JP2001507669A - サイクリン依存キナーゼ結合性化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性を有する物質であつて、(i)全長p16タンパク質のアミノ酸残基８４から１０３、あるいは、その活性部分または誘導体を含むペプチド；または、(ii)そのフラグメント、活性部分または誘導体の機能的類似物を含有し；全長p16、p15、p18及びp19タンパク質以外である物質を同定する。これらの物質は、Rbタンパク質のリン酸化を阻害することにより、腫瘍抑制において有用である。また、cdk類への結合を負うアミノ酸モチーフである、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０から９２に相当するFLDモチーフ、及び、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９４から９７に相当するLVVLモチーフの解析の記載される。ここに開示される物質は、過剰増殖疾患の処置、及び、類似の特性を持つ設計分子のスクリーニングに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 サイクリン依存キナーゼ結合性化合物 発明の属する分野 本発明は、サイクリン依存キナーゼ(cdk)に結合する特性を有する物質(substa nces)、特に、p16タンパク質のフラグメントの分析から導かれたこの特性を有す る物質に関する。また本発明は、これらの物質を含む製薬組成物、及びそれらの 医療処置方法における、特に過剰増殖疾患の処置における使用にも関する。また 本発明は、これらの物質の、関連する活性を具備する化合物の同定における方法 または使用にも関する。 発明の背景 Rb遺伝子産物（pRb）の、サイクリン依存キナーゼ（cdk）ファミリーの成員に よるリン酸化は、有糸分裂を受ける細胞コミットメントにおいて重要な段階であ る。この段階は、細胞周期のＧ１相後期に調節され、抑制（R）点として知られ ている（6）。cdkは鍵となる調節因子であり、それを介して、正及び負に作用す る両方の細胞シグナル導入因子が合流される。有糸分裂促進剌激は、Ｇ１後期に おけるpRbリン酸化が可能なＤ-サイクリンとcdk4またはcdk6の間の活性複合体を 誘発する。これらのキナーゼは、接触阻害、成長因子飢餓又はＴＮＦ-βから生 ずる細胞成長阻害シグナルの標的でもある。この阻害シグナルは、キナーゼまた はサイクリン−キナーゼ複合体のいずれかを直接妨害するINK4及びp21/KIP cdk 阻害剤の２つの速やかに延長されるファミリーの異なる成員の産生または活性を 誘発することにより、キナーゼ活性をブロックしうる（7）。これまでに同定さ れているINKタンパク質のファミリーは、p15、p16、p18及びp19である（20、22 、23）。 しかしながら、p53転写刺激（8）を介する腫瘍抑制活性に間接的に結合したp2 1^Cip1/WAF1とは異なり、INK4p16遺伝子は、多数のヒト腫瘍においてそれ自身が 欠失又は突然変異している（9-15）。INK4p16における生殖系列突然変異は、黒 色腫発育の危険の増大を伴う（9、10）。INK4p16の１５６アミノ酸産物は、CDKN 2また はp16 INK4a（この出願では、"p16"と呼称する）として知られている。 発明の概要 我々は、cdk4及びcdk6といったサイクリン依存キナーゼ(cyclin dependent ki nase)と相互作用するp16の領域を同定し研究することを開始し、これらの特性、 特にp16のこの領域に基づくペプチドを有する物質によるcdk類の結合が、Rbタン パク質のリン酸化を阻害することによる腫瘍抑制に使用できる可能性を試した。 小さなペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用及び生物学的活性に含ま れるタンパク質の領域を同定するのに強力な道具になることがる（16-19）。こ の発明において、我々は、p16アミノ酸配列に渡ってオーバーラップする一連の ２０アミノ酸（aa）ペプチドを合成紙、ビオチニル化した各ペプチドの、ラビッ ト網状赤血球溶解物中で発現した³⁵Ｓ−ラベルしたcdk4及びcdk6と相互作用する 能力を試験した。 これらの実験により、cdk4及びcdk6と相互作用し、cdk4−サイクリンＤ１に媒 介されたin vitroでのRbタンパク質のリン酸化を阻害するp16の残基８４から１ ０３に相当する２０アミノ酸の合成ペプチドが同定された。アラニン置換の連続 により、cdk4及びcdk6相互作用並びにRbリン酸化の阻害にとって重要なアミノ酸 残基が決定された。この出願では、p16の残基８４から１０３は、図１Ｃの最初 に記載した配列、即ち、DAAREGFLDTLVVLHRAGARに相当する。 さらに、小さなペプチドキャリア分子と結合し、組織培養媒質に直接適用した とき、p16誘導ペプチドは、血清餓死ヒトTaCaT細胞及び平常にサイクルする他の タイプの細胞の両方において、細胞周期のＳ相へ入ることをブロックする。これ は、in vivoでのpRbリン酸化の阻害を伴う。これらの結果は、小さなキャリア分 子に結合したp16由来合成ペプチドが、全長p16タンパク質の過剰発現に伴うＧ１ 相抑制を擬態できることを示している。 従って、第１の態様において、本発明は、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に 結合する特性を有する物質であって、 (i)全長p16タンパク質のアミノ酸残基８４から１０３、あるいは、その活性部 分または誘導体を含むペプチド、または、 (ii)そのフラグメント、活性部分または誘導体の機能的類似物を含有し、全長 p16、p15、p18及びp19タンパク質以外である物質を提供する。 好ましくは、サイクリン依存タンパク質（cdk）はcdk4またはcdk6である。ま た、この物質は、cdkとサイクリンＤとの間に形成された複合体によって媒介さ れるRbリン酸化を阻害する特性を有する。さらに、これは細胞がＳ相に入ること を阻止することによる細胞分化のブロックに使用できる。これらの物質はサイク リン依存キナーゼに結合するので、cdk類とサイクリンＤとの複合体の形成を阻 止するのにも使用でき、細胞中でのサイクリンＤレベルを向上させるさらなる生 物学的効果も有する。cdk4及びcdk6に依存するpRbのリン酸化のブロッキングと 同様に、ここに述べる物質は、pRbファミリーの成輿であるp107及びp103、又は 、cdk4及びcdk6媒介調節の標的である他の基質を含む他の細胞物質を標的とする こともできる。 本発明において、「活性部分」は、上記フラグメントの全長アミノ酸配列より 短いが、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性は保持しているペプチ ドの部分を意味する。好ましくは、このペプチドは、pRbリン酸化の阻害特性も 有する。 本発明では、「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を、例えば、該タンパ ク質をコードする拡散の操作、又は該タンパク質自体を変化させることにより、 変えることによって修飾したタンパク質である。天然アミノ酸配列のそのような 誘導体は、１又はそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換を含むが、当 該タンパク質に必要な活性を根本的に変えることはない。一例として、９２位の アスパラギン酸がアラニンに置換されたペプチド６は、cdk4及びcdk6への結合に おいてペプチド６（残基８４から１０３）より強いことがわかり、pRbリン酸化 をより阻害する。他の誘導体は、アミノ酸モチーフFLDとLVVLの間に１又はそれ 以上のアミノ酸残基の挿入を含む。 本発明では、「機能的類似物(functional mimetic)」は、p16アミノ酸配列の フラグメントまたは活性部分を含まなくてもよく、ペプチドでなくてもよいが、 p16フラグメントの一部又は全部の特性、特に、サイクリン依存タンパク質への 結合及び／またはpRbリン酸化の阻害特性を有する物質を意味する。 好ましい実施態様では、ペプチドは、全長p16タンパク質の残基８９から９７ を含む。より好ましくは、ペプチドは、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０ から９２に相当するアミノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質の アミノ酸残基９４から９７に相当するLVVLを含む。また、我々は、 ペプチドのＤ及びＬ異性体の両方が、cdkへの結合及び／またはpRbリン酸化阻害 特性を持つことを見出した。 さらなる態様では、本発明は、キャリア分子に結合した上記の物質を含む化合 物であって、in vivoで当該化合物を細胞に輸送可能にした化合物を提供する。 一実施態様では、キャリア分子は、アンテナペディア(Antennapedia)のホメオド メインから誘導された１６aaペプチド配列（例えば、ペネトラチン(Penetratin) という名前で販売されているもの）であり、上記の物質の１つと末端Cys残基を 介して結合できる。ペネトラチン分子及びその特性は、WO 91/18981に記載され ている。 さらなる実施態様では、上記ペプチドの１つを含む物質は、他のペプチド配列 に結合することによって安定化される。好ましくは、これにより、ペプチドは、 全長p16により類似したコンホメーションを持ち、典型的には、例えば、ペプチ ドフラグメントが全長p16に近接したあるいは超越した活性をゆうするといった 、該ペプチドの活性を非結合ペプチドに比較して向上させるという利点を持つ。 さらなる態様では、本発明は、上記の物質の１つ又はそれ以上を含む製薬組成 物、及びその組成物の医療処置方法における使用を提供する。好ましい実施態様 では、本発明は、これらの物質の、ガン、乾癖または動脈発生(arteriogenesis) といった過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における使用に関する。特に、p16陰 性またはcdkの過剰発現を伴う癌は、上記物質の１つ又はそれ以上を含む組成物 に格別に良好に反応するようである。 本発明の製薬組成物、及び本発明の使用は、上記の物質の１つに加えて製薬上 許容される賦形剤、キャリア、バッファ、安定化剤、またはこの分野で当業者に 知られている他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は、非毒性でなけれ ばならず、活性成分の有効性を阻害してはならない。キャリア又は他の材料の正 確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内 、 腹膜間経路に依存する。そのような投与について、腸管外に許容される水溶液が 用いられ、それは発熱因子を含まず、安定したｐＨ、等張性及び安定性を有する 。当業者は、適当な溶液を調製することができるであろう。必要ならば、保存剤 、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を含んでもよい。投与レ ベルは、当業者によって、処置すべき疾患、個々の患者の状態、運ばれる部位、 投与方法および実務者に知られた他の要因を考慮して決定される。上記の技術及 びプロトコールは、RemingtonのPharmaceutical Science，16th edition，Osol ，A.(ed)，1980に見出すことができる。 また、物質がタンパク質である実施態様では、本発明は、これらのタンパク質 をコードする核酸も提供する。当業者は、ここに開示されたアミノ酸配列から、 核酸配列を発現するのに用いられるホストのコドン優先などの要因を考慮して、 そのような核酸配列を容易に構成することができる。本発明の、タンパク質がキ ャリアタンパク質に結合した実施態様では、キャリアタンパク質をコードする核 酸は、ペプチドをコードする配列に結合されていてもよく、その配列は融合物と して発現される。 さらなる態様では、本発明は上記の核酸を取り込んだベクター、及び、そのベ クターで形質転換されたホストを提供する。 さらなる態様において、本発明は、上記の物質の、(i)前記物質の生物学的活 性の１又はそれ以上を有する化合物、または、(ii)前記物質の結合パートナーで ある化合物、例えば、p16またはp16類似物に特異的な抗体または相補的配列をス クリーニングする方法における使用を提供する。好ましくは、その物質はp16タ ンパク質のペプチドフラグメントである。類似物又は結合パートナーのスクリー ニング方法の例は、 (a)p16フラグメントを個体基質上に固定化し、当該基質をラベル化ペプチドま たは他の候補となる化合物のライブラリに曝し、次いで、該ペプチドまたは候補 化合物のp16フラグメントへの結合を検出すること； (b)ラベルしたcdk及びラベルしない候補化合物またはペプチドを用いること； (c)固相基質の他の組み合わせ及び結合測定； (d)p16タンパク質のフラグメント及び該フラグメントから生じた抗体を用いた ウェスタンブロット及び候補化合物による抗体の置換の測定； (e)p16ペプチドまたはp16フラグメントから誘導されたオリゴヌクレオチドに 結合する候補ペプチドを検出するための酵母２ハイブリッドスクリーンの使用（ 酵母２ハイブリッドスクリーンの説明は、我々の先願WO96/14334参照）； (f)フラグメントまたは候補化合物がRbのリン酸化を阻害及び／又は周期から の細胞の阻止をするか否かを決定するための細胞系におけるp16タンパク質のフ ラグメント及び／又は候補化合物の使用； (g)フラグメントまたは候補化合物が腫瘍の発生の阻害、腫瘍サイズの縮小、 腫瘍成長の阻害及び／又は腫瘍細胞移動の阻害をするか否かを決定するための腫 瘍成長の動物モデルにおけるp16タンパク質のフラグメント及び／又は候補化合 物の使用を含む。 さらなる態様において、本発明は、上記の物質の１つと競合する化合物を同定 する方法を提供し、この方法は、 (a)予め設定した量の検出可能なラベルをした物質をサイクリン依存キナーゼ （cdk）に結合させ、 (b)候補となる化合物を添加し、そして、 (c)cdkに結合したままのレベル化合物の量、あるいは、候補となる化合物で置 換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる。 さらなる態様で、本発明は、上記の物質の１つと類似物を同定する方法を提供 し、この方法は、 (a)１またはそれ以上の候補となる化合物を個体基質上に固定化し、 (b)該基質をラベル化サイクリン依存キナーゼ（cdk）に曝し、 (c)cdkに結合した候補化合物を選択することを含んでなる。 上記の態様で、好ましくは、サイクリン依存キナーゼが、cdk4またはcdk6であ る。好ましくは、この物質はp16タンパク質であり、より好ましくは、前述のFLD 及びLVVLモチーフである。便宜的に、候補化合物は合成結合ライブラリ(synthet ic combinatorial library)から選択できる。 本発明は、候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及び ／または該化合物の細胞がＳ相へ入ることを阻害する特性について試験すること を 更に含んでもよい。 さらなる態様では、本発明は、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０から９ ２に相当するアミノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質のアミノ 酸残基９４から９７に相当するLVVLを含むp16タンパク質のフラグメントの、前 記アミノ酸モチーフの三次元構造に類似するようにモデル化された有機化合物の 設計における使用であって、当該有機化合物が、サイクリン依存タンパク質に結 合する、及び／またはpRbリン酸化を阻害する特性を有する使用を提供する。 周知の製薬的に活性な化合物の類似物の設計は、「先行(lead)」化合物に基づ く製薬の開発で既知の方法である。これは、活性化合物を合成するのが困難また は高価である場合、あるいは、特定の投与方法に不適である場合に好適であり、 例えば、ペプチドは、消化管内でプロテアーゼによって即座に分解され易いので 経口組成物の活性成分としては不適である。類似物の設計、合成及び試験は、− 般に、目的とする特性のための多数の分子のスクリーニングを避けるようにされ る。 与えられた目的とする特性を有する化合物からの類似物の設計において共通に 用いられる数種の工程がある。第１に、化合物の目的とする特性を決定するのに 決定的及び／又は重要な特定の部分が同定される。ペプチドの場合、そのペプチ ドのアミノ酸残基を系統的に換えることにより、例えば、各残基を順番に置換す ることにより行うことができる。これらの部分又は残基は、その「薬物中心(pha rmacophore)」として知られる活性領域である。 薬物中心が見出されれば、その構造は、例えばスペクトル技術、Ｘ線回折デー タ及びＮＭＲ等の広範な情報源からのデータを用いた、例えば、立体化学、結合 、大きさ及び／又は電荷等のその物理的特性に従ってモデル化できる。このモデ ル化工程には、（原子間の結合ではなく、薬物中心の電荷及び／又は容量をモデ ル化する）コンピュータ分析類似性マッピング、及び他の技術も用いることがで きる。 この方法の変形例では、リガンド及びその結合パートナーの三次元構造がモデ ル化される。これは特に、リガンド及び／又は結合パートナーが、結合時にコン ホメーションを変える場合に有用であり、類似物の設計において、このことを考 慮したモデルを作ることができる。 次いで、テンブレート分子が選択され、その上に、薬物中心に類似させる化学 基がグラフトされる。テンプレート分子及びその上にグラフトされた化学基は、 従来から、類似物の合成が容易で、製薬上許容され、in vivoで分解しない一方 、先行化合物の生物学的活性を保持するように選択される。この方法で見出され た類似物（群）は、目的とする特性の有無、又はそれをどの程度発揮するかを見 るためにスクリーニングされる。次いで、さらなる最適化又は修正が行われ、in vivo又は臨床試験用の１又はそれ以上の最終的な類似物に到達する。 ここで本発明を、添付図面を参照しながら例を挙げてさらに詳細に説明する。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、請求の範囲を制限するよう に解釈されるべきものではない。 図面の簡単な説明 図１Ａ及びＢは、p16由来ペプチドの、in vivo発現されたcdk4又はcdk6への相 対的結合を示す。 図１Ｃは、p16タンパク質のアミノ酸８４から１０３に相当するペプチド６を 示す。 図１Ｄ及びＥは、ペプチド６アミノ酸のアラニン置換シリーズの、in vitroで 翻訳されたcdk4及びcdk6に対する類似の結合を示す。アラニンで置換されたアミ ノ酸残基が表示され、かつ、各ペプチドで沈降したcdk4及びcdk6の相対的量を示 した。アミノ酸８９−９０及び９４−９７に相当する疎水性残基のアラニンへの 置換は、ペプチド６の両方のキナーゼへの結合を低下させたが、Asp92の置換は 、相互作用をかなり増加させた。 図１Ｆは、cdk4を含有するSf9昆虫細胞溶解物を、次のビオチニル化ペプチド とともにインキュベートした実験からの結果を示す：ペプチド６（レーン１及び ４）、ペプチド１（レーン２及び５）、並びにペプチド１０（レーン３及び８） 。複合体は、ストレプトアビディン被覆アガロースビーズで沈降させた。cdkバ ンドの低下は、抽出方法に関連する（材料及び方法参照）。これらの結果は、ペ プチドの 添加前にcdk4に昆虫細胞溶解物を含むサイクリンＤ１が添加されると、ペプチド を含む抽出物がcdk4に結合しないことを示す。しかし、Ｄ１より前にペプチドを 添加するとペプチドはCDk4に結合し、ペプチドはサイクリンＤとcdkとの結合の 阻害を起こすことができることを示唆している。 図２Ａは、大腸菌の発現され精製された全長Rbタンパク質のリン酸化の阻害を 示す。p16由来野生型ペプチド（ペプチド１、６及び１０）またはペプチド６の アラニン置換シリーズが、それらのpRbリン酸化を阻害する能力について、cdk4 を含むSf9昆虫細胞溶解物によって試験された。p16シリーズのペプチド１及び１ ０は、CDk4又はcdk6を沈降させず、pRbリン酸化に影響を与えない。ペプチド６ はCDk4及びcdk6に結合し、pRbリン酸化のレベルをかなり低下させる。アラニン で置換されたペプチド６のアミノ酸残基が表示され、かつ、各ペプチド存在下で のpRbリン酸化のレベルを示す。残基９２（Ala92）におけるAla-Asp置換は、野 生型ペプチド６より高い効率で全長Ｒｂタンパク質のリン酸化を阻害し、そのcd k4及びcdk6へのより高い結合能を反映している。９０及び９５−９７位の疎水性 残基又は近接した残基のアラニン置換は、阻害能をバックグラウンドのレベルま で低下させた。 図２Ｂは、ペプチド６、ala92及びAla94の量の増加のpRbリン酸化への影響を 示す。50μMにおいて、Ala92によるcdk4-サイクリン依存性pRbリン酸化のブロッ クは、ほぼ完全になる。 図３は、小さなペプチドキャリアに結合したペプチド６によるヒトケラチン細 胞由来HaCaT細胞のＳ相への導入の阻害を示す。細胞は、血清及び10μMのBrdUが 添加される前に、72時間の血清飢餓によってＧ０で同期された。図３Ａは、100n Mのペネトラチンキャリア分子に結合したペプチド６が組織培養媒質に添加され たときの、血清刺激後の表示された時点を示す。表示されたデータは、血清のみ とインキュベートした細胞に対する、ペネトラチンキャリアに結合したペプチド ６とインキュベートした後の細胞のＳ相導入の％阻害％を示す。 図３Ｂは、ErdUラベルによる細胞合成ＤＮＡを示すパネルＡ、Ｃ、Ｅ及びＧと 、同じ領域で細胞をヘキストで染色したパネルＢ、Ｄ、Ｆ及びＨを示す。血清刺 激後にBrdUを取り込んだ細胞の比率は、24時間で71％（Ｅ及びＦ）、3時間で14 ％（Ｇ及びＨ）であった。24時間でのErdU取り込み細胞の数は、ペネトラチンキ ャ リア分子に結合したペプチドを12時間で添加した場合（パネルＡ及びＢ）の方が 、14時間の場合（パネルＣ及びＤ）に比較してかなり減少した。ペネトラチンの みによるＤＮＡ合成への影響は見られなかった（図示せず）。 図４Ａは、in vivoでのpRbのリン酸化を示す。低リン酸化された(hypophospho rylated)pRbは、低リン酸化されたサブタイプに比較して各区画に対する親和性 が低く、Triton X-100（26）を含む低張バッファを用いて核から抽出できる。パ ネルＡ、Ｃ及びＥは抗pRbモノクローナル抗体での染色を示し、Ｂ、Ｄ及びＦは 、ヘキストで染色した同じ範囲を示す。HaCaT細胞は、72時間の血清飢餓された 後に血清を添加された。ペネトラチンに結合したペプチド６（パネルＣ）または ペネトラチン自身（パネルＡ）は、血清添加後８時間に100nMで添加され、リン 酸化されたpRbは、23時間において、非抽出染色（パネルＥ）に比較した抽出性 （パネルＡ及びＥ）を決定することによって評価した。 図４Ｂは、ウェスタンブロット分析で決定したHaCaT全細胞抽出物におけるpRb リン酸化の状態を示す。細胞は、血清添加前に72時間飢餓とされ、表示した時点 で採取した。ペネトラチンに結合したペプチド６またはペネトラチン自身は、記 載したように10時間目に添加した。 図５Ａは、p16、他のINKファミリーの成輿の対応領域からの関連ペプチド、及 び、p16のフラグメントによるpRbリン酸化の相対的阻害を示す。特に、pRbリン 酸化に対するp16フラグメントのサイズの縮小の影響を示す。図５Ｂ及び５Ｃは 、INKファミリーの成員及びフラグメントのcdk4及びcdk6に対する結合の対応す る測定を示す。 図６Ａ及び６Ｂは、cdk−サイクリンＤキナーゼ活性に対する、ペプチド２０ 及び２１（図６Ａ）及びwt p16及びV95、96A p16(図６Ｂ)の濃度の増加の影響を 示すグラフである。ペプチド２０は、３６aa長の合成ペプチドであってD92A突然 変異を持ち、ペプチド２１はVV95、96AA突然変異を持つ。 図７は、３つの異なるペプチドで処理したHaCaT細胞のＦＡＣＳ分析結果を示 し、それらのペプチドは、２０aaペプチドに結合した１６aaペネトラチン配列か らなる３６aaペプチド（ペプチド６、V95,96A及びD92A突然変異p16ペプチド）で あり、該ペネトラチン配列は２０aaペプチドのＮ末端にあるようにされている（ 例えば、 Ｎ-ペネトラチン-p16-Ｃ）。これらの実験で、細胞は、10％ＦＣＳ及びペプチド が添加される前に72時間飢餓とされ、その２時間後に分析した。 詳細な説明 材料及び方法 ペプチド沈降 （最初の８Ｎ−末端残基以外の）p16と５aaのオーバーラップを持つ２０aaペ プチドライブラリを、ビオチン基が結合するＮ−末端にSGSGリンカーを付加して 合成した。ペプチド６のアラニン置換シリーズも同様にして合成した。ペプチド は、アガロースビーズ上に固定されたストレプトアビディンに結合され、PBSで ４回洗浄された後、³⁵Ｓ−メチオニンでラベルしたcdk4又はcdk6を含有するウサ ギの網状赤血球溶解物（Promega）とともに氷上でインキュベートした。ビーズ は、0.2％Triton X-100を含む1.2xPBSで４回洗浄した後、SDS付加バッファを添 加し、12％SDSポリアクリルアミドゲルに適用した。ケルは、オートラジオグラ フィーフィルムに曝し、cdk4及びcdk6に相当するバンドを濃度計で分析した。 in vitroでのpRbリン酸化 ペプチドは、50mMのHepes pH7.4、10mMのMgCl₂、2.5mMのEGTA、1mMのDTT、10m Mのβ−グリセロホスフェート、1mMのNaF及び1mMのNa₃VO₄、及び、10mMのHepes pH7.4、10mMぼのNaCl、1mMのEDTA及び0.5mMのPMSF中に溶解したヒトcdk4発現バ クロウィルス(baculovirus)で感染させたSf9昆虫細胞からの抽出物3mlを含有す るバッファ中、25mMの濃度でインキュベートした。混合物は、氷上で60分間イン キュベートした。Sf9溶解物（3ml）を含む上記のヒトサイクリンＤは、0.6mgの 精製した組み換え全長Rbタンパク質及び2.5mM³²P ATPとともに、ATPの最終濃度5 0mMで添加して、+30℃で10分間インキュベートし、反応はSDS付加バッファの添 加によって終了させ、8％のSDSポリアクリルアミドゲル上に添加した。ゲルは、 オートラジオグラフィーフィルムに曝し（図２Ａ）、また、pRbリン酸化のレベ ルをリン酸画 像化によって評価した（図２Ｂ）。 細胞周期阻害 システイン残基を、ペプチド６のＣ末端に付加し、アンテナペディア ホメオ ドメイン（24）の１６アミノ酸長ペネトラチンペプチド（アミノ酸配列RQIKIWFQ NRRMKWKK）へのジスルフィド結合を用いた結合に用いた。細胞は、FCS無しのDME M媒質中での72時間の飢餓に先立ってカバースリップ上に播種した。媒質を、10 ％のFCSとBrdUを含むDMEMに置換した。血清刺激後の異なる時点で結合したペプ チドを添加した。Ｓ相に入る細胞の数を、アセトン／メタノール（１：１）中で 細胞をカバースリップ上に固定し、1HのHCl中で30分間インキュベートし、PBSで ６回洗浄し、次いで、抗BrdUモノクローナル抗体及び二次抗体を複合しMowiol含 有ヘキストに載せたテキサスレッドとともにインキュベートすることにより、24 時間におけるBrdUを取り込んだ細胞数を見積もることにより決定した。少なくと も２回繰り返された各１回の実験について、３つの異なるカバースリップ上の少 なくとも６の異なる領域が計数された。図３Ａに示した値は１つの代表例である 。 ＦＡＣＳ分析 採取前20分に、細胞は10μMのBrdUとともにインキュベートした。トリプシン 化した細胞は、次いでPBS中で洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁し、3mlの96％EtOHと 注意深く混合し、4℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞は、1mg/mlの ペプスタチンを含む2mlの30mMのHCl中、37℃で30分間インキュベートした後、2M のHCl中で15分間インキュベートした。PBSで６回注意深く洗浄した後、細胞は、 200μl（１：５）の抗BrdU（Becton Dickinson）中、室温で1時間インキュベー トした。PBSで洗浄後、細胞は、FITC複合抗マウスIgG（１：８０）（Sigma）中 で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞は、25μg/mlのプロビジウムヨーデ ィン(propidium Iodine)を含有するPBSに再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。 in vivoでのpRbリン酸化 過リン酸化(hyperphosphorylated)pRbを、アセトン／メタノール（１：１）で の固定（26）の前に、0.1％のTriton X-100を含む低張バッファで細胞を処理す ることによりカバースリップ上で培養した細胞から抽出した。固定した細胞は、 抗pRbモノクローナル抗体IF8と１時間インキュベートし、PBSで３回洗浄し、テ キサスレッド複合二次抗体と45分間インキュベートした後、カバースリップをMo wiol含有ヘキストに添加した。 ウェスタンブロット分析のために、細胞を、50mMのTris pH8.0、150mMのNaCl 、1.0％のNP-40、0.5％のDOC、0.1％のSDS及び0.1mMのPMSFを含むRIPAバッファ 中、+4℃で30分間溶解させた。タンパク質濃度を測定した後、サンプルをSDS付 加バッファ中で煮沸し、8％SDSポリアクリルアミドゲル上に広げ、ニトロセルロ ース膜に移した。フィルターは、まず抗pRbモノクローナル抗体IF8とインキュベ ートした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）複合二次抗体（DAK0）と インキュベートし、ＥＣＬ（Amersham）で展開した。 部位指向性突然変異 VV95、96AA突然変異を、Promegaからの形質転換部位指向性突然変異源キット を用い、その製造者の指示に従って、his標識した野生型p16タンパク質に導入し た。突然変異は、対応するコドンをGTG GTGをGCG GCGに換えることにより導入し 、次いで、配列をＤＮＡシークエンスによって確認した。 結果 p16のcdkに結合する領域の同定 図１Ａ及びＢは、p16のaa８４から１０３に相当するペプチド（ペプチド６） が、ストレプトアビディンアガロースビーズに結合したとき、網状赤血球溶解物 からcdk4及びcdk6の両方の抽出に使用できることを示している。このペプチドの アラニン置換シリース（図１Ｃ）は、残基８９から９６の間の領域における疎水 性アミノ酸の置換が、ペプチドのcdk4及びcdk6の両方に結合する能力を低下させ ることを示した。興味深いことに、アスパラギン酸９２のアラニンによる置換は 、ペプチドの両方のキナーゼへの結合をかなり増加させる（図１Ｄ及びＥ）。 p16フラグメント及びpRｂリン酸化の阻害 p16ペプチドとサイクリン依存キナーゼとの相互作用の機能的重要性を研究す るために、我々は、p16由来のペプチド並びにペプチド６のアラニン置換シリー ズが、cdk4−サイクリンＤのin vitroアッセイにおいてpRbをリン酸化する能力 に影響を与えるか否かを調査した（図２）。p16由来のシリーズの中でペプチド ６のみがpRbリン酸化を有意に低下させた（ペプチド１、６及び１０の結果のみ を示した）。アラニン置換シリーズの種々のペプチドのcdk4及びcdk6に結合する 能力と、cdk4−サイクリンＤ１活性の阻害との間に相関が見られた。 p16結合ドメインにおける突然変異の影響 最も重要なのは、全長p16タンパク質のaa８９から９６に相当する残基の間に 位置する２つの疎水性領域の中、又はその近隣のアミノ酸の置換が、ペプチド６ に誘発されるpRbリン酸化の阻害を低下させることである。興味深いことに、ア スパラギン酸９２のアラニンへの置換は、cdk4キナーゼ活性の阻害においてペプ チド６より有効なペプチドをもたらす。連続した希釈により、50μMのペプチド 濃度で、Ala92ペプチド及びペプチド６により、pRbリン酸化がほぼ完全にブロッ クされることがわかった。対照的に、１置換Ala94は、このアッセイにおけるペ プチド６の機能を完全に不活性化する（図２Ｂ）。Ala92ペプチドの向上した結 合性と、そのキナーゼ阻害剤としての大きな有効性との関係は刺激的であり、ペ プチド６配列のさらなる突然転位体が、おそらく天然のp16タンパク質の活性阻 害部位に類似したコンホメーションをとることを促進することにより、より大き な活性を有する可能性があることを示唆している。ペプチド６及び他の関連タン パク質で表されるp16の阻害領域の同定におけるここに述べた研究の比較は、キ ナーゼ阻害剤p15（20、21）に相当するドメインに同一のモチーフが存在し、密 に関連したp18（21）及びp19（22、23）阻害剤内に保持されていることを示して いるが、この発明以前には、この類似性及びその意義は当業者に認識されていな かった。 p16遺伝子における点突然変異は、遺伝性及び第一期黒色腫からの腫瘍、並び に食道及び膀胱からの腫瘍に見られる（9、10、14、15）。これらの突然変異体 は、ペ プチド６に囲まれた領域内又はその近隣に密集し、細胞増殖及びpRbリン酸化を 阻害するそれらの能力を失っていることが示された（3、4、12）。これは、p16 タンパク質機能に対するこの領域の重要性をさらに支持している。 p16タンパク質の不活性化を招き、cdkへの結合を媒介する上記の領域以外の突 然変異は、p16タンパク質の全体的なコンホメーション変化を誘導することを示 すか、あるいは、温度感受性であり、これらの突然変異が我々が結合を媒介する と示唆したドメインの構造に影響を与えることを示す。さらに、p16Ｎ−または Ｃ−末端の欠失は、ともにp16の不活性化を招き、p16の構造が感受性であるとの 推論を支持する。 p16の細胞増殖に対する影響及びキャリアペプチドの使用 培養細胞におけるp16の過発現は、Ｓ相への導入をブロックするので（1-4）、 我々は、ペプチド６が細胞増殖に影響を与えうるかを見出すことを試みた。生物 学的膜を通して速くエネルギー非依存的な方法で転位することが知られているア ンテナベディア ホメオドメインの１６aa領域（24）を、キャリアとしてペプチ ド６に結合し、血清飢餓のヒトケラチン細胞由来のHaCaT細胞の組織培養媒質に 添加した。 図３は、キャリア分子に結合したp16ペプチドの0.1μMを、血清添加と同時ま たは12時間後までに添加したとき、血清添加後24時間にBrdU取り込みによれば、 Ｓ相に入る細胞数が極端に減少することを示している。しかし、結合したペプチ ドを、血清添加後14時間で添加すると、Ｓ相に入る細胞数は、ペプチドで処理し ていない細胞に見られる数と同等であった。このことは、ペプチドの影響が、Ｇ １後期に相当する細胞周期の狭い窓に限られることを示唆している。これは、血 清刺激及びタンパク質合成が、もはやＳ相への導入を確かめることを必要とせず 、pRbリン酸化の臨界点であることが示唆されている制限（R）点を含む（6、25 ）。 飢餓とされた細胞が、血清添加後10時間にキャリア分子に結合したp16ペプチ ド又はキャリア分子単独とともにインキュベートされたとき、23時間目に測定す るとpRb抽出能の相違が観察された（26）。抗pRbモノクローナル抗体で染色され たペブチド６とインキュベートした細胞の約60％は、キャリアのみとのインキュ ベ ートのわずか14％に匹敵する（図４Ａ）。この観察は、同様の方法で処理した全 HaCaT細胞抽出物のウェスタンブロット分析によって確認した（図４Ｂ）。これ らの結果は、低リン酸化されたpRbを持つ細胞の数が、キャリアペプチドに結合 したペプチド６を12時間以前に添加したとき、血清刺激後23時間で有意に減少す ることを示唆している。また、Sf9細胞抽出物に感染したバクロウイルスで観察 されたcdk4−サイクリンＤ活性の阻害（図２）が、in vivoでも起こることを示 唆している。 0から12時間の間の結合したペプチドの添加後のＳ相導入の確実な阻害は、ペ プチドの影響が永続的であり、キャリアに結合したペブチドは細胞内で即座に分 解されないことを示唆している。このことは、アンテナペディア ホメオドメイ ンキャリアペプチドが細胞内のタンパク質分解から保護されることを示唆する報 告（24）によって支持されている。 p16のCDk結合モチーフの精製及び他のタンパク質との比較 上記の結果は、p16の第３のアンキリン様リピートから誘導された２０aaペプ チドが、例えば、in vitroでのサイクリン依存キナーゼcdk4及びcdk6への結合及 びcdk4−サイクリンＤ１キナーゼ活性の阻害、並びに細胞周期進行のブロックと いつた、全長タンパク質と類似の特徴を持つことを示す。この領域は、全長p16 タンパク質のaa８４から１０３に相当するペプチド配列を含み、p15の対応領域 と同一であり、p18及びp19並びにマウスp16に高度に保持された。 キナーゼ阻害剤のINKファミリーの成員は、CDK−サイクリンＤキナーゼ活性を 、cdk4及びcdk6との直接的相互作用により特異的に阻害するので、我々は、この 活性が、これらのタンパク質間に共有される高度に保持された１つのドメインに 決定できるかを見出すことを試みた。それは、腫瘍抑制活性を持つINKファミリ ーの主にp16、より少ない程度でp15であるので、これらの異なるタンパク質が、 同じドメインを通して類似の方法でCDK−サイクリンＤキナーゼ複合体を阻害す るか否かを知り、それらの作用の平均ではなく、これらの異なるタンパク質の発 現の調節が、それらの腫瘍抑制剤としての役割を決定することを示唆するのは重 要である。よって、我々は、合成腫瘍抑制ペプチドのモデルとしての能力を向上 させる ために、このペプチドドメインを、さらに最小化及びプロテアーゼ分解に干活性 である修飾アミノ酸残基で置換できるか否かを見出すための実験を行った。 ペプチドのcdk4及びcdk6への結合性を研究するために、我々は³⁵Ｓラベルした メチオニンの存在下で、結合したin vitro網状赤血球翻訳システムにおいてタン パク質を発現させた。ペプチドのＮ−末端でSer-Gly-Ser-Gly-リンカーに結合し たビオチン基は、ストレプトアビディン被覆アガロースビーズに結合し、細胞溶 解物とともにインキュベートした。図５Ａは、pRbリン酸化測定結果を示し、図 ５Ｂ及び５Ｃは、INKの成員の結合及びp16ペプチドフラグメントのcdk4及びcdk6 への結合の測定を示す。 図５Ａ−Ｃは、p18及びマウスp16から誘導された、p16の８４−１０３領域に 相当するペプチドが、pRbリン酸化を阻害することを示し、それらのcdk4及びサ イクリンＤ１を過発現するSf9昆虫細胞溶解物によるpRbリン酸化を阻害する能力 を反映し、cdk4及びcdk6の両方に同様に結合する。 次いで、我々は、Ｎ−又はＣ−末端から同時に２つの残基を欠失させることに よって作製したp16ペプチド欠失シリーズを試験した。我々は、Ｎ−末端（図５ Ａ−Ｃのペプチド６）において２つの残基を取り除くことが、cdk結合性及びキ ナーゼ阻害高価の両方をかなり低下させ、この活性は、いずれかの末端で他の２ つの残基を欠失させることによって回復することを見出した。ペプチド１０のみ が、アンキリン様リピートの間に保持されたモチーフに相当する１０の残基を持 ち、密な二次螺旋構造を形成すると予想される。このペプチドは、その結合能力 の一部を失っているが、朱だに良好なキナーゼ阻害剤であり、ｐ１６ペプチド原 型の２０アミノ酸が、少なくとも１０残基に減少させることができ、なおかつCD K-サイクリンＤ１キナーゼ活性を阻害することを示している。この欠失シリーズ 及びアラニン走査は、ペプチドにおいて、我々が、結合性とキナーゼ阻害性との 間に強い相関があることを実験したことを示す。 R87P置換がペプチドの機能を阻害しないことを記すのは興味あることである。 この突然変異は、検出される殆どのp16突然変異と同様に、ペプチドとcdkとの相 互作用に重要であることが示された領域の外側にあるので、これらの突然変異が 、タンパク質のコンホメーション変化を誘発し、それが中心のアンキリン様ドメ イ ンに影響することを示唆している。この仮説は、P114及びG101Wがタンパク質の 全体的なコンホメーション変化を起こすこと、及び、R87P突然変異が温度感受性 であることを示した最近のＮＭＲ研究によって強化された。 同様の説明は、ペプチドは、２つの残基がＮ−末端を離れるとその効果を失う という驚くべき観察に対する答えも与えることができ、これらの欠失がペプチド のコンホメーション変化を起こすことを示唆している。最小の結合ペプチド（ペ プチド１０）は、基本的に極性残基に囲まれた２つの疎水性領域を有し、これは 両親媒性の螺旋回転を形成する。p18ペプチドは、p16ペプチドに比較すると８つ の置換基を有し、９５及び９６位のQTは第２の疎水性ポケットを壊すので、これ らがまずペプチドの結合ドメインを妨害すると思われる。しかし、このペプチド は、９７及び９８位に、極性基で囲まれているが２つの疎水性残基を有し、また 、無傷のGFLD領域並びにロイシン９８を有するので、第２の疎水性ポケツトが、 cdk結合性に影響を与えずにＣ−末端方向に向けて数残基分移動できることを示 唆している。 即ち、これらの結果は、p16フラグメントのサイズの初期の減少の後では、cdk 阻害性の幾分の低下をもたらすが（ペプチド６）、p16フラグメントのサイズの さらなる減少では、阻害性が再び増大する（ペプチド７から１０）ことを示して いる。このことは、１６aa（ペプチド７）、１４aa（ペプチド８）、１２aa（ペ プチド９）及び１０aa（ペプチド１０）を含む小さなペプチドが、全長p16と同 等又は類似の生物学的活性を維持できることを示している。また、これらの結果 は、p16の２つのモチーフ、ELDモチーフ及びLVVLモチーフが、キナーゼ結合性に とって重要であるという考えを支持している。 従って、これらの結果は、上述のp16の２０aaフラグメント（残基８４から１ ０３）は、少なくとも50％の大きさで作製でき、なおかつ活性を維持できること を示す。 ９５及び９６位におけるアラニン置換 p16ペプチドのアラニン走査置換シリーズからの上記の結果は、９５及び９６ 位の２つのバリンが、ペプチドのcdkに対する結合性びキナーゼ阻害性にとって 重 要であること、及び、アスパラギン酸９２のアラニンへの置換は結合性とキナー ゼ阻害性の両方を向上させることを示唆している。また、ペプチド欠失シリーズ から、これらの残基が、ペプチドの結合を媒介する１０残基の中にあることは明 らかである。 従って、このことをさらに実験するために、我々は、VV95；96AA及びD92A突然 変異を、高度に精製したペプチドに導入したが、このペプチドは、生物学的膜を 通した転位のためのアンテナペディア ホメオドメインの第３のドメインに結合 され、cdk4及びcdk6へのペプチド結合性に重要と思われる残基が、全長タンパク 質の離脱にも影響を与えるか否化を見るために、VV95;96AAは全長タンパク質に 導入された。VV95;96AA突然変異は、His標識された野生型p16に導入され、大腸 菌で発現され、対応するペプチドは99.9％の純度で合成された。 図６Ａ及び６Ｂは、これらの実験の結果を示す。結果は、VV９５、96AAの２つ の置換を持つペプチド２１が、in vivoにおいてかなり低い活性を持つことを示 している。また、同じペプチドは、in vitroでのcdk−サイクリンＤキナーゼ活 性の阻害においても活性が低かった。このことは、これらの残基がペプチドのcd k4及びcdk6に対する結合性にとって重要であることを示唆した上述の最初のアラ ニン走査の結果を確認するものである。 His標識した野生型のp16タンパク質に同じ置換を施すと、類似のキナーゼ阻害 活性の喪失が観察された（いずれの場合も、50％キナーゼ活性阻害濃度は、約５ 倍に上昇した）。我々は、特定の理論に結びつけるつもりはないが、これらの結 果は、これらの残基が、p16のペプチドフラグメント並びに全長タンパク質のcdk 4及びcdk6への直接結合に含まれる、即ち、キナーゼ阻害の機構は全長p16とここ で述べたペプチドフラグメントとで同じであるという見方をさらに支持する。 in vivoにおいて、同じ濃度で、ペプチド２０は、HaCaT細胞のＳ相への導入を 殆ど完全にブロックするが、ペプチド２１は、10μMのペプチド濃度で、加減に 近い効果を有するのみである。 異なる細胞系におけるp16に対する反応 上述のペネトラチンに結合したp16ペプチドに対する反応について、p16(-/-) で あるマウス（knockouts）及び平常マウスp16(+/+)からのマウス胚繊維芽細胞（M EF）を試験した。ペネトラチンに結合したp16ペプチドの同量で12時間処理した 後、Ｇ１における細胞集団の増加が、(+/+)は9％であったのに比較して、(-/-) では42％であった。２４時間後、図は5％に対して22％であった。同時に、Ｓ相 における減少は、30％(+/+)に対して33％であった。これらの結果を考え合わせ ると、p16(-/-)HEFは、p16ペプチドに対して(+/+)より感受性が高いことを示唆 されている。 また我々は、他の数種の細胞系を試験し、繊維芽、上皮及び筋肉由来の細胞に おいて効果を見たところ、これらは、p16ペプチドに対して類似の成長阻害を示 した。比較のための（pRb陰性細胞系である）Saos 2において成長阻害が観察さ れないことから、p16の生物学的活性がpRbリン酸化の阻害を介することが確かめ られた。これらの結果は表１にまとめた。 我々は、p16ペプチドが、マウス筋芽細胞（C2C12細胞）の筋管への分化を阻害 するか否かを見る実験も行った。これらの結果は、C2C12細胞を0.5％のFCS媒質 中に置くと、それらは多核性筋管から成長を停止した。しかし、それらをp16ペ プチドで処理すると、成長停止に加えて、0.5％のFCS存在下での多核性筋管の形 成も阻害した。 表１ 成長阻害剤 試験した細胞系 p16ペプチドの効果 源 p16(-/-) ＋＋ C2C12 ＋＋ HaCaT ＋＋＋ ヒトケラチン細胞系ヒト 一次ケラチン細胞 ＋＋＋ MRC5 ＋ ヒト繊維芽 MCF7 ＋＋＋ ヒト肺癌由来系 MEF+/+ ＋ マウス胚繊維芽p16陽性 3T3 ＋＋ マウス繊維芽系 Saos 2 − pRb陰性腫瘍細胞系 また我々は、p16ペプチドで処理された上皮細胞が細胞コロニーのモルホロジ ーをより密に変化させ、会合して表現系となることを観察した。これは、細胞培 養 皿への細胞接着性の向上を伴い、トリプシン処理後に細胞が剥離する前の時間を ６倍に増大させ、ペプチドが細胞接着性を変化させることを示している。細胞接 着性の修正は、腫瘍が広がって二次腫瘍を形成することの防止、腫瘍細胞の侵襲 性を修正する方法の提供という応用ができる。 最後に、Beta-Galアッセイでの測定によると、予備的な結果は、ペプチドが、 ヒトのケラチン細胞由来の細胞（HaCaT細胞）における老化を伴うことを示唆し ている。また、p16タンパク質の生理学的機能の１つは老化機構を含み、それはi n vivoでの腫瘍抑制機能と関連している可能性があるので、これは重要である。 細胞における老化を測定するアッセイは、Dimri，et al.，P.N.A.S.，1995，939 6頁以降に記載されている。 ＦＡＣＳ分析 図７は、２０aaペプチド（ペプチド６、V95,96AA及びD92A突然変異p16ペプチ ド）と１６aaのペネトラチン配列に結合した３６aaペプチドである３つの異なる ペプチドで処理したHaCaT細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す。これらのグラフは、F CSを得ていない細胞はＧ１相にあり、ペプチドの添加によって完全に停止するこ とを示している。 結論 これらの結果は、p16タンパク質の残基８４から１０３に相当する２０aaの合 成ペプチドが、全長野生型p16タンパク質について記述されている本質的な生化 学的及び生物学的特性を擬態することができることを示す。最も重要なのは、小 さなキャリア分子に結合したペプチドが、組織培養媒質に直接炭化した後に、in vivoにおいて細胞増殖を阻害する能力を持つことを見出したことである。この 方法は一般的に、in vivoでの生物学的事象の研究における小さな分子の応用に 広げることができ、この場合、治療的応用における特定の抑制遺伝子機能の置換 、新規な抗増殖薬に対する標的の同定のためのモデルとしての提供が可能となる 。 多数の異なる腫瘍が、pRbリン酸化調節過程において、cdk4及びサイクリンＤ １ の過発現を含む欠陥を露呈するのと同様に、p16機能の低下を示している。これ ら全ての腫瘍は、in vivoでのcdk-サイクリンＤ活性を阻害する薬剤のための候 補となり得る。 参考文献 この出願で挙げた参考文献は、ここに全て参考として取り入れる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年９月２６日（１９９７．９．２６） 【補正内容】 請求の範囲 １．サイクリン依存キナーゼ(cdk)4及びcdk6に結合する特性を有する物 質であって、 アミノ酸配列DAAREGFLDTLVVLHRAGARを含むp16ペプチドフラグメント、あるい は、cdk4またはcdk6に結合する特性を有するその活性部分または誘導体を含み、 Ｎ−末端Metの有無によらず、全長p16、p15、p18及びp19タンパク質以外である 物質。 ２．p16ペプチドフラグメントが、２０以下のアミノ酸長である請求項 １記載の物質。 ３．サイクリン依存キナーゼ(cdk)4及びcdk6に結合する特性を有する物 質であって、 アミノ酸配列DAAREGFLDTLVVLHRAGARを含むp16ペプチドフラグメント、あるい は、cdk4またはcdk6に結合する特性を有するその活性部分または誘導体を含む物 質。 ４．p16ペプチドフラグメントが、アミノ酸モチーフFLD、及び／または 、LVVLを含む請求項１から３のいずれかに記載の物質。 ５．p16ペプチドフラグメントが、FLDxLVVLのアミノ酸モチーフを含み 、xが１又はそれ以上のアミノ酸を表す請求項４記載の物質。 ６．p16ペプチドフラグメントのアスパラギン酸残基が、全長p16タンパ ク質の９２位に相当する位置において、疎水性アミノ酸残基に置換された請求項 １から５のいずれかに記載の物質。 ７．疎水性アミノ酸残基がアラニンである請求項６記載の物質。 ８．ｐ１６ペプチドフラグメントに結合した結合パートナーを含む請求 項１から７のいずれかに記載の物質。 ９．結合パートナーがキャリア分子であり、当該物質が細胞に輸送され 得るようにされた請求項８記載の物質。 １０．キャリア分子が、アンテナペディアホメオドメインから誘導され たペプチドを含む請求項９記載の物質。 １１．結合パートナーが安定化分子である請求項１から１０のいずれか に記載の物質。 １２．安定化分子がペプチドである請求項１１記載の物質。 １３．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の１またはそれ以上を 、生理学的に許容されるキャリアとともに含有してなる製薬組成物。 １４．医療的処置に用いるための請求項１から１２のいずれかに記載の 物質。 １５．過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における、請求項１から１２に いずれかに記載の物質の使用。 １６．過剰増殖疾患が、癌、乾癬または動脈発生である請求項１５記載 の使用。 １７．請求項１から１２のいずれかに記載の物質をコードする単離され た核酸。 １８．発現調節配列に調節可能に結合した請求項１７記載の核酸分子を 取り込んだベクター。 １９．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の、(i)前記物質とサ イクリン依存キナーゼ(cdk)4またはcdk6への結合について競合する特性を持つ化 合物、または、(ii)前記物質の結合パートナーである化合物をスクリーニングす る方法における使用。 ２０．請求項１から１２のいずれかに記載の物質と、サイクリン依存キ ナーゼ(cdk)4またはcdk6への結合について競合する化合物を同定する方法であっ て、 (a)予め設定した量の検出可能なラベルをした物質をcdk4またはcdk6に 結合させ、 (b)候補となる化合物を添加し、そして、 (c)cdk4またはcdk6に結合したままのラベル化合物の量、あるいは、候 補となる化合物で置換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる方法 。 ２１．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の類似物を同定する方 法であって、 (a)１またはそれ以上の候補となる化合物を固体基質上に固定化し、 (b)該基質をラベル化サイクリン依存キナーゼ(cdk)4またはcdk6に曝し 、 (c)cdk4またはcdk6に結合した候補化合物を選択することを含んでなる 方法。 ２２．cdk4またはcdk6が、網状赤血球溶解物中で生成される請求項２０ または２１記載の方法。 ２３．サイクリン依存キナーゼが、cdk4またはcdk6である請求項２０か ら２２のいずれかに記載の方法。 ２４．候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及 び／または該化合物の細胞がＳ相へ入ることを阻害する特性について試験するこ とを更に含む請求項２０から２３のいずれかに記載の方法。 ２５．候補化合物が、合成結合ライブラリから選択される請求項２０か ら２４のいずれかに記載の方法。 【手続補正書】 【提出日】平成１１年４月１４日（１９９９．４．１４） 【補正内容】 特許請求の範囲 １．サイクリン依存キナーゼ(cdk)4及びcdk6に結合する特性を有する物 質であって、 アミノ酸配列DAAREGFLDTLVVLHRAGARを持つペプチド、あるいは、cdk4またはcd k6に結合する特性を保持する当該ペプチドの活性部分または誘導体であり、前記 ペプチド、活性部分または誘導体が、２０以下のアミノ酸長である物質。 ２．ペプチドの活性部分が、アミノ酸モチーフFLD、及び／または、LVV Lを含む請求項１記載の物質。 ３．ペプチドの活性部分が、アミノ酸モチーフFLD及びLVVLを含み、そ れらが１またはそれ以上のアミノ酸で離間している請求項２記載の物質。 ４．ペプチドまたはその活性部分のアミノ酸モチーフFLDにおいて、ア スパラギン酸残基が疎水性アミノ酸残基で置換された請求項１から３のいずれか に記載の物質。 ５．疎水性アミノ酸残基がアラニンである請求項４記載の物質。 ６．結合パートナーに結合した請求項１から５のいずれかに記載の物質 。 ７．結合パートナーがキャリア分子であり、当該物質が細胞に輸送され 得るようにされた請求項６記載の物質。 ８．キャリア分子が、アンテナペディアホメオドメインから誘導された ペプチドを含む請求項７記載の物質。 ９．結合パートナーが安定化分子である請求項１から８のいずれかに記 載の物質。 １０．安定化分子がペプチドである請求項９記載の物質。 １１．請求項１から１０のいずれかに記載の物質の１またはそれ以上を 、生理学的に許容されるキャリアとともに含有してなる製薬組成物。 １２．医療的処置に用いるための請求項１から１０のいずれかに記載の 物質。 １３．過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における、請求項１から１０に いずれかに記載の物質の使用。 １４．過剰増殖疾患が、癌、乾癬または動脈発生である請求項１３記載 の使用。 １５．請求項１から１０のいずれかに記載の物質をコードする単離され た核酸。 １６．発現調節配列に調節可能に結合した請求項１５記載の核酸分子を 取り込んだベクター。 １７．請求項１から１０のいずれかに記載の物質の、(i)前記物質とサ イクリン依存キナーゼ(cdk)4またはcdk6への結合について競合する特性を持つ化 合物、または、(ii)前記物質の結合パートナーである化合物をスクリーニングす る方法における使用。 １８．請求項１から１０のいずれかに記載の物質と、サイクリン依存キ ナーゼ(cdk)4またはcdk6への結合について競合する化合物を同定する方法であっ て、 (a)予め設定した量の検出可能なラベルをした物質をcdk4またはcdk6に 結合させ、 (b)候補となる化合物を添加し、そして、 (c)cdk4またはcdk6に結合したままのラベル化合物の量、あるいは、 候補となる化合物で置換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる方 法。 １９．cdk4またはcdk6が網状赤血球溶解物から生成される請求項１８記 載の方法。 ２０．サイクリン依存キナーゼが、cdk4またはcdk6である請求項１８ま たは１９に記載の方法。 ２１．候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及 び／または該化合物の細胞がＳ相へ入ることを阻害する特性について試験するこ とを更に含む請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。 ２２．候補化合物が、合成結合ライブラリから選択される請求項１８か ら２１のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性を有する物質であ って、 (i)全長p16タンパク質のアミノ酸残基８４から１０３、あるいは、その活性部分 または誘導体を含むペプチド、または、 (ii)そのフラグメント、活性部分または誘導体の機能的類似物を含有し、全長p1 6、p15、p18及びp19タンパク質以外である物質。 ２．サイクリン依存タンパク質が、cdk4またはcdk6である請求項１記載 の物質。 ３．物質のサイクリン依存タンパク質への結合が、pRbリン酸化の阻害 を生ずる請求項１または２記載の物質。 ４．ペプチドが、全長p16タンパク質のアミノ酸残基８９から９７を含 む請求項１から３のいずれかに記載の物質。 ５．ペプチドフラグメントが、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０ から９２に相当するアミノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質の アミノ酸残基９４から９７に相当するLVVLを含む請求項１から４のいずれかに記 載の物質。 ６．ペプチドフラグメントが、FLDxLVVLのアミノ酸モチーフを含み、x が１又はそれ以上のアミノ酸を表す請求項５記載の物質。 ７．ペプチドフラグメントのアスパラギン酸残基が、全長p16タンパク 質の９２位に相当する位置において、疎水性アミノ酸残基に置換された請求項１ から６のいずれかに記載の物質。 ８．疎水性アミノ酸残基がアラニンである請求項８記載の物質。 ９．p16、p15、p18またはP19タンパク質から誘導された請求項１から８ のいずれかに記載の物質。 １０．キャリア分子に結合し、当該物質が細胞に輸送され得るようにさ れた請求項１から９のいずれかに記載の物質。 １１．キャリア分子が、アンテナペディアホメオドメインから誘導され たペプチドを含む請求項１０記載の物質。 １２．ペプチドフラグメントが安定化分子に結合した請求項１から１１ のいずれかに記載の物質。 １３．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の１またはそれ以上を 、生理学的に許容されるキャリアとともに含有してなる製薬組成物。 １４．医療的処置に用いるための請求項１から１２のいずれかに記載の 物質。 １５．過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における、請求項１から１２に いずれかに記載の物質の使用。 １６．過剰増殖疾患が、癌、乾癖または動脈発生である請求項１５記載 の使用。 １７．請求項１から１２のいずれかに記載の物質をコードする核酸。 １８．発現調節配列を結合した請求項１７記載の核酸を取り込んだベク ター。 １９．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の、(i)前記物質の生 物学的活性の１又はそれ以上を有する化合物、または、(ii)前記物質の結合パー トナーである化合物をスクリーニングする方法における使用。 ２０．請求項１から１２のいずれかに記載の物質と競合する化合物を同 定する方法であって、 (a)予め設定した量の検出可能なラベルをした物質をサイクリン依存キ ナーゼ（cdk）に結合させ、 (b)候補となる化合物を添加し、そして、 (c)cdkに結合したままのラベル化合物の量、あるいは、候補となる化合 物で置換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる方法。 ２１．請求項１から１２のいずれかに記載の物質の類似物を同定する方 法であって、 (a)１またはそれ以上の候補となる化合物を固体基質上に固定化し、 (b)該基質をラベル化サイクリン依存キナーゼ（cdk）に曝し、 (c)cdkに結合した候補化合物を選択することを含んでなる方法。 ２２．cdkが、網状赤血球溶解物中で生成される請求項２０または２１ 記載の方法。 ２３．サイクリン依存キナーゼが、cdk4またはcdk6である請求項２０か ら２２のいずれかに記載の方法。 ２４．候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及 び／または該化合物の細胞がＳ相へ入ることを阻害する特性について試験するこ とを更に含む請求項２０から２３のいずれかに記載の方法。 ２５．候補化合物が、合成結合ライブラリから選択される請求項２０か ら２４のいずれかに記載の方法。 ２６．全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０から９２に相当するアミ ノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９４から９ ７に相当するLVVLを含むp16タンパク質のフラグメントの、前記アミノ酸モチー フの三次元構造に類似するようにモデル化された有機化合物の設計における使用 であって、当該有機化合物が、サイクリン依存タンパク質に結合する、及び／ま たはpRbリン酸化を阻害する特性を有する使用。