CN1740326A - 重组嵌合分子Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表达质粒及抗肿瘤基因药物用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了重组嵌合Cb1泛素连接酶Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表达载体的构建方法，所构建的表达质粒pcDNA3.1(+)－Cb1－Grb7(SH2)－RING能够作为抗HER2阳性肿瘤的基因药物。经实验证明：重组嵌合分子Cb1－Grb2(SH2)－RING真核表达质粒转染HER2阳性乳腺癌细胞系SK－BR－3后，通过与HER2蛋白结合并促进其泛素化、下调，能够有效抑制与HER2过度活化有关的细胞的增殖，因而具有抗HER2阳性肿瘤的用途。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤基因治疗领域，涉及重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达载体的构建及其用于抗HER2阳性肿瘤的基因药物的用途。
背景技术
Cbl(Casitas B-lineage lymphoma)是一类进化上保守的、广泛分布的胞浆蛋白，由906个氨基酸组成，包含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，因此在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时分子内的RING结构域赋予Cbl泛素连接酶的功能，促进其结合的靶分子发生泛素化、下调，从而参与细胞内信号转导的负调控机制。Cbl突变或功能异常可以导致细胞发生转化或者免疫功能失调。
1.Cbl的结构及功能
(1)Cbl含有多个蛋白-蛋白结合结构域以及一个RING结构域
Cbl蛋白由N末端开始分别含有酪氨酸激酶结合结构域(TKB)、Linker、RING结构域、富含脯氨酸区、C末端几个酪氨酸磷酸化位点及亮氨酸拉链。其中TKB结构域由4H、EF及变异的SH2构成，识别和结合活化蛋白酪氨酸激酶PTK。RING介导与泛素结合酶E2结合。Linker对于保持Cbl分子上结合的底物、RING及E2三者之间形成的最佳空间位置具有重要作用。C端的脯氨酸富含区及酪氨酸位点分别介导Cbl分子与其它含SH3或含SH2的蛋白结合。
(2)Cbl作为泛素连接酶促进多种蛋白酪氨酸激酶泛素化、下调，参与细胞内信号转导的负向调控
Cbl分子的多价结合能力一方面决定了它作为一种多价接头分子参与信号转导途径。另一方面，RING赋予了Cbl蛋白在本质上是一种泛素连接酶，分子中的TKB及其他结构域可以识别并结合靶蛋白，RING负责募集泛素结合酶E2并将结合在E2上的泛素转移至其所结合的底物分子上，从而启动泛素化降解途径。以这种方式Cbl蛋白促进多种受体型蛋白酪氨酸激酶(RTK)如EGFR、PDGFRα、β、CSF-1R、Met、Hck等发生配体诱导的泛素化、随后降解，参与细胞内信号转导的负向调控，这对于维持细胞的内稳态具有重要意义。并且对于许多蛋白酪氨酸激酶如EGFR、Syk等而言，Cbl N端截短体(包含N末端到RING)便足以促使底物发生泛素化。Cbl突变后可成为癌蛋白；许多致癌性RTK如EGFRvV、CSF-1R、HER2等发生突变后能够逃逸Cbl的负调控作用。这些现象提示，加强或重建Cbl的负调控作用，或许能够抑制某些肿瘤细胞增殖。
2.重组嵌合泛素连接酶的应用
在泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来多个研究组应用重组技术构建重组嵌合泛素连接酶，成功降解正常情况下并非泛素化系统天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物结合亚单位F-box构成的嵌合F-box蛋白CFP，可靶向性降解pRB和β-catenin。将分别来自BRCA1和BARD的两个RING与增殖细胞核抗原PCNA进行重组后，该重组分子以蛋白酶体依赖的方式降低p57蛋白的水平，并且下调其功能。这些研究表明利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。但目前还没有应用重组Cbl泛素连接酶进行基因治疗研究的相关报道。
发明内容
鉴于Cbl细胞内蛋白的SH2负责识别和结合多种活化的蛋白酪氨酸激酶，为了靶向性地降解致癌相关蛋白HER2，本发明的目的在于，构建能够靶向性降解致癌相关蛋白HER2的重组嵌合Cbl泛素连接酶真核表达质粒，并应用于制备抗HER2阳性肿瘤的基因药物。
本发明将Cbl蛋白N端部分的SH2置换为能够结合并且介导HER2活化信号的下游信号分子Grb2的SH2，构建重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING，其中置换的SH2结构域负责对HER2靶向性结合，RING负责将泛素分子连接至底物以促进其发生泛素化、降解。
为了实现上述目的，本发明采取的技术解决方案是：
1)将BamH I和EcoR v引入Cbl N端编码基因SH2的两端，构建pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)
本发明利用PCR及重叠延伸技术，分别设计3对引物，进行3轮PCR反应，首先将BamH I引入CblN基因的SH2 N端即获得CblN(BamH I)。以CblN(BamH I)为模板，同法将EcoR V引入CblN基因的SH2 C端获得CblN(BamH I+EcoR V)。将其克隆入pGEM-T easy载体进行测序，测序正确后利用KpnI/XhoI酶切将其插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体的KpnI/XhoI酶切位点之间，即得到pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)。
2)扩增Grb2的SH2基因片段并置换入pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)，获得重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING
以SK-BR-3细胞的cDNA为模板，设计引物扩增得到Grb2SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy载体中，酶切鉴定及测序证实序列正确后，以BamH I和EcoR v双酶切将Grb2SH2基因片段切出，并将经同样酶切的pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)载体片断分别回收，两片段经T4连接酶进行连接反应，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经BamH I和EcoR v双酶切鉴定后，对获得预期大小的插入片段的载体再进行测序证实，命名为pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，此即为重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表达质粒。
3)Cbl-Grb2(SH2)-RING促进HER2泛素化和下调、抑制HER2阳性肿瘤细胞增殖
将构建成功的质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING稳定转染HER2阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞，通过免疫印迹、流式细胞仪和细胞实验证实其通过下调HER2水平，有效抑制了与HER2过度活化有关的肿瘤细胞增殖。进一步通过体内结合实验及泛素化实验证实重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING能够结合靶蛋白HER2并促进其泛素化程度增加。
附图说明
图1是pcDNA3.1(+)载体质粒图；
图2是对pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)载体的酶切鉴定；其中：
1：pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以Kpn I和Xho I双酶切；
2：pcDNA3.1(+)-CblN以Kpn I和Xho I双酶切；
3：pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以BamH I和EcoR V双酶切；
4：pcDNA3.1(+)-CblN以BamH I和EcoR V双酶切；
M：已知分子量标准品。
图3是对pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING载体的酶切鉴定，其中：
1：pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)以BamH I和EcoR V双酶切；
2：pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING以BamH I和EcoR V双酶切；
M：已知分子量标准品。
图4是pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING重组质粒对HER2的下调作用。稳定转染了pcDNA3.1(+)空质粒(vector)、pcDNA3.1(+)-CblN(简写为CblN)以及pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING(简写成CblN/Grb2)的SK-BR-3细胞株细胞提取物分别利用抗HER2和ACTIN的抗体进行免疫印迹分析。CblN/Grb2能够下调HER2蛋白。
图5是Cbl-Grb2(SH2)-RING对HER2阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3的增殖抑制作用。稳定转染了pcDNA3.1(+)空质粒(control)和CblN/Grb2的SK-BR-3细胞株，以200个细胞数接种于60mm培养皿培养14天，计算克隆形成率。CblN/Grb2能够抑制SK-BR-3细胞的克隆增殖能力。
图6是Cbl-Grb2(SH2)-RING促进HER2阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3中HER2泛素化程度增加。稳定转染了pcDNA3.1(+)空质粒(vector)、CblN/Grb2和pcDNA3.1(+)-CHIP(此处作为阳性对照，简写为CHIP)的SK-BR-3细胞株分别瞬时转染pcDNA3.1(+)-3×HA-Ub并给予25μM MG-132处理4h。取1.5mg细胞提取物以抗HER2抗体进行免疫沉淀，以抗HA抗体(图6上)或抗HER2抗体(图6下)进行免疫印迹分析。CblN/Grb2能够促进HER2泛素化程度增加。
下面结合附图和实验对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下是发明人给出的重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING)的构建与鉴定及该质粒对HER2阳性的肿瘤细胞生长的抑制作用。
1.重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒的构建
1.1实验材料
限制性内切酶、T4连接酶均购于大连宝生生物有限公司，真核细胞表达质粒pcDNA3.1(+)购于Invitrogen公司，pcDNA3.1(+)质粒图参见图1。图中，PCMV：CMV启动子，232-819位碱基，T7：T7启动子/引物位点，863-882位碱基；多克隆酶切位点：895-1010位碱基，BGHpA：牛生长激素多腺苷酸化序列，1028-1252位碱基，f1 ori：f1起始位点，1296-1726位碱基，SV40 ori：SV40起始位点，1731-2074位碱基，Neomycin：新霉素抗药性基因，2136-2930位碱基，SV40pA：SV40多腺苷酸化信号，3104-3234位碱基，pUC ori：pUC起始位点，3617-4287位碱基，Amipicilin：氨苄青霉素抗药性基因，4432-5428位碱基。
1.2重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING)的构建过程
首先利用PCR及重叠延伸技术，将BamH I和EcoR V引入Cbl N端编码基因SH2的两端，将其克隆入pGEM-T easy载体进行测序，测序正确后利用KpnI/XhoI酶切将其插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体的KpnI/XhoI酶切位点之间，即pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)。利用PCR得到Grb2SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy载体中，酶切鉴定及测序证实序列正确后，以BamH I和EcoR v双酶切将Grb2 SH2基因片段切出，并与经同样酶切的pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR v)载体片断分别回收后进行连接反应，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经BamH I和EcoR v双酶切鉴定后，对获得预期大小的插入片段的载体再进行测序证实，命名为pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，此即为重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表达质粒。
2.重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒稳定转染HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3后对细胞增殖的影响
将对数生长期的SK-BR-3细胞以每孔2×105细胞接种于6孔培养板内，培养液均为DMEM(GIBCO Co)，10％小牛血清(杭州四季青生物制品厂)，在二氧化碳培养箱(37℃)中培养。次日当细胞生长至90-95％时，按照LipofectamineTM2000说明书进行脂质体转染。于转染后24h按照1∶10传代，48h开始以400μg/mL的G418进行筛选，获得稳定转染的细胞株。对照细胞以同样的方法转染空质粒pcDNA3.1(+)并筛选稳定细胞株。通过免疫印迹、流式细胞仪以及细胞实验检测Cbl-Grb2(SH2)-RING的表达对HER2蛋白水平、细胞增殖的影响。进一步通过体内结合实验及泛素化实验检测该重组嵌合分子是否能够结合靶蛋白HER2并促进其泛素化。
在实际应用到肿瘤病人时，拟将该质粒以脂质体包裹后行局部瘤体注射；或者进一步将Cbl-Grb2(SH2)-RING构建到腺病毒载体中，获得Cbl-Grb2(SH2)-RING重组腺病毒后利用适当滴度的重组腺病毒进行局部瘤体注射。
本发明的技术效果是：
1.构建了重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，经酶切鉴定(图2、3)和DNA序列测定证明，序列完全正确。
2.重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING对HER2阳性的乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞增殖的影响
2.1下调SK-BR-3细胞中HER2蛋白
免疫印迹分析显示，与稳定转染了pcDNA3.1(+)空质粒(vector)及CblN的对照细胞株比较，稳定表达Cbl-Grb2(SH2)-RING(CblN/Grb2)的SK-BR-3细胞中HER2发生下调(图4)。间接免疫荧光染色及流式细胞仪分析细胞表面HER2表达情况也证明后者HER2阳性率降低至28.4％(转染了空载体的对照细胞株为89.6％)。
2.2抑制SK-BR-3稳定转染细胞株的增殖
克隆形成实验表明，与稳定转染pcDNA3.1(+)的对照细胞株(control)比较，稳定表达Cbl-Grb2(SH2)-RING(CblN/Grb2)的SK-BR-3克隆形成率降低66％(图5)。
2.3结合并促进HER2泛素化
体内结合实验表明，SK-BR-3细胞中过表达的嵌合重组分子Cbl-Grb2(SH2)-RING与HER2具有相互作用，表明该嵌合重组分子能够在体内结合HER2。稳定表达嵌合重组分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的SK-BR-3细胞以及稳定转染了pcDNA3.1(+)的对照细胞株分别瞬时转染pcDNA3.1(+)-3×HA-Ub，并给予MG-132处理以抑制蛋白降解，细胞裂解液用抗HER2的抗体进行免疫沉淀，以抗HA的抗体进行免疫印迹检测，结果表明稳定表达重组分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的SK-BR-3细胞中HER2泛素化较对照细胞明显增加。(图5)。
经上述实验证明：本发明构建的重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，转染HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3后，通过与HER2蛋白结合并促进其泛素化、下调，能够有效抑制与HER2过度活化有关的细胞的增殖，因而具有抗HER2阳性肿瘤的用途。
Claims (3)
1.重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达载体的构建方法，其特征在于：
首先将BamH I和EcoR v引入Cbl N端基因SH2的两端，将其克隆入pGEM-T easy载体进行测序，测序正确后利用KpnI/XhoI酶切并将其插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体的KpnI/XhoI酶切位点之间，即pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)；
利用PCR得到Grb2 SH2基因片段并克隆到pGEM-T easy载体中，酶切鉴定及测序证实序列正确后，以BamH I和EcoR v双酶切将Grb2SH2基因片段切出，插入到pcDNA3.1(+)-CblN(BamH I+EcoR V)载体的BamHI/EcoR V酶切位点之间；
经BamH I和EcoR v双酶切鉴定后，对获得预期大小的插入片段的载体再进行测序证实，命名为pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING，即为重组嵌合Cbl泛素连接酶Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒。
2.重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING用于制备抗HER2阳性肿瘤的基因药物的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，重组嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING转染HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3后，通过与HER2蛋白结合并促进其泛素化、下调，抑制与HER2过度活化有关的细胞的增殖。
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