KR19990086093A - 곤충세포를 이용한 가용성 cdk6 단백질의 대량 발현 및 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6를 발현시키고 발현된 가용성 CDK6 단백질을 정제하는 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 및 정제 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 가용성의 CDK6 단백질을 용이하게 대량 발현시킬 수 있고, 또한 순수한 CDK6 단백질을 얻을 수 있다.

Description

곤충세포를 이용한 가용성 ＣＤＫ6 단백질의 대량 발현 및 정제 방법

본 발명은 곤충세포를 이용한 가용성 CDK6 단백질의 대량 발현 및 정제 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6를 발현시키고 발현된 가용성 CDK6 단백질을 정제하는 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 및 정제 방법에 관한 것이다.

세포주기 변화의 분자수준에서의 연구는 90년대에 들어 더욱 활발하게 진행되어 세포주기 변화가 더욱 상세하게 밝혀지기 시작하였다. 세포주기 조절 기작에서 세포주기 조절인자는 세포주기의 조절기능을 통하여 세포의 성장, 분화, 발생, 노화, 아폽토시스(apoptosis) 등을 중심적으로 조절한다는 것이 밝혀졌다(Elledge et al., Science 274: 1664-1671). 이러한 연구의 결과들은 여러 병리 현상들을 정확하게 이해하는 데 큰 도움을 주고 있다. 그 대표적인 예가 암이다(Pardee, Science 246: 603-608, 1989). 정상세포가 암세포로 변형되는 과정에서 세포주기 조절 기능이 상실될 때가 많이 발견되었다. 암세포들의 분석은 세포주기 조절인자의 활동이 정상과 다른 경우의 예를 많이 보여주었고 특히 이 중에는 암병리에서 가장 문제시되는 전이와 깊은 상관관계도 있음을 보여 주었다(Steeg et al. Nature medicine 3: 152-154, 1997). 변형동물기술을 이용하여 세포주기 조절인자의 과량 발현 혹은 녹아웃(knock-out)을 유도하면 실험동물에 암이 생성되는 것은 직접적으로 비이상적 세포주기 조절이 암을 유발하는 요인이 된다는 것을 증명하고 있다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996).

세포주기 변화는 여타 모든 생물현상의 조절과 마찬가지로 양성 조절(positive regulation)과 음성 조절(negative regulation)을 받고 있다. 현재까지 알려진 세포주기 조절의 주 골격은 특정한 프로테인 키나제 패밀리 활성도(protein family kinase activity)에 의하여 그 진행이 결정되며 이 키나제 활성도는 세포가 처한 환경에 따라 양성 또는 음성 조절을 받게 된다(Morgan, Nature 374 9:131-134, 1995). 많은 암세포나 발암 기전의 연구 결과 상기 양성 또는 음성 조절에 문제가 발생되는 경우가 많이 발견되었다. 즉 필요 이상의 지나친 양성 효과(positive effect) 또는 음성 조절(negative regulation)의 상실 그리고 세포주기 조절에서 중요한 면인 시기 적절한 조절(timely regulation)의 어긋남이 암세포에서 문제점으로 지적되었다.

포유동물에서 세포주기를 조절하는 대표적인 키나제로는 3가지를 들 수 있다. 첫째는 세포주기의 G1 상 중간에서 활동적인 CDK4(Cell cycle dependent kinase 4)이고, 둘째는 G1 중간과 S 상에서 활동적인 CDK2, 그리고 G2-M 상 키나제인 CDC2이다. 이중 CDK4와 CDK2는 G1-S 세포주기 체크 사항(check point)에 의하여 그 활성도가 조절되며, CDC2는 G2-M 체크 사항(check point)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 여러 암세포들에서 CDK4와 CDK2의 조절기작이 비이상성을 나타내고, 실제로 변형동물에서 인위적으로 유도한 이들의 비이상성이 암을 유발하였다(Wang et al., Nature 369: 669-671, 1994).

CDK2는 분자량이 약 34 kd이며 CDK4와 약 47%의 유사성을 가진다. 알려진 세포주기 조절 키나제는 공통적인 방법에 의해 활성화된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). CDK가 활성화된 형태로 되려면 특정 세포주기에서만 존재하는 특정형태의 사이클린(cyclin)과 복합체를 이루어야 하고 특정 아미노산이 CAK(CDK activating kinase)에 의하여 인산화되어야 하며 N-말단 근처가 포스파타제(phosphatase)에 의하여 탈인산화(dephosphorylation)되어야 한다. CDK 2는 세포주기 변화 동안 번갈아 가며 여러 사이클린과 교대로 결합하면서 활성화된다. G1-S 전이 중에는 사이클린 E와 결합하고, S 상 중에는 사이클린 A와 결합하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 CDK 2가 사이클린 파트너(partner)를 세포주기 동안 바꾸는 것의 의미는 아직 잘 알려져 있지 않다. CDK 2 활성도는 세포가 G1 상에서 S 상으로 가는데 그리고 S 상을 완성하는데 꼭 필요하다는 데는 이의가 없다. 그러나 그에 대한 자세한 설명을 위해서는 진전된 연구가 필요하다. CDK 2는 CDK 4와 마찬가지로 RB 단백질을 시험관 내(in vitro)에서 인산화한다. 그리고 CDK 4와 다르게 히스톤 H1도 인산화한다. 이것의 생체 내(in vivo) 중요도는 현재 잘 모르고 있다. CDK 2는 위에서 기술한 여러 사이클린에 의하여 시기 적절하게 활성화(timely activation)된다. 또한 CDK 2는 CDK 4와 마찬가지로 p21 형태의 CDK 저해제에 의하여 그 활성도가 저해된다. 그러나 p16 형태는 전혀 저해제로서 작용하지 못한다. 세포분화중 CDK 2 활성도는 CDK 4와는 다르게 아직 줄어든다는 보고는 없다. CDK 2의 X-선 구조분석연구 결과는 CDK 효소의 활성화과정을 이해하고 그 효소작용 기작을 설명하는데 큰 도움을 주었다(Jefferey et al. Nature 376: 313-320, 1995). CDK 2-ATP 복합체와 CDK 2-사이클린 A-ATP 복합체의 구조분석 결과는 165번 아미노산의 인산화가 소위 T 루프(loop)의 이동을 유발하여 활성 자리 주머니(active site pocket)을 열린 상태로 만들어 단백질 기질(protein substrate)이 부착하는 환경을 조성한다는 것을 보여주며, 이 과정 중에 관계된 아미노산들을 보여주고 있다. 사이클린 A는 CDK 2에 부착하여 역시 기질이 부착될 수 있는 열린 형태를 유도하며 부착된 ATP가 반응에 적절한 방향성(orientation)을 가지도록 해주는 것으로 밝혀졌다. 그러나 아직 기질 펩티드가 CDK 2와 복합체를 만드는 경우에 대한 데이타는 다음 연구 과제로 남겨진 상태이며 기질의 결합에 대해서는 아직 구조적인 설명을 못하고 있다. 일부 유방암에서 사이클린 E의 과량 발현이 관찰되었고 이는 유방암의 전이와 깊은 연관이 있음이 알려져 있다(Pardee, et al., Nature medicine 2: 254, 1997). 사이클린 E의 과량 발현이 저 혈청 조건에서 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 저해하며, 앵커리지 독립 성장(anchorage independent growth)을 유도한다고 제안되었다. MMTV 프로모터를 이용한 CDK 2 과량 발현 변형 동물에서 가슴 상피 세포(breast epithelial cell)의 과증식(hyperploliferation), 네오플라지아(neoplasia)가 관찰되었다. 이러한 사실은 CDK 2 활성도가 세포 변화 과정 혹은 그것의 유지에 관여될 가능성을 보여주는 것이라 하겠다.

CDK 4는 분자량이 약 34 kd으로서 그 자체로는 키나제 활성을 가지지 않는다. CDK 4는 G1 중간 상에서 나타나는 D 타입 사이클린과 복합체를 만들고 아미노산 172 위치가 인산화될 때 활성화된 형태로 된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 이 키나제의 알려진 생체 내(in vivo) 기질은 종양 억제자(tumor suppressor) Rb로서 S(T)-P-X-K(R) 교감 펩타이드(consensus peptide)의 S(T)를 인식, 인산화한다. Rb는 모두 10개의 인산화 가능 자리를 가지고 있는데 이중 780번의 아미노산이 CDK 4만의 선호 시퀀스(preferable sequence)로 알려져 있으며 그외 부위는 CDK 4 등의 여러 CDK가 인산화할 수 있다. 효소활성을 가진 CDK 4는 CDK 4와 CYC D1을 배큘로바이러스(baculovirus)에서 동시 발현함으로써 얻을 수 있다(Yoichi, TIBS 22: 14-17, 1997). CDK 4는 Rb를 인산화함으로써 Rb의 G1-S 세포주기 진행의 억제작용을 저해하여 G1-S 세포주기 진행을 촉진한다고 알려져 있다(Sherr, Cell 73: 1059-1065, 1993). 실제로 Rb 단백질이 없는 세포는 CDK 4의 활성을 저해해도 G1-S 세포주기 진행을 막지 못하는 것으로 알려져 있다(Lucas et al., Nature 375: 503-506, 1995). 이는 Rb가 최소한 CDK 4의 세포내의 세포성장을 조절하는 일에 중심적인 다운 스트림 표적 기질(down stream target substrate)임을 나타낸다고 하겠다. CDK 4의 활동도가 여러 세포의 분화시 줄어드는 것으로 보아 CDK 4는 세포분화를 저해하는 것으로 추정되고 있다. 이 경우 다른 CDK 활동도는 변하지 않는 것으로 보아 이것은 CDK 4의 중요한 세포내 기능임을 암시하고 있다(Kranenburg et al., Journal of Cell Biology 131: 227-234, 1995). CDK 4 단백질은 일반적으로 세포내에서 세포주기 변화 동안 그 양이 변하지 않는 것으로 알려져 있다. 간혹 몇몇 암세포에서 그 단백질 양이 증가되는 것이 보고되었고 그 유전자가 증폭되는 경우도 알려져 있다. 그러나 현재 CDK 4 활성도의 조절로는 사이클린 D 양의 변화에 의한 양성 조절(positive regulation)과 그것의 천연 억제자(natural ingibitor) 단백질인 p16, p21, p27, p57 등에 의한 음성 조절(negative regulation)이 중요하다고 알려져 있다(Sherr, Cell 73: 1059-1065, 1993). D 타입 사이클린은 현재 D1, D2, D3 등 3가지가 알려져 있는데 이중에 D1 타입이 가장 연구가 많이 되었고 또한 중심적인 역할을 하는 사이클린이다. 사이클린 D는 G1 상에서 나타나서 CDK 4를 활동하게 만드는 역할을 하게 된다. 사이클린 D의 전사 조절에 있어서는 ras나 src의 활성화에 의한 세포내에서 사이클린 D1 m-RNA의 상향 조절(up regulation)이 보고되었다. 이 사이클린 D1 양의 증가는 곧 세포내에서의 CDK 4 활동도의 증가를 가져다 주는 것으로 알려져 있고 이러한 현상은 ras나 src가 암유전자 활동도(oncogenic activity)를 나타내는 중요한 이유가 된다(Peeper et al., Nature 386: 177-181, 1997).

CDK 4는 음성 조절도 받게 된다. 먼저 아직 알려지지 않은 키나제에 의한 17번 티로신의 인산화는 CDK 4 활성을 저해하는데 이는 곧 세포주기의 G0/G1 어레스트(arrest)의 직접적인 원인이 됨이 밝혀졌다(Terade et al., Nature 376: 358-362, 1995). CDK의 천연 단백질 억제자(natural protein inhibitor)는 2가지 형태로 분류된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 즉, p16 타입과 p21 타입이다. p16타입에는 p15와 p18이 속하며 이들은 CDK 4에 직접 결합하여 CDK 4 활동도를 저해한다. 또한 이들은 모두 안킬린 반복 도메인(ankylin repeat domain)으로 구성되어 있으며 CDK 들 중 CDK 4만을 저해하는 것으로 현재 알려져 있다. p21 형태에는 p27, p57이 속하며 이들은 CDK 4외에도 CDK 2와 CDC 2도 저해하는데 CDK들이 사이클린과 복합체를 이룬 형태를 인지하여 이를 저해한다. p16 형태들 중 p16과 p15는 많은 암세포에서 유전자가 상실된 것이 관찰된다. 실제로 p16 녹아웃(knock-out) 변형동물에서는 많은 조직에서 암생성을 보여주어 p16 기능의 상실은 암의 직접적인 원인이 됨을 증명하였다. p16 발현의 조절에 대해서는 아직 정확한 설명을 하지 못하고 있다. 그러나 p21의 암세포들에서의 비이상성은 거의 발견되지 않고 있다. 그 이유는 아직 분명치 않다. 반면 p21은 환경변화에 민감하게 반응하여 그 발현이 조절됨을 보여주었다. 즉 p53에 의하여 p21이 유도되며 노화되는 세포에서 그 발현이 증가된다(Harper et al., Cell 75: 805-816, 1993). p27은 TGF-b나 세포-세포 접촉 신호에 의하여 발현이 유도된다(Polyak et al., Cell 78: 66-69, 1994). CDK 4 활성도의 비이상적 조절과 암발생과의 연관은 여러 암조직에서 잘 나타나고 있다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996). 여러 암에서 p16, p15의 유전자의 상실이 보고되었고 특히 사이클린 D1의 과량 발현은 여러 암에서 보여지는데 특히 유방암이 전이성질을 띠는 것과 잘 연관이 됨을 보여주고 있다(Pardee et al., Nature medicine 2: 254, 1996). 이는 비이상적 CDK 활성도가 암세포의 악성을 띠게 하는 요인이 될 가능성을 제시해 주고 있다. p16 녹아웃 쥐는 p53 녹아웃 쥐 만큼이나 암이 잘 발생한다고 보고 된 것은 p16의 CDK 4 기능조절의 상실이 암의 원인이 됨을 증명했다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996). ras나 src 등을 과량 발현시킨 NIH 3T3 세포에서 CYC D1 양이 높은 것은 CDK 4 활성도가 암유전자들의 미토제닉 신호(mitogenic signal)의 다운스트림(downstream)에서 그 역할을 수행함을 보여준다고 하겠다(Pardee et al., Nature 386: 177-181, 1997). 역으로 밖에서 공급된 p16이나 p21은 암세포를 보통의 표현형(normal phenotype)으로 바꾸는 것이 관찰되었다(Bonfanti et al., Cancer Research 57: 1442-1446, 1997). 위에 열거된 실험적 증거들은 CDK 4 활성도의 규제철폐(deregulation)가 암을 유도하는 원인이 된다는 것이 분명한 사실임을 증명한다. 따라서 CDK 4의 저해제는 항암효과를 보일 가능성이 높다고 여겨진다.

지금까지 여러가지의 CDK의 저해제로서의 적은 분자량을 가지는 화합물이 보고되었으며 이중 일부는 항암제로서 임상실험중이다(Bible et al., Cancer Research 56: 4856-4861, 1996). 그러나 CDK 4 특이적인 화합물은 아직 보고되지 않았다. 이를 위해서는 CDK 4의 단백질 분자 구조의 규명이 절실하며, CDK 4의 단백질 분자구조의 규명을 위해서는 고순도의 다량의 CDK 4 단백질이 필요하다. 또한 p16이 CDK 4 특이적인 저해제임이 알려져 있으므로 p16이 어떻게 CDK 4를 저해하는가를 CDK 4/p16 복합체의 분자구조 규명을 통해 단서를 얻을 수 있다. 그러나 CDK4 단백질은 박테리아나 배큘로바이랄 발현에서 대부분 불용성인 형태로 발현된다.

CDK4와 매우 유사한 세포주기 조절 키나제에 CDK6가 있다. 아미노산 서열에서 CDK4와 약 80% 가량 동일하며 따라서 그 성질이 CDK4와 매우 유사하다(Bates et al., Oncogene 1994 June). 즉, CDK6는 CDK4와 마찬가지로 D-형 사이클린과 복합체를 만들고 p16, p15 단백질에 의해 그 활성도가 저해된다. CDK4의 조직 발현 패턴은 편재적인(ubiquitous) 반면에 CDK6는 주로 면역세포들에서 그 발현이 크게 나타난다. CDK6도 CDK4와 마찬가지로 세포주기상에서 G0/G1에서 S 상으로의 전이에 관여하는 것으로 간주된다. 따라서 CDK6는 그 성질이나 단백질 구조 등이 CDK4와 매우 유사할 것으로 생각된다. CDK4는 곤충세포와 박테리아 세포에서 가용성인 형태로 얻기가 불가능하다.

한편, 배큘로바이러스(Baculovirus)는 곤충에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서 약 80-200Kbp 크기의 이중가닥 DNA 가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있다. 일찍부터 생물학적 살충제를 연구하기 위하여 많이 사용되어 왔으며, 최근들어 각종 유용한 단백질을 곤충세포에서 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터로 이용되어 더욱 크게 각광을 받고 있다.

배큘로바이러스 속은 바이러스의 형태에 따라 다시 세 개의 아그룹으로 분류될 수 있다. 구체적으로 아그룹 A 바이러스인 핵다각체형 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus, NPV)는 한 개의 뉴클레오캡시드가 외피에 포함되거나 (single nuclear polyhedrosis virus, SNPV) 여러 개의 뉴클레오캡시드가 하나의 외피에 둘러싸인 (multiple nuclear polyhedrosis virus, MNPV) 형태를 가지며, 이 바이러스들은 다시 폴리히드라라는 폴리히드린 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 B 바이러스는 그래눌로시스바이러스 (GV)인데 외피당 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 그래눌린(granulin) 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 C 바이러스은 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 단백질 봉입체에 둘러싸여 있지 않다 (NOBV, non occluded Baculoviruses).

이들 바이러스 중에 현재 알팔파 루퍼 (alfalfa looper)로 불리우는 나방모충인 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica)에서 분리한 핵다각체형 바이러스(NPV)인 AcMNPV 바이러스 또는 봄비스모리 (Bombix mori)에서 분리한 NPV 인 BmNPV 바이러스가 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 발현 벡터 또는 발현 시스템으로 많이 이용되어 왔다.

배큘로바이러스가 곤충세포에 감염되는 경우 폴리히드린이라는 단백질이 총단백질 양의 25% 이상에 달할 정도로 발현되므로, 배큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터를 이용하면 유용한 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다. 또한, 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키면 대장균의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고 대장균이나 효모와는 달리 당의 부가(glycosylation)와 같은 번역후수식 (post-translational modification)이 효과적으로 이루어질 수 있다. 따라서 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하면 생물학적으로 활성이 있는 천연형의 단백질과 유사한 단백질을 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

본 발명자들은 CDK6 단백질이 수용성 상태로 발현되도록 하기 위하여 노력한 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 방법 및 정제방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제공하는 것이다.

도 1은 인간 CDK6 유전자를 배큘로바이랄 발현 발현벡터에 크로닝한 것을 나타낸 것이다.

도 2는 CDK6를 Sf21 곤충세포에서 발현하였을 때 가용성 프랙션에서 CDK6 단백질이 상당량 발견된 것을 보여준 것이다.

제1열은 발현 벡터를 함유하지 않은 불용성 Sf21 세포 파쇄액이고,

제2열은 발현 벡터를 함유하지 않은 가용성 Sf21 세포 파쇄액이고,

제3열은 본 발명의 pBac His CDK6를 함유한 불용성 Sf21 세포 파쇄액이고,

제4열은 본 발명의 pBac His CDK6를 함유한 가용성 Sf21 세포 파쇄액이고,

제M열은 표준 분자량 표지 단백질이다.

도 3a은 헥사 히스티딘으로 표지된 CDK6 유전자의 발현 후 세포파쇄물 및 니켈 친화 크로마토그래피의 분획의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다.

제1열은 전체 세포 파쇄물을 나타내고,

제2열은 원심분리 세포 침전물을 나타내고,

제3열은 원심분리 세포 상등액을 나타내고,

제4열은 니켈 친화 크로마토그래피에서 흡착되지 않고 용출된 분획을 나타내고,

제5열 내지 제7열은 니켈 친화 크로마토그래피에서 흡착된 후 이미다졸을 포함하는 완충용액에 의하여 용출된 분획을 나타낸 것이다.

도3b는 ATP 친화 크로마토그래피한 분획의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다.

제1열은 ATP 친화 크로마토그래피에 대한 표준을 나타내고,

제2열 내지 제7열은 ATP 친화 크로마토그래피의 용출 분획을 나타낸다.

도3c는 겔 여과 크로마토그래피한 분획의 SDS-PAGE를 나타낸 것이다.

제1열은 걸 여과 크로마토그래피에 대한 표준을 나타내고,

제2열 내지 제5열은 겔 여과 크로마토그래피의 용출 분획을 나타낸다.

도 4는 CDK6의 염기서열 및 이로부터 유추된 아미노산 서열을 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 방법은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6를 발현시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

본 발명에서 "가용성 프랙션(fraction)"이라 함은 예를 들어 200㎕의 완충액(20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM PMSF)을 가한 후 초음파 분쇄하고 12,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리한 상층액을 말하며, "불용성 프랙션"이라 함은 그 침전물을 말한다.

CDK4를 박테리아나 배큘로바이러스에 의하여 발현시키면 대부분 불용성인 형태로 발현된다. 즉, CDK4 유전자를 박테리아나 곤충세포에서 단독으로 과량 발현시키면 CDK4 95% 이상이 불용성의 봉지체(inclusion body)에서 발견되며, 이를 변형된 조건에서 정제한 후 리폴딩(refolding)하는 것은 여러 문제점을 야기시킬 수 있다. 다시 말하면 CDK4를 단독으로 발현시켜 순수한 CDK4 단백질을 얻기는 어렵다.

그러나, 본 발명에서는 CDK6을 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 동시에 대량 발현시킴으로써 정상적인 수용성의 CDK6 단백질을 손쉽게 얻을 수 있다. 본 발명에서 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 21 (Spodoptera frugiperda 21, Sf21)을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 CDK6 단백질의 분리를 용이하게 하기 위하여 CDK6의 N-말단에 헥사 히스티딘 표지(hexa histidine tagging)를 사용할 수 있다.

본 발명의 가용성 CDK6 단백질의 대량 발현 과정은 다음과 같다.

CDK6 유전자를 먼저 인간 T-세포 전체 c-DNA 등에서 PCR을 통하여 얻는다. 즉, CDK6의 아미노 말단 및 카르복시 말단에 해당하는 염기서열과 제한효소 인지부위를 가지는 염기서열로 구성되는 프라이머를 합성하고, 이를 이용하여 상기 인간 T-세포 전체 c-DNA 등을 주형으로 하여 PCR을 수행하여 CDK6 유전자를 얻는다. 그리고 PCR 결과물을 제한효소로 처리하고 이를 제한효소로 처리된 배큘로바이러스 벡터와 연결하여 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터를 제조한다.

다음에, 상기에서 제조한 배큘로바이러스 발현 벡터들 각각을 천연형의 오토그라파 캘리포니카 바이러스(AcMNPV)의 DNA 등과 동형 재조합(homologous recombination)시켜 재조합 배큘로바이러스를 제조한다. 구체적으로 상기에서 제조한 배큘로바이러스 발현 벡터들 각각을 제한효소 Bsu36I로 삼중 절단하여 준비한 단일 DNA인 BacPAK6 바이러스 DNA(클론테크사)와 함께 곤충세포, 특히 Sf21 세포에 공형질감염시켜서 재조합 배큘로바이러스를 제조한다.

상기에서 제조한 CDK6의 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 감염시키고 곤충세포를 배양하여 발현시키면 본 발명의 가용성의 CDK6 단백질를 얻을 수 있다.

상기와 같이 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6을 발현시키면 가용성의 CDK6 단백질을 얻을 수 있다. 본 발명에서는 정제를 용이하게 하기 위하여 CDK6의 아미노 말단에 헥사 히스티딘 표지를 할 수 있다.

본 발명의 CDK6의 정제방법은 CDK6 단백질이 발현된 곤충세포를 파쇄하고, 원심분리하여 상등액을 취한 후, 니켈 친화 크로마토그래피 및/또는 ATP 친화 크로마토그래피 및/또는 젤 여과 크로마토그래피를 수행하여 고순도의 CDK6 단백질을 얻는 것이다.

본 발명에서 CDK6의 아미노 말단에 헥사 히스티딘 표지가 된 CDK6 단백질을 정제하는 경우에는 니켈 친화 크로마토그래피가 유용하게 사용될 수 있다.

즉, 예를 들어, 헥사 히스티딘 표지가 된 CDK6 단백질이 발현된 곤충세포에 완충용액, 예를 들어 20mM 트리스, pH 8.5, 10% 글리세롤, 0.1M NaCl, 1mM PMSF 완충용액을 첨가하여 초음파 분쇄기로 파쇄하여 세포 균질액을 얻은 후, 불용성 침전물을 제거하기 위하여 원심분리하여 상등액만을 취한다. 상기 원심분리 상등액을 완충용액, 예를 들어 20mM 트리스, pH 8.5, 10% 글리세롤, 0.1M NaCl 완충용액으로 미리 평형된 니켈 친화 칼럼에 흘러보내 흡착시킨 후 이미다졸이 첨가된 완충용액으로 용출한 후 각각 분획을 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인하여 CDK4/p16 부분만을 모은다. 상기에서 얻은 CDK6 부분을 완충용액으로 미리 평형된 ATP 친화 칼럼에 흘러보내 결합시킨 후 염화나트륨이 함유된 완충용액으로 용출하여 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 각 분획을 확인한 후 CDK6 부분만을 모은다. 이렇게 하여 얻은 CDK6 단백질을 한외여과 농축기를 이용하여 농축하고 완충용액, 예를 들어 20mM 트리스, pH 8.5, 10% 글리세롤, 0.5mM DTT, 1mM EDTA, 0.1M NaCl 완충용액으로 미리 평형된 겔 여과 칼럼에 주입시킨 후 동일 완충용액으로 용출하여 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 각 분획을 확인한 후 CDK6 부분만을 모은다. 이렇게 정제함으로써 고순도의 CDK6 단백질을 얻을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CDK6 유전자의 분리 및 곤충세포 발현벡터에의 클로닝

단계1) 저카트(Jurkat) 세포로부터 c-DNA 합성

저카트(Jurkat) 세포로부터 RNA 추출을 콜로진스키 등의 방법(Cholozynski, P., et al., Anal. Biochem. (1987) 162 : 156)에 따라 다음과 같이 수행하였다. 5x10⁶세포에 1 ml의 RNA 추출액(4M 구아니디늄 티오사이아네이트, 25mM 소디움 시트레이트, pH 7.0, 0.5% 사코실(Sarcosyl), 0.1M 2-머캅토에탄올)을 가하고 진탕시켜 세포막을 파괴시킨 다음 0.8ml의 2M 나트륨 아세테이트(pH 4.0), 0.8 ml의 페놀, 1.6 ml의 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v)을 가하여 잘 혼합한 후 12,000G, 15분간 4℃에서 원심분리한 후 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 있는 새용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 방치한 다음 12,000G, 4℃에서 20분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 세척한 후 진공 건조시키고 20㎕의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다. c-DNA 단선을 합성하기 위해 위에서 얻은 RNA 용액 10㎕을 취하여 2㎕의 0.1M 메틸머큐리(CH₃HgOH)를 가한 다음 상온에서 10분간 방치하여 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 2㎕의 1M 2-머캅토에탄올을 가하여 5분간 반응시켰다. 여기에 5㎕의 10배 농축 역전사 효소 반응 용액(500mM 트리스-HCl, pH 8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl₂, 10mM 디티오스레이톨(Dithiothreitol)), 2.5㎕의 10mM dNTP 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 10mM), 24㎕의 다이에틸피로카보네이트(DEPC, Diethylpyrocarbonate)가 처리된 증류수, 1.0㎕의 RNase 억제제(RNasin, 1U/㎕, Promega, U.S.A.), 1㎕의 올리고(dT)12-18 시발체(oligo(dT)12-18 primer, GibcoBRL, U.S.A.)를 가한 다음 상온에서 10분간 방치시켜 RNA 주형과 시발체가 잘 붙게 한 다음 2.5㎕의 역전사효소(18U/㎕, Superscript RNase H- Reverse transcriptase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 c-DNA 가닥을 합성하였다.

단계 2) 시발체의 합성

CDK6 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용해 단계 1)에서 얻은 c-DNA로부터 얻기 위하여 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 합성하였다.

CDK6의 염기서열 정보로부터 CDK6 유전자에 대응하는 PCR용 시발체(서열번호 1, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다. 구체적으로 서열번호 1의 시발체는 CDK6의 아미노 말단에 해당하는 염기서열과 제한효소 NdeI인지부위를 포함하고, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 시발체는 종결코돈, 제한효소 XhoI 인지부위 및 CDK6의 카복시 말단의 염기서열을 포함한다.

서열번호 1 : 5'-GAATTCATATGGAGAAGGACGGCCTGTG-3'

서열번호 2 : 5'-GTTCCCTCGAGTCAGGCTGTATTCAGCTCCGA-3'

단계 3) CDK6 유전자의 분리

CDK6 유전자를 증폭하기 위하여 서열번호 1과 서열번호 2를 갖는 시발체를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 2에서 얻은 시발체 2㎍을 넣은 다음 상기 단계 1)에서 얻은 저카트 세포 c-DNA 1 ng을 주형으로 넣고 10㎕의 10배 중합 완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1% 트리톤 X-100, 2.5mM MgCl₂) 2.5 단위체 Taq 중합효소와 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR을 40회 실시하였다. 그 결과, 도 4의 염기서열 및 이로부터 유추한 도 4의 아미노산 서열을 가지는 CDK6의 유전자를 얻었다(도 4 참조). 이하 이 단편을 '단편 CDK6'라 칭한다.

단계 4) CDK6 유전자 발현벡터 제조

대한민국 특허출원 제97-10499호의 곤충세포 발현벡터 pBAC His MEK-1 2㎍을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오스레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 1% 아가로스젤로 전기영동 분리하여 5.5 kb 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 '단편 pBac His -N/X'이라 칭한다.

한편 상기 단계 3)에서 얻은 '단편 CDK6' 2㎍을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오스레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 7% 아크릴아마이드 젤로 전기영동 분리하여 약 980 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 '단편 CDK6-N/X'라 칭한다. 접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng의 '단편 CDK6-N/X'과 '단편 pBac His -N/X'을 넣은 다음, 2㎕의 10배 접합 반응용액(50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl₂, 10mM 디티오스레이톨, 1mM ATP, 25㎍/ml 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)), 10단위체의 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 CDK6 유전자를 포함한 곤충세포 발현벡터 pBac His CDK6를 얻었다(도 1 참조).

상기에서 얻은 재조합 플라스미드 pBac His CDK6에 클로닝된 CDK6 유전자의 염기서열 확인은 생거 등(Sanger, F., et al., (1977). PNAS U.S.A 74, 5463)의 방법에 따라 다이 사이클 시퀀싱 시스템(Dye Cycle Sequencing System)(Applied Biosystems, U.S.A)을 이용하여 수행하였고 동일한 회사의 ABI 377 DNA 염기서열기에 의하여 분석되었다.

<실시예 2> CDK6 유전자의 Sf21 세포에서의 발현

단계 1) 재조합 바이러스의 생성

대한민국 특허출원 제97-10499호의 방법에 따라 헥사 히스티딘으로 표지(tagging)된 CDK6을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 만들었다. 이를 1.0 x 10⁸pfu/ml 이상의 역가로 증식하여 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 4월 22일자로 기탁하였다. (수탁번호: KCTC 0465BP)

단계 2) 가용성/불용성 세포 추출물의 제조 및 SDS-PAGE 분석

상기에서 얻은 바이러스로 감염된 Sf21 세포에서의 CDK6의 발현은 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 15% SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 2 참조)

단계 3) 헥사 히스티딘으로 표지된 CDK6의 대량 발현

대한민국 특허출원 제97-10499호의 방법에 따라 헥사 히스티딘으로 표지(tagging)된 CDK6을 대량 발현하여 단백질 정제에 사용하였다.

<실시예 3> CDK6 단백질의 분리정제

단계 1) 세포파쇄

CDK6 단백질이 발현된 곤충세포(Sf21)에 20mM 트리스, pH 7.5, 10% 글리세롤, 1mM PMSF 완충용액을 첨가하여 초음파분쇄기(HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC., W225, 미국)로 1분씩 3회 파쇄하여 세포 균질액을 얻은 후 불용성 침전물을 제거하기 위하여 원심분리기(Bechman J2-21, Rotor JA20, 미국)로 16000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액만을 취하여 다음 과정에 사용하였다.

단계 2) Ni-NTA 친화 크로마토그래피

상기 과정에서 얻은 상등액을 20mM 트리스, 10% 글리세롤 완충용액으로 미리 평형된 니켈친화 칼럼(Qiagen, Ni-NTA superflow, 미국)에 흘러보내 흡착시킨 후 동일 완충용액으로 세척하고 이미다졸이 첨가된 완충용액으로 용출한 후 각각 분획을 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인하여 CDK6 부분만을 모았다(도 3a 참조).

단계 3) ATP 친화 크로마토그래피

상기 과정에서 얻어진 CDK6 부분을 10mM HEPES, pH 7.4, 10% 글리세롤, 0.5mM DTT, 1mM EDTA 완충용액으로 투석한 후 상기 완충용액으로 미리 평형된 ATP 칼럼(Sigma, 미국)에 흘러보내 결합시킨 후 결합하지 않은 부분은 동일 완충용액으로 충분히 세척하였다. ATP 칼럼에 결합된 CDK6 단백질은 염화나트륨이 함유된 완충용액으로 용출하여 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 각 분획을 확인한 후 CDK6 부분만을 모았다(도 3b 참조).

단계 4) S-200 겔 크로마토그래피

상기 과정에서 얻은 CDK6 단백질을 한외여과농축기(Amicon, YM10, 미국)를 이용하여 농축하고 20mM HEPES, pH 7.5, 10% 글리세롤, 1mM EDTA, 0.5mM DTT 완충용액으로 미리 평형된 S-200 겔 여과 칼럼에 주입시킨 후 동일 완충용액으로 용출하여 소디움 도데실셀페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동으로 각 분획을 확인한 후 CDK6 부분만을 모음으로써 고순도의 CDK6 단백질을 얻을 수 있었다(도 3c 참조).

이상에서 본 바와 같이, 본 발명은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6을 발현시키는 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 방법 및 정제방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 가용성의 CDK6 단백질을 용이하게 대량 발현시킬 수 있고, 또한 순수한 CDK6 단백질을 얻을 수 있다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 28

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

Claims (7)

1. CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, CDK6 유전자와 배큘로바이러스 벡터인 pBac His 가 결합되어 형성되는, CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 pBac His CDK6.
3. 곤충세포에서 CDK6 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스.
4. 제3항에 있어서, 곤충세포에 제2항의 배큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 MNPV 바이러스와 공형질 감염시켜 얻은 재조합 배큘로바이러스 (수탁번호: KCTC 0465BP).
5. 곤충세포에서 CDK6을 발현시킴을 특징으로 하는 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 방법.
6. 제5항에 있어서, 제3항 또는 제4항의 CDK6 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에서 발현시킴을 특징으로 하는 가용성의 CDK6 단백질의 대량 발현 방법.
7. CDK6 단백질이 발현된 곤충세포를 파쇄하고, 원심분리하여 상등액을 취한 후, 니켈 친화 크로마토그래피 및/또는 ATP 친화 크로마토그래피 및/또는 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 고순도의 CDK6 단백질의 정제방법.