JP2016121190A - ロドプシン拡散のインビボ送達による視覚応答の回復 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、National Institute of Healthの助成金(EY12180、EY−04068、EY16087、EY17130およびEY11522)による助成金によって、一部資金援助された。このことにより、米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
分子生物学および医薬の分野における本発明は、光受容体変性網膜において内網膜神経細胞を光感受性細胞へ変換し、それによって視覚認知および視覚の種々の局面を回復する、ライト・ゲートの(light−gated)陽イオン選択性膜チャネル、チャネルロドプシン−2(Chop2)のような、微生物型のロドプシンの使用に関する。
視覚は通常、光受容体とも呼ばれる桿体および錐体が光シグナルを電気的シグナルに変換し、次いでこれが第二および第三次の網膜神経細胞および視神経を通じて外側膝状核に、次いで視覚皮質にリレーされ、ここで視覚画像が形成されるとき、始まる(Baylor,D,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:560〜565;Wassle,H,2004,Nat.Rev.Neurosci.5:747〜57)。光受容体の消失に起因する視覚障害の患者については、視覚認知は、特定の障害の性質に依存してこれらの顆粒の神経位置の1つで電気的刺激を提供することによって誘発され得る。
本発明は、網膜における、生きている光非感受性内網膜神経細胞(ここでは光受容体は変性されているかまたは既に死滅している)の、直接の光感受性神経細胞への遺伝的変換に関しており、これによってこのような網膜に対して光感受性が与えられ、このような変性に罹患している被験体に対する視覚応答および機能的視覚の1つ以上の局面が回復される。疾患に起因する、この能力を欠く網膜に対する光感受性の回復によって、本発明は、視覚に必要である最も基礎的な光応答の機構を提供する。別の言い方をすれば、本発明は、網膜光受容体細胞の損失を補償するために、通常「光センサー(light sensors)」を有さない網膜神経細胞にそれらの「光センサー」を導入する。
(a)神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシンまたは光駆動性のイオンポンプロドプシンをコードする核酸発現ベクターであって、ロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに作動可能に連結された、プロモーター配列、および必要に応じて転写調節配列を含むベクターを網膜神経細胞に送達する工程と;
(b)この神経細胞中でベクターを発現させ、これによって光感度を回復する工程と、を包含する。
(a)この被験体の網膜に対して、この神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシンまたは光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸ベクターを送達する工程であって、このベクターはロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに対して作動可能に連結された、プロモーター配列および、必要に応じて、転写調節配列を含む工程と、
(b)この神経細胞中でこのベクターを発現する工程であって、このロドプシンの発現がこの神経細胞を光感受性にさせ、これによってこの網膜に対する光感受性の回復がされる工程と、を包含する。
(i)光刺激に対する露出後の上記被験体による光検出応答
(ii)光刺激に対する露出後の上記被験体による光投射応答;
(iii)光対暗のパターン化視覚刺激の被験体による光分解能;
(iv)光フラッシュ刺激因子またはパターンの視覚刺激に対する視覚皮質中の応答の電気的記録。
(a)(i)光刺激および/もしくはパターン刺激のレベルを変更すること、ならびに/または(ii)共通の光源もしくは対象物由来の環境的刺激、を認識するように被験体を訓練することによって特徴付けられる習慣性訓練と;
(b)視覚的に局所の物体を検出し、かつ訓練なしよりも有効にとりわけこの物体を動かすためにこの被験体を訓練することによって特徴付けられる方向付けおよび移動度の訓練、
のうちの1つ以上によって達成される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
網膜に対する光感受性を回復する方法であって:
(a)網膜神経細胞に対して、該神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシンまたは光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸発現ベクターを送達する工程であって、
該ベクターは該ロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに対して作動可能に連結されたプロモーター配列、および必要に応じて転写調節配列を含む工程と、
(b)該神経細胞中で該ベクターを発現する工程と、
を包含し、
これによって、光感受性を回復する、方法。
(項目2)
上記ロドプシンが、配列番号6を有するチャネルロドプシン−2(Chop2)、またはその生物学的に活性なフラグメント、好ましくは配列番号3、またはその保存的なアミノ酸置換改変体である、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記ベクターがrAAVウイルスベクターである、項目1に記載の方法。
(項目4)
上記プロモーターが構成的プロモーターである、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記構成的なプロモーターが、ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβアクチンプロモーター(CAG)である、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記プロモーターがハイブリッドCAGである、項目2に記載の方法。
(項目7)
上記構成的なプロモーターがCMVプロモーターである、項目4に記載の方法。
(項目8)
上記プロモーターが誘導性プロモーターおよび/または細胞型特異的プロモーターである、項目1に記載の方法。
(項目9)
上記細胞型特異的プロモーターが、mGluR6プロモーター、Pcp2(L7)プロモーターまたはニューロキニン−3(NK−3)プロモーターからなる群より選択される、項目8に記載の方法。
(項目10)
上記プロモーターが、mGlu6プロモーターであり、かつプロモーター配列の配列番号7の一部である、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記ベクターが、ハイブリッドCMVエンハンサー/ニワトリβ−アクチン(CAG)プロモーター、ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)、およびヒトまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を備える、項目1に記載の方法。
(項目12)
上記ベクターが、CAGプロモーター、ウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)、およびヒトまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を備える、項目2に記載の方法。
(項目13)
上記網膜神経細胞が、ON型およびOFF型の網膜神経節細胞、網膜桿状体双極細胞、AIIアマクリン細胞ならびにONおよびOFFの網膜錐体双極細胞から選択される、項目1に記載の方法。
(項目14)
上記ベクターが、ON型神経節細胞および/またはON型双極細胞に対して標的され、かつそこで発現される、項目13に記載の方法。
(項目15)
上記ベクターが、mGluR6プロモーターを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記mGluR6プロモーターが、プロモーター配列の配列番号7の一部である、項目15に記載の方法。
(項目17)
上記プロモーターがNK−3プロモーターであり、かつ上記ベクターがOFFの錐体双極細胞に標的される、項目9に記載の方法。
(項目18)
網膜の光受容体細胞が変性されているか、または変性されかつ死滅された、失明または盲目に罹患している被験体の網膜神経細胞に対する光感受性を回復する方法であって:
(a)該被験体の網膜に対して、該神経細胞中で発現可能な光ゲートチャネルロドプシンまたは光駆動性イオンポンプロドプシンをコードする核酸ベクターを送達する工程であって、
該ベクターはロドプシンをコードするオープンリーディングフレーム、およびそれに対して作動可能に連結されたプロモーター配列、および必要に応じて転写調節配列を含む工程と、
(b)該神経細胞中で該ベクターを発現する工程と、
を包含し、
該ロドプシンの発現が該神経細胞を光感受性にさせ、これによって該網膜に対する光感受性の回復がされる、方法。
(項目19)
上記ロドプシンが、Chop2、またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその保存的なアミノ酸置換改変体である、項目18に記載の方法。
(項目20)
上記ベクターがrAAVウイルスベクターである、項目18に記載の方法。
(項目21)
上記プロモーターが構成的プロモーターである、項目18に記載の方法。
(項目22)
上記構成的なプロモーターが、ハイブリッドCAGプロモーターである、項目21に記載の方法。
(項目23)
上記プロモーターがハイブリッドCAGプロモーターである、項目19に記載の方法。
(項目24)
上記構成的なプロモーターがCMVプロモーターである、項目21に記載の方法。
(項目25)
上記プロモーターが誘導性プロモーターまたは細胞型特異的プロモーターである、項目18に記載の方法。
(項目26)
上記細胞型特異的プロモーターが、mGluR6プロモーター、Pcp2(L7)プロモーターまたはニューロキニン−3(NK−3)プロモーターからなる群より選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
上記プロモーターが、mGlu6プロモーターであり、かつプロモーター配列の配列番号7の一部である、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記網膜神経細胞が、ON型の網膜神経節細胞、OFF型の網膜神経節細胞、網膜桿状体双極細胞、AIIアマクリン細胞、ON型網膜錐体双極細胞またはOFF型網膜錐体双極細胞である、項目18に記載の方法。
(項目29)
上記ベクターが、ON型神経節細胞および/またはON型双極細胞に対して標的され、かつそこで発現される、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記ベクターが、mGluR6プロモーターを含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
上記mGluR6プロモーターが、プロモーター配列の配列番号7の一部である、項目30に記載の方法。
(項目32)
上記プロモーターがNK−3プロモーターであり、かつ上記ベクターがOFFの錐体双極細胞に標的される、項目26に記載の方法。
(項目33)
上記光感受性の回復が、上記被験体における視覚の回復を生じる、項目18〜32のいずれかに記載の方法。
(項目34)
上記視覚が、以下の方法:
(i)光刺激に対する露出後の上記被験体による光検出応答
(ii)光刺激に対する露出後の上記被験体による光投射応答;
(iii)光対暗のパターン化視覚刺激の被験体による光分解能;
(iv)光フラッシュ刺激因子またはパターンの視覚刺激に対する視覚皮質の応答の電気的記録、
の1つ以上によって測定される、項目33に記載の方法。
(項目35)
上記失明または盲目が、変性疾患の結果である、項目18〜34のいずれかに記載の方法。
(項目36)
上記疾患が、網膜色素変性症または加齢性黄斑変性症である、項目35に記載の方法。
(項目37)
上記被験体がまた、上記ベクターの送達の前、同時、または後に視力補綴物を提供される、項目18〜34のいずれかに記載の方法。
(項目38)
上記視力補綴物が、網膜インプラント、皮質インプラント、外側膝状核インプラント、または視覚神経インプラントである、項目37に記載の方法。
(項目39)
上記被験体の視覚応答が、1つ以上の視覚刺激を用いる処置に供される、項目18〜34のいずれかに記載の方法。
(項目40)
上記被験体の視覚応答が、1つ以上の視覚刺激を用いる訓練に供される、項目38に記載の方法。
(項目41)
上記訓練が、以下の方法:
(a)(i)変動するレベルの光刺激および/もしくはパターン刺激、ならびに/または(ii)共通の光源もしくは対象物由来の環境的刺激、を認識するように被験体を訓練することによって特徴付けられる習慣性訓練と;
(b)視覚的に局所の物体を検出し、かつ訓練なしよりも有効にとりわけ該対象物を動かすために該被験体を訓練することによって特徴付けられる方向付けおよび移動度の訓練、
のうちの1つ以上によって達成される、項目39または40に記載の方法。
本発明は、ヒト、他の哺乳動物または他の動物被験体での眼の障害を処置するための方法を提供する。詳細には、眼の障害は、網膜色素上皮細胞または光受容体細胞における変異遺伝子または遺伝子欠損を含む障害である。本発明の方法は、眼の細胞における遺伝子の産生の発現を指向するプロモーター配列に作動可能に連結されるか、またはそのプロモーター配列の制御下にある眼の細胞に特異的な正常遺伝子をコードする核酸配列を担持する、組み換えウイルスの有効量の硝子体内または網膜下注射によるこの被験体への投与の工程を包含し、そして変異された遺伝子または欠失された遺伝子の発現の欠失または不正確な発現を置き換える。
本発明の方法が考慮され、かつ視覚の1つ以上のパラメーターを改善するために用いられ得る眼科の障害としては、限定はしないが、眼の前部および後部の両方に影響する発達性の異常が挙げられる。前眼部障害としては、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円錐角膜が挙げられる。後眼部障害としては、光受容体の機能不全によって生じる盲目障害、および/または網膜のジストロフィーおよび変性によって生じる死が挙げられる。網膜の障害としては、先天性定常夜盲症、加齢性黄斑変性症、先天性錐体ジストロフィー、および大グループの網膜色素変性症(RP)−関連障害が挙げられる。これらの障害としては、種々の年齢で生じる網膜における光受容体細胞、桿体および錐体の遺伝子的に死滅しやすい傾向が挙げられる。とりわけ、重篤な網膜症、例えば、年齢とともに進行し、小児期および青年期早期に盲目を生じるRP自体のサブタイプ、ならびにRP関連の疾患、例えば、LCAの遺伝的サブタイプ(人生の初年度程度の早期に小児期に視覚喪失を高頻度に生じる)である。後者の障害は、光受容体細胞、桿体および錐体の重篤な減少、およびしばしば完全な喪失によって遺伝的に特徴付けられる。(Trabulsi,EI,編,Genetic Diseases of the Eye,Oxford University Press,NY,1998)。
本発明の種々の実施形態によれば、種々の公知の核酸ベクター、例えば、組み換えウイルス、例えば、組み換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)、組み換えアデノウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えポックスウイルス、および当該分野で公知の他のウイルス、ならびにプラスミド、コスミドおよびファージなどをこれらの方法で用いてもよい。当該分野で周知の多くの刊行物は、遺伝子の送達のための種々のこのようなベクターの使用を考察している。例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,最終版;Kay,MA.ら、2001,Nat.Med.,7:33〜40;およびWalther Wら、2000,Drugs 60:249〜71を参照のこと)。
アデノ随伴ウイルスは、小型の一本鎖DNAウイルスであって、効率的な複製のためにヘルパーウイルスを要する(Berns,KI,Parvoviridae:the viruses and their replication,p.1007〜1041(第2巻),Fields,BNら、Fundamental Virology,第3版,(Lippincott−Raven Publishers,Philadelphia(1995))。AAVの4.7kbのゲノムは、2つの逆方向末端反復(ITR)、ならびにそれぞれRepタンパク質およびCapタンパク質をコードする2つのオープンリーディングフレーム(ORF)を有する。Repリーディングフレームは、分子量78、68、52および40kDaの4つのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は主に、AAV複製を調節すること、ならびにAAVのレスキューおよび宿主細胞染色体への組み込みに機能する。Capのリーディングフレームは、分子量85(VP1)、72(VP2)および61(VP3)kDaの3つの構造的タンパク質をコードし、これらのタンパク質がビリオンカプシドを形成する(Berns,前出)。VP3は、総AAVビリオンタンパク質の80%より多くを含む。
本明細書において用いる場合、AAV配列は代表的には、rAAVビリオン中にパッケージングされるrAAV構築物(例えば、ミニ遺伝子またはカセット)の形態である。最小限、rAAVミニ遺伝子は、AAV ITRおよび宿主細胞への送達のための異種核酸分子によって形成される。最も適切には、ミニ遺伝子は、異種配列に対して5’および3’側に配置されたITRを含む。しかし、直列に、例えば、5’〜3’またはヘッド・ツー・テールに配置された、または別の構成の5’ITRおよび3’ITRの配列を含むミニ遺伝子も所望され得る。他の実施形態は、複数のコピーのITRを有するミニ遺伝子、または5’ITR(または反対には3’ITR)が異種配列に対して5’および3’の両方に位置しているものを包含する。ITR配列は、異種配列のすぐ上流および/または下流に位置してもよい;介在性配列が存在してもよい。ITRはAAV5由来であってもよいし、または任意の他のAAV血清型由来であってもよい。ミニ遺伝子は、1血清型由来の5’ITRおよび別の血清型由来の3’ITRを含み得る。
最も好ましい実施形態では、この異種配列は、導入遺伝子として機能する核酸分子である。本明細書において用いる場合、「導入遺伝子(transgene)」という用語は、AAV配列に対して異種であり、かつ所望の産物、好ましくはChop2、ならびに宿主細胞中でこの核酸の転写および/または翻訳を指向または調整して、コードされた産物のこのような細胞中での発現を可能にする調節配列をコードする核酸配列をいう。好ましいポリペプチド産物とは、眼に、詳細には網膜神経細胞に送達され得る産物である。
本発明のミニ遺伝子または導入遺伝子は、コード配列またはORFに対して作動可能に連結された適切な配列を含み、標的された宿主細胞でその発現を促進する。「作動可能に連結された(operably linked)」配列としては、コード配列と接触しているプロモーターのような発現制御配列、およびポリペプチド産物の発現をトランスでまたは遠位で制御するように作用する発現制御配列の両方が挙げられる。
本発明に用いられるrAAVは、本明細書に記載される材料および方法、ならびに当該分野で周知の材料および方法を用いて構築および生成され得る。本発明の任意の構築物を生成するために好ましい方法は、構成的および誘導性の遺伝子操作、組み換え操作、および合成的技術、例えば、上記で引用される引用文献に示されるものである。
Chop2導入遺伝子および上記されるような標的眼細胞における使用のための細胞特異的プロモーターを含むrAAVは、従来の方法を用いて混入について評価され、そして例えば、網膜下注射による投与のための滅菌または無菌の薬学的組成物中に処方されるべきである。
本発明の種々のパラメーターを評価するためのインビトロおよびインビボの両方の研究を用いてもよく、これには、失明するヒトの眼科障害の認識された動物モデルを含む。ヒト網膜症、例えば、小児失明の大きい動物モデルが有用である。本明細書に提供される実施例によって、この方法が網膜疾患の範囲を処置するのに同様に用いられ得るということを当業者は容易に予想できるようになる。
1.光の検出または知覚(光が存在しようとしまいと認識する能力)
2.光投影(光刺激がきている方向を認識する能力);
3.解像力(回折格子または文字標的において種々の明るさレベル(すなわち、コントラスト)を検出する能力);および
4.認識(標的内の種々のコントラストのレベルを参照して視覚標的の形状を認識する能力)
従って「視覚(vision)」としては、光の存在を単に検出する能力が挙げられる。これは、本発明に従って処置されている罹患した被験体を訓練して光を検出する可能性を開き、これによって、個体は彼の環境から離れて応答することが可能になり、ただし相互作用はそのままであり得る。一例では、シグナルのアレイを生成して、これに対して視力低下したヒトが応答し得、これによってこの人は、離れて電気的方法によって連絡するか、または毎日のタスクを行う能力が強化される。さらにこのような人の移動は、「光検出」から生じる光のこのような新たな検知を用いるように訓練された場合劇的に増強する。光知覚が完全に欠損すれば、その人は、その人から離れたなんらかの物体について見分ける方法(聴覚および臭いは別として)がなくなる。
(1)光刺激に対する曝露後の被験体による光検出応答(証拠は、光がつけられる時、被験体個体による光の一般的な検出における指示または動きの信頼できる応答について追及される)
(2)光刺激に対する曝露後の被験体による光投射応答(証拠は、光がつけられる時、個体による光の特異的な検出における指示または動きの信頼できる応答について追及される)
(3)光対暗のパターン化された視覚刺激の被験体による光解像、これは、以下によって証明されるとおり、被験体が光対暗のパターン化視覚刺激を解像する能力を測定する:
(a)標的のトラッキングを実証する、実証可能な信頼できる、視線運動性に生成された眼振様の眼の動きおよび/または関連の頭部もしくは身体の動きの存在(上記を参照のこと)および/または
(b)例えば、指示することまたはバーもしくはボタンを押すことを含む、パターン視覚刺激を識別し、そして言語的または非言語的手段によるこのような識別を示すための信頼できる能力の存在;あるいは
(4)回復された網膜から視覚皮質への電気的伝達のエンドポイントである、光フラッシュ刺激またはパターン視覚刺激に対する視覚皮質応答の電気的記録。測定は、皮質表面上の視覚皮質の領域での頭皮表面上における電気的な記録、および/または視覚皮質の細胞内で記録することによってもよい。
(a)被験体を訓練することによって特徴付けられる習慣性訓練であって、(i)光および/もしくはパターン刺激のレベルを変化させること、ならびに/または(ii)当業者によって理解されるように共通の光源または物体からの環境的刺激を認識する訓練;ならびに
(b)視覚的に局所の物体を検出して、訓練なしよりも有効にこれらの物体の間で動くようにこの被験体を訓練することによって特徴付けられる方向および運動の訓練。
(以下の節で引用される引用文献は、最後に列挙して示し得る)
方法
Chop2−GFPキメラは、発現されたタンパク質がChop2領域のC末端に対して連結されたGFPを有するように、チャネルオプシン−2(Cho2)の活性フラグメント(配列番号3)をコードする核酸(配列番号2)に対して、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする核酸(下に示されるとおり配列番号1の一部)を連結することによって作成した。これらの配列の両方とも、上記で考察されるような「導入遺伝子(transgene)」を構成する。Chop2−GFPのDNAを、CMVプロモーターの制御下でHEK293細胞中にトランスフェクトした。
明るいGFP蛍光は、トランスフェクション後にHEK細胞中で18〜24時間内に検出した。その蛍光は、原形質膜に優先的に位置した。Chop2−GFPキメラの機能の保存は、パッチクランプ記録によって確認した。かなりの光ゲート電流がまた、内因性のオール・トランスレチナールの添加なしにChop2−GFP−発現HEK細胞で観察され、このことは、多数の機能的なChop2−GFPチャネルが、発色団について内因性の前駆体のみを用いてHEK細胞で形成されたということを示している。注射の3〜4ヵ月後、GFP蛍光が、注射された眼の網膜神経細胞で観察された。明るいGFP蛍光が多くの神経節細胞および水平細胞、いくつかのアマクリン細胞で、そして時には双極細胞で、注射後少なくとも1つの10週間にわたって観察された。Chop2−GFP−発現網膜神経細胞は、光刺激に応答して強固な膜脱分極を示し、そしてオール・トランスレチナールの外因性の供給源は必要としなかった。
進行性のインビトロおよびインビボの結果によって、Chop2の異所性発現が、「盲目の(blind)」網膜に対する光感受性の回復についての治療ストラテジーであることが示される。直接光ゲートされた膜チャネルChop2の機能的な発現を、インビボでラットの網膜ニューロンで実証した。従って、第二または第三次の網膜ニューロンにおける光ゲートの膜チャネルの発現は、光受容体生成後の光知覚の回復のための有用なストラテジーである。
材料および方法
DNAおよびウイルスベクター構築物
ChoP2のN末端フラグメント(Met1−Lys315)をコードするDNAフラグメントを(Nagelら、2003)、Chop2コードフラグメントの3’末端でインフレームに挿入された、ポリアデニル化シグナル(mP1)およびGFPを含むマウスプロタミン1遺伝子の最後のエキソンを含むpBluescriptベクター(Stratagene)中にクローニングして、Chop2−GFP融合タンパク質を生成した。Chop2−GFPキメラの機能は、トランスフェクトされたHEK293細胞中で確認した。
・ITR’s(両方の末端)(大文字下線)
・CAGプロモーター配列(小文字、太字、イタリック体)
・Kozak配列(小文字二重下線)
・Chop2コード配列(小文字、太字)
・緑色蛍光タンパク質コード配列(小文字、下線の太字)
・WPRE(調節性(制御)エレメント):(大文字)
・BGHポリA配列は印をしていない。
全ての動物実験は、施設のレベルで行い、そして実験動物の管理と使用についてのNIHのガイド(NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals)に従った。
動物をベクター注射後、種々の時点で屠殺した。Chop2−GFP蛍光の発現を、平坦なホール・マウントの網膜、垂直の網膜の、そして冠状の脳切片で検査した。切開した網膜および脳を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いて、それぞれ0.5〜2時間室温で、そして24時間4℃で固定した。この固定された網膜(3%アガロースに包埋)および脳を、ビブラトームを用いることによって切断した。この網膜および脳の切片または網膜のホール・マウントを、スライド上にマウントして、Vectashield培地(Vector Laboratories)でカバーした。GFP蛍光は、それぞれ、465〜495nm、505nm、および515〜555nmの励起フィルター、干渉フィルターおよび放射フィルターを装備した蛍光顕微鏡下で可視化し、そしてほとんどの画像はデジタルカメラで得た(Axiocam,Zeiss)。いくつかの画像を共焦点顕微鏡(TCS SP2,Leica)で得た。半薄垂直網膜切片の光学顕微鏡のために、眼を除核して、PBS中でリンスして、1%の四酸化オスミウム、2.5%のグルタルアルデヒドおよび0.2MのSorensonのリン酸緩衝液(pH7.4)中で、4℃で3時間固定した。次いで眼を段階的エタノールで脱水して、プラスチックに包埋して、1μmの切片中に切断して、メチレンブルー/アズール混合物で染色した。
解離した網膜細胞および網膜スライスを、以前に記載のとおり調製した(Pan,2000およびCuiら、2003)。ホール・セルの配置中でパッチ電極での記録を、EPC−9増幅器およびPULSEソフトウェア(Heka Electronik,Lambrecht,Germany)によって行った。記録は、以下を(mMとして)含むハンクス溶液中で行った:NaCl、138;NaHCO3,1;Na2HPO4、0.3;KCl、5;KH2PO4、0.3;CaCl2,1.25;MgSO4,0.5;MgCl2,0.5;HEPES−NaOH,5;グルコース,22.2;フェノールレッドを、0.001%(v/v)で;pHを7.2に、0.3NのNaOHを用いて調節した。
多重電極アレイ記録は、TianおよびCopenhagen(2003)によって報告された手順に基づいた。要するに、網膜を解剖して、ニトロセルロース濾紙ストリップ(Millipore Corp.,Bedford,MA)上に光受容体を横倒しに置いた。マウントした網膜を、200μm離れた30μmの直径の電極のMEA−60多重電極アレイ記録チャンバに入れ(Multi Channel System MCS GmbH,Reutlingen,Germany)、ここでは神経節細胞層が記録電極に面している。網膜は、全ての実験の間34℃で酸素化された細胞外溶液中で連続してパルスした。この細胞外溶液は、以下を(mMとして)含んだ:NaCl、124;KCl、2.5;CaCl2、2;MgCl2、2;NaH2PO4、1.25;NaHCO3,26;およびグルコース,22(95%のO2および5%のCO2でpH7.35)。記録は通常、網膜を記録チャンバに入れた後60分で開始した。各々の光刺激のオンセットの間の間隔は10〜15秒であった。シグナルは、200Hz(低カットオフ)と20kHz(高カットオフ)との間でフィルタリングした。個体の神経細胞由来の応答は、Offline Sorterソフトウェア(Plexon,Inc.,Dallas,TX)を用いて分析した。
視覚誘発性電位の記録は、野生型マウスのC57BL/6および129/Sv株の4〜6か月齢で、そしてrdl/rdlマウスで6〜11ヵ月齢で行った。記録は、ウイルスベクター注射後2〜6か月で行った。
解離した細胞および網膜のスライス記録のために、光刺激を、150Wのキセノンランプベースの走査単色光分光器によって、10nm(TILL Photonics,Germany)のバンド幅で生成して、光ファイバーで顕微鏡に伝えた。多重電極アレイ記録のために、光応答は、単色光分光器または175Wのキセノンランプベースのイルミネーター(Lambda LS,Sutter Instrument)(400〜580nmの帯域通過フィルターを備える)によって誘発させ、液体光ガイダー(liquid light guider)を通して記録チャンバの底に投射した。視覚誘発電位のために、光刺激を単色光分光器によって生成して、光ファイバーを通して眼に投射した。光の強度は、中性密度フィルターによって減弱させた。光エネルギーは、薄型センサー(TQ82017)および光強度測定器(Model:TQ8210)(Advantest,Tokyo,Japan)によって測定した。
インビボにおける網膜神経細胞でのChop2の発現
Chop2タンパク質の発現および局在化を直接可視化するために、Chop2チャネルのC末端部分を、GFPで置き換えて、Chop2−GFPキメラを作成した。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを選択して、網膜神経細胞中へのChop2−GFP融合タンパク質の発現を標的した。この理由はAAVベクターが、内網膜神経細胞を含む非分裂細胞へ導入遺伝子を送達し(Harvey ら、,2002 and Martinら、2003)、そして宿主ゲノムへ導入遺伝子を組み込む能力(Flotte,2004)である。
ChR2発現内網膜神経細胞の光誘発性電流の特性
Chop2チャネルの機能的な特性を、ホール・セルパッチクランプ記録を用いることによって内網膜神経細胞で検査した。これらの記録は、光受容体媒介性の光応答が確実に排除されるように、急性分離した細胞で行った。Chop2−GFP陽性細胞は、GFP蛍光によって特定した(図2A)。Chop2発色団、オール・トランスレチナールの前駆体は、添加されなかった。なぜなら、それは細胞中で普遍的に存在し得るからである(Kimら、1992、ならびにThompsonおよびGal,2003)。光誘発性の応答は、全ての記録されたGFP蛍光細胞で観察され(n=34)、このことは、機能的なChR2(発色団が結合したChop2)は、細胞中に既に存在する網膜発色団を有する網膜神経細胞で形成され得る。結果として、機能的なChR2 チャネルの発現はまた、外因性網膜発色団の供給なしに、培養された海馬神経細胞で近年報告されている(Boydenら、2005;ただしLiら、2005を参照のこと)。
光受容体欠損のrd1/rd1マウスにおけるChop2の発現
野性型網膜におけるChR2の発現および機能が達成されているが、本発明者らは、ChR2の発現が、光受容体変性後の網膜における光応答を回復し得るか否かに取り組んだ。この目的を達するために、この実験は、ヒトでの網膜色素変性症のいくつかの形態と同様である(McLaughlinら、1993)、サイクリックGMOホスホジエステラーゼPDE6中でヌル変異を有する光受容体変性モデルである、ホモ接合性のrdl(rdl/rdl)マウスで(Bowesら、1990)で行った。Chop2−GFPのウイルスベクターを、2〜12カ月齢で新生(P1)または成体マウスの眼に硝子体内注射した。野性型動物で観察された結果と同様、明るいGFPシグナルが、Chop2−GFP−注射された網膜で、主に網膜神経節細胞で観察された(図4Aおよび4B)。記録実験の時点で(他に示さない限り4ヶ月以上の年齢)、光受容体細胞は存在しなかった(図4C)。Chop2−GFPの発現は、15月齢のrdl/rdlマウスから図4Aで示された例と同様、rdl/rdlマウスで、16ヶ月までの年齢(ウイルス注射の3〜6カ月後)で観察された。これらの結果によって、この光受容体欠損モデルにおける内網膜神経細胞は、光受容体の完全な死滅後長期生存するだけでなく、Chop2−GFPの安定な発現の能力を保持していることが示される。
rdl/rdlマウスのChR2−発現生存内網膜神経細胞の光誘発性応答
rdl/rdlマウスにおけるChR2−発現網膜神経細胞の光応答特性を、網膜スライスにおけるホール・セル(whole−cell)パッチクランプ記録によって検査した。記録は、神経節細胞層に位置するGFP陽性の細胞から作成した。光誘発性の電流は、GFP陽性の細胞で観察された。電流の大きさは、ここでも光強度に依存性であった(図4Dおよび4Eにおける上のトレース;図4Fに示される光強度および電流の関係も参照のこと)。2群のChR2−発現網膜神経細胞が、それらの応答特性に基づいて観察された:一群の一過性スパイク発射神経細胞(図4D)および一群の徐放性スパイク発射神経細胞(図4E)。膜脱分極および/またはスパイク頻度はまた、光強度に依存した(図4Dおよび4Eにおける下部のトレース)。さらに、光は、より高い強度で、拡大時間スケールで第二のトレース(黒)および第四のトレース(赤)を重ね合わせることによって、図4Dおよび図4Eの右パネルで図示されるとおり電圧応答の動態を顕著に加速した。膜脱分極、スパイク発火頻度、および第一スパイクピークまでの時間に対する光強度の関係を、それぞれ図4G、4Hおよび4Iに示す。これらの結果により、ChR2の発現を伴う生存している網膜第三次神経細胞が、膜脱分極および/または作用電圧発火および応答動態で、光強度をコードし得ることが実証される。
ChR2−媒介性の網膜活性の多重電極アレイ記録
rdl/rdlマウスの光受容体欠損網膜のスパイクコード能力を、ホール・マウント網膜由来の多重電極アレイ記録の使用によってChR2の発現後に検査した。図5Aにおけるサンプル記録から示されるとおり、ライト・オンおよびオフに応答した高速動態でのスパイク発火が、Chop2−GFP−発現網膜で観察された(n=11、網膜)。光誘発性スパイク発火は、CNQX(25〜50μM)プラスAPV(25〜50μM)(n=3)の適用によって影響されず、このことは、この応答が、記録された細胞のChR2に由来することを示している。このような光誘発性のスパイク発火は、GFP単独を担持するウイルスベクターを注射された(n=2網膜)か、または注射されていない(n=3)網膜で観察された。後者によって、光受容体由来の光応答がないことが確認された。光誘発性のスパイク発火は、スラミン(100μM)では影響されず(n=2)、これは、メラノプシン受容体媒介性の光電流をブロックし得ることが報告されている(Melyanら、2005およびQiuら、2005)。
視覚誘発性電位
rdl/rdlマウスの網膜におけるChR2媒介性の光応答が、視覚皮質に伝達されたか否かを試験するために研究を行なった。AAV感染によって達成される網膜神経節細胞で、GFPのような導入遺伝子の発現は、脳でのより高次の視覚中心においてそれらの終わりまで拡大され得ることが報告された(Harveyら、2002)。従って、Chop2−GFP−発現網膜神経節細胞の軸索末端の解剖学的突出を最初に検査した。一貫して、網膜神経節細胞のChop2−GFP標識軸索末端は、外側膝状体腹側核(ventral lateral geniculate nucleus)および外側膝状体背側核(dorsal lateral geniculate nucleus)(図6A)、ならびに上丘(superior colliculus)(図6B)を含む脳のいくつかの領域で観察された。これらの結果によって、変性網膜における網膜神経節細胞の中央突出が維持されることが示される。
実施例1〜7の考察
本明細書に提示される結果によって、ChR2の発現に基づいた光受容体欠損げっ歯類網膜における光応答の回復のストラテジーは、機械的にかつ技術的に実現可能であることが実証された。最も重要な事には、この結果によって、ChR2が、網膜神経細胞における光センサーとしてその使用についてのいくつかの主な基準を満たすことが示された。第一に、融合されたChop2−GFPを担持するAAVベクターの送達によって、本発明者らは、網膜神経細胞がChoP2の長期の発現に耐容する能力を示した。今まで、Chop2−GFPタンパク質の発現は、12ヶ月間の非ジストロフィーラットの神経細胞で、そして光受容体欠損rdl/rdlマウスで6ヶ月間インビボにおいてウイルス注射後に達成されている。従って、本発明の結果によって、網膜神経細胞におけるChR2の発現が、正常な光周期条件下で生体適合性であることが示される。
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- 本願明細書に記載された発明。
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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