JP2002538789A - 新規なヒトカリクレイン−様遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸分子、そのような核酸分子によりコードされるカリクレイン−様タンパク質、およびタンパク質および核酸分子の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の属する技術分野】

（技術分野） 発明の分野 本発明は、核酸分子、そのような核酸分子によりコードされるタンパク質；な
らびにタンパク質および核酸分子の使用に関する。 発明の背景 カリクレインおよびカリクレイン−様タンパク質は、セリンプロテアーゼ酵素
族のサブグループであり、そして高度な基質特異性を表す（１）。これらのカリ
クレインの生物学的役割は、特異的ポリペプチド前駆体（基質）を選択的開裂し
て強力な生物活性を有するペプチドを放出することである（２）。マウスおよび
ラットでは、カリクレインは大きな多重遺伝子族によりコードされている。マウ
スのゲノムでは、少なくとも２４の遺伝子が同定された（３）。これらの遺伝子
の１１の発現が確認された；残りは偽遺伝子であると思われる（４）。同じ族の
１５〜２０のカリクレインがラットのゲノムで見いだされ（５）、ここで少なく
ともこれらのうちの４つが発現することが知られている（６）。 ３つのヒトのカリクレイン遺伝子、すなわち前立腺特異的抗原（ＰＳＡまたは
ＫＬＫ３）（７）、ヒトの腺のカリクレイン（ＫＬＫ２）（８）および組織（膵
臓−腎臓）カリクレイン（ＫＬＫ１）（９）が記載された。ＰＳＡ遺伝子は公開
された５．８ｋｂの配列に広がり（７）；ＫＬＫ２遺伝子は５．２ｋｂのサイズ
を有し、そしてその完全な構造も解明された（８）。ＫＬＫ１遺伝子は約４．５
ｋｂ長であり、そしてこの遺伝子のエキソン配列およびエキソン／イントロン結
合が決定された（９）。 マウスのカリクレイン遺伝子は染色体７に最高１１遺伝子の群でクラスターを
形成し、そして種々のクラスター中の遺伝子間の距離は、わずか３〜７Ｋｂであ
り得る（３）。すべての３つのヒトのカリクレイン遺伝子は、染色体１９ｑ１３
．２〜１９ｑ１３．４に割り当てられ、そしてＰＳＡとＫＬＫ２との間の距離は
１２Ｋｂであると予想された（９）。 マウスとヒトのカリクレインの間の主な差異は、ヒトのカリクレインの２つ（
ＫＬＫ２およびＫＬＫ３）は前立腺でほとんど排他的に発現されるのに対し、動
物ではいずれのカリクレインもこの器官に局在しない。ヒトのカリクレイン遺伝
子族の他の新たな員の候補には、プロテアーゼＭ（１０）（ザイム（Ｚｙｍｅ）
（１１）またはニューロシン（ｎｅｕｒｏｓｉｎ）（１２）および正常上皮細胞
−特異的遺伝子−１（ＮＥＳ１）とも言われている）（１３）を含む。両遺伝子
は染色体１９ｑ１３．３（１０、１４）に割り当てられ、そして他のセリンプロ
テアーゼおよびカリクレイン遺伝子族との構造的相同性を表す（１０〜１４）。 発明の要約 ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ザイムおよびＮＥＳ１遺伝子の相対的なゲノムの位置を正
しく定める試みでは、ヒトの染色体１９（１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４お）上の
およそ３００Ｋｂの連続する配列に広がる領域を調査した。本発明者は既知のカ
リクレイン遺伝子の相対的位置を同定することができ、そしてさらに彼らはヒト
のカリクレイン族の既知の員との位置的な近さ、および構造的類似性の両方を現
す他のカリクレイン−様遺伝子を同定した。新規遺伝子は、現在知られているカ
リクレイン族の員と相同性を現し、そして同じゲノム領域に同時に局在している
（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）。これらの新規遺伝子はすでに知られているカリ
クレインと同様に、胸部、精巣および前立腺を含む種々のガンに用途を有する。 本明細書に記載するカリクレイン−様タンパク質は、個々に「ＫＬＫ−Ｌ１、
ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６
」と呼び、そして集合的に「カリクレイン−様タンパク質」または「ＫＬＫ−Ｌ
タンパク質」と呼ぶ。タンパク質をコードする遺伝子は、「ｋｌｋ−ｌ１、ｋｌ
ｋ−ｌ２、ｋｌｋ−ｌ３、ｋｌｋ−ｌ４、ｋｌｋ−ｌ５またはｋｌｋ−ｌ６」呼
び、そして集合的に「カリクレイン−様遺伝子」または「ｋｌｋ−ｌ遺伝子」と
呼ぶ。 広く述べると本発明は、 （ｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、６
０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３
、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６のアミノ酸配列と実質的な配
列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列； （ｉｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、
６０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ
３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６のアミノ酸配列を含んで成
るタンパク質をコードする核酸配列； （ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列； （ｉｖ）（ｉ）の核酸配列の縮重形； （ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列に緊縮条件下でハイブリダ
イズすることができる核酸配列； （ｖｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、
６０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ
３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌのアミノ酸配列を含んで成る
タンパク質の切頭形、同族体、対立遺伝的または種の変異をコードする核酸配列
； （ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
的もしくは種の変異、 を含んで成る単離された核酸分子に関する。 好ましくは本発明の精製され、そして単離された核酸分子は； （ｉ）ＴがＵであることもできる配列番号１、１３、２１、４３、５６または６
５の配列を含んで成る核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的、好ましくは配列番号１、１３、２１、４３、５６また
は６５の完全な核酸配列に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸、そして好ましくは少なくとも１８ヌク
レオチドを有する核酸に、緊縮条件下でハイブリダイズすることができる核酸；
あるいは （ｉｖ）遺伝暗号の縮重により、コドン配列において（ｉ）〜（ｉｉｉ）の核酸
とは異なる核酸分子、 を含んで成る。 本発明は、ＫＬＫ−Ｌタンパク質の切頭形、ＫＬＫ−Ｌタンパク質の同族体ま
たは相同体あるいはそれらの切頭形（ＫＬＫ−Ｌタンパク質およびＫＬＫ−Ｌタ
ンパク質の切頭形、同族体および相同体も本明細書では集合的に「ＫＬＫ−Ｌ関
連タンパク質」と呼ぶ）をコードする配列を含んで成る核酸分子も意図する。 本発明の核酸分子は、適当な発現ベクター、すなわち挿入するコード配列の転
写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。したがって
、宿主細胞の形質転換に適合する組換え発現ベクターを構築することができ、こ
れは本発明の核酸分子および核酸分子に連結した１以上の転写および翻訳要素を
含んで成る。 組換え発現ベクターは、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を発現する形質転換した宿
主細胞を調製するために使用することができる。したがって本発明はさらに、本
発明の組換え分子を含む宿主細胞を提供する。また本発明は生殖細胞および体細
胞が、特にＫＬＫ−Ｌタンパク質またはＫＬＫ−Ｌタンパク質の切頭形をコード
する本発明の核酸分子を含んで成る組換え分子を含むトランスジェニック非ヒト
哺乳動物も意図する。 さらに本発明は、本発明の精製され、そして単離された核酸分子を使用してＫ
ＬＫ−Ｌ関連タンパク質を調製するための方法を提供する。１態様では、ＫＬＫ
−Ｌ関連タンパク質を調製する方法が提供され、この方法は（ａ）本発明の組換
え発現ベクターを宿主細胞に移し；（ｂ）形質転換していない宿主細胞から形質
転換した宿主細胞を選択し；（ｃ）選択した形質転換した宿主細胞を、ＫＬＫ−
Ｌ関連タンパク質の発現を可能とする条件下で培養し；そして（ｄ）ＫＬＫ−Ｌ
関連タンパク質を単離することを含んで成る。 本発明はさらに広く、配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７
、５８、５９、６０、６６または６７に示すアミノ酸配列を含んで成る単離され
たＫＬＫ−Ｌタンパク質を意図する。 本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質は、融合タンパク質を調製するためにタン
パク質のような他の分子と連結することができる。これは例えばＮ−末端または
Ｃ−末端融合タンパク質の合成により達成することができる。 さらに本発明は、本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質のエピトープに対する特
異性を有する抗体を意図する。抗体は検出可能な物質で標識し、そして組織およ
び細胞中で本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。 また本発明は、本発明の核酸分子および／または本発明のタンパク質に対して
独自なヌクレオチドプローブの構築を可能とする。したがって本発明はまた、本
発明の核酸配列、または本発明のタンパク質またはそれらの部分をコードする核
酸配列を含んで成るプローブに関する。このプローブは、例えば検出可能な物質
により標識することができ、そして本発明のタンパク質の１以上の特性を現すタ
ンパク質をコードする核酸分子を含む本発明の核酸分子を、ヌクレオチド配列の
混合物から選択するために使用することができる。 さらに本発明は本発明のタンパク質に結合する物質を同定する方法を提供し、
この方法は、物質とタンパク質との間の複合体の形成を可能とする条件下でタン
パク質と潜在的に結合することができる少なくとも１つの物質をタンパク質と反
応させ、そして結合を検出することを含んで成る。結合は複合体を、遊離物質を
、または非複合化タンパク質をアッセイすることにより検出することができる。
本発明はまた、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と相互作用する他の細胞内タンパク質
に結合する物質を同定する方法も意図する。方法はＫＬＫ−Ｌ遺伝子調節配列（
例えばプロモーター配列）に結合する化合物を同定するために使用することがで
きる。 さらに本発明は、化合物が本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の生物学的活性
をモジュレートする能力を評価する方法を提供する。例えばタンパク質とタンパ
ク質に結合する物質との相互作用を阻害または強化する物質を評価することがで
きる。１態様では、この方法は既知の濃度のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を、タン
パク質に結合する物質および試験化合物に、物質とタンパク質との間の複合体の
形成を可能とする条件下で提供し、そして複合体を取り出し、かつ／または検出
することを含んで成る。 本発明のタンパク質の生物学的活性をモジュレートする化合物は、化合物の存
在下および不存在下で、組織および細胞中の本発明のタンパク質の発現パターン
およびレベルを比較することにより、本発明の方法を使用して同定することもで
きる。 本発明のタンパク質、本発明の方法を使用して同定される物質および化合物、
および本発明のペプチドは、本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の生物学的活性
をモジュレートするために使用することができ、そしてそれらはガン（例えば胸
部、精巣および前立腺ガン）のような状態の処置に使用することができる。した
がって、物質および化合物はガンに罹患している個体に投与するための組成物に
製剤することができる。 したがって本発明は、１以上の本発明のタンパク質、本発明のペプチドまたは
本発明の方法を使用して同定された物質または化合物、および医薬的に許容され
得るキャリアー、賦形剤または希釈剤を含んで成る組成物にも関する。ガンを処
置または予防する方法も提供され、この方法は必要な患者に本発明のＫＬＫ−Ｌ
関連タンパク質または本発明の組成物を投与することを含んで成る。 本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるだ
ろう。しかしこの詳細な記載から当業者には様々な変化および修飾が本発明の精
神および範囲内で明らかとなるので、本発明の好適な態様を示す詳細な記載およ
び具体的な実施例は説明を目的とするだけであると理解されるべきである。 （本発明の詳細な説明） 本発明に従えば当業界の専門家の知識の範囲内で通常の分子生物学、微生物学
および組み替えＤＮＡ技術が使用される。このような技術は例えば次のような文
献に詳細に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｐｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻、（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ
編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｏｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．
Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ、 Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）
；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｎｅｙ編、（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉ
ｌａｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１
９８６）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｖｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔ
ｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）．１．本発明の核酸分子 上記のように、本発明によれば、ＫＬＫ−Ｌタンパク質をコードする連鎖をも
つ単離された核酸分子が提供される。「単離された」という言葉は、組み替えＤ
ＮＡ技術で製造される場合には細胞材料または培地の媒質を、また化学合成によ
って製造する場合には化学反応原料または他の化学物質を実質的に含まない核酸
を意味する。また「単離された」核酸はその核酸が誘導された核酸を自然に迂回
する（ｆｌａｎｋ）連鎖（即ち該核酸分子の５’および３’末端にある連鎖）を
含んでいない。「核酸」という言葉はＤＮＡおよびＲＮＡを含むものとし、二重
基準または単一基準のいずれであることもできる。一具体化例においては、核酸
分子は、配列番号２，３，１４，２２，２３，４４，４５，５７，５８，５９，
６０，６６または６７に示されるアミノ酸連鎖を含むＫＬＫ−Ｌタンパク質をコ
ードしており、好ましくは配列番号１，１３，２１、４３、５６、または６５に
示される核酸配列を含む核酸分子である。 本発明は配列番号２，３，１４，２２，２３，４４，４５，５７，５８，５９
，６０，６６または６７に示されるアミノ酸配列を含むＫＬＫ−Ｌタンパク質を
コードする核酸に相補的な核酸配列、好ましくは配列番号１，１３，２１、４３
、５６、または６５にに示される完全な核酸配列に相補的な核酸配列を含んでい
る。 本発明は、本発明の核酸配列に対し実質的な配列の同一性または相同性を有す
る核酸分子、或いは配列番号２，３，１４，２２，２３，４４，４５，５７，５
８，５９，６０，６６または６７に示されるアミノ酸配列に対し実質的な同一性
または類似性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含んでいる。好ましく
はこれらの核酸分子は実質的な配列の同一性、例えば少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
または８５％の核酸の同一性をもち、さらに好ましくは９０％の核酸の同一性を
有し、尤も好ましくは少なくとも８５％、９６％、９７％、９８％または９９％
の配列の同一性をもっている。当業界に公知であり本明細書で使用される「同一
性」という言葉は、二つまたはそれ以上のアミノ酸配列の間の関係、或いは二つ
またはそれ以上の核酸配列の間の関係を意味し、該配列を比較することによって
決定される。またこの言葉は、その場合に応じアミノ酸または核酸の間において
このような配列の連鎖を合致させることによって決定される配列の関係の程度を
意味する。同一性および類似性という言葉は当業界の専門家には良く知られた言
葉であり、通常の方法によって計算することができる（例えばＣｏｍｕｔａｔｉ
ｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘ
ｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；
Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ
Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅ
ｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｂｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｍｅｒ，
Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ＣａｒｉｌｌｏＨ．ａｎｄ
Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８巻、１
０７３頁（１９８８））。配列の間で最も大きな合致が得られるように工夫され
た方法が一般に好適である。同一性および類似性を決定する方法は次のような公
開されたコンピュータプログラムに中に体系化されている：ＧＣＧプログラムパ
ッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ １２（１）：３８７，１９８４；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦ
ＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５
，４０３〜４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩまたは他
の所から公開されている（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．等
、ＮＣＢＩ ＮＬＨ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｔｓｃ
ｈｕｌ，Ｓ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）
。 ＫＬＫ−Ｌタンパク質をコードする単離された核酸で遺伝子コードの縮重のた
めに本発明の核酸配列とは異なった配列をもつものも本発明の範囲内に入る。こ
のような核酸は機能的に同等なタンパク質（例えばＫＬＫ Ｌタンパク質）をコ
ードするが、遺伝子コードの縮重のためにＫＬＫ−Ｌタンパク質とは配列が異な
っている。一例としてＫＬＫ−Ｌタンパク質のヌクレオチド配列内部のＤＮＡ配
列の多形性のためにアミノ酸の配列には影響を与えないサイレント突然変異が生
じる。自然に起こる対立遺伝子の変異のために或る集団内部の個体の間で一つま
たはそれ以上のヌクレオチドの変動は起こり得る。このような任意のまたはすべ
ての核酸の変動は本発明の範囲内に入るものとする。ＤＮＡ配列の多形はＫＬＫ
−Ｌタンパク質のアミノ酸配列を変化させることもできる。このようなアミノ酸
の多形もまた本発明の範囲内に入るものとする。 本発明の他の態様によれば、緊縮な条件下において、好ましくは配列番号２，
３，１４，２２，２３，４４，４５，５７，５８，５９，６０，６６または６７
に示されるアミノ酸配列をもったＫＬＫ−Ｌタンパク質をコードする配列から成
る核酸分子に対し極めて緊縮な条件下においてハイブリダイズする核酸分子が提
供される。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切な緊縮条件は当業界
の専門家には公知であるか、またはＣｕｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｐｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１〜６．３．６の中に見出だすことができる。
例えば６．０ｘの塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃に
おいて処理し、次いで５０℃で２．０ｘのＳＳＣで洗滌する。緊縮度は洗滌条件
に使用した条件に基づいて選ばれる。例えば洗滌段階における塩の濃度を５０℃
における約２．０ｘＳＳＣという高い緊縮度から選ぶことができる。また高い緊
縮条件では洗滌段階における温度を約６５℃にすることができる。 本明細書に記載されているように本発明は、ＫＬＫ−Ｌタンパク質の切断を含
むＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質およびＫＬＫ−Ｌタンパク質の同族列をコードする
核酸分子を含むものとする。また本発明のｃＤＮＡに対応したｍＲＮＡの別のス
プライシングによって生じる本発明の核酸分子の変種も本発明の範囲内に入るこ
とを了解されたい（例えば配列番号５８、５９および６０のＫＬＫ−Ｌ５のスプ
ライシング変種）。 ＤＮＡを含む本発明の単離された核酸分子は本発明の核酸配列のすべてまたは
一部に基づいて標識された核酸プローブをつくることによって単離することがで
きる。標識された核酸分子のプローブは適当なＤＮＡライブラリー（例えばｃＤ
ＮＡまたは遺伝子ＤＮＡライブラリー）のスクリーニングを行なうのに使用され
る。例えばｃＤＮＡライブラリーを用い、標準的な方法で標識されたプローブを
使用してライブラリのスクリーニングを行なうことによりＫＬＫ−Ｌ関連タンパ
ク質をコードするｃＤＮＡを単離することができる。別法として遺伝子ＤＮＡラ
イブラリーを同様にスクリーニングし、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする
遺伝子を含むゲノムクローンを単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングして単離された核酸は標準的な方法で配列さ
せることができる。 ＤＮＡである本発明の単離された核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）法およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを使用し、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を
コードする核酸を選択的に増幅することによって単離することもできる。ＰＣＲ
に使用するために本発明のヌクレオチドの配列から合成オリゴヌクレオチド・プ
ライマーを設計することができる。核酸はこれらのオリゴヌクレオチド・プライ
マーおよび標準的なＰＣＲ増幅法を使用してｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増
幅することができる。このようにして増幅されたＤＮＡは適切なベクターの中に
クローン化し、ＤＮＡ配列の解析によって特徴付けることができる。ｃＤＮＡは
、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４〜５
２９９（１９７９）のチオシアン酸グアニジウム抽出法のような種々の方法によ
り全細胞ｍＲＮＡを単離することによりｍＲＮＡからつくることができる。次い
で逆転写酵素を用いｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する（例えばＧｉｂｃｏ／ＢＲ
Ｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手できるＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素
、またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｓｙ．Ｐｅｔｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＦＬから入手できるＡＭＶ逆転写酵素）。 ＲＮＡである本発明の単離された核酸分子は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡを適当なベクターの中にクローン化し、これによってｃＤＮＡ
を転写してＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードするＲＮＡ分子をつくることによ
って単離することができる。例えばバクテリオファージ・プロモーター（例えば
Ｔ７プロモーター）の下流でｃＤＮＡを或るベクターの中にクローン化すること
ができる。試験管内でＴ７ポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを転写し、得られたＲ
ＮＡを通常の方法で単離することができる。 本発明の核酸分子は標準的な方法で化学的に合成することができる。ポリオキ
シヌクレオチドを化学的に合成する方法は公知であり、それだけには限定されな
いが固相合成法を含んでいる。この方法はペプチド合成法と同様に市販のＤＮＡ
合成器中で完全に自動化されている（例えばＩｔａｋｕｒａ等、米国特許４，５
９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等、同４，４５８，０６６号；およびＩｔ
ａｋｕｒａ、同４，４０１，７９６号および同４，３７３，０７１号参照）。 或る特定の核酸分子がＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードしているかどうかを
決定するには、標準的な方法で適切な宿主細胞の中でｃＤＮＡを発現させ、本明
細書に記載した方法で発現したタンパク質を試験することによって行なうことが
できる。ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードするｃＤＮＡは標準的な方法、例え
ばジデオキシヌクレオチド連鎖終結法またはＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ化学的
配列決定法により核酸の配列、およびコードされているタンパク質の予想アミノ
酸配列を決定することができる。 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の開始コドンおよび翻訳されない配列はこの目的で
設計されたコンピュータ・ソフトウエア、例えばＰＣ／Ｇｅｎｅ（Ｉｎｔｅｋｉ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆ．）を用いて決定することができる。
ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする遺伝子のイントロン−エクソン（ｉｎｔ
ｒｏｎ−ｅｘｏｎ）構造および転写調節配列は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコ
ードする本発明の核酸分子を用いて確認し、ゲノムＤＮＡクローン・ライブラリ
ーを検証することができる。調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｒｏｙ ｅｌｅｍｅｎｔ
）は標準的な方法で同定することができる。これらの要素の機能は、これらの要
素を用いこれらの要素に動作的にに結合しているｌａｃＺ遺伝子のようなリポー
ター遺伝子を発現させることによって確かめることができる。これらの構造は通
常の方法を用いて培養した細胞の中に導入するか、非ヒト・トランスゼニック動
物モデルに導入することができる。ＤＮＡ中の調節要素を同定する他に、このよ
うな構造物は当業界に公知の方法を用い該要素と相互作用する核酸を同定するの
に使用することができる。 本発明の特定の具体化例においては、本明細書に記載された方法を用いて単離
された核酸分子は突然変異したｋｌｋ−ｌ対立遺伝子である。突然変異株の対立
遺伝子は、例えばガン（例えば乳腺、睾丸、脳、結腸および前立腺のガン）の兆
候に寄与する遺伝子型をもつことが知られているか或いはもつと提案されている
個体から単離ことができる。突然変異体の対立遺伝子または突然変異体の対立遺
伝子の生産物は本明細書記載の治療法および診断法に使用することができる。例
えば突然変異体のｋｌｋ−ｌ遺伝子のｃＤＮＡは本明細書記載のようにしてＰＣ
Ｒ法を用いて単離し、突然変異体の対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常の対立遺伝子
と比較して突然変異体の遺伝子生成物の機能の喪失または変化の原因となる突然
変異を確かめることができる。突然変異体の対立遺伝子をもっていることが分か
っているか或いは疑われる個体からのＤＮＡを用いてゲノム・ライブラリーをつ
くることができ、或いは突然変異体の対立遺伝子を発現することが知られている
か或いは疑われる組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーをつくること
ができる。次に正常のｋｌｋ−ｌ遺伝子またはその適当な断片をコードする核酸
を標識し、これをプローブととして用いてこのようなライブラリーにおける対応
する突然変異体の対立遺伝子を同定することができる。突然変異体の配列を含む
クローンは精製して配列の解析を行なうことができる。また、突然変異体のｋｌ
ｋ−ｌ対立遺伝子を発現することが知られている或いは疑われている組織から単
離されたＲＮＡからのｃＤＮＡを用いて発現ライブラリーをつくることができる
。推定的な突然変異体によってつくられた遺伝子の生産物は例えば上記のように
してＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に対して特定的な抗体を用いて発現させスクリー
ニングを行なうことができる。この抗体を用いて同定されたライブラリーのクロ
ーンは精製して配列解析を行なうことができる。 本発明の核酸分子、またはこの分子の断片の配列は転写に対する正常な提示に
対して逆転させ、逆向きの核酸分子をつくることができる。逆向きの核酸分子は
当業界に公知の方法を用い化学的な合成法および酵素の連結反応を使用してつく
ることができる。 ２．本発明のタンパク質 ＫＬＫ−Ｌタンパク質のアミノ酸配列は、表１〜５または配列番号２、３、１
４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、６０、６６もしくは６７に示
すような配列を含んでなる。 表１〜５または配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８
、５９、６０、６６もしくは６７に示すようなアミノ酸配列を含んでなるタンパ
ク質に加えて、本発明のタンパク質は、ＫＬＫ−Ｌタンパク質の切頭体、ＫＬＫ
−Ｌタンパク質の類似体、及びＫＬＫ−Ｌタンパク質に配列同一性または類似性
を有するタンパク質、並びに本明細書に記述するようなその切頭体を包含する（
すなわち、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に包含される）。切頭体タンパク質は、ト
リペプチド〜７０ｍｅｒポリペプチドの大きさの範囲である、３〜７０アミノ酸
残基の間のペプチドを含んでなることができる。 切頭体タンパク質は、アミノ基（−ＮＨ_２）、疎水性基（例えば、カルボベン
ゾキシ、ダンシルもしくはＴ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９−フ
ルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基、または脂質−脂肪酸コンジュ
ゲート、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物を包含するがこれらに限定さ
れるものではない高分子をアミノ末端の端に有することができる。切頭体タンパ
ク質は、カルボキシル基、アミド基、Ｔ−ブチルオキシカルボニル基、または脂
質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物を包含す
るがこれらに限定されるものではない高分子をカルボキシ末端の端に有すること
ができる。 本発明のタンパク質はまた、ＫＬＫ−Ｌタンパク質の類似体、並びに／または
１もしくはそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／もしくは欠失を含有するＫＬＫ
−Ｌタンパク質を包含することができるがこれらに限定されるものではない本明
細書に記述するようなその切頭体も包含することができる。アミノ酸置換は保存
的または非保存的性質のものであることができる。保存的アミノ酸置換は、ＫＬ
Ｋ−Ｌタンパク質アミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を同様の電荷、大
きさ及び／または疎水性特性のアミノ酸で置換することを含む。保存的置換のみ
が行われる場合、得られる類似体は、好ましくは、ＫＬＫ−Ｌタンパク質と機能
的に同等である。非保存的置換は、ＫＬＫ−Ｌタンパク質アミノ酸配列の１また
はそれ以上のアミノ酸を異なった電荷、大きさ及び／または疎水性特性を有する
１またはそれ以上のアミノ酸で置換することを含む。 １またはそれ以上のアミノ酸挿入をＫＬＫ−Ｌタンパク質中に導入することが
できる。アミノ酸挿入は、単一のアミノ酸残基または２〜１５アミノ酸の長さで
ある連続したアミノ酸からなることができる。 欠失は、ＫＬＫ−Ｌタンパク質配列からの１もしくはそれ以上のアミノ酸また
は別個の部分の除去からなることができる。欠失アミノ酸は連続していてもして
いなくてもよい。欠失突然変異を有する得られた類似体の下限の長さは、約１０
アミノ酸、好ましくは２０〜４０アミノ酸である。 本発明のタンパク質には、ＫＬＫ−Ｌタンパク質に配列同一性もしくは類似性
を有するタンパク質及び／または本明細書に記述するようなその切頭体が包含さ
れる。そのようなＫＬＫ−Ｌタンパク質には、アミノ酸配列が、選択したハイブ
リダイゼーション条件下で（本明細書におけるストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件の説明を参照）ＫＬＫ−Ｌタンパク質を得るために用いたプロー
ブとハイブリダイズする他の種からのＫＬＫ−Ｌタンパク質領域のアミノ酸配列
を含んでなるタンパク質が包含される。これらのタンパク質は、一般に、ＫＬＫ
−Ｌタンパク質に特有である同じ領域を有する。好ましくは、タンパク質は、表
１〜５または配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５
９、６０、６６もしくは６７に示すアミノ酸配列と実質的な配列同一性、例えば
、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５
％、８０％もしくは８５％の同一性、好ましく９０％の同一性、より好ましくは
少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性、そして最
も好ましくは９８％の同一性を有する。 アミノ酸配列相同性、類似性または同一性の％は、本明細書に記述するような
既知の方法を用いて基準配列と一致する整列したアミノ酸のパーセンテージとし
て計算される。 本発明はまた、本発明のタンパク質のアイソフォームも意図する。アイソフォ
ームは、本発明のタンパク質と同じ数及び種類のアミノ酸を含有するが、アイソ
フォームは異なる分子構造を有する。本発明により意図されるアイソフォームは
、好ましくは、本明細書に記述するような本発明のタンパク質と同じ特性を有す
る。 本発明はまた、融合タンパク質を製造するために選択したタンパク質またはマ
ーカータンパク質（以下参照）と結合したＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質も包含する
。さらに、ＫＬＫ−Ｌタンパク質及びＫＬＫ−Ｌタンパク質関連タンパク質の免
疫原性部分は、本発明の範囲内である。 本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質は、組換えＤＮＡ法を用いて製造すること
ができる。従って、本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする配列を有す
る本発明の核酸分子は、タンパク質の十分な発現を保証する適切な発現ベクター
中に既知のように導入することができる。可能な発現ベクターには、ベクターが
用いる宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミドまたは改変したウイルス
（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス
）が包含されるが、これらに限定されるものではない。 従って、本発明は、本発明の核酸分子並びに挿入したタンパク質配列の転写及
び翻訳のために必要な調節配列を含有する本発明の組換え発現ベクターを意図す
る。適当な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫遺伝子を包含
する様々な起源から得ることができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ（１９９０）に記述されている調節配列を参照）。適切な調節配列の選択
は、以下に説明するように選択した宿主細胞により決まり、そして当業者は容易
にこれを成し遂げることができる。必要な調節配列は、天然のＫＬＫ−Ｌタンパ
ク質及び／またはその隣接領域により供給することができる。 本発明はさらに、発現ベクター中にアンチセンスの向きにクローン化された本
発明のＤＮＡ核酸分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、
ＤＮＡ分子は、このＤＮＡ分子の転写により、本発明のタンパク質またはそのフ
ラグメントの核酸配列にアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を与えるように調
節配列に連結される。様々な細胞タイプにおいてアンチセンスＲＮＡ分子の連続
発現を導くアンチセンス核酸に連結される調節配列、例えばウイルスのプロモー
ター及び／もしくはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセンスＲ
ＮＡの組織もしくは細胞タイプ特異的発現を導く調節配列を選択することができ
る。 本発明の組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換されたま
たはトランスフェクションされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を
含有することもできる。マーカー遺伝子の例は、ある種の薬剤に対する耐性を与
えるＧ４１８及びハイグロマイシンのようなタンパク質、β−ガラクトシダーゼ
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、
または免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分の
ようなその一部をコードする遺伝子である。マーカーは、目的の核酸と別個のベ
クター上に導入することができる。 組換え発現ベクターはまた、組換えタンパク質の増加した発現；組換えタンパ
ク質の増加した可溶性；及びアフィニティー精製においてリガンドとして働くこ
とによる標的組換えタンパク質の精製の補助を与える融合部分をコードする遺伝
子を含有することもできる。例えば、融合タンパク質の精製後に融合部分から組
換えタンパク質を分離させるためにタンパク質分解切断部位を標的組換えタンパ
ク質に付加することができる。典型的な融合発現ベクターには、組換えタンパク
質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結
合タンパク質またはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．
，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＨ）が包含される。 組換え発現ベクターは、形質転換体宿主細胞を製造するために宿主細胞中に導
入することができる。「形質転換体宿主細胞」には、本発明の組換え発現ベクタ
ーで形質転換されているかまたはトランスフェクションされている宿主細胞が包
含される。「で形質転換される」、「でトランスフェクションされる」、「形質
転換」及び「トランスフェクション」という用語には、多数の標準的な技術の一
つによる細胞中への核酸（例えばベクター）の導入が包含される。原核細胞は、
例えば、電気穿孔または塩化カルシウムによる形質転換により核酸で形質転換す
ることができる。核酸は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、Ｄ
ＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクチン、電気穿孔
または微量注入のような通常の技術により哺乳類細胞中に導入することができる
。宿主細胞を形質転換及びトランスフェクションする適当な方法は、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９））及び他の実験教本に見出すこ
とができる。 適当な宿主細胞には、多種多様な原核及び真核宿主細胞が包含される。例えば
、本発明のタンパク質は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細
胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳類細胞におい
て発現することができる。他の適当な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ（１９９１）に見出すことができる。 また、挿入した核酸配列の発現を調節するか、またはタンパク質を所望のよう
に修飾し（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）プロセシングする（例えば
切断する）宿主細胞を選択することもできる。タンパク質の翻訳後プロセシング
及び修飾の特異的且つ特徴的な機構を有する宿主系または細胞系を選択すること
ができる。例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬＡ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、
２９３、３Ｔ３及びＷＩ３８を包含する真核宿主細胞を用いることができる。タ
ンパク質の長期の高収量の安定な発現のためには、遺伝子産物を安定に発現する
細胞系及び宿主系を工学設計することができる。 本明細書に記述する方法を用いて製造した宿主細胞及び特に細胞系は、ＫＬＫ
−Ｌ関連タンパク質の活性を調節する化合物をスクリーニングすること及び評価
することにおいて特に有用であることができる。 本発明のタンパク質はまた、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ｍｉｃｒ
ｏ−ｐｉｇｓ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル及びチ
ンパンジー）を包含するがこれらに限定されるものではない非ヒトトランスジェ
ニック動物において発現することもできる［Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａ
ｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３，１９８５），Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４，１９８３），Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４
４３８−４４４２，１９８５），Ｐａｌｍｉｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ
（Ｃｅｌｌ．４１：３４３−３４５，１９８５）及び米国特許第４，７３６，８
６６号を参照］。ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする本発明の核酸分子を動
物中に導入してトランスジェニック動物の創始系を作製するために当該技術分野
において既知である方法を用いることができる。そのような方法には、前核微量
注入、生殖細胞系へのレトロウイルスによる遺伝子導入、胚性幹細胞における遺
伝子ターゲッティング、胚の電気穿孔及び精子による遺伝子導入が包含される。 本発明は、全ての細胞においてＫＬＫ−Ｌ遺伝子を保有するトランスジェニッ
ク動物、及び全てではないがいくらかの細胞において導入遺伝子を保有する動物
を意図する。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子としてまたはコンカテマーで組込
むことができる。導入遺伝子は、特定の細胞タイプに選択的に導入し、そしてそ
こにおいて活性化することができる（例えば、Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ，１９９
２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３６を参照）
。導入遺伝子は、遺伝子ターゲッティングにより内因性遺伝子の染色体部位中に
組込むことができる。導入遺伝子は、特定の細胞タイプに選択的に導入してその
細胞タイプにおいて内因性遺伝子を不活性化することができる（Ｇｕ ｅｔ ａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６を参照）。 トランスジェニック動物における組換えＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の発現は、
標準的な技術を用いて評価することができる。最初のスクリーニングは、導入遺
伝子が組み込まれているかどうかを分析するためにサザンブロット分析またはＰ
ＣＲ法により行うことができる。トランスジェニック動物の組織におけるｍＲＮ
Ａ発現のレベルもまた、組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュー
ハイブリダイゼーション及びＲＴ−ＰＣＲを包含する技術を用いて評価すること
ができる。組織はまた、ＫＬＫ−Ｌタンパク質に対する抗体を用いて免疫細胞化
学的に評価することもできる。 本発明のタンパク質はまた、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４，Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）または均質な溶液
における合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒ
ｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ編集，Ｖｏｌ．１５ Ｉ及
びＩＩ，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）のようなタンパク質の化学におい
て周知である技術を用いて化学合成により製造することもできる。 タンパク質のような他の分子と結合した本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を
含んでなるＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、組換え技術により、ＫＬＫ−
Ｌ関連タンパク質のＮ末端またはＣ末端と所望の生物学的機能を有する選択した
タンパク質またはマーカータンパク質の配列を融合することにより製造すること
ができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記述するような選択したタン
パク質またはマーカータンパク質に融合したＫＬＫ−Ｌタンパク質を含有する。
融合タンパク質を製造するために用いることができるタンパク質の例には、免疫
グロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素
（ＨＡ）及び切断したｍｙｃが包含される。 ３．抗体 本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質は、これらのタンパク質に特異的な抗体を
製造するために用いることができる。タンパク質の非保存領域中の異なるエピト
ープに結合する抗体を製造することができる。タンパク質の非保存領域は、別の
タンパク質に実質的な配列相同性をもたないものである。十分に特性化されたド
メインのような保存領域からの領域もまた、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の保存領
域に対する抗体を製造するために用いることができる。ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク
質に特異性を有する抗体はまた、本明細書に記述するような細菌において融合タ
ンパク質を発現することにより作られる融合タンパク質から作製することもでき
る。 本発明は、完全なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、及び免疫学的
に活性のフラグメント（例えば、そのＦａｂ、（Ｆａｂ）_２フラグメントもしく
はＦａｂ発現ライブラリーフラグメント及びエピトープ結合フラグメント）、抗
体重鎖及び抗体軽鎖、遺伝子的に工学設計した単鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ，米国特許第４，９４６，７７８号）またはキメラ抗体、例えば、マウ
ス抗体の結合特異性を含有するが残りの部分はヒト起源のものである抗体を用い
ることができる。モノクローナル及びポリクローナル抗体、フラグメント並びに
キメラを包含する抗体は、当業者に既知である方法を用いて製造することができ
る。 ４．本発明の核酸分子、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質及び抗体の用途 本発明の核酸分子、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質及び抗体は、癌（例えば乳癌、
精巣癌及び前立腺癌）または他の症状の予後及び診断評価、並びに癌に素因を有
する被験体の同定において用いることができる（４．１．１及び４．１．２節）
。本発明の核酸分子及びＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を検出する方法は、ＫＬＫ−
Ｌ関連タンパク質及びＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする核酸分子を検出す
ることにより、癌を包含する症状をモニターするために用いることができる。本
明細書に記述する方法は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の発生発現を研究するため
に使用できることもまた当業者に明らかであり、従って、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパ
ク質の役割にさらなる洞察を与える。また、本発明の用途には、ＫＬＫ−Ｌまた
はＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の生物学的活性を調節する化合物の同定方法も包含
される（４．２節）。これらの化合物、抗体等は、癌の処置に用いることができ
る（４．３節）。 ４．１診断方法 癌（例えば乳癌、精巣癌及び前立腺癌）を包含する症状の診断及び予後評価、
並びにそのような症状に素因を有する被験体の同定に様々な方法を用いることが
できる。そのような方法は、例えば、本発明の核酸分子及びそのフラグメント、
並びにペプチドフラグメントを包含するＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に対して誘導
された抗体を利用することができる。特に、例えば：（１）ＫＬＫ−Ｌ突然変異
の存在の検出、または非疾病状態に対してＫＬＫ−Ｌ ｍＲＮＡの過剰なもしく
は不十分な発現の検出、またはある種の症状もしくはそのような症状に対する感
受性と相関関係がある可能性があるＫＬＫ−Ｌ転写産物の選択的スプライシング
形態の定性的もしくは定量的検出；及び（２）非疾病状態に対して過剰なもしく
は不十分な量のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質または疾病状態もしくは疾病状態への
進行と相関関係がある改変された（例えば全長より小さい）ＫＬＫ−Ｌタンパク
質の存在の検出に核酸及び抗体を用いることができる。 本明細書に記述する方法は、患者をスクリーニングして診断するため及び疾患
を発症する素因を示す個体をスクリーニングして同定するために、例えば臨床環
境において、都合よく用いることができる本明細書に記述する少なくとも１つの
特定のＫＬＫ−Ｌ核酸または抗体を含んでなる予め包装された診断キットを利用
することにより行うことができる。 核酸に基づく検出技術は、４．１．１節において以下に記述されている。ペプ
チド検出技術は、４．１．２節において以下に記述されている。本発明の方法を
用いて分析することができるサンプルには、ＫＬＫ−Ｌを発現するかまたはＫＬ
Ｋ−Ｌ関連タンパク質を発現することが既知であるかもしくは疑われるものが包
含される。これらのサンプルは、患者または細胞培養から得ることができ、そし
て生物学的流体、組織抽出物、新しく採取した細胞、及び細胞培養においてイン
キュベーションされている細胞のライセートを包含するがこれらに限定されるも
のではない。 本発明の核酸分子のいずれかから得られるオリゴヌクレオチドまたはより長い
フラグメントは、マイクロアレーにおける標的として用いることができる。マイ
クロアレーは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするため並びに遺伝
子変異体、突然変異及び多型を同定するために用いることができる。マイクロア
レーからの情報は、遺伝子機能を決定するため、疾病の遺伝学的根拠を理解する
ため、疾病を診断するため及び治療薬を開発しその活性をモニターするために用
いることができる。 マイクロアレーの製造、使用及び分析は、当業者に周知である（例えば、Ｂｒ
ｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）米国特許第５，４７４，７９６
号；Ｓｃｈｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９；Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ
ａｌ．（１９９５），ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ
．ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５；Ｈｅｌｌｅｒ，
Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９
４：２１５０−２１５５；及びＨｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７
）米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。 ４．１．１本発明の核酸分子を検出する方法 本発明の核酸分子により当業者はサンプル中の本発明の核酸配列の検出に使用
するヌクレオチドプローブを構築することができる。適当なプローブには、ＫＬ
Ｋ−Ｌタンパク質の領域からの少なくとも５個の連続したアミノ酸をコードする
核酸配列に基づく核酸分子が包含され、好ましくは、これらは１５〜３０ヌクレ
オチドを含んでなる。ヌクレオチドプローブは、^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃ等のよう
な適切なシグナルを与え且つ十分な半減期を有する放射性標識のような検出可能
な物質で標識することができる。用いることができる他の検出可能な物質には、
特定の標識した抗体により認識される抗原、蛍光性化合物、酵素、標識した抗原
に特異的な抗体及び発光性化合物が包含される。適切な標識は、検出されるヌク
レオチドに対するプローブのハイブリダイゼーション及び結合の速度及びハイブ
リダイゼーションに利用可能なヌクレオチドの量に関して選択することができる
。標識したプローブは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版
）に一般的に記述されているようにニトロセルロースフィルターまたはナイロン
膜のような固体支持体上の核酸にハイブリダイズすることができる。核酸プロー
ブは、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする好ましくはヒト細胞中の遺伝子を
検出するために用いることができる。ヌクレオチドプローブはまた、癌の診断に
おいて；癌の進行をモニターすること；または治療処置をモニターすることにお
いて有用であることもできる。 プローブは、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする遺伝子を検出するために
ハイブリダイゼーション技術において用いることができる。この技術は、一般に
、本発明のプローブと患者または他の細胞起源からのサンプルより得られた核酸
（例えば組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子）とを核酸中の相補的配列へのプ
ローブの特異的アニーリングに適した条件下で接触させること及びインキュベー
ションすることを含む。インキュベーション後に、アニーリングしていない核酸
を除き、そしてもしあればプローブにハイブリダイゼーションしている核酸の存
在を検出する。 本発明の核酸分子の検出は、ＰＣＲのような増幅方法を用いる特定の遺伝子配
列の増幅、及びそれに続く当業者に既知である技術を用いる増幅分子の分析を含
むことができる。適当なプライマーは、当業者により日常的に設計することがで
きる。 点突然変異、挿入、欠失及び染色体再編成を包含するｋｌｋ−ｌ構造に関する
異常を検出するためにゲノムＤＮＡを生物学的サンプルのハイブリダイゼーショ
ンまたは増幅アッセイにおいて用いることができる。例えば、直接塩基配列決定
、一本鎖構造多型分析、ヘテロ二重鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、化学的ミス
マッチ切断及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを利用することがで
きる。 当業者に既知である遺伝子型類別技術は、ｋｌｋ−ｌ遺伝子中の突然変異にご
く接近している多型を類別するために用いることができる。多型は、突然変異を
保有すると思われるファミリーの個体を同定するために用いることができる。多
型がｋｌｋ−ｌ遺伝子中の突然変異と連鎖不平衡を示す場合、それは突然変異を
保有すると患われる一般集団の個体をスクリーニングするために用いることもで
きる。用いることができる多型には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び単純配列
反復多型（ＳＳＬＰ）が包含される。 本発明のプローブは、ＲＦＬＰを直接同定するために用いることができる。本
発明のプローブまたはプライマーはさらに、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド
、ファージまたはプラスミドのようなゲノムクローンを単離するために用いるこ
とができる。クローン中のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは塩基配列決
定方法を用いてＳＳＬＰに関してスクリーニングすることができる。 本明細書に記述するハイブリダイゼーション及び増幅技術は、ｋｌｋ−ｌ発現
の定性的及び定量的な面をアッセイするために用いることができる。例えば、ｋ
ｌｋ−ｌを発現することが既知である細胞タイプまたは組織からＲＮＡを単離し
、本明細書に記載したハイブリダイゼーション（例えば標準的なノーザン分析）
またはＰＣＲ技術を利用して試験することができる。これらの技術は、正常なま
たは異常な選択的スプライシングによる可能性がある転写産物の大きさの違いを
検出するために用いることができる。これらの技術は、癌の症状または他の疾患
の症状を示す個体に対して正常な個体において検出される全長及び／または選択
的スプライシング転写産物のレベルの定量的違いを検出するために用いることが
できる。 プライマー及びプローブは、上記の方法においいてインサイチューで、すなわ
ち、生検または切除術から得られた患者組織の組織切片（固定及び／または凍結
した）上で直接用いることができる。 ４．１．２ ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を検出する方法 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質、または酵素コンジュゲートもしくは標識した誘導
体のような誘導体と特異的に反応する抗体は、様々なサンプル（例えば生物学的
材料）においてＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を検出するために用いることができる
。これらは診断または予後試薬として用いることができ、そしてこれらはＫＬＫ
−Ｌ関連タンパク質発現のレベルの異常、またはＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の構
造及び／もしくは時間的、組織、細胞もしくは非細胞位置の異常を検出するため
に用いることができる。抗体はまた、潜在的に治療に役立つ化合物をインビトロ
でスクリーニングして癌及び他の症状に対するそれらの効果を決定するために用
いることもできる。インビトロ免疫アッセイはまた、特定の治療の効能を評価す
るかまたはモニターするために用いることもできる。本発明の抗体はまた、ＫＬ
Ｋ−Ｌ関連タンパク質を生産するように遺伝子的に工学設計された細胞における
ＫＬＫ−Ｌ発現のレベルを決定するためにインビトロで用いることもできる。 これらの抗体は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の抗原決定基と抗体の間の結合相
互作用によるあらゆる既知の免疫アッセイにおいて用いることができる。そのよ
うなアッセイの例は、放射線免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳ
Ａ）、免疫蛍光法、免疫沈降法、ラテックス凝集、赤血球凝集及び組織化学試験
である。これらの抗体は、サンプル中のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を検出し定量
して特定の細胞事象もしくは病的状態における役割を決定するため及びそのよう
な病的状態を診断し処置するためにために用いることができる。 特に、本発明の抗体は、ＬＫＬ−Ｌ関連タンパク質を検出するため、それを特
定の細胞及び組織並びに特定の非細胞位置に位置付けるため、並びに発現のレベ
ルを定量するために免疫組織化学分析において、例えば細胞及び非細胞レベルで
用いることができる。 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を検出するために、光学及び電子顕微鏡検査を用い
て抗原を位置決定するための当該技術分野において既知である細胞組織技術を用
いることができる。一般に、本発明の抗体は、検出可能な物質で標識することが
でき、そして検出可能な物質の存在に基づいてＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を組織
及び細胞において位置決定することができる。検出可能な物質の例には、以下の
もの：放射性同位体（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、
蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、ルミノールのよ
うな発光標識；酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ）、ビオチニル基（標識を有するアビジン、例えば、光学もしくは熱量測定
法により検出することができる蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレ
プトアビジンにより検出することができる）、二次レポーター（例えば、ロイシ
ンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）
により認識される予め決定されたポリペプチドエピトープが包含されるが、これ
らに限定されるものではない。ある態様として、標識は、可能性がある立体障害
を減らすために様々な長さのスペーサーアームによりつけられる。抗体はまた、
電子顕微鏡検査により容易に視覚化されるフェリチンもしくは金コロイドのよう
な電子高密度物質に結合することもできる。 抗体またはサンプルは、細胞、抗体等を固定することができる担体または個体
支持体上に固定することができる。例えば、担体または支持体は、ニトロセルロ
ース、またはガラス、ポリアクリルアミド、斑レイ岩及び磁鉄鉱であることがで
きる。支持体材料は、球状（例えばビーズ）、円柱状（例えば、試験管もしくは
ウェルの内部表面または杆状体の外部表面）、または平ら（例えば、シート、試
験細片）を包含するあらゆる可能な形状を有することができる。また、一次抗原
−抗体反応をＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に対して反応する抗体に特異性を有する
二次抗体の導入により増幅する間接的方法を用いることもできる。例として、Ｋ
ＬＫ−Ｌ関連タンパク質に対する特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体である
場合、二次抗体は、本明細書に記述するような検出可能な物質で標識したヤギ抗
−ウサギガンマ−グロブリンであることができる。 放射性標識が検出可能な物質として用いられる場合、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク
質はオートラジオグラフィーにより位置決定することができる。オートラジオグ
ラフィーの結果は、様々な光学方法によりオートラジオフラフィー中の粒子の密
度を決定することにより、または粒子を計数することにより定量することができ
る。 ４．２物質／化合物を同定するかまたは評価する方法 本明細書に記述する方法は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に結合するかまたはＫ
ＬＫ−Ｌ関連タンパク質と相互作用する他のタンパク質に結合する物質、ＫＬＫ
−Ｌ関連タンパク質とＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質もしくはＫＬＫ−Ｌ関連タンパ
ク質と相互作用する他のタンパク質に結合する物質との相互作用を妨げるかもし
くは増大する化合物を包含するＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の生物学的活性を調節
する物質を同定するために設計される。ＫＬＫ−Ｌ調節配列に結合する化合物を
同定する方法もまた利用される。 本発明の方法を用いて同定される物質及び化合物には、Ｉｇを末端につないだ
融合ペプチド、ランダムペプチドライブラリーのメンバー並びにＤ−及び／また
はＬ−配置アミノ酸から作られた組み合わせ化学に由来する分子ライブラリーを
包含する可溶性ペプチド、ホスホペプチド（ランダムまたは部分的に縮重した指
定ホスホペプチドライブラリーを包含する）ようなペプチド、抗体［例えば、ポ
リクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラ、単鎖抗
体、フラグメント（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２及びＦａｂ発現ライブラリー
フラグメント、並びにそのエプトープ結合フラグメント）、並びに有機もしくは
無機小分子が包含されるがこれらに限定されるものではない。物質または化合物
は内因性の生理学的化合物であることができ、またはそれは天然のもしくは合成
の化合物であることができる。 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を調節する物質は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に結
合するそれらの能力に基づいて同定することができる。従って、本発明はまた、
ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に結合する物質を同定する方法も提供する。本発明の
方法を用いて単離された物質は、通常の技術を用いて単離し、クローン化し、そ
して塩基配列決定することができる。本発明のポリペプチドと会合する物質は、
本発明のポリペプチドの生物学的または免疫学的活性のアゴニストまたはアンタ
ゴニストであることができる。 「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドの活性の量を増やすかまたはその
期間を延ばす分子をさす。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドの生
物学的または免疫学的活性を減らす分子をさす。アゴニスト及びアンタゴニスト
は、本発明のポリペプチドと会合するタンパク質、核酸、炭水化物またはあらゆ
る他の分子を包含することができる。 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と結合することができる物質は、物質−ＫＬＫ−Ｌ
関連タンパク質の形成を可能とする条件下でＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に潜在的
に結合する試験物質とＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を反応させ、そして複合体を取
り出し、そして／または検出することにより同定することができる。複合体は、
物質−ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質複合体に関して、遊離した物質に関して、また
は複合体を形成していないＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に関してアッセイすること
により検出することができる。物質−ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の形成を可能と
する条件は、物質及びタンパク質の性質及び量のような因子に関して選択するこ
とができる。 物質−タンパク質複合体、遊離した物質または複合体を形成していないタンパ
ク質は、通常の単離技術、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル
濾過、分別、吸収、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集またはこれらの組み
合わせにより単離することができる。化合物のアッセイを容易にするために、Ｋ
ＬＫ−Ｌ関連タンパク質もしくは物質に対する抗体、または標識したＫＬＫ−Ｌ
関連タンパク質もしくは標識した物質を利用することができる。抗体、タンパク
質または物質は、上記のような検出可能な物質で標識することができる。 本発明の方法に用いるＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質または物質は、不溶化するこ
とができる。例えば、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質または物質は、アガロース、セ
ルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセ
ルロース、ポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラ
スチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エーテルーマレ
イン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナ
イロン、絹等のような適当な担体に結合することができる。担体は、例えば、チ
ューブ、試験プレート、ビーズ、円板、球等の形状であることができる。不溶化
したタンパク質または物質は、既知の化学的または物理的方法、例えば、臭化シ
アンカップリングを用いて適当な不溶性担体と材料を反応させることにより調製
することができる。 本発明はまた、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と結合する物質とＫＬＫ−Ｌ関連タ
ンパク質の結合のアゴニストまたはアンタゴニスト（すなわち、エンハンサーま
たはインヒビター）に関してアッセイすることにより、本発明のＫＬＫ−Ｌ関連
タンパク質の生物学的活性を調節する能力について化合物を評価する方法も意図
する。化合物がＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の結合のアゴニストもしくはアンタゴ
ニスト及びタンパク質に結合する物質であるかどうかを評価する基本的方法は、
試験化合物の存在下で、物質−ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質の形成を可能にする条
件下でＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質及び物質を含有する反応混合物を調製すること
である。試験化合物は、最初に混合物に加えることができ、またはＫＬＫ−Ｌ関
連タンパク質と物質の添加後に加えることができる。試験化合物を含まないかま
たはプラシーボを含むコントロールの反応混合物も調製する。複合体の検出を検
出し、そして反応混合物ではなくコントロール反応における複合体の形成は、試
験化合物がＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と物質の相互作用を妨げることを示す。反
応は液相で実施することができ、またはＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質、物質もしく
は試験化合物を本明細書に記述するように固定することができる。本発明のＫＬ
Ｋ−Ｌ関連タンパク質の生物学的活性を調節する化合物の能力は、細胞に対する
生物学的作用を測定することにより試験することができる。 本発明の方法を用いてアッセイすることができるアゴニストまたはアンタゴニ
スト、すなわち、エンハンサーまたはインヒビターは、アゴニスト結合部位、拮
抗的アンタゴニスト結合部位、非拮抗的アンタゴニスト結合部位またはアロステ
リック部位を包含するタンパク質または物質上の１またはそれ以上の結合部位に
対して作用することができると理解される。 本発明はまた、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に結合することができる物質とＫＬ
Ｋ−Ｌ関連タンパク質との相互作用のアゴニストの影響を阻害するアンタゴニス
トに関してスクリーニングすることも可能にする。従って、本発明は、ＫＬＫ−
Ｌ関連タンパク質の同じ結合部位を競合する化合物に関してアッセイするために
用いることができる。 本発明はまた、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と相互作用するタンパク質に結合す
る化合物を同定する方法も意図する。タンパク質−タンパク質相互作用は、共免
疫沈降、架橋及び勾配もしくはクロマトグラフィーカラムによる共精製のような
常法を用いて同定することができる。ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と相互作用する
タンパク質をコードする遺伝子の同時の同定をもたらす方法もまた用いることが
できる。これらの方法には、標識したＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質で発現ライブラ
リーを調べることが包含される。 インビボでタンパク質相互作用を検出するために２ハイブリッド系もまた用い
ることができる。一般に、２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミ
ドを構築する。第一のハイブリッドタンパク質は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に
融合した転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ−結合ドメインからなり、そし
て第二のハイブリッドタンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラス
ミド中に組換えられているｃＤＮＡによりコードされる未知のタンパク質に融合
した転写アクチベータータンパク質のアクチベータードメインからなる。これら
のプラスミドを、調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含有するレポータ
ー遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋
ワサビペルオキシダーゼ）を含有する酵母の株（例えば、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））に形質転換する。ハイブリッドタンパク
質単独では、レポーター遺伝子の転写を活性化することができない。しかしなが
ら、２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能性アクチベータータンパ
ク質を再構成し、そしてレポーター遺伝子レポーター遺伝子の発現をもたらし、
これをレポーター遺伝子産物に関するアッセイにより検出する。 融合タンパク質を上記の方法に使用できることが理解される。特に、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合したＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をこれらの
方法に用いることができる。 ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を調節する化合物を評価するために本発明の方法を
用いるために適当な試薬は、適当な容器中に包装した必要な材料を提供する都合
のよいキットに包装することができる。キットはまた、本発明の方法を行うこと
において有用な適当な支持体を含むこともできる。 ４．３組成物及び処置 本発明のタンパク質、本明細書に記述する方法により同定される物質または化
合物、抗体、及び本発明のアンチセンス核酸分子は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質
の生物学的活性を調節するために用いることができ、そしてそれらは、癌（例え
ば、前立腺癌、精巣癌、脳の癌、子宮癌、胸腺癌、卵巣癌、結腸癌、卵巣巖また
は乳癌）のような症状の処置に用いることができる。従って、物質、抗体、ペプ
チド及び化合物は、インビボでの投与のために適当な生物学的に適合した形態で
被験体への投与のために製薬学的組成物中に調合することができる。「インビボ
での投与のために適当な生物学的に適合した形態」は、治療効果が有毒な作用に
勝る投与する活性物質の形態を意味する。活性物質は、ヒト及び動物を包含する
生きている生物体に投与することができる。本発明の製薬学的組成物の治療的に
有効な量の投与は、所望の効果を得るために必要な投薬量及び期間で有効な量と
して定義される。例えば、物質の治療的に有効な量は、個体の疾病状態、年齢、
性別及び体重、並びに個体において所望の応答を引き出す抗体の能力のような因
子により変わる可能性がある。投薬計画は、最適な治療応答を与えるように調整
することができる。例えば、いくつかの分割した用量を毎日投与することができ
、または用量は治療状況の要求により示されるように対応して減らすことができ
る。 活性物質は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮施用または直腸
投与によるような常法で投与することができる。投与の経路により、活性物質は
、物質を不活性化する可能性がある酵素、酸及び他の天然の条件から物質を防御
する材料中に被覆することができる。 本明細書に記述する組成物は、有効な量の活性物質が製薬学的に許容しうる賦
形剤との混合物に合わせられるように、被験体に投与することができる製薬学的
に許容しうる組成物のそれ自体既知の製造方法により調製することができる。適
当な賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａ
ｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ １９８５）に記述されている。これに基づき、組成
物には、１またはそれ以上の製薬学的に許容しうる賦形剤または希釈剤と会合し
てそして適当なｐＨを有し且つ生理学的流体と等張である緩衝溶液中に含まれる
活性物質の溶液が包含される。 本発明の核酸分子は、カリクレインをコードする遺伝子に対するそれらの相同
性に基づき、高血圧症、心臓肥大、炎症性疾患、神経学的疾患及び血液凝固疾患
のような症状の処置においても有用である可能性がある。 標的とする器官、組織または細胞集団に核酸分子を送達するためにレトロウイ
ルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクシニアウイルス、または様々な細
菌プラスミドに由来するベクターを用いることができる。本発明のアンチセンス
を発現する組換えベクターを構築するために当業者に周知である方法を用いるこ
とができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（上記）Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ（上記）に記述されている技術を参照）。 全長ｃＤＮＡ配列及び／またはそれらの調節要素を含んでなる核酸分子により
当業者は、遺伝子機能のセンス（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ Ｈ ａｎｄ Ｈ Ｆ
Ｌｏｄｉｓｈ １９９３ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：９８−１０４
）またはアンチセンス（Ｅｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （１９９１）Ａｎｎｕ Ｒ
ｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０：６３１−６５２）調節における研究手段として本
発明のタンパク質をコードする配列を用いることができる。そのような技術は当
該技術分野において周知であり、そしてセンスもしくはアンチセンスオリゴマー
またはより大きいフラグメントをコーディングまたは制御領域に沿った様々な位
置から設計することができる。 本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、高レベルの所望のＫＬＫ−Ｌをコ
ードするフラグメントを発現するベクターで細胞または組織をトランスフェクシ
ョンすることにより止めることができる。そのような構築物は、翻訳できないセ
ンスまたはアンチセンス配列で細胞を充満させることができる。ＤＮＡへの組込
みなしでさえ、そのようなベクターは、全てのコピーが内因性のヌクレアーゼに
より能力を奪われるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができる。 遺伝子発現の改変は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の調節配列、す
なわち、プロモーター、エンハンサー及びイントロンにアンチセンスの分子、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡを設計することにより得ることができる。好ましくは、オリゴヌク
レオチドは、転写開始部位、例えば、リーダー配列の−１０〜＋１０の間から得
られる。アンチセンス分子はまた、転写産物がリボソームへに結合するの妨げる
ことによりｍＲＮＡの翻訳を妨げるように設計することもできる。阻害はまた、
「三重らせん」塩基対合方法論を用いて成し遂げることもできる。三重らせん対
合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く二重ら
せんの能力を弱める。三重らせんＤＮＡを用いる治療的利点は、Ｇｅｅ Ｊ Ｅ
ｅｔ ａｌ（Ｈｕｂｅｒ Ｂ Ｅ ａｎｄ Ｂ Ｉ Ｃａｒｒ（１９９４）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，
Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｍｔ Ｋｉｓｃｏ Ｎ．Ｙ．中）
により概説された。 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する酵素ＲＮＡ分子である。リボザ
イムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特的ハイブリダイゼーショ
ン及びそれに続くエンドヌクレオ分解（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断
により作用する。従って、本発明は、本発明のタンパク質をコードする配列のエ
ンドヌクレオ分解切断を特異的且つ効率よく触媒することができる工学設計した
ハンマーヘッドモチーフリボザイム分子を意図する。 あらゆる潜在的ＲＮＡ標的内の特定のリボザイム切断部位は、最初に、以下の
配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に関して標的分子を
走査することにより同定することができる。いったんこれらの部位が同定される
と、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチ
ドの間の短いＲＮＡ配列をオリゴヌクレオチドを操作不能にする可能性がある二
次構造特徴に関して評価することができる。また、候補標的の適合性は、リボヌ
クレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼ
ーションに対する利用可能性を試験することにより決定することもできる。 細胞または組織中にベクターを導入する方法には、本明細書に説明する方法、
並びにインビボ、インビトロ及びエクスビボ治療のために適当なものが包含され
る。エクスビボ治療には、ベクターは、患者から得られ同じ患者への自家移植の
ためにクローン的に増やした幹細胞中に導入することができる（米国特許第５，
３９９，４９３号及び第５，４３７，９９４号を参照）。トランスフェクション
及びリポソームによる送達は、当該技術分野において周知である。 本明細書に開示する核酸分子はまた、新しい技術がトリプレット遺伝暗号及び
特定の塩基対相互作用のような特性を包含するがこれらに限定されるものではな
い現在既知であるヌクレオチド配列の特性による場合、まだ開発されていない分
子生物学技術において用いることもできる。 本発明はまた、本発明のポリペプチドの機能を研究する方法も提供する。本発
明の核酸分子または遺伝子の発現を欠くかまたは部分的に欠く細胞、組織及び非
ヒト動物は、遺伝子中に特定の欠失または挿入突然変異を有する本発明の組換え
発現ベクターを用いて開発することができる。組換え発現ベクターはまた、相同
的組換えにより内因性遺伝子を不活性化または改変し、それにより欠損性細胞、
組織または動物を作製するために用いることができる。 ヌル対立遺伝子は、欠失突然変異により胚性幹細胞のような細胞において作製
することができる。組換え遺伝子はまた、遺伝子を不活性化する挿入突然変異を
含有するように工学設計することもできる。そのような構築物は、次に、トラン
スフェクション、電気穿孔、注入等のような技術により胚性幹細胞のような細胞
中に導入することができる。完全な遺伝子を欠く細胞は、次に、例えば、サザン
ブロッティイング、ノーザンブロッティングにより、または本明細書に記述する
方法を用いてコードされるポリペプチドの発現をアッセイすることにより同定す
ることができる。そのような細胞は、次に、本発明のポリペプチドを欠損するト
ランスジェニック非ヒト動物を作製するために胚性幹細胞に融合することができ
る。突然変異の生殖細胞系伝達は、例えば、胚性幹細胞を８細胞胚のような初期
の胚とインビトロで集め；得られた胚盤胞をレシピエントのメスに移し；得られ
た集合キメラの生殖細胞系伝達を生み出すことにより成し遂げることができる。
そのような突然変異動物は、通常は遺伝子発現に依存する、特定の細胞集団、発
生パターン及びインビボプロセスを特定するために用いることができる。 従って、本発明は、生殖細胞及び体細胞の全てがＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を
コードする遺伝子を不活性化するかまたは改変する組換え発現ベクターを含有す
るトランスジェニック非ヒト動物を提供する。ある態様として、本発明は、生殖
細胞及び体細胞の全てが、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に付随する病状をもたらす
ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする遺伝子を不活性化するかまたは改変する
組換え発現ベクターを含有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。さら
に、本発明は、本発明のＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質を発現しないトランスジェニ
ック非ヒト動物を提供する。ある態様として、本発明は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパ
ク質に付随する病状をもたらすＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質をコードする遺伝子を
発現しないトランスジェニック非ヒト動物を提供する。ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク
質病理学は、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質ホモ突然変異体に認められる表現型をさ
す。 トランスジェニック非ヒト動物には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハム
スター、イヌ、ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ、ブタ、ネコ、ヤギ及び非ヒト霊長類、好ま
しくはマウスが包含されるがこれらに限定されるものではない。 本発明はまた、（ａ）本発明のトランスジェニック非ヒト動物に作用因子を投
与すること； （ｂ）該作用因子が、作用因子を投与されていない工程（ａ）のトランスジェニ
ック非ヒト動物に対してトランスジェニック非ヒト動物において病状（例えば、
ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質に付随する病状）を減らすかまたは妨げるかどうかを
決定すること を含んでなる、ＫＬＫ−Ｌ関連タンパク質と付随する病状、好ましくはＫＬＫ−
Ｌ関連タンパク質と付随する病状を減らすかまたは妨げる因子を試験するための
モデル系を提供するトランスジェニック非ヒト動物アッセイ系も提供する。 作用因子は、本明細書において説明するように癌のような症状の処置及び予防
において有用である可能性がある。作用因子はまた、本明細書に記述するような
製薬学的組成物に導入することもできる。 本発明のタンパク質、物質、化合物、抗体、核酸分子、作用因子及び組成物の
活性は、動物実験モデル系において確かめることができる。治療効能及び毒性は
、ＥＤ_５０（５０％の集団において治療的に有効な用量）またはＬＤ_５０（５０
％の集団に致死の用量）統計値を計算することによるような、細胞培養において
または実験動物を用いて標準的な製薬学的方法により決定することができる。治
療指数は、有毒な作用に対する治療効果のある作用の用量比であり、そしてそれ
はＥＤ_５０／ＬＤ_５０比して表すことができる。大きい治療指数を示す製薬学的
組成物が好ましい。 以下の限定しない実施例は、本発明の実例となる。

【実施例】

実施例１ 材料及び方法 ヒトゲノムＤＮＡライブラリからの陽性ＰＡＣ及びＢＡＣゲノムクローンの同定 ＰＳＡ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＮＥＳ１及びＺｙｍｅ遺伝子の配列は既知であ
る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく増幅案が開発され、それはこれら
の遺伝子のそれぞれ１つに関して特異的なＰＣＲ産物の生成を可能にした。^３２
Ｐで標識されたこれらのＰＣＲ産物をプローブとして用い、約１００〜１５０Ｋ
ｂ長の陽性のクローンを同定する目的のためにヒトゲノムＤＮＡ ＰＡＣライブ
ラリ及びヒトゲノムＤＮＡ ＢＡＣライブラリをスクリーニングした。これらの
実験のための一般的戦略は他に（１４）公開されている。ゲノムライブラリをナ
イロン膜上に二重にスポッティングし、陽性のクローンを（１４）に記載されて
いる通りにサザンブロット分析によりさらに確かめた。 染色体１９上のＤＮＡ配列 Ｔｈｅ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙはヒトゲノムの配列決定プロジェクトに参加し、染色体１９の配
列決定に焦点を当てている。この染色体についての多くの配列決定の情報をｔｈ
ｅ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙのウェブサイトにおいて利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏ．
ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｅｍｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。 染色体１９ｑ１３．３−１３．４上のある領域を包含する約３００Ｋｂのゲノ
ム配列をそのウェブサイトから入手し、そこで既知のカリクレイン遺伝子を位置
決定する。この３００Ｋｂの配列はいろいろな長さの８つのコンティグ（ｃｏｎ
ｔｉｇｓ）により示される。複数の異なるコンピュータープログラムを用いるこ
とにより、図１及び図２８において劇的に示す通り、その領域のほとんど連続的
な配列を確立した。コンティグのいくつかはＤＮＡの両鎖上の領域を再構築する
ために、図１に示す通りに逆転していた。 ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ＮＥＳ１及びＺｙｍｅの公開されている配列ならびに整列
戦略を用いるコンピューターソフトウェアＢＬＡＳＴ ２を用いることにより、
連続地図上のこれらの遺伝子の相対的位置を同定した（図２８）。これらの既知
の遺伝子はさらなる研究のための証明（ｈａｌｌｍａｒｋｓ）として働いた。そ
の領域のＥｃｏＲ１制限地図もＬａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのウェブサイトにおいて利用できる。この制
限地図及びコンピュータープログラムＷｅｂＣｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｆｉｒｓｔｍａｒｋｅｔ．ｃｏｍ／ｃｕｔｔｅｒ／ｃｕｔ２．ｈｔｍｌ）を
用い、入手可能な配列の制限研究分析を行い、染色体１９に沿ったこれらのコン
ティグの指定及び相対的位置をさらに確かめた。得られた既知の遺伝子の立体配
置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）及び相対的位置を図１に示す。 遺伝子予測分析 全ゲノム領域のエキソン予測分析のために複数の異なるコンピュータープログ
ラムを用いた。すべてのプログラムを最初にＰＳＡ、Ｚｙｍｅ及びＮＥＳ１遺伝
子の既知のゲノム配列を用いて試験した。より信頼できるコンピュータープログ
ラム、ＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（遺伝子予測）、ＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（エキ
ソン予測）、Ｇｒａｉｌ２及びＧＥＮＥＩＤ−３をさらに使用するために選んだ
。 タンパク質相同性探求 新規遺伝子の推定エキソンを最初に対応するアミノ酸配列に翻訳した。推定新
規遺伝子のエキソンによりコードされるタンパク質に関するＢＬＡＳＴ相同性探
求をＢＬＡＳＴＰプログラム及びＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いて行った。 結果 染色体１９上におけるＰＳＡ、ＫＬＫ２、Ｚｙｍｅ及びＮＥＳ１の相対的位置 ヒトＢＡＣライブラリのスクリーニングはＺｙｍｅ遺伝子に関して陽性の２つ
のクローンを同定した（クローンＢＡＣ ２８８Ｈ１及びＢＡＣ ７６Ｆ７）。
これらのＢＡＣｓをＰＣＲならびにＰＳＡ、ＮＥＳ１、ＫＬＫ１及びＫＬＫ２に
関して特異的なプライマーによりさらに分析した。これらの分析は、両方のＢＡ
ＣｓがＺｙｍｅ、ＰＳＡ及びＫＬＫ２に関して陽性であり、ＫＬＫ１及びＮＥＳ
１遺伝子に関して陰性であることを示した。 ヒトＰＡＣゲノムライブラリのスクリーニングは、ＮＥＳ１に関して陽性であ
る１つのＰＡＣクローンを同定した（クローンＰＡＣ ３４Ｂ１）。さらなるＰ
ＣＲ分析は、このＰＡＣクローンがＮＥＳ１及びＫＬＫ１遺伝子に関して陽性で
あり、ＰＳＡ、ＫＬＫ２及びＺｙｍｅに関して陰性であることを示した。この情
報をその領域のＥｃｏＲ１制限地図と組み合わせると、これらの４つの遺伝子の
相対的位置を確定することができた。ＰＳＡは最も中心にあり、ＫＬＫ２、Ｚｙ
ｍｅ及びＮＥＳ１が続いた。さらにこれらの遺伝子の既知の配列を３００Ｋｂの
コンティグと整列させると、４つのすべての遺伝子の正確な位置決定及び、図１
において矢印で示す通り、転写の方向の決定が可能になった。ＫＬＫ１遺伝子配
列はこれらのコンティグのいずれの上においても同定されず、ＮＥＳ１よりさら
に末端にある（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）ようである（それがＮＥＳ１と同じＰＡＣ
上で一緒に位置決定されるから）。 新規な遺伝子の同定 問題のゲノム領域における新規な遺伝子の存在を考えるために、以下の通りに
１組の規則を用いた： １．少なくとも３つのエキソンのクラスターが見いだされねばならなかった。 ２．高い予測得点（探求プログラムにより示される「良い」又は「優れた」質）
を有するエキソンのみを推定新規遺伝子の構築のために考慮した。 ３．予測されるェキソンは、それらが少なくとも２つの異なるエキソン予測プロ
グラムによって同定された場合のみに信頼され得た。 この戦略を用いることにより、１１の推定新規遺伝子が同定され、その３つは
続く相同性分析で、前にマッピングされていない既知の遺伝子、すなわちヒト表
皮角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ）、ヒトニューロプシン及びトリプシ
ン−様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）であることが見いだされた。それらの相
対的位置を図１に示す。５つの遺伝子はすべて既知のヒトもしくは動物カリクレ
インタンパク質及び／又は他の既知のセリンプロテアーゼといろいろの相同性を
有する（図１においてＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ
４及びＫＬＫ−Ｌ５及び図２８においてＫＬＫ−Ｌ１〜ＫＬＫ−Ｌ６として描く
）。 表１〜５に、新しく同定された遺伝子のそれぞれ１つに関する予備的エキソン
構造及び部分的タンパク質配列を示す。表６に、予備的分析で推定新規遺伝子に
よりコードされるタンパク質に相同性であると思われるいくつかのタクパク質を
示す。配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、６
０、６６及び６７は、ＫＬＫ−Ｌ１〜ＫＬＫ−Ｌ６のアミノ酸配列を示し、配列
番号１、１３、２１、４３、５６及び６５はＫＬＫ−Ｌ１〜ＫＬＫ−Ｌ６をコー
ドする遺伝子の核酸配列を示す。 議論 新しく配列決定されたＤＮＡにおけるタンパク質−コード遺伝子の予測は、大
きなゲノム配列決定プロジェクトの確立の後、非常に重要になっている。この問
題は、多くの同じでない部分でコード配列を中断させている真核遺伝子のエキソ
ン−イントロン構造のために、複雑になっている。タンパク質−コードエキソン
及び全体的遺伝子構造を予測するために、複数のコンピュータープログラムが開
発された。これらのプログラムはすべて、可能的機能性シグナルと既知のタンパ
ク質−コード領域の全体的な統計的性質との組合わせに基づいている（１５）。
しかしながら、遺伝子構造予測のための最も強力な方法は、可能的機能性シグナ
ル（スプライシング部位、翻訳開始もしくは停止シグナルなど）に関する情報を
、予測されるタンパク質と既知のタンパク質群の間の相同性に関する情報と共に
、コード配列の統計的性質（コーディングポテンシャル（ｃｏｄｉｎｇ ｐｏｔ
ｅｎｔｉａｌ））と組み合わせることである（１６）。 マウス及びラットにおいて、カリクレインは大きな多重遺伝子ファミリーによ
りコードされ、これらの遺伝子は３．３〜７．０Ｋｂのような小さい距離で密集
して群になる傾向がある。ヒト染色体１９ｑ１３．１−ｑ１３．４と、カリクレ
インの遺伝子座を含むマウス染色体７の２０−ｃＭの近位部分の１７の遺伝子座
の間における遺伝子の順序（ｇｅｎｅ ｏｒｄｅｒ）の強い保存が実証されてい
る（１７）。 ヒトにおいては、数個のカリクレイン遺伝子が同定されたのみである。事実、
ＫＬＫ１、ＫＬＫ２及びＫＬＫ３（ＰＳＡ）のみがヒトカリクレイン遺伝子ファ
ミリーを示すと考えられている（９）。本明細書に記載する研究は、多数のカリ
クレイン−様遺伝子が染色体１９ｑ１３．２−ｑ１３．４当たりの３００Ｋｂの
領域内に密集している強い証拠を提供する。３つの確定されたヒトカリクレイン
（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３）、Ｚｙｍｅ及びＮＥＳ１、ならびに表皮角質
層キモトリプシン酵素、ニューロプシン及びＴＬＳＰ（トリプシン−様セリンプ
ロテアーゼ）ならびに他の５つの新規な遺伝子、ＫＬＫ−Ｌ１〜ＫＬＫ−Ｌ５は
１つの大きな遺伝子ファミリーを構成し得る。これは染色体１９のこの領域にお
けるカリクレイン又はカリクレイン−様遺伝子の合計数を１３にするであろう。 ヒト表皮角質層キモトリプシン酵素（１９）、ニューロプシン（２０）及びト
リブシン−様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）（２１）は３つの以前に特性化さ
れた遺伝子であり、カリクレイン及びセリンプロテアーゼファミリーの他のメン
バーと多くの構造的類似性を有する。しかしながらそれらは過去にマッピングさ
れていない。カリクレイン遺伝子ファミリーの領域内におけるそれらの正確なマ
ッピングは、これらの３つの遺伝子が新しく同定されたもの、あるいは既知のも
のと共に、おそらく１つの祖先遺伝子の複製に由来するファミリーを構成するこ
とを示している。これらの遺伝子のすべての相対的位置決定を図１に描く。 カリクレイン遺伝子は、古典的にキニノーゲンからリシルーブラジキニン（カ
リジン）を放出するそれらの能力により特性化されたセリンプロテアーゼのサブ
ファミリーである（１８）。しかしながらもっと最近、カリクレインを記述する
ために新しい構造的概念が生まれた。蓄積された配列データから、マウスがカリ
クレインコード配列に高い相同性を有する多くの遺伝子を有することが現在では
明らかである（１９−２０）。Ｒｉｃｈａｒｄ及び共同研究者等は、これらの遺
伝子を言うために「カリクレイン多重遺伝子ファミリー」の概念を寄せた（ｃｏ
ｎｔｒｉｂｕｔｅｄ）（２１−２２）。この定義は遺伝子産物の特定の酵素的機
能にあまり基づいておらず、それよりマウス染色体７へのその配列の相同性及び
それらの緊密な連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）に基づいている。ヒトにおいては、ＫＬ
Ｋ１のみがカリクレインの機能的定義を満たしている。ＫＬＫ２はトリプシン−
様酵素活性を有し、ＫＬＫ３（ＰＳＡ）は非常に弱いキモトリプシン−様酵素活
性を有している。ＫＬＫ２及びＫＬＫ３のこれらの活性は、前駆体から生物学的
に活性なペプチドを放出することが知られていない。より新しい定義に基づくと
、カリクレインファミリーのメンバーはカリクレイン酵素のための遺伝子のみで
なく、神経成長因子及び表皮成長因子の前駆体をプロセシングする酵素を含む他
の相同性プロテアーゼをコードする遺伝子をも含む（８）。従って、酵素カリク
レインとカリクレインもしくはカリクレイン−様遺伝子の間の明確な区別に注意
することが重要である。 研究を行う場合、「良い」又は「優れた」質を有すると予測されるエキソンの
みを考慮し、少なくとも２つの異なるプログラムによって予測されるエキソンの
みを考慮した。さらに、推定遺伝子の存在は、少なくとも３つのエキソンがその
領域において対等に（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ）密集している場合にみに考慮
した。これらの新規な遺伝子が実際に既知のカリクレイン及び他のセリンプロテ
アーゼに相同であるというさらなる証拠は、イントロン相の比較から生ずる。以
前に公開された通り（１４）、トリプシノーゲン、ＰＳＡ及びＮＥＳ１は５つの
コードエキソンを有し、その第１はイントロン相Ｉ（イントロンがコドンの第１
のヌクレオトドの後に存在する）を有し、第２はイントロン相ＩＩ（イントロン
が第２のヌクレオチド及びコドンの後に存在する）を有し、第３はインロトン相
Ｉを有し、第４はインロトン相０（イントロンがコドン間に存在する）を有する
。第５のエキソンは停止コドンを有する。予測される新規なカリクレイン−様遺
伝子のイントロン相はこれらの規則に従っており、それぞれの表に示されている
。さらなる支持は、表１〜５に示す通り、新規な遺伝子における、セリンプロテ
アーゼの触媒ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）の保存アミノ酸の
同定から生ずる。 コンピュータープログラムの精度を調べるために、ＰＳＡ、Ｚｙｍｅ及びＫＬ
Ｋ２遺伝子を含有する既知のゲノム領域を試験した。これらのプログラムの２つ
（Ｇｒａｉｌ２及びＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ）は調べた既知の遺伝子の約９５％
を検出することができた。発現配列標識配列（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＥＳＴ）との一致も、ＧｅｎｅＢｕｉｌ
ｄｅｒプログラムにおいて遺伝子構造予測のために用いることができ、これは特
に高い緊縮（例えば＞９５％相同性）においてプログラムの力を有意に向上させ
ることができた。 マウスにおいて、カリクレイン遺伝子の中の１０は偽遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｇ
ｅｎｅｓ）であると思われる（９）。 実施例２ 前立腺及び乳房組織におけるプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１ プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子の細かいマッピング及び、やはり同じ領域
にマッピングされる複数の他の相同遺伝子に対するその染色体における位置決定
を記載する。さらに、前立腺（最も高い発現を示す）の他にプロスターゼ／ＫＬ
Ｋ−Ｌ１が女性の乳房、精巣、副腎、子宮、結腸、甲状腺、脳、脊髄及び唾液腺
においても発現されることを示す広範囲の組織発現研究を行った。さらに、乳癌
細胞系ＢＴ−４７４において、遺伝子はアンドロゲン及びプロゲスチンにより上
方−調節される（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。 材料及び方法 染色体１９上のＤＮＡ配列 染色体１９に関する大きなＤＮＡ配列決定データをＴｈｅ Ｌａｗｒｅｎｃｅ
Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＬＮＬ）
のウェブサイトにおいて利用できる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ
．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。染色体１９ｑ１３．３−
１３．４上のある領域を包含する約３００Ｋｂのゲノム配列をそのウェブサイト
から入手し、そこで既知のカリクレイン遺伝子を位置決定する。この配列はいろ
いろな長さの９つのコンティグにより示される。ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ＮＥＳ１及
びプロテアーゼＭの配列ならびに整列プログラムＢＬＡＳＴ ２（３７）を用い
ることにより、連続地図上のこれらの遺伝子の相対的位置を決定した。 遺伝子予測分析 全ゲノム領域のエキソン予測分析のために複数の異なるコンピュータープログ
ラムを用いた。これらのすべてのプログラムを最初にＰＳＡ、プロテアーゼＭ及
びＮＥＳ１遺伝子の既知のゲノム配列を用いて試験した。最も信頼できるコンピ
ュータープログラム、ＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（遺伝子予測）［ｈｔｔｐ：／／
１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／−ｗｅｂｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉｌ
ｄｅｒ．ｈｔｍｌ］、ＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（エキソン予測）［ｈｔｔｐ：／
／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／−ｗｅｂｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉ
ｌｄｅｒ．ｈｔｍｌ］、Ｇｒａｉｌ２［ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎ
ｌ．ｇｏｖ］及びＧＥＮＥＩＤ−３［ｈｔｔｐ：／／ａｐｏｌｏ．ｉｍｉｍ．ｅ
ｓ／ｇｅｎｅｉｄ．ｈｔｍｌｌ］をさらに使用するために選んだ。 タンパク質相同性探求 新しく同定される遺伝子の推定エキソンを最初に対応するアミノ酸配列に翻訳
した。エキソンによりコードされるタンパク質に関するＢＬＡＳＴ相同性探求を
ＢＬＡＳＴＰプログラム及びＧｅｎｂａｎｋデータベースを用いて行った（３７
）。 発現配列標識（ＥＳＴｓ）の探求 配列相同性探求をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）上で、ＢＬＡＳＴＮアル
ゴリズム（３７）を用い、ヒトＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対して行っ
た。＞９５％相同性を有するクローンをＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌを介してＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．（３８）協
会から、及びＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ＴＩＧＲ．ＯＲＧ／ｔｄｂ／ｔ
ｄｂ．ｈｔｌｍ）から得た（表７）。クローンを増殖させ、精製し、次いで自動
化シークエンサーを用い、挿入片−フランキングベクタープライマーを用いて両
方向から配列決定した。 乳癌細胞系及び刺激実験 乳癌細胞系ＢＴ−４７４をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入した。Ｂ
Ｔ−４７４細胞をプラスチックフラスコ中で、グルタミン（２００ミリモル／Ｌ
）、ウシインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、胎児ウシ血清（１０％）、抗生物質及び
抗真菌剤が補足されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）中で密集近くまで培養した。次いで細胞を２４−ウェル組織培養
プレート中にアリコートとして入れ、５０％密集まで培養した。実験の２４時間
前に培地を、１０％木炭−ストリップト（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ
）胎児ウシ血清を含有するフェノールレッド非含有培地に変えた。刺激実験のた
めに、１００％のエタノール中に溶解された種々のステロイドホルモンを培地中
に１０^−８Ｍの最終的濃度で加えた。標準として１００％エタノールで刺激され
た細胞を含めた。細胞を２４時間培養し、次いでｍＲＮＡ抽出のために収穫した
。 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、製造者の指示に従って乳癌
細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度を分光光度測定により決定した。２μ
ｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ予備増幅システム（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ中に逆転写した。最終的容積は２０μｌであった
。新規な遺伝子の予測ゲノム構造及びＥＳＴ配列から得られる組合わされた情報
に基づき、２つの遺伝子−特異的プライマーを設計した（表８）。Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ ９６００ サーマルサイクラー上において、１μｌのｃＤＮＡ、
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭの
ＭｇＣｌ_２、２００μＭのｄＮＴＰ_５（デオキシヌクレオシドトリホスフェート
）、１５０ｎｇのプライマー及び２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌｄ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａ
ｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含有する反応混合物中でＰＣＲを行った。サ
イクリング条件はＴａｇ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの活性化のために９４
℃で９分間、続いて９４℃で３０秒間、６３℃で１分間の４３サイクル及び６３
℃で１０分間の最後の延長であった。等しい量のＰＣＲ産物を２％アガロースゲ
ル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色により視覚化した。ゲノムＤＮＡによ
る汚染を避けるために、ＲＴ−ＰＣＲのためのすべてのプライマーは少なくとも
２つのエキソンに及んだ。 ＫＬＫ−Ｌ１の組織発現 ２６種のヒト組織から単離された全ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａ
ｌｔｏ，ＣＡから購入した。組織培養実験のためにｃＤＮＡを上記の通りに調製
し、表８に記載するプライマー（配列番号５〜１２）を用いるＰＣＲ反応に用い
た。組織ｃＤＮＡを種々の希釈において増幅した。 ＰＣＲ産物のクローニング及び配列決定 ＰＣＲ産物のアイデンティティーを確証するために、それらをｐＣＲ ２．１
−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ，ＵＳＡ
）中に、製造者の指示に従ってクローニングした。自動化ＤＮＡシークエンサー
により、ベクター−特異的プライマーを用いて、挿入片を両方向から配列決定し
た。 結果 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子の同定 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４当たりの３００ＫｂのＤＮＡ配列のエキソ
ン予測戦略は、セリンプロテアーゼの構造記憶（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｍｉ
ｎｉｓｃｅｎｔ）を有する新規な遺伝子を同定した。この遺伝子の主な特徴は、
他のヒトカリクレイン遺伝子との、アミノ酸及びＤＮＡレベルにおけるその相同
性；触媒トリアド（ヒスチジン、アスパラギン酸及びセリン）の保存、エキソン
の数及びイントロン相の完全な保存であった。 ＥＳＴ配列相同性探求 遺伝子予測プログラム（上記のような）から得られる推定エキソンのヒトＥＳ
Ｔデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対するＥＳＴ配列相同性探求は、遺伝子の推定
エキソンへの＞９５％の同一性を有する５つの発現配列標識（ＥＳＴｓ）を明ら
かにした（表７）。陽性のクローンを得、挿入片を両方向から配列決定した。整
列を用いてＥＳＴ配列とコンピュータープログラムにより予測されるエキソンの
間の比較を行い、ＥＳＴ配列に従ってエキソン−イントロンスプライシング部位
の最終的選択を行った。さらに、ＥＳＴｓの多くが重なっており、データの精度
をさらに保証した。 ｋｌｋ−Ｌ２遺伝子のコード配列を配列番号１及びＧｅｎＢＡｎｋ Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ♯ＡＦ１３５０２３に示す。遺伝子のエキソンは以下の通りである：
エキソン１（９３９−９９９）；エキソン２（２２６３−２４２５）；エキソン
３（２８４７−３０９７）；エキソン４（３１８１−３３１７）；及びエキソン
５（４５８８−４７４０）。ＫＬＫ−Ｌ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号
２及び３に示す。 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子のマッピング及び染色体上の位置決定 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１配列及びＬａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで構築されたコンティグの３００Ｋ
ｂ領域内の他の既知のカリクレイン遺伝子の配列の整列は、すべての遺伝子の正
確な位置決定ならびに、図２に示すように、転写の方向の決定を可能にした。Ｐ
ＳＡ及びＫＬＫ２遺伝子の間の距離は１２，５０８ｂｐであると計算された。プ
ロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子はＫＬＫ２より２６，２２９ｂｐ末端にあり、
反対方向で転写される。ｚｙｍｅ遺伝子はプロスターゼ遺伝子より約５１Ｋｂ末
端にあり、同じ方向で転写される。ヒト表皮角質層キモトリプシン酵素遺伝子、
ニューロプシン遺伝子及びＮＥＳ１遺伝子はすべてｚｙｍｅよりさらに末端にあ
り、すべてｚｙｍｅと同じ方向で転写される。 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子の組織発現 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子を発現する組織をＲＴ−ＰＣＲにより評価
した。ｃＤＮＡｓの種々の希釈において実験を行い、発現の相対的レベルについ
てのいくつかの情報を得た。アクチンに関するＲＴ−ＰＣＲを正の標準として用
い、ＰＳＡ ｃＤＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲを組織に束縛される特異性を有する
他の正の標準として用いた。プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１に関して陽性のＥＳＴ
をＰＣＲ法のための標準として用いた。ＰＳＡ遺伝子は予想通り前立腺において
高度に発現され、やはり最近の文献報告（２４、２５）から予想される通り、乳
房及び唾液腺において比較的低い程度に発現されることが見いだされた。甲状腺
、気管及び精巣におけるＰＳＡの非常に低い発現も見いだされ、それは他者（２
６）による最近のＲＴ−ＰＣＲデータと一致する発見である。 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１の組織発現を表９及び図３にまとめる。このプロ
テアーゼは主に前立腺、精巣、副腎、子宮、甲状腺、結腸、中枢神経系及び乳房
組織において発現され、もっとずっと低いレベルで他の組織において発現される
。乳房、精巣及び前立腺組織からのＰＣＲ産物をクローニングし、それらを配列
決定することにより、ＲＴ−ＰＣＲ法の特異性をプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１に
関して確証した。乳房組織を用いた１つの例を図４に示す。クローニングされた
ＰＣＲ産物のすべてがプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１に関して報告されたｃＤＮＡ
配列と配列において同じであった。 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子のホルモン性調節 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１発現がステロイドホルモン調節下にあるか否かを
評価するために、ステロイドホルモンレセプター−陽性乳癌細胞系ＢＴ−４７４
をモデル系として用いた。図５に示す通り、標準は予想通りに働き、すなわちア
クチンはすべてのｃＤＮＡｓにおいてホルモン調節なく正に働き、エストロゲン
のみがｐＳ２遺伝子を上方−調節し、アンドロゲン及びプロゲスチンによりＰＳ
Ａ遺伝子が上方−調節された。プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１はＰＳＡに類似して
主にアンドロゲン及びプロゲスチンにより上方−調節された。この上方−調節は
用量−依存性であり、それは≧１０^−１０Ｍのステロイドホルモンレベルにおい
て明らかであった。 議論 ＫＬＫ３遺伝子は、現在利用できる最良の腫瘍マーカーに該当するタンパク質
であるＰＳＡをコードする（２４）。齧歯類にはあまり多くのカリクレイン遺伝
子があるので、ヒトにおいてこのファミリーがわずか３つの遺伝子に制限されて
いることは多少驚くべきことである。さらに最近、ＮＥＳ１（１３）及びｚｙｍ
ｅ／プロテアーゼＭ／ニューロシン（１０−１２）を含む新規なカリクレイン遺
伝子の候補がヒトにおいて発見された。既知のカリクレイン及び新しく発見され
たカリクレイン−様遺伝子は以下の類似性を共有している：（ａ）それらはセリ
ンプロテアーゼをコードする、（ｂ）それらは５つのコードエキソンを有してい
る、（ｃ）それらは互いに有意なＤＮＡ及びタンパク質相同性を共有している、
（ｄ）それらはすべてのマウスカリクレイン遺伝子が位置決定されているマウス
染色体７上のある領域に構造的に類似している領域である染色体１９ｑ１３．３
−ｑ１３．４上の同じ遺伝子座内にマッピングされる、（ｅ）それらはステロイ
ドホルモンにより調節されると思われる。プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１は同じフ
ァミリーのメンバーであり、それは、これらの共通の特性が新しく発見された遺
伝子によっても共有されているからである。 ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子の正確な位置決定及びその領域における他の遺伝子に関す
るその位置（図２）を決定した。プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１はＫＬＫ２とｚｙ
ｍｅの間にある。 Ｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（２７）は、セリンプロテアーゼ遺伝子をイントロ
ンの位置に従って５つの異なる群に分類できることを提案している。確定された
カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２及びＰＳＡ）、トリプシノーゲン及びキモト
リプシノーゲンは：（１）活性部位ヒスチジン残基のためのコドンからすぐ下流
のイントロン、（２）活性部位アスパラギン酸残基のためのコドンを含有するエ
キソンから下流の第２イントロンならびに（３）活性部位セリン残基のためのコ
ドンを含有するエキソンからすぐ上流の第３イントロンを有する１つの群に属す
る。図６においてわかる通り、プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子のゲノム体制
（ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）はこの群の遺伝子に非常に類似
している。エキソン１〜５のコード部分の長さはそれぞれ６１、１６３、２６３
、１３７及び１５３ｂｐであり、それはカリクレイン遺伝子のエキソンの長さに
近いか、又は同じであり、ＮＥＳ１（１４）、ｚｙｍｅ／プロテアーゼＭ／ニュ
ーロシン（１０−１２）及びニューロプシン（２８）遺伝子のような同じ染色体
領域における新しく発見された他の遺伝子のそれらに類似しているか、又は同じ
でもある。 感受性ＲＴ−ＰＣＲ案は、ＫＬＫ−Ｌ１酵素が前立腺組織において発現され、
それは精巣、女性の乳腺、副腎、子宮、甲状腺、結腸、脳、肺及び唾液腺を含む
他の組織においても有意な量で発現されることを明らかにした（図３及び表９）
。ＲＴ−ＰＣＲプライマーの特異性は得られるＰＣＲ産物の配列決定により確証
され、１つの例が図４に示されている（配列番号４）。乳癌細胞系ＢＴ−４７４
を用いる組織培養研究は、プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１を生産するこれらの細胞
の能力のみでなく、そのホルモン性調節もさらに確証した（図５）。 染色体１９ｑ１３．３上の相同遺伝子（ＰＳＡ、ＫＬＫ２、プロスターゼ、ｚ
ｙｍｅ及びＮＥＳ１）の群を含む興味深いテーマが現在発展している。結び付け
られたデータは、それらのすべてが前立腺及び乳房組織において発現され、それ
らのすべてがホルモン的に調節されることを示唆している。これらの遺伝子はす
べて、タンパク質分解を介して成長因子又はそれらのレセプター、あるいはサイ
トカインを調節することにより（正に、又は負に）、細胞増殖、分化又はアポプ
トシスにおいてある役割を果たすカスケード経路の一部であり得る（３０）。遺
伝子座１９ｑ１３の充実性腫瘍及び神経膠腫への連鎖（３１）も興味深く、それ
はその領域内の遺伝子のいくつかが転位により崩壊され得る可能性を向上させる
。 ＫＬＫ−１Ｌ遺伝子はセリンプロテアーゼをコードし、それはカリクレイン遺
伝子ファミリーの他のメンバーとの相同性を示し、同じ染色体位置にマッピング
される。カリクレインの多くの構造的特徴がプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１におい
て保存されている。２つの既知の遺伝子ＫＬＫ２及びｚｙｍｅの間のこの遺伝子
の正確なマッピングを示す。プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１が前立腺の他に、女性
の乳房を含む多くの組織において発現されることがさらに示されている。この遺
伝子は本明細書においてプロスターゼとも呼ばれる。乳癌細胞系を用いて、これ
らの細胞によりプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１が生産され得ること、ならびにその
発現がアンドロゲン及びプロゲスチンにより有意に上方一調節されることがさら
に示された。その領域における他の相同遺伝子（ＰＳＡ、ｚｙｍｅ及びＮＥＳ１
）に関する情報に基づくと、プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１は前立腺癌、乳癌及び
おそらく他の癌の発病及び／又は進行に含まれ得る。 実施例３ ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の同定 材料および方法 染色体１９のＤＮＡシークエンシング 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上の約３００ｋｂのヌクレオチドのシーク
エンシングデータは、ローレンス リバーモア ナショナルラボラトリー（Ｌａ
ｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（ＬＬＮＬ）のウェッブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇ
ｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）から得た。配列は異なる長さの
９連続状態であった。利用可能な配列の制限分析は、“ＷｅｂＣｕｔｔｅｒ”コ
ンピュータープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｉｒｓｔｍａｒｋｅｔ．ｃ
ｏｍ／ｃｕｔｔｅｒ／ｃｕｔ２．ｈｔｍｌ）を使用して行い、そしてこの領域の
ＥｃｏＲ１制限マップ（ＬＬＮＬウェッブサイトから利用可能）によりほとんど
連続するゲノム配列の延長物を構築した。既知のカリクレイン遺伝子の相対的位
置：ＰＳＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号＃Ｘ１４８１０）、ＫＬＫ２（Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ寄託番号＃Ｍ１８１５７）、およびザイム（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号
＃Ｕ６０８０１）を整列プログラムＢＬＡＳＴ２（３７）を利用して決定した。
新たな遺伝子同定多数のコンピュータープログラムを使用して、目的遺伝子領域
内に推定される新たな遺伝子の存在を予測した。このようなプログラムは最初に
ＰＳＡ、プロテアーゼＭおよびＮＥＳ１遺伝子の既知の遺伝子配列を使用して試
験した。最も信頼できるコンピュータープログラムＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（遺
伝子推定）（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／−ｗｅｂ
ｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉｌｄｅｒ．ｈｔｍｌ）ＧｅｎｅＢｕｉｌｄｅｒ（エキ
ソン推定）（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／−ｗｅｂ
ｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉｌｄｅｒ．ｈｔｍｌ）、Ｇｒａｉｌ２（ｈｔｔｐ：／
／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ）およびＧＥＮＥＩＤ−３（ｈｔｔｐ：／
／ａｐｏｌｏ．ｉｍｉｍ．ｅｓ／ｇｅｎｅｉｄ．ｈｔｍｌ）をさらなる使用に選
択した。発現した配列タグ（ＥＳＴ）調査推定上の新規遺伝子の予想されるエキ
ソンは、ヒトのＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対して国立バイオテクノロ
ジーセンター情報ウェッブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）でＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（３７）を使用
した相同性調査にかけた。９５％より高い相同性を持つクローンが、アラバマ州
、ハントスヴィルのリサーチジェネティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ Ｉｎｃ．）を通してＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅコンソーシアム（３８）から得
られた（表１０）。このクローンを増殖させ、精製し、そして自動化シークエン
サーで挿入物−フランキングベクタープライマーを使用して両方向からシークエ
ンシングした。ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（５’ＲＡＣＥ）ＥＳＴ配列データお
よび予想される遺伝子の構造に従い、２つの遺伝子−特異的プライマーを設計し
た（Ｒ１＆Ｒ２）（表１１）。２回のＲＡＣＥ反応（ネスティッド（ｎｅｓｔｅ
ｄ）ＰＣＲ）を、ヒト精巣の５μｌのＭａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ（商標）ｃ
ＤＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ポロ アルト、カリフォルニア
州、米国）を鋳型として用いて行った。反応混合物およびＰＣＲ条件は、製造元
の推薦に従い行った。簡単に説明すると、第１反応については変性を９４℃で５
分間、続いて９４℃で５秒間、続いて７２℃で２分間を５サイクル、次に９４℃
で５秒間、続いて７０℃で２分間を５サイクル、次に９４℃で５秒間、続いて６
５℃で２分間を３０サイクル、そしてネスティッドＰＣＲ反応については２５サ
イクル行った。 組織発現 ２６の異なるヒト組織から単離した全ＲＮＡは、カリフォルニア州のポロアル
トのクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。ｃＤＮＡは組織培養実
験用に以下に記載するように調製し、そして表１１（配列番号９〜１２、１５〜
２０）に記載するプライマーを用いてＰＣＲ反応に使用した。組織ｃＤＮＡは様
々な希釈状態で増幅した。 胸部ガン細胞系およびホルモン刺激実験 胸部ガン細胞系ＢＴ−４７４は、メリーランド州、ロックビルのアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞は、グルタミン（
２００ミリモル／リットル）、ウシインスリン（１０ｍｇ／リットル）、ウシ胎
児血清（１０％）、抗生物質および抗菌剤を補充したＲＰＭＩ培地（ギブコ（Ｇ
ｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ゲチスバーグ、メリーランド州）中で、プラスチックフラス
コ内で集密近くまで培養した。次いで細胞を２４−ウェルの組織培養プレートに
分け、そして５０％の集密度まで培養した。実験の２４時間前、培養基は１０％
の活性炭で処理したウシ胎児血清を含むフェノールレッドを含まない培地に変え
た。刺激実験には、１００％エタノールに溶解した種々のステロイドホルモンを
培養基に最終濃度１０・・Ｍで加えた。１００％エタノールで刺激した細胞を対
照として含めた。細胞を２４時間培養し、次いでｍＲＮＡ抽出のために回収した
。 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ）を製造元の指示に従い使用し
て胸部ガン細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度は分光光度的に測定した。２μｇの全
ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）前増幅系（ギブコＢＲＬ）を使用し
て第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。最終容量は２０μｌであった。新規遺伝子の推
定されるゲノム構造およびＥＳＴ配列から得た合わせた情報に基づき、２つの遺
伝子−特異的プライマーを設計し（表１１）、そしてＰＣＲは１μのｃＤＮＡ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ・、２００μＭ ｓＮＴＰｓ（デオキシヌクレオシド三リン酸）、１５
０ｎｇのプライマーおよび２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポ
リメラーゼ（ロッシュ モレキュラー システムズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ブランチバーグ、ニュージャジー州、米国）を含む
反応混合物中で、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）９６００熱循
環器で行った。サイクル条件は、ＴａｑＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを活性化
するために９４℃で９分間、続いて４３サイクルの９４℃で３０秒６３℃で１分
、そして最終延長は６３℃で１０分間であった。等量のＰＣＲ生成物を２％アガ
ロースゲルで電気泳動し、そしてエチジウムブロマイド染色により視覚化した。
ＲＴ−ＰＣＲ用のすべてのプライマーが、少なくとも２エキソンに広がり、ゲノ
ムＤＮＡによる混入を回避した。 ＰＣＲ生成物の同一性を確認するために、ＰＣＲ生成物は製造元の指示に従い
ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
カールスバーグ、カリフォルニア州、米国）にクローン化した。挿入物はベクタ
ー−特異的プライマーを使用して、自動化ＤＮＡシークエンサーで両方向からシ
ークエンシングした。 構造分析 多くの整列は、ｆｉｐ：／／ｆｉｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ／ｄｏｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／（ｃｌｕｓｔａｌｘ
ｌ．６４ｂ．ｍｓｗ．ｅｘｅ）から利用できるＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ソフトウェ
アパッケージおよびバイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＢＣＭ）、ハウストン、テキサス州、米国［ｋｉｗｉ．ｉ
ｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：８８０８／ｓｅａｒｃｈ−ｌａｕｎｃｈｅ
ｒ／ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｈｔｍｌ）から利用可能な多整列プログラムを使用して
行った。系統発生的研究は、ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ．ｗａｄｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ／ｇｅｔｍｅ．ｈｔｍｌで
利用できるＰｈｙｌｉｐソフトウェアパッケージを使用して行った。ディスタン
スマトリックス分析は、“Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ”プ
ログラムを使用して行い、そしてパルシモニー（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）分析は“
Ｐｒｏｔｐａｒｓ”プログラムを使用して行った。疎水性の研究は、ＢＣＭサー
チロウンチャープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍ
ｃ．ｅｄｕ：９９３／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈ
ｔｍｌ）を使用して行った。シグナルペプチドは“ＳｉｇｎａｌＰ”サーバー（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａ
ｌ）を使用して予想した。タンパク質構造分析は“ＳＡＰＳ”（タンパク質配列
の構造分析）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ
．ｅｄｕ：９９３／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔ
ｍｌ）を使用して行った。 結果 ゲノム配列のコンピューター分析では、４つのエキソンから成る推定上の新規
遺伝子が示された。この遺伝子は使用したすべてのプログラムにより検出され、
そしてすべてのエキソンが高い予測値を有した。推定されるエキソンのヒトＥＳ
Ｔデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対するＥＳＴ配列相同性調査では、推定される
エキソンの遺伝子に対して９５％より高い同一性を有する異なる組織に由来する
９つの発現した配列タグ（ＥＳＴ）クローンが明らかとなった（表１０）。陽性
クローンを得、そして挿入物を両方向からシークエンシングした。“ＢＬＡＳＴ
２配列”プログラムを使用して、ＥＳＴ配列を予想されたエキソンと比較し、そ
してＥＳＴ配列に従いエキソン−イントロンスプライス部位の最終選択を行った
。種々のＥＳＴ配列間の多くの重複領域の存在は、新規遺伝子の構造のさらなる
確認を可能とした。この遺伝子のコード配列を配列番号１３およびＧｅｎｅＢａ
ｎｋ寄託番号＃ＡＦ１３５０２８に示す。遺伝子の３’末端は、２つの配列決定
したＥＳＴの末端でゲノム配列には存在しないポリＡストレッチの存在により確
認された。配列決定したＥＳＴの１つにより、５’末端にさらなるエキソンの存
在が明らかとなった。このエキソンのヌクレオチド配列は、ゲノム配列と正に合
う。この遺伝子の５’末端をさらに同定するために５’ＲＡＣＥを行ったが、さ
らなる配列は得られなかった。しかし他のカリクレインの場合と同様に、さらな
に上流の非翻訳エキソン（１つまたは複数）を排除することはできなかった。Ｋ
ＬＫ−Ｌ２のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子のマッピングおよび染色体位置の決定 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子および他の既知のカリクレイン遺伝子の配列を目的領域の
３００Ｋｂ内で整列すると、図８の矢印で示すようにすべての遺伝子の正しい位
置および転写の方向を決定することが可能になる。ＰＳＡ遺伝子は、ＫＬＫ２か
ら１２．５０８塩基対（ｂｐ）離れて最も原動体に近く、そして両遺伝子が同じ
方向に転写されることが分かった（セントロメアからテロメア）。プロスターゼ
／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子は、２６，２２９ｂｐテロメアに近く、反対方向に転写さ
れ、ＫＬＫ−Ｌ２が続く。ＫＬＫ−Ｌ１とＫＬＫ−Ｌ２との間の距離は、約３５
キロベース（Ｋｂ）である。ザイム遺伝子は５，９８１ｂｐテロメアに近く、そ
してこれら３つの遺伝子は同じ方向に転写される（図８）。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の構造の特徴づけおよびそのタンパク質産物 図７に提示されるようなＫＬＫ−Ｌ２遺伝子は、第１９染色体ｑ１３．３−ｑ
１３．４上のゲノム配列の９，３４９ｂｐの領域に広がる５個のコーディングエ
キソンおよび４個の介在イントロンから形成される。エキソンの長さはそれぞれ
７３、２６２、２５７、１３４および１５６ｂｐである。イントロン／エキソン
スプライス部位（ｍＧＴ．．．．ＡＧｍ）およびそれらの隣接配列は、コンセン
サススプライス部位（−ｍＧＴＡＡＧＴ．．．ＣＡＧｍ−）に緊密に関係する（
３２）。ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の推定に基づくタンパク質コーディング領域は、３
２ｋＤａの予測される分子量をもつ推定される２９３アミノ酸のポリペプチドを
コードする８７９ｂｐのヌクレオチド配列から形成される。予測される第一エキ
ソンの位置１および２５に、２個の潜在的翻訳開始コドン（ＡＴＧ）が存在する
（番号は配列番号１３およびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１３
５０２８を指す）。第一のＡＴＧが開始コドンであろうと想定される。なぜなら
：（１）そのコドンの隣接配列（ＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧ）は、翻訳の開始のため
のコザックコンセンサス配列（ＧＣＣ Ａ／Ｇ ＣＣＡＴＧＧ）（３３）と緊密
に合致し、そして相同なザイム（ｚｙｍｅ）遺伝子のものと正確に同一であるか
らである。この開始コドンでのＮ末端の推定のシグナル配列は、他のトリプシン
様セリンプロテアーゼ（プロスターゼおよびＥＭＳＰ）に類似である（図９）。
ｃＤＮＡは、ポリＡテールの１１ｂｐ上流に配置される保存されたポリアデニル
酸化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含有する３’非翻訳領域の３２８ｂｐで（ザイ
ムのポリＡテールのものと正確に同一の位置で）終了する（１１）。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の疎水性研究は該タンパク質のＮ末端領域中に１個の疎水
性領域を示し（図１０）、仮定されるシグナルペプチドが存在することを示唆し
ている。コンピュータ解析により、２９アミノ酸のシグナルペプチドが予測され
、Ａｌａ^２９のカルボキシル端が切断部位である。ＫＬＫ−Ｌ２タンパク質の予
測される構造モチーフのより良好な特徴付けのため、それをカリクレイン多遺伝
子ファミリーの他のメンバーと整列し、（図９）、そして予測されたシグナルペ
プチド切断部位がザイム（１１）、ＫＬＫ１（１）、ＫＬＫ２（８）およびＫＬ
Ｋ−Ｌ１の予測されたシグナル切断部位と合致することが見出された。また、配
列の整列は、類推によって、Ｓｅｒ^６６のカルボキシル端の切断部位の存在を支
持し、これは図９に整列される全部の他のカリクレインの活性化ペプチドの切断
について予測された正確な部位である。興味深いことに、成熟タンパク質の開始
するアミノ酸配列（ＩＩＮＧ（Ｓ）ＤＣ）が、プロスターゼおよびエナメルマト
リックスセリンプロティナーゼ１（ＥＭＳＰ）の遺伝子中で保存されている。従
って、他のカリクレインと同様、ＫＬＫ−Ｌ２は、Ｎ末端シグナルペプチド（プ
レチモーゲン）、次いで活性化ペプチドおよび酵素ドメインを含有するプレプロ
酵素として合成されることもまたありそうである。 位置２３９のアスパラギン酸（Ｄ）の存在は、ＫＬＫ−Ｌ２が、他のカリクレ
イン（例えばＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＴＬＳＰ、ニューロプシン、ザイム、プロテ
アーゼおよびＥＭＳＰ）の大部分と同様しかし対応する位置にセリン（Ｓ）残基
を有しかつキモトリプシン様活性を有することが既知であるＰＳＡと異なる、ト
リプシン様切断パターンを所有するであろうことを示唆している（図９）。図９
中の点線を付けられた領域は、古典的カリクレイン（ＰＳＡ、ＫＬＫ１およびＫ
ＬＫ２）に特徴的しかしＫＬＫ−Ｌ２もしくはカリクレイン様遺伝子ファミリー
の他のメンバーで見出されない１１アミノ酸のループを示す（１１）。 カリクレイン多遺伝子ファミリーとの相同性 予測されたタンパク質の成熟の２２７アミノ酸配列を、「ＢＬＡＳＴＰ」およ
び「ＢＬＡＳＴ２配列」プログラムを使用して、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ
）データベースおよび既知のカリクレインに対し整列した。ＫＬＫ−Ｌ２はエナ
メルマトリックスセリンプロテイナーゼ１（ＥＭＳＰ１）遺伝子と５４％のアミ
ノ酸配列の同一性および６８％の類似性、トリプシン様セリンプロテアーゼ（Ｔ
ＬＳＰ）およびニューロプシン双方の遺伝子と５０％の同一性、ならびに、トリ
プシノーゲン、ザイムおよびＰＳＡ遺伝子とそれぞれ４７％、４６％および４２
％の同一性を有することが見出されている。複数の整列研究は、セリンプロテア
ーゼの典型的な触媒三つ組残基がＫＬＫ−Ｌ２遺伝子中で保存されており（Ｈ^１
０８、Ｄ^１５３およびＳ^２４５）、そして全部の他のカリクレインでの場合のよ
うに、十分に保存されたペプチドモチーフが触媒三つ組残基のアミノ酸残基の周
囲で見出される［すなわち、ヒスチジン（ＷＬＬＴＡＡＨＣ）、セリン（ＧＤＳ
ＧＧＰ）およびアスパラギン酸（ＤＬＭＬＩ）］ことを示す（１０、１１）。 推定の成熟ＫＬＫ−Ｌ２タンパク質中に１２のシステイン残基が存在し、それ
らの１０個は図９に整列されている全部のセリンプロテアーゼ中で保存されてお
り、そしてジスルフィド橋を形成すると期待することができる。他の２個のシス
テイン（Ｃ^１７８およびＣ^２７９）は、ＰＳＡ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２もしくはト
リプシノーゲン中に見出されないが、しかしながら、それらはプロスターゼ、Ｅ
ＭＳＰ１、ザイム、ニューロプシンおよびＴＬＳＰ遺伝子中の類似の位置で見出
され、そして付加的なジスルフィド結合を形成すると期待される。セリンプロテ
アーゼの活性部位を取り巻く２９個の「不変」アミノ酸が記述されている（３９
）。これらのうち、２６個はＫＬＫ−Ｌ２で保存されている。保存されないアミ
ノ酸の１つ（Ｐｒｏの代わりにＳｅｒ^２１０）はプロスターゼおよびＥＭＳＰ１
遺伝子中でもまた見出され、第二のもの（Ｖａｌの代わりにＬｅｕ^１０３）はＴ
ＬＳＰ遺伝子中でもまた見出され、そして第三のもの（Ｌｅｕの代わりにＶａｌ
^１７４）はプロスターゼもしくはＥＭＳＰ１遺伝子中でもまた保存されていない
。タンパク質の進化の研究によれば、これらのアミノ酸変化のそれぞれは同一群
のタンパク質への保存された進化的置換を表す（３９）。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の進化 他のセリンプロテアーゼとのＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の系統発生的関係を予測する
ため、「クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｘ」多整列プログラムを使用してカリク
レイン遺伝子のアミノ酸配列を一緒に整列し、そして近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏ
ｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）／ＵＰＧＭＡ法を使用して距離マトリックス樹を予測した
（図１０）。系統発生的解析は、古典的カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２およ
びＰＳＡ）を分離し、そしてＫＬＫ−Ｌ２をＫＬＫ−Ｌ１、ＥＭＳＰ１およびＴ
ＬＳＰとともにグループ分けした（４０、４１）。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の組織発現 表１２および図１１に示されるとおり、ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子は脳、乳腺および
精巣で主に発現されるが、しかし、より低レベルの発現が多くの他の組織中で見
出されている。ＲＴ−ＰＣＲの特異性を確かめるため、ＰＣＲ産物をクローン化
かつ配列決定した。 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子のホルモン調節 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子がステロイドホルモン調節下にあるかどうかを確かめるの
に、ステロイドホルモン受容体陽性の乳癌細胞系（ＢＴ−４７４）をモデルとし
て使用した。アンドロゲンおよびプロゲスチンによりアップレギュレートされる
ことが既知の対照としてＰＳＡを、また、エストロゲンにアップレギュレートさ
れる対照としてｐＳ２を使用した。結果は、ＫＬＫ−Ｌ２がエストロゲンおよび
プロゲスチンによりアップレギュレートされることを示す（図１２）。 卵巣組織中でのＫＬＫ−Ｌ２の発現 ＫＬＫ−Ｌ２は卵巣腫瘍中でアップレギュレート（過剰発現）されている（図
１３）。 考察 遺伝子予測のためのコンピュータプログラムおよび利用可能なＥＳＴデータベ
ースの助けを借りて、ＫＬＫ−Ｌ２（カリクレイン様遺伝子２について）と命名
された新たな遺伝子を同定した。ゲノム配列中で見出されなかった配列決定され
たＥＳＴ中の「ポリＡ」ストレッチの存在により該遺伝子の３’端を確かめ、ま
た、十分に保存されたコンセンサスのコザック配列中の開始コドンの存在により
翻訳の開始を同定した。 他のカリクレインでの場合にそうであるとおり、ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子は５個の
コーディングエキソンおよび４個の介在イントロンから構成され、そして、第二
のコーディングエキソンを除き、エキソンの長さはカリクレイン遺伝子ファミリ
ーの他のメンバーのものに匹敵する（図６）。エキソン−イントロンのスプライ
ス部位を、ＥＳＴ配列とゲノム配列を比較することにより同定し、そして、図６
に示されるとおり、コンセンサスのスプライス配列（−ｍＧＴ．．．．．．ＡＧ
ｍ−）（３２）の保存および完全に保存されたイントロン相によりさらに確認し
た。さらに、異なるエキソンに関する触媒三つ組残基の残基の位置もまた保存さ
れている（図６）。ＰＳＡおよびＨＳＣＣＥを除いた大部分の他のカリクレイン
での場合にそうであるとおり、ＫＬＫ−Ｌ２はキモトリプシンよりもトリプシン
により機能的に関係する（３４）。ＫＬＫ−Ｌ２の広範な組織発現は驚くことで
ないはずである。なぜなら、ノーザンブロット分析の代わりにより感受性のＲＴ
−ＰＣＲ技術を使用することにより、多くのカリクレイン遺伝子が、唾液腺、腎
、膵、脳および生殖系の組織（子宮、乳腺、卵巣および精巣）を包含する広範な
組織中で発現されていることが見出されたからである（３４）。ＫＬＫ−Ｌ２は
脳で高度に発現されている。別のカリクレイン、ニューロプシンもまた脳で高度
に発現されていることが見出され、そしてマウスの神経の可塑性で重要な役割を
有することが示されている（３５）。また、ザイム遺伝子は脳で高度に発現され
ており、そしてアミロイドを発生させる潜在能力を有するようである（１１）。
一緒にすれば、これらのデータは、中枢神経系におけるＫＬＫ−Ｌ２の可能な役
割を指す。 当初、各カリクレイン酵素は１個の特異的な生理学的基質を有すると考えられ
ていた。しかしながら、精製されたタンパク質がインビトロで切断することがで
きる基質の増大する数は、それらが多様な組織もしくは生理学的環境において多
様な機能を実施しているかも知れないという示唆につながっている。セリンプロ
テアーゼは、消化、組織の再建、血液凝固などに関与するタンパク質切断酵素を
コードし、そして、カリクレイン遺伝子の多くはプロペプチドの切断により活性
化されなくてはならない前駆体タンパク質として合成される。ＫＬＫ−Ｌ２の予
測されるトリプシン様切断特異性はそれを他のカリクレインの候補の活性物質に
するか、もしくは、それは線維素溶解および血液凝固で見出されるものに類似の
酵素反応の「カスケード」に関与しているかも知れない（３６）。 結論として、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの新たなメンバー、ＫＬＫ−
Ｌ２が特徴づけられた。この遺伝子はホルモン的に調節され、また、それは脳、
乳腺および精巣で主に発現されている。ＫＬＫ−Ｌ２は腫瘍マーカーとして有用
であるかも知れない。 実施例４ 材料および方法 新遺伝子発見のための戦略 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４周辺の約３００ｋｂの配列決定データは、
Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（ＬＬＮＬ）のウェブ・サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ
．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）から得られた。種々のコン
ピュータープログラムが、既に述べたように推定される新遺伝子の予測のために
使用された。 ＫＬＫ−Ｌ３ｃＤＮＡのためのＲＴ−ＰＣＲ ２６種の異なるヒト組織から単離された全ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ．ＣＡから購入された。ｃＤＮＡは下記のように調製され、そし
てＰＣＲ増幅のために使用された。プライマーセット（Ｌ３−Ｆ１およびＬ３−
Ｒ１）は、組織中の遺伝子の存在を同定するために使用され、そしてリバースプ
ライマー（Ｌ３−Ｒ１）は、遺伝子の完全ｃＤＮＡを増幅し、クローン化するた
めにその他のプライマー（Ｌ３−Ｆ２）とともに使用された。これらのプライマ
ー配列は表１３に示される（配列番号：９−１２，２４−２６）。組織ｃＤＮＡ
が種々の希釈において増幅された。 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 全ＲＮＡ２μｇが、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ予備増幅系（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
Ｒｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ中に逆転写さ
れた。最終容量は２０μｌであった。新遺伝子の予測ゲノム構造およびＥＳＴ配
列から得られる合体された情報に基づいて、２種の遺伝子特異的プライマー（Ｌ
３−Ｆ１およびＬ３−Ｒ１）が設計され（表１３，配列番号：９−１２，２４−
２６）、そしてＰＣＲが、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーマルサイク
ラーにおいて、ｃＤＮＡ１μｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５
０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、２００μＭｄＮＴＰ（デオキシヌクレオ
シド三リン酸）、プライマー１５０ｍｇおよびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａ
ｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）２．５ユニットを含有する反応混合液中で実施
された。サイクリング条件は９４℃で９分間、続いて９４℃３０秒間の４３サイ
クル、６３℃１分間、および６３℃１０分間の最終伸長であった。等量のＰＣＲ
生成物が、２％アガロースゲル上で電気泳動され、そして臭化エチジウム染色に
よって可視化された。ＲＴ−ＰＣＲのためのすべてのプライマーは、ゲノムＤＮ
Ａによる汚染を避けるために少なくとも２エクソンにわたった。 乳がん細胞系およびホルモン刺激実験 乳がん細胞系ＢＴ−４７４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入された
。細胞は、プラスチックフラスコにおいて、グルタミン（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）
、ウシ・インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、胎児ウシ血清（１０％）、抗生物質お
よび抗カビ剤を補足されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲｌ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で集密近くまで培養された。次いで、細胞は２４穴組織培
養プレート中に一定量添加され、そして５０％集密まで培養され、実験２４時間
前に培養培地は、１０％木炭−ストリップされた（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）胎児ウシ
血清を含有するフェノールレッド不含培地に変えられた。刺激実験では、１００
％エタノールに溶解された種々のステロイドホルモンが、最終濃度１０^−８Ｍに
おいて培養培地に添加された。１００％エタノールにより刺激された細胞が対照
として培養された。細胞は２４時間培養され、次いで、Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲｌ）による全ＲＮＡ抽出のために収穫された。ｃＤＮＡが調製され、
そして上記のように増幅された。対照遺伝子（ＰＳＡ、ｐＳ２およびアクチン）
は既に明細書に記述されたように増幅された。 ＰＣＲ生成物のクローニングおよび配列決定 ＰＣＲ生成物の同定を立証するために、それらがｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベク
ター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中に製造者の
指示にしたがってクローン化された。インサートは自動ＤＮＡシーケンサーによ
り、ベクター特異的プライマーを用いて両方向から配列決定された。 ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからのポジティブＰＡＣおよびＢＡＣゲノムク
ローンの同定 プライマーセットＺＩＳおよびＺＩＡＳ（表１４、配列番号：２７−４２）を
用いて生成されたＰＣＲ生成物は精製され、次いで、ランダムプライマー法（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，前出）によって^３２Ｐでラベルされ、そしてポジティブクロー
ンの同定のためにナイロン膜上に並列でスポットされたヒトゲノムＤＮＡ ＢＡ
Ｃライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして使用された。フィル
ターは、１５％ホルムアミド、５００ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、７％ＳＤＳ、１％Ｂ
ＳＡ（ｗ／ｖ）中で６５℃で一夜ハイブリダイズされ、次いで、０．１％ＳＤＳ
を含有する２Ｘ ＳＳＣ，１Ｘ ＳＳＣ，０．２Ｘ ＳＳＣにより連続して６５
℃において洗浄され、次いで、前記（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出）のようにＸ線フ
ィルムに暴露された。ポジティブクローンが得られ、選択用ＬＢ培地に塗布され
、次いで、単一クローンが一夜培養のためのＬＢブロスに移植された。ＮＥＳ１
についてポジティブなＰＡＣクローンが他に記述されるもの（１４）と類似の方
法によって同定された。ＰＡＣおよびＢＡＣライブラリーはｄｅ Ｊｏｎｇら（
４２）によって構築された。ＢＡＣおよびＰＡＣ ＤＮＡの精製は、急速アルカ
リ溶解ミニプレプ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）法によって実施されたが、これは標準Ｑ
ｉａｇｅｎ−Ｔｉｐ法の変法である。さらに、ポジティブクローンは前記（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，前出）のようにサザンブロット解析によって確認された。 ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅（５’ＲＡＣＥ） ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子のＥＳＴ配列およびコンピューター推定構造にしたがって
、２種の遺伝子特異的プライマーが設計された。２ラウンドのＲＡＣＥ反応（ネ
ストＰＣＲ）は、鋳型としてヒト精巣のＭａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ^ＴＭｃＤ
ＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）５μｌを用いて遂行された。反応混合液および条件は
製造者の推薦にしたがって選択された。ポジティブバンドは、製造者の推薦にし
たがってＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いてゲル精製された。 ゲノムＤＮＡからの他の遺伝子の遺伝子特異的増幅 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト腎臓カリクレイン（ＫＬＫ１）、ヒト小腺カ
リクレイン（ＫＬＫ２）、正常上皮細胞特異的Ｉ遺伝子（ＮＥＳＩ）、ＫＬＫ−
Ｌ１，ＫＬＫ−Ｌ２およびｚｙｍｅ遺伝子の公表された配列にしたがって、遺伝
子特異的プライマーがこれらの遺伝子の各々について設計され（表１４）、そし
てポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）に基づく増幅プロトコールを開発したが、これは
鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる特異的ＰＣＲ生成物を生成することを可能にし
た。ＰＣＲ反応は６５℃のアニーリング／伸長温度を用いることによって上記の
ように実施された。 構造解析研究 多重整列は、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗ
ａｒｅ／ｄｏｓ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／（ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｃｌｕｓｔａｌｘｌ
．６４．ｍｓｗ．ｅｘｅ）において利用できるｃｌｕｓｔａｌＸソフトウエアパ
ッケージおよびＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ
）ｓｅａｒｃｈ ｌａｕｎｃｈｅｒ（ｋｉｗｉ．ｉｍｇｅｎ．ｂｅｍ．ｔｍｃ．
ｅｄｕ：８８０８／ｓｅａｒｃｈ−ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｈｔ
ｍｌ）から得られる多重整列プログラムを用いて遂行された。系統発生的研究は
、（ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ／ｇｅｔｍｅ．ｈｔｍｌ）から得られるＰｈｙｌｉ
ｐソフトウエアパッケージを用いて遂行された。ディスタンスマトリックス解析
は、「Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ」プログラムを用いて遂
行され、そして節減解析は、「Ｐｒｏｍｐｔｅｒｓ」プログラムを用いて行われ
た。疎水性研究は、ＢＣＭｓｅａｒｃｈ ｌａｕｎｃｈｅｒプログラム（ｈｔｔ
ｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｓｅｑ−ｓ
ｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて遂行された。シ
グナルペプチドはＳｉｇｎａｌＰ ＷＷＷ ｓｅｒｖｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌ）を用いて予測され
た。タンパク質構造解析は、ＳＡＰＳ（タンパク質配列の構造解析）プログラム
（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｓ
ｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）によおて遂行さ
れた。 結果： 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４におけるヒト・カリクレイン座の隣接地図
の構築 ヒト染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４座（提案されたカリクレイン座）周辺
の配列情報は、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙウェブサイトにおいて利用できる。長さ焼く３００ｋｂの配
列が得られた。これらの配列は種々の長さのコンティグの形態において存在した
。ｃｏｎｔｉｇの制限解析研究は、種々のコンピュータープログラムを用いて実
施された。ＬＬＮＬウエブサイトにおいてまた利用できるこの領域のＥｃｏＲＩ
制限地図によって、これらのｃｏｎｔｉｇの相対的位置が、互いに関して定めら
れた。あるコンティグは重複していて、隣接するセグメントの構築を可能にした
；しかしながら、３個のギャップ（ｇａｐ）が存在した。ＧｅｎＢａｎｋデータ
ベース（３７）に対するこれらのはセグメントの＜ＢＬＡＳＴ＞解析は、２種の
古典的なカリクレイン、すなわち定義されるべきＰＳＡおよびＫＬＫ２の正確な
配置を可能にした。カリクレイン遺伝子と同族である他の新しく発見されたセリ
ンプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼＭ／ｚｙｍｅ／ニューロシン（ｎｅｕｒ
ｏｓｉｎ）（１０，１１，１２）、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＳＣＥ
）（５５）、ニューロプシン（ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ）（２８）、正常上皮細胞−
特異的１遺伝子（ＮＥＳ１）（１３）、トリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬ
ＳＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセス＃ＡＦ１６４６２３）、ＫＬＫ−Ｌ１（配列番
号：１）およびＫＬＫ−Ｌ２（配列番号：１３）が位置決定された。３００ｋｂ
ゲノム配列におけるギャップは部分的に次のように充たされた： （ａ）第１ギャップのマージン（ｍａｒｇｉｎ）は、ＫＬＫ２遺伝子の５’お
よび３’末端を含有することが分かった；このギャップは、ＫＬＫ２遺伝子（Ｇ
ｅｎＢａｎｋアクセス＃Ｍ１８１５７）のゲノム構造により充たされた。 （ｂ）第３ギャップ（ギャップはセントロメアからテロメアに対して数えられ
る）のマージンは、ｚｙｍｅ遺伝子ｍＲＮＡ配列の５’および３’末端をもつこ
とが分かった；かくしてｚｙｍｅ遺伝子に特異的な放射能標識プローブがヒトＢ
ＡＣライブラリーをスクリーニングするために使用され、そして２つのポジティ
ブクローンが得られた。制限解析、続いてサザンブロッティングが実施され、ｚ
ｙｍｅ遺伝子を含有するフラグメントが得られ、そして配列決定され、かくして
このギャップは充たされた。 （ｃ）第２のギャップ（ＫＬＫ−Ｌ１とＫＬＫ−Ｌ２の間）が、なお存在し、
そしてこの領域のＥｃｏＲＩ制限地図がその長さの近似的決定のために使用され
た（図１４）。 これらの遺伝子の相対的位置についてのさらなる支持は、ゲノムＤＮＡクロー
ンをスクリーニングするための遺伝子−特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を
行うことによって得られた。遺伝子（ＰＡＳ，ＫＬＫ２、ＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ
−Ｌ２およびｚｙｍｅ）のほとんどのセントロメア群が、１個のゲノムＢＡＣク
ローンに群がっていることが見いだされ、そして次の群（ＨＳＣＣＥ，ニューロ
プシン、ＫＬＫ−Ｌ３およびＮＥＳ１）は、図１４のデータから示されるように
、その他のクローン中に一緒に群がっていることが分かった。 ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子のクローニング ３個のエクソンから形成される推定される新遺伝子は、ゲノム配列のコンピュ
ーター解析によって予測された。予測されたエクソンは、ヒトＥＳＴデータベー
ス（ｄｂＥＳＴ）に対して配列相同性検索にかけられ、そして予測された遺伝子
と９９％相同性を示すＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセス＃ＡＡ５８３９
０８）を明らかにした。このＥＳＴが得られ、精製され、そして配列決定され、
そして配列が、予測遺伝子を含有するゲノム領域に対してＢＬＡＳＴソフトウエ
ア（３７）によって整列された。予測構造の下流のさらなるエクソンが同定され
た。遺伝子の３’末端が次のことによって証明された：（ａ）良好に保存された
領域における触媒三つ組残基のセリン残基の存在。この高度に保存されたモティ
ーフ（ＧＤＳＧＧＰ）は、常にあらゆる既知カリクレインにおける最後のエクソ
ンの最初において生じる。（ｂ）予測されたアミノ酸配列とともに枠内に存在す
る終止コドンの存在。ゲノム配列において見いだされなかったＥＳＴの末端にお
ける１９−ポリＡストレッチの存在。 遺伝子のｃＤＮＡ配列の精度を証明するために、ＰＣＲ反応が推定鋳型として
種々のヒト組織から単離されたｃＤＮＡとともに、遺伝子（Ｌ３−Ｆ２およびＬ
３−Ｒ１）の予測構造の最初と最後のエクソンについて遺伝子特異的プライマー
を用いて遂行された。期待される大きさのポジティブバンドが、精巣ｃＤＮＡか
ら単離され、そして完全に配列決定された。その配列がゲノム配列に対してＢＬ
ＡＳＴによって整列され、エクソン／イントロン境界を明瞭に定義した。遺伝子
の５’末端のさらなる特徴付けでは、５’ＲＡＣＥ反応が鋳型として精巣からの
Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを用いて行われた。これは、開始コド
ンと５’非翻訳領域を含有するさらなるエクソンの同定を可能にした。遺伝子の
全配列は、配列番号：２１（ＧｅｎＢａｎｋアクセス＃ＡＦ１３５０２６）にお
いて示され、そしてＫＬＫ−Ｌ３タンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２２お
よび２３において示される。 ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子の構造上の特徴： 図１５に示されるように、ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子は、エクソンをコードしている
５およびイントロンに介入している４から形成される、しかしながら、他のカリ
クレインと同様に、さらなる上流の非翻訳エクソンの存在を除外することはでき
ない（１４，２８）。エクソン／イントロンスプライス部位のすべては、真核生
物のスプライス部位についての共通配列に適合する（３２）。その遺伝子はさら
に、下記のように、ヒト・カリクレイン多重遺伝子ファミリーの共通の構造特性
に厳密に従う。 遺伝子の予測されるタンパク質−コーディング領域は、予測分子量２７．５ｋ
Ｄａをもつ推定アミノ酸ポリペプチドをコードしている７５３ｂｐから構成され
る。可能性のある翻訳開始コドンは、予測される第１のエクソンの位置２８にお
いて見いだされる（ヌクレオチド番号は配列番号：２１またはＧｅｎＢａｎｋア
クセス＃ＡＦ１３５０２６を指す）。このコドンは、共通Ｋｏｚａｋ配列（３３
）と良く合致しないが、それは、脊椎動物ｍＲＮＡの９７％において生じる位置
（−３’）にプリンを有し（４３）、それは、開始コドンに隣接しているｚｙｍ
ｅ遺伝子の配列とほとんど同一である。また、ほとんどのカリクレインが位置（
＋４）に共通Ｇヌクレオチドをもたないは注目されるべきである。 ヌクレオチド６８０３−６８０８（ＡＧＴＡＡＡ）は、共通ポリアデニル化シ
グナル（４４）に非常に似ていて、そして１４ヌクレオチドの空間の後に、ゲノ
ムＤＮＡ中には見いだされない１９ポリＡヌクレオチドのストレッチへと続く。
他の可能性のあるポリアデニル化シグナルは、３’非翻訳領域において識別する
ことはできず、上記モチーフが実際にポリアデニル化シグナルであるということ
を示唆している。同じポリアデニル化シグナルモチーフは、ＫＬＫ１およびＫＬ
Ｋ２遺伝子について予測された。 ＫＬＫ−Ｌ３タンパク質配列はユニークであるけれども、比較解析では、それ
がカリクレイン多重遺伝子ファミリーの他のメンバーと高度に相同であることを
明らかにした。ＫＬＫ−Ｌ３は、ＴＬＳＰ遺伝子生産物とタンパク質同一性４０
％を、そしてＫＬＫ−Ｌ２およびＫＬＫ−Ｌ１タンパク質と、それぞれ３８％お
よび３３％同一性を示す。疎水性解析では、アミノ末端領域が全く疎水性である
（図１６）ことを明らかにし、これは、この領域が他のセリンプロテアーゼに類
似するシグナル配列を保持するであろう可能性と一致する。ＫＬＫ−Ｌ３のアミ
ノ酸配列のコンピューター解析は、アミノ酸１９と２０間の切断部位を予測した
（ＧＷＡ−ＤＴ）。配列の整列（図１７）はまた、他のセリンプロテアーゼに相
同である部位において可能性のある切断部位（Ａｒｇ^２２）を明らかにした（リ
ジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）がほとんどの場合に存在する）。ＫＬＫ−Ｌ
３ポリペプチドを通して平均的に分布される数個の疎水性領域は、他のカリクレ
インおよびセリンプロテアーゼに類似して、球状タンパク質と合致している。図
１７における点を付した領域は、古典的なカリクレイン（ＰＡＳ，ＫＬＫ１およ
びＫＬＫ２）の１１−アミノ酸ループの特徴を示すが、ＫＬＫ−Ｌ３またはカリ
クレイン多重遺伝子ファミリーの他のメンバーにおいては見いだされない（１１
，４１）。 セリンプロテアーゼの活性部位周囲の２９個の「インバリアント」アミノ酸が
既に記述されている。これらの中、２６個はＫＬＫ−Ｌ３において保存されてい
る。保存されていないアミノ酸の１つ（Ｐｒｏの代わりにＳｅｒ^１６８）はまた
、プロスターゼ、ＫＬＫ−Ｌ２およびエナメルマトリックスセリンプロテアーゼ
（ＥＭＳＰ１）遺伝子において見いだされる。第２（Ｖａｌの代わりにＬｅｕ^５
８）はまた、ＴＬＳＰおよびＫＬＫ−Ｌ２遺伝子において見いだされ、そして第
３は、Ｇｌｙの代わりのＡｌａ^２６である。タンパク質進化の研究によれば、こ
れらの変化した各アミノ酸は、同じ群のタンパク質への保存された進化的変化を
表す（４５）。１２システイン残基は、推定成熟ＫＬＫ−Ｌ３タンパク質におい
て存在しており、それらの１０個は、図１７に整列されているすべてのセリンプ
ロテアーゼ中に保存されており、そしてジスルフィド架橋を形成することが期待
されるであろう。他の２個（Ｃ^１３６およびＣ^２３８）は、ＰＳＡ，ＫＬＫ１、
ＫＬＫ２もしくはトリプシノーゲンにおいて見いだされない；しかしながら、そ
れらはプロスターゼ、ＨＳＣＣＥ、ｚｙｍｅ ニューロプシンおよびＴＬＳＰ遺
伝子において類似の位置に見いだされ、そして付加的なジスルフィド結合を形成
することが期待される。 他のセリンプロテアーゼとＫＬＫ−Ｌ３遺伝子との系統発生上の関連を予測す
るために、カリクレイン遺伝子のアミノ酸配列が、「ＣｌｕｓｔａｌＸ」多重整
列プログラムを用いて一緒に整列させられ、そしてディスタンスマトリックス・
トリーが、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ法を用いて予測され
た（図１８）。系統発生的解析は、古典的なカリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２
およびＰＳＡ）を分別し、ＴＬＳＰ、ニューロプシン、ｚｙｍｅ、ＨＳＣＣＥお
よびプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１をグループとして纏めたが、これは既に公表さ
れた研究と一致する（１１，４１）。 ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子の組織発現およびホルモン調節 図１９に示されるように、ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子は、胸腺、精巣、脊髄、小脳、
気管、乳腺、前立腺、脳、唾液腺、卵巣および皮膚（後者２つの組織は図におい
て示されない）において主として発現される。低レベルの発現は、胎児脳、胃、
肺、甲状腺、胎盤、肝臓、小腸および骨髄において見られる。子宮、心臓、胎児
肝臓、副腎、結腸、脾臓、骨格筋、膵臓および腎臓では発現は見られない。ＲＴ
−ＰＣＲを立証するために、具体的に、代表的ＰＣＲ生成物がクローン化され、
そして配列決定された。図２０は、ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子がヒト乳がん細胞系ＢＴ
−４７４においてステロイドホルモンによって調節されることを示している。 （考察） ヒト・カリクレイン遺伝子座が定義され、そしてカリクレイン及び他のカリク
レイン−様遺伝子の相対的位置を表す第１の詳細な地図が構成された（図１４）
。この地図は古典的なカリクレインの位置についての以前の報告並びに放射線ハ
イブリッド及びＦＩＳＨ法（９、１４、６７）による幾つかの新規のカリクレイ
ンの適当な地図作成と一致している。しかし、この地図（図１４に示されたよう
な）のあるセグメントの長さはその領域のＥｃｏＲ１制限地図に依存しており、
大体のｋｂ単位で測定されることに注意しなければならない。更に、幾つかのカ
リクレインは現在はまだ同定されていない１種類又は複数の余分の５′エキソン
を有する可能性であるので、遺伝子間の間隔の測定値は将来僅かに変化する可能
性がある。確認された５′−未翻訳エキソンを含むカリクレインはＮＥＳＩ（１
４）、ザイム（ｚｙｍｅ）及びニューロプシン（ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ）（３５）
を含む。この地図はまた方向性であり、ＰＳＡ及びＫＬＫ２遺伝子が同一方向に
（セントロメアからテロメアに）転写され、そしてカリクレイン−様遺伝子の残
りが反対方向に転写される（図１４）ことを示している。 初期の報告はＫＬＫ１がＰＳＡ（９）に約３１ｋｂセントロメアに局在するこ
とを示した。示された地図はＰＳＡに２４ｋｂセントロメアのみ延伸し、このた
め、ＫＬＫ１は精密に局在化されなかった。従ってＫＬＫ１遺伝子の正確な位置
はまだ鎖状染色体１９配列データから規定しなければならない。この遺伝子座が
更に延伸され、そして他のカリクレイン−様遺伝子がＰＳＡの上流又はＴＬＳＰ
から下流に局在化される可能性はまだ存在する。 伝統的には、カリクレインはキニノーゲン（２）からリシル−ブラジキニン（
カリジン）を放出するそれらの能力を特徴としてもつ。ヒトにおいては、ＫＬＫ
１のみが、この「機能的な」定義に当てはまる。ＫＬＫ２及びＫＬＫ３は遺伝子
及びタンパク質の強度な構造的類似性並びに同一の染色体領域（２０）上へのこ
れらの遺伝子の密接な局在化に基づいた同一族に指定される。より最近には、カ
リクレインを説明するのに新規の構造的考え方が出現した。Ｒｉｃｈａｒｄｓと
その共同研究者はこれらの遺伝子（２０、２１）を表すために、マウスに「カリ
クレイン多重遺伝子族」の考え方を紹介した。この定義は遺伝子産物の特異的酵
素の機能に余り基礎をおかず、マウスの染色体７に対するその配列の類似性及び
その堅い結合を基礎にしている。 Ｉｒｗｉｎ等（２７）はセリン・プロテアーゼ遺伝子を前記のようなイントロ
ンの位置に従って５種類の異なる群に分類することができることを提唱した。そ
の結果は全てのカリクレイン（新規に同定されたＫＬＫ−Ｌ３遺伝子を含む）に
認められる。幾つかのより共通の構造的特徴の存在を示している。すなわち、（
１）すべての遺伝子は５個のコードするエキソン及び４個の介在イントロンから
形成される（幾つかの遺伝子は１種類又は複数の余分な５′未翻訳エキソン（２
４、３１、３５）（図２１）をもつ可能性をもつ）。（２）エキソンの長さは通
常同等である（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）。（３）イントロン相は常に保存される
（Ｉ−ＩＩ−Ｉ−０）（イントロン相の説明については図２１を参照されたい）
。（４）これらの遺伝子は明らかに非カリクレイン−様遺伝子（図１４）の介在
なしに、同一の染色体領域にクラスター集合している。従って、新規に同定され
たカリクレイン−様遺伝子（ＫＬＫ−Ｌ３）とともに、この領域に存在する最近
同定されたすべてのセリン・プロテアーゼ（ザイム、ＨＳＣＣＥ、ニュロブシン
、ＮＥＳＩ、プロテアーゼ／ＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２及びＴＬＳＰ）は、拡
大されたヒト・カリクレイン多重遺伝子族の一員と考えることができるであろう
。 染色体バンド１９ｑ１３は卵巣ガン（４６）を含む様々なヒトの固形腫瘍に非
ランダムに再配列されており、最近入手可能なデータはカリクレイン遺伝子座が
多数の悪性腫瘍に関連していることを示している。少なくとも３種類のカリクレ
イン遺伝子（ＰＳＡ、ザイム及びＮＥＳＩ）が乳ガン（１０、１３、４７、４８
）にダウンレギュレーションされ、そしてＮＥＳＩは新規の腫瘍サプレッサー遺
伝子であるように見える（２９）。更に、ＰＳＡは強力な抗脈管形成活性を示す
（４９）。幾つかのこれにのカリクレインは、凝固又はアポプトシス過程に類似
のカスケード経路に関与して、それによりタンパク分解酵素の前駆体が活性化さ
れて、次いで下流の基質に作用することが可能である。これらの活性はプロＰＳ
Ａに作用して活性化するＫＬＫ２遺伝子生産物について発見された（５０、５１
）。 拡大されたヒト・カリクレイン遺伝子族はネズミの遺伝子族と類似の員数をも
つ。幾つかのしんきの反論できないデータはこれらの遺伝子の少なくとも幾つか
は腫瘍サプレッサーとして（２９）、細胞成長の抑制的レギュレーターとして（
５２）、抗脈管形成（４９）及びアポトーシス（５２）分子として作用する可能
性を挙げた。幾つかの遺伝子族の一員の主要な診断的価値もまた、十分に確定さ
れた（２４、５４）。これらの理由により、この遺伝子族のすべてを、可能な診
断的又は予測的マーカーとして又は候補的治療標的として検討することは重要で
ある。 新規に同定されたＫＬＫ−Ｌ３遺伝子は皮膚、胸腺、中枢神経系、乳房、前立
腺及び睾丸を含む多数の組織に発現される。ＫＬＫ−Ｌ３の広範な組織発現は、
より感受性のＲＴ−ＰＣＲ法を使用することにより、多数のカリクレイン遺伝子
が広範な組織に発現されることが発現されることが発見されたので、驚くことで
はない。例えばＰＳＡ、ＫＬＫ２、前立腺／ＫＬＫ−Ｌ１及びＫＬＫ−Ｌ２は今
日、乳房及び多数の他の組織に発現することが知られている（３０、５４）。 多数の他のカリクレインと同様に、ＫＬＫ−Ｌ３はステロイドホルモンにより
しかし、アンドローゲン及びプロゲスチンによりアップレギュレーションされる
ＰＳＡ及びＫＬＫ２よりももっと複雑な様態でレギュレーションされる（７１）
。研究された乳房ガンの細胞ラインにおいて、ＫＬＫ−Ｌ３はプロゲスチン＞エ
ストローゲン＞アンドローゲンによりアツプレギュレートされるように見える（
図２０）。 実施例５ 材料および方法 染色体１９上のＤＮＡ配列および新規な遺伝子の予測 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４の近辺に存在する約３００Ｋｂのヌクレオ
チドの配列データをＬａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＬＮＬ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｅｎｏｍ
ｅ．ｈｔｍｌ）から入手して、ゲノム配列のほとんど隣接した伸長部（ａｌｍｏ
ｓｔ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）を構築した。多数種のコンピュ
ータープログラムを用いて、そのようなゲノム領域に存在すると推定される新し
い遺伝子を予測した。 発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）（ＥＳＴ）検
索 その推定した新しい遺伝子の予測されるエキソンに、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウ
エブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂ
ＬＡＳＴ／）上のＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（３７）をヒトＥＳＴデータベース
（ｄｂＥＳＴ）に対して用いた相同性検索を受けさせた。＞９５％の相同性を示
すクローンをＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．協会（３８）からＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ、Ｈｕｎｔｓｕｖｉｌｌｅ、ＡＬを通して得た。このクロー
ンを増殖させ、精製した後、インサートフランキングベクタープライマー（ｉｎ
ｓｅｒｔ−ｆｌａｎｋｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いた自動配
列決定装置で両方の方向から配列を決定した。 ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（３’ＲＡＣＥ） 前記遺伝子のＥＳＴ配列データおよび予測構造に従って、遺伝子に特異的な２
種類のプライマーを設計して、ヒト精巣のＭａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ（商標
）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）を鋳型とし
て５μｌ用いてＲＡＣＥ反応［ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ］を２回実施
した。用いた反応混合物とＰＣＲ条件は製造業者の推奨に従った。 組織発現 異なる２６種類のヒト組織から単離した全ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入
した。ｃＤＮＡを以下に記述する如く調製して、いろいろな組みのプライマーと
のＰＣＲ反応で用いた（表１５、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ ４６−５５、９−１２）
。組織ｃＤＮＡをいろいろな希釈度で増幅させた。 乳癌細胞系およびホルモン刺激実験 乳癌細胞系ＢＴ−４７４をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入した。グ
ルタミン（２００ミリモル／Ｌ）、ウシインシュリン（１０ｍｇ／Ｌ）、ウシ胎
児血清（１０％）、抗生物質および抗真菌剤を補充したＲＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をプラスチック製フラスコに
入れて、その中で細胞をほぼ密集度に到達するまで培養した。次に、その細胞を
一定分量でウエルが２４個備わっている組織培養板に移して、５０％密集度に到
達するまで培養した。実験を行う２４時間前に、前記培養培地を、炭を用いたス
トリッピングを受けさせ（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ておいたウシ
胎児血清を１０％含有していてフェノールレッドを含まない培地に変えた。刺激
実験では、いろいろなステロイド系ホルモンを１００％エタノールに溶解させて
培養培地に最終濃度が１０^−８Ｍになるように添加した。１００％エタノールを
用いた刺激を受けさせた細胞を対照として含めた。この細胞を２４時間培養した
後、収穫して、それにｍＲＮＡ抽出を受けさせた。 リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応 Ｔｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を製造業者の指示に従って
用いて、前記乳癌組織および細胞系から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの濃度を分
光光度計で測定した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）予備増幅装置（Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ）を用いて２μｇの全ＲＮＡを第一ストランドｃＤＮＡに逆転写させ
た。最終体積を２０μｌにした。新規な遺伝子に関して予測したゲノム構造およ
びＥＳＴ配列から得た情報を一緒にすることを基にして、遺伝子に特異的な２種
類のプライマー（Ｌ４−Ｆ１およびＬ４−Ｒ１、表１５のＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
４６および４７を参照）を設計した後、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サ
ーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）を用いて、ｃＤＮＡが１μ
ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）が１０ｍＭ、ＫＣｌが５０ｍＭ、ＭｇＣｌ
_２が１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシドのトリホスフェート）が２０
０μＭ、プラィマーが１５０ｎｇおよびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポ
リメタラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃ
ｈｂｕｒｇ、ＮＪ、米国）が２．５単位入っている反応混合物中でＰＣＲを実施
した。サイクリング条件（ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は、Ｔａｑ
Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメタラーゼを活性化させるための９４℃で９分間に続い
て９４℃で３０秒間と６３℃で１分間のサイクルを４３サイクルと６３℃で１０
分間の最終的な伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）であった。ＰＣＲ産物を等しい量で
用いて、これに２％アガロースゲルを用いた電気泳動を受けさせた後、それを臭
化エチジウムによる染色で可視化した。ゲノムＤＮＡによる汚染を回避する目的
で、ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーの全部に少なくとも２個のエキソンを挿入させた
（ｓｐａｎｎｅｄ）。 ＰＣＲ産物の同定を立証する目的で、それらを製造業者の指示に従ってｐＣＲ
２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ
、米国）にクローン化した（ｃｌｏｎｅｄ）。自動ＤＮＡ配列決定装置を用い、
ベクターに特異的なプライマーを用いることで、前記挿入断片の配列決定を両方
の方向から行った。 正常および悪性乳房組織 整復乳房形手術を受けた女性から正常な乳房組織を得た。Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐ
ｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐ
ｒｏｇｒａｍに参与している病院の女性患者から乳腫瘍組織を得た。前記正常な
組織および腫瘍組織を外科切除後直ちに液体窒素に入れて凍結させて、この様式
で抽出まで貯蔵した。これらの組織をドライアイス温度でハンマーを用いて微粉
砕した後、この上に記述したようにＴｒｉｚｏｌ試薬を用いてＲＮＡを抽出した
。 構造分析 ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｄｏ
ｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／［ｃｌｕｓｔａｌｘ１．６４ｂ．ｍ
ｓｗ．ｅｘｅ］で入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウエアパッケージおよび
Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）、ヒュウス
トン、ＴＸ、米国［ｋｉｗｉ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：８８０８
／ｓｅａｒｃｈ−ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｈｔｍｌ］から入手可
能なマルチプルアライメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログ
ラムを用いて、マルチプルアライメントを実施した。ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ／
ｇｅｔｍｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＰｈｙｌｉｐソフトウエアパッケージを用い
て系統発生研究を実施した。「Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ
」プログラムを用いてディスタンスマトリックス（Ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍａｔｒ
ｉｘ）分析を実施しそして「Ｐｒｏｔｐａｒｓ」プログラムを用いて節減（ｐａ
ｒｓｉｍｏｎｙ）分析を実施した。ＢＣＭサーチローンチャー（ｓｅａｒｃｈ
ｌａｕｎｃｈｅｒ）プログラム［ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．
ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３１／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃ
ｔ．ｈｔｍｌ］を用いて疎水性試験を実施した。「ＳｉｇｎａｌＰ」サーバー［
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｓｉｇｎａ
ｌ］を用いてシグナルペプチドを予測した。「ＳＡＰＳ」（蛋白質配列の構造分
析）プログラム［ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ
：９３３１／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ］
を用いて蛋白質構造の分析を実施した。 結果 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子のクローン化 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４の近辺のゲノム配列をコンピューターで解
析することで、少なくとも３個のエキソンで構成されている新規な推定遺伝子を
予測した。このような遺伝子が存在することを実験で実証する目的で、推定エキ
ソンにヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（ｄｂＥＳＴ）に対する配列相
同性検索を受けさせることで、＞９７％の相同性を示す４種類のＥＳＴクローン
を同定した（表１６）。全てのＥＳＴを睾丸組織からクローン化した。これらの
クローンを得た後、挿入断片の配列決定を両方の方向から行った。次に、配列を
コンピューターで予測した構造と比較し、そしてＥＳＴ配列に従って、イントロ
ン／エキソンスプライス部位の最終的な選択を行った。 図２２に示すように、３個のＥＳＴが前記遺伝子の予測した３個のエキソン（
エキソン３、４、５）にほとんど完全に合致し、そして１個のＥＳＴが予測した
エキソン３および５に完全に合致した。しかしながら、ＥＳＴは各々異なるエキ
ソン模様（ｅｘｏｎｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ）を伴ってさらなる上流に伸びてお
り、このことは、異なるスプライス変形（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）が
存在することを示唆している。このようなクローン配列を解釈する試みで、ある
種のＥＳＴには可能な３個全部の読み取り枠内に割り込んでいる終止コドンが存
在することが示された。この３個の共通エキソンにＧｅｎＢａｎｋのデータベー
スに対する相同性検索を受けさせることでＧｅｒｍａｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔから得たｃＤＮＡ配列であることが分かった。このクロー
ンはＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の長い形態［この形態に関しては以下に記述する］と同
じエキソン２を有するが、終止コドンを伴って終結する伸長した（ｅｘｔｅｎｄ
ｅｄ）エキソン３を有する（図２２）。このクローンを子宮組織から単離し、こ
れをソフトウエアで１９６個のアミノ酸から成る先が切り取られた蛋白質産物（
これの後に３’非翻訳領域が存在する）に翻訳させた（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）
［ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＬ０５０２２０］。 エキソン３および５に関して、遺伝子に特異的なプライマー［Ｌ４−Ｆ１およ
びＬ４−Ｒ１］を用いたＲＴ−ＰＣＲで異なる２６種類の組織からｃＤＮＡをス
クリーニング（表１５および図２２）することで、前記遺伝子が数多くの組織内
で発現することを実証した。当該遺伝子の完全構造を識別する目的で最も高いレ
ベルの発現を示した４種類の組織［唾液腺、乳腺、前立腺および精巣］（図２３
）および子宮［この組織からＥＳＴクローンＡＬ０５０２２０を単離した］を選
択した。いろいろなＥＳＴクローンで見られる上流のエキソン内に位置するフォ
ーワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）［プライマーＬ４−Ｂ
、Ｌ４−Ｄ、Ｌ４−Ｅ］（表１５および図２２）の各々と一緒に１つのリバース
プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（Ｌ４−Ｒ１）を用いていろいろ
なＰＣＲ反応を実施した。これらのＰＣＲ反応を、ＥＳＴクローンを正の対照と
して用いて、いろいろな実験条件下で実施した後、ＰＣＲ産物の配列を決定した
。これらの形態のいずれも精巣（これには３形態全部が見られる）を除いて前記
組織のいずれにも見られなかった。 プライマーＬ４−Ｒ１およびＬ４−Ｆ１を用いたＫＬＫ−Ｌ４遺伝子のＲＴ−
ＰＣＲにより、前記遺伝子は幅広く多様な組織内で発現することを確認した（図
２３）。前記組織内に存在する構造形態を得る目的で相同性試験を実施した。Ｋ
ＬＫ−Ｌ４遺伝子の予測したポリペプチドと他のカリクレインおよびカリクレイ
ン様遺伝子の全部を整列させることによる相同性で、予測した３個のエキソンの
上流に更に少なくとも２個のエキソンが存在するはずであることが示された。こ
のような３番目のエキソンの上流に位置するゲノムフラグメントに、遺伝子を予
測するさらなるコンピューター解析を受けさせることで、エキソン２を、ａ）共
通のエキソン／イントロンスプライス部位、ｂ）このエキソンの後方に位置して
いて他の公知カリクレイン全部のイントロン相と一致する保存イントロン相ＩＩ
、ｃ）このエキソンの末端部の直前に位置していて良好に保存されるペプチドモ
チーフ（以下を参照）に取り巻かれている触媒作用トリアド（ｔｒｉａｄ）（Ｈ
^７６）のヒスチジン残基の存在、ｄ）他のカリクレイン遺伝子に匹敵するエキソ
ンの長さ、を基にして識別した。また、保存されるイントロン相（相Ｉ）そして
前記エキソンの末端から匹敵する（他のカリクレインに比較して）距離の所に位
置する枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）出発コドンの存在を基にして、上流のゲノム配
列から１番目の潜在的エキソンを予測した。この予測した構造を実証する目的で
、予測した１番目のエキソン内に位置する別のフォーワードプライマー（プライ
マーＬ４−Ｘ１）（表１５および図２２）と一緒に１つのリバースプライマー（
Ｌ４−Ｒ１）を用いてＰＣＲ反応を実施した。試験を受けさせた組織から２つの
主要なＰＣＲ帯を得た、即ち予測した８１９ｂｐの帯（主要）と約６５０ｂｐの
主要でない追加的帯を得た（図２４）。この２つの帯のクローン化および配列決
定を行うことで、前記遺伝子が前記組織内に２つの主要な形態、即ち長い形態［
ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４３またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．
ＡＦ１３５０２４］と別の形態［短いＫＬＫ−Ｌ４変形と呼ぶ］（これはエキソ
ン３の内部に位置していて上流の代替スプライスドナー部位を利用し、従って２
１４ｂｐ短いｍＲＮＡ産物を作り出す）で存在することが分かった。そのような
代替スプライス部位によってコード化領域（予測した終止コドンをエキソン４の
開始点に生じさせる）の枠シフト（ｆｒａｍｅ−ｓｈｉｆｔｉｎｇ）が引き起こ
され、それによって、触媒作用トリアドのセリン残基を含有しない先の切り取ら
れた蛋白質産物がもたらされる（図２４および２５）。 長いＫＬＫ−Ｌ４形態とＥＳＴを整列させる（図２２）ことで、全てのＥＳＴ
がエキソン３の末端部から８０ｂｐ下流に位置する異なるスプライスドナー部位
を利用することが示された。このような追加的８０ｂｐはヌクレオチド位置５５
０５の所に枠内終止コドンを含有しており、それによって、より短いポリペプチ
ド産物の生成がもたらされるであろう。それらはまた位置８７０６の所に位置す
る代替ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナルも利用する
［番号はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４３またはＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．ＡＦ１３５０２４を指す］。Ｇｅｒｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅ
ｃｔから得たクローンは別のスプライスドナー部位を利用し、この部位はイント
ロン３内のさらなる下流に位置しておりそして４番目のエキソンも５番目のエキ
ソンも伴わないポリＡテールを伴って終結している。同じ終止コドン（位置５５
０５）が枠内に存在しており、従って先の切り取られた蛋白質産物が生じると予
測される（図２２）。 前記遺伝子の３’末端を得る目的で３’ＲＡＣＥ反応を実施し、そしてＰＣＲ
プライマーＬ４−Ｒ１の下流に位置する３’非翻訳領域の追加的３７５ｂｐフラ
グメントを得た。更に、プライマーＬ４−Ｆ１およびＬ４−Ｒ３（表１５および
図２２）を用いたＰＣＲ反応を実施することで、前記フラグメントは試験を受け
させた組織の全部に存在することも実証した。このフラグメントは推定ポリアデ
ニル化シグナル変形（ＴＡＴＡＡＡ）を伴って終結している。 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子およびそれの蛋白質産物の構造的特徴付け 長い形態のＫＬＫ−Ｌ４遺伝子を図２５に示す（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４３）
。ＫＬＫ−Ｌ４は５個のコード化エキソンと４個の介在イントロン（染色体１９
ｑ１３．３−ｑ１３．４上のゲノム配列の８，９０５ｂｐの領域を橋渡ししてい
る）で構成されている。このコード化領域の長さはそれぞれ５２、１８７、２６
９、１３７および１８９ｂｐである。前記遺伝子の予測蛋白質コード化領域は８
３１ｂｐで構成されており、２７７個のアミノ酸で構成されていると推定される
予測分子質量が３０．６ｋＤａの蛋白質をエンコードする（図２５）。イントロ
ン／エキソンスプライス部位（ｍＧＴ．．．．ＡＧｍ、ここで、ｍは任意の塩基
である）およびそれらのフランキング配列は共通スプライス部位配列に一致して
いる。予測した１番目のエキソンの位置４５の所に潜在的翻訳開始コドンが存在
する［番号はＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ４３を指す］。このｃＤＮＡは終止コドンから
更に下流に少なくとも３８２ｂｐ伸びており、そしてこの領域の末端部に推定ポ
リアデニル化シグナル（ＴＡＴＡＡＡ）が存在している（図２５）。 疎水性分析により、アミノ末端領域は極めて疎水性であることが実証され（図
２６）、このことは、前記領域が他のセリンプロテアーゼに類似した様式でシグ
ナル配列をつなぎ止めているであろうと言った可能性に一致している。図２６は
、また、ＫＬＫ−Ｌ４ポリペプチドの全体に渡ってむらなく分布している疎水性
領域がいくつか存在することも示しており、このことは、他のセリンプロテアー
ゼと同様に蛋白質が球形であることに一致している（１３）。ＫＬＫ−Ｌ４のア
ミノ酸配列をコンピューターで解析することで、アミノ酸２０と２１の間に開裂
部位が存在すると予測した（ＧＶＳ−ＱＥ）。他のセリンプロテアーゼとの配列
相同性を調べた結果（図２７）、別の潜在的開裂部位（Ｌｙｓ２５）が非常に近
くに存在すると予測された。他の大部分のカリクレインはアルギニンまたはリジ
ンの後方の開裂によって活性化を受ける。従って、蛋白質産物は分泌される蛋白
質である可能性が非常に高い。図２７の点線領域は、ＫＬＫ−Ｌ４にもカリクレ
インマルチ遺伝子系列の他の員にも見られない古典的なカリクレイン（ＰＳＡ、
ＫＬＫ１およびＫＬＫ２）に特徴的な１１個のアミノ酸から成るループが存在す
ることを示している（１１、１３、３５）。 ＫＬＫ−Ｌ４蛋白質のアミノ酸配列をＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４４および４５に
示す。 真核生物のセリンプロテアーゼの配列分析により、不変アミノ酸が２９個存在
することが示されている（３９）。それらの中の２８個はＫＬＫ−Ｌ４蛋白質内
に保存されそしてとりわけ他の全てのカリクレインでは残りのアミノ酸（Ｐの代
わりにＱ１８２）は保存されない（図２７）。推定成熟ＫＬＫ−Ｌ４蛋白質には
システイン残基が１０個存在する。それらは図２７に整列させたセリンプロテア
ーゼの全部に保存され、ジスルフィド橋渡しを形成すると期待される。位置２３
９の所にアスパルテート（Ｄ）が存在することは、ＫＬＫ−Ｌ４がトリプシン様
開裂パターンを示すであろうことを示唆しており、これは他のカリクレインの大
部分［例えばＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＴＬＳＰ、ニューロプシン、ザイム（ｚｙｍ
ｅ）、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）およびＥＭＳＰ］に類似しているが、
相当する位置にセリン（Ｓ）残基を有するＰＳＡとは異なり、これはキモトリプ
シン様の活性を示すことが知られている（図２７）（２、４０）。 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の地図作成および染色体位置決め ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子と他の公知カリクレイン遺伝子の配列を興味の持たれる３
００Ｋｂ領域（ヒトカリクレイン遺伝子系列の座）内で整列させることにより、
公知遺伝子全部の正確な位置決めを行うことができかつ図２８に矢印で示すよう
に転写の方向を決定することができた。ＰＳＡ遺伝子はＫＬＫ１とＫＬＫ２遺伝
子の間に位置し、ＫＬＫ２から１３，３１９個の塩基対（ｂｐ）だけ離れて位置
し、そして両方の遺伝子とも同じ方向［セントロメア（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅか
らテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の方向］で転写される。他のカリクレイン様遺
伝子は全部逆の方向で転写される。ＫＬＫ−Ｌ４はＫＬＫ−Ｌ６［ＳＥＱ．ＩＤ
．ＮＯ．６５］から１３ｋｂだけセントロメリック（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）
でありかつＫＬＫ−Ｌ５［ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．５６］に対して２１ｋｂだけよ
りテロメリック（ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）である。 カリクレインマルチ遺伝子系列との相同性 ＢＬＡＳＴアルゴリズム（３７）を用いて、ＫＬＫ−Ｌ４蛋白質（長い形態）
のアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースおよび公知のカリクレインに対し
て整列させることにより、ＫＬＫ−Ｌ４はＴＬＳＰおよびザイム遺伝子と５１％
のアミノ酸配列同一性を有し、ＫＬＫ−Ｌ２と４９％の同一性を示し、そしてＰ
ＳＡおよびＫＬＫ２遺伝子のそれぞれと４７％および４５％の同一性を示すこと
が示された。複数整列試験（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｔｕｄ
ｙ）により、セリンプロテアーゼの典型的な触媒作用トリアドはＫＬＫ−Ｌ４遺
伝子内に保存され（Ｈ^１０８、Ｄ^１５３およびＳ^２４５）そして他のカリクレイ
ン全部の場合と同様に触媒作用トリアドのアミノ酸残基の近辺に良好に保存され
るペプチドモチーフが見られることが分かっている［即ちヒスチジン（ＷＬＬＴ
ＡＡＨＣ）、セリン（ＧＤＳＧＧＰ）およびアスパルテート（ＤＬＭＬＩ）］（
図２７）（１、１１、１３、３５）。加うるに、更に図２７に示すように、ヒト
カリクレイン遺伝子系列の中で完全またはある程度保存されることが分かってい
る他の残基もいくつか存在する。ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子と他のセリンプロテアーゼ
の系統発生関連性を予測する目的で、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」複数整列プログラ
ムを用いてカリクレイン遺伝子のアミノ酸配列を一緒に整列させそしてＮｅｉｇ
ｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ方法を用いてディスタンスマトリックス
ツリー（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍａｔｒｉｘ ｔｒｅｅ）を予測した（図２９）。
系統発生分析により、ザイム、ＴＬＳＰ、ＫＬＫ−Ｌ３、ニューロプシンおよび
ＮＥＳ１遺伝子を用いてグループ分けした（ｇｒｏｕｐｅｄ）ＫＬＫ−Ｌ４と古
典的なカリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２およびＰＳＡ）を区別し、これは、以
前に公開された研究（４１）に一致しており、かつ前記グループの遺伝子は恐ら
く共通の祖先遺伝子から複製で生じるであろうことを示している。 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の組織発現およびホルモン調節 図２３に示すように、ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子は主に乳腺、前立腺、唾液腺および
精巣内に発現し、他のカリクレインの場合と同様に、他の数多くの組織内で見ら
れる発現のレベルは低い。ＲＴ−ＰＣＲ特異性を実証する目的で、ＰＣＲ産物を
クローン化して配列を決定した。 ステロイド系ホルモンレセプタに陽性の乳癌細胞系（ＢＴ−４７４）をモデル
として用いて、ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子がステロイド系ホルモン調節下にあるか否か
を実証した。アンドロゲンおよびプロゲスチンによってアップレギュレイートさ
れる（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことが知られている対照遺伝子としてＰＳＡ
を用い、そして同じ細胞系内でエストロゲンによってアップレギュレイートされ
る対照遺伝子としてｐＳ２を用いた。予備試験の結果は、ＫＬＫ−Ｌ４はプロゲ
スチンおよびアンドロゲンによってアップレギュレイートされかつより低い度合
ではあるがエストロゲンによってアップレギュレイートされることを示している
（図３０）。 乳癌組織および細胞系におけるＫＬＫ−Ｌ４の発現 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子が乳房腫瘍内に発現する度合および頻度を特徴付ける目的
で正常な３個の乳房組織と１９個の悪性乳房組織と３個の乳癌細胞系から得たｃ
ＤＮＡを用いた。これらのデータを帯強度の比較で解釈した。ＫＬＫ−Ｌ４遺伝
子の発現は、１９個の腫瘍の中の７個の腫瘍で検出されず、９個の腫瘍内で正常
組織よりも発現度合が低く、１個の腫瘍内で正常な組織に匹敵しており、そして
２個の腫瘍内で正常な組織よりも高かった。ホルモン刺激を用いないと、ＢＴ−
４７４およびＴ−４７Ｄ細胞系にＫＬＫ−Ｌ４のｍＲＮＡは検出可能な度合では
存在しなかったが、ＭＣＦ−７細胞系は陽性であった。このような予備試験の結
果は、前記遺伝子は乳房腫瘍の大部分（１６／１９）でダウンレギュレイートさ
れる（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ことを示唆している。 考察 確立されたカリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２およびＰＳＡ）、トリプシノー
ゲンおよびキモトリプシノーゲンは、（１）活性部位であるヒスチジン残基のコ
ドンの直ぐ下流に１つのイントロンが存在し、（２）活性部位であるアスパラギ
ン酸残基のコドンを含有するエキソンの下流に２番目のイントロンが存在しかつ
（３）活性部位であるセリン残基のコドンを含有するエキソンの上流に３番目の
イントロンが存在する群に属する。図３１は、ＫＬＫ−Ｌ４は上述した判断基準
に合致することを示しており、その上、ＫＬＫ−Ｌ４は染色体座１９ｑ１３．３
−ｑ１３．４上の他のカリクレイン遺伝子の直ぐ近くに位置することを示してい
る（図２８）。 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子がサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）の乳癌内でダウンレギュレ
イートされる可能性があることを示唆する前記予備的確認は驚くべきことではな
い。現在では、同じ染色体領域内に束になっているカリクレインおよびカリクレ
イン様遺伝子の多くが悪性に関係している（図２８）と言った証拠が増加してき
ている。ＰＳＡが今までのところ前立腺癌の最良マーカーである（２４）。最近
の報告により、ＰＳＡが抗脈管形成活性を示すと言った証拠が示されており、か
つそのような活性はそれがセリンプロテアーゼとして機能することに関係してい
る可能性があることも示されている（４９）。このような研究は、他のセリンプ
ロテアーゼ（酵素のカリクレインマルチ遺伝子系列の新しい員を包含）もまた潜
在的抗脈管形成活性に関して評価すべきであることを示唆していた（４９）。最
近の報告により、ｈＫ２（ＫＬＫ２遺伝子がエンコードする）は前立腺癌の別の
有用な診断マーカーに成り得ることが示唆されている（５７、５８）。ＮＥＳ１
は腫瘍抑制遺伝子になると思われている（２９）。プロテアーゼＭ遺伝子は一次
（ｐｒｉｍａｒｙ）乳房および卵巣腫瘍内で差別的に発現することが示され（１
０）、そしてヒト皮膚角質層のキモトリプティック（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ
）酵素は卵巣癌内で異常に高いレベルで発現することが示された（５９）。最近
同定された別のカリクレイン様遺伝子［ＫＬＫ−Ｌ４の近くに位置し、腫瘍に関
連して差別的に発現する遺伝子−１４（ＴＡＤＧ１４）と仮に呼ばれている］（
代替様式で切除された形態のニューロプシン、図２８を参照）は卵巣癌組織の約
６０％で過剰に発現することが確認された（５９）。また、新しく見つかった別
のカリクレイン様遺伝子であるプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１は前立腺癌に関係し
ていると推測されている（４１）。このように、広範に出版された新しい文献に
数多くのカリクレイン遺伝子がいろいろな形態のヒト癌に多重関連（ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ）していることが示唆されている。 真核細胞の核に存在するプレメッセンジャーＲＮＡから介在するＲＮＡ配列（
イントロン）を取り除くことが遺伝子発現を調節する時の主要な段階である（６
０）。ＲＮＡスプライシングは、蛋白質イソ型多様性（ｉｓｏｆｏｒｍ ｄｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）を生じさせることを可能にしかつ特殊な機能を持たせた特別な蛋
白質の発現を発生中の特定の細胞もしくは組織型に制限することを可能にする機
構を提供するものである（６０）。後生動物の５’および３’スプライス部位の
所のプレ−ｍＲＮＡ内の配列要素（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）は非
常に緩んだ共通配列を有し、高い保存を示すのはイントロンの最初と最後の２つ
の塩基（ＧＴ．．．ＡＧ）のみである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記）。このような
配列は単独ではスプライス部位選択の決定基にはなり得ない、と言うのは、同じ
であるが通常は活性を示さない共通配列を数多くの真核細胞の遺伝子のエキソン
とイントロンの両方に見ることができるからである。また、他の蛋白質ファクタ
ー（ｆａｃｔｏｒｓ）および前記スプライス部位の下流に位置する配列も関与し
ている。 カリクレインの中には複数スプライス（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｌｉｃｅ）形
態が頻繁に存在する。主要な１．６ｋｂの転写物に加えて異なるＲＮＡ種がＰＳ
Ａ遺伝子から転写される（６１）。数種の異なるＰＳＡ転写物をＲｅｉｇｍａｎ
他が記述している（７）。興味の持たれることに、そのようなクローンの１つに
は３’非翻訳領域と開放読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）
の最初の３７３個のヌクレオチドが欠如しており、終止コドンを含有する伸長エ
キソンを有し、ここに記述する如きＫＬＫ−Ｌ４のｃＤＮＡのいくつかの代替形
態に匹敵するパターンを有する（図２２）。Ｈｅｕｚｅ他は、２．１ｋｂのＰＳ
Ａ ｍＲＮＡに相当する全長ｃＤＮＡのクローン化を報告した。この形態はイン
トロン４の代替スプライシングでもたらされ、触媒活性に必須なセリン残基が欠
如している（６１）。また、Ｒｅｉｇｍａｎ他は、ヒトの腺のカリクレイン２（
ＫＬＫ２）遺伝子が代替スプライシングを受けた２つの形態は同じであることを
報告した（６２）。この組織カリクレイン遺伝子（ＫＬＫ１）の新規な転写物も
また結腸から単離された（６３）。興味の持たれることに、このような転写物に
は組織カリクレイン遺伝子が有する最初の２つのエキソンが欠如しているが、最
後の３つのエキソンは完全に保存されており、確認したパターンはＫＬＫ−Ｌ４
遺伝子のある種のＥＳＴ含有部分のそれと類似している（図２２）。最近同定さ
れたカリクレイン様遺伝子であるニューロプシンは、主要形態に加えて、代替ス
プライシングを受けた２つの形態を有することが確認された（５９、６４）。こ
こで、ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子のクローン化を記述し、そして多数種の代替ｍＲＮＡ
形態の同定を記述する。このような形態は、代替スプライシングの結果として生
じる可能性がある（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記）（イントロンのセグメントを保持
）（７）か、或は代替転写開始部位の利用で生じる可能性がある（６３）。長い
形態のＫＬＫ−Ｌ４および主要な代替スプライス変形［短いＫＬＫ−Ｌ４変形］
（図２４）は翻訳、分泌および活性化に必要な同じ５’配列を有することから、
両方のｍＲＮＡとも分泌される蛋白質をエンコードすると仮定することができる
（６１）。 長いＫＬＫ−Ｌ４と関連形態の相対的優勢度（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を
調査する目的で、いろいろな組織から得たｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させた。この
実験［ｍＲＮＡは匹敵する大きさを有し、１組のプライマーを同じ条件下で用い
る］では、一般に、ｍＲＮＡ種間の量的比較でＰＣＲを用いるのは困難であるが
、そのような比較は妥当である（６２）。試験を受けさせた５種類の正常な組織
（乳房、前立腺、精巣、唾液腺および子宮）の全部で長い形態のＫＬＫ−Ｌ４が
主要量で存在し、短い形態の発現は最小限のレベルであった（図２４）。 代替スプライシングを受けた形態の存在は悪性に関係している可能性がある。
最近の文献は、良性前立腺上皮に比較して悪性は異なる分子形態のＰＳＡを異な
る様式で発現する可能性があることを示唆している（６５）。前立腺癌とは対照
的に、良性前立腺過形成ではＰＳＡ ｍＲＮＡのスプライシングが異常に起こる
ことをＨｅｎｔｔｕ他が記述した（６６）。加うるに、転移が認めらるのに臨床
的に確認されない癌を潜在的に隠しているいろいろな前立腺組織がいろいろな形
態のＰＳＡが存在する原因になっている可能性があると言ったが仮定が最近成さ
れた（６５）。 実施例６材料および方法 染色体１９上のＤＮＡ配列 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上のヌクレオチドの約３００Ｋｂの配列デ
ータをＬａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（ＬＬＮＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／
ｇｅｎｏｍ／ｇｅｎｏｍ．ｈｔｍｌのウエブサイトから入手した。この配列は、
異なる長さの９コンティグの形であった。制限酵素分析、長ＰＣＲ戦略、次いで
ＤＮＡ配列決定、ＢＡＣおよびＰＡＣライブラリースクリーニングおよび選択し
たクローンの末端配列決定を、完全なヒトカリクレイン遺伝子座を表す隣接ゲノ
ム領域を構築するために使用した。新規の遺伝子の同定 関係がある隣接ゲノム領域内の推定新規遺伝子の存在を予測するために、多数
のコンピュータープログラムを使用した。新規遺伝子予測のためのこれらのプロ
グラムの能力は、第一に試験パラメーターとして既知のカリクレインのゲノム配
列を使用して検討した。最も信頼できるコンピュータープログラム；ＧｅｎｅＢ
ｕｉｌｄｅｒ（遺伝子予測）（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ
．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉｌｄｅｒ．ｈｔｍｌ）、ＧｅｎｅＢ
ｕｉｌｄｅｒ （エキソン予測）（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｅ
ｎｒ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｇｅｎｅｂｕｉｌｄｅｒ．ｈｔｍｌ）
、Ｇｒａｉｌ ２（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｂｉｏ．ｏｍｌ．ｇｏｖ）およびＧＥ
ＮＥＩＤ−３（ｈｔｔｐ：／／ａｐｏｌｏ．ｉｍｉｍ．ｅｓ／ｇｅｎｅｉｄ．ｈ
ｔｍｌ）を以後の使用のために選定した。発現された配列タグ（ＥＳＴ）サーチ 推定新規遺伝子の予測されたエキソンは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウエブサバー（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）上
でヒトＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対してＢＬＡＳＴＩＮアルゴリズム
（３７）を用いる相同性サーチにかけた。相同性＞９５％を有するクローンが、
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ．
を通じてＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（３８）から入手された。このク
ローンを増殖、精製および挿入近接ベクタープライマーを用いて自動配列決定装
置により両方向から配列決定した。ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ） 遺伝子のＥＳＴ配列および予測された構造について、遺伝子特異性プライマー
２組を５’および３’ＲＡＣＥ反応のために設計した。ＲＡＣＥ反応（ネスト（
ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ）の２ラウンドは、ヒト睾丸および前立腺の５μｌ Ｍａ
ｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ^ＴＭｃＤＮＡおよび鋳型としてプロステート（ｐｒｏ
ｓｔａｔｅ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い
てＲＡＣＥの個々のタイプに対して行なった。反応混合物およびＰＣＲ条件は、
メーカーの推奨に従って整列した。要約すると、最初の変性は、５分間、９４℃
、次いで、９４℃で５秒間および７２℃で２分間の５サイクル、次いで９４℃で
５秒間および７０℃で２分間の５サイクル、次いで９４℃で５秒間、６５℃で２
分間の３０サイクルを第一反応に対して、そしてネストしたＰＣＲ反応に対して
２５サイクルを行なった。組織発現 ２６種の異なるヒトから単離された全ＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡから購入した。ｃＤＮＡは、組織培養実験に対して以下に記載の
ようにして調製し、そしてＰＣＲ反応のために使用した。すべての既知のカリク
レイン遺伝子を整列した後、２種のプライマー（ＫＬＫ−Ｌ５−Ｒ１およびＫＬ
Ｋ−Ｌ５−Ｆ１）（表１７、配列番号６１〜６４、９〜１２および図３２）を比
較的低い相同性の場所から設計した。組織ｃＤＮＡは、種々の希釈度で増幅した
。カリクレイン間の高い相同性のため、および非特異性増幅を除外するために、
ＯＣＲ産物をクローニングして配列決定した。正常および悪性乳房組織 正常な乳房組織は、乳房減量手術を受けた女性から入手した。乳がん組織は、
Ｏｎｔａｒｉｏ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍの協力病院の女性患者から入手した。正常およ
びガン組織を外科手術後液体窒素中で直ちに冷凍し、そして抽出するまでそのま
ま保存した。液体窒素中で組織をハンマーを用いて粉砕し、そしてＲＮＡをＴｒ
ｉｚｏｌ試薬を用いて以下に記載のようにして抽出した。乳房および前立腺ガン細胞株およびホルモン刺激実験 乳がん細胞株ＢＴ−４７４およびＴ−４７Ｄ、およびＬＮＣａＰ前立腺ガン細
胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（
ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入した。細胞をＲＰＭＩ培地（Ｇ
ｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）内で、グルタミン（２０
０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ウシインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、ウシ胎児血清（１０％）
、抗生物質および抗真菌剤を補足し、プラスティックフラスコ内で集密の近くま
で培養した。次いで細胞を２４ウエル組織培養プレート内に配置し、そして５０
％集密まで培養した。実験の２４時間前に、培養培地を、１０％活性炭精製ウシ
胎児血清を含みフェノールレッドを含まない培地に交換した。刺激実験のために
、１００％エタノール中に溶かした種々のステロイドホルモンを最終濃度１０^−
８Ｍに培地内に加えた。１００％で刺激した培地を対照として含めた。細胞を２
４時間培養し、次いでｍＲＮＡ抽出のために採取した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） 全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用い、メーカーの指示
に従って細胞株または組織から抽出した。ＲＮＡ濃度は、分光分析で測定した。
全ＲＮＡの２μｌをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐ^ＴＭ 前増幅システム（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡ内に逆転写した。最終体積は２０μｌであった
。新規遺伝子の予測ゲノム配列およびＥＳＴ配列から得た総合情報に基づいて、
２種の遺伝子特異性プライマーを設計し（ＫＬＫ−Ｌ５−Ｆ１およびＫＬＫ−Ｌ
５−Ｒ１）（表１７）、そしてｃＤＮＡ １μｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴ
Ｐ（三リン酸デオキシヌクレオシド）、プライマー１５０ｎｇおよびＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ，ＵＳＡ）２．５単位を含む反応混
合物内で、パーキンエルマー９６００サーマルサイクルを用いて行なった。サイ
クリング条件は、Ｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの活性化のために９４
℃で９分間、次いで９４℃で３０秒間、６３℃で１分間の４３サイクルおよび最
後に６３℃で１０分間の段階であった。ＰＣＲＥ産物の等量を２％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、そしてエチジウムブロミド染色で可視化した。ＲＴ−ＰＣＲ
のためのすべてのプライマーをゲノムＤＮＡによる汚染を防ぐために少なくとも
２エキソンをスパンした。 ＰＣＲ産物の同定を確認するために、これらをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、メーカ
ーの指示に従ってクローニングした。挿入物は、自動配列決定装置によりベクタ
ー特異性プライマーを用いて両方向から配列決定した。 構造解析 下記で入手できるＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ソフトウエア：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．
ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｄｏｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／
ｃｌｕｓｔａｌｘ／（ｃｌｕｓｔａｌｘ１．６４ｂ．ｍｓｗ．ｅｘｅ）およびＢ
ａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ），Ｈｏｕｓｔ
ｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ（ｋｉｗｉ．ｉｍｇｅｎ．ｂｅｍ．ｉｍｃ．ｅｄｕ：８８０
８／ｓｅａｒｃｈ−ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｌａｕｎｃｈｅｒ／ｈｔｍｌ）を用いて
多重整列プログラムを用いて多重整列を行なった。系統発生学的研究は、ｈｔｔ
ｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄ
ｕ／ｐｈｙｌｉｐ／ｇｅｔｍｅ．ｈｔｍｌから入手できるＰｈｙｌｉｐソフトウ
エアパッケージを用いて行なった。距離マトリックス解析は、「Ｎｅｉｇｈｂｏ
ｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ」を用いそしてパーシモニー（Ｐａｒｓｉｍｏ
ｎｙ）解析は、「Ｐｒｏｔｐａｒｓ」プログラムを用いて行なった。疎水性研究
は、ＢＣＭサーチローンチャープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ．ｉｍｇｅｎ
．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ．９３３１／ｓｅｑ．ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐ
ｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて行なった。シグナルペプチドは、［Ｓｉｇｎ
ａｌＰ］サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉ
ｃｅｓ／ｓｉｇｎａｌ）を用いて行なった。タンパク質構造解析は、”ＳＡＰＳ
”（タンパク質配列の構造解析）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ／ｉｍｇｅ
ｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／９３３１／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕ−ｐ
ｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ）を用いて行なった。結果 ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の同定 関係するゲノム領域のコンピューター解析（染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．
４の周囲３００Ｋｂ）は、少なくとも３個のエキソンを含んでなる推定遺伝子を
予測した。ヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースのスクリーニングは、予想
エキソンを９９％相同性でＥＳＴクローン（ジーンバンクアクセション番号３９
４６７９）を明らかにした。クローンを入手し、精製および配列決定した。ＥＳ
Ｔの全長配列を推定新規遺伝子を含むゲノム領域と比較し、イントロンにより分
離された一定領域（エキソン）と１００％相同であることが分かった。この整列
は、新規遺伝子が７エキソンを含んでなることを示す。配列相同性の比較および
系統発生学的解析は、この新規の遺伝子が構造的に既知のカリクレインおよびそ
の他のプロテアーゼと類似していることを明らかにした（下記参照）。４種の新
規のカリクレイン遺伝子がこの領域内で発見されたので、この遺伝子はＫＬＫ−
Ｌ５と命名した（カリクレイン様遺伝子５として）。３個の可能なリーディング
フレーム内のコーディング領域を翻訳することを試みて、リーディングフレーム
中の１個のみが、インフレーム終止コドンを破壊することなく全長ポリペプチド
鎖を産生することが分かった。さらにこのリーディングフレームの正しさの支持
は、このフレームがセリンプロテアーゼ活性（触媒性三つ組）に必要な３個のア
ミノ酸残基およびその周囲にモチーフを保存することを証明して得られた。イン
フレームメチオニン開始コドンは、第二エキソン内に認められた。この開始コド
ンは、代表的なコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）内に入る（
３３）。従って、遺伝子は、他のカリクレイン様遺伝子と同様に少なくとも５’
非翻訳エキソンを有する〔例えばｚｙｍｅ、正常な外皮細胞特異性１遺伝子（Ｎ
ＥＳ１）（１４）、およびｎｅｕｒｏｐｓｉｎ（３５）〕。５’および３’ＲＡ
ＣＥ反応を遺伝子の５’および３’末端を得るために行なった。５’ＲＡＣＥで
はこれ以上の配列は得られなかった。しかし、３’ＲＡＣＥは、遺伝子の３’非
翻訳領域の同定を可能とした。追加の配列は、ゲノム構造内には存在しなかった
ポリーＡ延伸部分で終止し、これで遺伝子の３’の末端およびポリＡ−テイルの
開始を標識する。ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子のスプライス変種 ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子と他のカリクレインとの相同性解析は、追加の３’エキソ
ンの存在を明らかにし、これはカリクレイン多重遺伝子ファミリーの他のもので
は報告されていない所見である。さらに、２種の異なるＰＣＲバンドが３’ＲＡ
ＣＥを用いて得られた。これらのバンドの配列決定は、この遺伝子が少なくとも
２個のスプライス形をその３’末端で有することを明らかにした。最終エキソン
が単独隣接断片である一つの形および最終エキソンが２個のエキソンに分割され
介在するイントロンを有する別の形である。遺伝子の他の可能なスプライス変種
の全構造を同定するために、２種のプライマー（Ｌ５−Ｆ２およびＬ５−Ｒ２）
（表１７および図３２）を用いてＰＣＲを行なった。２６種の異なる組織からの
ｃＤＮＡを鋳型として使用しそして反応は種々の実験条件下で行なった（アニー
リング温度、ＭｇＣｌ２濃度）。３種の明瞭なバンドが多くの組織で観察された
。これらのバンドを切除、ゲル精製および配列決定した。図３２に示すように、
ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子は、３種の分子形を有することが認められた。 １）一つの形（以後は、「クラシカル」形と呼ぶ）は、５個のコーディングエ
キソンおよび４個の中間イントロンを有する代表的なカリクレイン様セリンプロ
テアーゼである（図３２）。ある種の他のカリクレインと同様に、５’非翻訳エ
キソンも存在し、そして別の上流側の非翻訳エキソンの可能性も排除できない。
エキソン１、２および３は、上記のＥＳＴで示される。開始コドンは、第二エキ
ソン（数字は、配列番号５６またはジーンバンクアクセッション番号ＡＦ１３５
０２５に対応する）内に存在する。終止コドンは、第６エキソン中に位置し、次
いで３’非翻訳領域、および代表的なポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）
がポリ−Ａ−テイルの１６ｂｐ前に位置する（図３３）。このＫＬＫ−Ｌ５の形
は、染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上の５，８０１ｂｐのゲノム長さをスパ
ンする。エキソンのコーディング領域の長さは、それぞれ３７、１６０、２６０
、１３４および１５６ｂｐである（図３３および３４）。予測されたタンパク質
コーディング領域は、７４７ｂｐを形成し、予測分子量２６．７ｋＤａを有する
誘導２４８−アミノ酸タンパク質をコードする。イントロン／エキソンスプライ
ス部位（ＧＴ．．．ＡＧ）およびこれらの近接配列は、コンセンサススプライス
部位配列と合致する。 ２）ＫＬＫ−Ｌ５関連タンパク質−１をコーディングする第二のｍＲＮＡ形は
、最後のエキソンが２個の別のエキソンに分割され、イントロンが介在する別の
スプライスされた形である（図３２）。最終エキソンのこのスプリットは、位置
９，４７８における他の終止コドンの使用をもたらし、従って、「クラシカル」
ＫＬＫ−Ｌ５形よりもアミノ酸６個長い誘導２５４アミノ酸タンパク質を創成し
、そのカルボキシ末端は、１９アミノ酸が配列中で異なる（図３２）。この変種
は、予測された分子量の２７．１ｋＤａを有する（塩基の番号付けに関しては配
列番号５６およびジーンバンクアクセッション番号ＡＦ１３５０２５号参照）。 ３）ＫＬＫ−Ｌ５関連タンパク質−２をコーディングする第三のｍＲＮＡ形は
、第４のエキソンがない他はクラシカルフォームに類似している（図３２）。こ
れは、コーディング領域のフレームシフトに導き、そして早すぎるインフレーム
終止コドンは、位置９．１８０に存在する。この形のタンパク質コーディング領
域は、３３６ｂｐからなり、分子量１２ｋＤａを有する予測された１１１アミノ
酸タンパク質をコードする。このタンパク質は、セリンプロテアーゼの特徴であ
るセリンおよびアルパラギン残基を欠失する。クラシカルＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の構造解析 図３５は、ＫＬＫ−Ｌ５とプロテアーゼ特異性抗原（ＰＳＡ）タンパク質の比
較疎水性分析を示す。両方の遺伝子のアミノ末端領域は、かなり疎水性であり、
ＫＬＫ−Ｌ５のこの領域が多分ＰＳＡに類似するシグナルペプチドを内包するで
あろうことを示す。図３５は、ＫＬＫ−Ｌ５ポリペプチド内の数種の均等に分布
した疎水性領域も示し、これは他のセリンプロテアーゼに類似する球形タンパク
質と一致する（１３）。図３６は、ＫＬＫ−Ｌ５タンパク質と他の同じファミリ
ー内の１０成員との整列を示す。図３６内の点線部分は、クラシカルヒトカリク
レインの１１アミノ酸特性ループ（ＰＳＡ、ｈＫ１およびｈＫ２）を示すが、し
かしこれはＫＬＫ−Ｌ５タンパク質又は他のカリクレイン多重ファミリーの成員
には認められない（１１、１３、１５）。カリクレインセリンプロテアーゼの配
列解析は、２９個の不変のアミノ酸の存在を示す（３９）。これらの内２８個は
、ＫＬＫ−Ｌ５ポリペプチドに変化しそして残りのアミノ酸（Ｐの代わりにＳ１
５６）は、すべの他のカリクレインのなかで保存されない（図３６）。システイ
ン残基２０個が推定ＫＬＫ−Ｌ５タンパク質内に存在し、これらの内１０個はす
べてのカリクレイン内で保存され、そして残りの２個（Ｃ１３３およびＣ２３５
）は、たのカリクレインの大部分内に存在するが、しかしクラシカルカリクレイ
ン内には存在せず、これらが追加の２硫化物架橋を構成する（図３６）。 位置１９４におけるアスパラギン酸（Ｄ）の存在は、ＫＬＫ−Ｌ５がトリプシ
ン様の開裂パターンを有することを示唆し、他のカリクレイン（例えばｈＫ１、
ｈＫ２、ＴＬＳＰ、ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ、ｚｙｍｅ、ｐｒｏｓｔａｓｅ、および
ＥＭＳＰ）の大部分と類似するが、しかしＰＳＡとは異なり、これは相当する位
置にセリン（Ｓ）残基を有し、そしてキモトリプシン様活性を有するとして知ら
れている（図３６）（５４）。カリクレイン多重遺伝子ファミリーの他の成員との相同性 ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子によりコードされるタンパク質は独特であるけれども、こ
れは他のカリクレイン様遺伝子と高度の相同性を有する。ＫＬＫ−Ｌ５タンパク
質（クラシカル形）は、ｎｅｕｒｏｐｓｉｎと４８％のアミノ酸配列一致および
５７％の総合類似性、正常な外皮細胞特異性１遺伝子産物（ＮＥＳ１）と４６％
の一致、およびＰＳＡおよびｈＫ２ タンパク質と３８％の一致を有する。多重整列は、セリンプロテアーゼの代表的
な三つ組は、ＫＬＫ−Ｌ５タンパク質で保存されることを示す（Ｈ^６２、Ｄ^１０
８およびＳ^２００）（図３３および３６）。さらに、良く保存されたペプチドモ
チーフは、他のセリンプロテアーゼの場合と同様に触媒三つ組のアミノ酸残基の
周囲に発見される〔例えばヒスチジン（ＶＬＴＡＡＨＣ）、セリン（ＧＤＳＧＧ
Ｐ）、およびアスパラギン酸（ＤＬＲＬＬ）〕（１１、１２）（図３６）。図３
６は、またカリクレインとカリクレイン様タンパク質の間で良く保存される他の
アミノ酸残基を示す。ＫＬＫ−Ｌ５タンパク質と他のセリンプロテアーゼとの系
統発生学的関連性を予測するために、カリクレインタンパク質のアミノ酸配列を
＃Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ”多重整列プログラムを用いて一緒に整列し、そして距離
マトリックスをＮｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡおよびＰｒｏｔ
ｐａｒｓパーシモニー法を用いて予測した。図３７は、クラシカルカリクレイン
（ｈＫ１、ｈＫ２およびＰＳＡ）およびＮＥＳ１を有するクラスター化ＫＬＫ−
Ｌ５およびｎｅｕｒｏｐｓｉｎタンパク質のセリンプロテアーゼから遠い別の群
への分離を示し、これは以前の公開された研究（２７、４１）と一致し、そして
この遺伝子の群が、多分共通の先祖遺伝子から遺伝子重複により発生したことを
示す。ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の組織発現およびホルモン調節 図３８に示すように、遺伝子は第一に唾液腺、胃、子宮、気管、前立腺、胸腺
、肺、直腸、脳、胸および甲状腺に最初に発現するが、他のカリクレインと同様
に低レベルの発現は、一部の他の組織（睾丸、膵臓、小腸、脊髄）にのみ見られ
る。ＲＴ−ＰＣＲ特異性を確認するために、ＰＣＲ産物をクローニングして配列
決定した。遺伝子の３種のスプライス形がこれら組織の大部分で発現された。し
かし、各形の相対頻度は、組織毎に異なっていた（図３８）。 ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子がステロイドホルモンの制御下にあるかどうかを研究する
ために、２種の乳がん細胞株（ＢＴ−４７４およびＴ−４７Ｄ）および前立腺ガ
ン細胞株（ＬＮＣａＰ）をモデルとして使用した。ＬＮＣａＰ細胞の場合に、遺
伝子はアンドロゲンおよびプロゲスチンによってのみアップレギュレーションさ
れた。この細胞内でのみ、すべての３種のアイソフォームが発現された。ＢＴ−
４７４細胞中では、ＫＬＫ−Ｌ５は、エストロゲンおよびアンドロゲンによりｍ
ＲＮＡレベルでアップレギュレーションされ、より低い程度でプロゲスチンでア
ップレギュレーションされることが見いだされた。能力の順番は、アンドロゲン
＞プロゲスチン＞エストロゲンであった。これらの細胞株の両方で、短いアイソ
フォーム（関連タンパク質−２）が存在した（図３９）。ＫＬＫ−Ｌ５は乳がん内でダウンレギュレーションされる ｍＲＮＡレベルでのＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の発現を、１７の乳ガン組織および一
つの正常な乳房組織をＲＴ−ＰＣＲで比較した。遺伝子は、すべての１２ガンで
発現されなかった（図４０）。すべての乳房組織内（正常および悪性）で、短い
アイソフォーム（関連タンパク質−２）が、１例のガンを除いて優勢であり、こ
れはクラシカル形でのみ発現した（図４０、レーン８）。これらの結果は、使用
したガンおよび正常組織の数が比較的少ないので予備的と解釈されるべきである
。ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子のマッピングおよび染色体定位 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上の広範なゲノム配列の知識は、正確な１
４カリクレイン様遺伝子の定位および転写の方向の決定を可能とし、これを図２
８に矢印で示す。ＰＳＡおよびＫＬＫ２のみがセントロメアから転写する。残り
の遺伝子は、逆方向に転写される。ＫＬＫ１遺伝子が最もセントロメア的であり
、そしてＫＬＫ−Ｌ６遺伝子が最もテロメア的であった（ＫＬＫ−Ｌ６；配列番
号６５）。ＫＬＫ−Ｌ５は、ＫＬＫ−Ｌ４（配列番号４３）から２１．３Ｋｂだ
けセントロメア寄りであり、トリプシン様セリンプロテアーゼ遺伝子（ＴＬＳＰ
）に１．６Ｋｂテロメア寄りである（図２８）。考察 図３４に示すように、カリクレインは、下記の共通的構造特性を特徴とする。
（ａ）すべての遺伝子は、５コーディングエキソンおよび４介在イントロンから
形成される〔一部の遺伝子は余分の非翻訳エキソンを有する〕（１４、３５）。
（ｂ）エキソンの長さは、通常同程度である。（ｃ）イントロン相は、常に保存
される（Ｉ−ＩＩ−Ｉ−０〕（イントロン相の定義については、図３４の用語参
照）。（ｄ）これらの遺伝子は、同じ染色体内にクラスターし、介在する非カリ
クレイン様遺伝子はない。（ｅ）セリンプロテアーゼの触媒三つ組のヒスチジン
残基は第二コーディングエキソンの末端付近、アスパラギン酸残基は第三コーデ
ィングエキソンの中央部、そしてセリンは第五コーディングエキソンの開始部分
に位置する。図３４に示すように、すべてのこれらの規範は、新規に同定された
ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子に適用される。従って、ＫＬＫ−Ｌ５は、カリクレイン多重
遺伝子ファミリーの新規の成員と考えるべきである。 セリンプロテアーゼおよびカリクレインは、Ｎ−末端シグナルペプチド（ｐｒ
ｅ−ｚｙｍｏｇｅｎ）を含む”ｐｒｅｐｒｏｅｎｚｙｍｅ”、次いで短い活性化
ペプチドとしておよび酵素ドメイン（４１、５６）として合成された。 Ｐｒｅ
ｐｒｏＰＳＡは、ｐｒｅ−領域（シグナルペプチド、１７残基）を構成する２４
コーティングの追加残基およびロペプチド（７残基）を有する（６７）。シグナ
ルペプチドは、タンパク質を小胞体（ＥＲ）へまたはこれを通過するように指令
する。ＥＲ内で、シグナルペプチドは除去され、そして得られたｐｒｏＰＳＡが
形質膜に輸送され、ここでこれが分泌される。疎水性研究（図３５）は、ＫＬＫ
−Ｌ５タンパク質のアミノ末端領域がシグナルペプチドを内包することを示した
。また、ＫＬＫ−Ｌ５のコンピューター解析は、アミノ酸１８および１８の間の
開裂部位を予測した（ＳＱＡ−ＡＴ）。従って、タンパク質産物は、分泌タンパ
ク質であると考えられる。 交互にスプライスされる形の存在は、ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の独特な特徴ではな
い。数種の例えカリクレインが、種々の交互にスプライスされる形で発現される
ことが知られている。主要な１．６Ｋｂ転写物に加えて、数種のＲＮＡ種がＰＳ
Ａ遺伝子から転写される。さらに、その他（６９、７０）は、数種のＲＮＡアイ
ソフォームを記述する。本されるイントロンおよび完全なエキソンの欠損は、こ
れらのアイソフォームの数種で報告されている。さらに、Ｒｉｅｇｍａｎらは、
ヒト腺カリクレイン（ＫＬＫ２）遺伝子の２種の交互スプライス形を報告し（６
２）、そしてＬｉｕらは同じ遺伝子の３種の交互形を単離した（６８）。組織カ
リクレイン遺伝子の新規の転写物は、直腸から単離された（６３）。最近同定さ
れたカリクレィン様遺伝子のｎｅｕｒｏｐｓｉｎは、優勢な形に加えて２種の交
互スプライス形を有することが見いだされた（３５、６４）。本明細書には、Ｋ
ＬＫ−Ｌ５遺伝子のクラシカルカリクレイン形および２種の独特のスプライス形
のクローニングが記述された。クラシカル形およびスプライス形は、他のカリク
レインと同様にすべて同じ転写、分泌及び活性化に必要な５’配列、すなわち５
’リーダー配列、シグナルペプチド、もよびｐｒｏ領域を有するので、すべの３
種のｍＲＮＡ形は、分泌されたタンパク質を産生すると考えるのが合理的である
。一部の組織中で優勢なＫＬＫ−Ｌ５の形を同定する予備的知見を図５３〜４０
に記載する。 予備的結果は、ＫＬＫ−Ｌ５が乳ガンおよび前立腺ガン細胞株中でステロイド
ホルモンによりアップレギュレーションされることを示す（図３９）。これらの
結果は、多くのカリクレイン遺伝子もステロイドホルモンにより制御されるので
驚くものではない。種々の細胞株間でのステロイドホルモンの能力の順番は、別
途記載のように、これらの間のステロイドホルモンの存在頻度の相違に起因する
のであろう。 結論として、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの新規の成員ＫＬＫ−Ｌ５は
、カリクレイン座（染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４）にマップされることを
特徴とする。この遺伝子は、主要形の他に２種のスプライス形を有する。ＫＬＫ
−Ｌ５は、種々の組織内に発現され、乳ガン中えはダウンレギュレーションされ
るように考えられ、そしてその発現はステロイドホルモンにより影響される。数
種の他のカリクレインがすでに有効なガンマーカーとして使用されているので、
ＫＬＫ−Ｌ５も同様の臨床的使用を見いだすであろう。 実施例７ 実施例６記載と本質的に同じ材料および方法を用いて、本発明をカリクレイン
多重遺伝子ファミリーのＫＬＫ−Ｌ６と呼ばれる他の新規の遺伝子を同定した。
ＫＬＫ−Ｌ６遺伝子の完全な構造を図４１に示す。エキソン１、２、３、４、５
、６および７は、核酸１１７２−１２８１、２５６１−２６９５、２７８１−２
８４２、３７１４−３８８５、５７１５−５９６８、６４６６−６６０２、およ
び７２５８−７５２０である。ＫＬＫ−Ｌ６遺伝子の核酸配列も配列番号６５、
ＫＬＫ−Ｌ６タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６６および６７に示す（ジー
ンバンクアクセッション番号ＡＦ１６１２２１参照）。 図４２は、ＫＬＫ−Ｌ６および前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）の比較疎水性解析
を示す。両方の遺伝子のアミノ末端領域は、非常に疎水性であり、ＫＬＫ−Ｌ６
のこの領域がＰＳＡに類似するシグナルペプチドを内包していることを示す。 ＫＬＫ−Ｌ６の多重整列を本明細書記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウエアプ
ログラムを用いて行なった（図４３）。 ＫＬＫ−Ｌ６タンパク質と他のセリンプロテアーゼの系統発生的関連性を予測
するために、カリクレインタンパク質のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｘ多重
整列プログラムを用いて整列し、そして距離マトリックス樹をＮｅｉｇｈｂｏｒ
Ｏｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡおよびＰｒｏｔｐａｒｓパーシモニー法を用いて
予測した。図４４は、クラシカルカリクレイン（ｈＫ１、ｈＫ２およびＰＳＡ）
を分離する系統発生学的解析を示し、そしてＫＬＫ−Ｌ６を別の群に位置した。 好ましい態様により本発明を説明および記述して、当該分野の熟練者には、こ
の原理からはなれることなく、その順序および細部を変更出来ることが認められ
るであろう。上記の請求範囲内に入るすべての変更を請求する。 本明細書に引用したすべての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、
特許または特許出願が特定しそして個別に引用して編入すると指定された場合に
は、引用することにより本明細書中に編入される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ８つのコンティグにより表された染色体１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４の付近の
連続ゲノム配列（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
の約３００Ｋｂを示し、各コンティグはその長さをＫｂで示されている。コンテ
ィグ番号は、ローレンス・リバーモアー・ナショナル・ラボラトリー・ウエブサ
イト（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｗｅｂｓｉｔｅ）において報告されたコンティグ番号を示す。７つ
の既知の遺伝子（ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ザイム（Ｚｙｍｅ）、ＮＥＳ１、ＨＳＣＣ
Ｅ、ニューロプシン（ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ）及びＴＬＳＰ）の局在化（ｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）に留意されたい（これらの遺伝子のフルネームについては略
号参照）。すべての遺伝子は転写の方向を示す矢印で表される。ヒトカリクレイ
ンに対する相同性を持たない遺伝子はＵＧ（未知の遺伝子）と呼ばれる。５つの
新しいカリクレイン様遺伝子（ＫＬＫ−Ｌ１〜ＫＬＫ−Ｌは最もセントロメリッ
クから最もテロメリックへと番号をつけられている。矢印のすぐ下又はすぐ上の
数は各コンティグにおける適当なＫｂ長さを示す。遺伝子長さ及び遺伝子間の距
離は最も近い６．５ｋｂに丸められる。ギャップの部位は星印でマークされる。

【図２】 染色体１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４の付近の連続ゲノム配列を示す。遺伝子は
コード化配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の方向を示す水平な矢印によ
り表される。遺伝子間の距離は塩基対で表される。

【図３】 ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたプロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）／ＫＬＫ−
Ｌ１遺伝子の組織発現を示す。アクチン及びＰＳＡは対照遺伝子である。解説は
表９に示される。

【図４】 プロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１プライマーを使用して女性の乳房組織からのｃＤ
ＮＡで得られたＰＣＲ生成物の配列を示す。プライマーはアンダーラインを付け
られている。配列は前立腺組織から得られた配列と同じである。

【図５】 ＢＴ−４７４乳癌腫細胞系（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ
ｌｉｎｅ）におけるプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１遺伝子のホルモンの調節（ｈｏ
ｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の実験結果を示すブロットである。ＤＨ
Ｔ＝ジヒドロテストステロン。ステロイドは１０^−８Ｍの最終濃度で加えられる
。アクチン（ステロイドホルモンにより調節されない）、ｐＳ２（エストロゲン
によりアップレギュレーションされる）及びＰＳＡ（アンドロゲン及びプロゲス
チンによりアップレギュレーションされる）は対照遺伝子である。プロスターゼ
／ＫＬＫ−Ｌ１はアンドロゲン及びプロゲスチンによりアップレギュレーション
される。

【図６】 ＰＳＡ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ザイム、ニューロプシン及びプロスターゼ／Ｋ
ＬＫ−Ｌ１遺伝子のゲノム構造の比較を示す略図である。エキソンはオープンボ
ックスにより示されそしてイントロンは接続線により示される。矢印ヘッドは開
始コドンを示しそして鉛直矢印は停止コドンを示す。ボックスの上の文字は触媒
トリアド（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）の相対的位置を示し、Ｈはヒスチ
ジンを示し、Ｄはアスパラギン酸を示し、そしてＳはセリンを示す。ローマ数字
はイントロン相を示す。イントロン相はコドン内のイントロンの位置を指し、Ｉ
はイントロンがコドンの第１ヌクレオチドの後に存在することを示す。ＩＩはイ
ントロンが第２ヌチドの後に存在することを示し、０はイントロンがコドン間に
存在することを示す。ボックス内の数はエキソンの長さを塩基対で示す。

【図７】 ＫＬＫ−Ｌ２遺伝子のゲノム組織（ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏ
ｎ）及び部分的ゲノム配列を示す。イントロン配列はスプライス部位（ｓｐｌｉ
ｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）以外は示されていない。イントロンは小文字で示さ
れ、そしてエキソンは大文字で示される。開始コドン及び停止コドンは丸で囲ま
れており、そしてエキソン−イントロン接合部はボックスで囲まれている。コー
ド化領域の翻訳されたアミノ酸は単一文字略号により下に示される。触媒残基は
三角形内にある。推定ポリアデニル化シグナルはアンダーラインを付けられてい
る。

【図８】 染色体１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４付近の殆ど連続したゲノム配列の約３００
Ｋｂ領域を示す。遺伝子はコード化配列の方向を示す水平矢印により表される。
遺伝子間の距離は塩基対で示される。

【図９】 ＫＬＫ−Ｌ２の推定されたアミノ酸配列のカリクレイン多重遺伝子族のメンバ
ーとの整合（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示す。遺伝子は（頂部から底部へ）、プロ
スターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１、エナメルマトリックスセリンプロテイナーゼ１（ＥＭ
ＳＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ、受け入れ番号＃ＮＰ ００４９０８）、ＫＬＫ−Ｌ
２、ザイム（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃Ｑ９２８７６）、ニューロプシン（
ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃ＢＡＡ２８６７３）、トリプシン様セリンプロテ
アーゼ（ＴＬＳＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃ＢＡＡ３３４０４）、ＰＳ
Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃Ｐ０７２８８）、ＫＬＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ
受け入れ番号＃Ｐ２０１５１）、ＫＬＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃ＮＰ
００２２４８）、及びトリプシノーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃Ｐ０
７４７７）である。（配列番号６８〜７７参照）。ダッシュは配列をより良く整 る。触媒トリアド付近の保存された区域はボックスで囲まれている。予想される

【図１０】 （Ａ）はいくらかのカリクレイン遺伝子の予想される系統樹のデンドログラム
を示す。隣接結合／ＵＰＧＡＭ法（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧ
ＡＭ ｍｅｔｈｏｄ）を使用してＫＬＫ−Ｌ２をカリクレイン遺伝子族の他のメ
ンバーと整合させた。遺伝子の名称及び受け入れ番号は図９に列挙されている。
樹は古典的カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２及びＰＳＡ）を同じグループに集
め、そしてＫＬＫ−Ｌ２遺伝子をＥＭＳＰ、プロスターゼ及びＴＬＳＰと１つの
グループにおいて整合させた。（Ｂ）ＫＬＫ−Ｌ２の疎水性と親水性のプロット
。

【図１１】 ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたＫＬＫ−Ｌ２遺伝子の組織発現を示すブロット
である。アクチン及びＰＳＡは対照遺伝子である。解説は表１２に示される。

【図１２】 ＢＴ−４７４乳癌腫細胞系におけるＫＬＫ−Ｌ２遺伝子のホルモンの調節（ｈ
ｏｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を示すブロットである。ＤＨＴ＝ジヒ
ドロテストステロン。ステロイドは１０^−８Ｍの最終濃度で加えられる。アクチ
ン（ステロイドホルモンにより調節されない）、ｐＳ２（エストロゲンによりア
ップレギュレーションされる）及びＰＳＡ（アンドロゲン及びプロゲスチンによ
りアップレギュレーションされる）は対照遺伝子である。ＫＬＫ−Ｌ２はエスト
ロゲン及びプロゲスチンによりアップレギュレーションされる。

【図１３】 ＥｔＢｒ染色アガロースゲルのブロットである。全ＤＮＡは正常な組織、良性
（ｂｅｎｉｇｎ）組織及び癌組織から抽出され、そしてｃＤＮＡを発生させるた
めに使用された。ＰＣＲはｃＤＮＡに対して行われた。

【図１４】 染色体１９ｑ１３．３〜ｑ１３．４付近の殆ど連続したゲノム配列の約３００
Ｋｂ領域を示す。遺伝子はコード化配列の方向を示す水平矢印により表される。
遺伝子長さ及び遺伝子間の距離は最も近い０．５ｋｂに丸められる。ギャップの
部位は星印でマークされる。ＴＬＳＰに対してテロメア側に他の３つのカリクレ
イン様遺伝子があるようである。

【図１５】 ＫＬＫ−Ｌ３遺伝子のゲノム組織及び部分的ゲノム配列を示す。イントロン配
列はスプライス部位以外は示されていない。イントロンは小文字で示され、そし
てエキソンは大文字で示される。全配列については配列番号２１を参照されたい
。開始コドン及び停止コドンは丸で囲まれており、そしてエキソン−イントロン
接合部はボックスで囲まれている。コード化領域の翻訳されたアミノ酸は単一文
字略号により下に示される。触媒残基は三角形内にある。推定ポリアデニル化シ
グナルはアンダーラインを付けられている。

【図１６】 ＫＬＫ−Ｌ３のパターンをザイム遺伝子のパターンと比較した、疎水性及び親
水性のプロットである。シグナルペプチドを表すらしい最初の２０のアミノ酸付
近の疎水性領域に留意されたい。

【図１７】 ＫＬＫ−Ｌ３の推定されたアミノ酸配列のカリクレイン多重遺伝子族のメンバ
ーとの整合である。遺伝子は（頂部から底部へそして括弧内はＧｅｎＢａｎｋ受
け入れ番号＃である）、ＰＳＡ（Ｐ０７２８８）、ＫＬＫ２（Ｐ２０１５１）、
ＫＬＫ１（ＮＰ００２２４８）、トリプシノーゲン（Ｐ０７４７７）、ＫＬＫ−
Ｌ３（ＡＦ１３５０２６）、トリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）（Ｂ
ＡＡ３３４０４）、ニューロプシン（ＢＡＡ２８６７３）、ザイム（Ｑ９２８７
６）、ヒト角質層キモトリプチック酵素（ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ ｃ
ｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）（ＨＳＣＣＥ）（ＡＡＤ４９７１８）
及びプロスターゼ／ＫＬＫ−Ｌ１（ＡＡＤ２１５８１）である。（配列番号７８
〜８４参照）。ダッシュは配列をより良く整合させるためのギャップを表す。触
媒トリアドの残基は肉太でありそしてイタリック体であり、そして２９のインバ
リアントセリンプロテアーゼ残基は（◆）により示される。システイン残基は（
●）により示される。触媒トリアド付近の保存された区域は黒で強調されている
。矢印ヘッド（▲）は潜在的開裂部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ
ｓｉｔｅｓ）を表す。点を打った区域はカリクレインループ配列を表す。

【図１８】 いくらかのセリンプロテアーゼ及びカリクレイン遺伝子の予想される系統樹の
デンドログラムである。隣接結合／ＵＰＧＡＭ法を使用してＫＬＫ−Ｌ３をカリ
クレイン遺伝子族の他のメンバーと整合させた。遺伝子の名称及び受け入れ番号
は図１７に列挙されている。樹は古典的カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２及び
ＰＳＡ）を同じグループに集め、そしてＫＬＫ−Ｌ３遺伝子をＴＬＳＰ、ニュー
ロプシン及びＮＥＳ１遺伝子とともに１つのグループにおいて整合させた。ＫＬ
Ｋ−Ｌ４（配列番号４３）はＴＬＳＰ（２１）に対して更に末端にある（ｌｉｅ
ｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｔｏ ＴＬＳＰ（２１））。

【図１９】 ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたＫＬＫ−Ｌ３遺伝子の組織発現を示すブロット
である。アクチン及びＰＳＡは対照遺伝子である。

【図２０】 ＢＴ−４７４乳癌腫細胞系におけるＫＬＫ−Ｌ３遺伝子のホルモンの調節を示
す。ＤＨＴ＝ジヒドロテストステロン。ステロイドは１０^−８Ｍの最終濃度で加
えられた。アクチン（ステロイドホルモンにより調節されない）、ｐＳ２（エス
トロゲンによりアップレギュレーションされる）及びＰＳＡ（アンドロゲン及び
プロゲスチンによりアップレギュレーションされる）は対照遺伝子である。ＫＬ
Ｋ−Ｌ３はプロゲスチン、エストロゲン及びアンドロゲンによりアップレギュレ
ーションされる。

【図２１】 ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ニューロプシン、ＮＥＳ１及びＫＬＫ−Ｌ３遺伝子のゲノ
ム構造の比較を示す略図である。エキソンはオープンボックスにより示されそし
てイントロンは接続線により示される。矢印ヘッドは開始コドンを示しそして矢
印は停止コドンを示す。ボックスの上の文字は触媒トリアドの相対的位置を示し
、Ｈはヒスチジンを示し、Ｄはアスパラギン酸を示し、そしてＳはセリンを示す
。ローマ数字はイントロン相を示す。イントロン相はコドン内のイントロンの位
置を指し、Ｉはイントロンがコドンの第１ヌクレオチドの後に存在することを示
し、ＩＩはイントロンが第２ヌチドの後に存在することを示し、０はイントロン
がコドン間に存在することを示す。ボックス内の数はエキソンの長さを塩基対で
示す。

【図２２】 ＥＳＴｓ（表１６）、ジャーマン・ゲノム・プロジェクトからのクローン、及
びＫＬＫ−Ｌ４の長い形態（ｌｏｎｇ ｆｏｒｍ）の比較ゲノム構造を示す。エ
キソンは連続バーにより表され、そしてイントロンは接続線により表される。連
続バーの上のエキソン番号はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号＃ＡＦ１３５０２４を
指す。ＥＳＴ ＩＤｓはＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号を表す。星印は停止コドン
の位置を示す。水平矢印はＰＣＲプライマー（表１５に記載されている）の方向
を示し、そして矢印ヘッドはエキソンに沿ったそれらの位置を示す。鉛直点線は
同じ断片の整合を示す。

【図２３】 ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の組織発現を示す。アクチ
ン及びＰＳＡは対照遺伝子である。ＫＬＫ−Ｌ４は乳房、前立腺、唾液腺及び精
巣において高度に発現される。

【図２４】 上部パネルにおいて、長いＫＬＫ−Ｌ４形態及び短いＫＬＫ−Ｌ４バリアント
の比較ゲノム構造を示すダイアグラムである。エキソンはボックスにより示され
、そしてイントロンは接続線により表される。エキソン番号は配列番号４３及び
ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ１３５０２４を指す。黒い領域は遺伝子の長い
形態では見いだされるが遺伝子の短い形態では見いだされない余分の断片（２１
４ｂｐ）を示す。２つの形態の停止コドンの位置は星印によりマークされている
。フレームシフトは別の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）スプライス部位の利用の結
果として起こり、そして停止コドンは短い形態においてエキソン４の始めに発生
させられる。下部のパネルはＬ４−Ｒ１及びＬ４−Ｘ１プライマー（図２２及び
表１５）を使用してＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の増幅のＰＣＲ生成物を示す。主要な長
い形態及び、ＫＬＫ−Ｌ４ｍＲＮＡの短い形態を表す少いバンドに留意されたい
。（Ｍ）左側に示されたｂｐでのサイズを有するマーカー。使用された組織は（
１）唾液腺、（２）乳腺、（３）前立腺、（４）精巣、（５）子宮、（６）乳癌
組織、（７）負の対照である。

【図２５】 ＫＬＫ−Ｌ４遺伝子のゲノム組織及び部分的ゲノム配列を示す。イントロン配
列はスプライス部位以外は示されていない。イントロンは小文字で示され、そし
てエキソンは大文字で示される。全配列については配列番号４３又はＧｅｎＢａ
ｎｋ受け入れ番号＃ＡＦ１３５０２４を参照されたい。開始コドン及び停止コド
ンは丸で囲まれており、そしてエキソン−イントロン接合部はアンダーラインを
付けられている。コード化領域の翻訳されたアミノ酸は単一文字略号により下に
示される。触媒残基はボックスで囲まれている。推定ポリアデニル化シグナルは
アンダーラインを付けられている。

【図２６】 腺性カリクレイン（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｈａｌｌｉｋｒｅｉｎ）遺伝子２（
ＫＬＫ２）と比較した、ＫＬＫ−Ｌ４タンパク質の疎水性及び親水性のプロット
である。シグナルペプチドの存在を示唆するアミノ末端の疎水性領域に留意され
たい。

【図２７】 ＫＬＫ−Ｌ４の推定されたアミノ酸配列のカリクレイン多重遺伝子族のメンバ
ーとの整合を示す。遺伝子は（頂部から底部へそして括弧内はＧｅｎＢａｎｋ受
け入れ番号＃である）、ＫＬＫ−Ｌ１／プロスターゼ（ＡＡＤ２１５８１）、エ
ナメルマトリックスセリンプロティナーゼ１（ＥＭＳＰ）（ＮＰ ００４９０８
）、ＫＬＫ−Ｌ２（ＡＦ１３５０２８）、ＰＳＡ（Ｐ０７２８８）、ＫＬＫ２（
Ｐ２０１５１）、ＫＬＫ−Ｌ１（ＮＰ ００２２４８）、トリプシノーゲン（Ｐ
０７４７７）、ザイム（Ｑ９２８７６）、ＫＬＫ−Ｌ４（ＡＦ１３５０２４）、
トリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）（ＢＡＡ３３４０４）、ＫＬＫ−
Ｌ３（ＡＦ１３５０２６）、ニューロプシン（ＢＡＡ２８６７３）及び正常な上
皮細胞特異的１遺伝子（ＮＥＳ１）（Ｑ４３２４０）である。（配列番号７８〜
８８参照）。ダッシュは配列をより良く整合させるためのギャップを表す。触媒
トリアドの残基は肉太でタイプされており、そしてそれらの付近の保存されたモ
チーフ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｏｔｉｆｓ）灰色により強調されている。２９
のインバリアントセリンプロテアーゼは（●）により示され、そしてシステイン

【図２８】 染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４の周辺のほぼ近接するゲノム配列の概略３
００Ｋｂ領域を示す。遺伝子はコード付け配列の方向を示す水平の矢印により表
される。それらの長さは各矢印の上部に示されている。遺伝子間の距離は矢印の
下の塩基対に記されている。ＫＬＫ１およびＰＳＡの間の距離は正確にはわから
ない。遺伝子の名称に関しては、略語を参照のこと。

【図２９】 ある種のカリクレインおよびセリンプロテアーゼ遺伝子に関する予測される系
統樹の樹状図である。隣接−結合（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）／ＵＰ
ＧＭＡ法を使用してＫＬＫ−Ｌ４を他のセリンプロテアーゼ類およびカリクレイ
ン遺伝子族の員と整列させた。樹は古典的なカリクレイン類（ＫＬＫ１、ＫＬＫ
２、およびＰＳＡ）を一緒にまとめそして１つの群の中のＫＬＫ−Ｌ４遺伝子を
酵素、ＮＥＳ１、ニューロプシン、ＫＬＫ−Ｌ３、およびＴＬＳＰと整列させた
。他のセリンプロテアーゼは、示されているように、別の群で整列させられた。

【図３０】 ＢＴ−４７４乳癌細胞系統におけるＫＬＫ−Ｌ４遺伝子のホルモン調節を示す
点である。ＤＨＴ＝ジヒドロテストステロン。ステロイド類を１０^−８Ｍの最終
濃度で加えた。アクチン（ステロイドホルモン類により調節されない）、ｐＳ２
（エストロゲン類により上方に調節される）並びにＰＳＡ（アンドロゲン類およ
びプロゲスチン類により上方に調節される）は対照遺伝子である。ＫＬＫ−Ｌ４
はアンドロゲン類およびプロゲスチン類により上方に調節されそしてエストロゲ
ン類によりそれより少ない程度に上方調節される。Ｈ_２Ｏを使用して全てのＰＣ
Ｒ反応におけるＰＣＲ特異性を検査した。さらなる詳細に関しては、本文を参照
のこと。

【図３１】 ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ニューロプシン、ＮＥＳ１、およびＫＬＫ−Ｌ４遺伝子の
ゲノム構造の比較を示すスキーム図である。エキソンは黒色の囲みにより示され
そしてイントロンは連接線により示される。矢印の先は出発コドンを示しそして
矢印は停止コドンを示す。囲みの上の文字は触媒３回対称軸のアミノ酸類の相対
的位置を示し、Ｈはヒスチジンを示し、Ｄはアスパラギン酸を示しそしてＳはセ
リンを示す。ローマ数字はイントロン状態（ｐｈａｓｅ）を示す。イントロン状
態はコドン内のイントロンの位置を示し、Ｉはコドンの第１ヌクレオチド後にイ
ントロンが生ずることであり、ＩＩは第２ヌクレオチド後にイントロンが生ずる
ことであり、０はコドン間でイントロンが生ずることである。囲み内の番号は塩
基対の中のエキソン長さを示す。疑問符はより多い未翻訳塩基の可能性を示す。

【図３２】 ＫＬＫ−Ｌ５の３つのスプライス形態である古典的なカリクレイン形態、関連
蛋白質−１、および関連蛋白質−２の比較用のゲノム構造を示す。エキソンは実
線により表されそしてイントロンは連接線により表される。エキソン番号はＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ．５６およびゲンバンク・アクセッション（ＧｅｎＢａｎｋ Ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ）＃ＡＦ１３５０２５を示す。出発コドンは逆矢印（▼）によ
り表されそして停止コドンは星印（＊）により表される。プライマー位置は垂直
矢印の先（▲）により表されそしてそれらの方向は水平矢印により表される。プ
ライマー配列およびコードに関しては表１７並びにＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．６１
−６４および９−１２を参照のこと。

【図３３】 ＫＬＫ−Ｌ５遺伝子のゲノム構成および部分的ゲノム配列を示す。イントロン
配列はスプライス部位周辺の短い配列以外は示されていない。イントロンはロア
ーケース文字でそしてエキソンは大文字で示される。全配列に関しては、ＳＥＱ
．ＩＤ．ＮＯ．５６を参照のこと。出発および停止コドンは円で囲まれそしてエ
キソン−イントロン境界は下線が引かれている。コード付け領域の翻訳されたア
ミノ酸類は一文字略語により下に示されている。触媒基は囲みに入れられている
。推定ポリアデニル化信号は下線が引かれている。関連蛋白質−１形態の外部イ
ントロンは括弧間の肉太でない文字により表される。このイントロンがスプライ
スされる時に、枠はコドンＡＡＣ（アスパラギン、Ｎ、リシンの代わり、Ｋ）と
それが停止コドンＴＡＡ（円で囲まれる）に出合うまで続く。

【図３４】 ＰＳＡ、ＫＬＫ２、ニューロプシン、ＮＥＳ１、ＫＬＫ−Ｌ４およびＫＬＫ−
Ｌ５遺伝子のゲノム構造の比較を示すスキーム図である。エキソンは実線により
示されそしてイントロンは連接線により示される。矢印の先は出発コドンの部位
を示し、そして矢印は停止コドンを表す。囲みの上の文字は触媒３回対称軸の相
対的位置を示し、Ｈはヒスチジンを示し、Ｄはアスパラギン酸を示しそしてＳは
セリンを示す。ローマ数字はイントロン状態を示す。イントロン状態はコドン内
のイントロンの位置を示し、Ｉはコドンの第１ヌクレオチド後にイントロンが生
ずることであり、ＩＩは第２ヌクレオチド後にイントロンが生ずることであり、
０はコドン間でイントロンが生ずることである。囲み内の番号は塩基対の中のエ
キソン長さを示す。疑問符はより多い未翻訳塩基の可能性を示す。

【図３５】 プロステート特異的抗原（ＰＳＡ）と比較したＫＬＫ−Ｌ５の疎水性および親
水性のプロットを示す。疎水性Ｎ−末端は信号および活性化ペプチドを固定でき
る。

【図３６】 ＫＬＫ−Ｌ５の推定アミノ酸配列とカリクレイン多重遺伝子族の員との整列を
示す。（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯｓ．７８−８１、８３、８４を参照のこと）。ダッ
シュ（−）は配列をより良く整列させるための間隙を表す。触媒３回対称軸の基
は肉太文字により表され、そして２９個の不変セリンプロテアーゼ基は（・）で
印がつけられている。システイン基は（◆）により印がつけられている。保存さ
れた領域は灰色でハイライトがつけられている。信号ペプチド中の予測される分
裂 矢印はトリプシン類似分裂部位を示す。

【図３７】 ある種のセリンプロテアーゼ類および他のカリクレイン蛋白質に関する予測さ
れる系統樹の樹状図である。隣接−結合／ＵＰＧＭＡ法を使用してＫＬＫ−Ｌ５
を他のセリンプロテアーゼ類およびカリクレイン遺伝子族の員と整列させた。樹
は古典的なカリクレイン類（ｈＫ１、ｈＫ２、およびＰＳＡ）を一緒にまとめそ
して１つの群の中のＫＬＫ−Ｌ５蛋白質をＮＥＳ１およびニューロプシンと整列
させた。他のセリンプロテアーゼ類は別の群で整列させられた。

【図３８】 ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の組織発現を示す。上の帯
（９０５塩基対、ｂｐ）は古典的な形態（図３２参照）であり、中間部（７７６
ｂｐ）は関連蛋白質−１であり、そして下の帯（６４４ｂｐ）は関連蛋白質−２
である。スプライス変種の論議に関しては、本文を参照のこと。使用したプライ
マー類は、表１７に示されているように、Ｌ５−Ｆ２およびＬ５−Ｒ２であった
。

【図３９】 ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞系統、ＢＴ−４７４およびＴ−４７Ｄ乳癌細胞系統中
のＫＬＫ−Ｌ５遺伝子のホルモン調節を示す。ステロイド類を１０^−８Ｍの最終
濃度で加えた。アクチン（ステロイドホルモン類により調節されない）を対照遺
伝子として使用した。ＬＮＣａＰ中でのみの３種のイソ形態の検出に注目するこ
と。

【図４０】 乳癌（１−１７）および正常（１８）組織中のＫＬＫ−Ｌ５遺伝子の発現を示
す。１２種の癌組織中での発現の完全な不存在に注目すること。イソ形態に関し
ては図３８を参照のこと。

【図４１】 ＫＬＫ−Ｌ６核酸分子の全構造を示す。

【図４２】 プロテアーゼ特異的抗原（ＰＳＡ）と比較したＫＬＫ−Ｌ６蛋白質の疎水性お
よび親水性のプロットである。

【図４３】 ＫＬＫ−Ｌ６の推定アミノ酸配列と多重遺伝子族の員との整列を示す。（ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯｓ．７８−８１、８３、８４参照）。ダッシュ（−）は配列をよ
り良く整列させるための間隔を表す。

【図４４】 ある種のセリンプロテアーゼ類および他のカリクレイン蛋白質に関する予測さ
れる系統樹の樹状図である。隣接−結合／ＵＰＧＭＡ法を使用してＫＬＫ−Ｌ６
を他のセリンプロテアーゼ類およびカリクレイン遺伝子族の員と整列させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ａ ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１４４，９１９ (32)優先日 平成11年７月21日(1999．7．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エレフテリオス・ピー・デイアマンデイス カナダ・オンタリオ エム５ジー ２エツ クス２・トロント・ジエラードストリート ウエスト1504・スイート44 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA14 BA43 CA04 DA03 EA04 FA18 GA11 HA01 HA14 HA15 HA17 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QQ01 QQ08 QQ36 QQ43 QR32 QR55 QS25 QS33 QS34 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA22 NA14 ZB26 4C086 AA01 AA03 EA16 NA14 ZB26 4H045 AA11 CA40 DA75 EA20 EA50 FA74

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ配列番号１
   、１３、２１、４３、５６または６５、あるいは配列番号１、１３、２１、４３
   、５６または６５の相補鎖とハイブリダイスする少なくとも３０個のヌクレオチ
   ドの単離されたＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、Ｋ
   ＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６核酸分子。
2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５
   ７、５８、５９、６０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−
   Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク
   質のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配
   列； （ｉｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、
   ６０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ
   ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質のアミノ酸配列
   を含んで成るタンパク質をコードする核酸配列； （ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列； （ｉｖ）（ｉ）の核酸配列の縮重形： （ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列に緊縮条件下でハイブリダ
   イズすることができる核酸配列； （ｖｉ）配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、５８、５９、
   ６０、６６または６７にそれぞれ示すＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ
   ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質のアミノ酸配列
   を含んで成るタンパク質の切頭形、同族体、対立遺伝子的または種の変異をコー
   ドする核酸配列；あるいは （ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
   子的もしくは種の変異、 を含んで成る単離された核酸分子。
3. 【請求項３】 （ｉ）ＴがＵであることもできる配列番号１、１３、２１、
   ４３、５６または６５の配列を含んで成る核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的、好ましくは配列番号１、１３、２１、４３、５６また
   は６５の完全な核酸配列に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸、そして好ましくは少なくとも１８ヌク
   レオチドを有する核酸に、緊縮条件下でハイブリダイズすることができる核酸；
   あるいは （ｉｖ）遺伝暗号の縮重により、コドン配列において（ｉ）〜（ｉｉｉ）の核酸
   とは異なる核酸分子、 を含んで成る本発明の精製され、そして単離された核酸分子。
4. 【請求項４】 ＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４
   、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質の抗体に結合するタンパク質をコ
   ードする単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 ヘテロロガスなタンパク質をコードする核酸分子に融合され
   た、前記請求項のいずれかに記載の単離された核酸分子の調節配列。
6. 【請求項６】 前記請求項のいずれかに記載の核酸分子を含んで成るベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 前記請求項のいずれかに記載の核酸分子を含んで成る宿主細
   胞。
8. 【請求項８】 配列番号２または３に記載のアミノ酸配列を含んで成る単離
   されたＫＬＫ−Ｌ１タンパク質。
9. 【請求項９】 配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含んで成る単離された
   ＫＬＫ−Ｌ２タンパク質。
10. 【請求項１０】 配列番号２２または２３に記載のアミノ酸配列を含んで成
    る単離されたＫＬＫ−Ｌ３タンパク質。
11. 【請求項１１】 配列番号４４または４５に記載のアミノ酸配列を含んで成
    る単離されたＫＬＫ−Ｌ４タンパク質。
12. 【請求項１２】 配列番号５７、５８、５９または６０に記載のアミノ酸配
    列を含んで成る単離されたＫＬＫ−Ｌ５タンパク質。
13. 【請求項１３】 配列番号６６または６７に記載のアミノ酸配列を含んで成
    る単離されたＫＬＫ−Ｌ６タンパク質。
14. 【請求項１４】 配列番号２、３、１４、２２、２３、４４、４５、５７、
    ５８、５９、６０、６６または６７のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の
    アミノ酸配列同一性を有する単離されたタンパク質。
15. 【請求項１５】 （ａ）請求項６に記載のベクターを宿主細胞に移し； （ｂ）形質転換していない宿主細胞から形質転換した宿主細胞を選択し； （ｄ）選択した形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を可能とする条件下
    で培養し；そして （ｃ）タンパク質を単離する、 ことを含んで成る、前記請求項のいずれかに記載のタンパク質の調製法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法に従い調製したタンパク質。
17. 【請求項１７】 請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記載のポリ
    ペプチドのエピトープに対する特異性を有する抗体。
18. 【請求項１８】 検出可能な物質で標識し、そして生物学的サンプル、組織
    および細胞を検出するために使用する、請求項１７に記載の抗体。
19. 【請求項１９】 請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記載のタン
    パク質、またはそれらの部分をコードする配列を含んで成るプローブ。
20. 【請求項２０】 前記請求項のいずれかに記載のタンパク質をコードする核
    酸分子の存在を決定することにより、またはタンパク質の存在を決定することに
    より、請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記載のタンパク質により媒
    介される状態を診断し、そしてモニタリングする方法。
21. 【請求項２１】 状態がガンである、請求項２０に記載の方法。
22. 【請求項２２】 請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記載のタン
    パク質に会合する物質を同定するための方法であって、（ａ）物質とタンパク質
    との間の会合を可能とする条件下でタンパク質と潜在的に会合することができる
    少なくとも１つの物質をタンパク質と反応させ、そして（ｂ）物質と会合したタ
    ンパク質を取り出すか、または検出することを含んで成り、ここで会合したタン
    パク質および物質の検出は物質がタンパク質と会合したことを示す上記方法。
23. 【請求項２３】 化合物が請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記
    載のタンパク質の生物学的活性をモジュレートする能力を評価する方法であって
    、既知の濃度のタンパク質をタンパク質に会合する物質および試験化合物に、物
    質とタンパク質との間の複合体の形成を可能とする条件下で提供し、そして複合
    体を取り出し、かつ／または検出することを含んで成る上記方法。
24. 【請求項２４】 生物学的サンプル中に配列番号２、３、１４、２２、２３
    、４４、４５、５７、５８、５９、６０、６６または６７のアミノ酸配列を含ん
    で成るタンパク質をコードする核酸を検出する方法であって、 （ａ）請求項２に記載の核酸分子を生物学的サンプル中の核酸分子とハイブリダ
    イズさせ、これによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んで成り、ここでハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在は生物学的サンプル中のタンパク質をコードす
    る核酸分子の存在と相関する上記方法。
25. 【請求項２５】 生物学的サンプル中の核酸分子が、ハイブリダイゼーショ
    ン工程の前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される、請求項２４に記載の方法
    。
26. 【請求項２６】 効果的な量の請求項１７に記載の抗体、あるいは請求項２
    ２または２３に記載の方法に従い同定された物質または化合物を投与することを
    含んで成る、請求項８、９、１０、１１、１２または１３に記載のタンパク質に
    より媒介される状態の処置法。
27. 【請求項２７】 状態がガンである請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 １以上の前記請求項のいずれかに記載の核酸分子またはタ
    ンパク質、あるいは前記請求項のいずれかに記載の方法を使用して同定された物
    質または化合物、および医薬的に許容され得るキャリアー、賦形剤または希釈剤
    を含んで成る組成物。
29. 【請求項２９】 １以上の前記請求項のいずれかに記載の核酸分子またはタ
    ンパク質、あるいは前記請求項のいずれかに記載の方法を使用して同定された物
    質または化合物の、前記請求項のいずれかに記載のタンパク質により媒介される
    状態を処置するための医薬組成物の調製における使用。
30. 【請求項３０】 請求項８、９、１０、１１、１２または１３にそれぞれ記
    載のＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５
    またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質を発現せず、それぞれＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ
    ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質
    が関係する病状を生じる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
31. 【請求項３１】 ＫＬＫ−Ｌ１、ＫＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ
    ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タンパク質が関係する病状を軽減するか、
    または抑制する作用物質を試験するためのモデル系を提供するトランスジェニッ
    ク動物アッセイ系であって、 （ａ）作用物質を請求項２６に記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与し；
    そして （ｂ）該作用物質が、作用物質を投与しなかった工程（ａ）のトランスジェニッ
    ク非ヒト動物に対してトランスジェニック非ヒト動物におけるＫＬＫ−Ｌ１、Ｋ
    ＬＫ−Ｌ２、ＫＬＫ−Ｌ３、ＫＬＫ−Ｌ４、ＫＬＫ−Ｌ５またはＫＬＫ−Ｌ６タ
    ンパク質が関係する病状を軽減するか、または抑制するかどうかを決定する、こ
    とを含んで成る上記トランスジェニック動物アッセイ系。