JPH10509312A

JPH10509312A - ｐ２１▲上ＷＡＦ１▼−ＰＣＮＡ相互作用部位の同定とその治療における応用

Info

Publication number: JPH10509312A
Application number: JP8515137A
Authority: JP
Inventors: フィリップレイン，デイヴィッド; スザンヌコックス，リンヌ; ワーブリック，エンマ; ムーアグローヴァー，デイヴィッド
Original assignee: サイクラセルリミテッド
Priority date: 1994-11-03
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1998-09-14
Also published as: DE69516416D1; US6242201B1; AU694574B2; WO1996014334A1; ATE191922T1; GB9422175D0; CA2203909A1; EP0789711A1; AU3811395A; EP0789711B1; DE69516416T2

Abstract

(57)【要約】ＰＣＮＡに結合する特性を備えた物質が開示されており、この物質はｐ２１^WAF1アミノ酸配列の１４１〜１６０残基を含むｐ２１^WAF1タンパク質のフラグメント、もしくはその活性部位または誘導体、あるいは（ii）前記タンパク質フラグメントの機能的ミメティックを含む。特に、ＰＣＮＡ結合活性は、配列モチーフＱＴＳＭＴＤＦＹの内部にあることが証明され、このモチーフにおいて太字で示された残基はＰＣＮＡ結合に決定的であり、下線が付された残基は重要である。これらの物質は、ガンもしくは乾癬等の過剰増殖疾患等の、ＰＣＮＡが関与した疾患の治療において使用することができ、ＰＣＮＡに結合する物質は、ＰＣＮＡを不活性化もしくはそのレベルを機能的に枯渇させる。ＰＣＮＡに結合する候補ペプチドを選別する酵母の二つのハイブリッドスクリーニング技術も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ｐ２１^WAF1−ＰＣＮＡ相互作用部位の同定とその治療における応用発明の技術分野本願発明は、癌の治療の分野に関するものである。より詳しくは、本願発明は、増殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen)（ＰＣＮＡ）に結合するｐ２１^WAF1の領域、並びにこの領域に基づく物質、フラグメントおよびミメティック（模倣物(mimetic)）の同定に関する。また、本願発明は、これらの分子を含んだ薬学的組成物、並びに、例えば腫瘍および他の過剰増殖細胞における、ＤＮＡ複製もしくはＰＣＮＡ結合を阻害するための治療適応用における使用にも関する。発明の背景ｐ２１^WAF1は、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３によって転写的に誘導され、細胞周期のＧ１およびＳ期におけるサイクリン依存性キナーゼ類（Ｃｄｋｓ）の有効な阻害剤として作用するタンパク質である。しかして、ｐ２１^WAF1は、少なくとも部分的にＣｄｋ活性を阻害することによってｐ５３チェックポイント経路の活性化に応じて細胞周期の制御因子（レギュレーター）として作用する（１−３）。ｐ２１^WAF1は、ｐ２１^CIP1（９）、ｐ２１^pic（３３）、ｐ２０^CAP（３４）およびＳｄｉ１（３５）としても知られている。ｐ２１^WAF1とＣｄｋ類は、代謝的に活性化および不活性化した形態で存在することができ、制御が微妙な効果であることを示唆している（４）。ｐ２１^WAF1は、in vitroで高濃度でＰＣＮＡに結合すること、並びにＤＮＡ複製をブロックすることについても報告されている（５）。ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製および修復において必須の役割を演じるポリメラーゼδに対する進行因子(processivity fact or)である（６、７）。形質転換した細胞系統において、ｐ２１^WAF1の発現は抑制されており、サイクリン依存性キナーゼは、複合体の化学量論は明確でないにしろ、Ｃｄｋ／サイクリン／ｐ２１^WAF1／ＰＣＮＡ複合体としてよりも、Ｃｄｋ／サイクリンバイナリー状態で見出される（１、８−１０）。しかして、細胞増殖のｐ５３−仲介抑制の間、ｐ２１^WAF1が細胞周期の進行、ＤＮＡ複製および損傷したＤＮＡの修復を調整するのに重要らしい。発明の概要我々は、ｐ２１^WAF1が、in vivoかつ先に報告されていた濃度より遥かに低い濃度でＰＣＮＡと相互作用することを見出した。ＰＣＮＡとの相互作用に係るｐ２１^WAF1の領域のマッピングについても開示されている。特に、出願人は、ｐ２１^WAF1のＣ末端領域から誘導されたペプチドがＰＣＮＡに結合することを見出し、ＤＮＡ複製の阻害の原因となることを示した。ｐ２１^WAF1とサイクリン−Ｃｄｋ類およびＰＣＮＡとの相互作用は、細胞増殖および細胞周期コントロールを調整するためにｐ２１^WAF1を用いる可能性を提供する。出願人は、ｐ２１^WAF1のＣ末端部位とＰＣＮＡとの間のin vivo相互作用を立証するために、酵母に二つのハイブリッドスクリーニング技術を用いた。特に、ｐ２１^WAF1のタンパク質配列を示す一連の重複ペプチドの分析により、ＰＣＮＡに対する高い親和性と結合選択性を示し、かつ、濃度に依存してin vitroにおけるＳＶ４０のＤＮＡ複製を阻害する、２０アミノ酸ペプチド（１４１−１６０）を同定した。さらなる実験により、ＰＣＮＡ結合および阻害に必須な残基が、配列ＱＴＳＭＴＤＦＹに定義付けられたモチーフの内部に存在することが示された。ＰＣＮＡ（正常細胞と腫瘍細胞の両方に由来する）とｐ２１^WAF1ペプチドとの相互作用における高い親和性は、ガンもしくは乾癬等の、ＰＣＮＡが関与した腫瘍治療および過剰増殖疾患の治療において、これらのペプチド、もしくはそのフラグメントまたはミメティックを使用できることを意味する。さらに、一つの態様として、本願発明はＰＣＮＡに結合する特性を備えた物質を提供し、前記物質は、（i）ｐ２１^WAF1アミノ酸配列の１４１〜１６０残基を含むｐ２１^WAF1タンパク質のフラグメント、もしくはその活性部位または誘導体、（ii）前記タンパク質フラグメントの機能的ミメティックを含む。本願発明では、“活性部位”とは、前記のｐ２１^WAF1アミノ酸配列の全長よりも短いが、ＰＣＮＡに結合する特性を保持したペプチドを意味する。本願発明では、“機能的ミメティック”とは、ｐ２１^WAF1アミノ酸配列の活性部位を含まなくてもよく、おそらくはペプチドではないが、ＰＣＮＡに結合する特性を備えた物質を意味する。本願発明では、“誘導体”とは、例えば、タンパク質をコードする核酸の操作、もしくはタンパク質そのものの変更等の、タンパク質のアミノ酸配列を変更することによって修飾されたｐ２１^WAF1タンパク質のフラグメントを意味する。未変性のアミノ酸配列のこのような誘導体は、根本的にタンパク質の本質的な活性を変えることなく、一つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失もしくは置換を含んでもよい。好ましくは、ｐ２１^WAF1タンパク質のフラグメントはｐ２１^WAF1アミノ酸配列の残基１４４〜１５１を含み、これらの残基は配列モチーフＱＴＳＭＴＤＦＹを定義する。この配列において、太字で示された残基はＰＣＮＡ結合に決定的であり、下線が付された残基は重要である。しかして、一つの実施態様では、本願発明は、ｐ２１^WAF1のＣ末端領域に基づいたあるクラスのペプチドを提供する。これらの化合物を、ガンおよび乾癬等の過剰増殖疾患を含む、ＰＣＮＡが関与する症状を治療するための薬品の調製に使用することもできる。これらのペプチドは、好ましくは、図４ｂに示されているように、配列モチーフＫＲＲＱＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＬＩＦＳを含むか、さらに好ましくは、配列モチーフＱＴＳＭＴＤＦＹおよびこれらのペプチドの機能的変異体もしくはミメティックを含む。さらなる態様では、本願発明は、一つ以上の上記ペプチドもしくはミメティックを含むＤＮＡ複製および／またはＰＣＮＡの結合を阻害するための薬学的組成物を提供する。任意に、薬学的組成物は、生理学的に使用可能なキャリアーと組み合わせて一つ以上の上記物質を含む。さらなる態様では、本願発明は、特に腫瘍細胞等の、細胞内のＰＣＮＡの不活性化もしくは機能的枯渇化等の、医学的治療方法における使用のために、上記ペプチド、ミメティックおよび組成物を提供する。さらなる態様では、本願発明はＰＣＮＡに結合するポリペプチドを選別する方法を用い、この方法は、（i）Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＰＣＮＡとの融合体を発現することのできるベクターで、Ｇａｌ１プロモーターの制御下で一つ以上のレポーター構成物を発現することが可能な酵母細胞を形質転換する、（ii）Ｇａｌ４の活性化ドメインと所定の候補ポリペプチドの融合体を発現することのできる一つ以上のベクターで前記酵母細胞を形質転換する、（iii）候補ポリペプチドがＰＣＮＡに結合した際に引き起こされるレポーター構成物の生成を検出して、Ｇａｌ４転写活性を再構成する、ことを含む。この方法は、より特異的にｐ２１^WAF1におけるＰＣＮＡ結合部位を定義するために人工的に合成されたペプチドとＰＣＮＡとの間の相互作用を検出するために以下に用いられる。しかしながら、ＰＣＮＡ結合活性について、例えばミメティック等の候補ペプチドをスクリーニングするために容易に用いることができる。既知の薬学的活性化合物に対するミメティックの設計は、“リード”化合物に基づいた薬品の改良に対する既知のアプローチである。これは、活性化合物が合成するのに困難もしくは高価である場合、あるいは、特定の投与方法に対して不適切である場合に望ましく、例えばペプチドは消化管でプロテアーゼによって急速に分解されがちであるので経口組成物に不適切な活性剤である。ミメティック設計、合成および試験は、一般的に標的特性について多数の分子を不特定にスクリーニングすることを避けるために一般的に用いられる。所定の標的特性を備えた化合物からのミメティックの設計に一般的に採用されるいくつかのステップがある。最初に、標的特性の決定に決定的および／または重要な化合物の特定部位が決定される。ペプチドの場合、例えば順番に各々の残基を置換することによって、ペプチドのアミノ酸残基を組織的に変えることによって行うことができる。化合物の活性領域からなるこれらの部分もしくは残基は、その“ファーマコホア(pharmacophore)”として知られている。ファーマコホアが一端見出されれば、その構造は、例えば立体化学、結合、大きさおよび／またはチャージ等の物理的特性に基づいて、例えば分光学的技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ等のある範囲の出所からのデータを用いて、モデル化することができる。コンピューター解析、類似性マッピング（原子間の結合よりも、ファーマコホアのチャージおよび／または体積をモデル化する）および他の技術を、このモデル化方法に用いることができる。このアプローチの変形では、リガンドとその結合パートナーの３次元構造がモデル化される。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが、結合の際にコンホメーションを変化する場合に特に使用することができ、ミメティックの設計にこのモデルを考慮することができる。次いで、鋳型分子が選択され、それにファーマコホアを模倣する化学的な基をグラフト（移植）することができる。鋳型分子およびそれにグラフトされた化学的な基は、リード化合物の生物学的活性を維持する一方で、ミメティックが容易に合成され、薬学的に使用でき、かつ、in vivoで分解しないように、都合よく選択することができる。このアプローチで見出されたミメティックもしくはミメティック類は、標的特性を備えているか否か、あるいはどの程度までそれを示すかを調べるためにスクリーニングすることができる。さらに、in vivoもしくは臨床試験用の一つ以上の最終的なミメティック類に至るように、最適化もしくは修飾を行うことができる。図面の簡単な説明図１：二つのハイブリッドシステムを用いたＰＣＮＡ相互作用タンパク質類（ｐｉｐ）を検出する手段プラスミドpas-pcnahsを、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１４７；Ｇａｌ４^AS）とヒトＰＣＮＡとのハイブリッドタンパク質を発現するように構成した（１３）。このプラスミドを、ＧＡＬ１プロモーターの制御下にレポーター遺伝子ｌａｃＺ（E.coli）とＨＩＳ３（S.cerevisiae）を発現するS.cerevi siae株Ｙ１９０に形質転換した（３０）。得られた形質転換体は、この株におけるレポーター構成物のいずれも、すなわち、ｌａｃＺ（β-ガラクトシダーゼのフィルターリフトアッセイによって決定）（３１）またはＨＩＳ３（ロイシンを補い、かつ、５０ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有するＳＤＡ（ＳＤとアデニン）で生育することによるアッセイ）（１４）のいずれも活性化しなかった。次いで、この形質転換株そのものを、Ｇａｌ４の活性化ドメイン（アミノ酸７６８−８８１）を備えた融合構成物としてｃＤＮＡを発現するベクターｐＡＣＴ中のヒトｃＤＮＡライブラリーで形質転換した（１２）。ライブラリーにコードされたＰＣＮＡ相互作用タンパク質類（Ｐｉｐ）を含有する形質転換体は、Ｇａｌ４活性の再構成を引き起こし、しかして、レポーター構成物を発現させる。これらを、３−アミノトリアゾールを含むＳＤＡにプレートすることによって選別したが、一方、形質転換頻度を調べるために３−アミノトリアゾールを含まないＳＤＡに一定分量をプレートした。陽性と見られるものを上述したようにｌａｃＺ発現について試験し、３−アミノトリアゾール含有ＳＤＡに画線し、さらなる分析のために単一のコロニーを単離した。ｃＤＮＡライブラリープラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＡ２２６に取り込んだ(rescued)（３２）。図２：二つのハイブリッドスクリーニング結果の概要棒は、水平および垂直軸に名称が付されたプラスミドに示されるように、形質転換株で行われたβ-ガラクトシダーゼコロニーリフトアッセイの結果を示す。ｐＨＳｐｉｐ９とｐＨＳｐｉｐ３１は、明細書に記載されているようにＧａ１４ −ｐ２１^WAF1融合物をコードする。ｐＳＰｐｉｐ３５は、ｐｃｎ１⁺がフレーム内(in-frame)で発現されるようにＳ．ポンベ（S.pombe）のＰＣＮＡ遺伝子ｐｃｎ１⁺の上流配列に融合されたＧａｌ４^ACTドメインをコードする。また、全ての形質転換体を、Ｈｉｓ３の発現を調べるために、適切な補足と３ −アミノトリアゾールを含んだＳＤＡ上に画線した。両方の試験において陽性であった形質転換体のみを、真の陽性としてカウントした。黒色の棒は、両方の試験における強力な陽性の結果を示し、網掛けの棒は、弱い陽性の結果を示し、白色の棒は陰性の結果を示す。ｐＡＳ−ｐｃｎａプラスミドは、ベクターｐＡＳ２中にそれぞれ、ホモサピエンス（Homo sapiens(HS)）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster(Dm)）、および、シゾサッカロミセスポンベ（Schiz osaccharomyces pombe(Sp)）のＰＣＮＡの完全な読み枠（オープン・リーディング・フレーム）を含む。対照プラスミドｐＡＳ−ＳＮＦ１、ｐＡＳ−ｐ５３、ｐＡＳラミンおよびｐＡＳ−ＣＤＫ２は、Harperらによって記載されている（９）。図３：ＰＣＮＡにおけるｐ２１^WAF1相互作用領域の同定ＰＣＮＡ分子内に構造ドメインを示唆する図式的ダイアグラム。数字は、Kong ら（１８）に示唆されたβ-シートドメイン、およびα-ヘリックスを示す。下の棒は、Ｇａｌ４^ACTとの融合体として発現されたＰＣＮＡの領域を示し、右欄（＋／−）は、二つのハイブリッドシステムにおけるｐ２１^WAF1との相互作用について調べた場合の陽性／陰性結果を示す（３２）。図４：ｐ２１^WAF1のペプチドとＰＣＮＡ結合のペプスキャン(pepscan)分析（ａ）ペプチド１−１１は、隣接するペプチド間に重複を備えたｐ２１^WAF1の完全なタンパク質配列を示す（１）。ペプチド６３はＰＣＮＡのＣ末端の１５アミノ酸を示す。（ｂとｃ）ｐ２１^WAF1ペプチドをストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡ皿上でインキュベートし、このプレートを徹底的に洗浄して、HeLa、アフリカツメガエル(Xenopus)、もしくはE.coli BL21過剰発現ＰＣＮＡからの細胞抽出物を添加した（ｂ）。（ｃ）では、ＢＬ２１由来の精製されたヒトＰＣＮＡを、ＥＬＩＳＡで同じペプチドの並びにおけるこれらの細胞の粗な溶解物と比較した。粗雑に洗浄した後、ポリクローナル抗ＰＣＮＡ抗体３００９、およびＨＲＰ-接合抗ウサギ第二抗体を用いて、ＴＭＢ視覚化を行うことによって、結合したＰＣＮＡを検出した。４５０ｎｍの光学密度を測定した。図５：沈降分析を用いたＰＣＮＡ結合に必要なｐ２１^WAF1部位のマッピング（ａ）ストレプトアビジン−アガロースビーズに個別に取り付けられたｐ２１^WA ^F1 の全１１ペプチドをＨｅｌａ細胞抽出物中でインキュベートし、遠心して溶解物から分離した。結合したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＣ１０モノクローナル抗ＰＣＮＡ抗体を用いたウェスタンブロッティング、ＨＲＰ抗マウス二次抗体とＥＣＬ検出によって分析した。ペプチドは図４ａに番号が付されており、Ｈは涸渇していないＨｅｌａ抽出物を示す。分子量マーカーサイズはｋＤａで示されている。ＰＣＮＡの位置は矢印で示されている。（ｂ）モノクローナル抗体ＰＣ１０でプローブしたウェスタンブロット、および（ｃ）種々のヒト腫瘍細胞系の抽出物からのペプチド１０−ストレプトアビジンビーズ沈降物のクーマシー染色ゲル（試験した１４系のうちの７つの結果が示されている）：Ａ４３１（サンプル１）、ＨＯＳ（サンプル２）、ＳＫＢＲ３（サンプル３）、ＢＴ５４９（サンプル４）、ＭＤＡ２３１（サンプル５）、Ｔ４７Ｄ（サンプル６）およびＤＬＤ１（サンプル７）。“ｓ”は、ペプチド−１０ビーズとインキュベートした後の上清を示し、“ｂ”は、ペプチド−１０−ストレプトアビジンアガロースビーズで沈降されたタンパク質を含む。“Ｍ”は分子量の標準の位置を示し、サイズはｋＤａで与えられている。図６：ペプチド１０によるＤＮＡ複製の阻害（ａ）ｐ２１^WAF1の全てのペプチドを、２０ｎｇ／μｌ（斜線の棒）もしくは４０ｎｇ／μｌ（塗りつぶされた棒）の終濃度になるようにin vitro ＳＶ４０複製反応に添加して、４０ｎｇ／μｌペプチドサンプルに等量希釈のＤＭＳＯ、あるいは無添加のものと比較した。３７℃で２時間インキュベーションした後、³ Ｈ−ｄＴＭＰの取り込みをＴＣＡ沈降およびシンチレーション計測により測定した。（ｂ）３０ｎｇ／μｌまでの範囲の濃度における複製反応にペプチド１０を添加して、等量希釈のペプチド溶液ＤＭＳＯと比較した。ラベル取り込みの程度を、上記のように２時間後に分析した。同じ濃度のペプチド９（データ示さず）もしくは溶媒のみでは、ＤＮＡ合成レベルにおける、感知しうる効果を全く示さなかった。図７：ｐ２１^WAF1のＰＣＮＡ最小結合部位の決定（ａ）ｐ２１^WAF1配列から、上記の推定上のＰＣＮＡ結合部位をカバーするようにアミノ酸重複と４アミノ酸の張り出しを備えたペプチドを生成した。（ｂ）これらのペプチドを、図４のように、ＥＬＩＳＡでＰＣＮＡに対する結合力について調べた。（ｃ）複製反応の最初にペプチドを添加することによって、in vitro におけるＳＶ４０ＤＮＡ複製阻害能力を個別に分析した。２時間、３７℃でインキュベーションを行い、³Ｈ−ｄＴＭＰの取り込みをＴＣＡ沈降およびフィルター結合により測定した。図８：ペプチド１０のアラニンスキャニング（ａ）ｐ２１^WAF1の推定上のＰＣＮＡ結合部位（ペプチド１０）における各アミノ酸を、連続的にアラニンに変化させ（“４４”−“６３”）、ペプチド“６４ ”では、同じペプチドの範囲内で、二つのアルギニンをアラニンに変えた。（ｂ）ポリクローナル抗体３００９で検出された、細菌で発現されたヒトＰＣＮＡを用いた、各ペプチドのＰＣＮＡ結合能力を決定するためのペプスキャンＥＬＩＳＡ。（ｃ）in vitroにおけるＳＶ４０ＤＮＡ複製に対するペプチドの効果（図７ｃ）。詳細な説明における以下の実施例は、本発明の種々の態様を例証するためのものであり、発明の範囲を限定するためのものではない。詳細な説明本出願人は、酵母サッカロミセスセレビシア(Saccharomyces cerevisiae)における機能的転写活性化因子の再構成を介してポリペプチド相互作用を検出する二つのハイブリッド相互作用トラップシステムを用いてヒトＰＣＮＡと物理的に相互作用するタンパク質をスクリーニングした（１１，１２）。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４^AS）とヒトＰＣＮＡ（１３）とのハイブリッドタンパク質を発現するプラスミドを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ分子とＧａｌ４の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ（Ｇａｌ４^ACT）とのハイブリッド融合構成物を発現するプラスミドをスクリーニングした（図１）（１２）。１ｘ１０⁶以上の形質転換体から７７のＨｉｓ＋コロニーを拾い出し、そのうちの１４がβ−ガラクトシダーゼを発現した。pAS-pcnahsを用いたコトランスフォーメーション(co-transformation)で再び陽性と判断された１２のこれらの株から、ｐＡＣＴ−誘導ライブラリープラスミドを単離した。ヒトＰＣＮＡ相互作用タンパク質をコードする各プラスミド（ｐＨＳｐｉｐ）を、種々のｐＡＳプラスミドとコトランスフォームすることによって他のＧａｌ４^AS融合物との非特異的相互作用について試験し（図２）、プラスミドを、クロスハイブリダイゼーションとＤＮＡ配列分析によって分類した。各ｐＨＳｐｉｐを、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびシゾサッカロミセスポンベ（Schizos accharomyces pombe）ＰＣＮＡの両方との相互作用についても試験した。１２の陽性のものは３つのクラスに分けられた。一つのクラス（ｐＨＳｐｉｐ９とｐＨＳｐｉｐ３１）は、pAS-pcnahsと特異的な相互作用を示した。配列分析により、これらのプラスミドの両方が、Ｇａｌ４^ACTを備えたフレームでｐ２１^WAF1のＣ末端の８９アミノ酸（８−１０）を発現したことが示されたが、一つのプラスミドのベクター配列は、わずかな再修飾を示した。しかして、ｐ２１^WAF1のＣ末端の半分は、ＰＣＮＡとの相互作用に十分である。以前に、ｐ２１^WAF1の全長をコードするクローンが、ヒトＣｋｄ２を伴った二つのハイブリッドシステムで相互作用することが示された（９）。ここに同定されたｐ２１^WAF1クローンのいずれも、二つのハイブリッドアッセイにおいてヒトＣｄｋ２と積極的に反応せず、このことはｐ２１^WAF1とＣｄｋ２の相互作用がｐ２１^WAF1のアミノ末端の半分に依存していることを示唆している。これを支持するものとして、Ｃｄｋ阻害因子ｐ２１^kip1は、ｐ２１^WAF1のＮ末端領域に似た配列領域を備えており、この領域に対応する５２アミノ酸ペプチド（Ｋｉｐ１［２８−２９］）はＣｄｋ阻害活性を保持している（１５，１６）。 S.pombe ＰＣＮＡ（ｐｃｎ１⁺）と相互作用するタンパク質をコードするS.pom be ｃＤＮＡを探すために、同様のスクリーニングを行った（１７）。同定された二つのクローンは、ｐｃｎ１⁺の完全な読み枠を発現し、このことはＰＣＮＡがそれ自身と相互作用しうることを示している。これらの結果は、Kongら（１８）によって提案されたモデルを支持しており、そのモデルでは、ＰＣＮＡが、ＤＮＡ鎖に複製複合体をつなぐスライド可能なクランプとして作用するホモトリマーを形成する。さらに、ｐｃｎ１＋は、ヒトとキイロショウジョウバエ（D．mel anogaster）ＰＣＮＡの両方と相互作用することが見いだされ、このことはこれらの相互作用が進化の上で保存されていることを示唆している（図２）。ヒトＰＣＮＡは、ＰＣＮＡ−Ｇａｌ４^ACTハイブリッドが二つのハイブリッドシステムにおけるレポーター遺伝子発現を活性化するのに十分なＤＮＡ結合能力を備えているため、このような構成物は二つのハイブリッド相互作用分析に用いられない。ＰＣＮＡの中心領域とｐ２１^WAF1との相互作用Ｇａｌ４^ASに融合したヒトＰＣＮＡの一連のＣ末端欠失構成物を、二つのハイブリッドアッセイでｐ２１^WAF1と相互作用するＰＣＮＡの領域を同定するために試験した（１３）。これらの実験の結果（図３）は、ｐ２１^WAF1がＰＣＮＡの中心領域と相互作用することを示唆している。E.coliのＤＮＡポリメラーゼIIIの βサブユニットとの構造的および配列的に類似することにより、二つの繰り返しドメインからなる３つのＰＣＮＡ分子がＤＮＡ鎖を取り囲むトロイド(toroid)構造を形成するモデルが示唆された（１８）。図３のデータは、二つのドメインを連結する“結合ループ(junctional loop)”とｐ２１^WAF1との相互作用に適合する。ＰＣＮＡとの相互作用に重要なｐ２１^WAF1の部位のペプチドマッピングＰＣＮＡと相互作用するｐ２１^WAF1の部位のマップを精錬するために、ｐ２１^WAF1 配列を示す一連の１１の重複２０マーペプチドの結合力を試験した（図４ａ）（１９）。このアプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用（例えばｐ５３−ＭＤＭ２）および抗体エピトープ（２０−２２）を微細にマップする(fine- map)ために連続的に用いられた。ｐ２１^WAF1ペプチドをビオチンに連結し、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートに取り付けた。Ｈｅｌａ細胞抽出物、アフリカツメガエル卵細胞抽出物、およびヒトＰＣＮＡクローンを過剰発現するE.coli BL21の溶解物（２３）を含む種々の源のＰＣＮＡを、固定されたペプチドの並びに適用した。結合したＰＣＮＡを、未変性および変性ＰＣＮＡのＣ末端の１５アミノ酸を認識するポリクローナル抗体３００９を用いて検出した（２４，２５）。試験された３つの起源のＰＣＮＡは、配列ＫＲＲＱＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＬＩＦＳのペプチド１０に強い特異性で結合する（図４ｂ）。ＰＣＮＡと、最初の４残基以外は全てを備えた隣接するペプチド１１との相互作用は、非常に弱い（細菌で発現されたＰＣＮＡがペプチド１０に対して結合する場合の１３％、ＨｅｌａＰＣＮＡの場合のたった３．８％）。同様の結果がモノクローナル抗体ＰＣ１０を用いた場合にも得られ（２６）、ＰＣＮＡとｐ２１^WAF1のペプチド１０との間の相互作用がＰＣＮＡに特異的であり、抗体の交差反応によるものではないことを示した。この特異性は、ｐ２１^WA ^F1 のペプチド１０に強力かつ特異的に結合する精製されたＰＣＮＡ（２７）を用いて確認された（図４ｃ）。ｐ２１^WAF1ペプチドは、細胞抽出物からＰＣＮＡを沈降させることができる未変性のＰＣＮＡとｐ２１^WAF1ペプチドとの間の相互作用の特異性をさらに確認するために、ペプチドをストレプトアビジン−アガロースビーズに取り付け、ＨｅＬａ細胞抽出物中でインキュベートした。沈降されたタンパク質を電気泳動により分離し、ニトロセルロース上にブロットし、抗ＰＣＮＡモノクローナル抗体ＰＣ１０でプローブした（図５ａ）（２８）。ＰＣＮＡをペプチド１０および弱いがペプチド１１を備えたビーズで沈降させた。ペプチド１０沈降物は未処理の対照抽出物（Ｈｅｌａ）と同量のＰＣＮＡを含んでおり、可溶性ＰＣＮＡの高度に十分な捕獲を示唆している。ＰＣＮＡは、他のあらゆるｐ２１^WAF1ペプチドの沈降において検出されなかった。ＰＣＮＡは、ペプチド１０ビーズにより、他の１４のヒト腫瘍細胞系抽出物から定量的に除去されうる（図５ｂ）。ある場合、例えばＳＫＢＲ３とＢＴ５４９細胞の場合では、細胞抽出物からビーズにＰＣＮＡのほぼ完全な移動が見られた。これは、これらの腫瘍細胞系のＰＣＮＡが、ｐ２１^WAF1を結合する能力については変えられないことを示唆する。ビーズと共に沈降するタンパク質の全体量が無視してよいことから、クーマシーブリリアントブルーで染色された平行ゲルは、ＰＣＮＡとの相互作用が高度に特異的であることを示している（図５ｃ）。ｐ２１^WAF1ペプチド１０ビーズとＰＣＮＡとの相互作用は、バッチ溶出テスト(batch elution tests)において、１００ｍＭグリシンｐＨ２．５、１００ｍＭトリエチルアミンｐＨ１２．５もしくは１４ＭＮａＣｌを用いることによって妨害されず、このことは結合の強さを示している。たったの５００ｐｇのペプチドをＥＬＩＳＡアッセイのウェルに適用した場合でも、強力な結合が検出される。これらの結果は、ペプチド１０ビーズを、ＰＣＮＡの細胞抽出物を涸渇させるために用いてもよいことを示唆し、ＤＮＡ複製および修復におけるＰＣＮＡの作用をさらに明らかにすることに使用可能な道具であることを立証する。ｐ２１^WAF1ペプチド１０によるＳＶ４０ＤＮＡ複製の阻害最近、ｐ２１^WAF1は、ＰＣＮＡを結合すること、およびＳＶ４０ＤＮＡの複製を阻害することが報告されている（５）。それゆえ、in vitroでのＳＶ４０ＤＮＡ複製における効果について２０マーペプチドを調べた（図６ａ）（２９）。全てのペプチドのうちの、ペプチド１０のみがＤＮＡ複製に重要な影響を与え、２０ｎｇ／μｌで対照レベルの５１％、並びに４０ｎｇ／μｌで対照値の３１％まで³Ｈ−ｄＴＭＰの取り込みを減少した。ペプチド１０による複製阻害の濃度依存性は図６ｂに示されている。あるペプチドでは、活性が著しく高く、全長ｐ２１^WAF1タンパク質よりたった１０倍高いモル比を必要とする。従って、細胞におけるＤＮＡ複製阻害および／またはＰＣＮＡへの結合が可能なこれらのペプチドは、ガンや乾癬等の腫瘍および他の過剰増殖疾患の治療において重要な治療的適用を有するかもしれない。ｐ２１^WAF1のＰＣＮＡ結合領域のさらなる同定ＥＬＩＳＡペプスキャン情報に基づいて、新しい代(generation)のペプチドを合成して、ｐ２１^WAF1のＰＣＮＡ結合部位の決定的な残基を調べた。最初に、アミノ酸１２１−１６４のｐ２Ｉ^WAF1配列に基づき、かつ、配列ＫＲＲＱＴＳＭＴＤＦＹＨＳＫＲＲＬＩＦＳの元の反応性ペプチドを含む、４つのアミノ酸の張り出しを備えた、すなわち隣接するペプチドと１６アミノ酸の重複を備えた一連のペプチドを作成することによって、認識配列の最小サイズを調べるために、ペプチド１０の配列をスキャンした（図７ａ）。これらのペプチドを、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡ皿上に固定し、ＢＬ２１細菌で過剰発現されたＰＣＮＡに対する結合を選別した。この並びの８つのペプチドでは、“６８”、“６９”および“７０”と称されるペプチドのみがＰＣＮＡに強力に結合した（図７ｂ）。これらの３つの中で、ペプチド“７０”（元のペプチド１０と同一）は何らかの検出可能な阻害活性を示したが、ラベル取り込みにおけるわずかな減少がペプチド“７１”で観察された（図７ｃ）。興味深いことに、ＰＣＮＡに対する結合能力があるにも関わらず、ペプチド“６８”と“６９”は、ＳＶ４０の複製を阻止する能力を何ら示さなかった。それゆえ、ＫＲＲＱＴＳＭＴＤＦＹＨのモチーフ（もしくはその一部）がＰＣＮＡへの結合に必要であるが、よりＣ末端側の残基ＳＫＲＲＬＩＦＳもＰＣＮＡ結合に貢献しうると結論する。さらに、ペプチド１０の各残基が連続的にアラニンに変えられた一連のペプチド、および二つのアルギニン（図８ａに記載されている）がアラニンに置換された二重変異体を作成した。これらのペプチドをＰＣＮＡ結合力に関してＥＬＩＳＡで試験して、Ｑ、ＤもしくはＹの変異がＰＣＮＡ結合能力を顕著に減少したが、認識には残基ＭとＦが絶対的に必要であることがわかった（図８ｂ）。一般的に、これらの変更されたペプチドでは、最大のＰＣＮＡ結合能力を備えたペプチドが、in vitroにおけるＳＶ４０ＤＮＡの複製をもっとも阻害することができ、逆に、ＰＣＮＡ結合の欠失がＳＶ４０複製の阻害の欠失と相互に関係するが（図８ｃ）、あるペプチド（例えば、Ｎ末端に付加的に５アミノ酸を備え、これに付随してＣ末端の５アミノ酸を欠失したペプチド１０の修飾形態）では、ＰＣＮＡ結合と複製阻害との間の関係は簡単なものではなかった。これらの実験の結果を組み合わせることにより、ＱＴＳＭＴＤＦＹに結合するＰＣＮＡに関連するｐ２１^WAF1の領域を定義することができる。この配列において、太字で示された残基はＰＣＮＡ結合に決定的であり、下線が付された残基は重要なものである。よりＮ末端側のＫＲＲの場合では、例えばｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼによるセリンもしくはスレオニンのリン酸化に共通な部位が観察され、ここに記載されたようなｐ２１^WAF1の一次配列、およびこの領域内の反応しやすい部位のリン酸化によって、結合ＰＣＮＡが制御されうる。さらに、最小結合部位を囲むアミノ酸は、ＰＣＮＡと、in vitroにおけるＳＶ４０ＤＮＡ複製を直接的に阻害する能力等のｐ２１^WAF1の生物学的活性との相互作用の親和性を定義するのに重要らしい。しかして、上記の結果は、酵母二つのハイブリッドスクリーニング法を用いてＰＣＮＡとｐ２１^WAF1のＣ末端領域との間の強力な相互作用を証明する。ｐ２１^WAF1 の２０アミノ酸ペプチドは、ＰＣＮＡと強力かつ特異的に結合し、in vitro におけるＤＮＡ複製を阻害することができる。２０アミノ酸ペプチドの中で、８つのアミノ酸領域が、ＰＣＮＡ結合に重要なｐ２１^WAF1の一部を定義することが見いだされた。しかして、これらの結果により、ゲノムの完全性を傷つけることなく、腫瘍や他の過剰増殖細胞におけるＤＮＡ複製を止めるために治療的に用いられるペプチドもしくはミメティックの開発することができる。本願発明の治療的適用は、ｐ２１^WAF1のＣ末端領域に基づいた上記の種々のペプチドの投与を含み、特に残基１４１−１６０に対応する２０アミノ酸ペプチド、もしくは残基１４４−１５１に対応する８アミノ酸ペプチド、あるいは、これらのペプチドの機能的変異体もしくはミメティックの投与を含む。治療的試薬の種々の投与方法を用いることができ、以下の既知の製剤および方法を用いることができる。投与量は、決まった実験で決定することができる。投与は全身的であっても標的化されていてもよく、後者の場合には、標的細胞に治療的試薬を直接的に（例えば局所的に）適用させてもよく、抗体もしくは細胞特異的リガンド等の標的化システムを使用してもよい。種々の理由、例えば、試薬が許容できないくらいに毒性である場合や、あまりに高度の投与量を必要とする場合や、標的細胞に入り込めない場合等に、標的化することが望ましい。これらの試薬を直接的に投与する代わりに、細胞に導入されたコード遺伝子、例えばウイルスベクターから発現させることによって標的細胞内で産生させることができる（種々のＶＤＥＰＴ技術 − 以下参照）。ベクターを、処理されるべき特異的細胞に標的化することができ、標的細胞によって多かれ少なかれ選択的にスイッチが入れられる制御部を含有させることができる。また、処理されるべき細胞内で産生されるか、あるいは処理されるべき細胞に向けられた活性化試薬によって活性化形態に転換されるように、前駆体の形態で試薬を投与することができる。この種のアプローチは、時としてＡＤＥＰＴもしくはＶＤＥＰＴとして知られ、前者は細胞特異的抗体に結合させることによって細胞に活性化剤を標的化することを含むが、後者はウイルスベクター中のコードＤＮＡから発現することによって、ベクター中の酵素等の活性化剤を産生することを含む（例えば欧州特許公開第４１５７３１号公報および国際特許出願第９０／０７９３６号参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ワーブリック，エンマイギリス国ＤＤ６９ＢＢフィフェテイポートダルグレイシュストリート 32 (72)発明者グローヴァー，デイヴィッドムーアイギリス国ＰＨ２７ＲＢパースエロルインチクーナンズステイブルズコテイジ（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．（i）ｐ２１^WAF1アミノ酸配列の残基１４１−１６０を含むｐ２１^WAF1タンパク質のフラグメント、もしくはその活性部位または誘導体；あるいは（ii）前記タンパク質フラグメントの機能的ミメティックを含む、ＰＣＮＡに対する結合力を備えた物質。２．フラグメントが、決定的なモチーフＱＴＳＭＴＤＦＹのｐ２１^WAF1の残基およびＰＣＮＡ結合活性に重要な残基を任意に含み、該配列において太字で示された残基はＰＣＮＡ結合に決定的であり、下線が付された残基は重要である、請求項１記載の物質。３．フラグメントが、ｐ２１^WAF1アミノ酸配列の残基１４４−１５１を含む、請求項１または２記載の物質。４．ＰＣＮＡに結合することにより、ＰＣＮＡを不活性化もしくはＰＣＮＡレベルを機能的に枯渇させる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の物質。５．請求項１ないし４のいずれか一項に記載の一つ以上の物質を、生理学的に使用可能なキャリアと組み合わせて含む薬学的組成物。６．医療処置の方法に用いる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の物質。７．ＰＣＮＡが関与する疾患を処置するための薬剤の調製における、ＰＣＮＡに結合することによってＤＮＡ複製を阻害する特性を備えた、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の物質の使用。８．物質をＰＣＮＡに結合させることにより、ＰＣＮＡを不活性化もしくはＰＣＮＡレベルを機能的に枯渇させる、請求項７記載の使用。９．疾患が、ガンもしくは乾癬等の過剰増殖疾患である、請求項７または８記載の使用。１０．（i）Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＰＣＮＡとの融合体を発現することのできるベクターで、Ｇａｌ１プロモーターの制御下で一つ以上のレポーター構成物を発現することが可能な酵母細胞を形質転換すること、（ii）Ｇａｌ４の活性化ドメインと所定の候補ポリペプチドの融合体を発現することのできる一つ以上のベクターで前記酵母細胞を形質転換すること、および（iii）候補ポリペプチドがＰＣＮＡに結合した際に引き起こされるレポーター構成物の生成を検出して、Ｇａｌ４転写活性を再構成することを含む、ＰＣＮＡに結合するポリペプチドを選別する方法。１１．ＰＣＮＡ結合活性に対するｐ２１^WAF1タンパク質のペプチドミメティックを選別する、請求項１０記載の方法。