KR19990045761A - 사이클린 의존성 키나제 결합성 화합물 - Google Patents

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에스. 지 롬보티스
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Abstract

이 발명은 (i) 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 84 내지 103을 포함하는 펩타이드나 그 활성 부분 또는 유도체 또는 (ii) 프러그먼트, 활성 부분 또는 유도체의 미메틱을 포함하는 사이클린 의존성 키나제 (cdk)에 대한 결합특성을 갖는 물질로서, 총 길이 p16, p15, p18 및 p19 단백질을 제외한 물질을 확인하기 위한 것임. 이러한 물질들은 Rb 단백질의 포스포릴화를 억제하므로 종양억제에 유용하게 사용됨. 아미노산 프러그먼트는 결합성 cdk, 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 90 내지 92에 해당하는 FLD 모티브와 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 94 내지 97에 해당하는 LvvL 모티브에 응답할수 있는 아미노산 모티브의 분할에 의하여 이루어짐. 전술한 물질은 과증식성 질병의 치료와 유사한 특성을 갖는 분자의 스크린 및 설계에 사용할수 있음.

Description

사이클린 의존성 키나제 결합성 화합물
본 발명은 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 대한 결합특성을 갖고 있는 물질에 관계되는 것으로서, 특히 p16 프로테인 프래그먼트의 분석으로부터 유도된 전술한 특성을 갖고 있는 물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 물질을 포함하는 의약 조성물과 의학적 처치, 특히 과증식성 질병의 치료에 대한 전술한 물질의 용도에도 관계된다. 본 발명은 또한 관계된 활성을 갖는 화합물을 동정하는데 전술한 물질들을 이용하는 방법에도 관계된다.
종래의 기술
사이클린 의존성 키나제(cdk) 패밀리의 멤버들에 의한 Rb 유전자 제품(pRb)의 포스포릴화는 유사분열이 진행되는 세포감작의 중요한 단계이다. 이러한 단계는 제한(R) 포인트로 알려진 세포 사이클의 G1 위상 후기에 조정된다(6). cdk들은 양성 및 음성적으로 작용하는 세포 신호변환인자가 결합되도록 하는 중요한 제어인자이다. 유사분열생식성 자극은 후기 G1에서 pRb를 포스포릴화할수 있는 D-사이클린과 cdk4 또는 cdk6 사이의 활성 복합체를 유발한다. 이러한 키나제들은 접촉억제, 증식인자 스타베이션(starvation) 또는 TGF-β로부터 나타나는 세포증식억제 신호를 위한 표적물질이다. 억제 신호들은 키나제 또는 사이클린-키나제 복합체를 직접적으로 매개하는 INK4와 p21/KIP cdk-억제제의 두 신속하게 확대되는 패밀리들을 구성하는 다른 멤버의 생산 및 활성을 유발하므로서 키나제 활성을 차단한다(7). 확인된 INK 단백질의 패밀리는 p15, p16, p18 및 p19(20, 22, 23)를 포함한다.
p53 전사자극을 통하여 종양억제 활성에 직접 관여하는 p21cip1/WAF1(8)과는 달리, INK4p16 유전자는 대다수의 사람 종양에서 제거되거나 변이된다(9-15). INK4p16에서의 배아계통 돌연변이는 현색 색소세포종의 생존율 증가와 관련된다(9,10). INK4p16 유전자의 156 아미노산 생성물은 CDKN2 또는 p16INK4a(이하 p16이라 함)으로 알려 졌다.
도 1A 와 1B는 생체외 표현된 cdk4 또는 cdk6에 대한 p16 유도 펩타이드의 상대적인 결합을 보여준다.
도 1C는 p16 단백질의 아미노산 84 내지 103에 해당하는 펩타이드 6을 보여준다.
도 1D 와 1E는 펩타이드 6 아미노산의 알라닌 치환체 시리즈의 번역된 cdk4 및 cdk6에 대한 유사한 생체외 결합을 보여 준다. 알라닌에 의하여 치환된 아미노산 잔기들이 표시되고 각개 펩타이드에 의하여 침전된 cdk4 및 cdk6의 상대적인 양이 나타나 있다. 알라닌에 대한 아미노산 89-90 및 94-97에 해당하는 소수성 잔기의 치환은 두 키나제에 대한 펩타이드 6의 결합을 감소시키고, 동시에 Asp92의 치환은 상호작용을 현저하게 증가시킨다.
도 1F는 cdk4를 포함하는 Sf9 인섹트 세포 용해질을 펩타이드 6 (레인 1 및 4), 펩타이드 1 (레인 2 및 5) 및 펩타이드 10 (레인 3 및 8)을 포함하는 비오티닐화 펩타이드로 배양한 실험결과를 보여 준다. 복합체는 스트렙타비딘-피복 아가로즈 비이드와 함께 침강되었다. cdk4 밴드의 하부는 추출방법에 관계된다(재료 및 방법 참조). 이러한 실험결과는 펩타이드 첨가 전에 인섹트 세포 용해질을 포함하는 사이클린 D1이 cdk4에 첨가되는 경우에는 펩타이드를 함유하는 추출물이 cdk4에 결합할수 없음을 보여 준다. 그렇지만, 사이클린 D1을 첨가하기 전에 펩타이드를 cdk4에 첨가하면 펩타이드가 cdk4에 결합하여 펩타이드가 사이클린 D와 cdk들간의 결합을 방해하는 것으로 예상된다.
도 2A는 이. 콜리로 표현되고 정제된 총 길이 Rb 단백질의 포스포릴화 억제를 보여 준다. p16 유도 야생형 펩타이드(펩타이드 1, 6 및 10) 또는 펩타이드 6 알라닌 치환 시리즈들에 대하여 cdk4를 함유하는 Sf9 인섹트(insect) 세포로부터 나온 용해질에 의한 pRb 포스포릴화의 간섭에 대한 능력을 시험하였다. p16 시리즈의 펩타이드 1과 10은 cdk4 또는 cdk6을 침전시키지 않고 pRb 포스포릴화에도 영향을 미치지 않았다. 펩타이드 6은 cdk4 및 cdk6에 결하하여 pRb 포스포릴화 수준을 감소시킨다. 알라닌으로 치환된 펩타이드 6의 아미노산 잔기가 표시되고 각개 펩타이드의 존재하에 나타나는 pRb 포스포릴화의 수준이 도시되었다. 잔기 92 (Ala92)에서의 Ala-Asp 치환은 야생형 펩타이드 6보다 더 효과적으로 총 길이 Rb 단백질의 포스포릴화를 억제하는바, 이는 cdk4 및 cdk6에 결합되는 더 많은 능력을 나타내는 것이다. 위치 90과 95-97에 있는 소수성 잔기 또는 그 인근에 있는 소수성 잔기의 알라닌 치환은 억제 용량을 기초환경 수준까지 감소시켰다.
도 2B는 펩타이드 6, Ala 92 및 Ala 94의 양을 증가시켰을 때 pRB 포스포릴화에 미치는 영향을 보여 준다. 50μM에서 펩타이드 Ala-92에 의한 cdk4-사이클린 D 의존성 pRb 포스포릴화의 차단이 거의 완전하게 이루어 졌다.
도 3은 작은 펩타이드 캐리어에 결합된 펩타이드 6을 갖는 사람 케라티노사이트 유도 HaCaT 세포의 S-위상 침입을 억제하는 것을 보여준다. 세포들은 혈청과 10μM BrdU가 첨가되기 전에 GO에서 혈청 스타베이션에 의하여 72시간 동안 동조하였다. 도 3A는 페네트라틴 캐리어 분자에 결합된 100nM 펩타이드 6이 조직배양액에 첨가되었을 때 나타나는 혈청자극의 표시 시점을 보여 준다. 나타난 데이터는 혈청 단독으로 배양한 세포들에 관계되는 페네트라틴에 결합된 펩타이드 6으로 배양한 후 S-위상으로의 세포 침입억제율(%)을 보여준다.
도 3B는 BrdU 표식에 의하여 DNA를 합성하는 세포들을 보여 주는 패널 A, C, E 및 G를 도시한 것이고, 패널 B, D, F 및 H는 훼슈트(Hoescht)로 염색된 동일한 세포 영역을 보여 준다. 혈청자극 후 BrdU에 결합된 세포들의 백분율은 24시간 후 71% (E 및 F)와 3시간 후 14% (G 및 H)였다. 24시간 후에 나타나는 BrdU에 결합되는 세포들의 수는 페네트라틴 캐리어 분자에 결합된 펩타이드 6이 14시간후에 첨가되는 경우( 패널 C 와 D)에 비하여 12시간후에 첨가되는 경우 (패널 A 와 B) 현저하게 감소되었다. 페네트라틴만을 사용한 경우에는 DNA 합성에 영향을 미치지 아니하는 것으로 관찰되었다(도시하지 않았음).
도 4A는 생체내 pRb의 포스포릴화를 보여 준다. 하이퍼포스포릴화된 pRb는 하이포포스포릴화된 서부타입에 비하여 핵에 대한 낮은 친화력을 갖고 있고 트리톤 X-100(26)을 포함하는 하이포토닉 완충제를 사용하여 핵으로부터 추출할수 있다. 패널 A, C 및 E는 항-pRb 모노클로날 항체로 염색된 것을 보여 주고, 패널 B, D 및 F는 훼슈트로 염색된 동일한 계통의 세포를 보여 준다. HaCaT 세포들은 혈청 첨가전에 72시간 동안 스타브된 혈청이다. 페네트라틴에 결합된 펩타이드 6 (패널 C) 또는 페네트라틴 자체 (패널 A)는 100nM으로 혈청 첨가 8시간 후에 첨가하였고, 23시간 후에 pRb 추출성을 측정하여(패널 A 및 C) 포스포릴화된 pRb의 양을 결정하여 비추출 염색된 것(패널 E)과 비교하였다.
도 4B는 웨스턴 블로트 분석에 의하여 측정된 HaCaT 총 세포추출물중의 pRb 포스포릴화 상태를 보여 준다. 세포들은 혈청 첨가전 72시간 동안 스타브되고 지정된 시점에서 수확하였다. 페네트라틴에 결합된 펩타이드 6 또는 페네트라틴 자신은 지시된 대로 10시간 후에 첨가하였다.
도 5A는 p16의 다른 INK 패밀리 멤버 프러그먼트의 해당 영역으로부터 나온 펩타이드에 관계되는 p16에 의한 pRb 포스포릴화의 상대적인 억제를 보여 준다. 특히, 도 5A는 p16 프러그먼트의 크기 감소가 pRb 포스포릴화에 미치는 영향을 보여 준다. 도 5B 및 5C는 INK 패밀리 멤버와 프러그먼트들이 cdk4 및 cdk6에 결합되었음을 보여 준다.
도 6A 및 6B는 cdk-사이클린 D 키나제 활성의 억제에 대한 펩타이드 20과 21 (도 6A) 및 wt p16과 V95,96A p16(도 6B)의 농도증가 효과를 보여 주는 그래프이다. 펩타이드 20은 D92A 돌연변이를 수반하는 36 aa 긴 합성 펩타이드이고, 펩타이드 21은 VV95, 96AA 돌연변이를 수반한다.
도 7은 20 aa 펩타이드 (펩타이드 6, V95,96A 및 D92A 돌연변이 p16 펩타이드)에 결합되어 페네트라틴 시퀀스가 20aa 펩타이드(예를들면, N-페네트라틴-p16-C)의 말단에 존재하는 16aa 페네트라틴 시퀀스를 포함하는 3종의 상이한 펩타이드 36aa 펩타이드로 처리된 HaCaT 세포들의 형광세포분석(FACS)결과를 보요 준다.
발명의 상세한 설명
재료 및 방법
펩타이드 침강
p16의 5 aa 오우버랩(1차 8-말단 잔기 로부터 떨어져 있는)을 갖는 20 aa 펩타이드 라이브러리를 비오틴 그룹이 결합된 N-말단에 SGSG 링커를 삽입하여 합성하였다. 알라닌 치환체 시리즈도 동일한 방법으로 합성하였다. 펩타이드를 아가로즈 비이드에 고정된 스트렙타비딘에 결합시키고, PBS로 4회 세척한 다음35S-메티오닌 표식 cdk4와 cdk6을 함유하는 토끼 망상 적혈구 용해질(프로메가)로 얼음욕 위에서 1시간 동안 배양한다. 비이드들을 0.2% 트리니트론 X-100을 포함하는 1.2 x PBS로 4회 세척한 다음, SDS 함유 완충액을 가하고 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 처리한다. 겔을 방사선사진 필름에 노출시키고 자기농도 분석기를 이용하여 cdk4 및 cdk6에 해당하는 밴드를 분석하였다.
생체내 pRb 포스포릴화
펩타이드를 50 mM 히페스(Hepes) pH 7.4, 10 mM MgCl2, 2.5 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM NaF 및 1 mM Na3VO4를 포함하는 완충액을 사용하여 25 mM의 농도로 배양하고, 사람 cdk4-표현 간상체 바이러스로 감염된 Sf9 인섹트 세포로부터 나온 추출물 3ml를 10 mM 히페스, pH 7.4, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 0.5 mM PMSF에 용해시킨다. 이 혼합물을 얼음욕에서 60분 동안 배양한다. 전술한 바와 같이 제조한 Sf9 용해질 3ml를 포함하는 사람 사이클린 D를 0.6 mg의 정제된 재조합 총 길이 Rb 단백질 및 2.5 mM32P ATP 와 함께 ATP의 최종농도가 50 mM로 되도록 혼합하고 30℃에서 10분 동안 배양한 다음, SDS 함유 완충액을 첨가하여 반응을 종결시키고 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에 지지시킨다. 겔을 방사선사진 필름(도 2A)에 노출시키고, pRb 포스포릴화 정도를 포스포이메이저(도 2B)로 측정하였다.
세포 사이클 억제
시스테인 잔기를 펩타이드 6의 C-말단에 삽입하고 디설파이드 결합에 의하여 안테나페디아 호메오도메인 (24) (아플리겐)의 16 아미노산 긴 페네트라틴 펩타이드(아미노산 시퀀스 RQIKIWFQNRRMKWKK)에 결합지키는데 사용한다. 세포들을 덮개유리에 접종하고 FCS 없이 DMEM 배지에서 72시간 동안 스타브시킨다. 배지를 10% FCS와 BrdU를 함유하는 DMEM으로 바꾼다. 결합된 펩타이드들은 혈청자극 후 상이한 시점에서 삽입되었다. 세포들을 아세톤/메타놀 (1 : 1)로 덮개유리에 고정시키고 1 M HCl에서 30분 동안 배양한 다음, PBS로 6회 세척하고 제2 항체와 혼합하여 훼슈트를 함유하는 모비올(Mowiol)에 지지시킨 항-BrdU 모노클로날 항체와 텍사스 레드로 배양하여 24시간 후 BrdU에 결합된 세포의 수를 측정하므로서 S-위상으로 침입된 세포의 수를 결정한다. 각개 실험에는 세 개의 덮개유리에 최소한 세 개의 다른 구역을 설정하여 최소한 두 번의 실험을 반복하여 각 실험마다 결과를 측정한다. 도 3A에 도시된 값들은 대표적인 한 실험 결과에서 나온 것이다.
형광세포분석
수확 20분 전, 세포들을 10μM BrdU로 배양한다. 트립틴화 세포들은 PBS로 세척하고 재차 1 ml의 PBS에 분산시키고 조심스럽게 3ml의 96% EtOH와 혼합한 다음, 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포들을 1mg/ml의 펩스타틴을 포함하는 2ml의 30mM HCl에서 37℃로 30분 동안 배양한 다음, 2M HCl에서 15분 동안 배양한다. PBS로 6회 세척한 다음, 세포들을 200μl(1 : 50)의 항-BrdU 항체(벡톤 디킨스)에서 실온으로 20분 동안 배양한다. PBS로 세척한 후, 세포들을 FITC 융합 항-마우스 IPG(1 : 80) (시그마)에서 30분 동안 배양한다. 세척후, 세포들을 재차 25μg/ml의 프로포듐/아이오다인을 함유하는 PBS에 분산시키고 형광세포분석분리장치를 사용하여 형광세포분석한다.
생체내 pRb 포스포릴화
하이퍼포스포릴화된 pRb를 덮개유리에서 배양한 세포들을 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 하이포토닉 완충액으로 처리하여 추출한 다음, 아세톤/메타놀(1 : 1) (26)로 고정시킨다. 고정된 세포들은 항-pRb 모노클로날 항체 IF8로 1시간 동안 배양하고 PBS로 3회 세척한 다음, 제2 항체와 배합된 텍사스 레드로 45분 동안 배양하고 훼슈트를 함유하는 모비올에 치상한다.
웨스턴 블로트 분석을 위하여, 세포들을 50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1.0% NP-40, 0.5% DOC, 0.1% SDS 및 0.1 mM PMSF를 함유하는 RIPA 완충액에 +4℃에서 30분 동안 용해시킨다. 시료들을 SDS 함유 완충액에서 끓이기 전에 단백질 농도를 측정하고, 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 옮긴 다음, 니트로셀룰로우스 막으로 이입시킨다. 필터를 항-pRb 모노클로날 항체 IF8로 배양한 다음, 제2 항체(DAKO)와 배합된 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 배양한 후, ECL(아머샴)로 발육시킨다.
사이트-방향성 돌연변이 유발
VV95,96AA 돌연변이는 프로메가사의 변형 사이트-방향성 돌연변이 유발 킷트를 제조회사의 지침에 따라 사용하여 야생형 히스-태그 p16 단백질 속으로 도입하였다. 돌연변이는 GTG GTG로부터 GCG GCG 까지의 해당하는 코돈들을 변경시키고 DNA 배열에 의하여 시퀀스를 구성시키므로서 도입되게 된다.
결과
cdk에 결합하는 p16 영역의 확인
도 1A 및 B는 p16의 aa 84 내지 103에 해당하는 펩타이드(펩타이드 6)가 스트렙타비딘 아가로즈에 결합되었을 때 망상적혈구 용해질로부터 cdk4 및 cdk6을 추출할수 있음을 보여준다. 이 펩타이드의 알라닌 치환체 시리즈(도 1C)는 잔기 89 내지 96사이의 영역에 있는 소수성 아미노산들의 치환체가 cdk4 및 cdk6에 결합하는 펩타이드의 능력을 감소시킴을 보여준다. 흥미롭게도, 아스파틱산 92는 알라닌과 함께 두 키나제에 대한 펩타이드의 결합을 증진시킨다(도 1D 및 E).
p16 프러그먼트와 pRb 포스포릴화의 억제
p16 펩타이드가 사이클린 의존성 키나제와 상호작용하는 기능적인 중요성을 설명하기 위하여, 펩타이드 6의 알라닌-치환체 시리즈 뿐만 아니라 p16 유도 펩타이드들이 생체내 및 생체외에서 pRb를 포스포릴화하는 cdk4-사이클린 D 능력에 영향을 미치는지에 대하여 실험하였다(도 2). 오직 p16 유도 시리즈만이 pRb 포스포릴화를 현저하게 감소시켰다(펩타이드 1, 6 및 10으로부터 나온 결과만이 도시되었다). 알라닌-치환체 시리즈에 있는 각종 펩타이드의 cdk4 및 cdk6에 대한 결합능력과 cdk4-사이클린 D1 키나제 활성의 억제 정도와의 상관관계도 관찰되었다.
p16 결합 도메인에서의 돌연변이 영향
총 길이 p16 단백질의 aa 89 내지 96에 해당하는 잔기들 사이에 위치하는 두 소수성 영역내에 있거나 또는 그 주위에 있는 아미노산 치환체들은 펩타이드 6 유발 pRb 포스포릴화의 억제를 감소시키는 것으로 나타났다. 아스파틱산을 알라닌으로 변화시키면 펩타이드가 cdk4 키나제 활성의 억제에 펩타이드 6 보다 더 많은 능력을 나타내는 것으로 나타났다. 희석한 시리즈는 50μM 펩타이드 농도에서 pRb 포스포릴화가 Ala 92 펩타이드와 펩타이드 6에 의하여 완전히 차단되는 것으로 나타났다. 반면, 이 검사에서 단일 치환체 Ala 94는 펩타이드 6의 기능을 완전히 불활성화시켰다(도 2B). Ala 92 펩타이드의 향상된 결합과 키나제 억제제로서의 보다 큰 효과는 천연 p16 단백질의 활성 억제 사이트에 보다 유사한 구조를 갖도록 펩타이드를 개량하므로서 펩타이드 6 시퀀스의 더 많은 변종들이 더 우수한 효과를 갖도록 할수 있음을 암시한다. 펩타이드 6과 기타 관련된 단백질에 의하여 표현되는 p16의 억제 사이트를 확인하기 위한 전술한 작업들을 대비하여 보면, 동일한 모티브가 키나제 억제제 p15(21, 22)의 해당하는 도메인에 존재하고 인접한 관련 p18 (21) 및 p19 (22, 23) 억제제에도 보존됨을 알수 있다. 이러한 사실은 본 발명의 작업 이전에는 관련 업계에도 알려지지 않은 것이다.
p16 유전자에서의 점 돌연변이는 식도와 방광(9, 10, 14, 15)의 종양 뿐만 아니라 흔히 나타나는 1차 색소세포종으로부터의 종양에서도 발견되었다. 이러한 돌연변이의 일부는 펩타이드 6으로 둘러 싸인 영역 내부나 그 주위에 집합되었으며, 세포 증식과 pRb 포스포릴화를 억제하는 능력을 상실하였음을 보여 주었다(3, 4, 12). 이러한 사실은 p16 단백질 기능에 대한 전술한 영역의 중요성을 입증하는 것이다.
p16 단백질의 불활성화에 의하여 나타나고 cdk에 대한 결합을 매개하는 것으로 예상되는 전술한 예상된 영역의 외측에 존재하는 p16 단백질에서의 돌연변이는 p16 단백질의 총체적인 구조변화를 유발하거나 온도 감수성으로 되게 하는 것으로 알려졌는바, 이러한 현상은 전술한 돌연변이가 본인들이 결합을 매개하는 것으로 예상한 도메인의 구조에 영향을 미치는 것으로 추측된다. 더구나, p16 N- 또는 C-말단의 결실은 p16에 불활성화를 가져와 p16의 구조가 감수성을 갖고 있다는 가설을 지지하고 있다.
세포증식에 대한 p16의 효과와 캐리어 펩타이드의 사용
배양된 세포에 있는 p16의 과표현이 S-위상 침입을 차단하므로(1-4), 본인들은 펩타이드 6이 세포증식에 영향을 미치기를 바랐다. 생물학적 막을 통하여 에너지와 무관하게 신속하게 전위되는 것으로 알려진(24) 안테나페디아 호메오도메인의 16 aa 영역은 펩타이드에 대한 캐리어로서 결합되어 혈청-스타브된 사람 케라티노사이트 유도 HaCaT 세포의 조직 배양액에 첨가된다.
도 3은 혈청 첨가 후, 12시간 또는 그 이후에 캐리어 분자에 결합된 p16 펩타이드 0.1μM을 첨가하면 S-위상으로 침입되는 세포의 수가 혈청 첨가후 24시간 후에 첨가된 BrdUdp 의하여 극적으로 감소됨을 보여 준다. 그렇지만, 결합된 배지가 혈청 첨가 후 14시간 내에 첨가된 경우에는 S-위상으로 침입하는 세포의 수가 펩타이드로 처리하지 아니한 세포에서 나타난 경우와 동일하였다. 이러한 사실은 펩타이드의 효과가 G1의 후단 부분에 해당하는 세포 사이클의 좁은 대역에만 한정됨을 의미한다. 이러한 좁은 대역은 혈청자극 및 단백질 합성이 세포가 S-위상으로 침입하는 것을 요구하지 않는 제한(R) 포인트를 포함하는바, 이러한 제한(R) 포인트는 pRb 포스포릴화의 임계시간으로 예상된다(6, 25).
스타브된 세포들이 혈청 첨가 24시간 후에 캐리어 분자에 결합된 p16 펩타이드 또는 캐리어 분자만으로 배양된 경우에는, 23시간 후에 검사하였을 때와 pRb 추출능력에서 차이가 나타났다. 캐리어 분자만으로 배양한 경우에는 세포들의 14% 만이 배양되었으나 항-pRb 모노클로날 항체로 처리된 펩타이드 6으로 배양한 경우에는 세포의 60%가 배양되었다(도 4A). 이러한 관찰은 유사한 조건하에 처리된 총 HaCaT 세포 추출물의 웨스턴 블로트 분석에 의하여 확인되었다(도 4B). 전술한 분석결과는 캐리어 펩타이드에 결합된 펩타이드 6이 12시간 전에 첨가된 경우에는 하이포포스포릴화된 pRb를 수반하는 세포의 수가 혈청자극 23시간 후 현저하게 증가함을 의미한다. 또한 이러한 사실은 간상체바이러스 감염 Sf9 세포 추출물(도 2)에서 관찰된 cdk4-사이클린 D 활성의 억제가 생체내에서 일어남을 의미한다.
결합된 펩타이드가 첨가된후 0 내지 12시간 사이에 S-위상으로의 침입억제가 일관성있게 일어나는 것은 펩타이드의 효과가 꾸준하게 나타남을 의미함과 동시에 펩타이드에 결합된 케리어가 세포내에서 신속하게 분해되지 않음을 의미한다. 이러한 사실은 안테나페디아 호메오도메인 캐리어 펩타이드가 세포 내에서의 단백질 분해로부터 보호된다는 것을 가정한 보고서와 일치한다(24)
p16의 cdk 결합 모티브의 정제 및 다른 단백질과의 비교.
전술한 결과는 p16의 제3 안키린상 반복으로부터 유도된 20 aa 펩타이드가 총 길이 단백질과 같은 유사한 속성, 예를들면 사이클린 의존성 키나제 cdk4 및 cdk6에 대한 결합특성 및 생체내 cdk4-사이클린 D1 키나제 활성을 억제하는 특성과 세포 사이클 진행을 차단하는 특성을 갖고 있음을 의미한다. 이러한 영역은 총 길이 p16 단백질의 aa 84 내지 103에 해당하고 p15의 해당부위에 일치하는 펩타이드 시퀀스를 포함하고 마우스 p16 에는 물론이고 p18 및 p19 에도 고도로 보존된다.
키나제 억제제의 INK 패밀리 멤버들이 cdk4 및 cdk6과의 직접적인 상호작용에 의하여 CDK-사이클린 D 키나제 활성을 억제하므로, 본인들은 이러한 활성이 전술한 단백질 사이에서 일역을 담당하고 있는 하나의 고도로 보존된 도메인을 측정할수 있는지 알기를 원했다. 전술한 멤버들은 주로 종양억제 활성에 관련된 INK 패밀리의 p16이고 보다 밑으로는 p15 이므로 이러한 상이한 단백질들의 표현 조절이 그들의 통상적인 작용보다 오히려 종양억제로서의 역할을 결정할 것이라고 가정하는 동일한 도메인을 통하여 유사한 형태로 CDK-사이클린 D 키나제 복합체를 억제할 것인지 아는 것이 중요하다. 따라서 본인들은 이러한 펩타이드 도메인이 최소로 감소되고 프로테아제 분해에 영향받지 아니하는 변형된 아미노산 잔기로 치환된 경우, 합성 종양억제 펩타이드용 모델로서의 잠재력을 개선할수 있는지 알기 위하여 실험을 실시하였다.
cdk4 및 cdk6에 대한 펩타이드의 결합을 연구하기 위하여 본인들은35S-표식된 메티오닌의 존재하에 결합된 기내 망상 적혈구 번역 시스템에서 단백질을 표시하였다. 펩타이드의 N-말단에 있는 Ser-Gly-Ser-Gly 링커에 결합된 비오틴 그룹을 스트렙타비딘 피복 아가로즈 비이드에 결합시키고 세포 용해질로 배양하였다. 도 5A는 pRb 포스포릴화를 측정한 결과를 보여주고, 도 5B 및 5C는 cdk4 및 cdk6에 대한 INK 패밀리 멤버와 p16 펩타이드의 결합에 대한 측정결과를 보여 준다.
도 5A-C는 p18 및 마우스 p16으로부터 유도된 p16의 84-103 영역에 해당하는 펩타이드가 cdk4와 사이클린 D1을 과표현하는 Sf9 인섹트 세포 용해질에 의하여 pRb 포스포릴화를 억제하는 그들의 능력을 반영하여 pRb 포스포릴화를 억제하고 유사한 방법으로 cdk4와 cdk6 모두에 결합됨을 보여 준다.
이어서 본인들은 N- 또는 C-말단으로부터 동시에 두 잔기를 결손시켜서 만든 p16 펩타이드 결손 시리즈를 실험하였다. 본인들은 N-말단에 있는 두 잔기(도 5A-C의 펩타이드 6)를 동시에 제거하면 cdk 결합과 키나제 억제효과를 심각하게 감소시키고 다른 두 잔기가 어느 한 말단에서 결손되면 활성이 재충전됨을 알았다. 오직 펩타이드 10은 안키린상 반복중에 보존된 모티브에 해당하는 10 잔기를 포함하고 밀집된 이차 나선구조를 형성하는 것으로 예상된다. 이 펩타이드는 그 결합능력의 일부를 상실하지만 아직도 원래의 20 아미노산 p16 펩타이드가 최소한 10 잔기와 함께 감소되어 CDK-사이클린 D1 키나제 활성을 억제할수 있음을 보여 주는 우수한 키나제 억제제이다. 이러한 결손 시리즈와 알라닌 스캔은 본인들이 실험한 펩타이드에는 결합과 키나제 억제 사이에 강력한 상관관계가 존재함을 보여 주었다
R87P 치환체는 펩타이드의 기능을 방해하지 않는다는데 주목할 필요가 있다. 이미 검출된 대부분의 p16 돌연변이와 마찬가지로 이 돌연변이도 cdk와의 펩타이드 상호작용에 중요한 것으로 알려진 영역 밖에 위치하므로 이러한 돌연변이는 중앙의 안키린형 도메인에 영향을 미치는 단백질의 구조적인 변화를 유발하는 것으로 추측된다. 이러한 가정은 P114와 G101W가 단백질의 총체적인 구조변화를 가져오고 R87P 돌연변이가 온도감수성임을 보여준 최근의 NMR 연구에 의하여 확인된다.
유사한 설명이 두 잔기가 N-말단으로부터 떨어져 나갔을때 이러한 결손이 펩타이드의 구조적인 변화를 가져와 펩타이드가 그 효력을 상실한다는 놀라울 만한 관찰에 대한 해답을 줄수 있었다. 최소한도의 결합 펩타이드 (펩타이드 10)는 기본적으로 앰피파틱 나선 휠을 형성할수 있는 극성 잔기들에 의하여 둘러 싸인 두 소수성 영역으로 구성된다. p18 펩타이드는 p16 펩타이드에 비교되는 8 치환체를 갖고 있고, 위치 95 및 96에 있는 QT는 우선적으로 제2 소수성 포켓을 파괴하여 펩타이드의 결합 도메인을 교란하는 것으로 생각된다. 그렇지만, 이 펩타이드는 극성 잔기로 둘러싸이는 대신 위치 97 및 98에 두 소수성 잔기를 갖고 있고 또한 이 펩타이드는 로이신 98 뿐만 아니라 손상되지 않은 GFLD 영역을 갖고 있는바, 이러한 사실은 제2 소수성 포켓이 수개의 잔기들을 cdk 결합에 영향을 미침이 없이 C-말단으로 이동될수 있음을 암시한다.
전술한 결과는 p16 프러그먼트의 크기 감소가 cdk 억제(펩타이드 6 참조)의 일부 감소를 가져온 후, p16 프러그먼트 크기의 추가 감소는 재차 억제(펩타이드 7-10 참조)를 증가시킨다는 것을 보여 준다. 이러한 사실은 16 aa (펩타이드 7), 14 aa (펩타이드 8), 12 aa (펩타이드 9) 및 10 aa (펩타이드 10)를 포함하는 작은 펩타이드 들이 총 길이 p16에 유사하거나 동일한 생물학적 효과를 갖고 있다는 것을 입증하는 것이다. 이러한 결과는 p16의 두 모티브가 키나제 결합, FLD 모티브 및 LVVL 모티브에 중요하다는 견해를 지지한다.
따라서, 이러한 결과는 전술한 p16의 20 aa 프러그먼트 (잔기 84 내지 103)가 최소한 50% 더 작게 만들 수 있고 작게 만들어도 활성을 유지함을 나타낸다.
위치 95 및 96에 있는 알라닌 치환체
p16 펩타이드의 알라닌 스캔 치환체 시리즈로부터 나온 전술한 결과는 위치 95 및 96에 있는 두 밸린 들이 cdk에 대한 펩타이드의 결합 및 키나제 억제기능에 중요할수 있음을 암시할뿐만 아니라 알라닌에 대한 아스파틱산의 치환이 결합과 키나제 억제능력을 강화한다는 것을 암시한다. 펩타이드 결손 시리즈에 따르면 이러한 잔기들이 펩타이드의 결합을 매개하는 10 잔기내에 있음을 분명히 알수 있다.
따라서, 이를 더 연구하기 위하여, 본인들은 VV95;96AA 및 D92A 돌연변이를 생물학적 막을 통하여 펩타이드를 운송하기 위한 안테나페디아 호메오도메인의 제3 도메인에 결합된 고도로 정제된 펩타이드속으로 도입하고, 또한 cdk4 및 cdk6에 대한 펩타이드 결합에 중요하다고 생각되는 잔기들이 총 길이 단백질의 결합에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 VV95;96AA를 총 길이 단백질속으로 도입하였다. VV95;96AA 돌연변이는 히스-태그 야생형 p16에 도입하여 이. 콜리로 표시하고 해당하는 펩타이드를 99.9% 순도로 합성하였다.
도 6A와 6B는 이러한 연구결과를 보여준다. 실험결과는 두 VV95,96A 치환체를 갖는 펩타이드 21이 생체내에서 현저하게 적은 활성을 갖고 있음을 보여준다. 동일한 펩타이드는 생체외에서 cdk-사이클린 D 키나제 활성을 억제하는 작용도 적은 것으로 나타났다. 이러한 사실은 이러한 잔기들이 펩타이드가 cdk4 및 cdk6에 결합하는데 중요한 역할을 하는 것으로 가정한 전술한 제1 알라닌 스캔의 결과를 확인시켜 준다.
동일한 치환체들이 야생형 히스-태그 p16 프로테인에 삽입된 경우에도 유사한 키나제 억제 활성의 감소가 관찰되었다(두 경우 모두에서 50% 키나제 억제 농도가 약 5배 증가하였다). 본인들은 어떤 특정한 이론에 억메이지는 않지만 이러한 결과는 이러한 잔기들이 cdk4 및 cdk6에 대한 총 길이 단백질과 p16 펩타이드 프러그먼트의 직접적인 결합에 참여한다는 견해를 지지하는 것이다. 즉, 키나제 억제 메카니즘은 총 길이 단백질과 전술한 펩타이드 프러그먼트에서 동일하게 나타난다.
생체내에서는, 동일한 농도의 펩타이드 20은 HaCaT 세포에서의 S-위상 침입을 거의 와벽하게 차단하지만, 펩타이드 21은 10μM 펩타이드 농도에서도 오직 최소한의 효과만을 나타내었다.
상이한 세포계의 p16에 대한 응답
p16(-/-)(넉아우트)인 생쥐들로부터 얻은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)와 정상적인 p16(+/+)로부터 얻은 마우스 배아 섬유아세포에 대하여 전술한 페네트라틴에 결합된 p16 펩타이드에 대한 감수성을 실험하였다. 페네트라틴에 결합된 동일한 양의 p16 펩타이드를 처리하고 12시간 후에 G1의 (-/-) 세포 개체군이 42% 증가한 반면 (+/+)는 9% 증가하였다. 24시간후에는 전술한 증가율이 22%와 5% 였다. 동시에 (+/+) 30%에 대한 S-위상의 감소는 33% 였다. 이러한 결과는 p16(-/-) MEF들이 (+/+)보다 p16 펩타이드에 대하여 더 감수성이 있음을 의미한다.
본인들은 섬유아세포, 에피델리아 및 근육 조직으로부터 채취한 세포에 대하여 실험한 결과, 이들은 p16 펩타이드에 응답하여 유사한 증식억제를 나타냄을 알게 되었다. 그러나 비교실험에 사용한 Saos 2(pRb 음성 세포계통)에서는 증식억제가 관찰되지 아니하여 p16의 생물학적 작용이 pRb 포스포릴화의 억제에 의하여 나타남을 확인할수 있었다. 이러한 결과는 표 1에 요약되었다.
본인들은 또한 p16 펩타이드가 마우스 근원세포(C2C12 세포)가 마이어튜브 세포로 분화되는 것을 억제하는지를 알기 위하여 실험하였다. 실험 결과는 C2C12 세포들은 0.5% FCS 배지에 주입하였을 때 증식을 중단하고 다핵 마이어튜부 세포로 분화되지 않았다. 그러나, 이들을 p16 펩타이드로 처리하였을때는 0.5% FCS의 존재하에 더 이상의 생장이 중단되고 다핵 마이어튜브 세포의 형성을 억제함을 알게 되었다.
실험한 세포계통 p16 펩타이드에 의한증식억제 효과 세포원
p16(-/-) ++
C2C12 ++
HaCaT +++ 사람 케라티노사이트 계통
사람 일차케라티노사이트 +++
MRC5 + 사람 섬유아세포
MCF7 +++ 마우스 배아 섬유아세포 p16 양성
MEF +/+ + 마우스 섬유아세포 계통
3T3 ++ pRb 음성 종양 세포 계통
Saos2 - pRb 음성 종양 세포계
본인들은 p16 펩타이드로 처리한 에피테리알 세포들이 세포-콜로니의 형태를 더 밀집되고 둥그런 표현형으로 변화시킴을 확인하였다. 이러한 현상은 트립신 처리후 세포들이 떨어져 나가기 전에 6배 증가를 가져오는 조직배양 접시에 대한 세포 유착의 증가와 관련되는 것으로서, 펩타이드들이 세포유착 특성을 변화시킬수 있음을 나타낸다. 이러한 세포유착 특성의 변화는 종양이 2차 종양으로 확산되는 것을 방지하는데 이용할수 있어서, 종양 세포의 감염능력을 변화시키는 방법에 이용될수 있다.
최종적으로, 예비실험 결과는 베타-갈 검사에 의하여 결정된바와 같이 펩타이드가 세포(HaCaT 세포)로부터 유도된 사람 케라티노사이트의 노쇄와 관련됨을 암시한다. 이러한 전제하에서 p16 단백질의 생리학적 기능중 하나가 생체내 종양억제 역할에 이어질수도 있는 노쇄 메카니즘을 포함한다는 것이 중요하다. 세포의 노쇄를 확인하는 검사방법은 딤리 등, 피.엔.에이.에스., 1995, 9396에 기재되어 있다.
형광세포분석
도 7은 20 aa 펩타이드에 결합된 16 aa 페네트라틴 시퀀스로 조성된 상이한 펩타이드 36 aa펩타이드(펩타이드 6, V95,96A 및 D92A 돌연변이체 p16 펩타이드)로 처리된 HaCaT 세포의 형광세포분석 결과를 부여 준다. 이 그래프는 FCS를 갖고 있지 않는 세포들이 G1 위상에 있으며 펩타이드의 첨가에 의하여 적절하게 저지됨을 보여 준다.
결론
이러한 결과는 p16 펩타이드의 잔기 84 내지 103에 해당하는 20 aa 합성 펩타이드가 총 길이 야생형 p16 단백질에 대한 전술한 필수적인 생화학적 및 생물학적 특성을 모방함을 보여 준다. 가장 중요한 것은 작은 캐리어 분자에 결합된 펩타이드가 조직배양액에 직접 첨가한후에 생체내 세포 포스포릴화를 억제하는 능력을 나타낸다는 것이다. 이 방법은 생물학적 이벤트를 연구함에 있어서 작은 펩타이드를 광범위하게 이용할수 있도록 하고, 특정한 억제 유전자 기능을 치료용으로 변화시키고 신규한 항-증식성 약물용 표적을 확인하기 위한 모델로서의 역할을 하도록 하는데 사용할수 있게 한다.
다수의 상이한 종양들은 cdk4 및 cdk6의 표시와 p16 기능의 손실을 보여주는 pRb 포스포릴화 조정경로에서 벗어난다. 이러한 모든 종양들은 생체내에서 cdk-사이클린 D 활성을 억제하는 약물을 위한 잠재성 캔디데이트들이다.
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본인들은 cdk4 및 cdk6과 같은 사이클린 의존성 키나제와 상호작용하는 p16의 부위를 확인하고, 이러한 p16 부위에 기초한 펩타이드를 포함하는 물질에 cdk들이 결합되면 Rb 단백질의 포스포릴화를 억제하므로 이들을 종양억제에 이용할수 있다는데 착안하여 본 발명을 완성하였다.
작은 펩타이드들은 때때로 단백질-단백질 상호작용에 과여된 단백질의 영역과 생물학적 활성을 확이하기 위한 강력한 도구가 될 수 있다(16-19). 이러한 연구과정에서 본인들은 p16 아미노산 시퀀스를 연결한 오우버랩되는 20 아미노산 (aa) 펩타이드 계열을 합성하고, 토끼 망상적혈구 용해질로 표시되는35S-표식 cdk4 및 cdk6과 상호작용하는 각개 비오티닐화 펩타이드의 능력을 실험하였다.
전술한 실험결과 cdk4 및 cdk6와 상호작용하고 생체외에서 Rb 단백질의 cdk4-사이클린 D1 매개성 포스포릴화를 억제하는 p16의 잔기 84 내지 103에 해당하는 20 아미노산 합성 펩타이드를 동정하였다. cdk4와 cdk6 상호작용 및 Rb 포스포릴화의 억제에 중요한 아미노산 잔기는 알라닌 치환체 계열로 확인되었다. 본 발명에서, p16의 잔기 84 내지 103은 예를들면 도 1C에서 DAAREGFLDTLVVLHRAGAR로 표시된 시퀀스에 해당한다.
더구나, p16-유도 펩타이드 차단 세포 사이클은 작은 펩타이드 캐리어 분자에 결합시켜 조직배양용 배지에 직접 처리하였을 때, 혈청 스타브된 사람 HaCaT 세포 및 정상적인 세포사이클을 갖는 다른 형태의 세포 둘다에 있는 S-위상으로 들어 간다. 이들은 생체내 pRb 포스포릴화의 억제에 관계된다. 이러한 결과는 작은 캐리어 분자에 결합된 p16-유도 합성 펩타이드가 총 길이 p16 단백질의 과다표현과 연관된 G1-위상 정지를 모방할수 있음을 나타낸다. 이러한 사실은 사람 종양에서 p16 억제 유전자 기능의 회복에 대한 경로를 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 형태는
(i)총 길이의 p16 단백질의 아미노산 잔기 84 내지 103 또는 이들의 활성 부분이나 유도체를 포함하는 펩타이드, 또는
(ii) 프러그먼트, 활성 부분 또는 유도체의 기능성 미메틱을
포함하는 사이클린 의존성 키나제 (cdk)에 대한 결합특성을 갖고 있는 물질을 제공한다. 전술한 물질에서, 총 길이 p16, p15, p18 및 p19 단백질은 제외된다.
바람직한 사이클린 의존성 키나제(cdk)는 cdk4 또는 cdk6 이다. 본 발명의 물질은 또한 cdk들과 사이클린 D 사이에 형성된 복합체에 의하여 매개된 Rb 단백질의 포스포릴화를 억제하는 특성을 갖고 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 물질은 S-위상 속으로의 세포 침입을 억제하므로 세포분화를 차단하기 위하여 사용할수 있다. 본 발명의 물질은 사이클린 의존성 키나제를 결합시키면 이들은 세포중의 사이클린 D 레벨을 증가시키는 부수적인 생물학적 효과를 갖는 cdk들과 사이클린 D 사이의 복합체 형성을 방지하는데 사용할수 있다. 본 발명의 물질은 pRb의 cdk4 및 cdk6 의존성 포스포릴화를 차단함과 동시에 pRb 패밀리 멤버 p107 및 p130을 포함하는 다른 세포 기질 또는 cdk4 및 cdk6 매개성 조절을 위하여 표적으로 하는 기타의 물질을 표적으로 하기 위하여 사용할수도 있다.
본 발명에서, "활성 부분"은 전술한 프러그먼트의 총 아미노산 시퀀스 보다 작으면서 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 결합되는 특성을 유지하는 펩타이드 부분을 의미한다. 특히 전술한 펩타이드는 pRb 포스포릴화를 억제하는 특성을 갖고 있다.
본 발명에서, "유도체"는 예를들면 단백질을 부호화하는 핵산을 조작하거나 또는 단백질 자체를 변화시키는 방법 등에 의하여 단백질의 아미노산 시퀀스를 변경시켜 변성시킨 단백질을 의미한다. 천연 아미노산 시퀀스의 전술한 유도체들은 기본적으로 단백질의 필수적인 활성변화 없이 하나 또는 그 이상의 아미노산이 삽입, 부가, 결실 또는 치환된 단백질을 의미한다. 예를들면, 아스파틱산 92가 알라닌으로 치환된 펩타이드 6의 유도체는 cdk4 및 cdk6에 결합될 때 펩타이드 6(잔기 84 내지 103) 보다 pRb 포스포릴화를 억제하는 능력이 더 큰 것으로 나타 났다. 기타 유도체로는 아미노산 모티브 FLD 및 LVVL 사이에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입된 것이 있다.
본 발명에서, "기능성 미메틱"은 p16 아미노산 시퀀스의 프러그먼트 또는 활성 부분을 포함하지 않고, 펩타이드가 아니면서 p16 프러그먼트 특성의 일부 또는 전부, 특히 사이클린 의존성 키나제에 대한 결합특성 및/또는 pRb 포스포릴화 억제특성을 갖고 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 바람직한 예에서는, 펩타이드가 총 길이 p16 단백질의 잔기 89 내지 97을 포함한다. 특히, 펩타이드는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 90 내지 92 에 해당하는 펩타이드 모티브 FLD 및/또는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 94 내지 97에 해당하는 펩타이드 모티브 LVVL를 포함한다. 본 발명자들은 펩타이드의 D 및 L형 이성체 모두가 cdk에 대한 결합특성과 pRb 포스포릴화 억제특성을 나타낸다는 사실을 알게 되었다.
본 발명의 또 하나의 형태는 생체내에서 세포내로 전달되도록 캐리어 분자에 결합된 전술한 물질을 포함하는 화합물을 제공한다. 전술한 캐리어 분자의 한 예로는 말단 Cys 잔기 를 통하여 전술한 물질에 결합될수 있는 안테나페디아 호메오도메인(예를들면, "페네트라틴"이란 상품명으로 판매되는 것)으로부터 유도된 16 aa 펩타이드 시퀀스가 있다. "페네트라틴" 분자와 그 특성에 대하여는 WO 91/18981호에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 전술한 펩타이드 중의 하나를 포함하는 물질은 다른 펩타이드 시퀀스에 결합되어 안정화될수 있다. 이러한 사실은 전술한 펩타이드들이 미결합 프러그먼트에 비하여 펩타이드 활성을 증가시키는 이점을 갖고 있어서 총 길이 p16 의 펩타이드에 유사함을 확인시켜 준다. 즉 전술한 안정화된 프러그먼트는 총 길이 p16의 활성에 유사하거나 더 능가하는 활성을 갖고 있다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 본 발명은 전술한 물질의 1종 이상을 포함하는 의약 조성물과 전술한 조성물을 의학적 처치에 사용하는 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 바람직한 예에 따르면, 본 발명은 과증식성 질병, 예를들면 암, 건선 또는 동맥형성 치료용 약물의 제조에 사용되는 전술한 물질의 용도에 관계된다. 특히, p16 음성이거나 cdk의 과표현과 관계되는 암은 전술한 물질의 1종 이상을 포함하는 조성물에 감수성이 있다.
본 발명에 의한 의약 조성물과 본 발명의 용도에 사용되는 의약 조성물은 전술한 본 발명의 물질과 함께 제약업계에 잘 알려진 의약적으로 허용되는 부형제, 캐리어, 완충제, 안정제 등을 포함할수 있다. 이러한 물질들은 독성이 없어야 하고 활성 성분의 효능을 저해하지 않아야 한다. 사용되는 캐리어나 기타 첨가제의 특성은 투여 방법, 즉 경구, 정맥내, 피부, 피하, 코, 근육내, 복강내 경로등 투여 경로에 의하여 결정된다. 예를들면 비경구적으로 투여하기 위하여는 파이로겐이 없고 적당한 pH, 등삼투압성 및 안정성을 갖는 수용액이 사용될수 있다. 이러한 용도에 적당한 수용액을 제조하는 방법은 제약업계에 숙련된자 들에게는 잘 알려져 있다. 방부제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제들은 필요한 만큼 포함된다. 투여량은 처리할 질병, 각개 환자의 증상, 투여 방법 및 기타 요인들에 의하여 결정된다. 전술한 투여 방법에 관하여는 레밍톤스 파머슈티칼 사이언스, 16판, 오솔, 에이. 1980에서 찾아볼수 있다.
전술한 물질이 단백질인 경우, 본 발명은 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산에도 관계된다. 당해 업계의 숙련자들은 핵산 시퀀스를 나타내기 위하여 사용하는 숙주에 있는 코돈 프레퍼런스와 같은 인자를 계산하므로서 공개된 아미노산 시퀀스로부터 전술한 핵산 시퀀스를 용이하게 구성할수 있다. 단백질이 캐리어 단백질에 결합된 경우에는 캐리어 단백질을 인코딩하는 핵산이 펩타이드를 인코딩하는 시퀀스와 융합으로 표현된 시퀀스에 결합될수 있다.
본 발명의 또 다른 형태는 전술한 핵산에 결합된 벡타 및 벡타와 함께 전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 본 발명은 (i)전술한 물질의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 (ii) 전술한 물질의 결합 파트너인 화합물, 예를들면 p16 또는 p16 미메틱에 대한 특정 항체나 상보성 펩타이드를 스크린하는 전술한 물질의 용도에도 관계된다. 전술한 물질들은 p16 단백질의 펩타이드 프러그먼트이다.
미메틱 또는 결합 파트너를 위한 스크린 공정은
(a) 고체 지지체에 p16 프러그먼트를 고정시키고 지지체를 표식된 펩타이드나 기타의 캔디데이트 화합물의 라이브러리에 노출시켜 p16 프러그먼트에 대한 펩타이드 또는 캔디데이트 화합물의 결합을 측정하는 공정,
(b) 표식된 cdk와 비표식 캔디데이트 화합물 또는 펩타이드,
(c) 고체상 기질과 결합측정 물질의 배합물,
(d) p16 단백질의 프러그먼트와 p16 프러그먼트에 올려진 항체를 사용하여 캔디데이트 화합물에 의한 항체의 전위를 검사하는 웨스턴 블로트,
(e) p16 펩타이드 또는 p16 프러그먼트로부터 유도된 올리고뉴클리어타이드에 결합된 캔디데이트 펩타이드를 검정하기 위하여 두 효소 혼성 스크린을 이용하는 공정(두 효소 혼성 스크린에 대하여는 출원인의 선출원 WO96/14334호를 참조할 것),
(f) 프러그먼트 또는 캔디데이트 화합물이 Rb의 포스포릴화를 억제하거나 또는 사이클링으로부터 세포를 보호하는지 여부를 검사하기 위하여 세포 시스템에 p16 단백질의 프러그먼트 및/또는 캔디데이트 화합물을 사용하는 공정,
(g) 프러그먼트 또는 캔디데이트 화합물이 종양의 출현을 억제하거나, 종양의 크기를 축소시키거나, 종양의 증식을 억제하거나 또는 종양세포의 이동을 억제하는지 검사하기 위하여 종양증식 동물 모델에 p16 단백질 및/또는 캔디데이트 화합물을 사용하는 공정을 포함한다.
본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 본 발명은 전술한 물질의 하나와 경쟁하는 화합물을 검정하는 방법을 제공하는바, 이 방법은
(a) 검정할수 있게 표식된 물질의 미리 설정된 량을 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 결합시키는 공정,
(b) 캔디데이트 화합물을 첨가하는 공정, 및
(c) cdk에 결합되어 잔류하거나 또는 캔디데이트 화합물에 의하여 전이된 표식된 화합물의 량을 측정하는 공정을 포함한다.
본 발명의 또 다른 형태에 따르면, 본 발명은 전술한 물질중의 한 물질의 미메틱을 확인하는 방법을 제공하는바, 이 방법은
(a) 하나 이상의 캔디데이트 화합물을 고체 기질에 고정시키는 공정,
(b) 기질을 표식된 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 노출시키는 공정, 및
(c) cdk에 결합된 캔디데이트 화합물을 분리하는 공정을 포함한다.
전술한 본 발명의 형태에서, 사이클린 의존성 키나제는 cdk4 도는 cdk6이다. 기질은 p16 단백질의 프러그먼트가 바람직 하지만, 더 바람직한 것은 전술한바와 같은 FLD 와 LVVL 모티브이다. 캔디데이트 화합물은 종합 콤비나토리얼 라이브라리에서 선택하는 것이 간편하다.
본 발명은 또한 pRb 포스포릴화를 억제하는 특성에 관계되는 캔디데이트 화합물을 시험하고 세포가 S-위상으로 침입하는 것을 억제하는 특성에 관계되는 화합물을 시험하는 공정을 포함한다.
또 다른 형태에 따르면, 본 발명은 사이클린 의존성 키나제에 대한 결합특성을 갖거나 pRb 포스포릴화 억제특성을 갖고 있는 유기화합물이 아미노산 모티브의 3차원 구조를 갖도록 설계하는데 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 90 내지 92에 해당하는 아미노산 모티브 및/또는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 94 내지 97에 해당하는 LVVL을 포함하는 p16 단백질 프러그먼트를 이용하는 방법에도 관계된다.
공지된 의학적으로 허용되는 활성 화합물에 대한 미메틱의 설계는 "리드" 화합물에 기초한 약물 개발에서 이미 알려져 있다. 이러한 설계는 활성 화합물이 합성하기 어렵거나 또는 합성에 고비용이 요구되는 경우 또는 활성 화합물이 특정한 투여방법에 부적당한 경우, 예를들면 펩타이드가 소화관에서 프로테아제에 의하여 신속하게 분해되는 경구투여용으로 부적당한 활성물질인 경우에 필요할수 있다. 미메틱 설계, 합성 및 시험은 표적특성을 위하여 다수의 분자들을 무질서하게 스크리닝하는 것을 피하는데 이용할수 있다.
주어진 표적특성을 갖고 있는 화합물로부터 미메틱을 설계하는데는 다수의 공정이 이용된다. 첫째, 표적특성을 결정하는데 필수적으로 중요한 화합물의 특정부분을 결정한다. 펩타이드의 경우, 이러한 작업은, 예를들면 각각의 잔기를 치환시키는 방법 등에 의하여 펩타이드 중에 존재하는 아미노산 잔기를 변경시키는 공정에 의하여 달성될수 있다. 화합물의 활성부위를 구성하는 전술한 부분들 또는 잔기 들은 "파마코포어"로 알려져 있다.
파마코포어가 확인되면, 분광기술, X-선 굴절 및 NMR로부터 나온 데이터를 이용하여 얻은 이들의 물리적 특성, 예를들면 입체화학, 결합, 크기 및/또는 하전에 의하여 그 구조를 모델링한다. 전술한 모델링 공정에는 컴퓨터 분석, 유전자 지도작성(원자들간의 결합 보다는 파마코포어의 하전 및/또는 용량을 모델링한다) 및 기타의 기술이 이용될수 있다.
변칙 방법에서는, 리간드와 그 결합 파트너의 3차원 구조를 모델링한다. 이 방법은 리간드 및/또는 그 결합 파트너가 결합상의 구조를 변화시키므로서 모델이 미메틱의 설계에 일역을 담당하도록 한다.
주형 분자는 파마코포어를 모방하는 화학 그룹이 융합되도록 선택한다. 주형분자와 주형분자에 융합된 화학 그룹들은 미메틱 들이 쉽게 합성되고 약물학적으로 허용되며 생체내에서 분해되지 아니하면서 리이드 화합물의 생물학적 활성을 유지하도록 선택한다. 이러한 접근방법에 의하여 발견한 미메틱들은 이들이 표적특성을 갖고 있는지 또는 이러한 특성을 어느정도 나타내는지 알아내기 위하여 스크린할수 있다. 더구나 생체내 또는 실험실내 실험을 위한 하나 또는 그 이상의 최종 미메틱에 도달할 때 까지 최적화시키고 개량할수 있다.
이하 본 발명을 도면에 의하여 상세히 설명한다. 다음의 실시예들은 발명을 보다 이해하기 쉽도록 설명하기 위한 것이고 발명의 범위를 한정시키기 위한 것이 아니다.

Claims (26)

  1. 총 길이 p16, p15, p18 및 p19 단백질을 제외하고
    (i) 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 84 내지 103 또는 이들의 활성 부분이나 유도체를 포함하는 펩타이드; 또는
    (ii) 프러그먼트, 활성부분 또는 유도체의 관능성 미메틱을 포함하는 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 대한 결합특성을 갖는 물질.
  2. 제1항에서, 사이클린 의존성 키나제가 cdk4 또는 cdk6임을 특징으로 하는 물질.
  3. 제1항 또는 2항에서, 사이클린 의존성 카네에 대한 전술한 물질의 결합이 pRb 포스포릴화의 억제를 가져옴을 특징으로 하는 물질.
  4. 제1항 내지 3항중의 한 항에서, 펩타이드가 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 89 내지 97를 포함함을 특징으로 하는 물질.
  5. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 펩타이드 프러그먼트가 총길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 89 내지 97에 해당하는 아미노산 모티브 FLD 및/또는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 94 내지 97에 해당하는 LVVL를 포함함을 특징으로 하는 물질.
  6. 제5항에서, 펩타이드 프러그먼트가 아미노산 모티브 FLDxLVVL(x는 하나 또는 그 이상의 아미노산임)임을 특징으로 하는 물질.
  7. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 총 길이 p16 단백질의 위치 92에 해당하는 위치에 있는 펩타이드 프러그먼트의 아스파틱산 잔기가 소수성 아미노산 잔기로 치환되었음을 특징으로 하는 물질.
  8. 제8항에서, 소수성 아미노산 잔기가 알라닌임을 특징으로 하는 물질.
  9. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 이 물질이 p16, p15, p18 및 p19로부터 유도된 것임을 특징으로 하는 물질.
  10. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 이 물질이 세포내로 전이될수 있도록 캐리어 분자에 결합되었음을 특징으로 하는 물질.
  11. 제10항에서, 캐리어 분자가 안테나페디아 호메오도메인으로부터 유도된 펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 물질.
  12. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 펩타이드 프러그먼트가 안정화 분자에 결합되었음을 특징으로 하는 물질.
  13. 전술한 청구항 중의 한 항의 물질을 하나 또는 그 이상 생리학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 의약 조성물.
  14. 의학적인 처치에 사용하기 위한 청구항 1 내지 12 중의 하나에 청구된 물질.
  15. 과증식성 질병 치료용 약물의 제조에 사용하기 위한 전술한 청구항 1 내지 12 중의 한항에 청구된 물질의 용도.
  16. 제15항에서, 과증식성 질병이 암, 건선 또는 동맥 형성임을 특징으로 하는 용도.
  17. 청구항 1 내지 12 중의 한 항에 청구된 물질을 인코딩하는 핵산.
  18. 압출 조절 시퀀스에 청구항 17의 핵산이 결합된 벡타.
  19. (i) 전술한 물질의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 (ii) 전술한 물질의 결합 파트너인 화합물을 스크린하는 방법에 사용하는 청구항 1 내지 12 중의 한 항에 청구된 물질의 용도.
  20. (a)설정된 양의 검출할수 있게 표식된 물질을 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 결합시키는 공정;
    (b) 캔디데이트 화합물을 첨가하는 공정; 및
    (c) cdk에 결합되거나 캔디데이트 화합물에 의하여 치환된 표식된 화합물의 양을 측정하는 공정
    을 포함하는 청구항 1 내지 12 중의 한 항에 청구된 물질과 경쟁하는 화합물을 확인하는 방법.
  21. (a) 하나 또는 그 이상의 캔디데이트 화합물을 고체 기질에 고정시키는 공정;
    (b) 기질을 표식된 사이클린 의존성 키나제(cdk)에 노출시키는 공정; 및
    (c) cdk에 결합된 캔디데이트 화합물을 선발하는 공정
    을 포함하는 청구항 1 내지 12 중의 한 항에 청구된 물질의 미메틱을 확인하는 방법.
  22. 청구항 20 또는 21에서, cdk들이 망상 적혈구로 생성됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 20 내지 22 중의 한 항에서, 세포 의존성 키나제가 cdk4 또는 cdk6 임을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 20 내지 23 중의 한 항에서, 이 방법이 pRb 포스포릴화를 억제하는 특성에 대하여 캔디데이트 화합물을 시험하는 공정 및/또는 세포들이 S-상으로 침입하는 것을 억제하는 특성에 대하여 화합물을 시험하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 20 내지 24 중의 한 항에서, 캔디데이트 화합물이 합성 콤비나토리알 라이브러리에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
  26. 전술한 아미노산 모티브의 3차원 구조를 모델링한 사이클린 의존성 키나제에 대한 결합특성 및/또는 pRb 포스포릴화 억제특성을 갖는 화합물의 설계에 사용하는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 90 내지 92에 해당하는 아미노산 모티브 FLD 및/또는 총 길이 p16 단백질의 아미노산 잔기 94 내지 97에 해당하는 SVVL을 포함하는 p16 단백질의 프러그먼트의 용도.
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