KR20180029969A - 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A(p16) 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법 - Google Patents
사이클린-의존성 키나제 억제제 2A(p16) 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180029969A KR20180029969A KR1020177035987A KR20177035987A KR20180029969A KR 20180029969 A KR20180029969 A KR 20180029969A KR 1020177035987 A KR1020177035987 A KR 1020177035987A KR 20177035987 A KR20177035987 A KR 20177035987A KR 20180029969 A KR20180029969 A KR 20180029969A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- peptide
- tissue
- amount
- fragment peptide
- Prior art date
Links
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 174
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 26
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 96
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 67
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims description 63
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 50
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 42
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 claims description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000534 ion trap mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 238000002553 single reaction monitoring Methods 0.000 claims 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 abstract 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 abstract 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 24
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 9
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 4
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N VQAVBBCZFQAAED-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JNNVNVRBYUJYGS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000013698 Cyclin-Dependent Kinase 6 Human genes 0.000 description 1
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O MUSGDMDGNGXULI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZWQVYZXPYSYPJD-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- TVDHVLGFJSHPAX-UWVGGRQHSA-N Gly-His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 TVDHVLGFJSHPAX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N Leu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N XTDDIVQWDXMRJL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 239000003168 generic drug Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
Abstract
본 발명은 SRM/MRM 질량 분석법에 의해 포르말린에 고정된 생물학적 샘플 중의 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A (p16) 단백질을 직접 정량하기 위한 방법을 제공한다. 단백질 샘플은, 예를 들어 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 생물학적 샘플로부터 제조되고, p16 단백질은 단백질 샘플 중의 p16으로부터의 적어도 하나의 단편 펩타이드를 정량함으로써 생성된 샘플에서 정량된다. 펩타이드는 변형 또는 비변형된 형태로 정량될 수 있다. p16 펩타이드의 변형된 형태의 예는, 펩타이드 서열 내의 티로신, 트레오닌, 세린 및/또는 다른 아미노산 잔기의 인산화이다.
Description
본 출원은, 그 전문이 본원에 참조로서 포함되는, 2015년 5월 22일자로 출원된 가출원 제62/165,614호의 우선권을 주장한다.
암은, 성장하고 분열하는 세포를 사멸시키고 다양한 방식으로 작용하는 일단의 치료제로 치료된다. 일반적인 화학치료제 컬렉션이 개별적으로 또는 조합되어 수십년간 사용되어 왔고, 이러한 일반적인 약제 컬렉션이 임상 종양학 실시에서 전통적이고 일상적인 암치료가 되었다. 이러한 전통적인 화학치료제는 빠르게 분열하는 모든 세포를 사멸시키는 작용을 하고, 빠른 세포 분열은 대부분 암 세포의 주요 특징 중 하나이다. 그러나, 이러한 약제는 또한 성장하는 정상 세포 역시 사멸시키므로, 이러한 약제는 암세포를 사멸시키기 위한 "표적화" 접근법으로 간주되지 않는다. 최근 몇 년간 암세포만을 선택적으로 표적하는 대규모 그룹의 암 치료제가 개발되었고, 상기 치료제는 정상 세포에 의한 것이 아닌 암세포에 의해서만 발현되거나, 또는 정상세포 보다 암세포에서 훨씬 많은 양으로 발현되는 단백질을 특이적으로 공격한다. 이러한 접근법은 암 치료에 대한 "표적화" 접근법으로 간주된다. 최근, "표적화" 유행에 있어서 암세포를 사멸시키기 위한 다른 접근법은 암세포를 사멸시키기 위한 암 환자의 면역 체계의 능력을 강화시키기 위해 면역 체계를 특이적으로 조절하는 것이였다.
p16 단백질은 최근 암 치료 결정에 있어서 점점 더 중요한 의미를 갖게되었다. 정상 세포에서 상기 p16 단백질은 사이클린-의존성 키나제 4 및 6(CDK4/6) 단백질 복합체에 결합하여 불활성화되어 세포 주기를 정지시킨다. 동형 접합체 유전자 결실, 프로모터 메틸화 (전사 억제), 또는 점 돌연변이 불활성화와 같은 메커니즘을 통한 p16 단백질 발현의 손실은 CDK4/6 단백질 복합체의 탈규제화된 활성화를 통해 종양 성장을 유도할 수 있다. 인간 유두종 바이러스 (HPV)의 특정 서브타입에 감염되면, 자궁 경부암 및 두경부암을 유도하고, 이러한 질병의 진단적인 특징 중 하나가 p16 단백질의 높은 발현이라는 것은 널리 알려져 있다. 높은 p16 발현을 갖는 두경부암은 HPV/p16 음성 종양에 비해 양호한 예후를 보이는 것이 관찰되었다. 이러한 이유 때문에, 많은 치료제가 현재 CDK4/6 경로를 표적으로 하여 개발중이며, p16 수준을 측정하는 것이 이러한 표적 약물의 임상 결과를 예측할 수 있다는 강력한 증거가 있다.
하기 기재된 방법은 p16 단백질 수준의 관련 척도를 제공하는 정량적 프로테오믹스 기반 SRM (Selectied Reaction Monitoring) 분석법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 암환자의 포르말린 고정 조직 중의 p16을 정량화하고, 암치료를 위해 개선된 치료를 결정할 수 있게 하는 질량 분석법을 제공한다.
사이클린-의존성 키나제 억제제 2A 및 CDKN2A라고도 지칭되는, 본 명세서에서 p16으로 불리는 p16 단백질의 서브서열로부터 유래하는 특정 펩타이드가 제공된다. 각 펩타이드에 대한 펩타이드 서열 및 단편화/전이 이온은, 본원에서 SRM/MRM이라고 지칭되는 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 분석으로도 지칭될 수 있는, 질량 분석 기반 선택 반응 모니터링 (Selectial Reaction Monitoring, SRM)에 특히 유용하다. 상기 p16 단백질의 SRM/MRM 정량 분석을 위한 펩타이드 용도를 기재한다.
이 SRM/MRM 분석은 p16 단백질 중의 하나 이상의 특정 펩타이드의 상대적 또는 절대적 정량 수준을 측정하는 데 사용할 수 있으므로, 질량 분석법(mass spectrometry)에 의해 생물학적 샘플에서 수득한 주어진 단백질 조제물 중 p16 단백질의 양을 측정하는 수단을 제공한다. p16에 대한 분석은 조직 중의 잠재적인 HPV 감염을 식별하거나 확인하는 데 사용할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 SRM/MRM 분석은, 포르말린으로 고정된 암 환자 조직과 같은 환자 조직 샘플로부터 조달된 세포로 조제된 복합 단백질 분해물 샘플 중의 이러한 펩타이드를 직접 측정할 수 있다. 포르말린 고정 조직으로부터 단백질 샘플을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로서 통합된다. 미국 특허 제7,473,532호에 기재된 방법은 액체 조직 시약을 사용하여 용이하게 수행할 수 있으며, 프로토콜은 Expression Pathology Inc. (Rockville, MD)로부터 이용 가능하다.
암 환자 조직으로부터 가장 넓고 유리하게 이용 가능한 조직 형태는 포르말린 고정, 파라핀 포매된 조직이다. 외과적으로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 지금까지 세계적으로 암 조직 샘플을 보존하는 가장 일반적인 방법이고, 표준 병리학 실시를 위한 관행이다. 포름알데하이드 수용액은 포르말린이라고 지칭된다. "100%" 포르말린은 물 중 포름알데하이드 포화 용액 (부피 기준으로 약 40% 또는 질량 기준 37%)과 소량의 안정제, 보통 산화 및 중합도를 제한하는 메탄올로 구성된다. 조직을 보존하는 가장 흔한 방법은, 일반적으로 10% 중성 완충 포르말린이라고 불리는 수성 포름알데하이드에 전체 조직을 장시간 (8시간에서 48시간) 담근 다음, 고정된 전체 조직을 실온에서 장기간 저장하기 위해 파라핀 왁스에 포매한다. 따라서, 포르말린 고정 암 조직을 분석하기 위한 분자 분석 방법은 암환자 조직 분석을 위한 가장 많이 수용되고 많이 활용되는 방법이 될 것이다.
SRM/MRM 분석 결과는, 수집 및 보존된 상기 조직 (생물학적 샘플)을 가지는 환자 또는 개체의 특정 조직 샘플 (예를 들어, 암 조직 샘플) 중의 p16 단백질의 정확하고 정밀한 정량 수준을 연관시키는 데 사용될 수 있다. 이는 암에 대한 진단 및 예후 정보를 제공할 뿐만 아니라, 의사 또는 다른 의료 전문가가 환자를 위한 적절한 치료법을 보다 정확하게 결정할 수 있게 한다. 이러한 분석법은 병변 조직 또는 다른 환자 샘플 중의 단백질 발현 수준에 대한 진단적, 예후적 및 치료학적으로 중요한 정보를 제공하는 동반 진단 분석법 (companion diagnostic assay)이라고 한다. 예를 들어, 이러한 분석법은 암의 단계 또는 등급을 진단하고, 환자가 가장 반응을 보일 수 있는 치료제를 결정하도록 설계할 수 있다.
본원에 기재된 분석법은 p16 단백질로부터의 특이적인 비변형된 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정하며, 또한 p16 단백질로부터의 특이적인 변형된 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정할 수 있다. 변형의 예로는, 펩타이드에 존재할 수 있는 인산화된 아미노산 잔기 및 글리코실화된 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 p16 단백질의 상대적 정량 수준은 SRM/MRM 방법, 예를 들어, 상이한 샘플 내 개별 p16 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적 (예를 들어, 시그니처 피크 면적 또는 통합된 단편 이온 강도)을 비교함으로써 결정된다. 또는, 다중 p16 시그니처 펩타이드에 대한 다중 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 비교하는 것이 가능하며, 각 펩타이드는 하나 이상의 부가적인 또는 상이한 생물학적 샘플 중의 상기 p16 단백질 함량에 대해 하나의 생물학적 샘플 중의 상대적 p16 단백질 함량을 결정하기 위한 각자의 특이적 SRM/MRM 시그니처 피크를 가진다. 이러한 방식으로, 상기 p16 단백질의 특정 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 양, 즉 p16 단백질의 양은 동일한 실험 조건하에서 두 개 이상의 생물학적 샘플에 걸처 동일한 p16 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 상대적으로 결정된다. 또한, 상대 정량은 생물학적 샘플로부터 동일한 단백질 제조물 내 다른 단백질 또는 복수의 단백질의 상이한 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 대한 시그니처 피크 면적과 그 펩타이드에 대한 시그니처 피크 면적을 SRM/MRM 방법으로 비교함으로써 단일 샘플 내 상기 p16 단백질로부터 주어진 펩타이드 또는 복수의 펩타이드에 대해 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 p16 단백질의 특정 펩타이드의 양, 즉, p16 단백질의 양은 동일한 샘플 내에서 서로 상대적으로 결정된다. 이러한 접근법은 샘플 간 및 샘플 내 다른 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 양에 대한 p16 단백질의 개별 펩타이드 또는 복수의 펩타이드 정량을 가능하게 하고, 시그니처 피크 면적에 의해 결정된 상기 양은 생물학적 샘플로부터의 단백질 조제물 중의 p16 펩타이드의 절대 부피 중량 또는 무게 중량에 상관없이, 서로 상대적이다. 상이한 샘플 간 개별 시그니처 피크 면적의 상대적 정량 데이터는 샘플당 분석된 단백질 양으로 표준화될 수 있다. 상대 정량은 다른 펩타이드/단백질에 대한 하나의 펩타이드/단백질의 상대적 단백질 양의 통찰력을 얻기 위해, 여러 단백질의 많은 펩타이드와 p16 단백질을 단일 샘플 및/또는 다수의 샘플에 걸쳐 동시에 수행할 수 있다.
p16 단백질의 절대적 정량 수준은, 예를 들어 하나의 생물학적 샘플중의 p16 단백질의 개별 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 스파이크된 내부 표준의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적에 비교하는 SRM/MRM 방법에 의해 결정된다. 일 실시 양태에서, 상기 내부 표준은 하나 이상의 중동위원소로 표지된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 정확히 동일한 p16 펩타이드의 합성 버전이다. 이러한 동위 원소 표지 내부 표준은 합성되고, 질량 분석법으로 분석할 때, 천연의 p16 펩타이드 시그니처 피크와는 다르며, 또한 비교 피크로서 사용될 수 있는 예측가능하고 일관성 있는 SRM/MRM 시그니처 피크를 생성한다. 따라서, 상기 내부 표준 물질을 공지된 양의 생물학적 샘플의 단백질 제조물에 넣어 질량 분석법으로 분석할 때, 천연 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적은 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적에 비교되고, 이러한 수치 비교는 생물학적 샘플의 오리지널 단백질 조제물 내에 존재하는 천연 펩타이드의 절대 몰 농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드의 절대 정량 데이터는 샘플당 분석된 단백질의 양에 따라 표시된다. 절대 정량은 개별 샘플학적 샘플 및 개별 샘플의 전체 코호트 내 절대 단백질 양의 통찰력을 얻기 위해, 여러 펩타이드들 및 단백질을 단일 샘플 및/또는 다수의 샘플에 걸쳐 동시에 수행할 수 있다.
SRM/MRM 분석 방법은, 예를 들어 포르말린 고정 조직과 같은 환자 유래 조직에서 직접적으로 암의 단계 및/또는 환자 예후의 진단을 보조하고, 그런 환자를 치료할 때의 치료제의 사용에 있어서 가장 유리한 결정을 보조할 수 있다. 부분적 또는 전체 종양의 치료적 제거와 같은 수술, 또는 의심되는 질환의 존재 여부를 결정하기 위해 실시한 조직 검사를 통해 환자로부터 제거된 암 조직은 특정 단백질, 또는 복수의 단백질 및 어떤 형태의 단백질이 환자 조직에 존재하는지 결정하기 위해 분석한다. 또한, 단백질 또는 여러 단백질의 발현 수준을 결정하여 건강한 조직에서 발견되는 "정상" 또는 기준 수준과 비교할 수 있다. 건강한 조직에서 발견되는 정상 또는 기준 수준의 단백질은, 예를 들어 암을 가지지 않는 하나 이상 개별적 관련 조직으로부터 유래 될 수 있다. 또는, 정상 또는 기준 수준은 암에 영향받지 않은 관련 조직의 분석을 통해 암을 가지는 개인에게서 수득될 수 있다. 단백질 수준의 분석 (예: p16 수준) 역시 p16 수준을 사용하여 암으로 진단받은 환자 또는 개체에서 암 단계를 진단하고 예후 정보를 제공하는 데 사용할 수 있다. 개별적 p16 펩타이드의 수준은 분석된 단백질 용해물 총량 당 SRM/MRM 분석에 의해 결정된 펩타이드의 몰량으로서 정의된다. 따라서, p16에 관한 정보는 p16 단백질 (또는 p16 단백질의 단편 펩타이드)의 수준과 정상 조직에서 관찰되는 수준을 상호 연관시킴으로써 암 및/또는 환자 예후의 단계 또는 등급을 결정하는 데 도움이 될 수 있다. 일단 p16 단백질의 정량적인 양이 암세포에서 결정되면, 그 정보는 예를 들어, 단백질 또는 단백질들 (예, p16)의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 암 조직을 특이적으로 치료하기 위해 개발된 치료제 (화학적 및 생물학적) 목록과 일치할 수 있다. p16 단백질 분석으로부터 정보를, 예를 들어 특정 단백질을 발현하는 세포/조직을 특이적으로 표적으로 하는 치료제 목록에 대응시키는 것은 질병 치료에 대한 맞춤 의학(personalized medicine) 접근법을 정의한다. 본원에 기재된 분석 방법은 진단 및 치료 결정을 위한 소스로서 환자 자신의 조직으로부터의 단백질 분석을 사용함으로써 맞춤 의학 접근법의 기초를 형성한다.
원칙적으로, 예를 들어 공지된 특이성을 가지는 (예를 들어, 트립신) 프로테아제로 분해시킴으로써 제조된 p16 단백질로부터 유도된 임의의 예측된 펩타이드는, 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석을 사용하여 샘플 내 p16 단백질의 존재량을 결정하기 위한 대용 리포터로서 사용될 수 있다. 마찬가지로, p16 단백질 중의 잠재적으로 변형된 것으로 알려진 부위에서 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 예측된 펩타이드 서열 또한 샘플 중의 p16 단백질의 변형 정도를 분석하는데 잠재적으로 사용될 수 있다.
p16 단편 펩타이드는 미국 특허 제7,473,532호에서 제공된 액체 조직 프로토콜의 사용법을 포함하여 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 상기 액체 조직 프로토콜 및 시약은 조직/생물학적 샘플 내 단백질의 단백질성 분해에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매된 조직으로부터 질량 분광 분석에 적합한 펩타이드 샘플을 생성할 수 있다. 액체 조직 프로토콜에서, 조직/생물학적 물질은 완충제 중에서 장시간 (예를 들어, 약 80℃ 내지 약 100℃에서 약 10분 내지 약 4시간 동안) 가열하어 단백질 교차 결합을 역전 또는 방출한다. 사용된 완충액은 중성 완충액 (예를 들어, 트리스-기반 완충액 또는 계면활성제를 함유하는 완충액)이다. 열처리 후에 상기 조직/생물학적 샘플을 트립신, 키모트립신, 펩신 및 엔도프로티나제 Lys-C를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 프로테아제로 상기 생물학적 샘플의 조직 및 세포 구조를 파괴시키고, 샘플을 액화시키기에 충분한 시간 동안 (예: 37℃ 내지 65℃ 온도에서 30분 내지 24시간) 처리하였다. 가열 및 단백질 분해의 결과는 액체, 가용성, 희석 가능한 생체 분자 용해물이다.
놀랍게도, p16 단백질의 많은 잠재적 펩타이드 서열은 즉시 분명하지 않다는 이유 때문에 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석법에 사용하기에 부적절하거나 효과적이지 않다는 것이 발견되었다. 이는 포르말린 고정 조직으로부터 유도된 펩타이드의 경우 특히 그러하다. MRM/SRM 분석에 가장 적합한 펩타이드를 예측하는 것은 불가능하기 때문에 p16 단백질에 대한 신뢰할 수 있고 정확한 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위해서는 실제 액체 조직 용해물 중의 변형된 및 비변형된 펩타이드를 실험적으로 확인하는게 필요하다. 어떠한 이론에 구속되기를 바지는 않지만, 일부 펩타이드는 예를 들어, 이온화가 잘되지 않거나 다른 단백질로부터 유도된 펩타이드와 구별되지 않는 단편을 생성하기 때문에 질량 분석법으로 검출하는데 어려울 수 있다. 또한, 펩타이드는 분리 (예: 액체 크로마토그래피)에 의해 잘 분해되지 않거나, 유리 또는 플라스틱 제품에 부착 될 수 있다.
본 명세서의 다양한 실시 양태에서 발견된 p16 펩타이드 (예를 들어, 표 1)는 포르말린 고정 암 조직으로부터 조달된 세포로 제조된 복합 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질의 프로테아제 분해에 의한 p16 단백질로부터 유래되었다. 달리 명시하지 않는 한, 각각의 경우에 프로테아제는 트립신이다. 이후, 액체 조직 용해물을 질량 분석법으로 분석하고, p16 단백질로부터 유도된 이러한 펩타이드를 검출하고 질량 분석법으로 분석하였다. 질량 분광 분석을 위한 펩타이드의 특정 선호 서브세트의 동정은; 1) 액체 조직 용해물의 질량 분광 분석에 있어서 단백질의 펩타이드 또는 복수 펩타이드가 이온화하는 실험적 결정, 2) 액체 조직 용해물을 제조하는데 사용된 프로토콜 및 실험 조건에서 생존할 수 있는 펩타이드의 능력에 기반한다. 이런 후자의 특성은 펩타이드의 아미노산 서열뿐만 아니라 샘플 제조 중에 변형된 형태로 생존하기 위한 펩타이드 중의 변형된 아미노산 잔기의 능력까지 확장된다.
포르말린 (포름알데하이드) 고정 조직으로부터 직접 조달된 세포의 단백질 용해물은 조직 미세절제술를 통해 샘플 튜브 안으로 세포를 수집한 후 장기간 액체 조직 완충액에서 세포를 가열하는 것을 수반하는 액체 조직 시약 및 프로토콜을 사용하여 조제되었다. 일단 포르말린-유도 교차 결합이 부정적으로 영향을 받으면, 조직/세포는 예를 들어, 프로테아제 트립신을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 프로테아제를 사용하여 예측 가능한 방식으로 완전히 분해된다. 각 단백질 용해물은 온전한 폴리펩타이드를 프로테아제로 분해시켜 펩타이드 집합체로 전환된다. 각 액체 조직 용해물은 (예: 이온 트랩 질량 분석법) 펩타이드에 대한 여러 글로벌 프로테옴 조사를 수행하기 위해 분석하였고, 데이터는 각 단백질 용해물에 존재하는 모든 세포 단백질을 질량 분석함으로써 확인 가능한 수많은 펩타이드의 동정을 제시하였다. 이온 트랩 질량 분광계 또는 단일 복합 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩타이드를 동정하기 위해 글로벌 프로파일링을 수행할 수 있는 질량 분광계의 다른 형태가 일반적으로 사용된다. 그러나 이온 트랩 질량 분광계는 펩타이드의 글로벌 프로파일링을 수행하기 위한 최상의 유형의 질량 분광계 일 수 있다. SRM/MRM 분석은 MALDI, 이온 트랩 또는 삼중사극를 포함한 모든 유형의 질량 분광계에서 개발 및 수행될 수 있지만, SRM/MRM 분석을 위한 장비 플랫폼은 삼중사극 장비 플랫폼인 것이 유리하다.
일단 채용된 조건하에서 단일 용해물의 단일 MS 분석에서 가능한 한 많은 펩타이드가 동정되면, 그 펩타이드의 목록을 대조하고 그 용해물에서 검출된 단백질을 결정하는데 사용하였다. 이 과정을 여러 액체 조직 용해물에 대해 반복하였고, 펩타이드의 대규모 목록을 단일 데이터 세트에 대조하였다. 이러한 유형의 데이터 세트는 분석된 생물학적 샘플의 유형 (프로테아제 분해 후), 특히 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내는 것으로 간주 될 수 있으며, 따라서 특정 단백질에 대한 펩타이드, 예를 들어 p16 단백질을 포함한다.
일 실시 양태에서, p16 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로 확인된 p16 트립신-처리된 펩타이드는, 표 1에 나열된 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3 중 1개, 2개 또는 3개 모두를 포함한다. 이들 펩타이드는 각각 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직으로 제조된 액체 조직 용해물에서 질량 분석에 의해 검출되었다. 따라서, 각 펩타이드는 포르말린 고정 환자 조직에 직접적으로 포함하는, 인간 생물학적 샘플의 p16 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 분석을 개발하는데 사용하기 위한 후보이다.
| 서열번호 | 펩타이드 서열 | 모노 동위원소 질량 | 전구체 전하 상태 | 전구체 m/z |
전이 m/z |
이온 유형 |
| 서열번호 1 | ALLEAGALPNAPNSYGR | 1712.8845 | 2 | 857.45 | 626.35 | b6 |
| 2 | 857.45 | 693.331 | y6 | |||
| 2 | 857.45 | 975.464 | y9 | |||
| 서열번호 2 | EGFLDTLVVLHR | 1397.7666 | 2 | 699.891 | 425.261 | y3 |
| 2 | 699.891 | 524.33 | y4 | |||
| 2 | 699.891 | 837.53 | y7 | |||
| 2 | 699.891 | 952.557 | y8 | |||
| 서열번호 3 | LPVDLAEELGHR | 1347.7146 | 2 | 674.865 | 618.322 | y11 |
| 2 | 674.865 | 740.368 | y6 | |||
| 2 | 674.865 | 811.405 | y7 | |||
| 2 | 674.865 | 924.489 | y8 |
표 1에 나열된 p16 트립신 펩타이드는 전립선, 결장 및 유방을 포함하는 상이한 인간 기관의 다수의 상이한 포르말린 고정 조직의 여러 액체 조직 용해물로부터 검출되었다. 이들 펩타이드 각각은 포르말린 고정 조직 중의 p16 단백질의 정량적 SRM/MRM 분석에 유용하다고 여겨진다. 이러한 실험에 대한 추가 데이터 분석은 어떠한 특정 기관 부위로부터 이들 펩타이드 중의 어느 하나에 대해서도 선호도가 관찰되지 않았음을 나타낸다. 따라서, 이들 펩타이드 각각은 임의의 생물학적 샘플 또는 임의의 신체 기관 부위에서 유래한 임의의 포르말린 고정 조직의 액체 조직 용해물 상에 p16 단백질의 SRM/MRM 분석을 수행하는데 적합하다고 여겨진다.
SRM/MRM 분석을 수행할 때 중요한 고려 사항이 펩타이드의 분석에 사용될 수있는 장비의 유형일 수 있다. SRM/MRM 분석법은 MALDI, 이온 트랩 또는 삼중사극을 포함한 모든 유형의 질량 분광계에서 개발 및 수행할 수 있지만, SRM/MRM 분석에 가장 적합한 장비 플랫폼은 현재 삼중사극 장비 플랫폼으로 간주된다. 이러한 유형의 질량 분광계는 현재 세포 내에 포함된 모든 단백질의 수십만에서 수백만 개의 개별 펩타이드로 구성될 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 중의 단일 단리된 표적 펩타이드의 추정 분석에 가장 적합한 장비이다.
p16 단백질로부터 유도된 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 분석을 가장 효율적으로 수행하기 위해서는, 분석 중에 펩타이드 서열에 추가하여 정보를 이용하는 것이 바람직하다. 그 추가 정보는 분석이 효율적으로 수행될 수 있도록 특정 표적화 된 펩타이드(들)의 정확하고 집중된 분석을 수행하기 위해 질량 분광계 (예: 삼중사극 질량 분광계)를 디렉팅하고 지시하는데 사용될 수 있다.
일반적으로 표적 펩타이드 및 특정 p16 펩타이드에 관한 부가적인 정보는 펩타이드의 하나 이상의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이이온 및 각 전이이온의 이온 유형을 포함할 수 있다. 부가적인 펩타이드 정보는 p16 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위해 사용될 수 있으며, 표 1에 이들 p16 펩타이드를 나타내었다.
하기 기재된 방법은 1) p16 단백질에 대한 질량 분석법에 기반한 SRM/MRM 분석에 사용할 수 있는 p16 단백질로부터 후보 펩타이드 동정, 2) 연관시키기 위한 p16 단백질의 표적 펩타이드에 대한 개별 SRM/MRM 분석법 또는 분석법들 개발 및 3) 암 진단 및/또는 최적 치료의 선택에 정량적 분석법을 적용하는데 사용된다.
분석 방법
1. p16 단백질에 대한 SRM/MRM 후보 단편 펩타이드의 동정
a. 단백질 분해를 위해, 프로테아제 또는 복수의 프로테아제 (트립신을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있음)를 사용하여 포르말린 고정 생물학적 샘플로부터 액체 조직 단백질 용해물을 제조한다.
b. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계에서 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고, 개별 단편 펩타이드가 인산화 또는 글리코실화와 같은 펩타이드 변형을 포함하지 않은 p16 단백질의 모든 단편 펩타이드를 동정한다.
c. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계에서 액체 조직 용해물 중의 모든 단백질 단편을 분석하고, 예를 들어 인산화 또는 글리코실화된 잔기와 같은 펩타이드 변형을 수행하는 p16 단백질의 모든 단편 펩타이드를 동정한다.
d. 전장 p16 단백질 전체로부터 특이적 분해 방법에 의해 생성된 모든 펩타이드는 잠재적으로 측정될 수 있지만, SRM/MRM 분석법 개발에 사용되는 선호 펩타이드는 포르말린 고정 생물학적 샘플로부터 제조된 복합 액체 조직 단백질 용해물에서 직접 질량 분석에 의해 동정된 것이다.
e. 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물을 분석할 때 환자 조직에서 특이적으로 변형되고 (인산화, 글리코실화 등), 질량 분광계에서 이온화되어 검출되는 펩타이드는 p16 단백질의 펩타이드 변형을 분석하기 위해 부호 펩타이드로서 동정된다.
2. p16 단백질 유래의 단편 펩타이드에 대한 질량 분석법
a. 액체 조직 용해물에서 동정된 개별 단편 펩타이드에 대한 삼중사극 질량 분광계에서의 SRM/MRM 분석이 p16 단백질 유래 펩타이드에 적용된다:
i. 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노 역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 최적의 크로마토그래피 조건을 위한 단편 펩타이드 최적 보유 시간 결정,
ii. 각 펩타이드에 대한 SRM/MRM 분석법 개발을 위한 펩타이드의 모노 동위 원소 질량, 각 펩타이드에 대한 전구체 전하 상태, 각 펩타이드에 대한 전구체 m/z 값, 각 펩타이드에 대한 m/z 전이 이온, 및 각 단편 펩타이드에 대한 각 전이 이온의 이온 유형 결정,
iii. SRM/MRM 분석은 삼중사극 질량 분광계에서 (i) 및 (ii)의 정보를 사용하여 실시할 수 있으며, 각각의 펩타이드는 삼중사극 질량 분광계에서 실시된 고유한 SRM/MRM 분석을 정확하게 정의하는 특징적이고 고유한 SRM/MRM 시그니처 피크를 가짐;
b. SRM/MRM 질량 분석의 고유한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적의 함수로서, 검출된 p16 단백질의 단편 펩타이드 양을 SRM/MRM 분석을 실시하여, 특정 단백질 용해물 내의 단백질의 상대적 및 절대적 양을 나타낼 수 있다:
i. 상대 정량은 다음과 같이 수행할 수 있다:
1. 하나의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출된 주어진 p16 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상의 액체 조직 용해물의 동일한 p16의 동일한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적과 비교함으로써 p16 단백질의 증가 또는 감소된 존재량을 결정,
2. 하나의 포르말린 고정 생물학적 샘플의 액체 조직 용해물에서 검출된 주어진 p16 펩타이드의 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 펩타이드 단편에 대한 두 샘플 간의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적 비교를 각 샘플에서 분석된 단백질의 양을 표준화한, 상이한 별도의 생물학적 소스에서 유래된 다른 샘플 내의 다른 단백질의 단편 펩타이드로부터 개발된 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적과 비교함으로써 p16 단백질의 증가 또는 감소된 존재량를 결정,
3. 주어진 p16 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적을 p16 단백질의 변화하는 수준을 다양한 세포 조건하에서 그들의 발현 수준을 변화시키지 않는 다른 단백질 수준으로 표준화하기 위해 포르말린 고정 생물학적 샘플의 동일한 액체 조직 용해물 내 다른 단백질로부터 유래한 다른 단편 펩타이드의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 비교함으로써 p16 단백질의 증가 또는 감소된 존재를 결정,
4. 이러한 분석법은 비변형된 단편 펩타이드 및 p16 단백질의 변형된 단편 펩타이드 모두에 적용될 수 있으며, 상기 변형은 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 변형된 펩타이드의 상대적인 수준은 비변형된 펩타이드의 상대적 양을 결정하는 동일한 방법으로 결정;
ii. 주어진 펩타이드의 절대적 양은 개별 생물학적 샘플 내 p16 단백질의 주어진 펩타이드에 대한 SRM/MRM 시그니처 피크 면적을 생물학적 샘플의 단백질 용해물 내로 스파이크된 내부 단편 펩타이드 표준의 SRM/MRM 시그니처 피크 면적과 비교함으로써 성취될 수 있다:
1. 내부 표준은 조사되고 있는 p16 단백질의 단편 펩타이드의 표지 합성 버전이다. 이 표준은 알려진 양으로 시료에 스파이크되며, SRM/MRM 시그니쳐 피크 면적은 내부 단편 펩타이드 표준 및 생물학적 샘플의 천연 단편 펩타이드 모두에 대해 별도로 결정되고, 이어서 두 피크 면적을 비교,
2. 이는 비변형된 단편 펩타이드 및 변형된 단편 펩타이드에 적용될 수 있으며, 상기 변형이 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만 이에 한정되지는 않고, 변형된 펩타이드의 절대적 수준은 비변형된 펩타이드의 절대적 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정될 수 있음.
3. 암 진단 및 치료에 단편 펩타이드 정량을 적용
a. p16 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 실시하고, 환자 종양 조직에서 암의 단계/등급/상태에 대한 p16 단백질 발현이 암 분야에서 잘 알려진 바와 같이 이전에 결정된 연관성이 확인됨을 입증한다.
b. p16 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량을 실시하고, 다른 치료 전략의 임상 결과와의 상관관계를 입증하고, 이 상관관계는 현장에서 이미 입증되었거나 환자의 코호트 및 그러한 환자 조직의 상관관계 연구를 통해 향후 입증될 수 있다. 일단 이전에 확립된 상관관계 또는 향후의 상관관계가 이 분석에 의해 확인되면, 상기 분석법은 최적의 치료 전략을 결정하는데 사용될 수 있다.
특정 p16 펩타이드에 대한 특이적이고 고유한 특성은 이온 트랩 및 삼중사극 질량 분광계에서 모든 p16 펩타이드를 분석함으로써 개발되었다. 그 정보는 펩타이드의 모노 동위원소 질량, 이의 전구체 전하 상태, 전구체 m/z 값, 전구체의 전이 m/z 값, 및 확인된 전이 이온 유형을 각각 포함한다. 그 정보는 포르말린 고정 샘플/조직의 액체 조직 용해물에서 직접적으로 각각 및 모든 후보 SRM/MRM 펩타이드에 대해 실험적으로 결정되어야 한다; 흥미롭게도 p16 단백질의 모든 펩타이드를 본원에 기재된 바와 같이 SRM/MRM을 사용하여 그러한 용해물에서 검출할 수는 없기 때문에, 검출되지 않은 p16 펩타이드는 포르말린 고정 샘플/조직의 액체 조직 용해물에서 직접적으로 펩타이드/단백질의 정량화에 사용하기 위해 SRM/MRM 분석법을 개발하기 위한 후보 펩타이드로 간주 될 수 없다.
특정 p16 펩타이드에 대한 특정 SRM/MRM 분석은 삼중사극 질량 분광계에서 수행된다. 특정 p16 SRM/MRM 분석법에 의해 분석된 실험적 샘플은, 예를 들어 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직으로부터 제조된 액체 조직 단백질 용해물이다. 이러한 분석법과 같은 데이터는 포르말린 고정 샘플 중의 이 p16 펩타이드에 대한 고유한 SRM/MRM 시그니처 피크의 존재를 나타낸다.
이 펩타이드의 특이적 전이 이온의 특성은 포르말린 고정 생물학적 샘플 중의 특정 p16 펩타이드를 정량적으로 측정하는데 사용된다. 이러한 데이터는 분석된 단백질 용해물 1 마이크로그램 당 펩타이드의 몰량의 함수로서 이 p16 펩타이드의 절대양을 나타낸다. 포르말린 고정 환자 유래 조직의 분석에 기초한 조직에서의 p16 단백질 수준의 평가는, 각각의 특정 환자에 대한 진단적, 예후적 및 치료학적 관련 정보를 제공할 수 있다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중의 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A (p16) 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법을 기재하며, 상기 방법은 질량 분석기를 이용하여 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계; 및 상기 샘플 중의 변형된 또는 비변형된 p16 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고, 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련된 실시 양태에서, 하나 이상의 p16 단편 펩타이드를 정량화하는 단계는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 생물학적 샘플 중의 각각의 p16 단편 펩타이드의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 p16 단편 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교된다. 일부 실시 양태에서, 상기 내부 표준은 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소를 포함하는 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드이다.
본원에 기재된 생물학적 샘플 (또는 그의 대용물로서의 단편 펩타이드)에서 p16 단백질의 수준을 측정하는 방법은 환자 또는 개체에서 암의 진단 및/또는 예후 지표로서 사용될 수 있다. 일 실시 양태에서, 상기 p16 단백질 수준의 측정 결과는 조직에서 발견되는 p16 단백질 수준과 정상 및/또는 암 또는 전암성 조직에서 발견되는 p16 단백질 수준을 연관시킴으로써 (예를 들어, 비교하는), 암의 진단 단계/등급/상태 및/또는 예후적 상태를 결정하는데 채용될 수 있다.
핵산과 단백질은 모두 동일한 Liquid Tissue™ 생체 분자 조제물로부터 분석할 수 있기 때문에, 단백질이 분석된 동일한 샘플의 핵산으로부터 질병 진단 및 약물 치료 결정에 대한 추가적인 정보를 생성할 수 있다. 예를 들어, p16 단백질이 증가된 수준의 특정 세포에 의해 발현되는 경우, SRM에 의해 분석될 때, 데이터는 세포의 상태 및 통제되지 않은 성장, 잠재적인 약물 내성 및 암 발생 가능성에 대한 정보를 제공할 수 있다. 동시에, SMLN 유전자 및/또는 이들이 코딩하는 핵산 및 단백질 (예: mRNA 분자 및 그 발현 수준 또는 스플라이스 변형)의 상태에 대한 정보는 p16 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가할 수 있는 동일한 Liquid Tissue™ 생체 분자 조제물에 존재하는 핵산에서 얻을 수 있다. 동일한 생체 분자 조제물에 존재하는 p16 유래가 아닌 유전자 및/또는 핵산은 p16 단백질의 SRM 분석과 동시에 평가할 수 있다. 일 실시 양태에서, p16 단백질 및/또는 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 추가 단백질에 관한 정보는 이들 단백질을 코딩하는 핵산을 조사함으로써 평가할 수 있다. 이들 핵산은, 예를 들어, 단일 염기쌍 다형, 전이, 변위 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 서열 분석 방법, PCR 방법, 제한 단편 다형 분석, 결실, 삽입의 확인 및/또는 변이의 존재 결정의 하나 이상, 둘 이상 또는 세 가지 이상에 의해 조사될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> EXPRESSION PATHOLOGY INC.
<120> SRM/MRM Assay for the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A (p16) protein
<130> IPA171297-US
<150> US62/165,614
<151> 2015-05-22
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg
1 5 10
Claims (28)
- 포르말린-고정 조직의 생물학적 샘플 중의 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A(p16) 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법으로서,
질량 분석법을 이용하여 상기 생물학적 샘플로부터 제조된 단백질 분해물 중의 p16 단편 펩타이드의 양을 검출 및 정량하는 단계; 및 상기 샘플 중의 p16 단백질의 수준을 계산하는 단계를 포함하고; 상기 p16 단편 펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되고,
상기 수준이 상대적 수준 또는 절대적 수준인 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계 전에 상기 단백질 분해물을 분획화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 분획화 단계가 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플의 상기 단백질 분해물이 액체 조직 프로토콜 (Liquid Tissue protocol)에 의해 제조되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 프로테아제 분해물을 포함하는 것인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단백질 분해물이 트립신 분해물을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, MALDI-TOF 질량 분석법, MALDI 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 사용되는 질량 분석법 모드가 선택 반응 모니터링 (Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring, MRM) 및/또는 다중 선택 반응 모니터링 (multiple Selected Reaction Monitoring, mSRM)인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p16 단편 펩타이드가 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플, 소변 샘플, 혈청 샘플, 복수 샘플, 담 샘플, 림프액, 타액 샘플, 세포 또는 고형 조직인 것인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 조직이 포르말린 고정 조직인 것인, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조직이 파라핀 포매된 조직인 것인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 조직이 종양으로부터 수득된 것인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 종양이 원발성 종양인 것인, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 종양이 속발성 종양인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드를 정량하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 p16 단편 펩타이드를 정량하는 단계가 하나의 생물학적 샘플에서 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시된 p16의 약 8 내지 약 45개 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 p16 단편 펩타이드의 양과, 상이한 별도의 생물학적 샘플에서 동일한 p16 단편 펩타이드의 양을 비교하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제17항에 있어서, 하나 이상의 p16 단편 펩타이드를 정량하는 단계가 알려진 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 생물학적 샘플 중의 상기 p16 단편 펩타이드 각각의 양을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 생물학적 샘플 중의 각각의 p16 단편 펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교되는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드가 동위원소 표지 펩타이드인 것인, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드가 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정된 중동위원소(heavy stable isotope)를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해물 중의 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계가 변형된 또는 비변형된 p16 단백질의 존재 및 개체 내 암과의 연관성을 나타내는 것인, 방법.
- 제21항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 p16 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 단계/등급/상태와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제22항에 있어서, 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 p16 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량한 결과를 암의 진단 단계/등급/상태와 연관시키는 단계가, 암의 진단 단계/등급/상태에 대한 부가적인 정보를 제공하기 위해 멀티플렉스 형식으로 다른 단백질 또는 다른 단백질의 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량하는 단계와 조합되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 p16 단편 펩타이드의 존재, 부재 또는 양 또는 p16 단백질의 수준에 근거하여, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 개체를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 수득되는 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양이 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드의 양 또는 p16 단백질의 수준에 근거하는 것인, 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 치료제가 p16 단백질에 결합하고/하거나 이의 생물학적 활성을 억제하는 것인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 치료제가 p16-발현 암세포를 특이적으로 표적하기 위해 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제27항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 액체 조직 프로토콜 및 시약을 사용하여 하나 이상의 변형된 또는 비변형된 p16 단편 펩타이드를 정량하기 위해 처리된 포르말린 고정 종양 조직인 것인, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562165614P | 2015-05-22 | 2015-05-22 | |
| US62/165,614 | 2015-05-22 | ||
| PCT/US2016/033776 WO2016191368A1 (en) | 2015-05-22 | 2016-05-23 | Srm/mrm assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2a (p16) protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180029969A true KR20180029969A (ko) | 2018-03-21 |
| KR102062149B1 KR102062149B1 (ko) | 2020-01-03 |
Family
ID=57325334
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177035987A KR102062149B1 (ko) | 2015-05-22 | 2016-05-23 | 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A(p16) 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10073075B2 (ko) |
| EP (1) | EP3322510B1 (ko) |
| JP (1) | JP6600697B2 (ko) |
| KR (1) | KR102062149B1 (ko) |
| CN (1) | CN107847866B (ko) |
| AU (1) | AU2016268215B2 (ko) |
| CA (1) | CA2986730C (ko) |
| IL (1) | IL255789A (ko) |
| WO (1) | WO2016191368A1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3322510B1 (en) * | 2015-05-22 | 2020-10-07 | Expression Pathology, Inc. | Srm/mrm assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2a (p16) protein |
| WO2018102827A1 (en) * | 2016-12-04 | 2018-06-07 | Expression Pathology, Inc. | Improved methods of treating lung cancer by predicting responders to cisplatin-pemetrexed combination therapy |
| US20200232987A1 (en) * | 2017-09-18 | 2020-07-23 | Nantomics, Llc | Proteomic And Genomic Analysis For Colon Cancer Prognosis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11510380A (ja) * | 1995-07-17 | 1999-09-14 | ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | ｐ１６発現構築物および癌治療におけるその適用 |
| JP2014501388A (ja) * | 2010-12-24 | 2014-01-20 | マップ ダイアグノースティックス ピーティーワイ エルティーディー | 選択反応モニタリング（ｓｒｍ）による癌および他の病理学的実体のタンパク質プロファイル |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7691632B2 (en) * | 1993-11-18 | 2010-04-06 | Cold Spring Harbor Laboratory | Kit for detecting the level of cyclin-dependent kinase inhibitor P16 gene expression |
| GB9519275D0 (en) * | 1995-09-21 | 1995-11-22 | Univ Dundee | Substances and their therapeutic use |
| WO1999023218A1 (fr) * | 1997-11-05 | 1999-05-14 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | PROTEINES DE FIXATION DE p16, GENE DE CES PROTEINES ET ANTICORPS CONTRE CES PROTEINES |
| WO2004080579A2 (en) | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Expression Pathology, Inc. | Liquid tissue preparation from histopatologically processed biological samples, tissues and cells |
| EP1510820B1 (en) * | 2003-08-25 | 2010-03-17 | MTM Laboratories AG | Method for detecting medically relevant conditions in a solubilized LBC sample |
| EP2386654A1 (en) * | 2005-05-02 | 2011-11-16 | University of Southern California | DNA Methylation markers associated with the CpG island methylator phenotype (cimp) in human colorectal cancer |
| KR20160096213A (ko) * | 2007-09-11 | 2016-08-12 | 캔서 프리벤션 앤 큐어, 리미티드 | 인간 폐조직 병변의 지표가 되는 인간 혈청 내 단백질의 동정 |
| FR2950697B1 (fr) * | 2009-09-25 | 2011-12-09 | Biomerieux Sa | Procede de detection de molecules par spectrometrie de masse |
| JP6046147B2 (ja) | 2011-09-22 | 2016-12-14 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． | がんの評価のための多重ｍｒｍアッセイ |
| AU2012358246B2 (en) * | 2011-12-21 | 2018-01-25 | Integrated Diagnostics, Inc. | Methods for diagnosis of lung cancer |
| EP2850229A4 (en) | 2012-05-16 | 2016-02-17 | Expression Pathology Inc | SRM / MRM METHOD FOR HISTOLOGICAL SUBTYPING OF PULMONARY TUMORS |
| EP2984176B1 (en) * | 2013-03-15 | 2018-12-05 | Expression Pathology, Inc. | Srm assay to indicate cancer therapy |
| EP3322510B1 (en) * | 2015-05-22 | 2020-10-07 | Expression Pathology, Inc. | Srm/mrm assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2a (p16) protein |
| WO2018102827A1 (en) * | 2016-12-04 | 2018-06-07 | Expression Pathology, Inc. | Improved methods of treating lung cancer by predicting responders to cisplatin-pemetrexed combination therapy |
| US20190219582A1 (en) * | 2018-01-18 | 2019-07-18 | Nantomics, Llc | p16 EXPRESSION AND CANCER TREATMENT OUTCOME |
-
2016
- 2016-05-23 EP EP16800603.9A patent/EP3322510B1/en active Active
- 2016-05-23 CA CA2986730A patent/CA2986730C/en active Active
- 2016-05-23 JP JP2017560755A patent/JP6600697B2/ja active Active
- 2016-05-23 KR KR1020177035987A patent/KR102062149B1/ko active IP Right Grant
- 2016-05-23 US US15/162,598 patent/US10073075B2/en active Active
- 2016-05-23 AU AU2016268215A patent/AU2016268215B2/en active Active
- 2016-05-23 WO PCT/US2016/033776 patent/WO2016191368A1/en active Application Filing
- 2016-05-23 CN CN201680042688.7A patent/CN107847866B/zh active Active
-
2017
- 2017-11-20 IL IL255789A patent/IL255789A/en unknown
-
2018
- 2018-09-10 US US16/126,772 patent/US10620184B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11510380A (ja) * | 1995-07-17 | 1999-09-14 | ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | ｐ１６発現構築物および癌治療におけるその適用 |
| JP2014501388A (ja) * | 2010-12-24 | 2014-01-20 | マップ ダイアグノースティックス ピーティーワイ エルティーディー | 選択反応モニタリング（ｓｒｍ）による癌および他の病理学的実体のタンパク質プロファイル |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3322510A1 (en) | 2018-05-23 |
| AU2016268215A1 (en) | 2017-12-07 |
| US10620184B2 (en) | 2020-04-14 |
| EP3322510B1 (en) | 2020-10-07 |
| US10073075B2 (en) | 2018-09-11 |
| JP2018517137A (ja) | 2018-06-28 |
| CN107847866A (zh) | 2018-03-27 |
| IL255789A (en) | 2018-01-31 |
| CN107847866B (zh) | 2020-06-30 |
| CA2986730C (en) | 2020-04-14 |
| US20160341713A1 (en) | 2016-11-24 |
| CA2986730A1 (en) | 2016-12-01 |
| JP6600697B2 (ja) | 2019-10-30 |
| US20190178866A1 (en) | 2019-06-13 |
| EP3322510A4 (en) | 2019-03-27 |
| KR102062149B1 (ko) | 2020-01-03 |
| AU2016268215B2 (en) | 2019-10-31 |
| WO2016191368A1 (en) | 2016-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10718780B2 (en) | SRM/MRM assay for the tyrosine-protein kinase receptor UFO(AXL) protein | |
| US10620184B2 (en) | SRM/MRM assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16) protein | |
| US10060927B2 (en) | SRM/MRM assay for the 6-O-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) protein | |
| CN106255766B (zh) | 针对雄激素受体(ar)蛋白质的srm/mrm测定 | |
| KR102071122B1 (ko) | 섬유아세포 증식 인자 수용체 2(fgfr2) 단백질에 대한 srm/mrm 분석법 | |
| KR102071121B1 (ko) | 메소텔린(msln) 단백질에 대한 srm/mrm 분석법 | |
| CA2954694A1 (en) | Srm/mrm assay for the tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 (cd30) protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |