CN106255766B - 针对雄激素受体(ar)蛋白质的srm/mrm测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了来自雄激素受体蛋白质(AR)的具体的肽和这些肽的衍生电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱或也可称作多反应监测(MRM)质谱的方法直接定量已经在福尔马林中固定的生物样品中的AR蛋白质。这类生物样品是经化学保藏和固定的，所述生物样品选自使用含有试剂/固定剂的甲醛处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及经福尔马林固定和或石蜡包埋的组织培养细胞。使用Liquid Tissue试剂和方案从所述生物样品中制备蛋白质样品并通过在蛋白质样品中定量至少一种或多种所描述的肽来使用SRM/MRM质谱的方法在Liquid Tissue样品中定量AR蛋白质。这些肽在其以修饰的或未修饰的形式存在时可被定量。AR肽的修饰的形式的一个示例是肽序列内酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。

Description

针对雄激素受体(AR)蛋白质的SRM/MRM测定

引言

人们使用一批杀伤正在生长和分裂的细胞并以多种方式发挥功能的治疗剂来治疗癌症。常见的化疗剂集合已被单独或联合使用了数十年，且该常见的试剂集合已成为临床肿瘤学实践中传统且常规的癌症治疗手段。这些传统的化疗剂通过杀伤所有快速分裂的细胞来发挥作用，快速分裂是大多数癌细胞的主要特性之一。然而，这些试剂也杀伤正在生长的正常细胞，因此这些试剂不被视作杀伤癌细胞的“靶向”方法。近年来，已开发出大量靶向癌细胞的癌症治疗剂，其中这些治疗剂特异性攻击仅由癌细胞表达而正常细胞不表达的蛋白质。这种方式被视癌症治疗的“靶向”方法。最近，以靶向方式杀伤癌细胞的另一种方法是特异性调控免疫系统以增强癌症患者的免疫系统杀伤癌细胞的能力。

靶向雄激素受体蛋白质(“AR”)的治疗剂已在早期临床试验中显示潜力。然而，仅那些癌细胞表达大量AR蛋白质的患者可能受益于这类AR靶向治疗剂。下文的方法提供了基于定量蛋白组学的试验，其传递AR信号通路激活的相关测量，因为AR通常不在正常组织和/或正常表皮细胞中表达。具体而言，该方法提供一种质谱测定，其对来自癌症患者的福尔马林固定的组织中的AR进行定量，并使针对癌症疗法的改进的治疗决定成为可能。

提供了来源于雄激素受体蛋白质(其也称作二氢睾酮受体和核受体亚家族3组C成员4蛋白质并在本文中称作AR)的亚序列的特定肽。各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可具体用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)中，其也称为多反应监测(MRM)测定，在本文中称作SRM/MRM。描述了用于AR蛋白质的SRM/MRM定量分析的肽的用途。

可使用该SRM/MRM测定来测量来自AR蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中AR蛋白质的总量的方法。

更具体地，该SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(Expression Pathology Inc.)(马里兰州罗克维尔)的Liquid Tissue试剂和方案方便地进行。

可最广泛且有利地获得的来自癌症患者组织的组织形式是福尔马林固定、石蜡包埋的组织。对手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定无疑是世界范围内最常见的保存癌症组织样品的方法且是标准病理学实践中已经接受的常规方法。甲醛水溶液被称作福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室温下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。

SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内AR蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断信息，而且容许医师或其它医疗专业人员确定用于患者的适当疗法。提供关于在患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能应答的治疗剂。

发明内容

本发明所述的测定测量来自AR蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自AR蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。

AR蛋白质的相对定量水平可通过SRM/MRM方法确定，例如通过比较不同样品中单个AR肽的SRM/MRM特征峰面积(signature peak area)(例如，特征峰面积或积分的片段离子强度)来确定。或者，在各种肽具有其自己的特异性SRM/MRM特征峰的情况下，可以比较多种AR特征肽的多个SRM/MRM特征峰面积，从而用一种或多种额外或不同的生物样品中的AR蛋白质含量来确定一种生物样品中的相对AR蛋白质含量。以此方式，可在相同实验条件下跨越两个或多个生物样品，相对于相同的一种或多种AR肽来确定来自AR蛋白质的一种或多种特定肽的含量并从而确定AR蛋白质的含量。另外，确定单一样品内来自AR蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量的方法可以是通过SRM/MRM方法比较该肽的特征峰面积与同一来自生物样品的蛋白质制备物中的来自不同的一种或多种蛋白质的其他和不同的一种或多种肽的特征峰面积。以此方式，通过同一样品内相对于一种肽的另一种肽来确定来自AR蛋白质的特定肽的含量并从而确定AR蛋白质的含量。这些方法生成样品之间或样品内单个或多个来自AR蛋白质的肽相对于另一个或多个肽的定量，其中通过特征峰测定的含量彼此相对，这与来自生物样品的蛋白质制备物中AR肽的绝对重量：体积或重量：重量含量无关。不同样品之间单个特征峰面积的相对定量数据标准化至每个样品中所分析的蛋白质含量。可跨越来自单个样品中同时存在的AR蛋白质和多个蛋白质的许多肽和/或跨越许多样品来进行相对定量，从而了解相对蛋白质含量，如相对于其他肽/蛋白质的一种肽/蛋白质。

AR蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM/MRM方法确定，通过该方法将来自在一种生物样品中的AR蛋白质的单个肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入的(spiked)内标物的SRM/MRM特征峰面积相比较。在一个实施方式中，该内标物为合成形式的完全相同的AR肽，其含有用一种或多种重同位素标记的一个或多个氨基酸残基。合成这类同位素标记的内标物，使得通过质谱分析时内标物产生可预测且一致的SRM/MRM特征峰，其与天然AR肽特征峰不同且截然不同并可用作比较峰。因此，当内标物以已知含量掺入来自生物样品的蛋白质或肽制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的SRM/MRM特征峰面积与内标肽的SRM/MRM特征峰面积相比较，且该数值比较显示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。片段肽的绝对定量数据根据每种样品中所分析的蛋白质的含量来显示。绝对定量可跨越单个样品中同时存在的许多肽(且因此许多蛋白质)和/或跨越许多样品进行，从而了解单个生物样品中和整个单个样品的组中的绝对蛋白质含量。

该SDM/MRM测定方法可用于辅助诊断例如直接位于患者来源的组织如福尔马林固定的组织中的癌症的阶段，并辅助确定哪种治疗剂将最有利地用于治疗该患者。对经由手术(如部分或全部肿瘤的治疗性移出)或经由为了确定疑似疾病的存在与否而进行的活检方法从患者移出的癌症组织进行分析以确定该患者组织中是否存在特定的一种或多种蛋白质以及存在何种形式的蛋白质。此外，可确定一种蛋白质或多种蛋白质的表达水平并将其与在健康组织中发现的“正常”或参考水平相比较。在健康组织中发现的蛋白质的正常或参考水平可来源于例如没有癌症的一个或多个个体的相关组织。或者，可通过分析未受癌症影响的相关组织来获得具有癌症的个体的正常或参考水平。蛋白质水平(例如AR水平)的测定还可用于诊断通过AR水平诊断具有癌症的患者或受试者中癌症的阶段。单个AR肽的水平定义为单位的所分析蛋白质裂解物总量中通过SRM/MRM测定确定的肽的摩尔含量。可通过关联AR蛋白质(或AR蛋白质的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平来使用AR相关的信息帮助确定癌症的阶段或等级。一旦在癌细胞中确定了AR蛋白质的定量含量，则可将该信息与经开发以特异性治疗癌症组织的治疗剂(化学和生物的)的列表相匹配，该癌症组织的特征是例如所测定的一种或多种蛋白质(例如AR)的异常表达。匹配来自AR蛋白质测定的信息与特异性靶向例如AR蛋白质或表达该蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表定义了治疗疾病的所谓个性化用药方法。本发明所述的测定方法使用来自患者自身组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗决定的来源，从而形成个性化用药方法的基础。

附图简要说明

图1(A-C)显示来自AR蛋白质的单个肽的SRM/MRM测定的结果，其在阳性对照样品(非福尔马林固定)和来自福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物上进行，且AR肽的定量在三重四极质谱上进行。显示了用于使用SRM/MRM方法测量已在福尔马林中固定的生物样品中该肽的前体和过渡离子的具体特征。

发明详述

原则上，例如通过使用特异性已知的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化来制备的来源于AR蛋白质的任何预测的肽均可用作替代性报告子以使用基于质谱的SRM/MRM测定确定样品中AR蛋白质的丰度。类似地，也可潜在地使用已知在AR蛋白质中潜在被修饰的位点处含有一个氨基酸残基的任何预测的肽序列来测定样品中AR蛋白质的修饰程度。

AR片段肽可通过多种方法来产生，包括使用在美国专利7,473,532中提供的Liquid Tissue方案。Liquid Tissue方案和试剂能够通过对组织/生物样品中的蛋白质进行蛋白水解消化来由福尔马林固定的石蜡包埋组织生成适用于质谱分析的肽样品。在Liquid Tissue方案中，将组织/生物制备物在缓冲液中加热延长的一段时间(例如，约80℃至约100℃，持续约10分钟至约4小时的时间)以逆转或释放蛋白质交联。所采用的缓冲液为中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液或含有去垢剂的缓冲液)。热处理后，将组织/生物样品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞内蛋白酶Lys-C的一种或多种蛋白酶处理足以破坏所述生物样品的组织和细胞结构并至℃。加热和蛋白水解的结果为液态可溶性可稀释的生物分子裂解物。

令人惊讶的是，发现来自AR蛋白质的许多潜在肽序列并不适合在基于质谱的SRM/MRM测定中使用或者在基于质谱的SRM/MRM测定中使用时是失效的，其原因目前不明。由于不可能预测最适合MRM/SRM测定的肽，因此必须通过实验在实际的Liquid Tissue裂解物中鉴定修饰的和未修饰的肽以开发针对AR蛋白质的可靠且准确的SRM/MRM测定。不希望受任何理论约束，但认为一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不会良好地电离或生成与其它蛋白质不同的片段。肽也可能无法在分离(例如，液相色谱)中良好地解析，或者附着到玻璃或塑料器具上。

在本发明的多个实施方式中发现的AR肽(例如，表1和/或表2)通过蛋白酶消化复杂的Liquid Tissue裂解物内的所有蛋白质而来源于AR蛋白质，该裂解物由从福尔马林固定的癌症组织中取得的细胞制备。除非另外指出，否则在各种情况下，该蛋白酶都为胰蛋白酶。Liquid Tissue裂解物随后通过质谱分析以确定通过质谱检测并分析的来源于AR蛋白质的那些肽。用于质谱分析的具体优选的肽亚组的鉴定基于：1)在Liquid Tissue裂解物的质谱分析中电离的来自蛋白质的一种或多种肽的实验确定，和2)肽在制备Liquid Tissue裂解物中使用的方案和实验条件下继续存在的能力。后一性质的范围不仅是肽的氨基酸序列，而且是肽内的修饰的氨基酸残基在样品制备期间以修饰的形式继续存在的能力。

从福尔马林(甲醛)固定的组织中直接取得的细胞的蛋白质裂解物使用LiquidTissue试剂和方案制备，Liquid Tissue试剂和方案要求经由组织显微解剖将细胞收集到样品管中，接着在Liquid Tissue缓冲液中对细胞加热延长的一段时间。一旦负面地影响到福尔马林诱导的交联，则使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶)以可预测的形式消化组织/细胞至完全消化。通过用蛋白酶消化完整的多肽将各蛋白质裂解物而转化成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱)各Liquid Tissue裂解物以对肽进行多重全局性蛋白组学研究，其中数据表示为来自各蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质的可通过质谱鉴定的尽可能多的肽的鉴定结果。通常采用离子阱质谱或能够进行全局性概要分析的另一形式的质谱来鉴定来自单一复杂蛋白质/肽裂解物的尽可能多的肽。但离子阱质谱可能是用于对肽进行全局性概要分析(global profiling)的最佳的质谱形式。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱的任何类型的质谱上开发并进行SRM/MRM测定，但通常认为对于SRM/MRM测定而言最有利的仪器平台是三重四极质谱仪器平台。

一旦在所采用的条件下在单一裂解物的单一MS分析中鉴定出尽可能多的肽，则整理肽的列表并将其用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对于多种Liquid Tissue裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单一数据集。可将该类型的数据集视为代表可在分析的生物样品类型中(蛋白酶消化之后)、特别是在生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的肽，且因此包括诸如AR蛋白质的具体蛋白质的肽。

在一个实施方式中，鉴定为可用于确定AR蛋白质的绝对或相对含量的AR胰蛋白酶肽包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，其各自列于表1。那些肽各自在由福尔马林固定的石蜡包埋组织制备的Liquid Tissue裂解物中通过质谱检测。因此，各肽均为用于开发人生物样品中AR蛋白质的定量SRM/MRM测定的候选物，该AR蛋白质包括直接在福尔马林中固定的患者组织中的AR蛋白质。

表1

表1中列出的AR胰蛋白酶肽包括从包括前列腺、结肠和乳腺的不同人类器官的多种不同福尔马林固定的组织的多种Liquid Tissue裂解物中检测到的那些。那些肽各自被视为可用于福尔马林固定的组织中的AR蛋白质的定量SRM/MRM测定。这些实验的进一步数据分析表明，并没有优先观察到来自任何特定器官位点的任何特定肽。因此，这些肽中的每一种都被认为是适合对来自来源于任何生物样品或体内的任何器官位点的任何福尔马林固定的组织的Liquid Tissue裂解物进行AR蛋白质的SRM/MRM测定。

在进行SRM/MRM测定时一个重要的考虑因素为可用于肽分析的仪器的类型。尽管可在包括MALDI、离子阱或三重四极质谱仪的任何类型的质谱仪上开发并进行SRM/MRM测定，但用于SRM/MRM测定的最有利的仪器平台通常被认为是三重四极仪器平台。该类型的质谱常被视作最适用于分析可由来自细胞内含有的所有蛋白质的数万至数百万个单个肽组成的很复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的靶标肽。

为了对来源于AR蛋白质的各种肽最有效地实施SRM/MRM测定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。该额外信息可用于引导并指导质谱(例如，三重四极质谱)对特异性靶标肽进行正确且集中的分析，从而可有效地进行测定。

关于靶标肽总体和关于特定AR肽的额外信息可包括该肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、m/z过渡离子和各过渡离子的离子类型中的一种或更种。可用于开发针对AR蛋白质的SRM/MRM测定的额外肽信息以来自表1中列表的三(3)种AR肽作为示例显示并示于表2中。可制备、获得针对表2中作为示例显示的三(3)种AR肽进行描述的类似额外信息并将其应用到表1中包含的其它肽的分析中。

表2

下文所述的方法用于：1)鉴定可用于AR蛋白质的基于质谱的SRM/MRM测定的来自AR蛋白质的候选肽，2)针对来自AR蛋白质的靶标肽开发单个SRM/MRM测定或多种SRM/MRM测定以进行匹配，和3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。

测定方法

1.AR蛋白质的SRM/MRM候选片段肽的鉴定：

a.使用一种或多种蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，从而由福尔马林固定的生物样品制备Liquid Tissue蛋白质裂解物

b.在离子阱串联质谱上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自AR蛋白质的所有片段肽，其中单个片段肽不含任何诸如磷酸化或糖基化的肽修饰

c.在离子阱串联质谱上分析Liquid Tissue裂解物中的所有蛋白质片段并鉴定来自带有诸如磷酸化或糖基化残基的肽修饰的AR蛋白质的所有片段肽

d.可测量由完整的全长AR蛋白质通过具体消化方法可能产生的所有肽，但用于开发SRM/MRM测定的优选肽为在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂Liquid Tissue蛋白质裂解物中通过质谱直接鉴定的那些

e.在分析来自福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物时将在患者组织中特异性修饰(磷酸化、糖基化等)并在质谱中电离化且因此被检测的肽鉴定为用于测定AR蛋白质的肽修饰的候选肽

2.来自AR蛋白质的片段肽的质谱测定

a.将针对Liquid Tissue裂解物中鉴定的单个片段肽的三重四极质谱上的SRM/MRM测定应用于来自AR蛋白质的肽

i.针对包括但不限于以下实验的最佳色谱条件确定片段肽的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反向液相色谱、高效液相色谱或反向高效液相色谱

ii.确定肽的单同位素质量、各肽的前体电荷状态、各肽的前体m/z值、各肽的m/z过渡离子和各片段肽的各过渡离子的离子类型以开发用于各肽的SRM/MRM测定。

iii.随后可使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极质谱上进行SRM/MRM测定，其中各肽均具有特征性且独特的SRM/MRM特征峰，该特征峰精确地限定在三重四极质谱上进行的独特的SRM/MRM测定

b.进行SRM/MRM分析使得来自SRM/MRM质谱分析的独特SRM/MRM特征峰面积的函数形式的所检测的AR蛋白质的片段肽的含量可指示特定蛋白质裂解物中AR蛋白质的相对含量和绝对含量。

i.相对定量可通过以下实现：

1.通过比较以下数值来确定AR蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的给定AR肽的SRM/MRM特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多的福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多的Liquid Tissue裂解物中相同AR片段肽的相同SRM/MRM特征峰面积

2.通过比较以下数值来确定AR蛋白质的增加或减少的存在量：来自一种福尔马林固定的生物样品的Liquid Tissue裂解物中检测到的给定AR肽的SRM/MRM特征峰面积与由来源于不同且单独的生物来源的其它样品中的其它蛋白质的片段肽发展的SRM/MRM特征峰面积，其中针对肽片段的两种样品之间的SRM/MRM特征峰面积的比较标准化至各样品中分析的蛋白质的含量。

3.通过比较以下数值来确定AR蛋白质的增加或减少的存在量：给定AR肽的SRM/MRM特征峰面积与来自福尔马林固定的生物样品的相同Liquid Tissue裂解物内的不同蛋白质来源的其它片段肽的SRM/MRM特征峰面积，从而将AR蛋白质的变化水平标准化至多种细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。

4.这些测定可应用于AR蛋白质的未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以与确定未修饰的肽的相对含量相同的方式确定修饰的肽的相对水平。

ii.给定肽的绝对定量可通过比较以下数值来实现：来自单个生物样品中的AR蛋白质的给定片段肽的SRM/MRM特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白质裂解物中的内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积

1.内标物为测量中的AR蛋白质的片段肽的经标记的合成形式。将该标准物以已知量掺入样品中，并可单独地确定生物样品中的天然肽片段和内部片段肽标准物的SRM/MRM特征峰面积，接着比较两个峰面积

2.这可应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中这些修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以与确定未修饰的肽的绝对水平相同的方式来确定修饰的肽的绝对水平。

3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗

a.进行AR蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明证实了患者肿瘤组织中的AR蛋白质表达与阶段/等级/状况的先前确定的关联性，如同在癌症领域中充分理解的那样

b.进行AR蛋白质的片段肽水平的相对和/或绝对定量并说明与来自不同治疗策略的临床结果的关联性，其中该关联性已经在该领域中说明或可在将来说明(通过针对患者群或来自那些患者的组织的关联性研究)。一旦通过该测定证实了先前确立的关联性或将来得出的关联性，则该测定方法可用于确定最佳治疗策略

通过在离子阱和三重四极质谱上分析所有AR肽来开发特定AR肽相关的特定且独特的特性。信息包括该肽的单同位素质量、其前体电荷状态、前体m/z值、该前体的过渡m/z值和各鉴定的过渡离子的离子类型。该信息必须针对在来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中直接存在的每个和每一个候选SRM/MRM肽通过实验进行测定；原因在于，有趣的是，并非所有来自AR蛋白质的肽都可使用本发明所述的SRM/MRM在这里裂解物中检测，表明未被检测到的AR肽无法被视为开发用于定量来自福尔马林固定的样品/组织的Liquid Tissue裂解物中直接存在的肽/蛋白质的SRM/MRM测定的候选肽。

在三重四极质谱上进行特定AR肽的具体SRM/MRM测定。通过具体的AR SRM/MRM测定分析的实验样品是例如从福尔马林固定和石蜡包埋的组织中制备的Liquid Tissue蛋白质裂解物。来自这类测定的数据显示存在针对福尔马林固定的样品中该AR肽的独特SRM/MRM特征峰。

针对该肽的特定的过渡离子特性用于定量测量福尔马林固定的生物样品中具体的AR肽。这些数据显示该AR肽的绝对含量，其是每毫克分析的蛋白质裂解物中该肽摩尔含量的函数形式。基于福尔马林固定的患者来源的组织的分析对组织中AR蛋白质水平的评价可提供关于各特定患者的诊断、预后和治疗有关的信息。在一个实施方式中，本发明描述了一种测量生物样品中雄激素受体蛋白质(AR)的水平的方法，其包括使用质谱检测和/或定量由所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰和/或未修饰的AR片段肽的含量；和计算所述样品中修饰的或未修饰的AR蛋白质的水平；且其中所述水平为相对水平或绝对水平。在一个相关实施方式中，定量一种或多种AR片段肽包括通过与添加的已知含量的内标肽比较来确定生物样品中各AR片段肽的含量，其中该生物样品中的各AR片段肽均与添加的具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，该内标物为同位素标记的内标肽，其包含选自¹⁸O、¹⁷O、³⁴S、¹⁵N、¹³C、²H或其组合的一种或多种重稳定同位素。

本发明所述的测量生物样品中AR蛋白质(或作为其替代的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断指标。在一个实施方式中，可通过关联(例如比较)组织中发现的AR蛋白质的水平与正常和/或癌性或癌前期组织中发现的AR蛋白质的水平来将该蛋白质水平的测量结果用于确定癌症的诊断阶段/等级/状况。

因为核酸和蛋白质两者都可由相同的Liquid Tissue^TM生物分子制备物分析，所以可以由用于蛋白质分析的相同样品中的核酸生成关于疾病诊断和药物治疗判断的额外信息。例如，如果AR蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，数据可提供关于细胞的状态及其不受控制地生长的潜在性、潜在的抗药性和癌症发展的信息。同时，可从相同的Liquid Tissue^TM生物分子制备物中存在的核酸中获得关于AR基因和/或核酸及其编码的蛋白质的状况的信息(例如，mRNA分子及其表达水平或剪接变化)，可在AR蛋白质的SRM分析的同时对其进行评价。可在AR蛋白质的SRM分析的同时对不来自AR且存在于相同生物分子制备物中的任何基因和/或核酸进行评价。在一个实施方式中，关于AR蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种额外的蛋白质的信息可通过检查编码那些蛋白质的核酸来评价。那些核酸可例如通过以下方法中的一种或多种、两种或更多种或三种或更多种检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、插入、缺失的鉴定，和/或是否存在突变的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。

Claims (16)

1.一种非诊断目的地测量福尔马林固定组织的人生物样品中雄激素受体蛋白质(AR)水平的方法，包括使用质谱检测和定量来自所述人生物样品的蛋白质消化物中的AR片段肽的含量；和计算所述样品中AR蛋白质的水平；

其中，所述AR片段肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述水平是相对水平或绝对水平。

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括在检测和定量所述AR蛋白质片段肽的含量之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。

3.权利要求2所述的方法，其中所述分级的步骤选自凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品的所述蛋白质消化物通过Liquid Tissue方案制备。

5.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质消化物包括蛋白酶消化物。

6.权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质消化物包括胰蛋白酶消化物。

7.权利要求1-3和6中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱、离子阱质谱、三重四极质谱、MALDI-TOF质谱、MALDI质谱和/或飞行时间质谱。

8.权利要求7所述的方法，其中使用的质谱模式是选择反应监测(SRM)、多反应监测(MRM)和/或多选择反应监测(mSRM)。

9.权利要求1-3、6和8中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品、尿样品、血清样品、腹水样品、疲液样品、淋巴液、唾液样品、细胞或实体组织。

10.权利要求9所述的方法，其中所述组织获自肿瘤。

11.权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤是原发性肿瘤。

12.权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤是继发性肿瘤。

13.权利要求12所述的方法，其中定量所述AR片段肽的水平包括比较一种生物样品中如SEQ ID NO:2所示的包含AR的约8至约45个氨基酸残基的氨基酸序列的AR片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同AR片段肽的含量。

14.权利要求13所述的方法，其中定量所述AR片段肽的水平包括通过与已知含量的添加的内标肽相比较来确定生物样品中各AR片段肽的含量，其中所述生物样品中各AR片段肽的含量与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。

15.权利要求14所述的方法，其中所述内标肽是同位素标记的肽。

16.权利要求15所述的方法，其中所述同位素标记的内标肽包含选自¹⁸O、¹⁷O、³⁴S、¹⁵N、¹³C、²H或其组合的一种或多种重稳定同位素。

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