CN106191100A - Sh3结构域非典型配体及其制备方法 - Google Patents

Sh3结构域非典型配体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明针对SH3结构域非典型配体分离鉴定的技术难题，提供一种SH3结构域非典型配体的制备方法，具体包括构建简并随机肽库、构建重组SH3结构域表达载体、肽库选择、阳性克隆测序、序列多重比对分析、配体基序验证等。本发明通过实施上述方法，制备了一系列SH3结构域非典型配体，确定其保守基序为LxLLFF，进而通过免疫沉淀和免疫印迹证实了非典型配体肽与SH3结构域在细胞内相互结合。本发明所述方法及获得的配体为SH3结构域的功能研究、及以构效关系为基础的药物设计等提供依据。

Description

SH3结构域非典型配体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及通过肽库技术研究蛋白质相互作用以获得SH3结构域的非典型配体及配体的保守基序。
背景技术
SH3结构域在细胞内广泛分布，通常由50～100个氨基酸组成，SH3结构域是一种参与调节多生物过程的重要蛋白质相互作用结构域。最初是在v-Src癌基因酪氨酸激酶产物的同源序列中发现该结构域，现已知SH3结构域在许多信号分子和细胞骨架分子中存在。典型的SH3结构域是由五条β折叠，RT loop，N-Src loop，the distal loop和一个310 helix组成。SH3结构域在细胞增殖分化的信号通路中发挥作用，被作为不同类型的癌症研究药物靶点。
SH3结构域的典型配体，包含-P-x-x-P-序列，加上两端的辅助结合位点形成RXXPXXP，PXXPXR的结合基序。目前SH3结构域在药物发现中的研究主要集中在结构相对单一的典型配体。近年来随着对SH3结构域的深入研究，一些SH3结构域的非典型配体相继被报道发现，例如：RKxxYxxY区域与Fyb，Fyn和Lck蛋白的SH3结构域结合。WxxxFxxLE区域与Pex13p蛋白的SH3结构域结合。这些SH3结构域非典型配体的发现一方面表明SH3结构域的功能存在多样性，另一方面也为以SH3结构域活性为对象的癌症药物靶点研究提供基础和依据。
然而，由于SH3结构域典型配体的丰度高、分布广、亲和力强，因此在常规的高通量、大规模筛选过程中，获得的SH3结构域配体绝大多数均为典型配体，很难发现SH3结构域的非典型配体，更难以发现SH3结构域配体的保守基序，因此目前关于SH3结构域非典型配体的报道较少，制约了SH3结构域及其配体的用途。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明提供一种SH3结构域非典型配体及其制备方法。具体而言：
本发明提供一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征包括以下步骤：
步骤一：构建密码子简并的随机肽库；
步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；
步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；
步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；
步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。
本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤一进一步包括：
(1)简并密码子和简并反密码子设计：
使密码子符合以下通式
5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1选自A、T、G，N2选自A、T、C、G，N3选自C、G；或N1选自A、T、C、G，N2选自A、T、G，N3选自C、G；
使反密码子符合以下通式
5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’选自C、G，N2’选自A、T、C，N1’选自A、T、C、G；
(2)肽库编码区的人工合成，人工合成以下两条序列
序列1：
TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；
序列2：
GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA
(3)将序列1、2退火后插入pGADT7载体的NdeI和BamHI之间，获得上述随机8肽的融合表达载体；
(4)将步骤(3)中的表达载体转化感受态大肠杆菌，获得8肽库；
(5)对8肽库的容量和重组率进行鉴定，测得库容达到107级以上，重组率达到90％以上，确定为合格。
本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤二进一步包括：
(1)将SH3结构域序列插入pBridge质粒的EcoRI和BamHI之间，所述SH3结构域选自由hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAb1SH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3组成的组；
(2)将表达SH3结构域的重组pBridge质粒转化于酵母感受态细胞中，筛选获得重组酵母菌。
本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤三进一步包括：
(1)从步骤一获得的随机肽库扩增后，提取并纯化质粒；
(2)用步骤二获得的重组酵母制备感受态细胞，用步骤(1)获得的质粒进行转化，抗性筛选阳性克隆；
(3)对步骤(2)获得的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测；
(4)β-半乳糖苷酶活阳性的克隆，提质粒、测序；
(5)对测序结果进行分析，获得结合SH3结构域的8肽序列。
本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤四进一步包括：使用序列分析软件，对步骤三获得的多个8肽序列进行分析比对，获得SH3结构域配体的肽基序。所述的序列分析软件包括DNASTAR、DNAMAN等。
本发明所述SH3结构域非典型配体的制备方法中，步骤五进一步包括：
(1)从步骤三获得的阳性8肽序列中选择具有SH3结构域配体肽基序的8肽序列，或人工设计具有步骤四所述配体基序的短肽序列；
(2)将所述8肽序列或人工设计的短肽序列插入载体中，使其与SH3结构域在同一个宿主中共表达，验证两者的相互作用。
其中，所述人工设计的短肽序列长度为6-20个氨基酸，优选8个氨基酸。
本发明还提供一种利用所述方法制备获得的SH3结构域非典型配体。
本发明所述SH3结构域非典型配体具有LxLLFF所示的多肽基序，其中x为天然氨基酸。
优选，所述SH3结构域非典型配体具有CILWLLFF的氨基酸序列。
另外，本发明还提供所述的SH3结构域非典型配体在促进或抑制SH3结构域功能中的用途。
本发明取得的技术效果在于：提供了一种简并化肽库的构建和使用方法，成功获得了一系列结构相似的SH3结构域非典型配体，分析出了SH3结构域非典型配体的基序LxLLFF。从而为SH3结构域的作用机理、功能研究、及以构效关系为基础的药物设计等提供依据。
附图说明
图1：库容测量试验中当稀释度为104时的平板计数情况；
图2：肽库选择阳性配体(有两条相同，只显示了9条)的序列比对情况及SH3结构域配体基序分析；
图3：WB检测鉴定结果。泳道1为阴性对照组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体)；泳道2为实验组(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。所述实施例的内容仅用于说明本发明，并不意味着对本发明的保护范围作出限定。
实施例一：肽库的构建
1.人工合成序列1、2所示的核酸，退火成双链。
1)在0.5ml离心管中配制下列反应液Oligo各取500pmol，在1×Annealing Buffer中，95度水浴10分钟，自然降温使之复性形成双链，形成粘性末端(NdeI和BamHI)。
表1退火反应体系
1×Annealing Buffer 20μl
Oligo 500pmol
ddH20 至总体积20μl
2)酶切产物用等体积的酚/氯仿抽提一次，10,000rpm离心2min，吸上清于另一管中；
3)估计上清的体积，加入1/10体积的NaAc(3M)溶液，然后加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀10min；
4)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两遍；
5)室温干燥沉淀，然后溶于适量ddH20中。用紫外分光光度计测量所得DNA的浓度与纯度。
2.将pGADT7(购自Clontech Laboratories Inc)在0.5用离心管中限制性内切酶NdeI和BamHI进行双酶切。
表2酶切反应体系
质粒DNA 10-12μl
10x酶切buffer 2μl
内切酶 1μl
ddH20 至总体积为20μl
于37℃水浴中反应2hr。
3.连接
表3连接反应体系
载体DNA 4μl(200ng)
Insert DNA 2μl(10ng)
10x连接buffer 2μl
T4DNA ligase 1μl(2U)
ddH20 至总体积为20μl
反应液于16℃水浴，反应过夜。
4.大肠杆菌的转化
1)以大肠杆菌DH10B株常规方法制备大肠杆菌电感受态细胞；
2)取新鲜制备的感受态细胞40μl，加入2-3μl脱盐后连接混合物；
3)将40μl细胞转入电转杯中，且使细胞覆盖住电转杯的底部；
4)打开电转仪，将电压设在1.8kv；
5)将电转杯放入；
6)按charge键，直到听见电击声；
7)迅速将细胞重悬在1ml的培养基中；
8)将细胞在37℃，200rpm摇培60min。取1μl转化菌液用于库容测定，其余则加入甘油至终浓度为20％，于-70℃储存。
5.库容测定
1)取1μl文库菌液加入100ul新鲜LB液体培养基中，再从中取10ul加入190ul新鲜LB液体培养基，如此进行10倍比梯度稀释，每梯度设三个重复；
2)各梯度菌液均匀涂布于LB固体培养基中(Ampr)，37℃倒置过夜；
3)计数，对克隆数为10-300的平板进行计数n；
4)按下列公式计算文库的容量；
5)文库的容量(cfu)＝(n/100μl)×10N(稀释倍数)×1000。
在104稀释度平板上，长出了185个克隆(如图1)；105稀释度平板上，长出了21个克隆。经计算库容量约为2×107cfu/mL。
6.重组率测定
1)在文库容量测定中得到的菌落中随机挑取50个克隆，分别摇菌过夜；
2)按小量法提取质粒DNA；
3)克隆测序鉴定，计算重组率；
4)重组率＝重组子数目/测序菌总数×％。
在随机挑取的50个克隆中，经过测序鉴定有两个空载体，计算重组率为96％。
实施例二：构建SH3结构域表达载体
以分别含有hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAblSH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3编码序列的原始质粒为模板扩增获得九种SH3结构域序列；将其编码序列构建到pBridge载体酶切位点EcoRI、BamHI之间。
1.示例性的引物设计如下：
2.PCR扩增体系及参数
表4.PCR反应体系
Component vol.μl
Template 1
Sense primer 1
Antisense primer 1
10×buffer 5
dNTP Mixture 4
DNA Polymerase HiFi 1
ddH2O 37
Total 50
示例性PCR反应参数：以95℃变性10分钟、94℃30秒、59℃30秒、72℃1分钟的条件进行35次循环，最后以72℃延伸10分钟和12℃保存。反应结束取20μl PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切胶然后高效快速纯化离心柱，13000r/min离心2分钟回收PCR产物。
3.酶切、连接、转化的步骤和参数如上所述。
4.鉴定挑取长出的大肠杆菌菌落加入2mlLB阳性培养液混匀，放入恒温摇床250rpm过夜，做6个平行样。各取菌液1μl作为模板，PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳，将紫外观测仪下条带大小与引物扩增的预期产物一致。经测序证实9种SH3编码区已成功插入pBridge载体酶切位点EcoRI、BamHI之间。
实施例三：肽库选择
1.将酵母菌株CG1945，接种固体YPD培养基、及各种营养缺陷型培养基(-Trp、-Leu、-His)中，确定酵母无野生LacZ活性。
2.将实施例二中构建的9种重组质粒转化酵母菌。
挑取少许酵母菌落加入3mlYPD液体，过夜培养，12000rpm离心弃上清，加入900μlddH20和100μlLiAc溶液混匀，置于30℃水浴5分钟。2000rpm离心弃上清，加入ddH2047μl，1.0MLiAc溶液36μl，50％PEG4000240μl，鲑鱼精DNA5μl，诱饵质粒8μl，使用涡旋振荡仪震摇1分钟，42℃水浴20分钟。之后离心去上清，沉淀加入ddH2050-100μl混匀，涂抹于SD/-Trp固体培养基，30℃培养3天。挑取-Trp培养基上的菌落，加入3ml-Trp液体培养基，放30℃摇床过夜培养。收集菌液，离心弃上清，把沉淀点到滤纸上，放入液氮中反复冻融3分钟，取出后加入5ml新配制Z buffer/x-Gal溶液湿润滤纸，放入30℃温箱定期观察。挑选8h内不变蓝的重组酵母菌用于肽库选择。
3.用实施例1中构建的肽库转化步骤2中的酵母菌。
1)挑取步骤2中不变蓝的酵母菌落于0.5mlSD/-Trp液混匀，将混合液转入50mlSD/-Trp液体培养基，30℃摇床培养16-18小时后，加入300mlYPD液体培养基30℃培养3小时。
2)1000rpm离心5分钟后将沉淀合并。加入2mlTE/LiAc液混匀。
3)加入8mlPEG/LiAc液、文库质粒75μl、鲑鱼精DNA200μl，利用涡旋振荡仪振摇5分钟，30℃摇床培养30分钟，加入1.2mlDMSO。42℃水浴15分钟，冰浴2分钟。
4)离心弃上清后加入7ml灭菌水混匀后，将所有液体均匀涂布到20个直径15cm的SD/-Trp-Leu-His固体培养基(含有抑制酵母生长的最小浓度的3AT)上，30℃培养一周。
4.挑取SD/-3培养基上的酵母菌落加入3mlSD/-3培养液，试管中混匀30℃摇床过夜培养。每管取1.5ml液体离心弃上清后将沉淀点到滤纸上，放入液氮冻融3分钟，加5ml新配制Zbuffer/x-Gal溶液湿润滤纸，放入30℃温箱，分别于4、8、10、12小时挑取变蓝的克隆。
5.将步骤4中培养10小时内变蓝的酵母克隆(阳性克隆)和培养12小时仍未变蓝的酵母克隆(阴性克隆)各挑取10个，提质粒，测序，根据酶切位点的设定，利用DNAclub软件将测序结果中核苷酸序列转化为相应氨基酸序列，即得到AD质粒所编码的SH3结构域配体蛋白的氨基酸序列。配体肽
mGadsCSH3的阳性配体序列：
02-1 VSLVKLFF
03-1 CIHLPPWF
27-3 RLWELYFW
28-2 GWFCLVFF
35-1 LHLFLLFC
36-2 LFVNFLCN
42-1 YGLCLLLF
58-2 YGLCLLLF
50-2 LMLCRLLF
52-2 CILWLLFF
其中42-1与58-2两个克隆测序结果翻译出的蛋白相同。
mGadsCSH3阴性配体(非配体肽)序列：
34-1 KFIFFLVR
29-1 FFLWKLMI
64-1 DFFVLWYW
27-1 SYLNKHNW
02-3 KYRHMVNN
11-3 FYLYLFCM
01-1 FLIMVVLH
41-2 YFFCMCKN
01-3 VLCVLYVV
03-3 FZFMLLYV
实施例四：序列分析和比对
将实施例三中获得的阳性配体序列和阴性配体序列分别用DNAstar软件进行分析，运行MegAlign程序，用CLUSTAL w算法进行多重序列比对分析，确定保守区序列。序列分析比对结果如附图所示，其表明SH3结构域配体具有共同的LxLLF基序；阴性配体序列比对后未发现共同的保守基序。
实施例五：SH3结构域配体基序LxLLF的验证。
以具有LxLLF基序的配体肽52-2为例，进行细胞内试验。
1.将mGadsCSH3构建到pEGFP-C3的EcoRI、BamHI之间，引物扩增、酶切、连接的方法参见上文。
2.以52-2克隆中携带有CILWLLFF外源肽的质粒为材料，将编码配体CILWLLFF的寡核苷酸构建到p3XFLAG-CMV-14中，扩增后提取纯化获得无内毒素质粒，酶切、连接、转化方法参见上文。
3.将步骤1、2获得的两种质粒先后或同时转染HEK293T细胞，获得同时表达上述两种质粒的重组HEK293T(以pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体作为阴性对照组)。取HEK293T细胞培养值细胞密度50％左右，更换新鲜的完全培养液，置37℃，5％CO2培养1h。取5-8μgDNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置。取VigoFect 1-4μl(起始用量2μl)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。然后将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5％CO2培养。
4.将转染后的HEK293T细胞用RIPA细胞裂解液进行裂解，取600μl加入anti-flag抗体(Abmart)3μg，4℃，颠倒混匀4小时；加入预冷的Protein G agarose 30μl，4℃颠倒混匀过夜。用1xIP buffer洗5次，12000g离心30s，然后0.1xIP buffer洗一次。12000g离心30s后，彻底去除buffer，加入60μl用60μl上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀。将上样样品95℃煮5分钟，游离抗原，抗体，珠子，离心取上清。
5.将上清进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE参数为浓缩胶12％、分离胶8％。电泳结束后进行Western-Blot，将凝胶上的蛋白转到NC膜上，转膜条件：300mA电流恒流转移2-4小时。
6.将NC膜用5％脱脂乳封闭后加入anti-GFP孵育过夜，洗膜后加入酶标羊抗GFP二抗孵育2h，洗膜后，加显色剂显色。
WB结果显示，转染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF的重组酵母裂解液中以anti-flag抗体能够沉淀出蛋白，并且其沉淀获得的多肽用WB检测GFP呈阳性。而转染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空载体的重组酵母裂解液中，以anti-flag抗体沉淀出的蛋白用WB检测不含GFP(结果如附图3所示)。
上述结果证实，当CILWLLFF、mGadsCSH3在真核动物细胞中表达时，二者能相互结合形成复合物。另外，采用35-1重复实施例五也取得了相似的结果。
上述实施例中的内容仅用于说明本发明，并不以任何方式对本发明的保护范围作出限定。在实际应用中，本领域技术人员根据本发明的构思和精神，以本发明为基础做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：构建密码子简并的随机肽库；
步骤二：构建SH3结构域表达载体，转入宿主细胞；
步骤三：肽库选择，获得能够结合SH3结构域的肽；
步骤四：序列比对，获得SH3结构域配体的肽基序；
步骤五：基序验证，挑选含有所述肽基序的典型阳性肽验证其与SH3结构域的结合能力。
2.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤一包括：
(1)简并密码子和简并反密码子设计：
使密码子符合以下通式
5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1选自A、T、G，N2选自A、T、C、G，N3选自C、G；或N1选自A、T、C、G，N2选自A、T、G，N3选自C、G；
使反密码子符合以下通式
5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’选自C、G，N2’选自A、T、C，N1’选自A、T、C、G；
(2)肽库编码区的人工合成，人工合成以下两条序列
序列1：TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；
序列2：GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA
(3)将序列1、2退火后插入pGADT7载体的NdeI和BamHI之间，获得上述随机8肽的融合表达载体；
(4)将步骤(3)中的表达载体转化感受态大肠杆菌，获得8肽库；
(5)对8肽库的容量和重组率进行鉴定，测得库容达到107级以上，重组率达到90％以上。
3.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤二包括：
(1)将SH3结构域序列插入pBridge质粒的EcoRI和BamHI之间，所述SH3结构域选自由hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAb1SH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3组成的组；
(2)将表达SH3结构域的重组pBridge质粒转化于酵母感受态细胞中，筛选获得重组酵母菌。
4.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤三包括：
(1)从步骤一获得的随机肽库扩增后，提取并纯化质粒；
(2)用步骤二获得的重组酵母制备感受态细胞，用步骤(1)获得的质粒进行转化，抗性筛选阳性克隆；
(3)对步骤(2)获得的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测；
(4)β-半乳糖苷酶活阳性的克隆，提质粒、测序；
(5)对测序结果进行分析，获得结合SH3结构域的8肽序列。
5.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤四包括：使用序列分析软件，对步骤四获得的多个8肽序列进行分析比对，获得SH3结构域配体的肽基序。
6.如权利要求1所述SH3结构域非典型配体的制备方法，其特征在于：所述步骤五包括：
(1)从步骤三获得的阳性8肽序列中选择具有SH3结构域配体肽基序的8肽序列，或人工设计具有步骤四所述配体基序的短肽序列；
(2)将所述8肽序列或人工设计的短肽序列插入载体中，使其与SH3结构域在同一个宿主中共表达，验证两者的相互作用；
其中，所述人工设计的短肽序列长度为6-20个氨基酸，优选8个氨基酸。
7.根据权利要求1所述方法制备的SH3结构域非典型配体。
8.如权利要求7所述的SH3结构域非典型配体，其具有LXLLFF所示的多肽基序，其中X为天然氨基酸。
9.根据权利要求8所述的SH3结构域非典型配体，其特征在于所述配体包含CILWLLFF的8肽序列。
10.权利要求7-9任一所述的SH3结构域非典型配体在制备促进或抑制SH3结构域功能的药物中的用途。
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