KR20010075274A - Ｒｅｃ２ 키나아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 hsRec2 또는 muRec2 또는 이들의 유도체인 효소와 ATP를 기질과 함께 배양시킴으로써 상기 세린 함유 기질을 인산화시키는 방법을 포함한다. Rec2 키나아제 활성의 자연적 기질은 p53 및 사이클린E와 같은 세포 회로 조절 단백질이다. Rec2의 과발현은 세포-회로 정체 및 세포고사를 유발한다고 알려져 있으며, 본 발명은 상기 작용이 키나아제에 의해 매개된 것임을 개시한다. 또한, 본 발명은 Rec2의 길항제 및 활성제를 측정하는 방법을 제공하며, 상기 길항제 및 촉진제는 약학적 활성을 갖는다. 본 발명은 hsRec2 및 p53, PCNA 및 cdc2의 세포 회로 조절 단백질 사이에 특별한 결합이 이루어짐을 더욱 개시한다.

Description

ＲＥＣ２ 키나아제{REC2 Kinase}

1. hsREC2의 구조 및 기능

모든 생명체가 살아있는 동안, 세포들의 DNA는 구조에 있어서의 변화, 예를 들어 잠재적 돌연변이를 유발하는 화학적 및 물리적 충격에 지속적으로 노출되기 쉽다. 이 잠재적 돌연변이는 세포상에서 발견되는 DNA 복구 효소에 의해 인식되는데, 이는 DNA 가닥 사이의 결합 오류에 의한 것이다. 상기 잠재적인 돌연변이가 고정될 경우 유발될 수 있는 치명적인 영향을 막기 위하여, 모든 생명체들은 DNA 결합 오류를 복구하기 위한 다양한 메카니즘을 갖고 있다. 또한, 고등동물은 높은 빈도로 손상된 DNA를 가지는 세포가 프로그램화된 사망 과정(세포 고사;apoptosis)을 밟는 메카니즘을 진화시켜 왔다.

여러 경로와 발전을 유도하는 상기 DNA 결합 오류 복구의 부재 및 세포 고사사이의 관계, 암질환의 치료에 대한 진보 및 반응 사이의 관계는 비록 불완전하기는 하지만 의과학자들에 의해 광범위하게 알려져있다(Chung, D. C. 및 Rustgi, A. K., 1995, Gastroenterology 109: 1685-99; Lowe, S. W 등, 1994, Science, 266: 807-10). 따라서, DNA 복구 및 DNA 결합 오류 모니터링에 연관된 단백질을 코딩하는 유전자를 동정하고 클로닝하는 것이 지속적으로 요구되고 있다.

박테리아, 조류, 및 효모를 사용한 연구에 따르면 결합 오류 복구 과정에 연관된 유전적으로 입증된 세그룹의 유전자가 알려져 왔다. 상기 그룹들은 각각 절단 복구 그룹(the excision repair group), 에러 프론 복구 그룹(the error prone repair group) 및 재조합 복구 그룹(the recombination repair group)으로 명명되었다. 각 그룹 내 유전자의 돌연변이는 특징적인 표현형(phenotype)를 유발한다. 효모 내 재조합 복구 그룹의 돌연변이는 이온 방사(ionizing radiation)에 대한 과도한 민감성, 포자 결핍, 및 유사분열 재조합이 감소 또는 부재하는 표현형을 나타낸다(Petes, T.D. 등, 1991, in Broach, J.R., 등 eds., The molecular Biology of the yeastSaccharomyces, pp. 407-522(Cold Spring Harbor press, 1991)).

재조합 복구 그룹내에서 몇몇 계통 발생적으로 연관된 유전자들이 알려져왔는데, 이는E. Coli의 recA(Radding, C. M., 1989, Biochim. Biophys. Acta 1008: 131-145),S. cerevisiae의 RAD51(Shinohara, A., 1992, Cell, 69:457-470,Aboussekhra, A.R., 등, 1992, Mol. Cell. Biol. 12; 3224-3234, Basile, G., 등, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 3235-3246),S. cerevisiae의 RAD57(Gene 105:139-140), 및U. maydis의 REC2(Bauchwitz, R., & Holloman, W.K., 1990, Gene, 96;285-288, Rubin, B.P.,등, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:6287-6296)이다. 세번째S. cerevisiae의 유전자 DMC1은 recA와 관련되어 있고, 비록 DMC1의 돌연변이가 세포-회로 진행, 재조합 및 감수분열의 결핍을 나타낸다고 하여도, 재조합 복구에 있어서는 그렇지 않다.

REC2가 결핍된U. maydis돌연변이의 표현형은 이온 노출에 대한 이온 방사에 대한 과도한 민감성, 유사분열 재조합 및 플라스미드내 재조합의 부재, 및 완전한 감수분열의 불가능으로 특징지어 진다(Holliday, R., 1967, Mutational Research 4:275-288).U. maydisREC2 유전자의 산물인 UmREC2은 매우 광범위하게 연구되어 왔다. 상기 UmREC2는 781 아미노산으로 구성된 ATPase이며, ATP가 없을 경우, 매우 다양한 환경에서 유사 DNA 가닥의 결합을 촉진시키는데, 예를들어 UmREC2는 변성된 DNA 가닥의 두가닥 형성, 두가닥 및 단일 가닥 유사 DNA사이에서의 교환 및 동일한 가닥 사이에서 뉴클레아제 저항 복합체의 형성을 촉매한다(Kmiec, E.B., 등, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:7163-7172). UmREC2는 그것이 유사쌍을 형성하는 유일한 진핵세포 ATPase라는 점에서 단일하며, 활성은 E. Coli 효소인 recA와 동일하다.

W.K. Holloman 및 E.B.Kmiec에 의해 1995년 1월 17일에 출원된 미국 특허 출원 제08/373,134호는U. maydis유래의 REC2, 재조합 UmREC2의 제조 방법 및 이의사용방법에 관하여 기술하고 있다. 본 발명의 출원일에 앞서, 사람 REC2 cDNA의 절편은 플라스미드 p153195의 형태로 IMAGE 콘소시움(consortium), 로렌스 리버모어 국제 실험실(Lawrence Livermore National Laboratories)로부터 얻을 수 있었다. 상기 p153195 서열 중 약 400bp는 dbEST 데이타베이스 상에서 얻을 수 있다.

Rice등에 의한 과학 출간물(Michael C. Rice 등, Isolation of human and mouse genes based on homology to REC2, 1997(7), Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 7414-7422)은 뮤린(murine) 및 사람의 Rec2 서열, 사람 REC2 cDNA의 서열을 개시하며, 방사선 조사가 초기 사람 포피 섬유아세포(foreskin fibroblasts)에서 hsREC2 전사체의 수준을 증가시킨다는 것을 기술하였다. 또한, Albala 등(Albala 등, 1997(12), Genomics 46, 476-479)은 RAD51B 라고 명명된 cDNA 및 동일 단백질의 서열을 개시하였다. Cartwright 등에 의해 공개된 hsR51h2는 코딩 서열의 C말단 14 뉴클레오타이드 및 3 말단의 전사되지 않은 서열을 제외하고는 hsREC2와 동일한 서열을 가진다(Cartwright 등, 1998, Nucleic Acids Research, 26, 1653-1659). 상기 hsREC2와 hsR51h2는 동일 초기 전사체의 교차 과정에 의해 나타나는 것으로 알려지고 있다. 본 출원의 모출원은 1998년 3월 19일자에 국제 공개번호 제98/11214호로 공개되었다.

또한 hsREC2의 구조는 1996년 9월 11일에 출원된 미국특허출원 제60/025,929호, 1997년 9월 11일에 출원된 미국특허출원 제08/927,165호, 및 1998년 3월 19일자에 공개된 국제특허공개 제98/11214호에 기술되었다.

2. 세포회로 조절

진핵세포의 세포 회로는 G₁, S(Synthesis), G₂, 및 M(Mitosis)의 네 단계로 구성된다. 세포의 단계를 결정짓는 중요한 생화학적 작용 및 다음 단계로의 진행율은 일련의 키나아제에 의해 이루어지는데, 상기 키나아제 예를 들어, cdk2, cdc2 는 사이클린(cyclin) 즉, 사이클린D, 사이클린E, 사이클린A에 결합하는 불안정한 단백질에 의해 조절되고 활성화된다. 상기 활성화된 복합체는 다른 단백질들을 교대로 인산화시키며, 상기 단백질은 세포 회로의 주어진 단계에 적합한 효소를 활성화 시킨다(Morgan D.O., 1997, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15, 261-291; Clurman, B.E., 및 Roberts, J.M., 1998, in The Genetic Basis of Human Cancer, pp. 173-191(ed. by Vogelstein, B. 및 Kinzer K.W., McGraw Hill, NY)

상기 세포 회로 G₁내에는 체크 지점이 존재하는데, 염색체의 손상 또는 미토겐(mitogen) 상실 같은 특수 조건 하에서 정상 세포는 상기 체크 지점을 통과하여 진행할 수 없다. G₁체크 지점에 연관된 단백질인 Rb 및 p53은 각각 미토겐 상실 및 염색체 손상과 관련되어 있다. 상기 단백질 중 하나에서의 불활성화 돌연변이는, 다른 돌연변이와 더불어 변이된 성장 즉, 종양 세포를 유발한다. 정상 p53 또는 Rb 유전자 복제의 시작은 변이된 표현형을 막는다. p53 또는 Rb 같은 유전자에 있어서, 상기 유전자의 부재는 변이와 관련되어 있으므로, "암 억제" 유전자라 불리운다. FNS(Familial neoplastic syndromes)의 잦은 발생은 암 억제 유전자 복제 부재의 유전으로 인한 것이다(Fearson, E.R., inVogelsteinpp. 229-236).

염색체 손상에 대한 반응으로 p53의 수치는 증가하나, 상기 반응을 매개하는메카니즘은 알려져 있지 않다. 다만 p53은 다양한 키나아제에 의해 인산화될 수 있으며 이러한 인산화는 p53 단백질을 안정화 시킨다는 사실이 알려져 있다(Agarwal, M. L. 등, 1998년 1월 2일, J. Biol. Chem. 273, 1-4).

본 발명은 분자 유전학 및 약학 분야에 속한다. 특히, 키나아제를 코딩하며 동물세포에서 세포 회로 조절 및 손상된 게놈 DNA(genomic DNA)의 복구에 관여하는, 키나아제 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 명세서 상에서 hsREC2 및 hsRec2로 각각 표기된 상기 유전자 및 단백질은 유사한 결합능 및 가닥 전이 활성을 갖는 포유류 단백질로서 동일한 상위유전자(supergene) 과에 속하고, 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis)에 대한 유사 결합능 및 가닥 전이 단백질에 대한 유사성 때문에RAD51이 분리되었다. 이러한 상관관계로 인해, 상기 동일 유전자 및 단백질은 어느 곳에서나 RAD51B 및 Rad51B로 명명된다.

도 1a-1d.

도 1a 및 1b는 서열번호 1로 표시되는 hsREC2 유래의 아미노산 서열이고,

도 1c 및 1d는 서열번호 2로 표시되는 hsREC2 cDNA 코딩 가닥의 핵산 서열이다. 도 1e 및 1f는 서열번호 3으로 표시되는 muREC2 유래의 아미노산 서열이고, 도 1g는 서열번호 4로 표시되는 muREC2 cDNA 코딩 가닥의 핵산 서열이다.

도 2a-2c.

도 2a는 hsREC2의 아미노산 서열이다. 특히 주목해야 할 것은 NLS(Nuclear localization sequence), A 박스 및 B 박스 모티프 서열, DNA 결합 서열 및 src-타입 인산화 부분("P")이다.

도 2b는 주석 달린 서열의 유전자 구조도이고, 특히 영역 80-200은 recA에 가장 밀접하게 연과되어 있다. 도 2c 및 2d는 hsREC2 및Ustilago maydisREC2 서열의 상동성을 나타낸 도이다. 최대 유사성을 갖는 영역은 43% 유사성을 나타내었으며, 굵게 표시하였다.

도 3a-3b

도 3a는 Rec2의 농도를 1 ㎍/30-40 ㎕으로 고정한 다음 시간을 달리하면서,미엘린 기본 단백질(0.25 μM) 내의³²P-ATP 유입량을 나타낸 그래프이다. 도 3b는 60분간 켐타이드의 농도를 달리하면서 서열번호 5로 표시되는 켐타이드(kemptide;LRRASLG) 내의³²P-ATP의 유입량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 hsRec2가 세포 회로를 조절하는 몇몇 단백질, 특히 사이클린 E 및 p53을 인산화시키는 세린 키나아제라는 예상치 못한 발견에 기초한다. 본 발명은 세포 회로의 인산화가 생리학적으로 상승된 부위에서 단백질을 조절하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 상기 Rec2 효소 활성의 발견은 Rec2의 특정 길항제 및 촉진제인 화합물의 발견을 위한 검정법의 구성을 가능하게 하며, 상기 화합물은 약학적 활성을 갖는다.

본 명세서에서 유전자는 모두 대문자, 예를 들어 hsREC2와 같이 표기하였고, 유전자에 상응하는 단백질은 첫문자만 대문자로, 예를 들어 hsRec2로 표기하였다.

hsREC2의 활성은 베큘로 바이러스(baculovirus)에서 제조된 유도체를 함유하는 N-말단 헥사히스타딜(hexahistadyl)을 사용하여 결정되었다. 결과는 hsREC2가 접합된 글루타치온-S-전이효소를 생산하는 베큘로 바이러스 및 E. coli에 제조된 티오레독신(thioredoxin)-접합된 hsREC2를 사용하여 확인하였다. 상기 결과는 키나아제의 활성이 Ni-NTA 레진상에 내생적 베큘로바이러스 키나아제의 동시-여과를 통해 유발된다는 것을 배제하기 위한 것이다. 여과 인공물(artifacts)의 가능성을 배제하기 위하여 Ni-NTA 여과된 헥사히스타딜-hsREC2는 준비된 SDS-PAGE로 더욱 여과하였다. 실버염색(Silver stain)에 의해 hsREC2 만을 포함한 부분이 선택되고 키나아제 활성을 가짐을 확인하였다.

muRec2 및 hsRec2의 서열은 350 아미노산 중 56개 정도에서만 차이난다. 본 발명은 muRec2 또는 hsRec2, 또는 아미노산의 혼합물로 이루어지는 단백질을 사용하여 수행될 수 있고, 몇몇 경우에서 상기 아미노산은 muRec2이고, 다른 경우에는 hsRec2의 아미노산이며, 이후로는 키메라성(chimeric) hs/muRec2라 칭한다. 또한, 163 지점에 티로신이 치환된 돌연변이 단백질(mutein)도 본 발명에서 사용될 수 있으며, 예를 들어 Tyr이 Ala로 치환된 경우가 있다. 따라서, 본 발명은 키메라성 hs/muREC2^ala163을 사용하여 좀 더 수행될 수 있다. 상기 치환의 일실시예에서는 어떤 양쪽성 아미노산도 가능하다. 상기 치환의 다른 실시예에서는 시스테인 또는 프롤린 외의 다른 어떤 아미노산도 가능하다. 본 명세서에 사용된 "Rec2 키나아제"라는 용어는 hsRec2, muRec2 및 모든 키메라성 hs/muRec2 단백질 및 Tyr163이 치환된 각각의 유도체로 구성된 군을 의미한다. 인공 Rec2 키나아제라는 용어는 또한 포유류 Rec2가 아닌 Rec2 키나아제이다. 본 명세서에서 포유류 Rec2라는 용어는 hsRec2 및 muRec2의 포유류 유사체로 구성된 단백질 군을 의미한다.

본 발명은 융합 단백질을 사용하여 좀 더 수행될 수 있는데, 상기 융합 단백질은 결과적인 융합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 단백질 또는 펩타이드인 제 2 서열에 융합된 Rec2 키나아제 또는 포유류 Rec2로 이루어진 서열을 갖는 단백질로 구성된다.

자연 발생의 hsRec2 및 muRec2는 인단백질의 형태로 발견되며, 상기 인산화는 키나아제로서 단백질의 활성에 필수적이지는 않다. 본 발명에서 Rec2 키나아제 및 포유류 Rec2는 인산화된 단백질 및 인산화되지 않은 단백질의 형태를 포함한다.

1. 세포 회로 조절

CMV 초기 프로모터에 바로 인접하여 연결된 hsREC2를 포함하는 발현벡터가 제조되고, 상기 벡터는 CHO 세포에 형질전환되었다. 티로신-163, 즉 src 사이트(phe-pro-arg-tyr; 서열번호 8에서 8-11 아미노산) 상에서 인산화 될 수 있는 티로신이 알라닌(hsREC2^ala163)으로 치환된 뮤테인이 제작되었다. 변이된 hsREC2가 삽입되지 않은 대조군(Sham; neo^r), hsREC2, 또는 hsREC2^ala163로 형질전환된 CHO 세포는 배양액 제거, 방출로 동일 조건화시켰고, DNA 함량은 다양한 시점에서 형광 흐름 세포 계수 정량(quantitative fluorescent flow cytometry)에 의해 검정되었다. hsREC2가 형질전환된 세포에서는 S 단계의 개시가 지연되었으며, 14시간 후 hsREC2가 형질전환된 세포의 75%가 G₁단계에 있었으며, 상대적으로 대조군의 경우 36%가 G₁상태에 있었다.

hsREC2^ala163이 아닌 hsREC2의 과발현은 세포를 UV 방사에 민감하게 한다. CHO 세포는 UV 15 J/㎡으로 조사하였고, 다시 형광 흐름 세포 계수 정량으로 세포를 분석하였다. 대조군과 비교하여 상기 hsREC2 세포는 조사 후 24, 48, 및 72 시간 후에 광범위한 세포고사를 나타내었다.

2. 키나아제 활성

hsREC2의 키나아제 활성은 다양한 기질 상에서 나타날 수 있다. 미엘린 기본 단백질 같은 인공 기질은 hsREC2에 의해 인산화되는 단백질 키나아제 C 및 단백질 키나아제 A에 대한 기질로 알려져 있다. 또한, ser/thr 키나아제의 기질로 알려진 켐타이드(leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)는 인산화될 수 있다. 또한, 하기에 제조된 재조합 단백질, p53, 사이클린 B1 및 사이클린 E는 hsREC2에 의해 인산화된다. 사이클린 B1/cdc2 및 사이클린 E/cdk2의 동종이합체(heterodomers)는 또한 hsREC2에 의해 인산화되었다. 상기 실험의 해석은 사이클린 E/cdk2는 자동인산화되며, 사이클린 E/cdk2가 아닌 사이클린 B1/cdc2는 hsREC2를 인산화시킨다는 사실로 인해 복잡해진다. 사이클린 B1/cdc2 복합체와 반대로 hsRec2는 자동키나아제가 아니다.

비록 세포내에서 hsREC2^ala163의 발현이 세포 회로에 어떠한 영향도 미치지 않는다 하더라도, hsREC2^ala163뮤테인은 완전하 키나아제 특성을 가진다.

mREC2와 관련하여 약학적 활성을 갖는 화합물은 추천된 활성제 또는 길항제의 존재시 mREC2의 키나아제 활성, 및 특히, hsmREC2의 활성을 검정함으로써 확인될 수 있다. 특히 바람직한 물질은 사이클린 E 및 p53이다.

3. 다른 단백질과 hsREC2의 관련

hsREC2 S³⁵-방사 표지는 망상적혈구 분해 시스템 상에서 결합된 전사 번역에 의해 준비된다. 상기 준비물은 HCT116 세포 추출물과 혼합되었다. 다양한 세포 단백질에 대하여 모노클로날 항체를 사용한 분리 반응이 추가되고, 항체결합물질은 단백질 A 세파로즈(Sepharose)로 분리된다. 상기 결합물질은 SDS-PAGE로 분석되고,자기방사화(autoradiograph)된다. 면역 침전(immunoprecipitation)은 항-p53, 항-PCNA 및 항-cdc2 모노클로날이 사용되었을 때 hsREC2를 포함하였으며, 항-cdc4 또는 항-cdk4 모노클로날을 사용하였을 경우에는 hsREC2가 침전되지 않았다.

4. hsREC2 활성제 또는 길항제는 약학적인 활성을 갖는다.

hsREC2의 활성은 상기 활성의 변화가 예를 들어 UV 조사 등의 유전적 손상 유발의 결과로서 세포 고사로 들어가는 세포를 민감화시키거나 또는 둔감화시킬 수 있으며, 또한, G₁및 S기를 연장하거나 단축시킴으로써 DNA 손상으로부터 세포를 보호하거나 또는 보호하지 않을 수 있다는 사실을 지적한다. hsREC2의 활성제 및 길항제는 개업 약사가 원하는 유형의 활성을 갖는 화합물이다. hsREC2 촉진제 또는 길항제인 화합물의 발견은 약제학적 과학에 있어서 매우 중요할 것이다.

일실시예에서 본 발명은 hsREC2의 키나아제 활성 상의 화합물의 효과를 결정지음으로써 주어진 화합물이 약학적 활성을 갖는지의 여부를 결정짓는 방법에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 본 발명은 hsREC2 및 제2 키나아제 상의 화합물의 상대적인 효과를 측정하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 사이클린 D/cdk4 및 사이클린 E/cdk2에는 미미하거나 또는 어떠한 효과도 나타내지 않는 hsREC2 활성제인 화합물은 세포를 G₁기에 정체시키며, 유전적 손상에 대한 반응으로 세포 고사를 유발한다. 본 발명의 특정 실시예에 있어서, 키나아제 검정은 p53, cdc2, cdk2 또는 사이클린 E로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 기질을 사용하여 수행된다. 대안적으로 상기 기질은 미엘린 기본 단백질 또는 켐타이드(leu-arg-arg-ala-ser-leu-gly)와 같은 모델 기질이 될 수 있다.

1. 오토그라피카 칼리포니아( Autographica california )의 베큘로 바이러스 감염에 의한 재조합 hsREC2 단백질의 제조

hsREC2 발현 벡터의 제조를 용이하게 하기 위하여, hsREC2 cDNA에 PCR 증폭을 통하여 Xho I 및 Kpn I의 제한효소 자리를 삽입시켰다. nt 71에서 시작하는 hsREC2 cDNA는 서열번호 6으로 표시되는 순방향 프라이머(5'-GAG CTCGAG GGTACC C ATG GGT AGC AAG AAA C-3')를 사용하여 확장되었으며, 개시 코돈의 5' 말단 쪽에 Xho I 및 Kpn I의 제한효소 자리(밑줄친 부분)가 위치되었다. hsREC2 cDNA의 전체 코딩 서열을 포함하는 재조합 분자는 Xho I 또는 Kpn I 중 하나를 사용하여 제거될 수 있으며 단일한 Xba I 부위는 서열번호 2로 표시되는 nt 1270 및 1280 사이에 위치한다.

베큘로 바이러스에서 HsREC2의 발현을 위한 벡터 pBacGSTSV는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda; Sf-9) 곤충 세포(ATCC 세포주 No. CRL1711, Rockville MD)에 주입하였으며, 상기 세포주는 Zailin Yu 박사(Baculovirus Expression Laboratory, Thomas Jefferson University)로 부터 얻었다. 벡터 pVLGS는 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum) 글루타치온 S-전이효소 폴리펩타이드 및 pGEX-2T(Smith & Johnson, GENE 67:31 (1988)) 유래의 트롬빈 절개 사이트를 코딩하는 절편을 삽입한 다음, 본 명세서의 참고 문헌에 포함된 벡터 pVL1393으로 삽입하여 제조되었다. 폴리 A 종결 신호 서열은 pVLGS로 삽입되어 pBacGSTSV를 생산하였다. 1.2 Kb의 hsREC2 절편을 포함하는 플라스미드는 Kpn I으로 절단되고, 절단되지 않은 3' 말단은 T4 중합효소로 제거되었으며, 결과물은 Xba I 으로 절단되었다. 결과적인 절편은 Sma I, Xba I으로 절단된 pBacGSTSV 벡터로 삽입되었으며, pGST/hsREC2가 제조되었다.

pGST/hsREC2 유래의 삽입물을 포함하는 재조합 바이러스는 일반적인 방법으로 분리되었고, Sf-9 세포는 감염되었다. Sf-9 세포는 10% FBS가 첨가된 SF900Ⅱ SFM (Gibco/BRL Cat# 10902) 또는 TNM-FH(Gibco/BRL Cat# 11605-011)에서 배양되었다. 배양 후 3-5일 후 감염된 세포를 수확하고, Ca⁺⁺및 Mg⁺⁺가 없는 PBS로 세척하고, 5×10⁷세포당 프로테나아제 저해제(ICN Cat #158837), 1% NP-40, 250 mM NaCl이 첨가된 5 ㎖ PBS상에서 음파파쇄하였다. 상기 침전물은 30,000×g에서 20분간 원심분리하여 제거되었다. 다음으로 상층액에 5×10⁷세포당 글루타치온-아가로오즈 레진(Sigma Chem. Co. Cat # G4510) 0.5 ㎖을 사용하였다. 상기 레진은 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl 및 2.5 mM CaCl₂의 버퍼로 세척되었고, hsREC2는 동일한 버퍼로 23℃에서 2시간 동안 트롬빈(thrombin; Sigma Chem. Co. Cat # T7513) 처리함으로써 방출시켰다. 어떤 실험 과정 동안에 트롬빈은 Thompson 및 Davie의 기술(Thompson 및 Davie, 1971, Biochim. Biophys. Acta. 250:210)에 의해 제거되었으며, 이는 아미노카프로일-p-클로로벤질마이드 친화 컬럼(aminocaproyl-p-chlorobenzylmide affinity column; Sigma Chem. Co. Cat # A9527)을 사용하였다.

대안적으로, 전장 hsREC2 cDNA는 베큘로 바이러스 시스템에서의 과발현 및 6 히스티딘 택(tag)을 사용한 정제를 위해 발현벡터 pAcHisA로 클로닝되었다. 클로닝을 위하여 hsREC2 발현 카세트(cassette)는 Kpn I으로 절단되었고, 3' 돌출 말단(protruding termini)은 T4 중합효소로 제거되었으며, 다음으로 DNA를 Xba I으로 절단하였다. 결과적인 절편은 pAcHisA의 Sma I 및 Xba I 부위로 접합되었다. hsREC2를 포함하는 재조합 바이러스는 정제되었고, 곤충 세포는 Z. Yu. 박사(Kimmel Cancer Institute의 베큘로 바이러스 발현 실험실)에 의해 감염되었다. 2 ℓ배양으로 얻은 곤충 세포 펠렛은 10 mM TrisCl(pH 7.5), 130 mM NaCl, 2% TX100, 2 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 아프로티닌(aprotinin), 및 1 ㎍/㎖ 펩스타틴의 용액 60 ㎖에 현탁되었고, 20% 펄스 상에서 마이크로 팁을 사용하여 각각 5초씩 4회 얼음상에서 음파파쇄하였다(Branson sonifer 450). 찌꺼기는 30,000 ×g에서 20분간 원심분리함으로써 제거되었다. 불순물이 제거된 상층액은 두개의 50 ㎖ 배양 튜브에 나누어 담고, Ni-NTA 아가로즈 1 ㎖을 각 튜브에 4℃에서 흔들어주면서 1시간동안 첨가하였다. 결합되지 않은 절편은 짧은 원심분리에 의해 레진으로 부터 분리되었고, 상기 레진은 100 mM 이미다졸 10 ㎖을 사용하여 10분간 흔들어 주면서 세척하였고, 2000 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 두번째로 500 mM 이미다졸을 사용한 10분간의 세척이 끝난 후에 슬러리를 컬럼으로 옮기고, 배출액은 버렸다. 정제된 his-hsRec2는 1M 이미다졸(pH 7.0; 용출액을 모으기 전에 10분간 컬럼 상에 이미다졸)로 용출시켰고, 50 mM TrisCl(pH 7.4), 50 mM NaCl, 10% 글리세롤로 하룻밤 동안 투석하였다. 편의를 위하여, 이 단백질은 hishsRec2 대신 hsRec2로 언급할 것이다.

2. 재조합 hsREC2 단백질의 박테리아 제조.

hsREC2 cDNA 코딩 영역은 이전에 사용되었던 포유류 발현 벡터 pcDNA3 G8로 부터 Xba I으로 절단되었고, T4 중합효소로 5' 돌출 말단을 제거한 다음 Kpn I으로 절단하였다. 상기 결과적인 절편은 박테리아 발현 벡터 pBAD/HisC(Invitrogen, Corp., U.S.A)의 Kpn I 및 무딘 Hind III 위치로 삽입되었다. 6개의 히스티딘을 가진 절편 상에 클론된 hREC2를 가진 상기 제조된 발현 벡터는 과발현을 위하여 LMG194 박테리아(Invitrogen, Corp., USA)로 전기형질전환(electrotransformation) 되었다. LB 엠피실린 배양액 500 ㎖에 단일 콜로니를 접종하였고, 37℃ 로그 단계까지 성장시켰다. 0.02% 아라비노오즈로 4시간 동안 상기 배양을 촉진시켰고, 8,000 ×g에서 원심분리하여 수확되었다. 상기 펠렛은 재현탁시켰고, 1 ㎎/㎖ 리소자임(lysozyme)으로 용해시켰으며, 0℃에서 50 mM NaH₂PO₄,300 mM NaCl, 1% TX100, 2 ㎍/㎖ 류펩틴 및 아프로티닌 및 1 ㎍/㎖ 펩스타틴, 1 ㎎/㎖ DNase I, 10 mM βME 및 20 mM 이미다졸의 5 부피상에서 음파파쇄하였다. 상기 침전물은 10,000 ×g에서 30분간 원심분리함으로써 정화한 다음 활성화된 Ni + NTA 아가로오즈 레진 1 ㎖을 포함하고 있는 밀봉된 컬럼에 넣고 1시간 동안 4℃에서 흔들어 주었다. 다음으로 상기 컬럼을 열고 4℃에서 50 mM NaH₂PO₄,300 mM NaCl, 1% TX100, 50 mM 이미다졸의 20부피의 압력으로 세척하였다. 다음으로 결합된 단백질은 500 mM 이미다졸을 가진 상기 세척 버퍼의 세배로 용출되고 1 ㎖ 튜브에 모았다. 상기 정제된 His-HsRec2는 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10% 글리세롤 용액상에서 투석되었고, -80℃에 저장되었다.

3. hsREC2 키나아제의 검출

포스포키나아제 필터 검정.기질은 켐타이드 또는 미엘린 기본 단백질 중 하나이고, his-hsRec2 약 1 ㎍을 포스포키나아제로 첨가하였다. 상기 두 검정을 위해 사용한 버퍼는 50 mM TrisCl(pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM DTT를 포함하였다. 상기 두번째 기질,³²P-ATP는 1972 cpm/pmole(켐타이드) 및 2980 cpm/pmole(MBP)의 특정 활성을 가진 50 μM로 유지하였다.³²P-ATP는 30℃에서 지정된 시간동안 수행된 반응을 개시하기 위하여 첨가되었다. 반응의 종결 시점에서 20 ㎕를 포스포셀룰로오즈 디스크(phosphocellulose discs) 상에 점찍고, 1% 인산으로 디스크당 10 ㎖로 두번 증류수로 두번 세척하였다. 필터는 왈락 섬광계수기(Wallac Scintillation counter)로 카운트 되었다. hsRec2가 첨가되지 않은 기질은 대조군으로 사용되었고, 상기 수치는 0 포인트를 얻기 위하여 감하였다.

미엘린 기본 단백질(0.25 μM)은 상기 조건에서 0 내지 25분간 인산화되었다. 인산염 병합은 시간에 따라 비례하며 25 분에서 1.2 pmole에 도달하였다. 상기 인산염 유입율은 기질 농도에 따라 0.06 mM까지 비례상승하며, 반면에 0.09 pmoles/분율로 유입되는 것이 관찰되었다.

두가지, 즉 GST-hsRec2 및 티오레독신-hsRec2의 다른 hsRec2 접합은 또한 포스포 키나아제의 활성을 나타낸다. 게다가 상기 활성이 오염에 의한 것이 라는 증거는 하이브리도나 상층액을 사용한 hsREC2의 면역 침전 및 하기에 기술한 바와 같이 기질로서 p53을 사용하여 포스포키나아제 활성 검정에 의해 뒷받침된다. 상기 실험은 상기 키나아제가 항-hsREC2 모노클로날 항체에 의해 침전되었음을 확인시켜준다.

hsRec2에 의해 인산화되지 않은 두개의 기질은 하나의 티로신을 포함하는 티로신 키나아제 기질 펩타이드이고, 이것을 서열번호 7로 표시되는 pp60^src(RRLIEDAEYAARG) 인산화 부분, 및 hsRec2 펩타이드, 서열번호 8로 표시되는 잔기 153-172(VEIAESRFPRYFNTEEKLLL)를 둘러싸는 서열로 부터 유래된다.

p53 인산화.사람 제조합 p53(0.5 ㎍, Pharmingen, San Diego, CA)은 30℃ 50 mM TrisCl(pH 7.4), 10 mM MgCl₂및 1 mM DTT 상에서 hsRec2가 있는 상태에서 또는 없는 상태에서 배양되었다. 상기 반응은³²P-ATP(25 μM, ATP, 40 cpm/femtomole)의 첨가에 의해 개시된다. 각 시점의 종결지점에서, 동일 부피의 2×로딩 버퍼(5)가 첨가되었고, 튜브는 모든 튜브가 모아질 때까지 얼음상에 위치시켰다. 다음으로 샘플을 100℃에서 10분간 가열하였으며 레디 젤(Ready Gels; Bio-Rad Labotatories, Hercules, CA) 상에 13 ㎕를 러닝시켰고, X-레이 필름에 현상하기 전에 니트로셀룰로오즈 막으로 하룻 밤 동안 전이시켰다. 동위원소 표지된 p53은 쉽게 관찰되었다.

cdc2/싸이클린 B 포스포키나아제 검정.정제된 사람 재조합 사이클린B1/cdc2(oncogene, Cambridge, MA)는 30℃에서 10 또는 60 분간 hsRec와 함께 배양되었고, 상기 p53의 경우에 기술한 것과 동일한 버퍼 조건을 사용하였다. 동일 부피의 2×로딩 버퍼(5)가 첨가되었고, 샘플은 100℃에서 10분간 가열되었고, SDS-젤상에서 러닝시켰으며, 니트로샐룰로오즈 막으로 전이되었고 필름에 노출시켰다. hsREC2 키나아제 활성에 의해 유발된 방사선 표지된 사이클린 B1은 cdc2에 의한 사이클린 B1의 "자기인산화"의 수치 이상으로 쉽게 관찰되었다.

cdk2/사이클린 E 포스포 키나아제 검정.GST-사이클린 E는 pGEX-2TcycE(A. Giordano, Thomas Jefferson University)로 형질전환된E. Coli로 부터 분리되었고, 글루타치온 세파로오즈 4B(Glutathione Sepharose 4B; Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용하여 정제하였다. 글루타치온 세파로오즈 GST-사이클린 E는 세척되었고, 다음으로 50 mM TrisCl(pH 7.4)상에 슬러리를 1:1로 저장하였다. 사이클린 E가 결합된 cdk2의 검정을 위해서, 정화된 cdk2(A. Koff, Sloan-Kettering, NY)는 기술된 바와 같이 사이클린 E와 배양되었고 결합되지 않은 슬러리는 1:1 슬러리로 저장되기 전에 세척에 의해 제거되었다. 키나아제 활성은 cdk2가 결합되어 있거나 또는 결합되어 있지 않은 움직이지 않는 GST-사이클린 E를 가지고 전술한 p53과 동일한 조건을 사용하여 수행되었다. 사이클린 E 및 hsREC2의 인산화는 cdk2가 없을시 쉽게 관찰된다. cdk2가 있을 경우 자가 인산화가 발견되나, 상기 수치 이상의 사이클린 E의 hsREC2 인산화는 명확하다.

p53 및 hsRec2와 관련된 시험관 내 검정.hsRec2(5 ㎍) 및 15 ㎕ 아가로오즈-GST-p53(Oncogene Sciences)은 0.5 ㎖ 바인딩 버퍼((10%) glycerol, 50 mM TrisCl(pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1mM EDTA, 1 mM DTT, 0.02% NP 40, 200 mM NaCl, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌 및 류펩틴, 및 20 μM PMSF)에 첨가되었다. 실온에서 한시간 반응시킨 다음, p53 아가로오즈는 침전되었고, 고농도의 세정제를 사용한 상기와 같은 버퍼로 두번, 50 mM TrisCl(pH 7.4), 10 mM MgCl₂로 한번 세척하였다.

PCNA, p53 및 cdc2와 번역된 hsRec2의 시험과 내에서의 연관.

Xba I으로 선형화된 pCMVhREC2가 시험관내(Ambion, ustin TX)에서 처음으로 전사되었는데, 벡터 1 ㎍을 사용하였고, 다음으로 양성 대조군으로서 키트 내 포함되어 있는 Xef1 mRNA을 따라 시험관 내에서 전사되었다.³⁵S-메티오닌을 포함하는 Xef1 또는 hsRec2의 결과물을 포함하는 망상적혈구 분해물은 HCT16세포(50 mM TrisCl(pH 7.4), 120 mM NaCl, 0.5% NP40, 20 μM PMSF, 2 ㎍/㎖ 펩스타틴, 및 10 ㎍/㎖ 류펩틴 및 아프로티닌, MB)의 추출물 1.2 mg과 함께 두시간 동안 배양되었고, PCNA, p53 또는 cdc2에 대한 항체 10 ㎍이 하룻 밤 동안의 배양 과정동안 첨가되었다. 다음날, 단백질 A 세파로오즈가 2 시간동안 첨가되었으며, 펠렛은 500 ㎕ MB로 4번 세척되었다. 펠렛은 40 ㎕의 샘플 버퍼에 현탁되고, 10분간 가열하였으며, 10% 젤상에서 15 ㎕를 러닝하였고, 낮은 백그라운드를 얻기 위하여 X-레이 필름 현상전에 니트로셀룰로오즈 막으로 전이시켰다.

Claims (20)

1. Rec2 키나아제 또는 포유류 Rec2의 서열을 포함하는 서열을 갖는 효소와 유효 농도의 ATP를 기질과 함께 배양시키는 단계, 및 상기 기질의 인산화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 세린-함유 기질을 인산화시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소의 서열은 Tyr¹⁶³외의 아미노산을 포함하는 Rec2 키나아제의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 효소의 서열은 Tyr¹⁶³외의 아미노산을 포함하는 hsRec2의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 효소의 기질은 사람 단백질 p53, cdc2, cdk2 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 효소의 기질은 켐타이드(kemptide)인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 효소의 서열은 hsRec2의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 효소의 기질은 p53, cdc2, cdk2 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 효소의 기질은 켐타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 효소의 서열은 포유류 Rec2의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 효소의 기질은 사람 단백질 p53, cdc2, cdk2 및 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 효소의 기질은 켐타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 효소 및 상기 효소의 길항제 또는 활성제의 혼합물을 형성하는 단계, 및 기질의 인산화 정도에 따른 상기 길항제 또는 활성제의 영향을 측정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. a) Rec2 키나아제 또는 포유류 Rec2의 서열을 포함하는 서열을 갖는 효소;

    b) 상기 효소의 세린을 함유하는 기질; 및

    c) γ-인산염 표지된 ATP를 포함하는 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 인산염 표지는³²P인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제13항에 있어서, 상기 기질은 세포 회로 조절 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 기질은 사람 p53, 사람 cdc2, 사람 cdk2, 및 사람 사이클린 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제13항에 있어서, 상기 기질은 켐타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제13항에 있어서, 상기 효소의 서열은 hsRec2 또는 hsRec2^Ala163의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. Tyr¹⁶³외의 아미노산을 갖는 Rec2 키나아제를 포함하는 효소.
20. Tyr¹⁶³외의 아미노산을 갖는 포유류 Rec2의 서열을 포함하는 서열을 갖는 효소.