KR19990086091A

KR19990086091A - 곤충세포를 이용한 가용성 cdk４／p１６ 복합체의 대량발현 방법

Info

Publication number: KR19990086091A
Application number: KR1019980018880A
Authority: KR
Inventors: 양범석; 김동명; 손호선; 윤혜성
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1998-05-25
Publication date: 1999-12-15

Abstract

본 발명은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK4를 p16과 동시에 발현시킴으로써 CDK4와 p16이 복합체를 형성하여 세포파쇄후 원심분리 결과물의 상층액에 용해되는 즉, 가용성의 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법에 관한 것으로서, CDK4 만을 단독으로 발현시키는 경우에는 불용성의 CDK4가 대부분 발현되어 순수한 CDK4를 얻기 어려운 반면에 본 발명의 발현방법에 의하면 CDK4와 p16이 복합체를 형성하여 가용성을 나타내므로 순수한 CDK4 또는 CDK4/p16 복합체를 대량으로 얻을 수 있다.

Description

곤충세포를 이용한 가용성 ＣＤＫ４／ｐ１６ 복합체의 대량 발현 방법

본 발명은 곤충세포를 이용한 가용성 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK4를 p16과 동시에 발현시킴으로써 CDK4와 p16이 복합체를 형성하여 세포파쇄후 원심분리 결과물의 상층액에 용해되는 즉, 가용성의 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법에 관한 것이다.

세포주기 변화의 분자수준에서의 연구는 90년대에 들어 더욱 활발하게 진행되어 세포주기 변화가 더욱 상세하게 밝혀지기 시작하였다. 세포주기 조절 기작에서 세포주기 조절인자는 세포주기의 조절기능을 통하여 세포의 성장, 분화, 발생, 노화, 아폽토시스(apoptosis) 등을 중심적으로 조절한다는 것이 밝혀졌다(Elledge et al., Science 274: 1664-1671). 이러한 연구의 결과들은 여러 병리 현상들을 정확하게 이해하는 데 큰 도움을 주고 있다. 그 대표적인 예가 암이다(Pardee, Science 246: 603-608, 1989). 정상세포가 암세포로 변형되는 과정에서 세포주기 조절 기능이 상실될 때가 많이 발견되었다. 암세포들의 분석은 세포주기 조절인자의 활동이 정상과 다른 경우의 예를 많이 보여주었고 특히 이 중에는 암병리에서 가장 문제시되는 전이와 깊은 상관관계도 있음을 보여 주었다(Steeg et al. Nature medicine 3: 152-154, 1997). 변형동물기술을 이용하여 세포주기 조절인자의 과량 발현 혹은 녹아웃(knock-out)을 유도하면 실험동물에 암이 생성되는 것은 직접적으로 비이상적 세포주기 조절이 암을 유발하는 요인이 된다는 것을 증명하고 있다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996).

세포주기 변화는 여타 모든 생물현상의 조절과 마찬가지로 양성 조절(positive regulation)과 음성 조절(negative regulation)을 받고 있다. 현재까지 알려진 세포주기 조절의 주 골격은 특정한 프로테인 키나제 패밀리 활성도(protein family kinase activity)에 의하여 그 진행이 결정되며 이 키나제 활성도는 세포가 처한 환경에 따라 양성 또는 음성 조절을 받게 된다(Morgan, Nature 374 9:131-134, 1995). 많은 암세포나 발암 기전의 연구 결과 상기 양성 또는 음성 조절에 문제가 발생되는 경우가 많이 발견되었다. 즉 필요 이상의 지나친 양성 효과(positive effect) 또는 음성 조절(negative regulation)의 상실 그리고 세포주기 조절에서 중요한 면인 시기 적절한 조절(timely regulation)의 어긋남이 암세포에서 문제점으로 지적되었다.

포유동물에서 세포주기를 조절하는 대표적인 키나제로는 3가지를 들 수 있다. 첫째는 세포주기의 G1 상 중간에서 활동적인 CDK4(Cell cycle dependent kinase 4)이고, 둘째는 G1 중간과 S 상에서 활동적인 CDK2, 그리고 G2-M 상 키나제인 CDC2이다. 이중 CDK4와 CDK2는 G1-S 세포주기 체크 사항(check point)에 의하여 그 활성도가 조절되며, CDC2는 G2-M 체크 사항(check point)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 여러 암세포들에서 CDK4와 CDK2의 조절기작이 비이상성을 나타내고, 실제로 변형동물에서 인위적으로 유도한 이들의 비이상성이 암을 유발하였다(Wang et al., Nature 369: 669-671, 1994).

CDK2는 분자량이 약 34 kd이며 CDK4와 약 47%의 유사성을 가진다. 알려진 세포주기 조절 키나제는 공통적인 방법에 의해 활성화된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). CDK가 활성화된 형태로 되려면 특정 세포주기에서만 존재하는 특정형태의 사이클린(cyclin)과 복합체를 이루어야 하고 특정 아미노산이 CAK(CDK activating kinase)에 의하여 인산화되어야 하며 N-말단 근처가 포스파타제(phosphatase)에 의하여 탈인산화(dephosphorylation)되어야 한다. CDK 2는 세포주기 변화 동안 번갈아 가며 여러 사이클린과 교대로 결합하면서 활성화된다. G1-S 전이 중에는 사이클린 E와 결합하고, S 상 중에는 사이클린 A와 결합하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 CDK 2가 사이클린 파트너(partner)를 세포주기 동안 바꾸는 것의 의미는 아직 잘 알려져 있지 않다. CDK 2 활성도는 세포가 G1 상에서 S 상으로 가는데 그리고 S 상을 완성하는데 꼭 필요하다는 데는 이의가 없다. 그러나 그에 대한 자세한 설명을 위해서는 진전된 연구가 필요하다. CDK 2는 CDK 4와 마찬가지로 RB 단백질을 시험관 내(in vitro)에서 인산화한다. 그리고 CDK 4와 다르게 히스톤 H1도 인산화한다. 이것의 생체 내(in vivo) 중요도는 현재 잘 모르고 있다. CDK 2는 위에서 기술한 여러 사이클린에 의하여 시기 적절하게 활성화(timely activation)된다. 또한 CDK 2는 CDK 4와 마찬가지로 p21 형태의 CDK 저해제에 의하여 그 활성도가 저해된다. 그러나 p16 형태는 전혀 저해제로서 작용하지 못한다. 세포분화중 CDK 2 활성도는 CDK 4와는 다르게 아직 줄어든다는 보고는 없다. CDK 2의 X-선 구조분석연구 결과는 CDK 효소의 활성화과정을 이해하고 그 효소작용 기작을 설명하는데 큰 도움을 주었다(Jefferey et al. Nature 376: 313-320, 1995). CDK 2-ATP 복합체와 CDK 2-사이클린 A-ATP 복합체의 구조분석 결과는 165번 아미노산의 인산화가 소위 T 루프(loop)의 이동을 유발하여 활성 자리 주머니(active site pocket)을 열린 상태로 만들어 단백질 기질(protein substrate)이 부착하는 환경을 조성한다는 것을 보여주며, 이 과정 중에 관계된 아미노산들을 보여주고 있다. 사이클린 A는 CDK 2에 부착하여 역시 기질이 부착될 수 있는 열린 형태를 유도하며 부착된 ATP가 반응에 적절한 방향성(orientation)을 가지도록 해주는 것으로 밝혀졌다. 그러나 아직 기질 펩티드가 CDK 2와 복합체를 만드는 경우에 대한 데이타는 다음 연구 과제로 남겨진 상태이며 기질의 결합에 대해서는 아직 구조적인 설명을 못하고 있다. 일부 유방암에서 사이클린 E의 과량 발현이 관찰되었고 이는 유방암의 전이와 깊은 연관이 있음이 알려져 있다(Pardee, et al., Nature medicine 2: 254, 1997). 사이클린 E의 과량 발현이 저 혈청 조건에서 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 저해하며, 앵커리지 독립 성장(anchorage independent growth)을 유도한다고 제안되었다. MMTV 프로모터를 이용한 CDK 2 과량 발현 변형 동물에서 가슴 상피 세포(breast epithelial cell)의 과증식(hyperproliferation), 네오플라지아(neoplasia)가 관찰되었다. 이러한 사실은 CDK 2 활성도가 세포 변화 과정 혹은 그것의 유지에 관여될 가능성을 보여주는 것이라 하겠다.

CDK 4는 분자량이 약 34 kd으로서 그 자체로는 키나제 활성을 가지지 않는다. CDK 4는 G1 중간 상에서 나타나는 D 타입 사이클린과 복합체를 만들고 아미노산 172 위치가 인산화될 때 활성화된 형태로 된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 이 키나제의 알려진 생체 내(in vivo) 기질은 종양 억제자(tumor suppressor) Rb로서 S(T)-P-X-K(R) 교감 펩타이드(consensus peptide)의 S(T)를 인식, 인산화한다. Rb는 모두 10개의 인산화 가능 자리를 가지고 있는데 이중 780번의 아미노산이 CDK 4만의 선호 시퀀스(preferable sequence)로 알려져 있으며 그외 부위는 CDK 4 등의 여러 CDK가 인산화할 수 있다. 효소활성을 가진 CDK 4는 CDK 4와 CYC D1을 배큘로바이러스(baculovirus)에서 동시 발현함으로써 얻을 수 있다(Yoichi, TIBS 22: 14-17, 1997). CDK 4는 Rb를 인산화함으로써 Rb의 G1-S 세포주기 진행의 억제작용을 저해하여 G1-S 세포주기 진행을 촉진한다고 알려져 있다(Sherr, Cell 73: 1059-1065, 1993). 실제로 Rb 단백질이 없는 세포는 CDK 4의 활성을 저해해도 G1-S 세포주기 진행을 막지 못하는 것으로 알려져 있다(Lucas et al., Nature 375: 503-506, 1995). 이는 Rb가 최소한 CDK 4의 세포내의 세포성장을 조절하는 일에 중심적인 다운 스트림 표적 기질(down stream target substrate)임을 나타낸다고 하겠다. CDK 4의 활동도가 여러 세포의 분화시 줄어드는 것으로 보아 CDK 4는 세포분화를 저해하는 것으로 추정되고 있다. 이 경우 다른 CDK 활동도는 변하지 않는 것으로 보아 이것은 CDK 4의 중요한 세포내 기능임을 암시하고 있다(Kranenburg et al., Journal of Cell Biology 131: 227-234, 1995). CDK 4 단백질은 일반적으로 세포내에서 세포주기 변화 동안 그 양이 변하지 않는 것으로 알려져 있다. 간혹 몇몇 암세포에서 그 단백질 양이 증가되는 것이 보고되었고 그 유전자가 증폭되는 경우도 알려져 있다. 그러나 현재 CDK 4 활성도의 조절로는 사이클린 D 양의 변화에 의한 양성 조절(positive regulation)과 그것의 천연 억제자(natural ingibitor) 단백질인 p16, p21, p27, p57 등에 의한 음성 조절(negative regulation)이 중요하다고 알려져 있다(Sherr, Cell 73: 1059-1065, 1993). D 타입 사이클린은 현재 D1, D2, D3 등 3가지가 알려져 있는데 이중에 D1 타입이 가장 연구가 많이 되었고 또한 중심적인 역할을 하는 사이클린이다. 사이클린 D는 G1 상에서 나타나서 CDK 4를 활동하게 만드는 역할을 하게 된다. 사이클린 D의 전사 조절에 있어서는 ras나 src의 활성화에 의한 세포내에서 사이클린 D1 m-RNA의 상향 조절(up regulation)이 보고되었다. 이 사이클린 D1 양의 증가는 곧 세포내에서의 CDK 4 활동도의 증가를 가져다 주는 것으로 알려져 있고 이러한 현상은 ras나 src가 암유전자 활동도(oncogenic activity)를 나타내는 중요한 이유가 된다(Peeper et al., Nature 386: 177-181, 1997).

CDK 4는 음성 조절도 받게 된다. 먼저 아직 알려지지 않은 키나제에 의한 17번 티로신의 인산화는 CDK 4 활성을 저해하는데 이는 곧 세포주기의 G0/G1 어레스트(arrest)의 직접적인 원인이 됨이 밝혀졌다(Terade et al., Nature 376: 358-362, 1995). CDK의 천연 단백질 억제자(natural protein inhibitor)는 2가지 형태로 분류된다(Morgan, Nature 374: 131-134, 1995). 즉, p16 타입과 p21 타입이다. p16타입에는 p15와 p18이 속하며 이들은 CDK 4에 직접 결합하여 CDK 4 활동도를 저해한다. 또한 이들은 모두 안킬린 반복 도메인(ankylin repeat domain)으로 구성되어 있으며 CDK 들 중 CDK 4만을 저해하는 것으로 현재 알려져 있다. p21 형태에는 p27, p57이 속하며 이들은 CDK 4외에도 CDK 2와 CDC 2도 저해하는데 CDK들이 사이클린과 복합체를 이룬 형태를 인지하여 이를 저해한다. p16 형태들 중 p16과 p15는 많은 암세포에서 유전자가 상실된 것이 관찰된다. 실제로 p16 녹아웃(knock-out) 변형동물에서는 많은 조직에서 암생성을 보여주어 p16 기능의 상실은 암의 직접적인 원인이 됨을 증명하였다. p16 발현의 조절에 대해서는 아직 정확한 설명을 하지 못하고 있다. 그러나 p21의 암세포들에서의 비이상성은 거의 발견되지 않고 있다. 그 이유는 아직 분명치 않다. 반면 p21은 환경변화에 민감하게 반응하여 그 발현이 조절됨을 보여주었다. 즉 p53에 의하여 p21이 유도되며 노화되는 세포에서 그 발현이 증가된다(Harper et al., Cell 75: 805-816, 1993). p27은 TGF-b나 세포-세포 접촉 신호에 의하여 발현이 유도된다(Polyak et al., Cell 78: 66-69, 1994). CDK 4 활성도의 비이상적 조절과 암발생과의 연관은 여러 암조직에서 잘 나타나고 있다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996). 여러 암에서 p16, p15의 유전자의 상실이 보고되었고 특히 사이클린 D1의 과량 발현은 여러 암에서 보여지는데 특히 유방암이 전이성질을 띠는 것과 잘 연관이 됨을 보여주고 있다(Pardee et al., Nature medicine 2: 254, 1996). 이는 비이상적 CDK 활성도가 암세포의 악성을 띠게 하는 요인이 될 가능성을 제시해 주고 있다. p16 녹아웃 쥐는 p53 녹아웃 쥐 만큼이나 암이 잘 발생한다고 보고 된 것은 p16의 CDK 4 기능조절의 상실이 암의 원인이 됨을 증명했다(Serrano et al., Cell 85: 27-37, 1996). ras나 src 등을 과량 발현시킨 NIH 3T3 세포에서 CYC D1 양이 높은 것은 CDK 4 활성도가 암유전자들의 미토제닉 신호(mitogenic signal)의 다운스트림(downstream)에서 그 역할을 수행함을 보여준다고 하겠다(Pardee et al., Nature 386: 177-181, 1997). 역으로 밖에서 공급된 p16이나 p21은 암세포를 보통의 표현형(normal phenotype)으로 바꾸는 것이 관찰되었다(Bonfanti et al., Cancer Research 57: 1442-1446, 1997). 위에 열거된 실험적 증거들은 CDK 4 활성도의 규제철폐(deregulation)가 암을 유도하는 원인이 된다는 것이 분명한 사실임을 증명한다. 따라서 CDK 4의 저해제는 항암효과를 보일 가능성이 높다고 여겨진다.

지금까지 여러가지의 CDK의 저해제로서의 적은 분자량을 가지는 화합물이 보고되었으며 이중 일부는 항암제로서 임상실험중이다(Bible et al., Cancer Research 56: 4856-4861, 1996). 그러나 CDK 4 특이적인 화합물은 아직 보고되지 않았다. 이를 위해서는 CDK 4의 단백질 분자 구조의 규명이 절실하며, CDK 4의 단백질 분자구조의 규명을 위해서는 고순도의 다량의 CDK 4 단백질이 필요하다. 또한 p16이 CDK 4 특이적인 저해제임이 알려져 있으므로 p16이 어떻게 CDK 4를 저해하는가를 CDK 4/p16 복합체의 분자구조 규명을 통해 단서를 얻을 수 있다.

한편, 배큘로바이러스(Baculovirus)는 곤충에만 한정적으로 감염을 일으키는 바이러스로서 약 80-200Kbp 크기의 이중가닥 DNA 가 막대형의 뉴클레오캡시드 외피에 둘러싸여 있다. 일찍부터 생물학적 살충제를 연구하기 위하여 많이 사용되어 왔으며, 최근들어 각종 유용한 단백질을 곤충세포에서 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터로 이용되어 더욱 크게 각광을 받고 있다.

배큘로바이러스 속은 바이러스의 형태에 따라 다시 세 개의 아그룹으로 분류될 수 있다. 구체적으로 아그룹 A 바이러스인 핵다각체형 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus, NPV)는 한 개의 뉴클레오캡시드가 외피에 포함되거나 (single nuclear polyhedrosis virus, SNPV) 여러 개의 뉴클레오캡시드가 하나의 외피에 둘러싸인 (multiple nuclear polyhedrosis virus, MNPV) 형태를 가지며, 이 바이러스들은 다시 폴리히드라라는 폴리히드린 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 B 바이러스는 그래눌로시스바이러스 (GV)인데 외피당 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 그래눌린(granulin) 단백질의 복합체에 봉입되어 있다. 아그룹 C 바이러스은 단 하나의 뉴클레오캡시드로 구성되고 단백질 봉입체에 둘러싸여 있지 않다 (NOBV, non occluded Baculoviruses).

이들 바이러스 중에 현재 알팔파 루퍼 (alfalfa looper)로 불리우는 나방모충인 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica)에서 분리한 핵다각체형 바이러스(NPV)인 AcMNPV 바이러스 또는 봄비스모리 (Bombix mori)에서 분리한 NPV 인 BmNPV 바이러스가 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 발현 벡터 또는 발현 시스템으로 많이 이용되어 왔다.

배큘로바이러스가 곤충세포에 감염되는 경우 폴리히드린이라는 단백질이 총단백질 양의 25% 이상에 달할 정도로 발현되므로, 배큘로바이러스의 폴리히드린 프로모터를 이용하면 유용한 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다. 또한, 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키면 대장균의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고 대장균이나 효모와는 달리 당의 부가(glycosylation)와 같은 번역후수식 (post-translational modification)이 효과적으로 이루어질 수 있다. 따라서 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하면 생물학적으로 활성이 있는 천연형의 단백질과 유사한 단백질을 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

그러나 CDK 4 단백질은 박테리아나 배큘로바이러스(baculovirus)에 의한 발현에서 대부분 불용성인 형태로 발현된다. 즉, 95% 이상이 불용성의 봉지체(inclusion body)에서 발견되며, 이를 변형조건에서 정제한 후 리폴딩(refolding)은 여러가지 문제점을 야기시킬 수 있다. 다시 말해, 불용성의 단백질 (inclusion body)이 형성되므로 이를 녹여서 활성형 단백질의 형태로 전환시키는 공정에 많은 노력과 시간이 필요하다는 문제점을 야기시킨다. 그러므로 순수한 CDK4 단백질을 얻는 데 많은 노력, 시간 및 경비가 소요되는 반면에 대량으로 얻기는 힘들다.

이에 본 발명자들은 CDK 4 단백질이 수용성 상태로 발현되도록 하기 위하여 노력한 결과, 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK 4를 p16과 함께 발현시키면 CDK 4/p16의 가용성 복합체가 다량 발현됨을 알고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 가용성의 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 CDK4 유전자 또는 p16 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제공하는 것이다.

도 1은 CDK4와 p16 유전자를 가진 pBAC 배큘로바이랄 발현벡터의 크로닝 과정을 나타낸 것이다.

도 2a는 CDK4 유전자의 단백질 산물이 배큘로바이랄 공발현을 통하여 사이클린(Cyclin) D1과 복합체를 만들었을 때 효소활성을 보임을 나타내는 것이고,

도 2b는 p16 유전자의 단백질 산물이 배큘로바이랄 공발현을 통하여 정상적인 CDK 4 효소 저해능을 보임을 나타낸 것이다.

도 3은 CDK4 단독으로 곤충세포에서 발현시 CDK4 단백질은 세포 파쇄물중 가용성 분획(fraction)에서는 SDS-PAGE 후 쿠마지 염색상에서 거의 관찰되지 않음을 보인 것이다.

레인 1 : 표준 전체 세포 파쇄물

레인 2 : CDK4 감염된 것 중 가용성 분획

레인 3 : CDK4 감염된 것 중 불용성 분획

레인 4 : CDK4 감염된 것의 전체 세포 파쇄물

도 4는 CDK4를 p16과 곤충세포에서 동시 발현시킬 때 상당량의 CDK4가 가용성 분획에서 CDK4와의 복합체 형태로 발견됨을 보인 것이다.

레인 1 : CDK4 단독 발현시 가용성 분획의 SDS-PAGE 전개

레인 2 : CDK4와 p16 동시 발현시 가용성 분획의 SDS-PAGE 전개

레인 3 : 가용성 분획의 표준 SDS-PAGE 전개

도 5는 PCR을 통하여 얻은 CDK4 유전자 단편의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 6은 p16 유전자 단편의 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 가용성의 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK4를 p16과 동시에 발현시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 CDK4 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 p16 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

본 발명에서 "가용성 분획(fraction)"이라 함은 예를 들어 200㎕의 완충액(20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM PMSF)을 가한 후 초음파 분쇄하고 12,000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리한 상층액을 말하며, "불용성 분획"이라 함은 그 침전물을 말한다.

본 발명은 CDK4와 p16을 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 동시에 발현시킴으로써 가용성 CDK4/p16 복합체를 얻는 것이다.

CDK4를 박테리아나 배큘로바이러스에 의하여 발현시키면 대부분 불용성인 형태로 발현된다. 즉, CDK4 유전자를 박테리아나 곤충세포에서 단독으로 과량 발현시키면 CDK4 95% 이상이 불용성의 봉지체(inclusion body)에서 발견되며, 이를 변형된 조건에서 정제한 후 리폴딩(refolding)하는 것은 여러 문제점을 야기시킬 수 있다. 다시 말하면 CDK4를 단독으로 발현시켜 순수한 CDK4 단백질을 얻기는 어렵다.

그러나, 본 발명은 CDK4와 p16을 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 동시에 대량 발현시킴으로써 정상적인 수용성의 CDK4 단백질을 손쉽게 얻을 수 있도록 한다. 상기 발현된 CDK4는 p16과 복합체를 형성하여 수용성을 띠게 된다. 즉, 단독 발현시 CDK4는 불용성을 띠는 데 반하여 CDK4를 p16과 동시에 발현시키면 발현된 CDK4는 p16과 복합체를 형성하여 가용성을 띠게 된다. 본 발명에서 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 21 (Spodoptera frugiperda 21, Sf21)을 사용하는 것이 바람직하다.

이렇게 대량 발현된 CDK4/p16 복합체는 정제후 복합체의 형태로 또는 두 요소를 분리한 후 각각을 사용할 수 있다. 상기 복합체의 분리를 용이하게 하기 위하여 CDK4나 p16의 N-말단이나 C-말단에 여러가지 표지(tagging), 예를 들면 GST 또는 헥사 히스티딘 표지(hexa histidine tagging)를 사용할 수 있다.

본 발명의 수용성 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 과정은 다음과 같다.

CDK4 유전자를 먼저 인간 간 c-DNA 라이브러리 등에서 PCR을 통하여 얻는다. 즉, CDK4의 아미노 말단 및 카르복시 말단에 해당하는 염기 서열과 제한효소 인지부위를 가지는 염기 서열로 구성되는 프라이머를 합성하고, 이를 이용하여 상기 인간 간 c-DNA 라이브러리 등을 주형으로 하여 PCR을 수행하여 CDK4 유전자를 얻는다. 그리고 PCR 결과물을 제한효소로 처리하고 이를 제한효소로 처리된 배큘로바이러스 벡터와 연결하여 CDK4 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터를 제조한다.

마찬가지로 p16 유전자를 헬라 세포 c-DNA 등으로부터 PCR을 통하여 얻고, 그 PCR 결과물을 제한효소로 처리하고 이를 제한효소로 처리된 배큘로바이러스 벡터와 연결하여 p16 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터를 제조한다. 도 1은 상기 CDK4 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 p16 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터의 제조과정을 나타내었다.

다음에, 상기에서 제조한 배큘로바이러스 발현 벡터들 각각을 천연형의 오토그라파 캘리포니카 바이러스(AcMNPV)의 DNA와 동형 재조합(homologous recombination)시켜 재조합 배큘로바이러스를 제조한다. 구체적으로 상기에서 제조한 배큘로바이러스 발현 벡터들 각각을 제한효소 Bsu36I로 삼중 절단하여 준비한 단일 DNA인 BacPAK6 바이러스 DNA(클론테크사)와 함께 곤충세포, 특히 Sf21 세포에 공형질감염시켜서 재조합 배큘로바이러스를 제조한다.

상기에서 제조한 CDK4 및 p16의 재조합 배큘로바이러스를 함께 곤충세포에 감염시키고 곤충세포를 배양하여 발현시키면 본 발명의 가용성의 CDK4/p16 복합체를 얻을 수 있다.

PCR을 통하여 얻은 상기 두 유전자의 염기 서열을 확인한 결과를 도 5 및 도 6 에서 볼 수 있다. 이렇게 클로닝한 CDK4 유전자의 단백질 산물은 배큘로바이랄 공 발현을 통하여 얻을 수 있는 사이클린 D1과 복합체를 형성할 때 효소활성을 보인다(도 2a). 또한 상기한 p16 유전자를 곤충세포에서 발현한 후 그 단백질을 얻었을 때 정상적인 CDK4 효소 저해능을 보인다(도 2b). 한편, 상기 CDK4 발현 벡터를 곤충세포에서 단독으로 발현하였을 때 발현된 CDK4 단백질은 세포 파쇄물 중 가용성 분획에서는 SDS-PAGE후 쿠마지 염색상에서 관찰하면 거의 발견되지 않는다. 도 3에서 보면, 제2열의 가용성 분획에서는 CDK4가 거의 보이지 않는다. 이것은 CDK4를 단독으로 발현시키면 CDK4 단백질이 거의 모두 불용성 분획의 봉지체(inclusion body)에 존재하기 때문이다.

그러나 CDK4와 p16을 곤충세포에서 동시에 발현시키면 상당량의 CDK4가 가용성 분획에서 CDK4/p16 복합체 형태로 존재하게 된다(도 4). 이 가용성 분획을 간단한 크로마토그래피를 사용하여 분리하면 CDK4와 p16 단백질이 같이 행동한다. 이것은 가용성 분획에서 CDK4와 p16 단백질이 복합체를 이루고 있음을 의미하는 것이다.

한편, 본 발명은 p16대신에 p16 유사체 즉, CDK4와 복합체를 형성할 수 있는 단백질을 사용할 수도 있다. 즉, CDK4와 복합체를 형성할 수 있는 사이클린 D1과 같은 단백질을 사용할 수도 있다. 그러나, 단독 발현시 불용성인 CDK4를 상기와 같이 동시 발현시킬 때 CDK4를 가용성으로 만드는 능력은 p16이 사이클린 D1에 비해 월등하다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CDK 4, p16 유전자의 배큘로바이랄 발현 벡터에의 클로닝

CDK 4 유전자는 서열 1의 BNCDK4 프라이머(36염기; 5'-AAG,CTT,GGA,TCC,CAT, ATG,GCT,ACC,TCT,CGA,TAT,GAG-3')와 서열 2의 XbaICDK4 프라이머(33염기; 5'-CCG, TCT,AGA,CCA,TGG,CAG,CCA,CTC,CAT,TGC,TCA-3')를 합성하여 클론테크(Clontech)에서 구입한 인간 태아 간의 cDNA 라이브러리를 주형(template)로 PCR하여 얻었다. PCR 결과물을 BamHI과 XbaI으로 처리하여 0.9 kbp DNA 조각을 아가로즈 젤에서 분리하여 벡터인 pVL1393(Pharmingen #21201P)의 BamHI과 XbaI절단 부위에 T4 리가제로 접합한 후, 대장균에 형질전환하고 선별하여 pVL1393 CDK4를 만들고 시퀀스가 이미 알려진 바(GenBank: M14505)와 같았다. 다시 pVL1393 CDK4를 BamHI과 EcoRI으로 처리한 후 약 0.9 kbp 조각을 아가로즈 젤에서 분리하여 벡터인 pBacPAK8의 BamHI과 EcoRI 절단부위에 접합하여 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacPAK8 CDK4 플라스미드를 만들었다.

P16 유전자를 얻기 위해 서열 3의 p16Nco 프라이머(28염기; 5'-GGC,CAT,GGA, GCC,TTC,GGC,TGA,CTG,GCT,G-3')와 서열 4의 p16Bam 프라이머(32염기; 5'-GGG, GAT, CCT,CAA,TCG,GGG,ATG,TCT,GAG,GGA,CC-3')를 합성하여 헬라 cDNA 라이브러리를 주형으로 PCR하여 약 0.5 kbp 조각을 얻었다. 이것을 NcoI과 BamHI으로 처리하여 벡터인 pACT2(GenBank: U29899)의 NcoI과 BanHI 절단부위에 접합하여 pACT2 p16 플라스미드를 만들었다. 이 유전자의 시퀀스를 결정한 결과 시라노(Serrano, M., Nature, 366, 704-707)의 것과 같았다. pACT2 p16을 NdeI과 BamHI으로 처리하여 p16 단편을 아가로즈 젤에서 정제하고 다시 배큘로바이러스 벡터인 pBacPAK8 His- 벡터의 NdeI과 BglII절단 부위에 접합하여 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacPAK8 His-p16를 만들었다.

결과적으로 pBacPAK8 His-p16은 pBacPAK8 벡터의 BamHI 절단부위에서부터 다음 시퀀스(ATG,CAT,CAT,CAC,CAC,CAT,CAC,GGA,TCC,CAT,ATG,GCC; 아미노산으로 해석하면 Met,His,His,His,His,His,His,Gly,Ser,His,Met,Ala)를 p16 앞에 더 가지도록 만들었다.

<실시예 2> CDK4 효소 활성의 측정과 p16 단백질에 의한 저해

CDK4 활성의 측정은 가와가미(Kawakami, K., Biochemical and biophysical research communications 219, 778-783)의 방법에 준했다. [감마-³²P 표지된]ATP와 Rb 단백질과 앞에서 만든 CDK4 바이러스와 사이클린 D1 바이러스를 동시에 감염시킨 세포 추출물 또는 대조군의 세포추출물을 넣고 반응한 후 SDS-PAGE 젤로 Rb 단백질을 분리하여 Rb 단백질에 포함된 방사성 활성을 측정하였다. 또 농도별로 희석된 p16 단백질과 순수분리된 GST-CDK4/cyclin D1 단백질을 넣고 상기와 같이 반응하여 측정하였다. 이 때, p16 단백질을 넣지 않았을 때의 효소활성을 100%로 표시하였다. CDK4/cyclin D1 단백질은 GST-CDK4 바이러스와 cyclin D1 바이러스를 동시에 감염시킨 Sf21 곤충세포로부터 얻은 추출물을 글루타치온 세파로스 비드를 이용하여 정제한 것을 사용하였다. p16 단백질은 p16 유전자를 가진 배큘로 바이러스를 감염시킨 곤충세포로부터 순수 정제하여 사용하였다.

<실시예 3> CDK4, p16 유전자의 Sf21 세포에서의 발현 및 가용성 세포 추출 분 획(fraction)

재조합 바이러스를 만드는 방법과 재료는 클론테크 사의 BacPAK^TM배큘로바이러스 발현 시스템(클론테크 #K1601-1)을 사용하였다. 요약하면, pBacPAK8 CDK4 플라스미드 또는 pBacPAK8 His-p16 플라스미드를 Bsu36I 절단된 BacPAK6 바이러스 DNA와 함께 곤충세포에 감염(transfection)하여 재조합 배큘로바이러스를 생성하고, 저융점 아가로즈에서 플라크를 분리배양하여 단일클론 바이러스를 얻었다. 이것을 각각 CDK4 바이러스, His-p16 바이러스라 한다. 상기 본 발명의 재조합 배큘로바이러스인 CDK4 바이러스 및 His-p16 바이러스를 각각 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 4월 22일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0464BP, 수탁번호 : KCTC 0466BP).

이 두가지 바이러스를 1.0 x 10⁸정도의 고농도로 배양하여, 35mm 배양접시에서 Sf21 세포에 CDK4 바이러스를 단독으로 혹은 CDK4 바이러스와 His-p16 바이러스를 동시에 감염시켜 48시간 배양한 후 수용성(soluble) 단백질을 분석하였다. 이 때 발현된 단백질은 곤충세포 내에 축적되므로 곤충세포를 수확하여 4℃에서 200㎕의 완충액(20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM PMSF)을 가한 후 초음파 분쇄하고 12,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리한 상층액 15㎕을 폴리아크릴아마이드젤로 분리(SDS-PAGE)하여 분석하였다(도 2a).

위의 실험으로 CDK4를 p16과 동시에 발현시키면 곤충세포에서 수용성 CDK4를 얻을 수 있음을 알았다. 그래서, 대량 생산을 위해 2 x 10⁸Sf21 세포를 300ml TNM-FH(5% FBS)에서 면적이 1750 cm²인 세포배양용 롤러병(Falcon #3035)에 넣고 24시간 동안 0.2 rpm으로 회전시키며 배양하였다. 배양액을 제거하고 CDK4 바이러스와 His-p16 바이러스를 각각 1.5 x 10⁹pfu로 넣고 30분간 0.2 rpm으로 회전시키며 감염시켰다. 여기에 400ml의 TNM-FH(5% FBS)를 더 넣고 48시간 동안 배양하였다. 이 배양세포를 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 침전물을 얻었다. 세포는 50 ml의 인산염 생리식염수(pH=7.4)로 한번 세척하여 다시 1500 rpm에서 5분간 원심분리하여 가라않은 세포를 70℃에 보관 후 필요시 사용하였다.

이상에서 본 바와 같이, 본 발명은 곤충세포에서 CDK4를 p16과 동시에 발현시킴으로써 CDK4와 p16이 복합체를 형성하여 세포파쇄후 원심분리 결과물의 상층액에 용해되는 즉, 가용성의 CDK4/p16 복합체의 대량 발현 방법에 관한 것으로서, CDK4를 단독으로 발현시키는 경우에는 대부분이 불용성 형태로 얻어져서 순수한 CDK4를 대량으로 얻기가 어려운 반면에, 본 발명은 CDK4를 p16과 동시에 발현시켜 CDK4와 p16의 복합체 상태로 발현되게 하여 가용성의 CDK4를 CDK4/p16 복합체 형태로 대량 얻을 수 있으므로 이 복합체를 그대로 사용할 수 있고, 또한 이 복합체를 분리 정제하여 순수한 CDK4를 대량으로 얻을 수 있다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 33

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 28

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열목록]

서열번호 : 4

서열의 길이 : 32

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

Claims

CDK4 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 pBac PAK8 CDK4.
p16 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacPAK8 His-p16.
곤충세포에서 CDK4 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스.
제3항에 있어서, 곤충세포에 제1항의 배큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 MNPV 바이러스와 공형질 감염시켜 얻은 재조합 배큘로바이러스 CDK4 (수탁번호 : KCTC 0464BP).
곤충세포에서 p16 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스.
제5항에 있어서, 곤충세포에 제2항의 배큘로바이러스 발현 벡터를 야생형 오토그라파 캘리포니카 MNPV 바이러스와 공형질 감염시켜 얻은 재조합 배큘로바이러스 His-p16 (수탁번호 : KCTC 0466BP).
곤충세포를 이용하여 CDK4 및 p16 또는 p16 유사체를 동시에 발현시킴을 특징으로 하는 가용성의 CDK4/p16(또는 p16 유사체) 복합체의 대량 발현 방법.
제7항에 있어서, 제3항 또는 제4항의 CDK4 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스와 제5항 또는 제6항의 p16 유전자 또는 p16 유사체 유전자를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에서 동시에 발현시킴을 특징으로 하는 가용성의 CDK4/p16(또는 p16 유사체) 복합체의 대량 발현 방법.