JP6600697B2 - サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ｐ１６）タンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ - Google Patents

サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ（ｐ１６）タンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ Download PDF

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Description

関連出願の参照
本出願は、２０１５年５月２２日出願の仮出願第６２／１６５，６１４号の優先権を主張し、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。
緒論
癌は、成長および分裂中の細胞を死滅させ、様々な様式で機能する一群の治療薬で処置される。一般的な化学療法薬群が数十年の間、単剤または合剤で使用されており、この一般的な薬剤群は、臨床的腫瘍学実践における旧来の慣例の癌治療となっている。これら旧来の化学療法薬は、急速に分裂する総ての細胞を死滅させることにより働き、急速な細胞分裂はほとんどの癌細胞の主要な特性の１つである。しかしながら、これらの薬剤はまた、成長中の正常細胞も死滅させ、従って、これらの薬剤は癌細胞を死滅させるための「標的」アプローチであるとは見なされない。近年、癌細胞を選択的に標的とする大きな癌治療薬群が開発されてきており、この治療薬は、癌細胞のみに発現され正常細胞には発現されないか、または正常細胞よりも癌細胞で多量に発現されるタンパク質に特異的に作用する。このアプローチは、癌療法のための「標的」アプローチであると見なされる。最近では、「標的」様式で癌細胞を死滅されるための別のアプローチは、癌患者の免疫系の癌細胞死滅能を高めるように免疫系を特異的に調節するというものになっている。
ｐ１６タンパク質は、癌処置の決定に最近ますます重要性を増している。正常細胞では、ｐ１６タンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ４および６（ＣＤＫ４／６）タンパク質複合体と結合してそれを不活性化し、その結果、細胞周期の停止をもたらす。同型接合遺伝子欠失、プロモーターのメチル化（転写抑制）、または不活性化点突然変異などの機構によるｐ１６タンパク質発現の損失は、ＣＤＫ４／６タンパク質複合体の調節を欠いた活性化を介して腫瘍成長を駆動し得る。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のある種のサブタイプによる感染が子宮頸癌および頭頸部癌の発生をもたらし、これらの疾患の診断上のホールマークの１つがｐ１６タンパク質の高発現であることは周知である。ｐ１６の高発現を伴う頭頸部癌はＨＰＶ／ｐ１６陰性腫瘍に比べて有利な予後を有することが認められている。このため、ＣＤＫ４／６経路を標的とする多くの治療薬が現在開発中であり、ｐ１６レベルの測定がこれらの標的化薬の臨床転帰の予測となり得るという説得力のある証拠がある。
下記の方法は、ｐ１６タンパク質レベルの適切な測定をもたらす定量的プロテオミクスに基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイを提供する。特に、本方法は、癌患者からのホルマリン固定組織においてｐ１６を定量し、癌療法に関する改善された処置決定を可能とする質量分析アッセイを提供する。
ｐ１６タンパク質（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２ＡおよびＣＤＫＮ２Ａとも呼ばれ、本明細書ではｐ１６と呼称される）の部分配列に由来する特定のペプチドが提供される。各ペプチドのペプチド配列およびフラグメンテーション／遷移イオンが、質量分析に基づく選択反応モニタリング(Selected Reaction Monitoring)（ＳＲＭ）では特に有用であり、このＳＲＭは、多重反応モニタリング(Multiple Reaction Monitoring)（ＭＲＭ）アッセイとも呼ぶことができ、本明細書ではＳＲＭ／ＭＲＭと呼称する。Ｐ１６タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量的分析のためのペプチドの使用が記載される。
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ｐ１６タンパク質に由来する特定のペプチドの１以上の相対的または絶対的定量的レベルを測定するために使用することができ、従って、生体サンプルから得られた所与のタンパク質調製物中のｐ１６タンパク質の量を質量分析により測定する手段を提供する。ｐ１６に関するアッセイは、組織における潜在的ＨＰＶ感染を同定または確認する助けとして使用することができる。
より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌患者組織などの患者の組織サンプルから取得された細胞から調製された複雑なタンパク質溶解液サンプルにおいて、これらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載され、その内容は引用することによりその総てが本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、好都合には、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（ロックヴィル、ＭＤ）から入手可能なリキッドティッシュ試薬およびプロトコールを用いて実施され得る。
癌患者組織から最も広くかつ有利に入手可能な組織形態は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的に取り出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界的にみても、癌組織サンプルを保存する断然最も一般的な方法であり、標準的な病理学実践で受け入れられている慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中ホルムアルデヒドの飽和溶液（約４０容量％または３７質量％）からなり、酸化および重合度を限定するために少量の安定剤、通常はメタノールを含む。組織が保存される最も一般的な方法は、組織全体を長時間（８時間〜４８時間）、一般に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれるホルムアルデヒド水溶液に浸漬し、次いで、その固定組織全体を室温で長期保存するためにパラフィンワックスに包理するというものである。よって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析法が、癌患者組織の分析のための、最も許容され、頻用される方法となる。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイからの結果は、組織（生体サンプル）が採取および保存された患者または被験体の特定の組織サンプル（例えば、癌組織サンプル）内のｐ１６タンパク質の正確かつ精密な定量的レベルと相関させるために使用することができる。これにより、その癌に関する診断および予後情報が提供されるだけでなく、医師またはその他の医療専門家がその患者に適当な療法をより正確に決定することも可能となる。罹患組織またはその他の患者サンプルにおけるタンパク質の発現レベルに関して診断上、予後上、および治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断し、患者が応答する可能性が最も高い治療薬を決定するように設計することができる。
概要
本明細書に記載のアッセイは、ｐ１６タンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、また、ｐ１６タンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的レベルを測定することもできる。修飾の例としては、それらのペプチド上に存在し得るリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。
ｐ１６タンパク質の相対的定量的レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、例えば、異なるサンプル中の個々のｐ１６ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積（例えばシグネチャーピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することによって決定される。あるいは、ある生体サンプル中の相対的ｐ１６タンパク質含量を決定するために、各ペプチドがその固有の特定のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する複数のｐ１６シグネチャーペプチドに関する複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を１以上の付加的または異なる生体サンプル中のｐ１６タンパク質含量と比較することも可能である。このように、ｐ１６タンパク質に由来する特定の１または複数のペプチドの量、および従ってｐ１６タンパク質の量は、同じ試験条件下で、２以上の生体サンプルについて、同じｐ１６ペプチドまたは複数のペプチドと相対的に決定される。加えて、相対的定量は、単一のサンプル内のｐ１６タンパク質から所与の１または複数のペプチドを、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により、そのペプチドに関するシグネチャーピーク面積を、その生体サンプルからの同じタンパク質調製物内の異なる１または複数のタンパク質に由来する別の異なる１または複数のペプチドに関するシグネチャーピーク面積と比較することによって決定することができる。このように、ｐ１６タンパク質由来の特定のペプチドの量、および従ってｐ１６タンパク質の量は、同じサンプル内で互いに相対的に決定される。これらのアプローチは、サンプル間およびサンプル内で、別の１または複数のペプチドの量に対して、ｐ１６タンパク質由来の個々の１または複数のペプチドの定量化を可能とし、この場合、その生体サンプルからのタンパク質調製物中のｐ１６ペプチドの絶対的重量／容量または重量／重量の量に関わらず、シグネチャーピーク面積により決定される量は互いに相対的である。異なるサンプル間の個々のシグネチャーピーク面積に関する相対的定量的データは、サンプル当たりに分析されるタンパク質の量に対して正規化することができる。相対的定量化は、あるペプチド／タンパク質の他のペプチド／タンパク質に対する相対的タンパク質量について洞察を得るために、単一のサンプルでおよび／または多数のサンプルで同時に、複数のタンパク質およびｐ１６タンパク質に由来する多数のペプチドについて行うことができる。
ｐ１６タンパク質の絶対的定量的レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定され、それにより、生体サンプル中のｐ１６タンパク質に由来する個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が、添加した内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較される。１つの実施態様では、内部標準は、１以上の重い同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する、同じ正確なｐ１６ペプチドの合成型である。このような同位体標識内部標準は、質量分析により分析した場合に、それが天然ｐ１６ペプチドシグネチャーピークとは異なり明瞭に区別され、コンパレータピークとして使用できる予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを生じるように合成される。よって、内部標準が生体サンプルからのタンパク質調製物に既知の量で添加され、質量分析により分析される場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較され、この数的比較が、生体サンプルからの元のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対的モル濃度および／または絶対的重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドに関する絶対的定量的データは、サンプル当たりに分析されるタンパク質の量に応じて示される。絶対的定量化は、個々の生体サンプルにおいて、また、個々のサンプルのコホート全体において絶対的タンパク質量について洞察を得るために、単一のサンプルでおよび／または多数のサンプルで同時に、多数のペプチド、および従ってタンパク質について行うことができる。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来組織で直接、癌の病期の診断および／または患者の予後の補助に、ならびにどの治療薬がその患者の処置に使用するのに最も有利であるかを決定する補助に使用することができる。部分的もしくは全腫瘍の治療的摘出などの手術を介して、または疑われる疾患の有無を決定するために行われる生検手順を介して患者から取り出される癌組織は、特定の１または複数のタンパク質がその患者組織に存在するかどうか、およびどの形態のタンパク質が存在するかを決定するために分析される。さらに、１または複数のタンパク質の発現レベルを決定し、健康な組織で見られる「正常」または参照レベルと比較することができる。健康な組織で見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、癌を持たない１以上の個体の関連組織から導くことができる。あるいは、正常または参照レベルは、癌に侵されていない関連組織の分析により、癌を持つ個体に関して得ることもできる。タンパク質レベル（例えば、ｐ１６レベル）のアッセイはまた、ｐ１６レベルを使用することにより、患者または癌と診断された被験体の癌の病期を診断するため、およびその予後情報を提供するために使用することもできる。個々のｐ１６ペプチドのレベルは、分析されるタンパク質溶解液の総量当たりの、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されるペプチドのモル量と定義される。よって、ｐ１６に関する情報は、ｐ１６タンパク質（またはｐ１６タンパク質のフラグメントペプチド）のレベルを正常組織に見られるレベルと相関させることにより、癌の病期もしくはグレードおよび／または患者の予後の決定の補助に使用することができる。癌細胞においてひと度ｐ１６タンパク質の定量的な量が決定されれば、その情報を、例えば、アッセイされた１または複数のタンパク質（例えば、ｐ１６）の異常な発現を特徴とする癌組織を特異的に処置するために開発された（化学的または生物学的）治療薬のリストとの一致を探すことができる。ｐ１６タンパク質アッセイから得られた、例えば、特定のタンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的とする治療薬のリストとの一致情報は、疾患を処置するための個別化医療アプローチと呼ばれてきたものを規定する。本明細書に記載のアッセイ方法は、患者固有の組織に由来するタンパク質の分析を診断および処置決定のよりどころとして使用することにより、個別化医療アプローチの基礎を成す。
詳細な説明
原理上、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化することにより調製されたｐ１６タンパク質に由来するいずれの推定ペプチドも、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いてサンプル中のｐ１６タンパク質の存在量を決定するためのサロゲートリポーターとして使用することができる。同様に、ｐ１６タンパク質において修飾されている可能性があることが知られている部位にアミノ酸残基を含有するいずれの推定ペプチド配列も、サンプル中のｐ１６タンパク質の修飾程度をアッセイするためにおそらく使用可能である。
ｐ１６フラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に示されるリキッドティッシュプロトコールの使用を含む様々な方法によって作製することができる。リキッドティッシュプロトコールおよび試薬は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、組織／生体サンプルにおけるタンパク質のタンパク質分解消化により、質量分析に好適なペプチドサンプルを作製することができる。リキッドティッシュプロトコールでは、組織／生体サンプルをバッファー中で長時間（例えば、約８０℃〜約１００℃で約１０分〜約４時間）加熱して、タンパク質架橋を逆転させるかまたは解除する。使用するバッファーは、中性バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ系バッファー、または洗剤含有バッファー）である。加熱処理後、組織／生体サンプルを、限定されるものではないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含む１以上のプロテアーゼで、その生体サンプルの組織および細胞構造を破壊してサンプルを液化するのに十分な時間（例えば、３７〜６５℃の温度で３０分〜２４時間）処理する。加熱およびタンパク質分解の結果として、液体、可溶性、希釈可能な溶解液が得られる。
驚くことに、ｐ１６タンパク質に由来する多くの潜在的ペプチド配列が、即明らかにならない理由で、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで使用するために適切でないまたは効果的でないことが判明した。このことは特にホルマリン固定組織に由来するペプチドについて言える。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最適なペプチドの予測ができなかったので、ｐ１６タンパク質に関して信頼できる正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のリキッドティッシュ溶解液で修飾および非修飾ペプチドを実験的に識別する必要があった。いずれの理論にも縛られるものではないが、ペプチドの中には、十分にイオン化しないため、または他のタンパク質と明瞭に異ならないフラグメントを生じるために、例えば、質量分析によっては検出が困難なものがあると考えられる。ペプチドはまた、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）で十分に解明できない場合があり、またはガラスもしくはプラスチック器具に付着する場合もある。
本開示の種々の実施態様（例えば、表１）に見られるｐ１６ペプチドは、ホルマリン固定癌組織から取得された細胞から調製された複雑なリキッドティッシュ溶解液内の全タンパク質のプロテアーゼ消化により、ｐ１６タンパク質から誘導されたものである。そうではないことが述べられない限り、各場合において、プロテアーゼはトリプシンであった。次に、このリキッドティッシュ溶解液を、質量分析により検出され分析されるｐ１６タンパク質に由来するペプチドを決定するために質量分析により分析した。質量分析に好ましい特定のペプチドのサブセットの同定は、１）タンパク質に由来するどの１または複数のペプチドがリキッドティッシュ溶解液の質量分析においてイオン化するかの実験的決定、および２）リキッドティッシュ溶解液の調製に使用されるプロトコールおよび実験条件に耐えるペプチドの能力に基づく。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列に及ぶだけでなく、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の、サンプル調製実施地の修飾型での存続能にも及ぶ。
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接取得された細胞に由来するタンパク質溶解液は、リキッドティッシュ試薬と、組織顕微解剖により細胞をサンプルチューブに回収した後に、それらの細胞をリキッドティッシュバッファー中で長時間加熱することを必然的に伴うプロトコールとを用いて調製した。ひと度、ホルマリンにより誘導される架橋が負の作用を受けると、その後、組織／細胞は、例えば、限定されるものではないが、プロテアーゼトリプシンを含むプロテアーゼを用いる予測可能な様式で完全に消化される。各タンパク質溶解液は、無傷のポリペプチドがプロテアーゼにより消化されることでペプチドの集合体となる。各リキッドティッシュ溶解液は、ペプチドのマルチプルグローバルプロテオミックサーベイを行うために分析され（例えば、イオントラップ型質量分析による）、そこでは、データは、各タンパク質溶解液中に存在する総ての細胞タンパク質から質量分析により同定できる可能な限り多くのペプチドの同定として提示された。イオントラップ型質量分析計または単一の複雑なタンパク質／ペプチド溶解液から可能な限り多くのペプチドを同定するためのグローバルプロファイリングを行うことができる別の形態の質量分析計が一般に使用される。しかしながら、イオントラップ型質量分析計が、ペプチドのグローバルプロファイリングを行うために最良のタイプの質量分析計であり得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ型、イオントラップ型、または三連四重極型を含む、いずれのタイプの質量分析計に対しても開発および実施可能であるが、有利には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用のインストルメントプラットフォームは、三連四重極型インストルメントプラットフォームである。
使用される条件下、単一の溶解液の単一のＭＳ分析でできる限り多くのペプチドが同定されたところで、次に、そのペプチドリストを照合し、その溶解液で検出されたタンパク質を決定するために使用した。そのプロセスを多重リキッドティッシュ溶解液に対して繰り返し、極めて大きなペプチドリストを単一のデータセットと照合した。そのタイプのデータセットは、分析された（プロテアーゼ消化後に）生体サンプルのタイプにおいて、具体的には、生体サンプルのリキッドティッシュ溶解液において、検出可能なペプチドに相当すると考えることができ、従って、例えばｐ１６タンパク質などの特定のタンパク質に関するペプチドが含まれる。
１つの実施態様では、ｐ１６タンパク質の絶対的または相対的量の決定において有用であると特定されたｐ１６トリプシンペプチドには、配列番号１、配列番号２、および配列番号３（総て表１に挙げられている）の１つ、２つ、または３つ総てが含まれる。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製されたリキッドティッシュ溶解液において質量分析により検出された。従って、各ペプチドは、直接的にはホルマリン固定患者組織におけるものを含め、ヒト生体サンプルにおけるｐ１６タンパク質のための定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発において使用するための候補である。
表１に挙げられているｐ１６トリプシンペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の多重リキッドティッシュ溶解液から検出された。それらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織におけるｐ１６タンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有用であると考えられる。これらの試験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位に由来するこれらのペプチドのいずれについても選好性は見られないことが示された。従って、これらのペプチドのそれぞれは、生体サンプルにまたは身体の任意の器官に由来するホルマリン固定組織からのリキッドティッシュ溶解液に対してｐ１６タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために好適であると考えられる。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う際の重要な考慮事項は、ペプチドの分析に使用され得る機器のタイプである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ型、イオントラップ型、または三連四重極型を含む、いずれのタイプの質量分析計に対しても開発および実施可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために最も有利なインストルメントプラットフォームは、現在のところ、大抵の場合、三連四重極型インストルメントプラットフォームであると考えられる。このタイプの質量分析計は、現在のところ、細胞内に含まれる全タンパク質に由来する数百ないし数千から数百万までの個々のペプチドからなり得る極めて複雑なタンパク質溶解液内での単一の単離された標的ペプチドの推定分析に最適な機器である。
ｐ１６タンパク質に由来する各ペプチドのためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も有効に実施するためには、その分析においてペプチド配列に加えて情報を利用できることが望ましい。その付加的情報は、そのアッセイが有効に実施され得るように、特定の標的化ペプチドの適正かつ集中的分析を行うために質量分析計（例えば、三連四重極型質量分析計）に指示および教示を与える上で使用され得る。
一般には標的ペプチド、および特定のｐ１６ペプチドに関する付加的情報は、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプのうち１以上を含み得る。ｐ１６タンパク質に関するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用可能な付加的ペプチド情報は、表１からこれらのｐ１６ペプチドに関して示されている。
１）ｐ１６タンパク質に関する質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに使用可能なｐ１６タンパク質由来の候補ペプチドを同定すること、２）相関を得るために、ｐ１６タンパク質由来の標的ペプチドに関して個々のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイまたは一連のアッセイを開発すること、ならびに３）定量的アッセイを癌診断および／または最適な療法の選択に適用することを目的に下記の方法を使用した。
アッセイ方法
１．ｐ１６タンパク質に関するＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．タンパク質を消化するために１または複数のプロテアーゼ（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を用いて、ホルマリン固定生体サンプルからリキッドティッシュタンパク質溶解液を調製する。
ｂ．イオントラップ型タンデム質量分析計でリキッドティッシュ溶解液中の全タンパク質フラグメントを分析し、ｐ１６タンパク質由来の全フラグメントペプチドを同定する。ここで、個々のフラグメントペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいずれのペプチド修飾も含まない。
ｃ．イオントラップ型タンデム質量分析計でリキッドティッシュ溶解液中の全タンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化残基またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有する、ｐ１６タンパク質由来の全フラグメントペプチドを同定する。
ｄ．おそらく全長ｐ１６タンパク質全体から特定の消化方法により作出された全ペプチドを測定することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体サンプルから調製された複雑なリキッドティッシュタンパク質溶解液において直接、質量分析により同定されるものである。
ｅ．患者組織において特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化など）され、かつ、ホルマリン固定生体サンプルからのリキッドティッシュ溶解液を分析する際に質量分析計でイオン化し、従って、検出されるペプチドが、ｐ１６タンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして同定される。
２．ｐ１６タンパク質由来のフラグメントペプチドに関する質量分析アッセイ
ａ．リキッドティッシュ溶解液において同定された個々のフラグメントペプチドに関する三連四重極型質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ｐ１６タンパク質由来のペプチドに適用する。
ｉ．限定されるものではないが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含む最適なクロマトグラフィー条件に関して、フラグメントペプチドの最適保持時間を決定する。
ｉｉ．各ペプチドに関するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、そのペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体荷電状態、各ペプチドの前駆体ｍ／ｚ値、各ペプチドのｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドの各遷移イオンのイオンタイプを決定する。
ｉｉｉ．次に、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて三連四重極型質量分析計で行うことができ、ここで、各ペプチドは、三連四重極型質量分析計で実施した際のユニークなＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを正確に定義する、特徴的かつユニークなＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析からのユニークなＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の関数としての、ｐ１６タンパク質のフラグメントペプチドの検出量が、特定のタンパク質溶解液におけるタンパク質の相対的および絶対的両方の量を示し得るように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ．相対的定量化は、下記により達成され得る。
１．あるホルマリン固定生体サンプルからのリキッドティッシュ溶解液で検出された所与のｐ１６ペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４またはそれを超えるホルマリン固定生体サンプルからの少なくとも第２、第３、第４またはそれを超えるリキッドティッシュ溶解液における同じｐ１６フラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ｐ１６タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
２．あるホルマリン固定生体サンプルからのリキッドティッシュ溶解液において検出された所与のｐ１６ペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別の生物学的供給源に由来する他のサンプルにおける、他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから得られたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ｐ１６タンパク質の存在の増加または減少を決定すること、ここで、ペプチドフラグメントに関する２サンプル間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積比較は、各サンプルにおいて分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３．ｐ１６タンパク質の変化レベルを、様々な細胞条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに対して正規化するために、所与のｐ１６ペプチドに関するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、ホルマリン固定生体サンプルからの同じリキッドティッシュ溶解液内の異なるタンパク質に由来する他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより、ｐ１６タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
４．これらのアッセイは、ｐ１６タンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に適用でき、ここで、これらの修飾には、限定されるものではないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、修飾ペプチドの相対的レベルは、非修飾ペプチドの相対的量の決定と同様に決定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対的定量化は、個々の生体サンプルにおけるｐ１６タンパク質由来の所与のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、生体サンプルからのタンパク質溶解液中に添加された内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することにより達成され得る。
１．内部標準は、調査対象のｐ１６タンパク質由来のフラグメントペプチドの標識合成型である。この標準は既知量でサンプルに添加され、生体サンプルにおいて内部フラグメントペプチド標準および天然フラグメントペプチドの両方のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を個別に決定した後に、両ピーク面積の比較を行うことができる。
２．これを非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用することができ、ここで、これらの修飾には、限定されるものではないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、修飾ペプチドの絶対的レベルは、非修飾ペプチドの絶対的レベルの決定と同様に決定することができる。
３．癌診断および処置に対するフラグメントペプチド定量化の適用
ａ．ｐ１６タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、癌の分野でよく理解されているように、予め決定された、ｐ１６タンパク質の発現と患者腫瘍組織における癌の病期／グレード／状態との関連が確認されることを実証する。
ｂ．ｐ１６タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、異なる処置戦略からの臨床転帰との相関を実証する、ここで、この相関は、当技術分野ですでに実証されているか、または患者および患者由来の組織のコホート間の相関研究により将来、実証され得る。従前に確立された相関または将来に導き出される相関のいずれかがこのアッセイにより確認されれば、そのアッセイ方法は、最適な処置戦略を決定するために使用することができる。
特定のｐ１６ペプチドに関する特定のユニークな特徴は、イオントラップ型および三連四重極型質量分析計の両方での全ｐ１６ペプチドの分析により明らかにした。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆体荷電状態、前駆体ｍ／ｚ値、前駆体の遷移ｍ／ｚ値、および同定された遷移のそれぞれのイオンタイプが含まれる。その情報は、直接、ホルマリン固定サンプル／組織からのリキッドティッシュ溶解液におけるそれぞれの全候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに関して、実験的に決定されなければならないが、これは、興味深いことに、ｐ１６タンパク質由来の総てのペプチドが、本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭを用いてこのような溶解液で検出できるわけではなく、このことは検出されないｐ１６ペプチドは、ホルマリン固定サンプル／組織からのリキッドティッシュ溶解液においてペプチド／タンパク質を直接定量する上で使用するためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドとは見なされ得ないことを示すからである。
特定のｐ１６ペプチドに関する特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極型質量分析計で実施される。特定のｐ１６ ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより分析される試験サンプルは、例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された組織から調製されるリキッドティッシュタンパク質溶解液である。アッセイなどからのデータは、ホルマリン固定サンプル中のこのｐ１６ペプチドに関するユニークなＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークの存在を示す。
このペプチドの特定の遷移イオンの特徴は、ホルマリン固定生体サンプルにおける特定のｐ１６ペプチドを定量的に測定するために使用される。これらのデータは、分析されるタンパク質溶解液１マイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数としての、このｐ１６ペプチドの絶対的量を示す。ホルマリン固定された患者由来組織の分析に基づく組織中のｐ１６タンパク質レベルの評価は、特定の各患者に関する診断、予後、および治療関連情報を提供し得る。１つの実施態様において、本開示は、生体サンプルにおいてサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａタンパク質（ｐ１６）のレベルを測定するための方法であって、その生体サンプルから調製されたタンパク質消化物において、質量分析を用いて、１以上の修飾または非修飾ｐ１６フラグメントペプチドを検出するおよび／またはその量を定量すること、ならびにそのサンプルにおける修飾または非修飾ｐ１６タンパク質のレベルを計算することを含んでなる方法を記載し、ここで、そのレベルは相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連の実施態様において、１以上のｐ１６フラグメントペプチドの定量は、加えた既知量の内部標準ペプチドと比較することにより、生体サンプル中のｐ１６フラグメントペプチドのそれぞれの量を決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中のｐ１６フラグメントペプチドのそれぞれは、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施態様では、内部標準は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択される１以上の重い安定同位体を含んでなる、同位体で標識された内部標準ペプチドである。
本明細書に記載の生体サンプル中のｐ１６タンパク質（またはそのサロゲートとしてのフラグメントペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または被験体の癌の診断および／または予後指標として使用することができる。１つの実施態様では、ｐ１６タンパク質のレベルの測定からの結果は、組織中に見られたｐ１６タンパク質のレベルを正常および／または癌性もしくは前癌組織中に見られるそのタンパク質のレベルと相関させる（例えば、比較する）ことにより、癌の診断病期／グレード／状態および／または予後状態を決定するために使用することができる。
核酸およびタンパク質の両方が同じリキッドティッシュ（商標）生物分子調製物から分析できるので、タンパク質分析時と同じサンプルで核酸から疾患診断および薬物処置決定に関する付加的情報を得ることができる。例えば、ｐ１６タンパク質がある特定の細胞により高レベルで発現される場合、ＳＲＭによりアッセイすれば、そのデータは、細胞の状態およびそれらの脱制御増殖に関する能力、潜在的薬剤耐性ならびに癌の発生に関する情報を提供することができる。同時に、ｐ１６遺伝子および／または核酸およびそれらがコードするタンパク質の状態（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライス型）に関する情報が、同じリキッドティッシュ（商標）生物分子調製物中に存在する核酸から得られ、ｐ１６タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価可能である。ｐ１６に由来しないが同じ生物分子調製物中に存在する、いずれの遺伝子および／または核酸も、ｐ１６タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。１つの実施態様では、ｐ１６タンパク質および／または１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超える付加的タンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を調べることにより評価することができる。それらの核酸は、例えば、シーケンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限フラグメント多形分析、欠失、挿入の同定、および／または限定されるものではないが、一塩基多形、トランジション、トランスバージョン、もしくはそれらの組合せを含む、突然変異の決定のうち１以上、２以上、または３以上により調べることができる。

Claims (16)

  1. ホルマリン固定組織のヒト生体サンプルにおいてサイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａタンパク質（ｐ１６）のレベルを測定するための方法であって、該生体サンプルから調製されたタンパク質消化物においてｐ１６フラグメントペプチドを、質量分析により検出する、およびその量を定量すること；ならびに該サンプルにおけるｐ１６タンパク質のレベルを計算することを含んでなり、該ｐ１６フラグメントペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ、該レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法。
  2. 前記ｐ１６フラグメントペプチドを検出する、およびその量を定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分画工程が、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ型質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析、ＭＡＬＤＩ型質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含んでなり、使用される質量分析の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記組織が腫瘍から得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｐ１６フラグメントペプチドの定量が、ある生体サンプルにおける前記ｐ１６フラグメントペプチドの量を、異なる別の生体サンプルにおける同じｐ１６フラグメントペプチドの量と比較することを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ｐ１６フラグメントペプチドの定量が、生体サンプル中の前記ｐ１６フラグメントペプチドの量を、加えた既知量の内部標準ペプチドと比較することにより決定することを含んでなり、前記生体サンプル中のｐ１６フラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記内部標準ペプチドが同位体で標識されたペプチドであり、該同位体で標識された内部標準ペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはそれらの組合せから選択される１以上の重い安定同位体を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記タンパク質消化物における前記ｐ１６フラグメントペプチドの検出およびその量の定量が、修飾または非修飾ｐ１６タンパク質の存在および被験体における癌との関連を示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ｐ１６フラグメントペプチドの検出およびその量の定量の結果、または前記ｐ１６タンパク質のレベルを、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることをさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ｐ１６フラグメントペプチドの検出およびその量の定量の結果、または前記ｐ１６タンパク質のレベルを、癌の診断病期／グレード／状態と相関させることが、癌の診断病期／グレード／状態に関する付加的情報を提供するために、多重形式で他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドを検出する、および／またはその量を定量することと組み合わせられる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記生体サンプルが得られた被験体に対して、前記ｐ１６フラグメントペプチドの存在、不在、もしくは量、またはｐ１６タンパク質のレベルに基づき、処置を選択するための指標を提供することをさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記生体サンプルが得られた患者に、治療上有効な量の治療薬を投与するために、前記ｐ１６フラグメントペプチドの量またはｐ１６タンパク質のレベルに基づき、治療薬および／または治療薬の投与量を選択するための指標を提供することをさらに含んでなり、ここで、該治療薬はｐ１６タンパク質と結合し、および／またはその生物活性を阻害する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
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