KR20000019889A

KR20000019889A - 곤충세포를 이용한 cdk4/p16 복합체의 제조방법

Info

Publication number: KR20000019889A
Application number: KR1019980038215A
Authority: KR
Inventors: 장호진; 이재형
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1998-09-16
Filing date: 1998-09-16
Publication date: 2000-04-15

Abstract

본 발명은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK4 (cell cycle dependent kinase 4)와 CDK4 저해제인 p16 을 동시에 발현시킴으로 복합체 형태의 CDK4 와 p16 (CDK4 / HC△P16 복합체)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명은 히스티딘 표지와 같은 인위적인 부위가 없는 p16 유전자만을 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스 그리고 이를 이용하여 가용성 CDK4 / P16 복합체를 발현시키고 다양한 과정으로 정제하는 방법으로 구성되며, 상기 방법으로 안정한 CDK4 가 대량 생산될 수 있어 새로운 항암제 등을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

곤충세포를 이용한 ＣＤＫ4 / Ｐ16 복합체의 제조방법

본 발명은 곤충세포에서 CDK4 와 그의 저해제인 p16 을 동시에 발현시킴으로 CDK4 와 p16 를 복합체 형태 (이하 " CDK4 / P16 복합체 " 라고 약칭함)로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 히스티딘 표지와 같은 인위적인 부위가 없는 p16 유전자만을 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스 그리고 이를 이용하여 가용성 CDK4 / P16 복합체를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

세포주기는 세포가 지니고 있는 성분을 똑같이 복사하여 정확하게 분리함으로 동일한 딸세포를 만드는 일련의 과정을 말한다. 다세포 생물체는 이러한 세포 순환에 의해 만들어지고, 이 과정은 세포가 손상 혹은 사멸되는 경우 세포를 보호하기 위하여 고등생물이 다 성장한 이후에도 정지하지 않는다. 만일 세포주기가 멈추게 되면 며칠 이내로 인간은 죽게 된다.

세포주기 변화를 분자 수준에서 연구하려는 시도들이 90년대에 들어 활발하게 진행되어 그 변화 과정에 대하여 더욱 상세하게 밝혀지기 시작하였다. 세포주기 조절 기작은 세포주기 조절인자가 작용하여 세포의 성장, 분화, 발생, 노화, 아폽토시스 (apoptosis) 등을 주로 조절하는 것으로 이루어져 있음이 밝혀졌다 (Elledge, et al., Science, 274: 1664-1671). 이러한 연구의 결과들은 여러 병리 현상들을 정확하게 이해하는데 큰 도움을 주고 있다. 그 대표적인 예가 암으로서, 정상세포가 암세포로 변형되는 과정에서 세포주기 조절 기능이 상실되는 경우가 많이 발견되었다 (Pardee, Science, 246: 603-608, 1989). 이들 암세포를 분석한 결과 세포주기 조절인자의 활성이 많은 경우에 있어서 정상세포와 다르고, 특히 이 중에는 암 병리에서 가장 문제시되는 전이 과정과도 직접 상관 관계가 있는 예도 보고되었다 (Steeg, et al., Nature medicine, 3: 152-154, 1997). 또한, 변형동물 기술을 이용하여 세포주기 조절인자의 과량 발현 또는 녹-아웃 (knock-out)을 유도하면 실험동물에 암이 생성되는 것이 보고되어, 직접적으로 비이상적인 세포주기 조절이 암을 유발하는 요인임이 증명되었다 (Serrano, et al., Cell, 85: 27-37, 1996).

세포주기 변화는 여타 모든 생물 현상의 조절과 마찬가지로 포지티브 조절 (positive control) 및 네가티브 조절 (negative control)을 받고 있다. 포유동물 세포에서 세포주기를 조절하는 대표적인 키나제로는 3가지를 들 수 있다. 첫째는 세포 주기의 중간-G1 기 (mid-G1 phase)에서 활동적인 CDK4 (cell cycle dependent kinase 4)이고, 둘째는 중간-G1 및 S 기에서 활동적인 CDK2 이며, 세째는 G2 및 M 기에서 활동적인 CDC2 이다. 이중 CDK4 와 CDK2 는 G1-S 세포주기 체크 사항 (check point)에 의하여 그 활성이 조절되며, CDC2 는 G2-M 세포주기 체크 사항에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). 여러 암세포들에서 CDK4 와 CDK2 의 조절 기작이 비이상성을 나타내고, 실제로 변형동물에서 인위적으로 유도한 이들의 비이상성이 암을 유발하였다 (Wang, et al., Nature, 369: 669-671, 1994).

CDK4 는 분자량이 약 34 kd 으로서 그 자체로는 키나제 활성을 가지지 않으나 중간-G1 기에서 나타나는 D 타입 사이클린과 복합체를 만들어 아미노산 172번 위치가 인산화되면 활성화된 형태로 된다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). 이 키나제의 알려진 생체내 (in vivo) 기질은 종양 억제자 (tumor suppressor)인 Rb 단백질로서 S(T)-P-X-K(R) 서열을 가지는 교감 펩타이드 (consensus peptide)의 S(T)를 인식하여 인산화한다. Rb 는 모두 10개의 인산화 가능 부위를 가지고 있는데, 이중 780번 아미노산이 CDK4 만의 선호 서열 (preferable sequence)로 알려져 있으며 그 외 부위는 여러 CDK 가 인산화할 수 있다. 이러한 효소 활성을 가지는 CDK4 는 CDK4 와 사이클린 D1 (CYC D1)을 배큘로바이러스 (baculovirus)에서 동시 발현시킴으로써 얻을 수 있다 (Yoichi, TIBS, 22: 14-17, 1997). CDK4 는 Rb 를 인산화함으로 Rb 의 G1-S 세포주기 진행의 억제작용을 저해하여 G1-S 세포주기 진행을 촉진한다고 알려져 있다 (Sherr, Cell, 73: 1059-1065, 1993). 실제로 Rb 단백질이 없는 세포는 CDK4 의 활성을 저해해도 G1-S 세포주기 진행을 막지 못하는 것으로 알려져 있다 (Lucas, et al., Nature, 375: 503-506, 1995). 이는 Rb 가 최소한 CDK4 의 세포내의 성장을 조절하는 과정에 중심적인 다운 스트림 표적 기질 (down stream target substrate)임을 나타내는 것이다.

현재 CDK4 의 활성은 사이클린 D 양의 변화에 의한 포지티브 조절과 그것의 천연 억제자 (natural inhibitor) 단백질인 p16, p21, p27, p57 등에 의한 네가티브 조절에 의하여 조절된다고 알려져 있다 (Sherr, Cell, 73: 1059-1065, 1993). D 타입의 사이클린은 현재 D1, D2, D3 등 3가지가 밝혀져 있고, 이중 D1 타입이 가장 많이 연구되어 가장 중심적인 역할을 하는 사이클린인 것으로 보고되었다. 사이클린 D 는 G1 기에 나타나서 CDK4 를 활동하게 만드는 역할을 한다. 이러한 사이클린 D 의 전사 조절에 있어서 ras 또는 src 의 활성화에 의한 세포 내의 사이클린 D1 mRNA 의 상향 조절 (up regulation)이 보고된 바 있다. 이 사이클린 D1 양의 증가는 곧 세포 내에서의 CDK4 활성의 증가를 가져다 주는 것으로 알려져 있고, 이러한 현상은 ras 또는 src 가 암유전자 활성을(oncogenic activity)을 나타내는 중요한 이유가 된다 (Peeper, et al., Nature, 386: 177-181, 1997).

CDK4 의 천연 억제자 단백질은 다시 2가지 형태로 분류되는데, 구체적으로 p16 타입과 p21 타입이다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). p16 타입에는 p15 및 p18 이 속하고 이들은 CDK4 에 직접 결합하여 CDK4 활성을 저해한다. 또한 이들은 모두 안킬린 반복 도메인 (ankylin repeat domain)으로 구성되어 있으며, CDK 들중 CDK4 만을 저해하는 것으로 현재 알려져 있다. p21 타입에는 p27 및 p57 이 속하며 이들은 CDK4 외에도 CDK2 와 CDC2 를 저해하는데 CDK 가 사이클린과 복합체를 이룬 형태를 인지함으로 작용한다. p16 타입들 중 p18 및 p15 는 많은 암세포에서 그 유전자가 상실된 것이 관찰되고, 실제로 p16 녹-아웃 (knock-out) 변형동물은 많은 조직에서 암이 생성되므로 p16 기능의 상실이 암의 직접적인 원인이 됨을 알 수 있다.

세포주기 조절에 관여하는 상기에 기술한 여러 키나제 중에서 CDK4 는 그의 비이상적인 조절이 암의 진행과 직접적인 관련이 있다고 특히 많이 연구, 보고되어 왔다 (Bartkova, et al., Cancer Research, 56: 5475-5483, 1996). 상기의 사실을 미루어 볼 때 CDK4 저해제 등은 항암제로 유용하게 이용될 것으로 보이며, 이미 세계 유수의 연구기관에서는 항암제로서의 CDK 저해제에 대하여 활발히 연구하고 있다. 지금까지 CDK 저해제로는 주로 분자량이 작은 화합물이 보고되었으며, 이중 일부는 항암제로서 임상 실험 중에 있으나 아직 CDK4 에 특이적으로 작용하는 화합물은 보고되지 않았다 (Bible, et al., Cancer Research, 56: 4856-4861, 1996).

일반적으로 단백질의 저해제를 찾기 위하여는 먼저 단백질의 구조를 분석하는 것이 바람직하므로, CDK4 의 분자 구조를 규명하는 것이 필요하고 이를 위하여 고순도의 CDK4 를 대량으로 얻어야 한다. 그러나 다른 조절인자와 달리 CDK4 는 물성이 좋지 않아 단독으로 다루는 것이 어려우므로 많은 양의 CDK4 를 확보하는 것이 쉽지 않다. 실제로 CDK4 를 박테리아나 곤충세포에서 발현시켜 보면 대부분 불용성 단백질 형태로 생산되어 이를 정제하는 과정에서 재구성 (refolding) 등에 어려움이 많으며 그 수율도 낮게 나타난다.

배큘로바이러스 (Baculovirus)는 곤충에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서 약 80-200 Kbp 크기의 이중가닥 DNA 가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있는데, 최근에 각종 유용한 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터로서 크게 각광을 받고 있다. 특히 알팔파 루퍼 (alfalfa looper)로 불리우는 나방모충인 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica)에서 분리한 핵다각체형 바이러스 (NPV)인 AcMNPV 바이러스 또는 봄비스 모리 (Bombix mori)에서 분리한 NPV 인 BmNPV 바이러스가 외래 단백질을 대량 생산하는 발현 벡터 또는 발현 시스템으로 많이 이용되어 왔다.

배큘로바이러스가 곤충세포에 감염되는 경우 폴리히드린이라는 단백질이 총단백질 양의 25% 이상에 달할 정도로 발현되므로 배큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터를 이용하면 유용한 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다. 또한, 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키면 대장균의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질이 대량 생산될 수 있고 대장균이나 효모와는 달리 당의 부가 (glycosylation)와 같은 번역후수식 (post-translational modification)이 효과적으로 이루어질 수 있다. 따라서 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하면 생물학적으로 활성이 있는 천연형과 유사한 단백질을 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

본 발명자들은 CDK4 의 물성 및 발현 상의 어려움을 극복하기 위하여 부단히 연구한 결과, 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 CDK4 를 CDK4 특이 저해제인 p16 를 히스티딘이 표지된 형태로 동시에 발현시킴으로써 CDK4 / HP16 복합체를 최초로 순수 정제하여 이미 출원한 바 있었다 (대한민국 특허출원 제 98-18880호 및 제 98-9338호 참조). 또한, 상기 CDK4 / HP16 복합체는 p16 단백질 (HP16)의 카복시 말단이 불안정하여 제한된 트립신 농도에서도 쉽게 절단되고 유동성 (flexible) 구조일 가능성이 높아 단백질의 결정화에 나쁜 영향을 끼칠 수 있으므로, 본 발명자들은 HP16 과 동일한 활성을 가지나 카복시 말단이 절단된 결손형 단백질 (이하 " C△p16 " 라고 약칭함)을 곤충세포에서 대량 생산하는 방법을 동일자로 출원한다.

그러나 p16 단백질에 붙어있는 히스티딘 표지는 인위적으로 부착시킨 아미노산 부위이므로 CDK4 / HP16 복합체가 결정 구조로 쌓일 경우 단백질의 활성 등에 나쁜 영향을 미칠 수 있고, 실제로도 히스티딘 표지가 없는 CDK4 / P16 복합체 구조를 얻는 것이 더욱 정확하고 올바른 연구를 가능하게 하여 CDK4 저해제를 개발하는데 중요하다.

이에 본 발명자들은 CDK4 를 대량 생산하기 위하여 계속 연구한 결과, 곤충세포에서 상기 히스티딘 표지가 없는 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제작하고, 이를 이용하여 곤충세포에서 상기 p16 과 CDK4 를 동시에 발현시켜 결정화가 용이한 가용성의 CDK4 / P16 복합체를 형성시키고 이를 정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 곤충세포에서 CDK4 와 히스티딘 표지가 없는 p16 의 복합체를 대량 생산하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1 은 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터의 제조 과정을 나타낸 것이고,

도 2 는 본 발명의 CDK4 / P16 복합체의 정제 과정을 나타내는 흐름도이고,

도 3 은 본 발명의 CDK4 / P16 단백질의 정제 과정을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)으로 나타낸 것이다.

레인 1 : 전체 세포 용출액 ; 레인 2 : 용출 상등액 ;

레인 3 : DEAE 정제 분획 ; 레인 4 : S-200 젤 정제 분획 ;

레인 5 : 암모늄 설페이트 침전 분획 ; 레인 6 : 부틸 세파로스 정제 분획

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충세포에 CDK4 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스와 히스티딘 표지가 없는 p16 을 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 동시감염하여 발현시키는 CDK4 / P16 복합체의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명은 상기 과정으로 CDK4 / P16 복합체가 발현된 곤충세포의 파쇄액으로 음이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 소수성 크로마토그래피를 수행하는 CDK4 / P16 복합체의 정제방법을 제공한다.

상기 모든 과정에서 pH 7.0 - 10.0 범위인 완충용액을 이용하고, 암모늄 설페이트는 30 % 농도 이하로 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명은 히스티딘 표지가 없는 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 그의 대장균 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 곤충세포에서 p16 을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 새로운 항암제의 개발에 유용한 CDK4 단백질을 얻기 위하여, 결정화가 용이한 가용성 CDK4 / P16 복합체를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

우선 본 발명은 히스티딘 표지가 없는 p16 을 생산할 수 있는 곤충세포 발현 벡터를 제작하기 위하여, 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 His-P16 (대한민국 특허출원 제 98-18880호)로부터 히스티딘을 제거한 p16 유전자 절편을 얻어 기존의 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 (Clontech co.)에 삽입함으로써 인위적으로 부착된 아미노산 부위가 없는 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 을 제작한다 (도 1 참조).

본 발명은 상기 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 을 대장균에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 을 이용하고 기존의 방법 (대한민국 특허출원 제 98-18880호 참조)을 참조하여 곤충세포에서 p16 유전자를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제작한다. 구체적으로, 배큘로바이러스 발현 시스템 등을 사용하여 상기 발현 벡터를 제한효소로 절단된 배큘로바이러스와 함께 곤충세포에 감염시켜 재조합 바이러스를 생성시킨 다음 단일클론 배큘로바이러스를 분리한다.

또한, CDK4 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스로는 기존의 재조합 배큘로바이러스 (대한민국 특허출원 제 980-18880호의 기탁균주 KCTC 0464BP)를 이용한다.

본 발명은 상기 CDK4 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스와 히스티딘이 표지가 없는 p16 을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 동시감염시켜 CDK4 / C△p16 복합체를 대량 발현시킨 다음 하기 CDK4 / P16 복합체의 정제에 사용한다.

구체적으로, 상기 재조합 배큘로바이러스를 높은 농도로 배양한 다음 곤충세포에 동시에 감염시킨 다음 수용성 단백질의 발현을 분석한다. 이 때 발현된 단백질은 곤충세포 내에 축적되므로 곤충세포를 수확하여 초음파 분쇄하고 그 상등액을 얻어 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하면 CDK4 가 수용성 복합체 형태로 확인된다 (도 2 참조). 이 때 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 21 (Spodoptera frugiperda 21, sf21)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 CDK4 / P16 복합체를 정제하기 위하여, 단백질이 발현된 곤충세포 sf21 를 초음파로 파쇄하고 이로부터 세포 균질액을 얻어 불용성 침전물을 제거하고 다양한 크로마토그래피 과정 등을 수행한다. 이 때 음이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 소수성 크로마토그래피 등을 사용한다.

구체적으로, 상기 수용성 세포 파쇄액을 완충용액으로 미리 평형된 DEAE 음이온 교환 칼럼에 흡착시키고 염화나트륨이 첨가된 완충용액으로 단백질을 용출시킨 다음, 한외여과농축기로 농축하고 다시 평형된 S-200 젤 여과 칼럼에 주입시켜 단백질을 용출시키고, 암모늄 설페이트를 적당한 농도로 첨가하여 침전시킨 다음 평형된 부틸 세파로스 (butyl sepharose) 칼럼에 주입시켜 다시 암모늄 설페이트가 없는 용액으로 단백질을 용출시켰다. 상기 각 과정에서 CDK4 / P16 복합체를 포함하는 분획은 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 등으로 확인하여 수집하였다 (도 2 및 도 3 참조).

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<참조예 1> CDK4 및 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터의 제작

CDK 4 유전자는 시발체로 BNCDK4 프라이머 (36 염기; 5'-AAG,CTT,GGA,TCC, CAT,ATG,GCT,ACC,TCT,CGA,TAT,GAG-3')와 XbaICDK4 프라이머 (33 염기; 5'-CCG, TCT,AGA,CCA,TGG,CAG,CCA,CTC,CAT,TGC,TCA-3'), 주형으로 클론테크 (Clontech)사의 인간 태아 간 cDNA 라이브러리를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 얻었다. 상기 PCR 산물을 제한효소 BamHI 과 XbaI으로 처리하여 0.9 kb DNA 조각을 아가로즈 젤에서 분리하고 이를 플라스미드 벡터인 pVL1393 (Pharmingen #21201P)의 BamHI 과 XbaI 절단 부위에 T4 리가제로 접합하여 대장균에 형질전환하고 벡터 pVL1393 CDK4 를 선별하였다. 다시 상기 벡터 pVL1393 CDK4 를 BamHI 과 EcoRI으로 처리하고 약 0.9 kb DNA 조각을 아가로즈 젤에서 분리하여 발현 벡터 pBacPAK8 의 BamHI 과 EcoRI 절단부위에 접합하여 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacPAK8 CDK4를 제작하였다 (수탁번호 : KCTC 0464BP).

또한, p16 유전자는 시발체로 p16Nco 프라이머 (28 염기; 5'-GGC,CAT,GGA, GCC,TTC,GGC,TGA,CTG,GCT,G-3')와 p16Bam 프라이머 (32 염기; 5'-GGG,GAT,CCT,CAA, TCG,GGG,ATG,TCT,GAG,GGA,CC-3'), 주형으로 헬라 cDNA 라이브러리를 사용한 PCR 을 수행하여 약 0.5 kb DNA 조각을 얻었다. 이를 제한효소 NcoI 과 BamHI 으로 처리하고 벡터 pACT2 (GenBank: U29899)의 NcoI 과 BanHI 절단 부위에 접합하여 벡터 pACT2 p16 를 제작하고 그 유전자 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 유전자 염기 서열이 시라노 (Serrano, M., Nature, 366, 704-707)의 것과 동일함을 확인하였다. 다음 상기 벡터 pACT2 p16 을 제한효소 NdeI 과 BamHI 으로 처리하고 p16 단편을 아가로즈 젤 상에서 정제하여 다시 발현 벡터 pBacPAK8 His- 벡터의 NdeI 과 BglⅡ 절단 부위에 접합함으로 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacPAK8 His-p16 를 제작하였다 (수탁번호 : KCTC 0466BP). 상기 발현 벡터 pBacPAK8 His-p16 은 pBacPAK8 벡터의 BamHI 절단 부위에서부터 p16 앞까지에 하기 서열을 더 포함한다

(GGA,TCT,ATG,CAT,CAC,CAC,CAT,CAC,GGA,TCC,CAT,ATG,GCC,ATG,G; 아미노산으로 해석하면 Met,His,His,His,His,His,His,Gly,Ser,His,Met,Ala,Met)

<실시예 1> p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터의 제조

본 발명은 히스티딘 표지가 없는 p16 을 생산할 수 있는 곤충세포 발현 벡터를 제작하기 위하여, 우선 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 2μg (Clontech co.)을 제한효소 BamHI 과 EcoRI 를 사용하여 NEB 완충용액 2 (50 mM NaCl, 10 mM 트리스-염산, 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 1 % 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 5.5 Kb 핵산 절편을 분리하였다. 이하 이 절편을 ' 단편 pBacPAK8 B/RI ' 이라 칭한다.

한편 p16 유전자를 얻기 위하여, 참조예 1 의 과정으로 제작한 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 His-P16 (대한민국 특허출원 제 98-18880호)을 제한효소 BamHI 과 EcoRI을 사용하여 다시 NEB 완충용액 2 (50 mM NaCl, 10 mM 트리스-염산, 10 mM MgCl₂, 1 mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 7 % 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하여 약 450 Kb 핵산 절편을 분리하였다. 이하 이 절편을 ' 단편 p16-B/RI '이라 칭한다.

다음 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100 ng 의 ' 단편 pBacPAK8 His B/RI '과 ' 단편 p16-B/RI '을 넣고, 2㎕ 의 10배 접합반응용액 (50 mM 트리스-염산, pH 7.8, 10 mM MgCl₂, 10 mM 디티오트레이톨, 1 mM ATP, 25㎍/ml 소혈청 알부민), 10 단위체의 T4 DNA 리가제, 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101 (ATCC 33694) 균주에 형질전환시켜 p16 유전자를 포함하는 본 발명의 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 을 선별하여 얻었다.

<실시예 2> 곤충세포 sf21 에서 CDK4 / P16 복합체의 발현

대한민국 특허출원 제 98-18880호의 방법에 따라, 상기 참조예 1 의 과정으로 얻은 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 CDK4 또는 실시예 1 의 과정으로 얻은 pBacPAK8 p16을 이용하여 CDK4 또는 p16 유전자를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제작하였다. 구체적으로 클론테크사의 BacPAK^TM배큘로바이러스 발현 시스템 (클론테크 #K1601-1)을 사용하는데, 상기 발현 벡터 pBacPAK8 CDK4 또는 pBacPAK8 p16 를 제한효소 Bsu36I 로 절단된 BacPAK6 바이러스 DNA 와 함께 곤충세포에 감염 (transfection)시켜 재조합 바이러스를 생성시킨 다음 저융점 아가로즈에서 플라크를 분리, 배양하여 단일클론 배큘로바이러스를 얻었다. 이것을 각각 CDK4 바이러스 및 p16 바이러스라고 칭하고, 1.0108 pfu/ml 이상의 역가로 증식시켰다.

(단계 2) CDK4 / P16 복합체의 발현

대한민국 특허출원 제 98-18880호의 방법에 따라, 상기 CDK4 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스와 상기 단계 1 에서 얻은 p16 을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포 sf21 에 동시감염 (co-infection)시키고 CDK4 와 p16 을 복합체 형태로 대량 발현하게 하여 다음 단백질 정제 과정에 사용하였다.

구체적으로 상기 두 바이러스를 1.0 × 10⁸정도의 높은 농도로 배양하여 35 mm 배양접시에서 sf21 세포에 CDK4 바이러스를 단독으로 혹은 CDK4 바이러스와 p16 바이러스를 동시에 감염시켜 48시간 배양한 다음 수용성 단백질을 분석하였다. 이 때 발현된 단백질은 곤충세포 내에 축적되므로 곤충세포를 수확하여 4℃에서 200㎕의 완충용액 (20 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF)을 가한 다음 초음파 분쇄하고 12,000 rpm 으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석하였다 (도 3 참조). 상기 과정으로 CDK4 를 p16 와 동시에 발현시키면 곤충세포에서 CDK4 가 수용성 형태로 얻어짐을 확인하였다.

<실시예 3> CDK4 / P16 복합체의 분리·정제

(단계 1) 세포 파쇄 과정

CDK4 / P16 단백질이 발현된 곤충세포 sf21 에 20 mM 트리스, pH 8.0, 10 % 글리세롤, 0.5 mM 디티오트레이톨, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF 완충용액을 첨가하여 초음파 분쇄기 (HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC., W225, 미국)로 1분씩 3회 파쇄하고 이로부터 세포 균질액을 얻은 다음 원심분리기 (Beckman J2-21, Rotor JA20, 미국)로 16,000 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하였다. 다음 이로부터 상등액만 취하여 다음 과정에 이용하였다.

(단계 2) DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 과정

상기 과정에서 얻은 상등액을 20 mM 트리스, pH 8.0, 10 % 글리세롤, 1 mM EDTA, 0.5 mM 디티오트레이톨 완충용액으로 미리 평형된 DEAE 음이온 교환 칼럼(Pharmacia, DEAE 세파로스, 스웨덴)에 주입시켜 흡착시킨 다음 동일한 완충용액으로 세척하고 다시 염화나트륨이 첨가된 완충용액으로 단백질로 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 소디움 도데실설페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인하여 CDK4 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모았다.

(단계 3) S-200 젤 크로마토그래피 과정

상기 과정에서 얻은 CDK4 / P16 단백질을 한외여과농축기 (Amicon, YM30, 미국)를 이용하여 농축하고 20 mM 트리스, pH 8.0, 10 % 글리세롤, 0.5 mM 디티오트레이톨, 1 mM EDTA, 0.2 M NaCl 완충용액으로 미리 평형된 S-200 젤 여과 칼럼(Pharmacia, 스웨덴)에 주입시킨 다음 동일한 완충용액으로 단백질을 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인하여 CDK 4 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모았다.

(단계 4) 암모늄 설페이트 처리 과정

상기 과정에서 얻은 CDK4 / P16 복합체 용액에 암모늄 설페이트가 농도 30 % 가 되도록 첨가하여 30분간 저어주고 다시 원심분리하고 침전물만 따로 모아 다음 단계에 이용하였다.

(단계 5) 소수성 크로마토그래피 과정

상기 과정에서 얻은 침전물에 0.5 M 암모늄 설페이트, 20 mM 트리스, pH 8.0, 10 % 글리세롤, 0.5 mM 디티오트레이톨, 1 mM EDTA 완충용액을 넣어 녹이고 이를 미리 상기 완충용액으로 평형된 부틸 세파로스 (butyl sepharose) 칼럼 (Pharmacia, 스웨덴)에 주입시킨 다음 암모늄 설페이트가 없는 용액을 사용하여 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인하여 CDK4 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모음으로써 고순도의 단백질을 정제할 수 있었다.

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 방법은 히스티딘 표지와 같은 인위적으로 부착된 아미노산 부위가 없는 p16 을 CDK4 와 동시에 발현시킴으로 결정화가 용이하고 가용성인 CDK4 / P16 복합체를 대량 생산하게 한다. 상기 CDK4 / P16 복합체는 정제 과정이 용이하여 CDK4 / P16 복합체의 결정구조 분석, CDK4 의 구조와 작용 기작에 대한 연구, 순수 정제된 CDK4 를 이용한 새로운 항암제 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다

Claims

히스티딘 표지가 없는 p16 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16.
제 1항의 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 로 형질전환시킨 대장균 형질전환체.
제 1항의 곤충세포 발현 벡터 pBacPAK8 p16 을 야생형 배큘로바이러스와 함께 곤충세포에 감염시켜 제조됨으로써 곤충세포에서 p16 을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스.
곤충세포에 CDK4 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스와 제 3항의 재조합 배큘로바이러스를 동시감염하여 CDK4 와 p16 을 복합체 형태로 대량 발현시키는 CDK4 / P16 복합체의 제조방법.
제 4항의 과정으로 CDK4 / P16 복합체가 발현된 곤충세포의 파쇄액으로 음이온 교환 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 소수성 크로마토그래피를 수행하는 CDK4 / P16 복합체의 정제방법.
제 1항에 있어서, 모든 과정에서 pH 7.0 - 10.0 범위인 완충용액을 이용하고, 암모늄 설페이트는 30 % 농도 이하로 처리하는 CDK4 / P16 복합체의 정제방법.