細胞への遺伝的変換
に関しており、これによってこのような網膜に対して光感受性が与えられ、このような変
性に罹患している被験体に対する視覚応答および機能的視覚の１つ以上の局面が回復され
る。疾患に起因する、この能力を欠く網膜に対する光感受性の回復によって、本発明は、
視覚に必要である最も基礎的な光応答の機構を提供する。別の言い方をすれば、本発明は
、網膜光受容体細胞の損失を補償するために、通常「光センサー（ｌｉｇｈｔ ｓｅｎｓ
ｏｒｓ）」を有さない網膜神経細胞にそれらの「光センサー」を導入する。

本発明者らおよび共同研究者らは、桿体および錐体の変性を受けている網膜に対する光
感受性を回復するためにＣｈｏｐ２／ＣｈＲ２を用いる実現可能性を検討した。この結果
によって本明細書では、インビボでげっ歯類の内網膜神経細胞におけるＣｈｏｐ２／Ｃｈ
Ｒ２の長期間発現が示された。この結果また、これらの内網膜神経細胞が十分な数の機能
的なＣｈＲ２チャネルを発現して、オール・トランスのレチナールの外的な供給なしに強
固な膜脱分極または活動電位発火を生じることができるということを示している。さらに
、本発明者らは、光受容体欠損マウスモデルにおけるＣｈＲ２の発現が、網膜神経節細胞
が光シグナルをコードできるだけでなく、視覚皮質における視覚的に喚起された応答を回
復もできるということを実証した。

本発明は、網膜の光受容体変性の結果として視覚を失っているかまたは盲目である個体
に対する視覚喪失の回復に関する。本発明は、これらの網膜神経細胞において光感受性の
膜チャネルまたは分子を発現することによって、このような疾患状態の網膜における網膜
神経細胞が、光に応答することを可能にする。好ましい光感受性のチャネルまたは分子は
、微生物型の光ゲートチャネルロドプシン、例えば、ＣｈＲ２、ＣｈＲ１、光駆動イオン
ポンプ、例えば、バクテリオロドプシン（Ｌａｎｙｉ，ＪＫ，２００４，Ａｎｎｕ Ｒｅ
ｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：６６５〜８８）、ハロロドプシン（Ｌａｎｙｉ，ＪＫ，１９
９０，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．７０：３１９〜３０）、およびそれらの誘導体である。

本発明者らによって発見されたとおり、盲目のマウスの網膜において正常には光感受性
（直接）でない網膜神経細胞、例えば、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および双極細胞は、チ
ャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）と呼ばれる緑藻タンパク質またはその生物学的に活性
なフラグメントまたは保存的アミノ酸置換改変体が神経細胞膜に挿入されるとき、光に反
応し得る。この研究は、ヒトでのＲＰをモデリングする状態である、網膜での光感受性細
胞、桿体および錐体を失うように遺伝子的に交配されたマウスで行った。ＲＰに加えて、
本発明のアプローチによって可能性として処置され得る網膜変性性眼疾患の多くの形態が
存在する。

本明細書において開示されるとおり、視覚機能は、桿体および錐体が死んだ後、網膜に
おける他の生存細胞に対して光感受性の特性を伝達することによって回復され得る。ＤＮ
Ａ移入のアプローチを用いて、本発明者らは、桿体および錐体が死んだ後に生存したマウ
ス網膜神経細胞に光吸収タンパク質ＣｈＲ２を導入した。これらの細胞は光感受性になり
、そして視神経およびより高次の視覚経路を介して視覚皮質までシグナルを送り、ここで
視覚の知覚が生じる。電気生理学的方法を用いて、ＣｈＲ２処置マウスのほとんどにおけ
る視覚皮質にこのシグナルが達したことが示された。この光感受性は、少なくとも６ヶ月
間持続し、このことは、この被験体が、他のタイプの網膜細胞におけるＣｈＲ２発現また
は光感受性および／もしくはＣｈＲ２の波長選択性の改変のような、本明細書に開示され
るさらなる手技を用いて、あるいは類似の細菌タンパク質を用いて、有用な視覚を再獲得
し得、正常な視覚の回復のための転帰の改善のために多様な光感受性チャネルを生成する
ことを示唆している。

当業者によって注目されるとおり、このストラテジーは、「視野のパラダイムシフト（
ｐａｒａｄｉｇｍ ｓｈｉｆｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ）」に相当し、これは、「遺
伝子操作された（補綴細胞）としてリエンジニアリングする網膜介在神経細胞の新しい分
野（ｎｅｗ ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｒｅｔｉｎａｌ ｉｎ
ｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ａｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ‘ｐｒｏｓｔ
ｈｅｔｉｃ’ｃｅｌｌｓ）」をいう。本発明は、「置換光検知受容体として機能する生存
している網膜介在神経細胞を遺伝子操作する可能性を開いた（ｏｐｅｎｅｄ ｔｈｅ ｐ
ｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ
ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ ａｓ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｌｉｇｈｔ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
）」（Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｊ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．，２００６，Ｎｅｕｒ
ｏｎ．５０：１−３；本発明者らおよび共同研究者の同じ論点の刊行物に対する予告編と
して書かれた、Ｂｉ Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ ５０，２３〜３３，２００６）。

本発明者らは、網膜光受容体細胞に対して遺伝子を移入するためにウイルスベクターを
用いることによってこの分野での進歩に投資した（Ｆｌａｎｎｅｒｙ ＪＧら、１９９７
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：６９１６〜２１）。光非感受
性網膜介在神経細胞の光感受性細胞への変換によって、盲目の網膜変性の処置のための完
全に新規な方向が誘導される。

本発明の１実施形態では、網膜双極細胞、特定のアマクリン細胞および神経節細胞を、
Ｃｈｏｐ２ ＤＮＡの形質導入について標的して、桿体および錐体の機能を包含する光感
受性細胞へそれらを機能的に変換する。網膜における細胞の積層の結果、光受容体細胞が
双極細胞を興奮させ、これが神経節細胞を興奮させて、視覚皮質にシグナルを伝達する。
双極ＯＮ型細胞において本発明のチャネルオプソニンを発現することが好ましい。硝子体
内および／または網膜下の注射を用いて、標的されている細胞に達するようにＤＮＡ分子
およびウイルスベクターを送達する。

１実施形態では、プロモーターは、代謝調節型グルタミン酸受容体６の発現を制御する
遺伝子である、Ｇｒｍ６遺伝子のｍＧｌｕＲ６プロモーター領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号ＢＣ０４１６８４）由来である（（Ｕｅｄａ Ｙら、１９９７，Ｊ Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｌ ７：３０１４〜２３）。このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション
番号−ＡＬ６２７２１５に示される。上記のＧｅｎＢａｎｋ記録由来のこのプロモーター
領域の配列の好ましい実施例は、図８に示される、１１０２３ヌクレオチドからなる配列
番号９である。もとのＵｍｅｄａらの研究では、１０ｋｂのプロモーターを使用したが、
プロモーターおよびＧｒｍ６のコントロールエレメントを含む配列の正確な長さは、フラ
グメントの長さを増大または減少することによって調節され得る。これは、所望の標的細
胞における、好ましくはグルタミン酸受容体が富化されている双極細胞、詳細には網膜で
のほとんどの双極細胞である、「オン」型双極細胞における、選択されたコード配列、好
ましくはＣｈｏｐ２のトランスジェニック発現を駆動するＧｒｍ６遺伝子から最適にサイ
ズ化されたフラグメントの作用を選択および立証するための慣用的な試験の問題である（
Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｙ．，ら、１９９３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１１８６８
〜７３）。

本発明は、網膜に対する光感受性を回復する方法に関しており、この方法は以下：
（ａ）神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシンまたは光駆動性のイオンポ
ンプロドプシンをコードする核酸発現ベクターであって、ロドプシンをコードするオープ
ンリーディングフレーム、およびそれに作動可能に連結された、プロモーター配列、およ
び必要に応じて転写調節配列を含むベクターを網膜神経細胞に送達する工程と；
（ｂ）この神経細胞中でベクターを発現させ、これによって光感度を回復する工程と、
を包含する。

ロドプシンは好ましくは、チャネルロドプシン−２（Ｃｈｏｐ２）または生物学的に活
性なフラグメントまたはその保存的なアミノ酸置換改変体である。

このベクターは好ましくはｒＡＡＶウイルスベクターである。

このプロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー
／ニワトリ（ｃｈｉｋｅｎ）βアクチンプロモーター（ＣＡＧ）（配列番号１の一部とし
て下に示される）、またはＣＭＶプロモーターであってもよい。このプロモーターはまた
、（ｉ）誘導性プロモーター、または（ｉｉ）細胞型特異的プロモーターであってもよく
、後者の好ましい例は、ｍＧｌｕＲ６プロモーター（例えば、配列番号９のプロモーター
配列の一部）、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロモーターまたはニューロキニン−３（ＮＫ−３）プ
ロモーターである。

上記の方法における好ましいベクターは、ＣＡＧプロモーター、ウッドチャック転写後
調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびヒトまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を
備える。

本方法では、網膜神経細胞は、ＯＮ−およびＯＦＦ−型の網膜神経節細胞、網膜桿状体
双極細胞、ＡＩＩアマクリン細胞ならびにＯＮおよびＯＦＦの網膜錐体双極細胞から選択
される。好ましくは、このベクターは、ＯＮ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞
に対して標的され、かつそこで発現される。上記ベクターが、ＮＫ−３プロモーターを含
む場合、このベクターは好ましくは、ＯＦＦ錐体双極細胞に標的化される。

本発明はまた、網膜の光受容体細胞が変性されているか、または変性されかつ死滅され
た、失明または盲目に罹患している被験体の網膜神経細胞に対する光感受性を回復する方
法に関しており、この方法は：
（ａ）この被験体の網膜に対して、この神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロド
プシンまたは光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸ベクターを送達する工程
であって、このベクターはロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およ
びそれに対して作動可能に連結された、プロモーター配列および、必要に応じて、転写調
節配列を含む工程と、
（ｂ）この神経細胞中でこのベクターを発現する工程であって、このロドプシンの発現
がこの神経細胞を光感受性にさせ、これによってこの網膜に対する光感受性の回復がされ
る工程と、を包含する。

この方法では、上記ロドプシンは好ましくは、Ｃｈｏｐ２、またはその生物学的に活性
なフラグメントまたは保存的なアミノ酸置換改変体である。上記ベクターは好ましくはｒ
ＡＡＶウイルスベクターである。好ましいプロモーターは上記に提示される実施形態につ
いて上記されるとおりである。このベクターに好ましい標的細胞は上記されるとおりであ
る。

上記の方法を用いる光感受性の回復は好ましくは、この被験体における視覚の回復を生
じる。この視覚は好ましくは、以下の方法の１つ以上によって測定される：
（ｉ）光刺激に対する露出後の上記被験体による光検出応答
（ｉｉ）光刺激に対する露出後の上記被験体による光投射応答；
（ｉｉｉ）光対暗のパターン化視覚刺激の被験体による光分解能；
（ｉｖ）光フラッシュ刺激因子またはパターンの視覚刺激に対する視覚皮質中の応答の
電気的記録。

この前述の方法では、上記失明または盲目は、変性疾患の結果、好ましくは、網膜色素
変性症または加齢性黄斑変性症であってもよい。

別の実施形態では、上記被験体はまた、上記ベクターの送達の前、同時、または後に視
力補綴物を提供される。好ましい視力補綴物は、網膜インプラント、皮質インプラント、
外側膝状核インプラント、または視覚神経インプラントを含む。

前述の方法を使用する場合、この被験体の視覚応答は、１つ以上の視覚刺激を用いる訓
練に供されてもよい。この訓練は好ましくは、以下の方法：
（ａ）（ｉ）光刺激および／もしくはパターン刺激のレベルを変更すること、ならびに
／または（ｉｉ）共通の光源もしくは対象物由来の環境的刺激、を認識するように被験体
を訓練することによって特徴付けられる習慣性訓練と；
（ｂ）視覚的に局所の物体を検出し、かつ訓練なしよりも有効にとりわけこの物体を動
かすためにこの被験体を訓練することによって特徴付けられる方向付けおよび移動度の訓
練、
のうちの１つ以上によって達成される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
網膜に対する光感受性を回復する方法であって：
（ａ）網膜神経細胞に対して、該神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシン
または光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸発現ベクターを送達する工程で
あって、
該ベクターは該ロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに
対して作動可能に連結されたプロモーター配列、および必要に応じて転写調節配列を含む
工程と、
（ｂ）該神経細胞中で該ベクターを発現する工程と、
を包含し、
これによって、光感受性を回復する、方法。
（項目２）
上記ロドプシンが、配列番号６を有するチャネルロドプシン−２（Ｃｈｏｐ２）、また
はその生物学的に活性なフラグメント、好ましくは配列番号３、またはその保存的なアミ
ノ酸置換改変体である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ベクターがｒＡＡＶウイルスベクターである、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記プロモーターが構成的プロモーターである、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記構成的なプロモーターが、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチン
プロモーター（ＣＡＧ）である、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記プロモーターがハイブリッドＣＡＧである、項目２に記載の方法。
（項目７）
上記構成的なプロモーターがＣＭＶプロモーターである、項目４に記載の方法。
（項目８）
上記プロモーターが誘導性プロモーターおよび／または細胞型特異的プロモーターであ
る、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記細胞型特異的プロモーターが、ｍＧｌｕＲ６プロモーター、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロ
モーターまたはニューロキニン−３（ＮＫ−３）プロモーターからなる群より選択される
、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記プロモーターが、ｍＧｌｕ６プロモーターであり、かつプロモーター配列の配列番
号７の一部である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記ベクターが、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）
プロモーター、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびヒトまたはウ
シ成長ホルモンポリアデニル化配列を備える、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記ベクターが、ＣＡＧプロモーター、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲ
Ｅ）、およびヒトまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を備える、項目２に記載の
方法。
（項目１３）
上記網膜神経細胞が、ＯＮ型およびＯＦＦ型の網膜神経節細胞、網膜桿状体双極細胞、
ＡＩＩアマクリン細胞ならびにＯＮおよびＯＦＦの網膜錐体双極細胞から選択される、項
目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ベクターが、ＯＮ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞に対して標的され、
かつそこで発現される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記ベクターが、ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記ｍＧｌｕＲ６プロモーターが、プロモーター配列の配列番号７の一部である、項目
１５に記載の方法。
（項目１７）
上記プロモーターがＮＫ−３プロモーターであり、かつ上記ベクターがＯＦＦの錐体双
極細胞に標的される、項目９に記載の方法。
（項目１８）
網膜の光受容体細胞が変性されているか、または変性されかつ死滅された、失明または
盲目に罹患している被験体の網膜神経細胞に対する光感受性を回復する方法であって：
（ａ）該被験体の網膜に対して、該神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシ
ンまたは光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸ベクターを送達する工程であ
って、
該ベクターはロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに対
して作動可能に連結されたプロモーター配列、および必要に応じて転写調節配列を含む工
程と、
（ｂ）該神経細胞中で該ベクターを発現する工程と、
を包含し、
該ロドプシンの発現が該神経細胞を光感受性にさせ、これによって該網膜に対する光感受
性の回復がされる、方法。
（項目１９）
上記ロドプシンが、Ｃｈｏｐ２、またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその
保存的なアミノ酸置換改変体である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ベクターがｒＡＡＶウイルスベクターである、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記プロモーターが構成的プロモーターである、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
上記構成的なプロモーターが、ハイブリッドＣＡＧプロモーターである、項目２１に記
載の方法。
（項目２３）
上記プロモーターがハイブリッドＣＡＧプロモーターである、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
上記構成的なプロモーターがＣＭＶプロモーターである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記プロモーターが誘導性プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターである、項目
１８に記載の方法。
（項目２６）
上記細胞型特異的プロモーターが、ｍＧｌｕＲ６プロモーター、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロ
モーターまたはニューロキニン−３（ＮＫ−３）プロモーターからなる群より選択される
、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記プロモーターが、ｍＧｌｕ６プロモーターであり、かつプロモーター配列の配列番
号７の一部である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
上記網膜神経細胞が、ＯＮ型の網膜神経節細胞、ＯＦＦ型の網膜神経節細胞、網膜桿状
体双極細胞、ＡＩＩアマクリン細胞、ＯＮ型網膜錐体双極細胞またはＯＦＦ型網膜錐体双
極細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２９）
上記ベクターが、ＯＮ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞に対して標的され、
かつそこで発現される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記ベクターが、ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記ｍＧｌｕＲ６プロモーターが、プロモーター配列の配列番号７の一部である、項目
３０に記載の方法。
（項目３２）
上記プロモーターがＮＫ−３プロモーターであり、かつ上記ベクターがＯＦＦの錐体双
極細胞に標的される、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
上記光感受性の回復が、上記被験体における視覚の回復を生じる、項目１８〜３２のい
ずれかに記載の方法。
（項目３４）
上記視覚が、以下の方法：
（ｉ）光刺激に対する露出後の上記被験体による光検出応答
（ｉｉ）光刺激に対する露出後の上記被験体による光投射応答；
（ｉｉｉ）光対暗のパターン化視覚刺激の被験体による光分解能；
（ｉｖ）光フラッシュ刺激因子またはパターンの視覚刺激に対する視覚皮質の応答の電
気的記録、
の１つ以上によって測定される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
上記失明または盲目が、変性疾患の結果である、項目１８〜３４のいずれかに記載の方
法。
（項目３６）
上記疾患が、網膜色素変性症または加齢性黄斑変性症である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記被験体がまた、上記ベクターの送達の前、同時、または後に視力補綴物を提供され
る、項目１８〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
上記視力補綴物が、網膜インプラント、皮質インプラント、外側膝状核インプラント、
または視覚神経インプラントである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記被験体の視覚応答が、１つ以上の視覚刺激を用いる処置に供される、項目１８〜３
４のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
上記被験体の視覚応答が、１つ以上の視覚刺激を用いる訓練に供される、項目３８に記
載の方法。
（項目４１）
上記訓練が、以下の方法：
（ａ）（ｉ）変動するレベルの光刺激および／もしくはパターン刺激、ならびに／また
は（ｉｉ）共通の光源もしくは対象物由来の環境的刺激、を認識するように被験体を訓練
することによって特徴付けられる習慣性訓練と；
（ｂ）視覚的に局所の物体を検出し、かつ訓練なしよりも有効にとりわけ該対象物を動
かすために該被験体を訓練することによって特徴付けられる方向付けおよび移動度の訓練
のうちの１つ以上によって達成される、項目３９または４０に記載の方法。

図１Ａ〜１Ｉ。インビボでの網膜神経細胞におけるＣｈｏｐ２−ＧＦＰの発現。図１Ａは、ｒＡＡＶ−ＣＡＧ−Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ発現カセットを示す。ＣＡＧ：ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター。ＷＰＲＥ：ウッドチャック転写後調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）。ＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列。（図１Ｂおよび図１Ｃ）ウイルスベクター注射２ヶ月後の眼からの低倍率（図１Ｂ）および高倍率（図１Ｃ）で見られたＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光。（図１Ｄ）神経節細胞の共焦点画像であって、積層画像（左）および単一光切片画像（右）を示す。（図１Ｅ）水平細胞におけるＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光であって、体細胞、軸索および遠位軸索末端におけるＧＦＰを示す。（図１Ｆおよび１Ｇ）アマクリン細胞（図１Ｆ）および網膜双極細胞（図１Ｇ）におけるＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光。図１Ｈおよび１Ｉは、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターの注入１２ヶ月後の網膜から採取した蛍光画像（図１Ｈ）および位相差画像（図１Ｉ）を示す。（図１Ｂ−１Ｅ）における画像は、ラット網膜の平坦なホール・マウントから採取した。（図１Ｆ〜１Ｉ）における画像は、ラットの網膜の垂直スライス切片からとった。スケール・バー：（図１Ｂ）では２００μｍ；（図１Ｃ）では１００μｍ；（図１Ｄ）では１５μｍ；（図１Ｅ）では５０μｍ、図１Ｈおよび（図１Ｉ）では５０μｍ；（図１Ｆ）および（図１Ｇ）では２５μｍ。ＯＮＬ：外核層；ＩＮＬ：内核層；ＩＰＬ：内網状層；ＧＣＬ。 図２Ａ〜２Ｈ。ＣｈＲ２発現網膜神経細胞の光誘発電流（Ｌｉｇｈｔ−Ｅｖｏｋｅｄ Ｃｕｒｒｅｎｔｓ）の特性。（図２Ａ）ウイルスベクター注射した眼から分離したＧＦＰ陽性網膜ニューロンの位相差画像（左）および蛍光画像（右）。スケール・バー：２５μｍ。（図２Ｂ）４２０〜５８０ｎｍにまたがる波長の光刺激に対するＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光網膜細胞の記録。光強度は、１．０〜１．６×１０^１８光子ｃｍ^−２ｓ^{− １}にまたがっていた。（図２Ｃ）４６０ｎｍの波長で光刺激によって誘発される電流の代表的な記録であって光強度は、２．２×１０^１５〜１．８×１０^１８光子ｃｍ^−２ｓ^−１におよぶ。（図２Ｄ）延長された時間スケールで示される図２Ｃ由来の光刺激の発現後の電流トレース。この線は、指数関数による１電流トレースのフィッティングを示す：Ｉ_{（ ｔ）}＝ａ_０＋ａ_１×（１−ｅｘｐ［−ｔ／τ１］）＋ａ_２×（ｅｘｐ［−ｔ／τ_２］）、ここでτ_１およびτ_２はそれぞれ興奮伝達時間および不活化時間定数に相当する。（図２Ｅ）延長された時間スケールで示される図２Ｃ由来の光刺激の終了後の電流トレース。この線は、単一指数関数による１電流トレースのフィッティングを示す：Ｉ_（ｔ）＝ａ_０＋ａ_１×（１−ｅｘｐ［−ｔ／τ］）、ここでτは不活化時間定数に相当する。（図２Ｆ）光強度応答曲線。データポイントは、単一ロジスティック関数曲線に適合した。（図２ＦおよびＨ）図２Ｄに示されるフィッティングから得られた光強度および興奮伝達時間定数（図２Ｇ）ならびに光強度および不活化時間定数（図２Ｈ）の関係。全ての記録は、−７０ｍＶという保持電位で作成した。図２Ｆ〜２Ｈにおけるデータポイントは平均±ＳＤ（ｎ＝７）として示す。 図３Ａ〜３Ｃ。ＣｈＲ２発現網膜神経細胞の光誘発電圧応答（Ｌｉｇｈｔ−Ｅｖｏｋｅｄ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の特性。（図３Ａ）ＧＦＰ陽性スパイク非発射型神経細胞由来の代表的な記録。この電圧応答は、４６０ｎｍの波長で４つの間欠的な光刺激によって誘発され、強度は、電流クランプにおいて２．２×１０^１５〜１．８×１０^１８光子ｃｍ^−２ｓ^−１におよぶ。破線は、飽和した電圧レベルを示す。（図３Ｂ）光刺激を繰り返すためのＧＦＰ陽性スパイク非発射型神経細胞からの代表的な記録。同じ細胞由来の光誘発性の電流（上のトレース）および電圧応答（下のトレース）を示した。左のパネルは、延長時間スケールにおける第一（赤）および第二（黒）の重ね合わせを示す。破線は、電流の保持成分（上）およびプラトーな膜電位（下）を示す。（図３Ｃ）反復される光刺激に対するＧＦＰ陽性スパイク発射型神経細胞由来の代表的な記録。図３Ｂおよび３Ｃにおける応答は、４６０ｎｍの波長で、１．８×１０^１８光子ｃｍ^{− ２}ｓ^−１の強度の光によって誘発された。 図４Ａ〜４Ｉ。ｒｄｌ／ｒｄｌマウスの網膜神経細胞におけるＣｈＲ２の発現および光応答特性（Ｌｉｇｈｔ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。（図４Ａ）９ヶ月齢でＣｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターを注射した１５月齢のマウスの平坦な網膜ホール・マウントで見られたＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光。（図４Ｂ）３ヶ月齢でＣｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターの注射した６月齢のマウスの網膜由来の垂直切片で見られたＣｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光。（図４Ｃ）出生後１日でＣｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクター注射された５月齢のマウス由来の半薄垂直網膜切片の光学顕微鏡画像。スケール・バー：（図４Ａ）では５０μｍ、そして（図４Ｂおよび図４Ｃ）では３０μｍ。（図４Ｄ−４Ｅ）は、一過性スパイク発射（図４Ｄ）および持続性スパイク発射（図４Ｅ）のＧＦＰ陽性神経細胞の代表的な記録を示す。この応答は、４６０ｎｍの波長での４つの漸増的強度の光によって誘発された。中性密度（Ｌｏｇ＝Ｉ）なしの光強度は、３．６×１０^１７光子ｃｍ^２ｓ^−１であった。この電流は、−７０ｍＶの保持電位で記録した。重ね合わせた第二（黒塗り）および第四（破線または赤い）の電流および電圧トレースを、延長時間スケールの右パネルに示す。（図４Ｆ−４Ｉ）は、光の強度に対する、電流の振幅（図４Ｆ）、膜脱分極（図４Ｇ）、スパイクの数（図４Ｈ）、および第一スパイクピークまでの時間（図４Ｉ）の関係を示す。記録は、ｒｄｌ／ｒｄｌマウスから、４ヶ月以上の月齢で行った。データポイントは、平均±ＳＥである（図４Ｆ〜４Ｈではｎ＝６、図４Ｉではｎ＝４）。 図５Ａ〜５Ｄ。ｒｄｌ／ｒｄｌマウスのＣｈＲ２発現網膜の多重電極アレイの記録。（図５Ａ）ｒｄｌ／ｒｄｌマウス（年齢≧４ヶ月）の網膜由来の光誘発性スパイク活性のサンプル記録。この記録は、ＣＮＱＸ（２５μＭ）およびＡＰ５（２５μＭ）の存在下で行った。突出した光誘発性スパイク活性が、５８電極のうち４９で観察された（電極１５は、アース付きで、電極３４は不完全であった）。（図５Ｂ）３つの漸増光強度に対する単一電極から記録したサンプルの光誘発スパイク。（図５Ｃ）単一の神経細胞に由来する、３０連続した光誘発性のスパイクのラスター・プロット（ｒａｓｔｅｒ ｐｌｏｔｓ）。（図５Ｄ）平均したスパイク・頻度のヒストグラム。中性密度フィルターなしの光強度（ＬｏｇＩ＝０）は、８．５×１０^１７光子ｃｍ^−２ｓ^−１であった。図５Ａに示された応答は、中性密度フィルターなしの単一光パルスによって誘発された。 図５Ａ〜５Ｄ。ｒｄｌ／ｒｄｌマウスのＣｈＲ２発現網膜の多重電極アレイの記録。（図５Ａ）ｒｄｌ／ｒｄｌマウス（年齢≧４ヶ月）の網膜由来の光誘発性スパイク活性のサンプル記録。この記録は、ＣＮＱＸ（２５μＭ）およびＡＰ５（２５μＭ）の存在下で行った。突出した光誘発性スパイク活性が、５８電極のうち４９で観察された（電極１５は、アース付きで、電極３４は不完全であった）。（図５Ｂ）３つの漸増光強度に対する単一電極から記録したサンプルの光誘発スパイク。（図５Ｃ）単一の神経細胞に由来する、３０連続した光誘発性のスパイクのラスター・プロット（ｒａｓｔｅｒ ｐｌｏｔｓ）。（図５Ｄ）平均したスパイク・頻度のヒストグラム。中性密度フィルターなしの光強度（ＬｏｇＩ＝０）は、８．５×１０^１７光子ｃｍ^−２ｓ^−１であった。図５Ａに示された応答は、中性密度フィルターなしの単一光パルスによって誘発された。 図６Ａ〜６Ｅ。ｒｄｌ／ｒｄｌマウスのＣｈｏｐ２−ＧＦＰ発現網膜神経節細胞の中心射影および視覚誘発性電位。（図６Ａ）外側膝状体腹側核および外側膝状体背側核における網膜神経節細胞のＧＦＰ標識末端分枝。（図６Ｂ）上丘における網膜神経節細胞のＧＦＰ標識末端分枝。ＯＴ：光学トラック（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｃｋ）；ｖＬＧＮ：外側膝状体腹側核（ｖｅｎｔｒａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）；ｄＬＧＮ：外側膝状体背側核（ｄｏｒｓａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）；ＳＣ：上丘（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）。スケール・バー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）：図６Ａ）では２００μｍ、図６Ｂ）では１００μｍ。（図６Ｃ）野性型マウスから記録したＶＥＰ。この応答は、４６０ｎｍおよび５８０ｎｍの両方の波長で観察された。（図６Ｄ）Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターを注射したｒｄｌ／ｒｄｌマウスから記録したＶＥＰ。この応答は、４６０ｎｍの波長での光によってのみ誘発され、５８０ｎｍの波長では誘発されなかった。（図６Ｅ）ＧＦＰのみを担持するウイルスベクターを注射されたｒｄｌ／ｒｄｌマウスからは検出可能なＶＥＰは観察されなかった。４６０および５８０ｎｍの波長で角膜表面において測定された光強度は、それぞれ５．５×１０^１６および５．２×１０^１６光子ｃｍ^−２ｓ^{− １}であった。（図６Ｆ）４２０、４６０、５００、５２０、および５４０ｎｍの波長で種々の光強度に対する、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターを注射したｒｄｌ／ｒｄｌマウス由来のＶＥＰの振幅のプロット。各々の眼については、その応答は、４６０ｎｍで得たピーク応答に対して正規化する。そのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３つの眼）である。各々の波長でのスペクトル感度は、破線によって示される、正規化されたピーク応答の４０％を生じる補間光強度の逆数として規定された。（図６Ｇ）感度データポイントは、４６１ｎｍのピーク波長を用いてビタミンＡ_１ベースの視物質テンプレートによってフィットさせた。 図６Ａ〜６Ｅ。ｒｄｌ／ｒｄｌマウスのＣｈｏｐ２−ＧＦＰ発現網膜神経節細胞の中心射影および視覚誘発性電位。（図６Ａ）外側膝状体腹側核および外側膝状体背側核における網膜神経節細胞のＧＦＰ標識末端分枝。（図６Ｂ）上丘における網膜神経節細胞のＧＦＰ標識末端分枝。ＯＴ：光学トラック（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｃｋ）；ｖＬＧＮ：外側膝状体腹側核（ｖｅｎｔｒａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）；ｄＬＧＮ：外側膝状体背側核（ｄｏｒｓａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）；ＳＣ：上丘（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）。スケール・バー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ）：図６Ａ）では２００μｍ、図６Ｂ）では１００μｍ。（図６Ｃ）野性型マウスから記録したＶＥＰ。この応答は、４６０ｎｍおよび５８０ｎｍの両方の波長で観察された。（図６Ｄ）Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターを注射したｒｄｌ／ｒｄｌマウスから記録したＶＥＰ。この応答は、４６０ｎｍの波長での光によってのみ誘発され、５８０ｎｍの波長では誘発されなかった。（図６Ｅ）ＧＦＰのみを担持するウイルスベクターを注射されたｒｄｌ／ｒｄｌマウスからは検出可能なＶＥＰは観察されなかった。４６０および５８０ｎｍの波長で角膜表面において測定された光強度は、それぞれ５．５×１０^１６および５．２×１０^１６光子ｃｍ^−２ｓ^{− １}であった。（図６Ｆ）４２０、４６０、５００、５２０、および５４０ｎｍの波長で種々の光強度に対する、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰウイルスベクターを注射したｒｄｌ／ｒｄｌマウス由来のＶＥＰの振幅のプロット。各々の眼については、その応答は、４６０ｎｍで得たピーク応答に対して正規化する。そのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３つの眼）である。各々の波長でのスペクトル感度は、破線によって示される、正規化されたピーク応答の４０％を生じる補間光強度の逆数として規定された。（図６Ｇ）感度データポイントは、４６１ｎｍのピーク波長を用いてビタミンＡ_１ベースの視物質テンプレートによってフィットさせた。 図７は、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰフラグメント、作動可能に連結されたハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を含む、ウイルス発現構築物ｒＡＡＶ２−ＣＡＧ−Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ（配列番号１）のマップを示す。 図８（シート１〜３）は、Ｇｒｍ６遺伝子のｍＧｌｕＲ６プロモーター領域の配列（配列番号９）（１１０２３ヌクレオチド）を示す（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０４１６８４）。このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＬ６２７２１５に示される。 図８（シート１〜３）は、Ｇｒｍ６遺伝子のｍＧｌｕＲ６プロモーター領域の配列（配列番号９）（１１０２３ヌクレオチド）を示す（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０４１６８４）。このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＬ６２７２１５に示される。 図８（シート１〜３）は、Ｇｒｍ６遺伝子のｍＧｌｕＲ６プロモーター領域の配列（配列番号９）（１１０２３ヌクレオチド）を示す（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＣ０４１６８４）。このゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＬ６２７２１５に示される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒト、他の哺乳動物または他の動物被験体での眼の障害を処置するための方
法を提供する。詳細には、眼の障害は、網膜色素上皮細胞または光受容体細胞における変
異遺伝子または遺伝子欠損を含む障害である。本発明の方法は、眼の細胞における遺伝子
の産生の発現を指向するプロモーター配列に作動可能に連結されるか、またはそのプロモ
ーター配列の制御下にある眼の細胞に特異的な正常遺伝子をコードする核酸配列を担持す
る、組み換えウイルスの有効量の硝子体内または網膜下注射によるこの被験体への投与の
工程を包含し、そして変異された遺伝子または欠失された遺伝子の発現の欠失または不正
確な発現を置き換える。

眼科障害
本発明の方法が考慮され、かつ視覚の１つ以上のパラメーターを改善するために用いら
れ得る眼科の障害としては、限定はしないが、眼の前部および後部の両方に影響する発達
性の異常が挙げられる。前眼部障害としては、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円
錐角膜が挙げられる。後眼部障害としては、光受容体の機能不全によって生じる盲目障害
、および／または網膜のジストロフィーおよび変性によって生じる死が挙げられる。網膜
の障害としては、先天性定常夜盲症、加齢性黄斑変性症、先天性錐体ジストロフィー、お
よび大グループの網膜色素変性症（ＲＰ）−関連障害が挙げられる。これらの障害として
は、種々の年齢で生じる網膜における光受容体細胞、桿体および錐体の遺伝子的に死滅し
やすい傾向が挙げられる。とりわけ、重篤な網膜症、例えば、年齢とともに進行し、小児
期および青年期早期に盲目を生じるＲＰ自体のサブタイプ、ならびにＲＰ関連の疾患、例
えば、ＬＣＡの遺伝的サブタイプ（人生の初年度程度の早期に小児期に視覚喪失を高頻度
に生じる）である。後者の障害は、光受容体細胞、桿体および錐体の重篤な減少、および
しばしば完全な喪失によって遺伝的に特徴付けられる。（Ｔｒａｂｕｌｓｉ，ＥＩ，編，
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９８）。

詳細には、本発明の方法は、機能の喪失にかかわらず眼の組織構造の長期保存によって
、そして被験体の眼の細胞における機能喪失と正常な遺伝子の欠損または非存在との間の
関連によって、特徴付けられる、ＲＰＥ関連の網膜症のような眼科障害に起因して視覚を
喪失している被験体に対する少なくとも部分的な視覚の処置および／または復旧に有用で
ある。種々のこのような眼科障害、例えば、小児期発現の失明病、網膜色素変性症、黄斑
変性症、および糖尿病性網膜症、ならびに、当該分野で公知の眼の失明病が公知である。
これらの他の障害、ならびに以前には未知の原因の失明病（後者は、上記と同じ説明で特
徴付けられる）も、本発明の方法によって首尾よく処置され得ることが予想される。従っ
て、本発明の方法によって処置される特定の眼科障害は、上述の障害およびまだそのよう
に特徴付けられていない多数の疾患を包含し得る。

視覚情報は、２つの経路を通じて網膜を通じて処理される：光ＯＮをシグナル伝達する
ＯＮ経路、および光ＯＦＦをシグナル伝達するＯＦＦ経路（Ｗａｓｓｌｅ、前出）。ＯＮ
およびＯＦＦ経路の存在が、コントラスト感度の増強には重要であると一般に考えられる
。ＯＮ経路における視覚シグナルは、ＯＮ錐体双極細胞からＯＮ神経節細胞へリレーされ
る。ＯＮ錐体双極細胞およびＯＮ神経節細胞の両方が、光に応答して脱分極される。他方
では、ＯＦＦ経路の視覚シグナルは、ＯＦＦ錐体双極細胞からＯＦＦ神経節細胞に伝達さ
れる。ＯＦＦ錐体双極細胞およびＯＦＦ神経節細胞の両方が、光に応答して低分極される
。ほのかな明りで見る能力（暗所視）を担う桿体双極細胞は、ＯＮ双極細胞（光に応答し
て脱分極）である。桿体双極細胞は、ＡＩＩアマクリン細胞（ＯＮ型網膜細胞）を通じて
ＯＮおよびＯＦＦの錐体双極細胞へ視覚シグナルを伝達する。

本発明の実施例によって、ＣＡＧプロモーターによる網膜神経節細胞における光感受性
チャネル、すなわちＣｈＲ２を偏在的に発現する発現の機能的な結果が示され、かつこれ
が有用な視覚を回復するのに十分であることが示唆される。しかし、ＯＮ型網膜神経細胞
に対するＣｈＲ２のような脱分極膜チャネルの標的化は、より良好な有用な視覚を生じ得
る。さらに、双極細胞のような、より遠位の網膜神経細胞における光センサーの発現は、
変性網膜の残留しているシグナル処理機能を利用する。さらに、ＯＮ型網膜神経細胞（Ｏ
Ｎ型神経節細胞および／またはＯＮ型双極細胞）において、ＣｈＲ２のような脱分極光セ
ンサーを発現すること、およびハロロドプシン（ｈａｌｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）（塩化物
ポンプ）のような低分極光センサー（Ｈａｎ，Ｘら、２００７，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，Ｍａ
ｒ ２１；２：ｅ２９９；Ｚｈａｎｇ，Ｆら、２００７；Ｎａｔｕｒｅ ４４６：６３３
−９；ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ’ｒｅｓｕｌｔｓ）を、ＯＦＦ型網膜神経細
胞（ＯＦＦ型神経節細胞および／またはＯＦＦ型双極細胞）において発現することによっ
て、光受容体変性網膜においてＯＮおよびＯＦＦ経路を作成できる。

網膜でＯＮ経路およびＯＦＦ経路を回復するための別のアプローチは、桿体双極細胞ま
たはＡＩＩアマクリンに対して、ＣｈＲ２のような脱分極光センサーを発現することによ
って達成される。この理由は、桿体双極細胞またはＡＩＩアマクリン細胞の脱分極が、錐
体双極細胞および下流の網膜神経節細胞のレベルでＯＮおよびＯＦＦ応答をもたらし得、
従って網膜で固有であるＯＮ経路およびＯＦＦ経路が維持され得るからである（Ｗａｓｓ
ｌｅ，２００４）。

本発明によれば、以下のアプローチを用いて、内網膜神経細胞の光感度を回復する。

（１）偏在的に発現するＣｈＲ２のような光感受性チャネルを使用して、全てのタイプ
の神経節細胞（ＯＮおよびＯＦＦの両方の神経節細胞）、または全てのタイプの双極細胞
（桿体双極細胞、ならびにＯＮおよびＯＦＦ錐体双極細胞）における膜脱分極を生じる。
ＣＡＧプロモーターを有するＡＡＶベクターは既に、本明細書で例示されるとおり、げっ
歯類の網膜においてこのアプローチを部分的に達成している。

（２）脱分極光センサー、例えば、ＣｈＲ２は、ＯＮ型網膜神経細胞、例えば、ＯＮ型
神経節細胞またはＯＮ型双極細胞に標的される。Ｄｒ．Ｊ．Ｇ．Ｆｌａｎｎｅｒｙのグ
ループからの研究は、ＡＡＶ−２ウイルスベクターを用いることによってＯＮ型網膜神経
節細胞においてＧＦＰを標的する、ヒトギャップ接合性タンパク質（コネキシン−３６）
プロモーターのフラグメントを特定した（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＫＰら、２００７，Ｉｎ
ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＯＮ−Ｔｙｐｅ Ｒｅ
ｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｒｅｔ
ｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ．ＡＲＶＯ ａｂｓｔｒａｃｔ，２００７）。ｍＧｌｕＲ６プ
ロモーターの容易にパッケージ可能なバージョン（＜２．５ｋｂ）によって、ＯＮ型双極
細胞（桿体双極細胞およびＯＮ型錐体双極細胞の両方）に対するＣｈＲ２の標的化が可能
になる。

（３）細胞特異的なプロモーターを用いて、特定のタイプの網膜神経細胞を標的する。
桿体双極細胞を標的し得るプロモーターは、Ｐｃｐ２（Ｌ７）プロモーターである（Ｔｏ
ｍｏｍｕｒａ，Ｍら、２００１，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：５７〜６３）。
活性プロモーターの長さは好ましくは、２．５Ｋｂ未満であり、そのため、これは、ＡＡ
Ｖウイルスカセット中にパッケージングされ得る。

（４）ＣｈＲ２のような脱分極光センサーは、ＯＮ型神経節細胞またはＯＮ型錐体双極
細胞、および低分極光センサー、例えば、ハロロドプシンに対して、ＯＦＦ型神経節細胞
またはＯＦＦ型錐体双極細胞に標的化されて、ＯＮおよびＯＦＦ経路が生成される。上記
されるとおり、ｍＧｌｕＲ６プロモーター（＜２．５ｋｂ）の十分短い（パッケージ可能
）バージョンによって、ＯＮ型双極細胞に対してＣｈＲ２を標的することが可能になる。
ニューロキニン−３（ＮＫ−３）プロモーターを用いて、ＯＦＦ錐体双極細胞に対してハ
ロロドプシンを標的する（Ｈａｖｅｒｋａｍｐ，Ｓら，２００２，Ｊ Ｃｏｍｐａｒａｔ
ｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４５５：４６３〜７６）。

ベクター
本発明の種々の実施形態によれば、種々の公知の核酸ベクター、例えば、組み換えウイ
ルス、例えば、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、組み換えアデノウイルス、組
み換えレトロウイルス、組み換えポックスウイルス、および当該分野で公知の他のウイル
ス、ならびにプラスミド、コスミドおよびファージなどをこれらの方法で用いてもよい。
当該分野で周知の多くの刊行物は、遺伝子の送達のための種々のこのようなベクターの使
用を考察している。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，最終版；Ｋａｙ，ＭＡ．ら、２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７：３３〜
４０；およびＷａｌｔｈｅｒ Ｗら、２０００，Ｄｒｕｇｓ ６０：２４９〜７１を参照
のこと）。

組み換えベクターのアセンブリのための方法は周知である。例えば、その全てが参照に
よって本明細書に援用される、ＷＯ ００／１５８２２およびそこに引用される他の参考
文献を参照のこと。

種々のウイルスベクター系に対して利点および不利な点がある。どれほど多くのＤＮＡ
がパッケージ可能かという限界は、どの系が使用されるかを選択するのにおける１つの決
定因子である。ｒＡＡＶは、約４．５ｋｂのＤＮＡに限定される傾向であるが、レンチウ
イルス（例えば、レトロウイルス）系は、４〜５ｋｂを収容し得る。

ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルスは、小型の一本鎖ＤＮＡウイルスであって、効率的な複製のために
ヘルパーウイルスを要する（Ｂｅｒｎｓ，ＫＩ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖ
ｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．１００７〜１０４１
（第２巻），Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３
版，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐ
ｈｉａ（１９９５））。ＡＡＶの４．７ｋｂのゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ
）、ならびにそれぞれＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする２つのオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。Ｒｅｐリーディングフレームは、分子量
７８、６８、５２および４０ｋＤａの４つのタンパク質をコードする。これらのタンパク
質は主に、ＡＡＶ複製を調節すること、ならびにＡＡＶのレスキューおよび宿主細胞染色
体への組み込みに機能する。Ｃａｐのリーディングフレームは、分子量８５（ＶＰ１）、
７２（ＶＰ２）および６１（ＶＰ３）ｋＤａの３つの構造的タンパク質をコードし、これ
らのタンパク質がビリオンカプシドを形成する（Ｂｅｒｎｓ，前出）。ＶＰ３は、総ＡＡ
Ｖビリオンタンパク質の８０％より多くを含む。

５’末端および３’末端で隣接するｒｅｐおよびｃａｐのＯＲＦは、１４５ｂｐのＩＴ
Ｒであり、その最初の１２５ｂｐは、Ｙ型またはＴ型の二重鎖構造を形成し得る。この２
つのＩＴＲはＡＡＶの複製、レスキュー、パッケージングおよびゲノムの組み込みに必須
の唯一のｃｉｓエレメントである。「ｆｌｉｐ」および「ｆｌｏｐ」と呼ばれるＡＡＶの
ＩＴＲの２つの高次構造が存在する（Ｓｎｙｄｅｒ，ＲＯら、１９９３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ
，６７：６０９６〜６１０４；Ｂｅｒｎｓ，ＫＩ，１９９０ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅ
ｖ，５４：３１６〜２９）。全体的なｒｅｐおよびｃａｐドメインは、切除されて、導入
遺伝子、例えば、レポーターまたは治療用導入遺伝子で置き換えられてもよい（Ｃａｒｔ
ｅｒ，ＢＪ，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓ
ｓｅｒ，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５〜１６８（１９９０））。

ＡＡＶは、多くの動物種で見出されており、これには霊長類、イヌ、家禽およびヒトが
挙げられる（Ｍｕｒｐｈｙ，ＦＡら、Ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｉｘｔｈ Ｒｅｐｔ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｃｏｍｍｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｒｃ
ｈ Ｖｉｒｏｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９５）。６つの霊長類血清型が
公知である（ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６）。

ミニ遺伝子、ベクターおよびカプシド、ならびに本発明で用いられる他の構築物を生成
するのに使用されるＡＡＶのＩＴＲ配列および他のＡＡＶ配列は、種々の供給源から入手
され得る。例えば、この配列は、現在公知のヒトＡＡＶおよびまだ特定されていない血清
型の両方を含む、任意の上記の６つのＡＡＶ血清型または他のＡＡＶ血清型または他のデ
ンソウイルスによって提供され得る。同様に、他の動物種に感染することが公知のＡＡＶ
は、本発明の分子および構築物で用いられるＩＴＲの供給源であり得る。種々の血清型の
ＡＡＶ由来のカプシドを、他のベクター成分と種々の混合物中で組み合わせてもよい（例
えば、ＷＯ０１／８３６９２（２００１年１１月８日）参照によって本明細書に援用され
る）。多くのこれらのウイルス株または血清型は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．，から入手可
能であり、または種々の他の供給源（学術的または商業的）から入手可能である。

例えば、種々のデータベースから入手可能な、公表されたＡＡＶ配列に基づいて、公知
の技術を用いて本発明のベクターおよびウイルスを調製することに用いられる配列を合成
することが所望され得る。本発明の構築物を調製するために利用される配列の供給源は、
限定されるとは考えられない。同様に、ＡＡＶの血清型および（起源の）種の選択は、当
該分野の技術の範囲内であり、限定とは解釈されない。

ミニ遺伝子
本明細書において用いる場合、ＡＡＶ配列は代表的には、ｒＡＡＶビリオン中にパッケ
ージングされるｒＡＡＶ構築物（例えば、ミニ遺伝子またはカセット）の形態である。最
小限、ｒＡＡＶミニ遺伝子は、ＡＡＶ ＩＴＲおよび宿主細胞への送達のための異種核酸
分子によって形成される。最も適切には、ミニ遺伝子は、異種配列に対して５’および３
’側に配置されたＩＴＲを含む。しかし、直列に、例えば、５’〜３’またはヘッド・ツ
ー・テールに配置された、または別の構成の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの配列を含むミ
ニ遺伝子も所望され得る。他の実施形態は、複数のコピーのＩＴＲを有するミニ遺伝子、
または５’ＩＴＲ（または反対には３’ＩＴＲ）が異種配列に対して５’および３’の両
方に位置しているものを包含する。ＩＴＲ配列は、異種配列のすぐ上流および／または下
流に位置してもよい；介在性配列が存在してもよい。ＩＴＲはＡＡＶ５由来であってもよ
いし、または任意の他のＡＡＶ血清型由来であってもよい。ミニ遺伝子は、１血清型由来
の５’ＩＴＲおよび別の血清型由来の３’ＩＴＲを含み得る。

用いられるＡＡＶ配列は好ましくは、１４５ｂｐのシス作用性５’および３’ＩＴＲ配
列である（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，ＢＪ，前出）。好ましくは、全体的なＩＴＲ配列を用
いるが、最少の改変は許容できる。これらのＩＴＲ配列を改変するための方法は周知であ
る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；Ｂｒｅｎｔ，Ｒ
ら編集，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ
Ｍら、編，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，第５版，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００２；Ｃａｒｔｅｒら、前出；
およびＦｉｓｈｅｒ，Ｋら、１９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：５２０〜３２）。公知の
方法を用いてｒＡＡＶウイルスを操作することが慣習的である（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ
，Ｊら、１９９９，前出）。本発明において使用されるこのような分子の例は、５’およ
び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する異種配列、好ましくはＣｈｏｐ２配列を含む「シス
作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）」プラスミドである。

この異種配列は、細胞に送達されて発現されることが所望されるタンパク質またはポリ
ペプチドをコードする。本発明は、選択されたプロモーターおよび他の従来のベクター調
節成分の制御下のＣｈｏｐ２配列に関する。

標的されかつ発現されている導入遺伝子
最も好ましい実施形態では、この異種配列は、導入遺伝子として機能する核酸分子であ
る。本明細書において用いる場合、「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」という用語は
、ＡＡＶ配列に対して異種であり、かつ所望の産物、好ましくはＣｈｏｐ２、ならびに宿
主細胞中でこの核酸の転写および／または翻訳を指向または調整して、コードされた産物
のこのような細胞中での発現を可能にする調節配列をコードする核酸配列をいう。好まし
いポリペプチド産物とは、眼に、詳細には網膜神経細胞に送達され得る産物である。

導入遺伝子は、正常な光受容体特異的遺伝子における変異を含む、任意の多数の原因か
ら生じ得る眼の障害を有する被験体の視覚状態を処置するかそうでなければ改善するため
に送達および発現される。この標的された眼の細胞は、光受容体細胞（完全に変性されて
いない場合）であっても、またはさらに好ましくは、他の網膜神経細胞、すなわち、双極
細胞および網膜神経節細胞であってもよい。

Ｃｈｏｐ２オプシンコード配列に作動可能に連結されたｍＧｌｕＲ６プロモーターおよ
びレポーター遺伝子、例えば、ＧＦＰまたは別の蛍光タンパク質を用いて、約４．５ｋｂ
の挿入物が好ましく、オプシンについては１ｋｂ、レポーターについては０．７ｋｂ、ｍ
ＧｌｕＲ６プロモーター領域については１０ｋｂ、そして従来の転写調節因子については
約０．４ｋｂ。

種々のオプソニン遺伝子の使用によって、異なるチャネルタンパク質の吸収極大が異な
るにつれて所望の波長の選択が可能になる。１実施形態では、報告された遺伝子を視覚ス
ペクトルの赤い部分に動かす。

同様に、本明細書で報告された研究に基づいて、形質導入されたマウス網膜において誘
発電位を刺激するのに必要な光の明るさによって、漸増する光感度を有するチャネルオプ
シンが所望され得ることが示される。これは、適切な天然に存在するオプシン、例えば、
他の微生物型ロドプシンの選択によって、またはＣｈｏｐ２の光感度およびそれの他の特
性、例えば、イオン選択性およびスペクトル感度を改変して、視覚回復に対する必要性を
より良好にフィットさせる多様化光感度チャネルを生成することによって、達成され得る
。

異なる導入遺伝子を用いて、送達されているタンパク質の別のサブユニットをコードし
ても、または同時発現が所望される異なるポリペプチドをコードしてもよい。単一の導入
遺伝子が、各々のいくつかのサブユニットをコードするＤＮＡを含む場合、各々のサブユ
ニットをコードするＤＮＡは、短いサブユニットコードＤＮＡ配列（例えば、ＩＲＥＳを
含む総ＤＮＡが５ｋＢ未満）に好ましい内部リボサイムエントリーサイト（ｉｎｔｅｒｎ
ａｌ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）によって隔てられてもよ
い。ＩＲＥＳを使用しない他の方法、例えば、その全てが当該分野で公知である、第二の
内部プロモーター、別のスプライスシグナル、翻訳と同時またはその後のタンパク質分解
性切断ストラテジーなどの使用が同時発現に用いられてもよい。

本明細書において有用な核酸のコード配列または非コード配列は好ましくは、それらが
発現されるべき種にとってコドン最適化される。このようなコドン最適化は当該分野では
慣用的である。

好ましい導入遺伝子は全長ポリペプチド、好ましくはＣｈｏｐ２（配列番号６）をコー
ドするが、本発明はまた、Ｃｈｏｐ２の（または網膜神経細胞で発現されるべき本発明の
任意の別のポリペプチドの）生物学的に活性なフラグメントまたは保存的アミノ酸置換改
変体をコードするベクターにも関する。有用なフラグメントの非限定的な例は、配列番号
３および配列番号８の配列を有するポリペプチドである。このフラグメントまたは改変体
は、形質転換されている標的細胞によって発現され、そして改変体ではなく天然のアミノ
酸配列を有する全長または実質的に全長のポリペプチドのものと機能的に等価である光感
度をこのような細胞に与えることを可能にする。生物学的に活性なフラグメントまたは改
変体は「機能的に等価（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」であり、この
用語は当該分野で十分に理解され、そして本明細書においてさらに詳細に記載される。フ
ラグメントまたは改変体の要求性の生物学的活性は、チャネルオプシンの活性を確立する
ために本明細書に開示されるかまたは当該分野で公知である任意の方法を用いて、野生型
の天然のポリペプチドに対して以下の活性を有する：約５０％、約５５％、約６０％、約
６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、お
よび本明細書で導き出せる任意の範囲、例えば、約７０％〜約８０％、そしてさらに好ま
しくは約８１％〜約９０％；またそれよりさらに好ましくは、約９１％〜約９９％。

遺伝子コードの縮重の結果として、同じ配列のポリペプチドを発現する本発明の核酸お
よびベクターのコード配列における任意の改変体は、本発明の範囲内に包含されることが
理解されるべきである。

本発明の改変体のアミノ酸配列同一性は、代表的には特定の数学的アルゴリズムに基づ
いて標準的な方法を用いて決定される。好ましい実施形態では、アミノ酸配列の間の同一
性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８
：４４４−４５３（１９７０）のアルゴリズムを用いて決定され、このアルゴリズムはＢ
ｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１
４、１２、１０、８、６、または４というギャップウエイト、および１、２、３、４、５
または６という長さウエイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれている。さ
らに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、Ｇ
ＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）にお
けるＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、
５０、６０、７０、または８０というギャップウエイトおよび１、２、３、４、５、また
は６という長さウエイトを用いて決定される。別の実施形態では、２つのアミノ酸または
ヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０
）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１〜１７
（１９８９））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ １２０ウエイト残余表（ｗｅｉｇｈｔ
ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２というギャップ長ペナルティおよび４というギャ
ップペナルティを用いて決定される。本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はさらに
、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連の配列を特定するために、公的データベー
スに対する検索を行うための「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として
用いられてもよい。このような検索は、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）を用い
て行われ得る。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索は、例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
のＣｈｏｐ２をコードするＤＮＡに対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬ
ＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われてもよい。ＢＬＡＳＴのタ
ンパク質検索は、Ｃｈｏｐ２のような適切な参照タンパク質に相同なアミノ酸配列を得る
ために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行われてもよい。比較
目的のギャップアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用しても
よい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５
：３３８９〜３４０２）。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用
する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォ
ールトパラメーターを用いてもよい。Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ ｎｃｂｉ
．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。

好ましいアミノ酸配列を改変体は、天然の全長チャネルオプシンポリペプチド、好まし
くは、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のＣｈｏｐ２（配列番号６）と、またはそのフラ
グメント（例えば、配列番号３または８）と以下の程度の配列同一性を有する：約５０％
、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％
、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％
、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％
、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％
、または約９９％、およびその中で導き出せる任意の範囲、例えば、約７０％〜約８０％
、そしてさらに好ましくは約８１％〜約９０％など；またはそれよりさらに好ましくは、
約９１％〜約９９％の同一性。好ましい生物学的に活性なフラグメントは、配列番号６の
残基１〜３１５に相当する配列番号３を含むかもしくはそれからなり、または配列番号８
を含むかもしくはそれからなる。

フラグメントまたは改変体をコードするＤＮＡ分子を生成するために任意の多数の公知
の組み換え方法が用いられる。改変体の生成のためには、コード配列に変異を導入して、
本発明の所望のアミノ酸配列改変体を生成することが慣用的である。部位指向性の変異誘
発は、プロトコールおよび試薬が市販されている周知の技術である（例えば、Ｚｏｌｌｅ
ｒ，ＭＪら、１９８２，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７〜６５００；Ａ
ｄｅｌｍａｎ，ＪＰら、１９８３，ＤＮＡ ２：１８３〜９３）。これらの変異体は、単
純な欠失もしくは挿入、体系的な欠失、塩基の集団の挿入もしくは置換、または単一の塩
基の置換を包含する。

機能的等価物に関して、「生物学的に機能的な等価な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」タンパク質、ポリペプチド、遺伝子また
は核酸の定義における、固有の（生来の）（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）とは、その分子の規定の
部分内で作成され得る変化の数に対する制限が存在し、そして等価な生物学的活性の受容
可能なレベルを有する分子がやはり生じ得るという概念であることが当業者にはよく理解
される。従って、生物学的に機能的な等価なペプチドとは、ほとんどでも全てでもない特
定のアミノ酸が置換され得るペプチドとして本明細書で規定される。

詳細には、ポリペプチドの長さが短いほど、少ないアミノ酸変化が作成されるはずであ
る。それよりフラグメントが長ければ、中間的な数の変化を有し得る。全長ポリペプチド
タンパク質は、多数の変化について最も耐性を有する。特定の残基が、結合領域または活
性部位におけるポリペプチド残基の生物学的または構造的な特性に対して特に重要である
ことが示されている場合、このような残基は、一般には交換され得ないこともよく理解さ
れる。この方式では、機能的な等価物とは、本明細書において、それらのネイティブな生
物学的活性のかなりの量を維持するポリペプチドとして規定される。

タンパク質の化学および構造の詳細な説明については、参照によって本明細書に援用さ
れる、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８，およびＣ
ｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３を参照のこと。タンパク質分子において作成され得る置換
のタイプは、Ｓｃｈｕｌｚら、（前出）の表１〜２およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（前出）の
図３〜９に提示されるような、種々の種の相同なタンパク質の間のアミノ酸変化の頻度の
分析に基づいてもよい。このような分析に基づいて、保存的置換は、以下の５つの群のう
ちの１つ内の変化として本明細書で規定される。

上記のカッコ内の３つのアミノ酸残基は、タンパク質の構造に特別な役割を有する。Ｇ
ｌｙは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従ってその鎖に可塑性を付与する。Ｐｒｏは、そ
の通常でない幾何形状のせいで、その鎖を緊密に拘束する。Ｃｙｓは、タンパク質折り畳
みに重要であるジスルフィド結合形成に関与し得る。

アミノ酸の疎水性親水性指標も、改変体選択において考慮され得る。各々のアミノ酸は
、それらの疎水性および電荷の特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられており、
これらは以下である：Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．８）；
Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ（＋１．８）；
Ｇｌｙｃｉｎｅ（グリシン）（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）；
Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−３．２）；
Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ａｓｎ（−３．５）；
Ｌｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。タンパク質様の分子に対して相互作用
的な生物学的機能を付与するのにおける疎水性親水性指標の重要性は一般に、当該分野で
理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１
５７：１０５〜３２）。特定のアミノ酸が、同様の疎水性親水性指標係数またはスコアを
有する他のアミノ酸で置換されてもよく、それでも同様の生物学的活性を保持しているこ
とが公知である。疎水性親水性指標に基づく変化を作成するのには、その疎水性親水性係
数が±２内であるアミノ酸置換が好ましく、±１内であるアミノ酸置換が特に好ましく、
そして±０．５内のアミノ酸置換がそれよりさらに特に好ましい。類似のアミノ酸の置換
は、そのように作成された生物学的に機能的なポリペプチドが、本発明の特定の実施形態
における使用に意図される場合特に、疎水性親水性指標に基づいて有効になり得ることも
当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性
によって支配されるとおり、タンパク質様分子の最大の局所平均親水性が、その分子の生
物学的な特性に相関するということを開示する。親水性の値については、米国特許第４，
５５４，１０１号を参照のこと。類似の親水性値に基づいた変化を作成するのにおいて、
親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１内であるアミノ酸置換が特に好
ましく、そして±０．５内のアミノ酸置換がそれよりさらに特に好ましい。

調節性（制御）配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
本発明のミニ遺伝子または導入遺伝子は、コード配列またはＯＲＦに対して作動可能に
連結された適切な配列を含み、標的された宿主細胞でその発現を促進する。「作動可能に
連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」配列としては、コード配列と接触して
いるプロモーターのような発現制御配列、およびポリペプチド産物の発現をトランスでま
たは遠位で制御するように作用する発現制御配列の両方が挙げられる。

発現制御配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）として
は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびハンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロ
セシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質のｍ
ＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配
列）；核酸またはタンパク質の安定性を増強する配列；そして所望の場合、タンパク質プ
ロセシングおよび／または分泌を増強する配列が挙げられる。多くの変化した発現制御配
列であって、天然および非天然の構成的な誘導性のおよび／または組織特異的な配列を含
む配列は、当該分野で公知であり、そして所望の発現のタイプに依存して本明細書で利用
され得る。

真核生物細胞についての発現制御配列は代表的には、プロモーター、エンハンサー、例
えば、免疫グロブリン遺伝子由来の配列、ＳＶ４０、ＣＭＶなど、およびスプライスドナ
ーおよびアクセプター部位を含み得るポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列は
一般には、コード配列に対して３’側および３’側ＩＴＲ配列に対して５’側に挿入され
る。ウシ成長ホルモン由来のポリＡは適切な配列である。

本明細書で有用な調節配列はまた、イントロン、例えば、プロモーター／エンハンサー
配列とコード配列との間に位置する配列を含んでもよい。１つの有用なイントロン配列は
、ＳＶ４０由来であり、そしてＳＶ４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。別には、ウッドチ
ャック肝炎ウイルス転写後エレメントが挙げられる（例えば、Ｗａｎｇ ＬおよびＶｅｒ
ｍａ，Ｉ，１９９９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：３９０
６〜１０を参照のこと）。

ＩＲＥＳ配列、または上で考察されるような他の適切なシステムは、単一の転写物由来
の２つ以上のポリペプチドを生成するために用いられ得る。ｎ例示的なＩＲＥＳは、ポリ
オウイルスＩＲＥＳであり、これが光受容体、ＲＰＥおよび神経節細胞における導入遺伝
子発現を支持する。好ましくは、ＩＲＥＳはｒＡＡＶベクターにおけるコード配列に対し
て３’側に位置する。

このプロモーターは、好ましくは網膜神経細胞における、眼の設定における選択された
導入遺伝子の発現を駆動し得る多数の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターから
選択され得る。好ましいプロモーターは、「細胞特異的（ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）
」であり、このことは、これが光受容体細胞のような特定の眼の細胞タイプにおける選択
された導入遺伝子の発現を指向するように選択されるということを意味している。

有用な構成的プロモーターの例としては、例示されたＣＭＶ早初期エンハンサー／ニワ
トリβ−アクチン（ＣβＡ）プロモーター−エキソン１−イントロン１エレメント、ＲＳ
ＶＬＴＲプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ジ
ヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター、およびホスホグリセロールキナーゼ（ｐ
ｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ）（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。

さらなる有用なプロモーターは、Ｗ．Ｗ．Ｈａｕｓｗｉｒｔｈら、１９９８，Ｗ０９８
／４８０２７およびＡ．Ｍ．Ｔｉｍｍｅｒｓら、２０００，ＷＯ００／１５８２２に開示
される。ＲＰＥ細胞特異的遺伝子発現をインビボで駆動することが見出されたプロモータ
ーとしては、（１）５２８ｂｐのプロモーター領域（マウスの１１−シスレチノールデヒ
ドロゲナーゼ（ＲＤＨ）遺伝子の塩基１〜５２８）（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ，ＣＡら、１９９
５，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３６：１９８８〜９６；Ｓ
ｉｍｏｎ，Ａ．ら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１１０７〜１２，１９
９５；Ｓｉｍｏｎ，Ａ．ら、１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３６：４２４〜３）Ｇｅｎｂ
ａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｘ９７７５２）；（２）２２７４ｂｐのプ
ロモーター領域）ヒト細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｕ
ｌａｒ ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＲＡＬＢ
Ｐ）遺伝子由来（Ｉｎｔｒｅｓ，Ｒら、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２
５４１１〜１８；Ｋｅｎｎｅｄｙ，ＢＮら、１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３
：５５９１〜８，１９９８）、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｌ
３４２１９）；ならびに（３）ヒトＲＰＥ６５由来の１４８５ｂｐのプロモーター領域（
Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ａら、１９９８，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ．
Ｓｃｉ．３９：６３７〜４４，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｕ
２０５１０）。これらの３つのプロモーター（ＷＯ００／１５８２２”２．３および３に
おいて以下の配列番号で標識される）は、ＧＦＰのＲＰＥ細胞特異的な発現を促した。本
明細書に考察される種々のプロモーターおよびプロモーター領域におけるわずかな配列改
変は（付加でも、欠失でもまたは変異でも、天然に存在してもまたはインビトロで導入さ
れても）、本発明の細胞標的において発現を駆動する能力に影響しないと想定される。さ
らに、網膜細胞における、詳細には双極細胞または神経節細胞における豊富なおよび／ま
たは特異的な発現によって特徴付けられる、他のプロモーターの使用は、まだ発見されて
ない場合でも、特に本発明の範囲内に包含される。

誘導性プロモーターは、眼の細胞における導入遺伝子産物の産生の量およびタイミング
を制御するために用いられる。このようなプロモーターは、この遺伝子産物が、それが過
剰に蓄積する場合、いくつかの所望されない、例えば毒性の効果を細胞中で有する場合に
有用であり得る。誘導性プロモーターとしては、当該分野で公知のプロモーター、例えば
、Ｚｎ誘導性のヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ
）誘導性マウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター；Ｔ７プロモーター；エ
クジソン昆虫プロモーター；テトラサイクリン抑制系；テトラサイクリン誘導性系；ＲＵ
４８６−誘導性系；およびラパマイシン誘導性系が挙げられる。任意の誘導性プロモータ
ーであって、その作用が緊密に調節され、そして特定の標的の眼の細胞タイプに特異的で
あるプロモーターが用いられ得る。他の有用なタイプの誘導性プロモーターは、特異的な
生理学的状態、例えば、温度、急性期、細胞複製または分化状態によって調節されるプロ
モーターである。

本明細書における使用のための種々のベクターおよび調節（制御）エレメントの選択は
、従来の、十分記載され、そして容易に利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出；およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。全てではないベクターおよび発現制
御配列が、本発明の導入遺伝子、好ましくはＣｈｏｐ２を発現するのに十分等しく機能す
るということが容易に理解される。明らかに、当業者は、本発明の範囲から逸脱すること
なく、そして一般的な知識および本明細書に提供されるガイダンスに基づいて、公知の発
現制御配列のなかで慣用的な選択を適用し得る。当業者は、１つ以上の発現制御配列を選
択し、発現されているコード配列に対してそれらを作動可能に連結してミニ遺伝子を作成
し、このミニ遺伝子またはベクターをＡＡＶベクターに挿入し、そしてｒＡＡＶに公知の
パッケージング方法のうち１つに従って感染性粒子またはビリオンへのこのベクターのパ
ッケージングを生じることができる。

ｒＡＡＶの産生
本発明に用いられるｒＡＡＶは、本明細書に記載される材料および方法、ならびに当該
分野で周知の材料および方法を用いて構築および生成され得る。本発明の任意の構築物を
生成するために好ましい方法は、構成的および誘導性の遺伝子操作、組み換え操作、およ
び合成的技術、例えば、上記で引用される引用文献に示されるものである。

要するに、ｒＡＡＶビリオン中へのｒＡＡＶ構築物をパッケージングするために、ＡＡ
ＶのｒｅｐおよびＡＡＶのｃａｐまたはその機能的なフラグメントを発現するのに必要な
配列、ならびにＡＡＶの産物に必須のヘルパー遺伝子が宿主細胞に存在しなければならな
い。例えば、異なる血清型のＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするシュー
ドタイプのｒＡＡＶビリオンベクターの産生およびヘルパー機能を提供するＡｄＶ転写産
物を記載する米国特許出願公開第２００７／００１５２３８号を参照のこと。例えば、Ａ
ＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ配列は、限定はしないが、トランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、リポソーム送達、膜融合、ＤＮＡコーティングペレットの微粒子銃送達、
ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含む任意の公知の方式で宿主細胞に導入されて
もよい。遺伝子療法の目的のために眼の中および周囲の特定の領域にＤＮＡを送達するた
めに特に適合されたデバイスは、最近記載されており（例えば、参照によって本明細書に
援用される、米国特許出願公開２００５／０２７７８６８）、本発明の範囲内で用いられ
る。このようなデバイスは、エレクトロポレーションおよびエレクトロマイグレーション
（ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を利用し、これは網膜の背後に位置されてもよい
可塑性支持体上に例えば２つの電極を提供する。第三の電極は、中空支持体の一部であり
、この支持体はまた所望の領域にこの分子を注射するために用いられ得る。この電極は、
網膜の背後または硝子体内を含む、眼の周囲に配置されてもよい。

これらの配列は、エピソームとして細胞中で安定に存在してもよいし、または細胞のゲ
ノムに安定に組み込まれてもよい。それらはまた、宿主細胞においてさらに一過性に発現
されてもよい。例えば、有用な核酸分子は、５’〜３’のプロモーター、プロモーターと
ｒｅｐ配列の開始部位との間の任意のスペーサー、ＡＡＶのｒｅｐ配列、およびＡＡＶの
ｃａｐ配列を含む。

ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、それらの発現制御配列とともに、好ましくは、単一ベクタ
ーに提供されるが、それらは個々のベクター中に別々に提供されてもよい。このプロモー
ターは任意の適切な構成的、誘導性または天然のプロモーターであってもよい。Ｒｅｐお
よびＣａｐタンパク質を提供する送達分子は、任意の形態、好ましくはプラスミドであっ
てもよく、このプラスミドは、マーカーとして使用される配列のような他の非ウイルス配
列を含んでもよい。この分子は代表的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびパッケージング配列を
排除する。相同組み換えの発生を回避するために、他のウイルス配列、特にアデノウイル
ス配列が回避される。このプラスミドは好ましくは、安定に発現されるものである。

引用される参考文献に記載される従来の遺伝子操作または組み換えＤＮＡ技術が用いら
れる。ｒＡＡＶは、製造業者の指示に従ってリン酸カルシウム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）また
はＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）試薬（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかによる三重トランスフェ
クション方法を用いて生成され得る。例えば、Ｈｅｒｚｏｇら、１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅ
ｄ．５：５６〜６３を参照のこと。

ｒＡＡＶビリオンは、全てが調節性配列指向性発現の制御下であるｒＡＡＶビリオンに
パッケージングされるべきｒＡＡＶ構築物、ＡＡＶのｒｅｐ配列およびＡＡＶのｃａｐ配
列を含む、本明細書に記載されるようなｒＡＡＶを含む宿主細胞を培養することによって
生成される。

適切なウイルスヘルパー遺伝子、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４Ｏｒｆ６および
ＶＡは、好ましくは別々のプラスミド上で培養物に添加されてもよい。その後、導入遺伝
子の発現を指向するｒＡＡＶビリオンは、混入するヘルパーウイルスも野生型ＡＡＶもな
しに単離される。

特定の発現制御配列が、所定の導入遺伝子に適切であるか否かを評価して、導入遺伝子
を発現するのに最も適切なものを選択することが慣習的である。例えば、標的細胞は、イ
ンビトロで感染され得、そして細胞中の導入遺伝子の多数のコピーがサザンブロットまた
は定量的ＰＣＲによってモニターされ得る。ＲＮＡ発現のレベルは、ノーザンブロットの
定量的ＲＴ−ＰＣＲによってモニターされ得る。タンパク質発現のレベルは、ウエスタン
ブロット、免疫組織化学、酵素イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
）（ＥＩＡ）、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）を含むイムノアッセイによって、または他の方法によってモニターされ得る。特異的
な実施形態は、下の実施例に記載される。

本発明の薬学的組成物および方法
Ｃｈｏｐ２導入遺伝子および上記されるような標的眼細胞における使用のための細胞特
異的プロモーターを含むｒＡＡＶは、従来の方法を用いて混入について評価され、そして
例えば、網膜下注射による投与のための滅菌または無菌の薬学的組成物中に処方されるべ
きである。

このような処方物は、薬学的に、そして／または生理学的に受容可能なビヒクル、希釈
剤、キャリアまたは賦形剤、例えば、緩衝化生理食塩水または他の緩衝液、例えば、ＨＥ
ＰＥＳを、生理学的なｐＨを維持するために含む。このような成分およびそれらの処方物
の考察については、一般には、Ｇｅｎｎａｒｏ，ＡＥ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃ
ｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２００３また
は最終版を参照のこと。また、ＷＯ００／１５８２２も参照のこと。この調製物が長期間
保管されるべき場合、これは、例えば、グリセロールの存在下で凍結されてもよい。

上記の薬学的組成物は、任意の適切な経路によって、好ましくは、硝子体内または網膜
下注射によって、標的化されている網膜層に依存して、視覚疾患または失明病を有する被
験体に投与される。

Ｂｅｎｎｅｔｔおよび共同研究者（本明細書に引用される）の開示は、網膜色素上皮（
硝子体腔から最も遠位の層）の標的化に関する。本発明によれば、ＤＮＡ構築物は、網膜
神経節細胞または双極細胞のいずれかに標的化される。この神経節細胞は、本明細書に記
載のような硝子体内注射に合理的に十分使用可能である。硝子体内および／または網膜下
注射は、特に光受容体細胞層が変性のせいで存在しない環境中で（本発明が克服しようと
する変性の特定の形態における場合である）、双極細胞に対する必須のアクセスを提供し
得る。

ベクターが、詳細には哺乳動物網膜神経細胞において、ＡＡＶ媒介性送達によって、導
入遺伝子を発現する能力について試験するために、ＳＶ４０ポリＡ配列に連結されたＬａ
ｃＺまたはＧＦＰのようなレポーター遺伝子に連結された好ましいプロモーター配列の組
み合わせが、プラスミドに挿入されて、そしてｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージング
されて、濃縮され、混入するアデノウイルスについて試験され、そして感染中心アッセイ
を用いてｒＡＡＶについて滴定されてもよい。多数の試験被験体、好ましくは近交系マウ
スの右目は、ｒＡＡＶ調製物の約１μｌを網膜下に注射される（例えば、１ｍｌあたり約
１０^１０を超える感染単位）。２週後、動物の半分の右（試験）および左（コントロール
）の眼を取り除き、固定して、適切な基質または抗体または他の物質で染色して、レポー
ター遺伝子の存在を明らかにする。注射された眼の試験網膜のほとんどが、局所染色領域
、例えば、局所化された網膜剥離を作成する注射ウイルスの網膜下小疱と一致した、Ｌａ
ｃＺ／Ｘｇａｌについては青、またはＧＦＰについては緑を示した。全てのコントロール
の眼は、レポーター遺伝子産物について陰性である。後者の時点で屠殺されたマウスで試
験されたレポーター遺伝子発現は、注射の少なくとも１０週後に検出され、これによって
、レポーター導入遺伝子の一過性発現が示唆される。

選り抜きのプロモーター、好ましくは構成的ＣＭＶプロモーターまたは細胞特異的プロ
モーター、例えば、ｍＧｌｕＲ６の制御下でＣｈｏｐ２ＤＮＡをコードする核酸配列を担
持するｒＡＡＶビリオンの有効量は好ましくは、１注射あたり約１５０〜約８００μｌの
容積中に、約１０^１０〜約１０^１３個のｒＡＡＶ感染性単位の範囲が好ましい。ｒＡＡＶ
感染性単位は、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ＳＫら、１９８８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：１９
６３に従って測定され得る。より好ましくは、有効量は、約１０^１０〜約１０^１２個のｒ
ＡＡＶ感染性単位であり、そしてその注射容積は好ましくは、約２５０〜約５００μｌで
ある。他の投薬量および容積、好ましくはこれらの範囲内だが可能性としてはそれらの外
側が、年齢、体重、全体的な健康ならびに特定の眼の障害の性質および重篤度を含む、処
置されている被験体（好ましくはヒト）の身体的状態を考慮して処置の専門家によって選
択されてもよい。

本発明の核酸またはｒＡＡＶ組成物のさらなる用量（「ブースター（ｂｏｏｓｔｅｒｓ
）」）を投与することも所望され得る。例えば、眼の標的細胞内の導入遺伝子発現の期間
に依存して、第二の処置は、６ヶ月後または年々投与されてもよく、そして同様に繰り返
されてもよい。ＡＡＶに対する中和抗体は、用いられる経路および用量の観点で生成され
ることが予想されず、これによって反復処置経路が可能になる。

このようなさらなる用量についての必要性は、例えば、周知の電気生理学的および他の
網膜および視覚機能試験および視覚挙動試験を用いて処置する専門家によってモニターさ
れ得る。処置専門家は、当該分野の慣用的な技術を行う適切な試験を選択し得る。相対的
な転帰のパラメーターをさらに改善するために単一または複数の用量のいずれかでその組
成物のより大きい容積を注射することも所望され得る。

光感度および視覚の回復または改善
本発明の種々のパラメーターを評価するためのインビトロおよびインビボの両方の研究
を用いてもよく、これには、失明するヒトの眼科障害の認識された動物モデルを含む。ヒ
ト網膜症、例えば、小児失明の大きい動物モデルが有用である。本明細書に提供される実
施例によって、この方法が網膜疾患の範囲を処置するのに同様に用いられ得るということ
を当業者は容易に予想できるようになる。

他者による初期の研究では、網膜変性は遺伝子治療技術によって遅延させられ得ること
が実証されているが、本発明では、行動的パラメーターを含む視覚の種々のパラメーター
を生成または改善することが予測される機能の明確な生理学的回復を実証する。

行動的測定は、公知の動物モデルおよび試験、例えば水迷路における能力を用いて、得
ることが可能であり、ここでは視覚が保存されているかまたは種々の程度まで回復されて
いる被験体は光に向かって泳ぐ（Ｈａｙｅｓ，ＪＭら、１９９３，Ｂｅｈａｖ Ｇｅｎｅ
ｔ ２３：３９５〜４０３）。

失明が成体の寿命の間に誘発されるか、または個人が視覚を失う前に視覚を経験するの
に十分ゆっくりと先天性の失明が発症するモデルでは、種々の試験において被験体の訓練
を行ってもよい。この方法では、これらの試験を視覚喪失の後に再投与して、本発明の組
成物および方法の有効性をその視覚回復効果について試験する場合、動物は、盲目状態で
新規に作業を学習しなければならないということはない。他の行動試験には、学習を必要
とせず、そして特定の挙動の本能に依拠する。例としては、視動眼振試験である（Ｂａｌ
ｋｅｍａ ＧＷら、１９８４，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．
２５：７９５〜８００；Ｍｉｔｃｈｉｎｅｒ ＪＣら、１９７６，Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ
．１６：１１６９〜７１）。

本明細書において例証されるとおり、Ｃｈｏｐ２をコードするＤＮＡでの網膜神経細胞
のトランスフェクションによって、残留網膜神経細胞、主に双極細胞および神経節細胞に
、光感受性の膜チャネルを与える。従って、強力な光刺激を用いて、視覚シグナルを処理
することを担う脳の領域である、動物の視覚皮質に対する視覚刺激の伝達を測定すること
が可能であった；従って、これは、本明細書に示されるとおり、視覚の形成を構成する。
このような視覚は、正常なヒト視覚の形態とは異なり得、そして光の感覚と呼ばれてもよ
く、また「光検出（ｌｉｇｈｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」または「光知覚（ｌｉｇｈｔ
ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）」とも名付けられる。

従って、「視覚（ｖｉｓｉｏｎ）」という用語は本明細書において用いられる場合、生
物体が分化または作用の刺激として光を有用に検出する能力として規定される。視覚とは
、以下を包含するものとする：
１．光の検出または知覚（光が存在しようとしまいと認識する能力）
２．光投影（光刺激がきている方向を認識する能力）；
３．解像力（回折格子または文字標的において種々の明るさレベル（すなわち、コントラ
スト）を検出する能力）；および
４．認識（標的内の種々のコントラストのレベルを参照して視覚標的の形状を認識する能
力）
従って「視覚（ｖｉｓｉｏｎ）」としては、光の存在を単に検出する能力が挙げられる
。これは、本発明に従って処置されている罹患した被験体を訓練して光を検出する可能性
を開き、これによって、個体は彼の環境から離れて応答することが可能になり、ただし相
互作用はそのままであり得る。一例では、シグナルのアレイを生成して、これに対して視
力低下したヒトが応答し得、これによってこの人は、離れて電気的方法によって連絡する
か、または毎日のタスクを行う能力が強化される。さらにこのような人の移動は、「光検
出」から生じる光のこのような新たな検知を用いるように訓練された場合劇的に増強する
。光知覚が完全に欠損すれば、その人は、その人から離れたなんらかの物体について見分
ける方法（聴覚および臭いは別として）がなくなる。

光知覚を生じる本発明の方法によって、完全な正常な視覚なしでさえも、睡眠覚醒サイ
クルおよび関連のモルモンを含む多くの生理学的プロセスを制御する正常に調節されたサ
ーカディアンリズムが改善または可能にされる。残留する網膜神経節細胞（ｒｅｔｉｎａ
ｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ）（ＲＧＣ）を有する数例の盲目の個体は、ＲＧＣメ
ラノプシンを用いてそれらのリズムを媒介し得るが、彼らにとってそうすることは希であ
る。従って、ほとんどの盲目の人は、自由継続の（ｆｒｅｅ−ｒｕｎｎｉｎｇ）サーカデ
ィアンリズムを有する。このような個体がメラノプシン経路を利用する場合でさえ、この
効果は極めて弱い効果である。従って、本発明の方法は、光エントレインメント（ｅｎｔ
ｒａｉｎｍｅｎｔ）をなくさせること、またはそれらのサーカディアンリズムの弱い（メ
ラノプシン媒介性）光エントレインメントを改善することによって、盲目の個体の健康状
態を改善することが期待される。これは被験体の健康増進および幸福につながる。

サーカディアンリズムに加えて、本発明は、他の光誘発性の生理学的現象の欠損を改善
する基礎を提供する。光受容体変性は、個人が寝ていなければいけないサーカディアンサ
イクル（概日周期）における間隔の間の自発運動の種々の程度の陰性のマスキング、また
は抑うつを生じ得る。別の結果は、松果体メラトニンの抑制である。これらの両方がエン
トレインメントプロセスに寄与する。従って、光受容体が変性されているかまたは変性さ
れた被験体におけるこれらの応答または活性の改善は、現実の世界における被験体の環境
に応答する適切な睡眠／覚醒周期に対して、それ自体、視覚とは独立して寄与する。

本発明のさらに別の利点は、瞳孔光反射の正規化である。なぜなら、瞳孔サイズの調節
は、天然のフィードバックループにおける光刺激の有効性を調節することを補助するから
である。従って、本発明は、この天然のフィードバックループの再確立を促進し、本明細
書に記載のように処置される被験体における視覚をより有効にさせる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、Ｃｈｏｐ２をコードするＤＮＡを含む
ベクターを投与する前、および好ましくは後の視覚の測定を包含する。視覚は、当該分野
で周知の任意の多数の方法またはまだ確立されていない方法を用いて測定される。本明細
書で最も好ましいのは、以下の視覚的応答である：
（１）光刺激に対する曝露後の被験体による光検出応答（証拠は、光がつけられる時、被
験体個体による光の一般的な検出における指示または動きの信頼できる応答について追及
される）
（２）光刺激に対する曝露後の被験体による光投射応答（証拠は、光がつけられる時、個
体による光の特異的な検出における指示または動きの信頼できる応答について追及される
）
（３）光対暗のパターン化された視覚刺激の被験体による光解像、これは、以下によって
証明されるとおり、被験体が光対暗のパターン化視覚刺激を解像する能力を測定する：
（ａ）標的のトラッキングを実証する、実証可能な信頼できる、視線運動性に生成さ
れた眼振様の眼の動きおよび／または関連の頭部もしくは身体の動きの存在（上記を参照
のこと）および／または
（ｂ）例えば、指示することまたはバーもしくはボタンを押すことを含む、パターン
視覚刺激を識別し、そして言語的または非言語的手段によるこのような識別を示すための
信頼できる能力の存在；あるいは
（４）回復された網膜から視覚皮質への電気的伝達のエンドポイントである、光フラッ
シュ刺激またはパターン視覚刺激に対する視覚皮質応答の電気的記録。測定は、皮質表面
上の視覚皮質の領域での頭皮表面上における電気的な記録、および／または視覚皮質の細
胞内で記録することによってもよい。

光の知覚のみを有する小児がこの視覚を有するということを評価することはしばしば困
難であることが当該分野で公知である。訓練には、彼らの視覚的感覚に対してこのような
小児が反応するようになる必要がある。このような状況は下で例証される動物研究で模倣
される。本発明の組成物および方法が達成される光の知覚を促進することまたは増強する
ことは、有益である。なぜなら光知覚を有する患者は光を見るように訓練可能なだけでな
く、彼らは、光の視覚方向を検出するように通常は訓練され得、これによって彼らは、彼
らの環境での移動において訓練されることが可能になる。さらに、基礎的な光知覚でさえ
、特定の毎日の作業を達成することをこれらの個体に可能にするために専門的に操作され
た電気的および機械的なデバイスとともに、本発明の組成物および方法を用いて視覚が改
善される個体を含む、視覚的に障害のある個体によって用いられ得る。これを超えて、か
つそれらの条件に依存して、それらは、特徴の認識およびそれらの障害が可能な場合は読
み取りのような解像タスクにおいてさえ訓練されることが可能であり得る。従って、本発
明は、さらなる訓練方法を適用することによって、障害された被験体の視覚をこのような
レベルまで増強し、これらの個体は上記の目標を達成すると期待される。

低感度の視覚は、夜盲症を有するヒトの状態を模倣し得る。その例は、網膜色素変性症
（ＲＰ）であり、その人は、その環境で光レベルを適応することが困難であり、補助照明
および／または暗視装置のような光増幅デバイスを用い得る。

従って、下に記載される動物試験で記載されている視覚回復によって、ヒトに関しては
、その人は視覚機能の下端におかれる。それにもかかわらず、このようなレベルでの配置
は、大きな利点である。なぜなら、これらの個体は、彼らを完全な失明に比べて大きく改
善したレベルの視覚非依存をもたらす運動において、そして可能性として低次の解像タス
クで訓練され得るからである。

本発明の実施例で研究されたマウスには、光受容体の完全な欠失をもたらした；これは
最悪のヒト疾患でさえかなり希である。最も類似のヒトでの状態はＲＰである。ＲＰのほ
とんどの場合、中心視野は、極めて悪くなるまでは保持される。対照的に、研究されたマ
ウスモデルでは、このマウスは出生直後に完全に盲目になる。

視力低下に遭遇した一般的な障害は、Ｊ．ＴａｓｃａおよびＥ．Ａ．Ｄｅｇｌｉｎ、Ｅ
ｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｌｏｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅの第６章，Ｒ．Ｌ
．Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ，編，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｐｕｂｌ．
，１９９９（その全体が参照によって援用される）によって記載される。類似の変性条件
についての引用文献があるが、これらの引用文献は、視覚鋭敏さとして測定可能な形態視
（ｆｏｒｍ ｖｉｓｉｏｎ）を示す。神経節細胞層は、全ての形態のＲＰでは保持されず
、そのため本発明のアプローチは、このような障害については機能しない。

重篤な症例のＲＰを有するヒトに本発明の方法を適用する場合、中心視覚は、ある程度
低レベルである時間維持されるが、末梢の網膜は最初に変性することが予測される。これ
は、本発明を用いる再活性化のための標的である変性網膜である。本質的に、これらの個
体は、彼らが徐々に盲目に達する場合、運動性視力を保持できる。

視覚の中心の「スイートスポット（ｓｗｅｅｔ ｓｐｏｔ）」内に光受容体喪失によっ
て特徴付けられる黄斑変性症を有する被験体（Ｍａｃｕｌａ Ｌｕｔｅａ）は、本発明に
従う処置によって利益を得ることが期待され、この場合、回復された視覚の解像能力は、
ヒト網膜黄斑内のかなり高い神経細胞密度に起因してさらに高いと期待される。

視覚的に障害された個体によって用いられ得る日光および人工的な光の明るい照射は、
本発明の処置の結果として回復された視覚で行われる多くの視覚活性に十分であると期待
される。必要に応じて、罹患した人の視覚感度をさらに増強するために、光増幅デバイス
を用い得ることも可能である。ヒトの視覚系は、１０対数単位範囲を超える輝度で作動し
得る。他方では、微生物型のロドプシン、例えば、ＣｈＲ２は、最大３対数範囲の輝度を
超えて作動する。さらに、患者が遭遇する光条件は、光センサーの作動範囲の外側になり
得る。種々の光条件について補償するために、光の前増幅または減衰デバイスを用いて、
光条件の作動範囲を拡大してもよい。このようなデバイスは、暗視ゴーグルおよび／また
は３Ｄアドベンチャーおよび娯楽システムのような、現在利用可能な技術からアセンブル
され得るカメラ画像処理システム、およびマイクロディスプレイを含む。（例えば、Ｗｏ
ｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂ−ｅｍａｇｉｎ．ｃｏｍ／の以下のＵＲＬを参照のこと）。

本発明は、当該分野で公知の他の形態の視覚治療と組み合わせて用いられ得る。これら
のうち主要なものは、視力補綴物の使用であり、これには、網膜インプラント、皮質イン
プラント、外側膝状核インプラントまたは視神経インプラントが挙げられる。従って、本
発明を用いる生存する網膜神経細胞の遺伝的改変に加えて、処置されている被験体は、分
子方法が使用される前、同時または後に視力補綴物を提供されてもよい。

視力補綴物の有効性は、個人の訓練、従って、本明細書で考慮されるような患者細胞の
Ｃｈｏｐ２形質転換の潜在的な影響を増強することで改善され得る。訓練のアプローチの
例は、参照によって援用される米国特許出願公開第２００４／０２３６３８９号（Ｆｉｎ
ｋら）に見出される。この訓練方法は、参照画像に基づいて視力補綴物を有する患者に対
して非視覚的参照刺激を提供する工程を包含し得る。この非視覚参照刺激とは、患者に対
してその補綴物が誘導する視覚画像の期待値を与えることを意図する。非視覚的参照刺激
の例は、ピンボード、Ｂｒａｉｌｌｅテキスト、または言語的コミュニケーションである
。視力補綴物は、患者の神経細胞であって、その応答性が本明細書に開示されるようなＣ
ｈｐ２を発現することによって改善されている神経細胞を、非視覚的な参照刺激由来の患
者の予測される知覚にマッチする視覚知覚を誘導することを企図する一連の刺激パターン
で刺激する。この患者は、どの一連の刺激パターンが、予想される知覚を最も緊密に模倣
する知覚を誘導するかを示すフィードバックを提供する。この患者フィードバックは、「
適合度機能（ｆｉｔｎｅｓｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」（費用関数またはエネルギー関数と
も呼ばれる）として用いられる。視覚補綴物を通じて患者に提供される引き続く刺激は、
少なくとも一部は、患者の以前のフィードバックに基づき、それに関しては刺激のパター
ンは、予想される知覚に最も適合する知覚を誘導する。引き続く刺激パターンはまた、少
なくとも一部は、適合度関数最適化アルゴリズム、例えば、シミュレーションアニーリン
グアルゴリズムまたは遺伝的アルゴリズムに基づいてもよい。

従って、本発明の特定の実施形態では、被験体における視覚の改善または回復の方法は
さらに、上記されるようなその被験体の訓練を包含する。訓練方法の好ましい例は以下で
ある：
（ａ）被験体を訓練することによって特徴付けられる習慣性訓練であって、（ｉ）光お
よび／もしくはパターン刺激のレベルを変化させること、ならびに／または（ｉｉ）当業
者によって理解されるように共通の光源または物体からの環境的刺激を認識する訓練；な
らびに
（ｂ）視覚的に局所の物体を検出して、訓練なしよりも有効にこれらの物体の間で動く
ようにこの被験体を訓練することによって特徴付けられる方向および運動の訓練。

実際には、視力低下リハビリテーションの分野で代表的に用いられる任意の視覚刺激技
術がここで適用可能である。

光受容体変性によって誘発される内網膜神経細胞の再構築は、光受容体の死滅後の網膜
ベースのレスキューストラテジーについての懸念を惹起させた（Ｓｔｒｅｔｔｏｉ ａｎ
ｄ Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ ２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
．９７：１１０２０〜５；Ｊｏｎｅｓ，ＢＷら、２００３，Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ
４６４：１〜１６；Ｊｏｎｅｓ，ＢＷおよびＭａｒｃ，ＲＥ，２００５，Ｅｘｐ Ｅｙ
ｅ Ｒｅｓ．８１：１２３〜３７；Ｊｏｎｅｓ，ＢＷら、２００５，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ
Ｏｐｔｏｍ．８８：２８２〜９１）。網膜再構築は、光受容体からの求心性入力の喪失で
ある求心路遮断（換言すれば、光誘発性活性の喪失）から生じると考えられる。そのため
、桿体および錐体の死滅後、網膜双極細胞および神経節細胞に対する、そしてそれらを通
じたより高次の視覚中枢への光誘発性入力は存在しない。このような入力の喪失に応答し
て、網膜およびそれらの高次の視覚ネットワークを、他の形態の入力を求める方式で、再
構築を受けるように誘引する。別の言い方をすれば、網膜は、その正常なネットワークを
維持するために光を検知するように用いられる必要があり、光検知の喪失があれば、その
ネットワークは、再構築プロセスを介して悪化する。このプロセスは、光受容体死滅の即
時的な結果ではなく；むしろ、これは緩徐なプロセスであって、介入のための合理的に長
いウインドウを提供する。

従って、本発明に従って、内網膜ニューロンに対する光感度を回復するさらなる有用性
は、網膜における、そして可能性としては、より高次の中心における再構築プロセスの予
防または遅延である。このような網膜再構築は、内網膜網状構造、主に双極と網膜神経節
細胞との間の接続の悪化のような所望されない結果を有し得る。双極細胞または神経節細
胞において光誘発性活性を誘導することによって、本発明は、入力の欠失に起因して再構
築を予防または減少する；本発明の方法は、この欠失入力を誘導し（双極細胞または神経
節細胞のいずれかで開始する）、それによって網膜およびより高次の視覚中枢ネットワー
クを安定化する。従って、視覚に対するその直接の効果とは独立して、本発明は、光受容
体移植またはデバイスインプラントのような他の治療的アプローチのために有益である。

本発明をここで一般に記載してきたが、同じことが、例示の目的で提供され、そして特
定しない限り本発明を限定するとは解釈されない以下の実施例を参照してさらに容易に理
解される。

実施例の概要
（以下の節で引用される引用文献は、最後に列挙して示し得る）
方法
Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰキメラは、発現されたタンパク質がＣｈｏｐ２領域のＣ末端に対し
て連結されたＧＦＰを有するように、チャネルオプシン−２（Ｃｈｏ２）の活性フラグメ
ント（配列番号３）をコードする核酸（配列番号２）に対して、緑色蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）をコードする核酸（下に示されるとおり配列番号１の一部）を連結することによっ
て作成した。これらの配列の両方とも、上記で考察されるような「導入遺伝子（ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｅ）」を構成する。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰのＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの制御
下でＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。

ウイルス構築物（配列番号１）を、ＣＡＧプロモーターを含むＡＡＶ−２ウイルスカセ
ット中にＣｈｏｐ２−ＧＦＰをサブクローニングすることによって作成した。この構築物
のマップは図７に示す。このウイルスベクターを、新生ラットの眼に注射した。Ｃｈｏｐ
２−ＧＦＰの発現は、網膜のホール・マウントまたはスライス切片においてＧＦＰ蛍光に
よって検査した。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの機能は、全細胞のパッチクランプ記録によって評
価した。

結果
明るいＧＦＰ蛍光は、トランスフェクション後にＨＥＫ細胞中で１８〜２４時間内に検
出した。その蛍光は、原形質膜に優先的に位置した。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰキメラの機能の
保存は、パッチクランプ記録によって確認した。かなりの光ゲート電流がまた、内因性の
オール・トランスレチナールの添加なしにＣｈｏｐ２−ＧＦＰ−発現ＨＥＫ細胞で観察さ
れ、このことは、多数の機能的なＣｈｏｐ２−ＧＦＰチャネルが、発色団について内因性
の前駆体のみを用いてＨＥＫ細胞で形成されたということを示している。注射の３〜４ヵ
月後、ＧＦＰ蛍光が、注射された眼の網膜神経細胞で観察された。明るいＧＦＰ蛍光が多
くの神経節細胞および水平細胞、いくつかのアマクリン細胞で、そして時には双極細胞で
、注射後少なくとも１つの１０週間にわたって観察された。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−発現網
膜神経細胞は、光刺激に応答して強固な膜脱分極を示し、そしてオール・トランスレチナ
ールの外因性の供給源は必要としなかった。

従って、本発明者らは、選択されたＡＡＶベクター構築物が、正常なおよび病気の網膜
の両方において硝子体内注射後、網膜神経節細胞を効率的に標的化し、そしてＣｈｏＰ２
−ＧＦＰ ｃＤＮＡを効率的に送達し、そして、高レベルでタンパク質を発現するという
ことを実証した。内因性の網膜がＣｈｏＰに結合される場合、これは光切り換え（ｐｈｏ
ｔｏｓｗｉｔｃｈｅｄ）されてもよく、そして神経活性は、網膜でおよび皮質レベルで誘
発され得る。これは、いくつかの技術によって示された（最初は、個々の解離されたＲＧ
Ｃのインビトロのパッチクランプ記録により、続いて大集団のＲＧＣの代表であるホール
・マウントの網膜調製物の多電極アレイ記録によって）。最終的には、生きた盲目のマウ
ス由来のインビボ皮質記録によって、重要な接続はより高次の視覚中枢に機能的に維持さ
れることが実証された。

結論
進行性のインビトロおよびインビボの結果によって、Ｃｈｏｐ２の異所性発現が、「盲
目の（ｂｌｉｎｄ）」網膜に対する光感受性の回復についての治療ストラテジーであるこ
とが示される。直接光ゲートされた膜チャネルＣｈｏｐ２の機能的な発現を、インビボで
ラットの網膜ニューロンで実証した。従って、第二または第三次の網膜ニューロンにおけ
る光ゲートの膜チャネルの発現は、光受容体生成後の光知覚の回復のための有用なストラ
テジーである。

実施例１
材料および方法
ＤＮＡおよびウイルスベクター構築物
ＣｈｏＰ２のＮ末端フラグメント（Ｍｅｔ^１−Ｌｙｓ^３１５）をコードするＤＮＡフラ
グメントを（Ｎａｇｅｌら、２００３）、Ｃｈｏｐ２コードフラグメントの３’末端でイ
ンフレームに挿入された、ポリアデニル化シグナル（ｍＰ１）およびＧＦＰを含むマウス
プロタミン１遺伝子の最後のエキソンを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）中にクローニングして、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ融合タンパク質を生成した。
Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰキメラの機能は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で確認
した。

ウイルス発現構築物ｒＡＡＶ２−ＣＡＧ−Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−ＷＰＲＥは、Ｃｈｏｐ
２−ＧＦＰフラグメントを、アデノ随伴（血清型２）ウイルス発現カセット中にサブクロ
ーニングすることによって作成した。このウイルスカセットは、ハイブリッドのＣＭＶエ
ンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ウッドチャック転写後調節エ
レメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化配列を含んだ
。ウイルスベクターをパッケージングしてアフィニティー精製した（ＧｅｎｅＤｅｔｅｃ
ｔ）。

ベクターマップを図７に示す。

このベクター（配列番号１）の核酸配列を、下にアノテーション型で示す（記載どおり
のアノテーションを有する）：
・ＩＴＲ’ｓ（両方の末端）（大文字下線）
・ＣＡＧプロモーター配列（小文字、太字、イタリック体）
・Ｋｏｚａｋ配列（小文字二重下線）
・Ｃｈｏｐ２コード配列（小文字、太字）
・緑色蛍光タンパク質コード配列（小文字、下線の太字）
・ＷＰＲＥ（調節性（制御）エレメント）：（大文字）
・ＢＧＨポリＡ配列は印をしていない。

Ｃｈｏｐ２とＧＦＰとの間を含む残りの配列（全て小文字）はベクター配列である

上記のベクター由来のＣｈｏｐ２コード配列を、配列番号２として下に示す。番号付け
は、ヌクレオチド数およびコドン数の両方を示す。コードされたポリペプチド（配列番号
３）も示す。ここでも、これはＣｈｏｐ２ポリペプチドのＮ末端の３１５残基である（配
列番号６）。

Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの全長Ｃｈｏｐ２タンパク質をコードする天然の核酸配列
（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＡＦ４６１３９７）は、以下のヌクレオチド
配列を有する（配列番号４）。このコード配列は、ヌクレオチド２８で始まるＡＴＧコド
ンで開始することに注目のこと。

配列番号４のコード部分は、７３７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする７３７個
の三つ組コドン（プラス終止コドン）として組織化された配列番号５として下に示される
。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終止コドンは強調される。

配列番号３および４によってコードされるＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＧｅｎＢａｎ
ｋアクセッション番号ＡＦ４６１３９７）の全長Ｃｈｏｐ２タンパク質は、以下のアミノ
酸配列、配列番号６を有する：

本発明に有用な別の有用なＣｈｏｐ２配列は、３１０アミノ酸のポリペプチド（全長の
ネイティブなＣｈｏＰ２の生物学的に活性なフラグメント）をコードする９３３ヌクレオ
チド（終止コドンを含む）の核酸であり、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒ
ｄｔｉｉ由来の合成構築物である（ＥＦ４７４０１７およびＺｈａｎｇら，２００７，Ｎ
ａｔｕｒｅ（印刷中）を参照のこと）。この配列は、ヒト発現についてコドン最適化され
る。下に示されるｎｔ配列は配列番号７であり、示されるコードされたアミノ酸配列は、
配列番号８である。アミノ酸配列である配列番号８を有するポリペプチドは、Ｃ末端で短
縮され、３１０でＰｒｏがＡｓｎを置き換えている配列番号６のフラグメントである。

ＡＡＶベクター注射
全ての動物実験は、施設のレベルで行い、そして実験動物の管理と使用についてのＮＩ
Ｈのガイド（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従った。

新生（Ｐ１）ラットの仔犬（Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙおよびＬｏｎｇ−Ｅｖａｎ
ｓ）およびマウスの仔（Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪまたはｒｄｌ／ｒｄｌ）
を氷上で冷却することによって麻酔した。成体マウス（ｒｄｌ／ｒｄｌ）を、ケタミン（
１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射によって麻酔した。
解剖顕微鏡下で、眼瞼を通じてハサミで切開して強膜を露出した。ハリを用いてレンズの
後ろの強膜領域で小さい穿孔（目打ち）を行い、そして０．８〜１５μｌのウイルスベク
ター懸濁液を、１ｍｌあたり約１０^１１ゲノム粒子の濃度で、３２ゲージの先端の丸い（
ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）ハリを有するＨａｍｉｌｔｏｎシリンジでその孔を通して硝子
体内腔に注射した。各々の動物について、通常は１つの眼だけに、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰを
担持するウイルスベクターを注射して、他の眼は、ＧＦＰ単独を担持するコントロールの
ウイルスベクターを注射しないかまたは注射した。注射後、動物を１２／１２時間の明／
暗サイクルに保持した。動物を飼育する部屋の光の照明は、５００ｎｍの波長で測定して
、６．０×１０^１４光子ｃｍ^−２ｓ^−１であった。

組織学
動物をベクター注射後、種々の時点で屠殺した。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ蛍光の発現を、平
坦なホール・マウントの網膜、垂直の網膜の、そして冠状の脳切片で検査した。切開した
網膜および脳を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、それぞれ０．５〜２時
間室温で、そして２４時間４℃で固定した。この固定された網膜（３％アガロースに包埋
）および脳を、ビブラトームを用いることによって切断した。この網膜および脳の切片ま
たは網膜のホール・マウントを、スライド上にマウントして、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ培
地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でカバーした。ＧＦＰ蛍光は、それぞれ
、４６５〜４９５ｎｍ、５０５ｎｍ、および５１５〜５５５ｎｍの励起フィルター、干渉
フィルターおよび放射フィルターを装備した蛍光顕微鏡下で可視化し、そしてほとんどの
画像はデジタルカメラで得た（Ａｘｉｏｃａｍ，Ｚｅｉｓｓ）。いくつかの画像を共焦点
顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２，Ｌｅｉｃａ）で得た。半薄垂直網膜切片の光学顕微鏡のために
、眼を除核して、ＰＢＳ中でリンスして、１％の四酸化オスミウム、２．５％のグルタル
アルデヒドおよび０．２ＭのＳｏｒｅｎｓｏｎのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、４℃
で３時間固定した。次いで眼を段階的エタノールで脱水して、プラスチックに包埋して、
１μｍの切片中に切断して、メチレンブルー／アズール混合物で染色した。

パッチ−クランプ記録
解離した網膜細胞および網膜スライスを、以前に記載のとおり調製した（Ｐａｎ，２０
００およびＣｕｉら、２００３）。ホール・セルの配置中でパッチ電極での記録を、ＥＰ
Ｃ−９増幅器およびＰＵＬＳＥソフトウェア（Ｈｅｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ，Ｌａｍ
ｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。記録は、以下を（ｍＭとして）含むハ
ンクス溶液中で行った：ＮａＣｌ、１３８；ＮａＨＣＯ_３，１；Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３
；ＫＣｌ、５；ＫＨ_２ＰＯ_４、０．３；ＣａＣｌ_２，１．２５；ＭｇＳＯ_４，０．５；Ｍ
ｇＣｌ_２，０．５；ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，５；グルコース，２２．２；フェノールレッ
ドを、０．００１％（ｖ／ｖ）で；ｐＨを７．２に、０．３ＮのＮａＯＨを用いて調節し
た。

電極溶液は以下を（ｍＭとして）含んだ：Ｋ−グルコン酸塩、１３３；ＫＣｌ，７；Ｍ
ｇＣｌ_２，４；ＥＧＴＡ，０．１；ＨＥＰＥＳ，１０；Ｎａ−ＧＴＰ，０．５；およびＮ
ａ−ＡＴＰ，２；ＫＯＨを用いてｐＨを７．４に調節した。電極の抵抗は、１３〜１５Ｍ
Ωであった。記録は、室温で行った（〜２２℃）。

多重電極アレイ記録
多重電極アレイ記録は、ＴｉａｎおよびＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ（２００３）によって報
告された手順に基づいた。要するに、網膜を解剖して、ニトロセルロース濾紙ストリップ
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に光受容体を横倒しに置
いた。マウントした網膜を、２００μｍ離れた３０μｍの直径の電極のＭＥＡ−６０多重
電極アレイ記録チャンバに入れ（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ ＭＣＳ
ＧｍｂＨ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ここでは神経節細胞層が記録電極
に面している。網膜は、全ての実験の間３４℃で酸素化された細胞外溶液中で連続してパ
ルスした。この細胞外溶液は、以下を（ｍＭとして）含んだ：ＮａＣｌ、１２４；ＫＣｌ
、２．５；ＣａＣｌ_２、２；ＭｇＣｌ_２、２；ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２５；ＮａＨＣＯ_３
，２６；およびグルコース，２２（９５％のＯ_２および５％のＣＯ_２でｐＨ７．３５）。
記録は通常、網膜を記録チャンバに入れた後６０分で開始した。各々の光刺激のオンセッ
トの間の間隔は１０〜１５秒であった。シグナルは、２００Ｈｚ（低カットオフ）と２０
ｋＨｚ（高カットオフ）との間でフィルタリングした。個体の神経細胞由来の応答は、Ｏ
ｆｆｌｉｎｅ Ｓｏｒｔｅｒソフトウェア（Ｐｌｅｘｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｄａｌｌａｓ，Ｔ
Ｘ）を用いて分析した。

視覚誘発電位の記録
視覚誘発性電位の記録は、野生型マウスのＣ５７ＢＬ／６および１２９／Ｓｖ株の４〜
６か月齢で、そしてｒｄｌ／ｒｄｌマウスで６〜１１ヵ月齢で行った。記録は、ウイルス
ベクター注射後２〜６か月で行った。

全身麻酔（ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．８ｍｇ／ｋｇ）
のｉ．ｐ．注射）の後、動物を定位固定装置に装着した。体温は、調節しないか、または
加熱パッドおよび直腸プローブを用いて３４℃に維持した。瞳孔は、１％のアトロピンお
よび２．５％のａｃｃｕ−フェニレフリンで拡大させた。正中線から約２．５ｍｍ中心で
、かつラムダ縫合に１ｍｍ吻側の頭がい骨の小部分（〜１．５×１．５ｍｍ）を、穿孔し
て取り出した。記録は、刺激された眼の反対側で皮質の表面の真下０．４ｍｍ進んだガラ
スのマイクロピペット（４ＭのＮａＣｌを充てんした後約０．５Ｍの抵抗）によって、視
覚野から行った（領域Ｖ１）。刺激は０．５Ｈｚで２０ｍｓのパルスであった。応答を増
幅して（１，０００〜１０，０００）、バンドパス（帯域通過）フィルタリングして（０
．３〜１００Ｈｚ）、デジタル化（１ｋＨｚ）して、３０〜２５０のトライアルにわたっ
て平均した。

光刺激
解離した細胞および網膜のスライス記録のために、光刺激を、１５０Ｗのキセノンラン
プベースの走査単色光分光器によって、１０ｎｍ（ＴＩＬＬ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）のバンド幅で生成して、光ファイバーで顕微鏡に伝えた。多重電極アレイ記
録のために、光応答は、単色光分光器または１７５Ｗのキセノンランプベースのイルミネ
ーター（Ｌａｍｂｄａ ＬＳ，Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（４００〜５８０
ｎｍの帯域通過フィルターを備える）によって誘発させ、液体光ガイダー（ｌｉｑｕｉｄ
ｌｉｇｈｔ ｇｕｉｄｅｒ）を通して記録チャンバの底に投射した。視覚誘発電位のた
めに、光刺激を単色光分光器によって生成して、光ファイバーを通して眼に投射した。光
の強度は、中性密度フィルターによって減弱させた。光エネルギーは、薄型センサー（Ｔ
Ｑ８２０１７）および光強度測定器（Ｍｏｄｅｌ：ＴＱ８２１０）（Ａｄｖａｎｔｅｓｔ
，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって測定した。

（実施例２）
インビボにおける網膜神経細胞でのＣｈｏｐ２の発現
Ｃｈｏｐ２タンパク質の発現および局在化を直接可視化するために、Ｃｈｏｐ２チャネ
ルのＣ末端部分を、ＧＦＰで置き換えて、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰキメラを作成した。アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを選択して、網膜神経細胞中へのＣｈｏｐ２−ＧＦＰ融
合タンパク質の発現を標的した。この理由はＡＡＶベクターが、内網膜神経細胞を含む非
分裂細胞へ導入遺伝子を送達し（Ｈａｒｖｅｙ ら、，２００２ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ
ら、２００３）、そして宿主ゲノムへ導入遺伝子を組み込む能力（Ｆｌｏｔｔｅ，２００
４）である。

ウイルス発現カセットであるｒＡＡＶ２−ＣＡＧ−Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−ＷＰＲＥは、
ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーターを含む
ＡＡＶ血清型−２発現カセット中にＣｈｏｐ２−ＧＦＰキメラをサブクローニングするこ
とによって作成した（図１Ａ）。一般には網膜神経細胞におけるＣｈｏｐ２チャネルの発
現および機能を確立するために、本発明者らは、最初に、非ジストロフィー網膜中でＣｈ
ｏｐ２の発現を検査した。このウイルスベクターを出生１日後のラットおよびマウスの眼
の硝子体内腔に注射した。注射の３〜４週後に、明るいＧＦＰ蛍光を全ての注射した眼の
網膜神経細胞で観察し（図１Ｂ〜１Ｈ）、これによってＣｈｏｐ２−ＧＦＰが発現された
ことを確認した。この発現は通常、網膜全体にわたってコンフルエントであった（図１Ｂ
）。

Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−蛍光は主に、網膜神経節細胞で観察された（図１Ｃおよび１Ｄ；
また図１Ｈも参照のこと）。この蛍光シグナルは、内網状層（ＩＰＬ）全体にわたって観
察され（図１Ｈ）、このことは、ウイルスベクターが、ＯＮおよびＯＦＦ神経節細胞の両
方でＣｈｏｐ２−ＧＦＰの発現を標的したことを示している。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの発現
はまた高頻度に、水平細胞（図１Ｅ）、アマクリン細胞（図１Ｆ）、および時には、双極
細胞（図１Ｇ）で観察された。

このＧＦＰシグナルは主に、Ｃｈｏｐ２チャネルの７回膜貫通部分によって膜に固定さ
れているＧＦＰタグと一致して、原形質膜に局在した（図１Ｄ）。一旦細胞中で発現され
れば、ＧＦＰシグナルは、遠位プロセスおよび軸索末端を含む全細胞にわたって広がった
（図１Ｃおよび図１Ｅを参照のこと）。明るいＧＦＰ蛍光は、注射後１２ヶ月以上安定で
あることが見出された（図１Ｈ）が、網膜の形態には大きな変化は注目されなかった（図
１１）。これらの結果によって、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの長期間の安定な発現が、インビボ
において内網膜神経細胞で達成されたことが示された。

実施例３
ＣｈＲ２発現内網膜神経細胞の光誘発性電流の特性
Ｃｈｏｐ２チャネルの機能的な特性を、ホール・セルパッチクランプ記録を用いること
によって内網膜神経細胞で検査した。これらの記録は、光受容体媒介性の光応答が確実に
排除されるように、急性分離した細胞で行った。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ陽性細胞は、ＧＦＰ
蛍光によって特定した（図２Ａ）。Ｃｈｏｐ２発色団、オール・トランスレチナールの前
駆体は、添加されなかった。なぜなら、それは細胞中で普遍的に存在し得るからである（
Ｋｉｍら、１９９２、ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＧａｌ，２００３）。光誘発性の
応答は、全ての記録されたＧＦＰ蛍光細胞で観察され（ｎ＝３４）、このことは、機能的
なＣｈＲ２（発色団が結合したＣｈｏｐ２）は、細胞中に既に存在する網膜発色団を有す
る網膜神経細胞で形成され得る。結果として、機能的なＣｈＲ２ チャネルの発現はまた
、外因性網膜発色団の供給なしに、培養された海馬神経細胞で近年報告されている（Ｂｏ
ｙｄｅｎら、２００５；ただしＬｉら、２００５を参照のこと）。

ＣｈＲ２−媒介性の光応答の特性は最初に、電圧クランプで試験された。光誘発性電流
は、ＣｈＲ２の報告されたピークスペクトル感度と一致して、約４６０ｎｍの最も感受性
の波長を用いて５８０ｎｍの波長まで光刺激によってＣｈｏｐ２−ＧＦＰ発現内網膜神経
細胞で観察された（Ｎａｇｅｌら、２００３）。電流の振幅および動態は、光強度に依存
した（図２Ｃ）。図２Ｄおよび図２Ｅは、拡大時間スケールで、それぞれ光刺激の発生お
よび終わりの直後に電流トレースを示す。検出可能な電流は、ほとんどのげっ歯類細胞に
おいて、２．２×１０^１５光子ｃｍ^−２ｓ^−１の光強度で観察された。いくつかの細胞で
は、電流は、２×１０^１４光子ｃｍ^−２ｓ^−１の光強度で観察された（示さず）。より高
い光強度では、電流は、非融合ＣｈＲ２の特性と同様の一過性および持続的な成分の両方
を示した（Ｎａｇｅｌら、２００３）。光強度とピーク電流との間の関係を図２Ｆに示す
（ｎ＝７）。電流の活性化および不活性化動態はまた、光強度に依存した（図２Ｄ）。電
流の初期段階は、図２Ｄに例示されるように（赤いトレース）、単一の活性化および不活
性化定数を用いる指数関数によってよくフィットされ得る。光強度に対する活性化および
不活性時間定数は、それぞれ図２Ｇおよび２Ｈにプロットされる。他方では、ライト・オ
フ後の電流の非活性化動態は、光強度依存性ではなかった。電流減衰トレースは、図２Ｅ
に示されるような単一指数関数によってよくフィットされ得る（赤いトレース）。時間定
数は１７．１±６．５ｍｓであった（平均±ＳＤ，ｎ＝７）。

次の実験で、ＣｈＲ２−媒介性の電流が膜脱分極を駆動するのに十分であったか否かを
検査した。図３Ａは、４６０ｎｍの波長で４つの間欠的光強度に応答したスパイク非発射
型神経細胞由来の代表的な応答を示す。検出可能な応答が、ほとんどの記録された細胞に
おいて、２．２×１０^１５光子ｃｍ^−２ｓ^−１という光強度で観察された。より高い光強
度では、膜脱分極は飽和レベルに近づいた。反復された光刺激に対するＣｈＲ２−媒介性
の光応答をさらに検査した。電流の過渡的成分は、反復された刺激まで減少したが、電流
の持続成分は、安定であった（図３Ｂの上のトレース）。これは、重ね合わせた第一（赤
いトレース）および第二（黒いトレース）の光誘発性電流を比較することによって図３Ｂ
の右のパネルで拡大時間スケールで明らかにみられた。同じ細胞について、電流クランプ
では、この刺激が、強固な膜脱分極を誘発した（図３Ｂにおける下部のトレース）。膜脱
分極は、応答の最初の部分を除いて、ほとんど同一レベルに達した。これはまた、第一（
赤いトレース）および第二（黒いトレース）の光誘発性応答を重ね合わせた、拡大時間ス
ケール（右パネル）で示された。図３Ｃは、繰り返された光刺激に対するスパイク発射神
経細胞の代表的な記録を示す。ここでも、刺激で、複数のスパイクをともなうほぼ同一の
膜脱分極が誘発された。まとめると、これらの結果によって、第二および第三次の網膜神
経細胞におけるＣｈＲ２媒介性の電流は、膜脱分極および／またはスパイク発射を駆動す
るのに十分であることが実証された。

実施例４
光受容体欠損のｒｄ１／ｒｄ１マウスにおけるＣｈｏｐ２の発現
野性型網膜におけるＣｈＲ２の発現および機能が達成されているが、本発明者らは、Ｃ
ｈＲ２の発現が、光受容体変性後の網膜における光応答を回復し得るか否かに取り組んだ
。この目的を達するために、この実験は、ヒトでの網膜色素変性症のいくつかの形態と同
様である（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９９３）、サイクリックＧＭＯホスホジエステラ
ーゼＰＤＥ６中でヌル変異を有する光受容体変性モデルである、ホモ接合性のｒｄｌ（ｒ
ｄｌ／ｒｄｌ）マウスで（Ｂｏｗｅｓら、１９９０）で行った。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰのウ
イルスベクターを、２〜１２カ月齢で新生（Ｐ１）または成体マウスの眼に硝子体内注射
した。野性型動物で観察された結果と同様、明るいＧＦＰシグナルが、Ｃｈｏｐ２−ＧＦ
Ｐ−注射された網膜で、主に網膜神経節細胞で観察された（図４Ａおよび４Ｂ）。記録実
験の時点で（他に示さない限り４ヶ月以上の年齢）、光受容体細胞は存在しなかった（図
４Ｃ）。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの発現は、１５月齢のｒｄｌ／ｒｄｌマウスから図４Ａで示
された例と同様、ｒｄｌ／ｒｄｌマウスで、１６ヶ月までの年齢（ウイルス注射の３〜６
カ月後）で観察された。これらの結果によって、この光受容体欠損モデルにおける内網膜
神経細胞は、光受容体の完全な死滅後長期生存するだけでなく、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰの安
定な発現の能力を保持していることが示される。

実施例５
ｒｄｌ／ｒｄｌマウスのＣｈＲ２−発現生存内網膜神経細胞の光誘発性応答
ｒｄｌ／ｒｄｌマウスにおけるＣｈＲ２−発現網膜神経細胞の光応答特性を、網膜スラ
イスにおけるホール・セル（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ）パッチクランプ記録によって検査し
た。記録は、神経節細胞層に位置するＧＦＰ陽性の細胞から作成した。光誘発性の電流は
、ＧＦＰ陽性の細胞で観察された。電流の大きさは、ここでも光強度に依存性であった（
図４Ｄおよび４Ｅにおける上のトレース；図４Ｆに示される光強度および電流の関係も参
照のこと）。２群のＣｈＲ２−発現網膜神経細胞が、それらの応答特性に基づいて観察さ
れた：一群の一過性スパイク発射神経細胞（図４Ｄ）および一群の徐放性スパイク発射神
経細胞（図４Ｅ）。膜脱分極および／またはスパイク頻度はまた、光強度に依存した（図
４Ｄおよび４Ｅにおける下部のトレース）。さらに、光は、より高い強度で、拡大時間ス
ケールで第二のトレース（黒）および第四のトレース（赤）を重ね合わせることによって
、図４Ｄおよび図４Ｅの右パネルで図示されるとおり電圧応答の動態を顕著に加速した。
膜脱分極、スパイク発火頻度、および第一スパイクピークまでの時間に対する光強度の関
係を、それぞれ図４Ｇ、４Ｈおよび４Ｉに示す。これらの結果により、ＣｈＲ２の発現を
伴う生存している網膜第三次神経細胞が、膜脱分極および／または作用電圧発火および応
答動態で、光強度をコードし得ることが実証される。

実施例６
ＣｈＲ２−媒介性の網膜活性の多重電極アレイ記録
ｒｄｌ／ｒｄｌマウスの光受容体欠損網膜のスパイクコード能力を、ホール・マウント
網膜由来の多重電極アレイ記録の使用によってＣｈＲ２の発現後に検査した。図５Ａにお
けるサンプル記録から示されるとおり、ライト・オンおよびオフに応答した高速動態での
スパイク発火が、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−発現網膜で観察された（ｎ＝１１、網膜）。光誘
発性スパイク発火は、ＣＮＱＸ（２５〜５０μＭ）プラスＡＰＶ（２５〜５０μＭ）（ｎ
＝３）の適用によって影響されず、このことは、この応答が、記録された細胞のＣｈＲ２
に由来することを示している。このような光誘発性のスパイク発火は、ＧＦＰ単独を担持
するウイルスベクターを注射された（ｎ＝２網膜）か、または注射されていない（ｎ＝３
）網膜で観察された。後者によって、光受容体由来の光応答がないことが確認された。光
誘発性のスパイク発火は、スラミン（１００μＭ）では影響されず（ｎ＝２）、これは、
メラノプシン受容体媒介性の光電流をブロックし得ることが報告されている（Ｍｅｌｙａ
ｎら、２００５およびＱｉｕら、２００５）。

さらに、光のオンおよびオフの両方に対する応答動態（図５Ｂを参照のこと）は、内因
性に光感受性の網膜神経節細胞によって生成される動態（Ｔｕら、２００５）よりもかな
り高速であった。これらの結果によって、本発明者らの記録条件のもとで内因性に光感受
性の神経節細胞から観察された光応答に対する有意な寄与はありそうにないことが示され
た。光誘発性の応答はしばしば、Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰが網膜で広範に発現されたという観
察と一致して、ほとんどの電極によってピックアップされることが見出された（図５Ａを
参照のこと）。応答のかなりの部分が、光刺激の間に維持された。図５Ｂは、３つの漸増
製の光刺激に応答した単一電極によって記録された生のトレースを例示する。記録の単一
神経細胞からソートしたスパイク活性のラスター・プロットを図５Ｃに示した。発火頻度
は、記録の経過の間に極めて安定であった。平均したスパイク頻度ヒストグラムを図５Ｄ
に示す。ここでも、スパイク頻度は、より高い光強度まで増大した。光応答は、５時間ま
で記録され得る。これらの結果、ＣｈＲ２−発現網膜神経節細胞が、スパイク発火頻度で
光強度を容易にコードできることがさらに実証される。

（実施例７）
視覚誘発性電位
ｒｄｌ／ｒｄｌマウスの網膜におけるＣｈＲ２媒介性の光応答が、視覚皮質に伝達され
たか否かを試験するために研究を行なった。ＡＡＶ感染によって達成される網膜神経節細
胞で、ＧＦＰのような導入遺伝子の発現は、脳でのより高次の視覚中心においてそれらの
終わりまで拡大され得ることが報告された（Ｈａｒｖｅｙら、２００２）。従って、Ｃｈ
ｏｐ２−ＧＦＰ−発現網膜神経節細胞の軸索末端の解剖学的突出を最初に検査した。一貫
して、網膜神経節細胞のＣｈｏｐ２−ＧＦＰ標識軸索末端は、外側膝状体腹側核（ｖｅｎ
ｔｒａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）および外側膝状体
背側核（ｄｏｒｓａｌ ｌａｔｅｒａｌ ｇｅｎｉｃｕｌａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）（図
６Ａ）、ならびに上丘（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）（図６Ｂ）を含む脳
のいくつかの領域で観察された。これらの結果によって、変性網膜における網膜神経節細
胞の中央突出が維持されることが示される。

次いで、視覚皮質由来の視覚誘発性電位（ＶＥＰ）を検査した。最初に、図６Ｃで例示
されるとおり、ＶＥＰは、４６０および５８０ｎｍの両方の波長で光刺激に応答して全て
の試験された野性型マウス（４〜６カ月齢）で観察された（ｎ＝６つの眼）。ｒｄｌ／ｒ
ｄｌマウス（６〜１１カ月齢）のＣｈｏｐ２−ＧＦＰ−注射した眼において試験した場合
、ＶＥＰは、ＣｈＲ２チャネルの光感度と一致して（図２Ｂを参照のこと）、４６０ｎｍ
の波長で光刺激に応答してほとんどの眼（１３のうち９つ）で観察されたが、５８０ｎｍ
の波長での光刺激に対しては観察されなかった（図６Ｄ）。４６０ｎｍの波長で光刺激に
応答してＣｈｏｐ２−ＧＦＰ−注射された眼でＶＥＰの平均振幅は１１０±３４μＶ（平
均±ＳＥ；ｎ＝１０）であって、これは、野性型マウスで観察された振幅（２７４±１１
３μＶ；ｎ＝６）より小さいが、これらの２つの値は、有意に異なることはなかった（一
元分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定、ｐ＜０．１）。野性型マウスに比較したＣｈｏｐ２−ト
ランスフェクトマウスにおけるＶＥＰでのより低い振幅は、驚くことではない。なぜなら
、ＣｈＲ２の発現はおそらく、網膜神経節細胞のわずかな部分でのみ達成されたからであ
る。Ｃｈｏｐ２−ＧＦＰ−注射した眼におけるＶＥＰのピークに対する平均潜時は、４５
±１．７ｍｓ（ｎ＝１０）であって、これは、野性型マウスで観察された潜時よりも短い
（６２±２．８ｍｓ；ｎ＝６）。これらの２つの値は、有意に異なった（ｐ＜０．０１）
。後者が予測される。なぜなら、網膜神経節細胞でのＣｈＲ２によって媒介される光応答
は、光受容体の下流の２つのシナプスに由来するからである。コントロールとして、ＧＦ
Ｐ単独（ｎ＝５）を担持するウイルスベクターを注射された年齢のマッチしたｒｄｌ／ｒ
ｄｌマウスの眼で４６０ｎｍの波長での光刺激に対しては、検出可能なＶＥＰは観察され
なかった（図６Ｅ）。さらに、検出可能なＶＥＰは、４２０〜６２０ｎｍにおよぶ波長に
対しては（示さず）、注射されていないｒｄｌ／ｒｄｌマウス（ｎ＝３；５ヶ月齢）では
観察されず、これによって、５ヶ月以上の年齢でのｒｄｌ／ｒｄｌマウスはＶＥＰに基づ
いて完全に盲目であることが確認された。

盲目のｒｄｌ／ｒｄｌマウスにおけるＶＥＰは、それらの網膜で発現されたＣｈＲ２に
由来することをさらに確実にするために、ＶＥＰの作用スペクトルを、それらの正規化さ
れた振幅を変化する光波長および強度に対応してプロットして、この応答の相対感度を得
ることによって測定した（図６Ｆ）（ｎ＝３）。このデータポイントは、約４６０ｎｍで
ＣｈＲ２の報告されたピーク作用スペクトルに対する良好なマッチである（Ｎａｇｅｌら
、２００３）、４６１ｎｍのピーク波長で（図６Ｇ）、ビタミンＡ_１ベースの視物質テン
プレート（ＰａｒｔｒｉｄｇｅおよびＤｅ Ｇｒｉｐ，１９９１）によって十分フィット
された。まとめると、これらの結果によって、光受容体欠損網膜におけるＣｈＲ２の発現
は、脳において視覚誘発された応答を回復し得ることが実証された。

実施例８
実施例１〜７の考察
本明細書に提示される結果によって、ＣｈＲ２の発現に基づいた光受容体欠損げっ歯類
網膜における光応答の回復のストラテジーは、機械的にかつ技術的に実現可能であること
が実証された。最も重要な事には、この結果によって、ＣｈＲ２が、網膜神経細胞におけ
る光センサーとしてその使用についてのいくつかの主な基準を満たすことが示された。第
一に、融合されたＣｈｏｐ２−ＧＦＰを担持するＡＡＶベクターの送達によって、本発明
者らは、網膜神経細胞がＣｈｏＰ２の長期の発現に耐容する能力を示した。今まで、Ｃｈ
ｏｐ２−ＧＦＰタンパク質の発現は、１２ヶ月間の非ジストロフィーラットの神経細胞で
、そして光受容体欠損ｒｄｌ／ｒｄｌマウスで６ヶ月間インビボにおいてウイルス注射後
に達成されている。従って、本発明の結果によって、網膜神経細胞におけるＣｈＲ２の発
現が、正常な光周期条件下で生体適合性であることが示される。

第二に、これらの結果によって、十分な数のＣｈＲ２が、網膜神経細胞で形成され得、
ここで内因性の発色団のみが、標準的な食餌によって供給され、強固な網膜脱分極および
／または作用電位発火を網膜において、そしてＶＥＰを視覚皮質において生じ得る。ここ
で、１１−ｃｉｓからａｌｌ−トランスレチナールへの光異性化後に、それらの発色団を
急速に失う動物の視物質とは異なり（Ｗａｌｄ，１９６８）、微生物型ロドプシンについ
て、オール・トランス（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ）から１１−ｃｉｓレチナールへの光異性化
は可逆性であって、両方の異性体がタンパク質に結合したままであるということが価値の
あることである（Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ，１９９８）。一旦、ＣｈＲ２複合体が形成され
れば、光感受性チャネルは、同じ発色団部分での光異性化の複数のサイクルを保持し得る
。新規なＣｈＲ２形成の有効性は、発色団の有効性に依存することが期待され得るが、新
規なＣｈＲ２を形成するための発色団の一定の再供給の必要性は、全体的なＣｈＲ２機能
に対する限界を課すとは思われない。多重電極アレイ記録において観察されるとおり、Ｃ
ｈＲ２は、活性の喪失なしにインビトロで数時間光刺激に対して反復して応答する。従っ
て、これらの結果によって、ＣｈＲ２の代謝回転速度は、人工的に生成される光センサー
としての使用にさらなる利点である、かなり遅いということが示される。

さらに、もともとは細胞発現系（Ｎａｇｅｌら、２００３）において、後には海馬神経
細胞において（Ｂｏｙｄｅｎら、２００５，Ｉｓｈｉｚｕｋａら、２００６およびＬｉら
、２００５）報告され、そして今では網膜神経細胞において示されているとおり、ＣｈＲ
２チャネルの多数の特性が光センサーとしてのその使用について極めて有利である。

最初に、ＣｈＲ２チャネルは、ニューロン膜興奮性の背景にある陽イオンに透過性であ
る。従って、光によるＣｈＲ２チャネルの活性化は、膜脱分極を直接生成して内網膜神経
細胞のＯＮ応答を模倣し得る。実際、本明細書に示されるとおり、スパイク非発射型およ
びスパイク発射型の網膜神経細胞においてＣｈＲ２によって媒介される光誘発性の応答は
、ＯＮ双極細胞および維持されたＯＮ−神経節細胞の光応答を顕著に模倣した（Ｗｅｒｂ
ｌｉｎおよびＤｏｗｌｉｎｇ，１９６９、ならびにＫａｎｅｋｏ，１９７０）。

第二に、光に応答する電流の活性化動態は、極めて速いが、電流の維持された成分は、
連続的または反復した光照射に対して明らかな不活性化を示さない。従って、ＣｈＲ２−
発現神経細胞は、急速な動態を伴うが、色素不活性化を伴わずにシグナル伝達し得る。結
果として、ＣｈＲ２の発現は、高い時間分解能を有する神経興奮性の光学的制御を可能に
することが示されている（Ｂｏｙｄｅｎら、２００５，Ｉｓｈｉｚｕｋａら、２００６お
よびＬｉら、２００５）。さらに、光誘発性電流の大きさおよび活性化の動態は、３−対
数−単位の範囲にわたって光照射量に依存するということがここで示されている。ホール
・セルおよび多重電極アレイ記録において実証されるとおり、これによって、段階的な膜
脱分極および／またはスパイク頻度での種々の光強度のコード化が可能になる。

また、光受容体変性後の網膜における光感度回復のストラテジーの実現可能性について
の重要性のうち、この研究の結果によって、多くの内網膜神経細胞が高齢のｒｄｌ／ｒｄ
ｌマウス（最大１６ヶ月齢まで）で生存しており、そして全ての光受容体の死滅後長くＣ
ｈＲ２を発現し得るということが示される。これは、このマウスモデルにおいて、いくつ
かの再構築にかかわらず、多くの内網膜神経細胞が生存するということを示す組織学的研
究と一致する（Ｊｉｍｅｎｅｚら、１９９６，Ｓｔｒｅｔｔｏｉ ａｎｄ Ｐｉｇｎａｔ
ｅｌｌｉ，２０００、およびＣｈａｎｇら、２００２）。さらに、ＣｈＲ２を用いる本発
明によって、生存している内網膜神経細胞が、膜脱分極および／または作用電位発火で、
光シグナルをコードし、そして視覚シグナルを視覚皮質に対して伝達するそれらの生理学
的な能力を保持することが示された。従って、ＣｈＲ２の発現に基づくストラテジーは、
特定の段階での特定の網膜変性疾患について少なくとも適切である。

光受容体変性によって誘発される内網膜神経細胞の再構築は、光受容体の死滅後に網膜
ベースのレスキューストラテジーについてのいくつかの懸念を惹起した（Ｓｔｒｅｔｔｏ
ｉおよびＰｉｇｎａｔｅｌｌｉ，２０００，Ｊｏｎｅｓら、２００３、ならびにＪｏｎｅ
ｓおよびＭａｒｃ，２００５）。しかし、網膜変性疾患は、種々の細胞タイプの変性、生
存および機能的状態の時間経過に関して異種である（Ｃｈａｎｇら、２００２）。ＣｈＲ
２の使用は、このような研究を引き受けるための強力なツールである。

網膜再構築は、求心路遮断によって生じると考えられる（ＪｏｎｅｓおよびＭａｒｃ，
２００５）。従って、内網膜神経細胞における光感度の回復は、再構築プロセスを予防ま
たは遅延することが可能であり得る。

最終的に本発明によれば、ウイルスベースの遺伝子送達系、例えば、ＡＡＶベクター（
Ｆｌａｎｎｅｒｙら、１９９７，Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９９，Ａｌｉら、２０００およ
びＡｃｌａｎｄら、２００１）は、本明細書において実証されるような網膜神経細胞中に
Ｃｈｏｐ２を導入するためのツールである。

本発明の結果、ＡＡＶ血清型２およびＣＡＧプロモーターを有するウイルス構築物は、
神経節細胞におけるＣｈｏｐ２の強固な発現を達成したことが示された。しかし、この構
築物でのＣｈｏｐ２の発現は、ＯＮおよびＯＦＦ型の両方の神経節細胞を標的すると考え
られるので、ＯＮ−およびＯＦＦ−の両方の神経節細胞のＯＮ型への変換が視覚知覚にど
のように影響するかを決定すべきことが依然として残される。

霊長類の行動研究によって、網膜中のＯＮチャネルの薬理学的遮断が、光減衰の検出お
よび形状の知覚のような視覚機能を重篤に障害しないということが報告された（Ｓｃｈｉ
ｌｌｅｒら、１９８６）。従って、ＯＮチャネルに対する、例えば、ＯＮ型神経節細胞に
対するＣｈＲ２の標的は、有用な視覚を生じると期待される。

双極細胞のような、より遠位の網膜神経細胞においてＣｈＲ２を発現することも本明細
書で考察される；このアプローチは、変性網膜の残留するシグナル処理機能を利用する。
桿体双極細胞に対してＣｈＲ２を標的化することは、特に魅力的である。なぜなら、桿体
双極細胞の脱分極は、錐体双極細胞および網膜神経節細胞のレベルでＯＮおよびＯＦＦ応
答をもたらし得（Ｗａｓｓｌｅ，２００４）、それによって、網膜中で固有のＯＮおよび
ＯＦＦチャネルを維持するからである。

ＣｈＲ２発現網膜における応答を産生するために必要な閾値光強度は、１０^１４〜１０
^１５光子ｃｍ^−２ｓ^−１に近いと考えられる。比較として、正常な桿体および錐体光受容
体についての閾値は、それぞれ、約１０^６および１０^１０光子ｃｍ^−２ｓ^−１である（Ｄ
ａｃｅｙら、２００５）。従って、ＣｈＲ２−発現網膜は、実質的に高い光子範囲で作動
する。正常な網膜に比較してＣｈＲ２発現網膜の比較的低い光感度は、多数の因子に起因
し得る。第一に、桿体および錐体における視物質と比較したトランスフェクトされた網膜
神経細胞におけるＣｈＲ２分子の低横断面密度が存在し得る。第二に、ＣｈＲ２−発現内
網膜神経細胞は、固有の多層光受容体膜組織化を、代表的には桿体および錐体の外節につ
いて欠き、これがより高い色素密度を達成するように発達し、これによって光子捕獲の確
率を増大する（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇら，１９８０）。第三に、増幅カスケードを通じてそ
れらのシグナルを伝達する視物質とは異なり（Ｓｔｒｙｅｒ，１９９１）、直接の光ゲー
トのＣｈＲ２チャネルは、このような増幅能力を欠く。最終的に、正常な網膜では、視覚
シグナルの増幅は、シグナルが複数の光受容体から神経節細胞を覆うにつれて生じる（Ｂ
ａｒｌｏｗら、１９７１）。このプロセスは、ＣｈＲ２−トランスフェクトされた網膜で
はまだ達成されていなかった。これらの要因のどれが、ＣｈＲ２発現網膜の減少した光感
度に最も寄与するかということはまだ明らかでない。興味深いことに、ＣｈＲ２は、緑藻
における低強度の光に対する走光性を媒介した（Ｓｉｎｅｓｈｃｈｅｋｏｖら、２００２
；ただしＫａｔｅｒｉｙａら、［２００４］を参照のこと）。従って、網膜神経細胞にお
けるＣｈＲ２の光感度は、異種発現のためにＣｈｏｐ２分子に導入された改変によって変
更されていてもよい。このような相違はまた、藻類および哺乳動物細胞の種々の構造的ま
たは機能的組織化に影響し得る。

それにもかかわらず、臨床使用については、光増感デバイスが、光作動範囲を拡大する
ために用いられ得る。

現在では、光受容体細胞が一旦失われれば、視覚回復に利用可能な処置はない。上記で
注記されるとおり、正常な光受容体細胞または前駆体細胞の移植（Ｂｏｋ，１９９３およ
びＬｕｎｄら、２００１）または網膜インプラントを介する生存する第二および第三次の
網膜神経細胞の直接の電気的刺激（Ｚｒｅｎｎｅｒ，２００２）は、桿体および錐体の変
性後の網膜における光応答の回復についての可能なストラテジーとして提唱されている。
本発明の重要な利点とは、網膜への組織またはデバイスの導入には関与せず、従って免疫
反応および生体不適合性の合併症を大部分回避し得るということである。さらに、本発明
のアプローチは、回復された「視覚」についての高い空間分解能を達成することが期待さ
れる。なぜなら、このアプローチは、細胞レベルを標的するからである。従って、生存し
ている網膜神経細胞における、ＣｈＲ２のような微生物型チャネルロドプシンの発現は、
桿体および錐体の変性によって生じる完全な盲目の処置についてのストラテジーである。

実施例の節に引用された参考文献

学術論文または要約、公開もしくは対応する米国特許もしくは外国特許出願、発効され
た米国特許もしくは外国特許、または任意の他の引用文献を含む、本明細書において引用
される全ての参考文献は、本明細書において参照によって全体が援用されており、これに
は、この引用された参考文献に提示される全てのデータ、表、図およびテキストを包含す
る。さらに、本明細書に引用される引用文献内に引用される参考文献の全内容がまた全体
として参照によって援用される。

公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法または従来の方法に対する言及は、本発
明の任意の局面、説明または実施形態が関連の当該分野で開示され、教示されまたは示唆
されるということを承認するものでは決してない。

特定の実施形態の前述の説明は、当該分野の技術の範囲内の知識（本明細書に引用され
る参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験なしに、本発明の一般的
概念から逸脱することなく、特定の実施形態のような種々の適用について、他者が容易に
改変および／または適応し得るという本発明の一般的な性質を従って完全に明らかにする
。従って、このような適応および改変は、本明細書に提示される教示およびガイダンスに
基づいて、開示された実施形態の意味および等価物の範囲内であるものとする。本明細書
における表現または用語法は、説明の目的であって限定はせず、その結果、本発明の明細
書のこの用語法または表現は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に提示される教示
およびガイダンスの観点から当業者によって解釈されるべきである。

Claims (1)

1. 明細書に記載された方法。

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