TW202408586A

TW202408586A - 喜樹鹼類衍生物及配體-藥物偶聯物

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Publication number: TW202408586A
Application number: TW112117605A
Authority: TW
Inventors: 付雅媛; 李楨; 陳常豔; 柴曉鵑; 于智勇; 唐鋒; 曹卓曉; 唐任宏
Original assignee: 大陸商先聲再明醫藥有限公司
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2023-05-11
Publication date: 2024-03-01
Also published as: WO2023217227A1

Abstract

本發明係關於一類結構新穎的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，具體而言，本發明提供結構通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、其製備方法、含有前述偶聯物的藥物組成物、及其在治療腫瘤中的用途。

Description

喜樹鹼類衍生物及配體-藥物偶聯物

本發明屬於生物醫藥領域，關於一類結構新穎的配體-藥物偶聯物、其製備方法、含有該偶聯物的藥物組成物以及作為抗腫瘤藥物的用途。

抗體-藥物偶聯物（antibody-drug conjugate，ADC）作為新型的靶向藥物，藉由將特異性結合腫瘤細胞表面抗原的單株抗體與具有生物活性的毒素分子相連，將抗體的腫瘤靶向性及毒素分子的高效殺傷作用相結合，同時又避免前者療效偏低及後者毒副作用過大、成藥性差等缺陷。與以往傳統的化療藥物相比，ADC藥物能精準地靶向腫瘤細胞，並降低對正常細胞的影響，以達到更為安全有效的抗腫瘤效果。

2000年第一個抗體藥物偶聯物Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）獲美國FDA批准上市，用於治療成人急性骨髓性白血病（AML）。2011年美國FDA批准新型靶向ADC藥物Adcetris（bretuximab vedotin）上市，用於治療霍奇金淋巴瘤以及系統性間變性大細胞淋巴瘤。Mylotarg及Adcetris都是針對血液瘤的治療藥物。2013年，Kadcyla（ado-trastuzumab emtansine，T-DM1）被美國FDA批准，用於治療HER2陽性同時對曲妥珠單抗（Trastuzumab）及紫杉醇有抗藥性的晚期或者轉移性乳腺癌，是第一個被批准的治療實體瘤的ADC藥物。

ADC一般包含三個部分：抗體、連接子及毒素。喜樹鹼類衍生物是其中一類應用於ADC開發的毒素，其藉由抑制拓撲異構酶I從而達到抗腫瘤作用。第一三共公司（Daiichi Sankyo）採用喜樹鹼類衍生物依喜替康作為毒素，針對HER2靶點，開發ADC藥物Enhertu（Trastuzumab deruxtecan，DS-8201），於2019年被美國FDA批准上市。臨床研究表明，Enhertu對HER2陽性的乳腺癌、胃癌及非小細胞肺癌等都有較好的治療效果。

儘管目前已有多個ADC藥物上市，但依然存在一些安全性問題及耐藥性問題，仍有極大的未滿足的臨床需求。因此，所屬技術領域極需進一步開發更為有效及安全的ADC藥物。

本發明提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為Pc-(L-D) _n，其中， Pc為配體單元； L為連接子單元； D為以下式（D-I）所示的藥物單元：（D-I）其中， X選自NH或O； R ¹選自鹵素、CN、C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₆炔基，前述C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₆炔基任意被一個或多個R ^a1取代； X ₁選自CR ²或N； R ²選自H、鹵素、CN，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基，前述5-6元雜環基任意被一個或多個R ^a2取代； R ⁴選自H、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基，前述C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基任意被一個或多個R ^a4取代； R ⁵選自H、鹵素、CN、NH ₂或NO ₂，或者R ¹、R ⁵與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基、5-6元雜芳基或C ₅-C ₇環烯基，前述5-6元雜環基、5-6元雜芳基或C ₅-C ₇環烯基任意被一個或多個R ^a5取代； R ⁶選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者C ₃-C ₆環烷基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成C ₃-C ₆環烷基，前述C ₃-C ₆環烷基任意被一個或多個R ^a7取代；每一個R ^a1、R ^a2、R ^a4、R ^a5、R ^a7獨立地選自D、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基，前述OH、NH ₂、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基任意被一個或多個R ^b取代；每一個R ^b獨立地選自鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₃烷基、OH、O(C ₁-C ₃烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₃烷基)或N(C ₁-C ₃烷基) ₂；條件是：i) 當R ¹選自甲基，R ²選自F時，R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成環丙基； ii)當X選自NH時，R ⁵不選自H；iii)式（D-I）所示化合物不包含；並且，n為1~16的實數。

在一些實施手段中，每一個R ^a1、R ^a2、R ^a4、R ^a5、R ^a7獨立地選自D、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基。

在一些實施手段中，每一個R ^a2及R ^a7獨立地選自D。

在一些實施手段中，R ¹選自鹵素、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₃炔基。

在一些實施手段中，R ¹選自Cl、Br、甲基、環丙基或乙炔基。

在一些實施手段中，R ¹選自Cl、Br或甲基。

在一些實施手段中，R ²選自H、鹵素、CN，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基，前述5-6元雜環基含有1或2個氧原子作為環原子，前述5-6元雜環基任意被一個或多個D原子取代。

在一些實施手段中，R ²選自H、鹵素、CN，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基，前述5-6元雜環基含有1或2個氧原子作為環原子。

在一些實施手段中，R ²選自H、F或Cl，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成、或。

在一些實施手段中，R ²選自H、F或Cl，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成、。

在一些實施手段中，R ⁵選自H、鹵素、NH ₂或NO ₂，或者R ¹、R ⁵與其等連接的原子共同形成5-6元雜芳基或C ₅-C ₆環烯基，前述5-6元雜芳基或C ₅-C ₆環烯基任意被一個或多個R ^a5取代。

在一些實施手段中，R ⁵選自H、Cl、F、NH ₂或NO ₂，或者R ¹、R ⁵與其等連接的原子共同形成或。

在一些實施手段中，R ⁴選自H或C ₁-C ₃烷基。

在一些實施手段中，R ⁴選自H。

在一些實施手段中，R ⁶選自H或甲基。

在一些實施手段中，R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者任意被一個或多個D取代的C ₃-C ₆環烷基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成C ₃-C ₆環烷基。

在一些實施手段中，R ⁷選自H、甲基、異丙基或者任意被一個或多個D取代的環丙基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成環丙基。

在一些實施手段中，R ¹、R ²與其各自連接的原子共同形成或，R ⁶選自H或甲基，R ⁷選自H、甲基、異丙基或者任意被一個或多個D取代的環丙基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成環丙基。

在一些實施手段中，結構單元選自、、、、、、、、、或。

在一些實施手段中，R ¹選自甲基，R ²選自F，R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成環丙基。

在一些實施手段中，X選自NH，R ⁵選自Cl、F、NH ₂或NO ₂。

在一些實施手段中，式（D-I）所示的藥物單元選自式（D-Ia）所示的藥物單元：（D-Ia）其中，R ¹、R ²、R ⁴、R ⁵、R ⁶、R ⁷如上文定義。

在一些實施手段中，式（D-I）所示化合物選自以下所示化合物：或。

在一些實施手段中，本發明提供一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為Pc-(L-D) _n，其中， Pc、L、n如前文定義； D選自以下化合物之一：或。

在一些實施手段中，連接子單元L選自或，其a端與配體單元Pc共價連接，b端與藥物單元D共價連接，其中，m1、m2各自獨立地選自整數2~8，m3選自整數1~16，L ¹、L ²各自獨立地選自由1至8個胺基酸構成的肽殘基，前述肽殘基進一步任意被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基及4-7元雜環基中的一個或多個取代基取代。

在一些實施手段中，前述L ¹、L ²各自獨立地選自由2、3或4個胺基酸構成的肽殘基，前述肽殘基進一步任意被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基及4-7元雜環基中的一個或多個取代基取代。

在一些實施手段中，前述L ¹為Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Ala-Ala-Ala三肽殘基。

在一些實施手段中，前述L ²為Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Val-Lys二肽殘基。

在一些實施手段中，m1選自5。

在一些實施手段中，m2選自2，m3選自8。

在一些實施手段中，連接子單元L選自以下化學結構：或，其a端與配體單元Pc共價連接，b端與藥物單元D共價連接。

在一些實施手段中，本發明通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：或。其中Pc及n如前文定義。

在一些實施手段中，前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中前述配體單元Pc可選自多肽、抗體或其抗原結合片段。

在一些實施手段中，配體單元Pc可特異性結合選自以下組的一種或多種抗原：HER2、p95HER2、HER3、CD3、CD16、ROR1、DLL3、CDH6、CD70、CD5、CD20、BCMA、EGFR、VEGF及LIV-1。

在一些實施手段中，前述抗體或其抗原結合片段為單特異性、雙特異性、三特異性、或四特異性的。

在一些實施手段中，前述抗體選自Trastuzumab、Pertuzumab或Rituximab。

在一些實施手段中，前述Pc為特異性結合HER2、p95HER2、CDH6、ROR1或LIV-1的抗體或其抗原結合片段；前述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）或/及輕鏈可變區（VL）；

在一些實施手段中，（1）前述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、3、19、21、37、46、54、56、71、80、82或84所示的VH中所含的HCDR1、HCDR2及HCDR3；或/及前述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2、4、20、22、38、47、55、57、72、81、83或85所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2及LCDR3；或（2）前述重鏈可變區或/及前述輕鏈可變區包含與第（1）組中前述HCDR1-3或/及LCDR1-3中的每個CDR相比，具有至少80%同一性的胺基酸序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列；進一步的，前述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。選擇性地，前述HCDR1-3或/及前述LCDR1-3根據Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統確定。

在一些實施手段中，前述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，或/及前述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中，前述HCDR1-3或/及前述LCDR1-3選自以下：（1）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:7-9；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:10-12；（2）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:13-15；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:16-18；（3）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:23-25；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:26-28；（4）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:29-31；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:32-34；（5）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:40-42；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:43-45；（6）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:48-50；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:51-53；（7）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:58-60；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:61-63；（8）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:64-66；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:67-69；（9）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:74-76；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:77-79；（10）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:86-88；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:89-91；（11）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:92-94；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:95-97；（12）前述HCDR1-3為SEQ ID NO:98-100；或/及前述LCDR1-3為SEQ ID NO:101-103；或，（13）前述HCDR1-3或/及前述LCDR1-3具有與第（1）-（12）組中任一組前述HCDR1-3或/及LCDR1-3中的每個CDR相比，至少80%同一性，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列；理想地，前述HCDR1-3或/及前述LCDR1-3具有與第（1）-（12）組中任一組前述HCDR1-3或/及LCDR1-3中的每個CDR相比，至少80%同一性的胺基酸序列；進一步的，前述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施手段中，前述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）或/及輕鏈可變區（VL），前述重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、3、19、21、37、46、54、56、71、80、82或84所示的胺基酸序列，或/及前述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2、4、20、22、38、47、55、57、72、81、83或85所示的胺基酸序列；或者，前述重鏈可變區或/及前述輕鏈可變區分別包含與上述任一重鏈可變區或/及輕鏈可變區相比，具有至少80%同一性的胺基酸序列；進一步的，前述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施手段中，前述抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區序列及/或輕鏈恆定區序列，前述重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區選自完整的恆定區序列或其片段，前述恆定區片段包含CH1，鉸鏈區，CH2，CH3或Fc；選擇性地，前述重鏈恆定區選自人類或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，前述輕鏈恆定區選自人類或鼠kappa恆定區或lamda恆定區；選擇性地，前述抗體或其抗原結合片段包含完整的重鏈及輕鏈，前述重鏈由前述VH及重鏈恆定區組成，前述重鏈恆定區具有如SEQ ID NO:5、39或73所示的胺基酸序列，前述輕鏈由前述VL及輕鏈恆定區組成，前述輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。

在一些實施手段中，前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n選自1~16的實數，例如n選自2~12的實數，例如n選自4~10的實數，例如n選自5~9的實數，例如n選自6~8的實數。

在一些實施手段中，n選自5~9的實數，例如n為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。

本發明亦提供一種藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為L’-D，其中：藥物單元D如前文前述任一所定義； L’選自或，其b端與藥物單元D共價連接，L ¹、L ²、m1、m2、m3如前文前述任一所定義。

在一些實施手段中，L’選自，其b端與藥物單元D共價連接，m1選自5，L ¹選自Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Ala-Ala-Ala三肽殘基。

在一些實施手段中，L’選自，其b端與藥物單元D共價連接，m2選自2，m3選自8，L ²選自Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Val-Lys二肽殘基。

在一些實施手段中，L’選自以下化學結構之一：或，其b端與藥物單元D共價連接。

在一些實施手段中，本發明通式為L’-D的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：或。

本發明亦提供以下式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽：（D-H）其中， R ¹、X ₁、X、R ⁴、R ⁵、R ⁶、R ⁷如前文前述任一所定義。在一些實施手段中，式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽選自以下所示化合物或其藥學上可接受的鹽：或。

另一方面，本發明提供一種藥物組成物，其包含本發明前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的輔料。

另一方面，本發明提供治療哺乳動物腫瘤的方法，包含對需要該治療的哺乳動物，理想為人類，給予治療有效量的前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。

另一方面，本發明提供前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

另一方面，本發明提供前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在治療腫瘤中的用途。

另一方面，本發明提供治療腫瘤的前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。

另一方面，本發明提供一種藥物組成物，其包含本發明前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的輔料。

另一方面，本發明提供治療哺乳動物腫瘤的方法，包含對需要該治療的哺乳動物，理想為人類，給予治療有效量的前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。

另一方面，本發明提供前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

另一方面，本發明提供前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物在治療腫瘤中的用途。

另一方面，本發明提供治療腫瘤的前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組成物。

另一方面，本發明提供通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，包含將本發明前述通式為L’-D的藥物-連接子化合物與前述配體偶聯的步驟，選擇性地，前述配體為抗體或其抗原結合片段。

另一方面，本發明提供通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，包含將本發明前述藥物單元D與前述配體單元Pc連接的步驟；選擇性地，藉由前述連接子單元L連接；選擇性地，配體為抗體或其抗原結合片段。

另一方面，本發明提供前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽在製備前述通式為Pc-(L-D) _n的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽中的用途，及/或前述式（D-H）所示的化合物或其藥學上可接受的鹽在製備前述通式為L’-D的藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽中的用途。

本發明提供的配體-藥物偶聯物具有顯著的抗炎活性及/或降低的毒副作用。

術語定義及說明

除非另有說明，本發明中所用的術語具有下列含義，本發明中記載的基團及術語定義，包含其作為實例的定義、示例性的定義、理想的定義、表格中記載的定義、實施例中具體化合物的定義等，可以彼此之間任意組合及結合。一個特定的術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照所屬技術領域通常的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

術語「配體」是指能識別及結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。配體的作用是將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，這些配體包含但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子。在本發明的實施手段中，配體或配體單元表示為Pc，配體可藉由配體上的雜原子與連接子單元形成連接鍵。在本發明的一些實施手段中，配體選自抗體或抗原結合片段，前述抗體選自嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或鼠源抗體；在本發明的一些實施手段中，抗體為單株抗體。

術語「連接子」或「連接子單元」是指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或化學鍵。

術語「藥物」指在生物體內具有生物活性的小分子化合物。在本發明的一些實施手段中，藥物為具有抗炎功能的糖皮質激素受體致效劑或其相應的磷酸酯分子。

術語「配體-藥物偶聯物」，指配體藉由穩定的連接子單元與具有生物活性的藥物相連。在本發明的一些實施手段中，「配體-藥物偶聯物」為抗體-藥物偶聯物（antibody drug conjugate，ADC），ADC指將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接子單元與具有生物活性的藥物相連。

術語「DAR」或「藥物抗體比率」是指每個抗體分子連接的小分子糖皮質激素受體致效劑藥物的平均數目。在本發明的抗體-藥物偶聯物中，DAR由變量「n」定義，n既可以是整數，也可以是小數。

術語「抗體」按最廣義使用，是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列及/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本文「抗體」涵蓋各種形式及各種結構，只要其等展現出期望的抗原結合活性。本文的「抗體」包含具有移植的互補決定區（CDR）或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包含抗體衍生的支架（其包含引入以例如穩定化抗體三維結構的突變）以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer等人, 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129(2003)；Roque等人, Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004)。此類支架亦可以包含非抗體衍生的支架，例如所屬技術領域已知可用於移植CDR的支架蛋白，包含但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。

本文的「抗體」包含典型的「四鏈抗體」，其屬於由兩條重鏈（HC）及兩條輕鏈（LC）組成的免疫球蛋白；重鏈是指這樣的多肽鏈，其在N端到C端的方向上由重鏈可變區（VH）、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區（HR）、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成；並且，當前述全長抗體為IgE同種型時，任意地亦包含重鏈恆定區CH4結構域；輕鏈是在N端到C端方向上由輕鏈可變區（VL）及輕鏈恆定區（CL）組成的多肽鏈；重鏈與重鏈之間、重鏈與輕鏈之間藉由二硫鍵連接，形成「Y」字型結構。由於免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成及排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將本文的「免疫球蛋白」分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA及IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈及ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成及重鏈二硫鍵的數目及位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分為IgA1及IgA2。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

本文的「抗體」亦包含不包含輕鏈的抗體，例如，由單峰駝（Camelus dromedarius）、雙峰駝（Camelus bactrianus）、大羊駝（Lama glama）、原駝（Lama guanicoe）及羊駝（Vicugna pacos）等產生的重鏈抗體（heavy-chain antibodies, HCAbs）以及在鯊等軟骨魚綱中發現的免疫球蛋白新抗原受體（Ig new antigen receptor, IgNAR）。

本文的「抗體」可以來源於任何動物，包含但不限於人類及非人類動物，前述非人類動物可選自靈長類動物、哺乳動物、嚙齒動物及脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原駝、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱（例如鯊）。

本文的「抗體」包含但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。

術語「單株抗體」是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除可能的變異體（例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在）之外，包含前述群體的各個抗體是相同的及/或結合相同的表位。與通常包含針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。本文修飾語「單株」不應解釋為需要藉由任何特定方法產生前述抗體或抗原結合分子。舉例來說，單株抗體可藉由多種技術製得，包含（但不限於）雜交瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法及其它所屬技術領域已知的方法。

術語「天然抗體」是指藉由多細胞生物體的免疫系統產生及配對的抗體。本文的術語「工程化抗體」是指藉由基因工程、抗體工程等技術獲得的非天然抗體，示例性地，「工程化抗體」包含人源化抗體、小分子抗體（例如scFv等）、雙特異性抗體等。

術語「單特異性」是指表示具有一個或多個結合位點，其中每個結合位點結合相同抗原的相同表位。

術語「多特異性抗體」是指具有至少兩個抗原結合位點，前述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。因此，諸如「雙特異性」、「三特異性」、「四特異性」等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合的不同表位的數目。

術語「價」表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合位點的存在。因此，術語「單價」、「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點的存在。

本文的「全長抗體」、「完好抗體」及「完整抗體」在本文中可互換使用，是指具有基本上與天然抗體結構相似的結構。

本文的「抗原結合片段」及「抗體片段」在本文中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，前述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。本文「抗原結合片段」或「抗體片段」包含但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、VHH及scFv。

完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成兩個同一的抗原結合片段，稱作「Fab」片段，每個含有重及輕鏈可變域，還有輕鏈的恆定域及重鏈的第一恆定域（CH1）。如此，本文的術語「Fab片段」指包含輕鏈的VL域及恆定域（CL）的輕鏈片段以及重鏈的VH域及第一恆定域（CH1）的抗體片段。Fab’片段因在重鏈CH1域的羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同，包含來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH是其中恆定域的半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點（兩個Fab片段）及Fc區的一部分的F(ab’)2片段。

「Fv片段」是由 IgG 及 IgM 產生的最小片段，包含完整的抗原結合位點，Fv 片段具有與 Fab 相同的結合特性及相似的三維結合特性，Fv片段的 VH 及 VL 鏈藉由非共價相互作用結合在一起。

術語「scFv」（single-chain variable fragment）是指包含VL及VH結構域的單個多肽鏈，其中前述VL及VH藉由連接子（linker）相連（參見，例如, Bird等人, Science 242:423-426 (1988)；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)；及Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg及Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。合適的現有技術連接子由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS)4的連接子，但也可使用其變體（Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。可用於本發明的其他連接子由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56及Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間亦可以存在二硫鍵，形成二硫鍵連接的Fv（dsFv）。

術語「雙抗體（diabody）」，其VH及VL結構域在單個多肽鏈上表現，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位（參見，例如, Holliger P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)，及Poljak R. J.等人, Structure 2:1121-1123(1994)）。

術語「嵌合抗體（Chimeric antibody）」是指這樣的抗體，其輕鏈或/及重鏈的一部分源自一個抗體（其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類），且輕鏈或/及重鏈的另一部分源自另一個抗體（其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類），但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性（U.S.P 4,816,567 to Cabilly等人；Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855(1984)）。例如，術語「嵌合抗體」可包含這樣的抗體（例如人鼠嵌合抗體），其中抗體的重鏈及輕鏈可變區來自第一抗體（例如鼠源抗體），而抗體的重鏈及輕鏈恆定區來自第二抗體（例如人類抗體）。

術語「人源化抗體」是指經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體（供體抗體），全部或部分的非CDR區（例如，可變區中的FR及/或恆定區）來自於人源免疫球蛋白（受體抗體）。人源化抗體通常保留或部分保留供體抗體的預期性質，包含但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫反應的能力等。

術語「全人抗體」是指具有其中FR及CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本文的「全人抗體」可以包含不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變）。然而，本文的「全人抗體」不包含其中來源於另一個哺乳動物物種（例如小鼠）的種系的CDR序列已被移植到人類框架序列上的抗體。

術語「可變區」是指抗體重鏈或輕鏈中所包含的使抗體結合抗原的區域，「重鏈可變區」與「VH」、「HCVR」可互換使用，「輕鏈可變區」與「VL」、「LCVR」可互換使用。天然抗體的重鏈及輕鏈的可變域（分別是VH及VL）一般具有相似的結構，每個域包含四個保守的框架區（FR）及三個高變區（HVR）。參見例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W. H. Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文的術語「互補決定區」與「CDR」可互換使用，通常指重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）的高變區（HVR），該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本文的術語「框架區」或「FR區」可互換，是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的該等胺基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區及3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本文的「CDR」可由所屬技術領域習知的方式加以標註及定義，包含但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包含但不限於AbRSA網站（http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php）、abYsis網站（www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）及IMGT網站（http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results）。本文的CDR包含不同定義方式的胺基酸殘基的重疊（overlap）及子集。

本文的術語「重鏈恆定區」是指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的胺基酸序列。「重鏈恆定區」至少包含：CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。「重鏈恆定區」包含「全長重鏈恆定區」及「重鏈恆定區片段」，前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似的結構，而後者僅包含「全長重鏈恆定區的一部分」。示例性地，典型的「全長抗體重鏈恆定區」由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為IgE時，其亦包含CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包含CH1結構域。示例性地，典型的「重鏈恆定區片段」可選自CH1、Fc或CH3結構域。

本文的術語「輕鏈恆定區」是指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，前述輕鏈恆定區可選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。

本文的術語「Fc」是指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3及CH2結構域。Fc區包含例如天然序列Fc區、重組Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人類IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端賴胺酸（根據Kabat編號系統的殘基447）可以例如在抗體的產生或純化過程中，或藉由對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包含或不包含Lys447。

本文的術語「同一性」可藉由以下方式計算獲得：為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的「同一性」百分數，將前述序列出於最佳比較目的比對（例如，可以為最佳比對而在第一及第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列）。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則前述分子在這個位置處是相同的。

考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目及每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨前述序列共有的相同位置變化而變化。

可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較及同一性百分數的計算。例如，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema及Wunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)算法（在www.gcg.com可獲得），使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。又例如，使用GCG軟體包中的GAP程序（在www.gcg.com可獲得），使用NWSgapdna.CMP矩陣及空位權重40、50、60、70或80及長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別理想的參數集合（及除非另外說明否則應當使用的一個參數集合）是採用空位罰分12、空位延伸罰分4及移碼空位罰分5的Blossum62評分矩陣。

本文中「n為1-16的實數」指n為大於或等於1且小於或等於16的任意實數。

本文中「」表示連接位點。

本文中消旋體或者對映體純的化合物的圖示法來自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120。除非另有說明，用楔形鍵及虛楔鍵（及）表示一個立體中心的絕對構型，用黑實鍵及虛鍵（及）表示一個立體中心的相對構型（如脂環化合物的順反構型）。

術語「互變異構體」是指因分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產生的官能團異構體。本發明化合物可表現出互變異構現象。互變異構的化合物可以存在兩種或多種可相互轉化的種類。互變異構體一般以平衡形式存在，嘗試分離單一互變異構體時通常產生一種混合物，其理化性質與化合物的混合物是一致的。平衡的位置取決於分子內的化學特性。例如，在很多脂族醛及酮如乙醛中，酮型佔優勢；而在酚中，烯醇型佔優勢。本發明包含化合物的所有互變異構形式。

術語「立體異構體」是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，包含順反異構體、對映異構體及非對映異構體。

本發明的化合物可以具有不對稱原子如碳原子、硫原子、氮原子、磷原子或不對稱雙鍵，因此本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。特定的幾何或立體異構體形式可以是順式及反式異構體、E型及Z型幾何異構體、(-)-及(+)-對映體、(R)-及(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，以及其外消旋混合物或其它混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，以上所有這些異構體以及其等的混合物都屬於本發明化合物的定義範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子、不對稱硫原子、不對稱氮原子或不對稱磷原子，所有取代基中關於到的這些異構體以及其等的混合物，也均包含在本發明化合物的定義範圍之內。本發明的含有不對稱原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來，光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。

術語「被取代」是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧代（即=O）時，意味著兩個氫原子被取代，氧代不會發生在芳香基上。

術語「任意」或「任意地」是指隨後描述的事件或情況可以發生或不發生，該描述包含發生前述事件或情況及不發生前述事件或情況。例如，乙基「任意」被鹵素取代，是指乙基可以是未被取代的（CH ₂CH ₃）、單取代的（CH ₂CH ₂F、CH ₂CH ₂Cl等）、多取代的（CHFCH ₂F、CH ₂CHF ₂、CHFCH ₂Cl、CH ₂CHCl ₂等）或完全被取代的（CF ₂CF ₃、CF ₂CCl ₃、CCl ₂CCl ₃等）。所屬技術領域中具有通常知識者可理解，對於包含一個或多個取代基的任何基團，不會引入任何在空間上不可能存在及/或不能合成的取代或取代模式。

當任何變量（例如R ^a、R ^b）在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。例如，如果一個基團被2個R ^b所取代，則每個R ^b都有獨立的選項。

當一個連接基團的數量為0時，比如-(CH ₂) ₀-，表示該連接基團為鍵。

當其中一個變量選自化學鍵或不存在時，表示其連接的兩個基團直接相連，比如A-L-Z中L代表鍵時表示該結構實際上是A-Z。

當本文中關於到的連接基團若沒有指明其連接方向，則其連接方向是任意的。例如當結構單元中的X選自「C1-C3亞烷基-O」時，此時X既可以按照與從左到右的方向連接環A及環B構成「環A-C1-C3亞烷基-O-環B」，也可以按照從右到左的方向連接環A及環B構成「環A -O-C1-C3亞烷基-環B」。

本文中的C _m-C _n，是指具有m-n範圍中的整數個碳原子。

術語「烷基」是指通式為C _nH _2n+1的烴基，該烷基可以是直鏈或支鏈的。術語「C ₁-C ₆烷基」應理解為表示具有1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基。前述烷基包含但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、二級丁基、三級丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基或1，2-二甲基丁基等；術語「C ₁-C ₃烷基」指含有1至3個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基。

本文前述「C ₁-C ₆烷基」可以進一步包含「C ₁-C ₃烷基」。

術語「炔基」是指由碳原子及氫原子組成的直鏈或支鏈的具有至少一個三鍵的不飽和脂肪族烴基。例如，術語「C ₂-C ₆炔基」應理解為理想為表示直鏈或支鏈的烴基，其包含一個或多個三鍵並且具有2、3、4、5或6個碳原子。「C ₂-C ₆炔基」的實例包含但不限於乙炔基（‑C≡CH）、丙‑1‑炔基（1‑丙炔基、‑C≡CCH ₃）、丙‑2‑炔基（‑CH ₂C≡CH）、丁‑1‑炔基、丁‑2‑炔基或丁‑3‑炔基。「C ₂-C ₆炔基」可以包含「C ₂-C ₃炔基」，「C ₂-C ₃炔基」實例包含乙炔基（‑C≡CH）、丙‑1‑炔基（1‑丙炔基、‑C≡CCH ₃）、丙‑2‑炔基（‑CH ₂C≡CH）。

術語「環烷基」指完全飽和的且以單環、並環、橋環或螺環等形式存在的碳環。術語「C ₃-C ₆環烷基」應理解為表示飽和的單環、並環、螺環或橋環，其具有3～6個碳原子，具體實例包含但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。

術語「環烯基」是指不完全飽和的且以單環、稠環、橋環或螺環等形式存在的非芳香族碳環基。除非另有指示，該碳環通常為5至8元環。術語「C ₅-C ₇環烯基」是指環原子數為5、6或7的環烯基，具體實例包含但不限於環戊烯基、環戊二烯基、環己烯基、環己二烯基、環庚烯基或環庚二烯基等。術語「C ₅-C ₇環烯基」可以包含「C ₅-C ₆環烯基」等範圍。術語「C ₅-C ₆環烯基」是指環原子數為5或6的環烯基，具體實例包含但不限於環戊烯基、環戊二烯基、環己烯基、環己二烯基等。

術語「雜環基」是指完全飽和的或部分飽和的單環、並環、螺環或橋環基團，其環原子中含有1-5個雜原子或雜原子團（即含有雜原子的原子團），前述「雜原子或雜原子團」包含但不限於氮原子（N）、氧原子（O）、硫原子（S）、磷原子（P）、硼原子（B）、-S(=O) ₂-、-S(=O)-、-P(=O) ₂-、-P(=O)-、-NH-、-S(=O)(=NH)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)NH-等。術語「4-7元雜環基」意指環原子數目為4、5、6或7的雜環基，且其環原子中含有1-3個獨立選自上文前述的雜原子或雜原子團。其中，4元雜環基的實例包含但不限於氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基；5元雜環基的實例包含但不限於四氫呋喃基、二氧雜環戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、4,5-二氫噁唑或2,5-二氫-1H-吡咯基；6元雜環基的實例包含但不限於四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、哌嗪基、三噻烷基、四氫吡啶基或4H-[1,3,4]噻二嗪基；7元雜環基的實例包含但不限於二氮雜環庚烷基。理想地，「4-7元雜環基」可以包含「4-7元雜環烷基」、「5-6元雜環基」、「5-6元雜環烷基」等範圍。

術語「5-6元雜芳基」指具有5或6個環原子的芳族環基，且其包含1-3個，理想為1-2個獨立選自N、O及S的雜原子。特別地，5-6元雜芳基選自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基等。

術語「鹵」或「鹵素」是指氟、氯、溴及碘。

術語「治療」是指外科手術或藥物處理（surgical or therapeutic treatment），其目的是預防、減緩（減少）治療對象中不希望的生理變化或病變，如癌症、自身免疫性疾病及病毒感染的進展。有益的或所希望的臨床結果包含但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定（即，未惡化）、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解（無論是部分緩解或完全緩解），無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的對象包含已患有病症或疾病的對象以及易於患上病症或疾病的對象或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包含消除、消失、不發生等情況。

術語「有效量」指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。「有效量」亦指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。

術語「受試者」是指接受對如本發明前述的特定疾病或病症的治療的生物體。對象及患者的實例包含接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人類、靈長類動物（例如，猴）或非靈長類哺乳動物。

構成「治療有效量」的本發明化合物的量取決於該化合物、疾病狀態及其嚴重性、給藥方式以及待被治療的哺乳動物的年齡而改變，但可例行性地由所屬技術領域中具有通常知識者根據其自身的知識及本發明內容而確定。

術語「藥學上可接受的」，是針對該等化合物、材料、組成物及/或劑型而言，其等在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類及動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語「藥學上可接受的鹽」是指藥學上可接受的酸或鹼的鹽，包含化合物與無機酸或有機酸形成的鹽，以及化合物與無機鹼或有機鹼形成的鹽。

術語「藥物組成物」是指一種或多種本發明的化合物或其鹽與藥學上可接受的輔料組成的混合物。藥物組成物的目的是有利於對有機體給予本發明的化合物。

術語「藥學上可接受的輔料」是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的該等輔料。合適的輔料是所屬技術領域中具有通常知識者熟知的，例如碳水化合物、蠟、水溶性及/或水可膨脹的聚合物、親水性或疏水性材料、明膠、油、溶劑、水等。

詞語「包括（comprise）」或「包含（comprise）」及其英文變體例如comprises或comprising可理解為開放的、非排他性的意義，即「包含但不限於」。

本發明亦包含與本文中記載的該等化合物相同，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本發明化合物。可結合到本發明化合物的同位素的實例包含氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘及氯的同位素，諸如分別為 ²H、 ³H、 ¹¹C、 ¹³C、 ¹⁴C、 ¹³N、 ¹⁵N、 ¹⁵O、 ¹⁷O、 ¹⁸O、 ³¹P、 ³²P、 ³⁵S、 ¹⁸F、 ¹²³I、 ¹²⁵I及 ³⁶Cl等。

某些同位素標記的本發明化合物（例如用 ³H及 ¹⁴C標記）可用於化合物及/或受質組織分布分析中。氚化（即 ³H）及碳-14（即 ¹⁴C）同位素對於由於其等易於製備及可檢測性是尤其理想的。正電子發射同位素，諸如 ¹⁵O、 ¹³N、 ¹¹C及 ¹⁸F可用於正電子發射斷層掃描（PET）研究以測定受質佔有率。通常可以藉由與揭示於下文的技術手段及/或實施例中的該等類似的下列程序，藉由同位素標記試劑取代未經同位素標記的試劑來製備同位素標記的本發明化合物。

本發明的藥物組成物可適用於腸胃外給藥，如合適的單位劑型的無菌溶液劑、混懸劑或凍乾產品。例如，本發明的藥物組成物可以是用於肌內或皮下給藥的無菌注射水溶液形式。本發明的藥物組成物在使用時可接受其它溶媒或溶劑，如水、林格氏液或等滲氯化鈉溶液。

本文前述化合物的所有施用方法中，每天給藥的劑量為0.001mg/kg到600mg/kg體重，理想為0.05mg/kg到200mg/kg體重，更理想為0.1mg/kg到100mg/kg體重，以單獨或分開劑量的形式。

本發明的化合物可以藉由所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包含下面列舉的具體實施方式、其與其它化學合成方法的結合所形成的實施方式以及所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的均等替換方式，理想的實施方式包含但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，前述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑及物料。為獲得本發明的化合物，有時需要所屬技術領域中具有通常知識者在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

所屬技術領域合成路線規劃中的一個重要考量因素是為反應性官能團（如本發明中的胺基、羧基）選擇合適的保護基，例如，可參考Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4th Ed). Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.本發明引用的所有參考文獻整體上併入本發明。

下面藉由實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述本發明，其中也揭示其具體實施例方式，對所屬技術領域中具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神及範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種改變將是顯而易見的。本發明所使用的所有試劑是市售的，無需進一步純化即可使用。

除非另作說明，混合溶劑表示的比例是體積混合比例。

除非另作說明，否則，％是指wt％。

化合物經手工或ChemDraw®軟體命名，市售化合物採用供應商目錄名稱。

化合物的結構是藉由核磁共振（NMR）及/或質譜（MS）來確定的。NMR位移的單位為10 ^-6（ppm）。NMR測定的溶劑為氘代二甲基亞碸、氘代氯仿、氘代甲醇等，內標為四甲基矽烷（TMS）；「IC ₅₀」指半數抑制濃度，指達到最大抑制效果一半時的濃度，「EC ₅₀」指能半數最大效應濃度，引起50%最大效應的濃度。

實施例1 、( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-11 H-[1,4] 二噁己環並[2,3- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物1 ）

步驟1 ：1-(7- 胺基-2,3- 二氫苯並[ b][1,4] 二噁己環-6- 基)-2- 氯乙烷-1- 酮( 中間體1-2) 的合成

將 反應物 1-1（500 mg, 3.31 mmol）溶於1,2-二氯乙烷（3 mL）中，反應液降溫至0 °C，向其中加入三氯化硼（1 M, 2.65 mL）及三氯化鋁（573.36 mg，4.30 mmol），反應液於氮氣保護下0 °C向其中加入氯乙腈（299.67 mg, 3.97 mmol），反應液於氮氣保護下90 °C攪拌16 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，依次加入冰水（30 mL）及1N HCl（10 mL），然後攪拌30分鐘。向反應液中加入二氯甲烷（30mL*3）萃取3遍，合併有機相用飽和食鹽水（30 mL）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。減壓濃縮至乾，粗產物經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=9:1）得到標題化合物（210 mg）。

MS m/z (ESI): 228.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：( S)-15-( 氯甲基)-8- 乙基-8- 羥基-2,3,11,14- 四氫-12 H-[1,4] 二噁己環並[2,3- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮（中間體1-4 ）的合成

將 中間體 1-2（100 mg, 439.28 μmol）及 中間體 1-3（115.64 mg, 439.28 μmol）溶於無水甲苯（3 mL）中，向其中加入對甲苯磺酸吡啶鹽（22.08 mg, 87.86 μmol），反應液於氮氣保護下100 °C攪拌16 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，反應液過濾，濾餅用乙醇（5 mL *2）洗滌得到標題化合物粗產物（130 mg）。

MS m/z (ESI): 455.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-15-( 疊氮甲基)-8- 乙基-8- 羥基-2,3,11,14- 四氫-12 H-[1,4] 二噁己環並[2,3- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮（中間體1-5 ）的合成

將 中間體 1-4（120 mg, 263.82 μmol）溶於二甲亞碸（1 mL）中，向其中加入疊氮化鈉（25.73 mg, 395.73 μmol），反應液於氮氣保護下25 °C攪拌3 小時。LC-MS檢測反應完畢。向其中加入冰水（2 mL）攪拌0.5 小時，過濾得到標題化合物粗產物（90 mg）。

MS m/z (ESI): 462.1 [M+H] ⁺。

步驟4 ：( S)-15-( 胺基甲基)-8- 乙基-8- 羥基-2,3,11,14- 四氫-12 H-[1,4] 二噁己環並[2,3- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮（中間體1-6 ）的合成

將 中間體 1-5（90 mg, 195.05 μmol）溶於無水甲苯（1 mL）中，向其中加入亞磷酸三乙酯（81.02 mg,487.62 μmol），反應液於氮氣保護下100 °C攪拌3 小時。反應液降溫至25 °C，向其中加入鹽酸甲醇溶液（0.5mL），反應液於氮氣保護下85 °C攪拌16 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，過濾得到標題化合物（18 mg）。

MS m/z (ESI): 436.1 [M+H] ⁺。

步驟5 ：( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-11 H-[1,4] 二噁己環並[2,3- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物1 ） 的合成

將 中間體 1-6（18 mg, 41.34 μmol）及2-羥基乙酸（15.72 mg, 206.69 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（23.58 mg, 62.01 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（DIEA）（16.03 mg，124.02 μmol），反應液於25°C攪拌3 小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例10%-30%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（7 mg）。

MS m/z (ESI): 494.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.69 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.57 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.74 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 4.44 (s, 4H), 3.82 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 1.94-1.80 (m, 2H), 0.88 (m, 3H)。

實施例3 、( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物3 ）

步驟1 ：1-(2- 胺基-5- 氯-4- 氟苯基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體3-2 ）的合成

將三氯化硼（1M，13.74mL）溶於1,2-二氯乙烷（24 mL）中，反應液降溫至0℃，向其中加入 反應物 3-1（2 g，13.74 mmol）及氯乙腈（1.56 g，20.61 mmol），反應在0℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（2.38 g，17.86 mmol）。之後反應液在氮氣保護下升至25℃攪拌10分鐘。反應液於氮氣保護下90℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（50 mL）及5%HCl（10 mL）於25℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（50mL），有機相用水（2 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例40%-60%，溶析時間10分鐘）得到標題化合物（320 mg）。

MS m/z (ESI): 222.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：( S)-9- 氯-11-( 氯甲基)-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體3-3 ）的合成

將 中間體 3-2（220 mg, 990.80 μmol）及 中間體 1-3（273.86 mg, 1.04 mmol）溶於甲苯（2 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（24.90 mg, 99.08 μmol）。反應液在100℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2mL*2）洗滌得到標題化合物粗產物（270 mg）。

MS m/z (ESI): 449.0 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-11-( 胺基甲基)-9- 氯-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮 （3-4 ）的合成

將 中間體 3-3（50 mg, 111.29 μmol）溶於乙醇（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（23.40 mg, 166.94 μmol）。反應液在90℃攪拌1.5 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及甲醇的極性遞減的混合物作為溶析液；甲醇梯度比例0%-30%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（22 mg）。

MS m/z (ESI): 430.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.71 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 8.14 (s, 0.3H， HCOOH), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 1.93-1.84 (m, 2H), 0.90-0.85 (m, 3H)。

步驟4 ：( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物3 ）的合成

將 3-4（22 mg, 51.18 μmol）及2-羥基乙酸（19.46 mg, 255.92 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入HATU（29.19 mg, 76.77 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（19.84 mg，153.55 μmol），反應液於25 °C攪拌1.5小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例10%-40%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.20 mg）。

MS m/z (ESI): 488.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.90-8.85 (m, 2H), 8.20 (d, J= 10.3 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.60 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 5.56 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.83 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.83 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 1.93-1.81 (m, 2H), 0.88 (m, 3H)。

實施例5 、(S)- N-((9- 溴-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-3,14- 二氧亞基-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物5 ）

步驟1 ：1-(2- 胺基-5- 溴-4- 氟苯基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體5-2 ）的合成

將三氯化硼（1 M，10.53 mL）溶於1,2-二氯乙烷（24 mL）中，反應液降溫至0℃，向其中加入 中間體 5-1（2 g，10.53 mmol）及氯乙腈（1.19 g，15.79 mmol），反應在0℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（1.82 g，13.68 mmol）。反應液在氮氣保護下，25 ℃攪拌10分鐘。隨後升溫至90 ℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（50 mL）及5% HCl（10mL）於25℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（50mL），有機相用水（2 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例39%-49%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（380 mg）。

MS m/z (ESI): 265.9 [M+H] ⁺。

步驟2 ：( S)-9- 溴-11-( 氯甲基)-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體5-3 ）的合成

將 中間體 5-2（200 mg, 750.48 μmol）及 中間體 1-3（207.44 mg, 788.01 μmol）溶於無水甲苯（4 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（22.63 mg, 90.06 μmol）。反應液在100℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1mL），反應液於25℃攪拌0.5 小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2mL*2）洗滌得到標題化合物粗產物（200 mg）。

MS m/z (ESI): 493.0 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-11-( 胺基甲基)-9- 溴-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體5-4 ）的合成

將 中間體 5-3（200 mg, 405.10 μmol）溶於乙醇（4 mL）中，向其中加入烏洛托品（113.58 mg, 810.19 μmol）。反應液在90℃攪拌1.5 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例6%-26%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（30 mg）。

MS m/z (ESI):476.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.83 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 8.18 (d, J= 9.8 Hz, 1H), 8.14 (s, 0.4H， HCOOH), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 4.53 (s, 2H), 1.92-1.85 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

步驟4 ：(S)- N-((9- 溴-4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-3,14- 二氧亞基-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物5 ）的合成

將 中間體 5-4（15 mg, 26.88 μmol）及2-羥基乙酸（10.22 mg, 134.41 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入HATU（15.33 mg, 40.32 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（10.42 mg，80.65 μmol），反應液於25 °C攪拌1 小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液，乙腈梯度比例6%-36%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.09 mg）。

MS m/z (ESI): 532.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 9.00 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 8.86 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.15 (d, J= 9.8 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.60 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 5.56 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.83 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.83 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 1.94-1.82 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.4 Hz, 3H)。

實施例6 、( S)- N-((8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧亞基-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物6 ）

步驟1 ：1-(2- 胺基-4- 氯-5- 甲基苯基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體6-2 ）的合成

將三氯化硼（1 M，2.82 mL）溶於1,2-二氯乙烷（8 mL）中，反應液降溫至0℃，向其中加入 反應物 6-1（0.5 g，3.53 mmol）及氯乙腈（319.91 g，4.24 mmol），反應在0℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（612.09 mg，4.59 mmol）。反應液在氮氣保護下25℃攪拌10分鐘。之後反應液升溫至90℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（25 mL）及5%HCl（5 mL）於25℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（20mL），有機相用水（20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=9:1）得到標題化合物（500 mg）。

MS m/z (ESI): 218.0 [M+H] ⁺

步驟2 ：( S)-8- 氯-11-( 氯甲基)-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體6-3 ）的合成

將 中間體 6-2（250 mg, 1.15 mmol）及 中間體 1-3（316.87 mg, 1.20 mmol）溶於甲苯（5 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（34.57 mg, 137.56 μmol）。反應液在100℃攪拌18 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5 小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2 mL*2）洗滌得到標題化合物粗產物（230 mg）。

MS m/z (ESI): 445.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-11-( 胺基甲基)-8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-1,12-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體6-4 ）的合成

將 中間體 6-3（49.56 mg, 111.29 μmol）溶於乙醇（0.5 mL）中，向其中加入烏洛托品（23.40 mg, 166.94 μmol）。反應液在90℃攪拌1.5 小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例2%-32%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（11.0 mg）。

MS m/z (ESI): 426.2 [M+H] ⁺。

步驟4 ：( S)- N-((8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物6 ）的合成

將 中間體 6-4（11 mg, 25.83 μmol）及2-羥基乙酸（9.82 mg, 129.15 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU（14.73 mg, 38.74 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（10.01 mg，77.49 μmol），反應液於25 °C攪拌1 小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液，乙腈梯度比例10%-40%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（3.00 mg）。

MS m/z （ESI): 484.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.77 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.59 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 4.85 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.84 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.91-1.82 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)

實施例7 、( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-1 H,11 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物7 ）

步驟1 ：4,6- 二溴-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 胺（中間體7-2 ）的合成

將 中間體 7-1（10.0 g）溶解在無水乙腈中，在0℃下分批加入 N-溴代丁二醯亞胺（NBS）（27.5 g），隨後在室溫下攪拌過夜。將反應液過濾，濾液減壓濃縮，殘餘物溶於200 mL乙酸乙酯，並用水（100 mL*2）洗滌。所得有機相用無水硫酸鈉乾燥，矽膠拌樣，然後置於矽藻土上，用500 mL石油醚淋洗，濾液濃縮得到標題化合物（17.0 g）。

MS m/z (ESI): 289.9 [M+H] ⁺。

步驟2 ：4- 溴-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 胺（中間體7-3 ）的合成

將 中間體 7-2（15.0 g）及氯化亞錫（15.0 g）溶解在75 mL醋酸中，並加入6N的濃鹽酸140 mL，在90℃下反應3 小時。將反應體系冷卻至室溫，濃縮除去醋酸，殘留物溶解在乙酸乙酯100 mL中，用飽和碳酸鈉水溶液調節pH至8左右，過濾，濾液分去有機相，水相再用乙酸乙酯（50 mL*3）萃取。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到標題化合物（10 g）。

MS m/z (ESI): 212.0 [M+H] ⁺。

步驟3 ： N-(4- 溴-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體7-4 ）的合成

將 中間體 7-3（10.0 g）溶於無水二氯甲烷100 mL，加入三乙胺（10.6 g），並在0℃下緩慢滴加乙醯氯（5.5 g），然後反應體系在室溫下攪拌過夜。反應液用水（100 mL*2）洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾。濾液減壓濃縮，殘餘物用矽膠柱層析法純化（石油醚：乙酸乙酯=90：10）得到標題化合物（7.1 g）。

MS m/z (ESI): 254.0 [M+H] ⁺。

步驟4 ： N-(4- 乙醯基-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體7-5 ）的合成

在氮氣保護下，將 中間體 7-4（6.7 g）及三丁基-(2-乙氧基乙烯基)錫（10.4 g）溶於100 mL無水1,4-二氧六環中，然後加入二(三苯基膦)二氯化鈀（1.8 g），然後反應體系在100℃下攪拌過夜。反應液冷卻至室溫，加入3 N的鹽酸30 mL，室溫下攪拌1小時。用矽藻土過濾反應液，所得濾液用乙酸乙酯100 mL稀釋，並用水（100 mL*2）洗滌。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚：乙酸乙酯=85：15）得到標題化合物（4.7 g）。

MS m/z (ESI): 218.1 [M+H] ⁺。

步驟5 ： N-(4-(2- 溴乙醯基)-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體7-6 ）的合成

將 中間體 7-5（4.7 g）溶於50 mL醋酸中，加入33%的氫溴酸-乙酸溶液7.3 g，室溫下緩慢滴加溴素（2.85 g），然後室溫下繼續攪拌反應3小時。反應結束後，將反應液倒入冰水中，攪拌至大量固體析出，過濾，用石油醚洗滌濾餅，所得固體乾燥得到標題化合物（5.0 g）。

MS m/z (ESI): 296.0 [M+H] ⁺。

步驟6 ：1-(5- 胺基-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 基)-2- 氯乙-1- 酮（中間體7-7 ）的合成

將 中間體 7-6（5.0 g）溶於30 mL乙醇中，加入6 N濃鹽酸35 mL，反應體系在80℃下攪拌2小時。反應體系冷卻至室溫，減壓濃縮除去溶劑，殘留物用二氯甲烷100 mL溶解，用飽和碳酸氫鈉水溶液調節pH至7左右，分去有機相，水相再用二氯甲烷（50 mL*2）萃取。合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚：乙酸乙酯=75：25）得到標題化合物（840 mg）。

MS m/z (ESI): 210.0 [M+H] ⁺。

步驟7:( S)-15-( 氯甲基)-8- 乙基-8- 羥基-1,2,3,8,11,14- 六氫-9 H,12 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12- 二酮（中間體7-8 ）的合成

將 中間體 7-7（100 mg）及 中間體 1-3（125.55 mg）溶於甲苯（5 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（5.99 mg）。反應液在90℃攪拌18 小時。待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5 小時。反應液過濾，濾餅用石油醚（2mL*2）洗滌得到標題化合物（180 mg）。

MS m/z (ESI): 437.0 [M+H] ⁺。

步驟8 ：( S)-15-( 胺基甲基)-8- 乙基-8- 羥基-1,2,3,8,11,14- 六氫-9 H,12 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12- 二酮 （中間體7-9 ） 的合成

將 中間體 7-8（50 mg）溶於甲醇（1 mL）及 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL）的混合溶液中，向其中加入烏洛托品（483.13 mg）。反應液在50 ℃攪拌4 小時。反應結束後，反應液冷卻至室溫，加入濃鹽酸（0.5 mL）攪拌0.5小時，然後減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例20%-40%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（22.0 mg）。

MS m/z (ESI): 418.2 [M+H] ⁺。

步驟9 ：( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-1 H,11 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物7 ） 的合成

將 中間體 7-9（15 mg）及羥基乙酸（10.93 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU（27.32 mg）及二異丙基乙胺（4.64 mg），反應液於25°C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例30%-50%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（9.0 mg）。

MS m/z (ESI): 476.2[M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.28 (t, J= 5.1 Hz, 1H), 8.02 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.78 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.49-5.45 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.97 (d, J= 5.0 Hz, 2H), 3.88 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 3.57 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.09 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.23-2.15 (m, 2H), 1.95-1.80 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例9 、( S)- N-((4- 乙基-8- 氟-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-1- 羥基環丙烷-1- 甲醯胺（化合物9 ）

將 中間體 9-1（6.00 mg, 14.66 μmol, 可根據專利文獻WO2020219287報導方法合成）及 中間體 9-2（4.49 mg, 43.97 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU（8.36 mg, 21.98 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（5.68 mg，43.97 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例6%-36%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（3.00 mg）。

MS m/z (ESI): 494.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.96 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 8.50 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.90 (d, J= 10.9 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 4.85 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 2.53 (s, 3H), 1.92-1.83 (m, 2H), 1.05-1.00 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.85-0.81 (m, 2H)。

實施例10 、( S)- N-((8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-1- 羥基環丙烷-1- 甲醯胺（化合物10 ）

將 中間體 6-4（6.24 mg, 14.66 μmol）及 中間體 9-2（4.49 mg, 43.97 μmol）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL）中，向其中加入HATU （8.36 mg, 21.98 μmol）及DIEA （5.68 mg, 43.97 μmol），反應液25 °C攪拌1 小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，減壓濃縮至乾。粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例16%-46%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.20 mg）。

MS m/z (ESI): 510.1 [M+H] ⁺。

1H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.96 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 4.84 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 2.59 (s, 3H), 1.94-1.80 (m, 2H), 1.01 (d, J= 3.0 Hz, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.83 (d, J= 3.0 Hz, 2H)。

實施例11 、 N-((( S)-8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯胺（化合物11 ）

將 中間體 6-4（6.0 mg, 14.09 μmol）及 中間體 11-1（8.18 mg, 70.45 μmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入HATU （8.04 mg, 21.13 μmol）及DIEA（5.46 mg, 42.27 μmol），反應液25°C攪拌1小時。LC-MS檢測反應完畢。反應液過濾，減壓濃縮至乾，粗產物經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱5 um，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例16%-46%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（3.0 mg）。

MS m/z (ESI): 524.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.66 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.53 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 5.50 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 4.91-4.76 (m, 2H), 3.61-3.55 (m, 1H), 2.59 (s, 3H), 1.94-1.82 (m, 2H), 1.05-0.97 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.34- 0.31 (m, 2H), 0.29-0.20 (m, 2H)。

實施例12 、( S)-2- 胺基- N-((7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基) 乙醯胺 （化合物12 ）

步驟1 ：1-(2- 氟-3,4- 二甲氧苯基) 乙烷-1- 酮 （中間體12-2 ）的合成

將 中間體 12-1（25.0 g）溶於1,2-二氯乙烷（DCE，250 mL）中，反應液冷卻至0℃，向其中緩慢加入三氯化鋁（64.04 g），再向反應液中滴加乙醯氯（64.04 g）。反應液於氮氣氛圍下0°C攪拌2小時。反應結束後，向其中加入水（300 mL），使用乙酸乙酯（150 mL*3次）萃取，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮。殘留物以矽膠柱層析法純化（ISCO®；120 g SepaFlash® 快速矽膠柱，梯度0~50% 石油醚/乙酸乙酯，流速70 mL/min），得到標題化合物（21.0 g）。

MS m/z (ESI): 199.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：1-(2- 氟-3,4- 二羥基苯基) 乙烷-1- 酮( 中間體12-3 ）的合成

將 中間體 12-2（15.00 g）溶於無水二氯甲烷（DCM，150 mL）中，反應液冷卻至-78℃，向緩慢向其中滴加三溴化硼（56.88 g），反應液於氮氣氛圍下-78 °C攪拌2 小時，再升溫至0℃反應4小時。反應結束後，反應液緩慢滴入冰水中淬滅，淬滅完畢後，使用乙酸乙酯（150 mL*3次）萃取，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮。殘留物以矽膠柱層析法純化（ISCO®；120 g SepaFlash® 快速矽膠柱，梯度0~50% 石油醚/乙酸乙酯，流速70 mL/min），得到標題化合物（8.50 g）。

MS m/z (ESI): 171.0 [M+H] ⁺。

步驟3 ：1-(4- 氟苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙烷-1- 酮（中間體12-4 ）的合成

將 中間體 12-3（4.0 g）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（40 mL）中，向其中加入碳酸銫（11.49 g）及1,2-二碘甲烷（18.89 g）。反應液於氮氣氛圍下100 ℃攪拌8分鐘。反應結束後，反應液緩慢倒入水中，使用乙酸乙酯（50 mL*3次）萃取，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮。殘留物以矽膠柱層析法純化（ISCO®; 24 g SepaFlash® 快速矽膠柱，梯度0~15% 石油醚/乙酸乙酯，流速60 mL/min）得到標題化合物（2.0 g）。

MS m/z (ESI): 183.0 [M+H] ⁺。

步驟4 ：1-(4- 氟-6- 硝基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙烷-1- 酮 （中間體12-5 ） 的合成

將 中間體 12-4（2.0 g）溶於無水二氯甲烷（15 mL）中，向其中加濃硫酸（5.38 g, 98%質量分數），反應液降溫至0 °C。再向反應液緩慢滴加濃硝酸（3.46 g, 68%質量分數）。反應液於25 ℃攪拌2 小時。反應結束後，將反應液緩慢滴入冰水（50 mL）中，再加入乙酸乙酯（50 mL），有機相用水（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮至乾。殘留物以矽膠柱層析法純化（ISCO®; 24 g SepaFlash® 快速矽膠柱，梯度0~40% 石油醚/乙酸乙酯，流速60 mL/min）得到標題化合物（1.8 g）。

¹H NMR (400MHz, 氘代氯仿）δ = 7.51 (s, 1H), 6.26 (s, 2H), 2.63 (s, 3H)。

步驟5 ：1-(6- 胺基-4- 氟苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙烷-1- 酮（中間體12-6 ）的合成

將 中間體 12-5（1.8 g）溶於無水甲醇（18 mL）及水（9 mL）中，向其中加入氯化銨（635.83 mg）及鐵粉（2.21 mg）。氮氣氛圍下反應液於80 °C攪拌2 小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫。反應液過濾，濾液用乙酸乙酯（50 mL）稀釋，有機相用水（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮至乾，得到標題化合物（1.5 g）。

MS m/z (ESI): 198.0 [M+H] ⁺。

步驟6 ： N-(6- 乙醯基-7- 氟苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺 （中間體12-7 ）的合成

將 中間體 12-6（500.0 mg）溶於無水二氯甲烷（5 mL）中，向其中加入吡啶（601.79 mg），氮氣氛圍下向反應中滴加乙醯氯（398.14 mg）。氮氣氛圍下反應液於25 °C攪拌1.5 小時。反應結束後，有機相經減壓濃縮至乾。殘留物以矽膠柱層析法純化（ISCO®；12 g SepaFlash® 快速矽膠柱，梯度0~40% 石油醚/乙酸乙酯，流速60 mL/min）得到標題化合物（380.0 mg）。

¹H NMR （400MHz, 氘代氯仿）δ = 11.72 (s, 1H), 8.18 (d, J= 1.0 Hz, 1H), 6.10 (s, 2H), 2.64 (d, J= 8.4 Hz, 3H), 2.22 (s, 3H)。

步驟7 ： N-(6-(2- 溴乙醯基)-7- 氟苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺 （中間體12-8 ）的合成

將 中間體 12-7（380.0 mg）溶於乙酸（3 mL）中，向其中加入溴化氫的乙酸溶液（1.95 g，33%含量），再向反應液中緩慢滴加液溴（256.42 mg）。反應液在25℃攪拌1小時。反應結束後，反應液緩慢倒入冰水中攪拌0.5 小時，過濾，濾餅用水（20 mL*2）洗滌，濾餅乾燥，得到標題化合物（400.0 mg）。

MS m/z (ESI): 317.8 [M+H] ⁺。

步驟8 ：1-(6- 胺基-4- 氟苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體12-9 ）的合成

將 中間體 12-8（400.0 mg）溶於無水乙醇（2 mL）及濃鹽酸（2 mL）中，反應液於60 °C攪拌3 小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（20 mL），用飽和碳酸氫鈉調節至pH=8，再加入乙酸乙酯（40 mL），有機相用水（20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮至乾，得到標題化合物（220.0 mg）。

MS m/z (ESI): 232.0 [M+H] ⁺。

步驟9 ：( S)-14-( 氯甲基)-7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮 （中間體12-10 ） 的合成

將 中間體 12-9（200.0 mg）及 中間體 1-3（227.32 mg）溶於甲苯（3 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（21.70 mg）。反應液在90 ℃攪拌16 小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（5mL*2）洗滌，得到標題化合物（320.0 mg）。

MS m/z (ESI): 459.0 [M+H] ⁺。

步驟10 ：( S)-14-( 胺基甲基)-7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮（中間體12-11 ）的合成

將 中間體 12-10（260.00 mg）溶於無水甲醇（1 mL）及無水 N, N-二甲醯甲醯胺（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（238.32 mg）。反應液在50℃攪拌3小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例0%-30%, 溶析時間14分鐘）得到標題化合物（85.0 mg）。

MS m/z (ESI): 440.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 7.49 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.38 (s, 2H), 5.44 (s, 4H), 4.27 (s, 2H), 1.94-1.79 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

步驟11 ：( S)-(2-(((7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-8,10,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基) 胺基)-2- 氧代乙基) 胺基甲酸三級丁酯 （中間體12-12 ） 的合成

將 中間體 12-11（7 mg）及2-((三級-丁氧羰基)胺基)乙酸（5.58 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（12.11 mg）及二異丙基乙胺（2.06 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，將反應液濃縮至乾，得到標題化合物（8.00 mg）。

MS m/z (ESI): 597.3 [M+H] ⁺。

步驟12 ：( S)-2- 胺基- N-((7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基) 乙醯胺（化合物12 ）的合成

將 中間體 12-12（6 mg）溶於二氯甲烷（0.5 mL），向其中加入三氟乙酸（902.27 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例2%-32% , 溶析時間12分鐘），得到標題化合物（1.3 mg）。

MS m/z (ESI): 497.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.80-8.58 (m, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 5.50 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.85 (s, 2H), 3.09-2.75 (m, 2H), 1.92-1.79 (m, 2H), 0.87 (t, J= 7.1 Hz, 3H)。

實施例13 、2- 環丙基- N-((( S)-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-1 H,11 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物13 ）

將 中間體 7-9（10 mg）及 中間體 11-1（8.34 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （13.66 mg）及二異丙基乙胺（3.10 mg），反應液於25 °C攪拌1 小時。反應結束後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例34%-54% , 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（0.8 mg）。

MS m/z (ESI): 516.2 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.25 (t, J= 5.0 Hz, 1H), 8.01 (d, J=8.5 Hz, 1H), 7.78 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.99-4.85 (m, 2H), 3.59 (s, 1H), 3.56 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 3.08 (t, J= 7.7 Hz, 2H), 2.23-2.16 (m, 2H), 1.92-1.72 (m, 2H), 1.15-1.01 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.46-0.19 (m, 4H)

實施例14-1 、2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物14 ）

步驟1 ：1-(6- 硝基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙酮（中間體14-2 ）的合成

將 中間體 14-1（10.0 g, 60.92 mmol）溶於硝基甲烷（100 mL）中，向其中緩慢加入硝酸（35.43 g, 365.50 mmol, 65%純度），反應液於25 °C攪拌2.5小時。反應結束後，向反應液中緩慢加入飽和碳酸氫鈉溶液，調節pH至7-8，再向其中加入二氯甲烷（100 mL），有機相用水（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。經製備薄層色譜法純化（石油醚：乙酸乙酯 = 1: 2）得到標題化合物（5 g）。

MS m/z (ESI): 210.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：1-(6- 胺基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙酮 （中間體14-3 ） 的合成

將 中間體 14-2（2.37 g, 11.33 mmol）溶於無水乙醇（25 mL）中，向其中加入鈀碳（0.2 g, 10%純度），反應液於氫氣保護下25 °C攪拌16小時。反應結束後，反應液過濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌2遍，濾液經減壓濃縮至乾得到標題化合物（1.6 g）。

MS m/z (ESI): 180.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ： N-(6- 乙醯基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺 （中間體14-4 ） 的合成

將 中間體 14-3（1.0 g, 5.58 mmol）溶於二氯甲烷（10 mL）中，反應液冷卻至0 °C向其中加入 N, N-二異丙基乙胺（DIEA）（1.08 g, 8.37 mmol）及乙醯氯（569.55 mg, 7.26 mmol）。反應液在25 ℃攪拌1.5小時。反應結束後，反應液經減壓濃縮至乾得到標題化合物（1.23 g）。

MS m/z (ESI):222.1 [M+H] ⁺。

步驟4 ： N-(6-(2- 溴乙醯基) 苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺 （中間體14-5 ） 的合成

將 中間體 14-4（1.23 g, 5.00 mmol）溶於乙酸（12 mL）中，向其中加入溴化氫的乙酸溶液（1.84 g, 7.51 mmol, 33%純度），再緩慢向其中加入液溴（959.69 mg, 6.01 mmol）反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液倒入冰水中攪拌10min。過濾，濾餅用水洗滌2遍，減壓濃縮至乾，向殘餘物中加入乙酸乙酯（2 mL）及石油醚（10 mL），反應液在25°C下攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅經乾燥得到標題化合物（500 mg）。

MS m/z (ESI): 300.0 [M+H] ⁺。

步驟5 ：1-(6- 胺基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基)-2- 氯乙酮 （中間體14-6 ） 的合成

將 中間體 14-5（0.2 g, 666.43 μmol）溶於無水乙醇（1 mL）及濃鹽酸（1 mL）中，反應液於60 °C攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（10 mL）及飽和碳酸氫鈉（10 mL），再加入二氯甲烷（50 mL），有機相用水（20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。經製備薄層色譜法（石油醚：乙酸乙酯 = 6: 1）得到標題化合物（160 mg）。

MS m/z (ESI): 214.0 [M+H] ⁺。

步驟6 ：( S)-14-( 溴甲基)-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮 （中間體14-7 ） 的合成

將 中間體 14-6（50 mg, 234.06 μmol）及 中間體 1-3（61.62 mg, 234.06 μmol）溶於甲苯（1 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（5.88 mg, 23.41 μmol）。反應液在90℃攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2mL*2）洗滌後，乾燥得到標題化合物（60 mg）。

MS m/z (ESI): 441.1 [M+H] ⁺。

步驟7 ：( S)-14-( 胺基甲基)-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮 （中間體14-8 ） 的合成

將 中間體 14-7（55.00 mg, 124.76 μmol）溶於乙醇（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（52.47 mg, 374.29 μmol）。反應液在80℃攪拌1.5小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及甲醇的極性遞減的混合物作為溶析液; 甲醇梯度比例0%-27%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（10 mg）。

MS m/z (ESI): 422.1 [M+H] ⁺。

步驟8 ：2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物14 ） 的合成

將 中間體 14-8（10.00 mg, 20.17 μmol）及 中間體 11-1（23.42 mg, 201.71 μmol) 溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（ 11.50 mg, 30.26 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（7.82 mg，60.51 μmol），反應液於25 °C攪拌1.5小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例4%-44%，溶析時間9分鐘）得到標題化合物（3 mg）。

MS m/z (ESI): 520.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.37 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 6.05 (s, 2H), 5.27 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 4.48 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 1.66-1.55 (m, 2H), 0.76-0.40 (m, 1H), 0.63 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.14-0.06 (m, 2H), 0.05-0.04 (m, 2H)。

步驟9 ：2- 環丙基-2- 羥基乙酸苄酯（中間體14-9-P1/P2 ）的製備

對中間體14-9進行拆分製備得到異構體14-9-P1及14-9-P2。取 中間體 14-9（1.3 g）經超臨界流體色譜製備（DAICEL CHIRALPAK AD柱，10 μm二氧化矽，30mm直徑，250mm長度；使用乙醇（含有0.1%氨水）作為溶析液）得到 中間體 14-9-P1（600 mg）及 中間體 14-9-P2（600 mg）。

藉由以下手性超臨界流體色譜條件對上述兩個異構體進一步分析。

柱子	Chiralpak AD-3 150*4.6mm I.D., 3um
流動相	A:二氧化碳
B:甲醇（0.05% 二乙胺）
時間（分鐘）	B相%
0	5
4	40
0.2	5
1.8	5
流速	2.5毫升/分鐘
波長	PDA 220nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector

中間體14-9-P1 ：

在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為2.990分鐘；

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ 7.43-7.29 (m, 5H), 5.29-5.16 (m, 2H), 3.67 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 1.19-1.07 (m, 1H), 0.58-0.38 (m, 4H)。

中間體14-9-P2 ：

在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為2.661分鐘；

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ 7.46-7.28 (m, 5H), 5.30-5.16 (m, 2H), 3.67 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 1.21-1.03 (m, 1H), 0.60-0.36 (m, 4H)。

步驟10 ：2- 環丙基-2- 羥基乙酸（中間體14-10-P1/P2 ）的合成

氫氣氛圍下，將 中間體14-9-P1（500 mg）加入到甲醇（15 mL）中, 向反應液中加入濕鈀碳（10 mg, 10%），反應液在氫氣氛圍下25°C攪拌16小時。反應結束後，反應物經過濾，濾液經減壓濃縮，得 中間體 14-10-P1（273 mg）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ 3.63 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 1.21-1.09 (m, 1H), 0.61-0.40 (m, 4H)。

氫氣氛圍下，將 中間體14-9-P2（500 mg）加入到甲醇（15 mL）中, 向反應液中加入濕鈀碳（10 mg, 10%），反應液在氫氣氛圍下25°C攪拌16小時。反應結束後，反應物經過濾，濾液經減壓濃縮，得 中間體 14-10-P2（279 mg）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ 3.63 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 1.19-1.08 (m, 1H), 0.60-0.39 (m, 4H)。

步驟11 ：2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物14-P1/P2 ）的合成

將 中間體 14-8（40.00 mg）及 中間體 14-10-P1（28.11 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（46.02 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（31.28 mg），反應液於25 °C攪拌1.5小時。反應結束後，反應液經製備高效液相色譜純化（Boston Green ODS C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例16%-46%, 溶析時間12分鐘），得 化合物 14-P1（22.00 mg）。

MS m/z (ESI): 520.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.62 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.73 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 3.54 (d, J= 5.9 Hz, 1H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.06-0.96 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.39-0.30 (m, 2H), 0.29-0.21 (m, 2H)。

將 中間體 14-8（10.00 mg）及 中間體 14-10-P2（8.27 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（18.05 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（6.13 mg），反應液於25 °C攪拌1.5小時。反應結束後，反應液直接經製備高效液相色譜純化（Boston Green ODS C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例16%-46%，溶析時間12分鐘），得 化合物 14-P2（8.00 mg）。

MS m/z (ESI): 520.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.63 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.72 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.55 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 1.92-1.81 (m, 2H), 1.03-0.97 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.38-0.30 (m, 2H), 0.28-0.22 (m, 2H)。

藉由以下手性超臨界流體色譜分析方法分別對兩個異構體進一步分析。

柱子	Chiralcel OJ-3 100A 4.6mm I.D., 3μm
流動相	A:二氧化碳
B:乙醇（0.05% 二乙胺）
流速	2.8 毫升/分鐘
波長	PDA 254nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector and QDa Detector

化合物14-P1 ：

在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.673分鐘；

化合物14-P2 ：

在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.735分鐘。

實施例14-2 ：( S)-2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物14-S ）

步驟1 ：( S)-4- 苄基-3-(2- 環丙基乙醯基) 噁唑烷-2- 酮（中間體3 ）的合成

秤取 起始原料 1（150.0 g），4-二甲胺基吡啶（160.15 g），及 起始原料 2（221.2 g），溶解於1500 mL二氯甲烷中，並在室溫下攪拌15分鐘。秤取1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（ EDCI, 359.0 g），分批加入反應反應液，加畢，在室溫下攪拌約5小時。反應結束後，向反應液中加入二氯甲烷（1500 mL）稀釋，然後依次用水（500 mL）洗滌2次，2 N HCl（500 mL）洗滌一次，飽和碳酸氫鈉溶液（500 mL）洗滌一次，飽和食鹽水溶液（500 mL）洗滌一次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後濾液減壓濃縮至乾，得標題化合物（302 g）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.32-7.35 (m, 2H), 7.26-7.29 (m, 1H), 7.21-7.23 (m, 2H), 4.68-4.71 (m, 1H), 4.17-4.23 (m, 2H), 3.30-3.33 (dd, 1H), 2.91-2.95 (dd, 1H), 2.78-2.82 (m, 2H), 1.14-1.18 (m, 1H), 0.59-0.63 (m, 2H), 0.21-0.26 (m, 2H).

步驟2 ：( S)-4- 苄基-3-(( S)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯基) 噁唑烷-2- 酮 ( 中間體5 ）的合成

秤取 中間體 3（200 g），溶解於2000 mL無水四氫呋喃中，在氮氣保護下，-78℃下攪拌15分鐘。隨後，向反應液中滴加二(三甲基矽基)胺基鈉（443.5 mL，2 M 的四氫呋喃溶液）。滴加結束，反應液在-78℃下攪拌30分鐘。將 中間體 4（201.5 g）溶解於700 mL 四氫呋喃中溶清，並緩慢滴加入反應反應液。滴加結束，-78℃下攪拌2小時。隨後，向反應液中加入冰醋酸220 mL，淬滅反應。滴畢後逐漸升溫至室溫，並向反應液中加入2 N HCl 600 mL，室溫（20-25℃）攪拌10小時。隨後，反應液減壓濃縮，並向殘留物中加入乙酸乙酯（1000 mL）及水（200 mL），攪拌20分鐘。分離水相用乙酸乙酯（500 mL x2）萃取兩次，合併有機相，依次用飽和NaHCO ₃溶液400 mL，飽和Na ₂S ₂O ₃溶液400 mL及飽和食鹽水各洗滌兩次，所得有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物用矽膠柱色譜純化（石油醚:乙酸乙酯=1/30）得標題化合物（128.7 g）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.37 (dd, J = 8.1, 6.8 Hz, 2H), 7.33-7.29 (m, 1H), 7.27-7.23 (m, 2H), 4.81 (dd, J = 7.9, 5.9 Hz, 1H), 4.72 (ddt, J = 10.0, 7.5, 2.9 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 8.3Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 9.1, 2.5 Hz, 1H), 3.48 (dd, J = 8.2, 3.9 Hz, 1H), 3.35 (dd, J = 13.5, 3.4 Hz,1H), 2.88 (dd, J = 13.5, 9.4 Hz, 1H), 1.36-1.29 (m, 1H), 0.62-0.44 (m, 4H).

步驟3 ：( S)-4- 苄基-3-(( S)-2-(( 三級丁基二甲基矽基) 氧基)-2- 環丙基乙醯基) 噁唑烷-2- 酮（中間體6 ）的合成

秤取 中間體 5（128.7 g），溶解於1300 mL 二氯甲烷中，並加入咪唑（56.17 g），在冰浴下攪拌15分鐘。隨後分批向反應液中加入TBSCl （107.3 g），並在室溫下攪拌3小時。向反應液中加入200 mL 2N HCl攪拌20分鐘，分液。有機相依次用飽和NaHCO ₃溶液200 mL及飽和食鹽水各洗滌兩次。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物用矽膠柱色譜純化（石油醚:乙酸乙酯=80：1）得標題化合物（160 g）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.35-7.37 (m, 2H), 7.30-7.32 (m, 1H), 7.26-7.29 (m, 2H), 5.26-5.31 (m, 1H), 4.67-4.71 (m, 1H), 4.20-4.26 (m, 2H), 3.41-3.44 (dd, 1H), 2.72-2.76 (dd, 1H), 1.25-1.31 (m, 1H), 0.94 (s, 9H), 0.54-0.56 (m, 2H), 0.46-0.48 (m, 2H), 0.12 (s, 6H).

步驟4 ：( S)-2-(( 三級丁基二甲基矽基) 氧基) -2- 環丙基乙酸苄酯（中間體7 ）的合成

秤取苄醇（62.18 g），溶解於500 mL 四氫呋喃中，並在-25℃下攪拌。量取正丁基鋰（213.6 mL, 2.5 M的四氫呋喃溶液），緩慢滴加入反應液。滴畢，在-25℃下攪拌1小時。秤取 中間體 6（160 g），溶於320 mL 四氫呋喃中，並在-25℃下緩慢滴加入反應液中。滴畢，在-15℃下攪拌3小時。向反應液中加入飽和NH ₄Cl（200 mL）溶液淬滅反應。隨後減壓濃縮，並向反應液中加入甲基三級丁基醚 400 mL及水（150 mL），攪拌30分鐘，分液，水相用甲基三級丁基醚（200 mL x2）萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水（250 mL）洗滌一次，無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液經減壓濃縮，殘留物經矽膠柱色譜純化（石油醚:乙酸乙酯=100:1），得標題化合物（125 g）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.28-7.40 (m, 5H), 5.17-5.26 (m, 2H), 3.86-3.89 (m, 1H), 1.21-1.46 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.45-0.51 (m, 4H), 0.05 (s, 6H).

步驟5 ：( S)- 2- 環丙基-2- 羥基乙酸苄酯（中間體8 ）的合成

秤取 中間體 7（125 g），溶於1200 mL 四氫呋喃中，並加入冰醋酸（35.1 g），在室溫下攪拌5分鐘。隨後向反應液中加入四丁基氟化銨（ TBAF, 585 mL, 1 M的四氫呋喃溶液），並將反應液置於45℃下反應4小時。反應液減壓濃縮除去四氫呋喃（600 mL），並向殘餘物中加入300 mL水及400 mL甲基三級丁基醚，攪拌20分鐘，分液，水相用甲基三級丁基醚（200 mL）萃取兩次，合併有機相，依次用飽和NaHCO ₃溶液200mL及飽和食鹽水各洗滌兩次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘留物矽膠柱色譜純化（石油醚:乙酸乙酯=60:1），得標題化合物（68.9 g）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl ₃) δ 7.27-7.39 (m, 5H), 5.22-5.28 (m, 2H), 3.82 (d, 1H), 2.7 (brs, 1H), 1.11-1.15 (m, 1H), 0.41-0.56 (m, 4H).

藉由以下手性超臨界流體色譜條件對 中間體 8進一步分析。

中間體8在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.013分鐘；與實施例14-1 中間體14-9-P1在相同色譜分析條件下的保留時間（2.990分鐘）基本一致， 中間體 8與 中間體 14-9-P1構型相同，兩者為相同的化合物。

步驟6 ：( S)-2- 環丙基-2- 羥基乙酸 （中間體9 ）的合成

將 中間體 8（5 g）溶於甲醇（80 mL）中，向反應液中加入濕鈀碳（10%質量含量, 0.7 g），並在氫氣氛圍下，25 °C攪拌16小時。反應結束後，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾後，得標題化合物（2.4 g）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄ ) δ = 3.63 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 1.20-1.09 (m, 1H), 0.61-0.39 (m, 4H)。

步驟7 ：( S)-2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物14-S ） 的合成

將 中間體 14-8（90 mg）及 中間體 9（49.60 mg）溶於無水N,N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入O-(7-氮雜苯並三氮唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲六氟膦鹽（121.81 mg）及N,N-二異丙基乙胺（82.81 mg），反應液於25°C攪拌16小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Green ODS 150*30mm*5um; 流動相:[A: 水（0.225%甲酸），B:乙腈]；B%: 20%-50%, 12min）得標題化合物（21 mg）。

MS m/z (ESI): 520.0[M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.62 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.48 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.73 (d, J=5.6 Hz, 2H), 3.54 (d, J= 5.5 Hz, 1H), 1.93-1.80 (m, 2H), 1.05-0.97 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.39-0.30 (m, 2H), 0.30-0.22 (m, 2H)。

藉由以下手性超臨界流體色譜條件對 化合物 14-S進一步分析。

化合物14-S在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.654分鐘；與實施例14-1製備得到的 化合物14-P1在相同色譜分析條件下的保留時間（3.673分鐘）基本一致。因此判斷 化合物 14-S與實施例14-1製備得到的 化合物14-P1構型相同，兩者為相同的化合物。

實施例15 、( S)- N-((9- 溴-4- 乙基-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b][1,7] 萘啶-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物15 ）

步驟1 ：1-(5- 胺基-2- 溴吡啶-4- 基) 乙酮 （中間體15-2 ）的合成

將 中間體 15-1（500 mg, 3.67 mmol）溶於無水四氫呋喃（90 mL）中，向其中加入碳酸氫鈉（617.04 mg，7.34 mmol）及2-吡咯烷酮三溴化氫鹽（1.64 g，5.03 mmol），反應液於25°C攪拌8小時。反應結束後，反應液過濾，經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=20: 1）得到標題化合物（300 mg）。

MS m/z (ESI): 214.9 [M+H] ⁺。

步驟2 ： N-(4- 乙醯基-6- 溴吡啶-3- 基) 乙醯胺 （中間體15-3 ） 的合成

將 中間體 15-2（150 mg, 697.52 mmol）溶於二氯甲烷（2 mL）中，反應液冷卻至0 °C向其中加入 N, N-二異丙基乙胺（180.30 mg, 1.40 mmol）及乙醯氯（109.51 mg，1.40 mmol）。反應液在25℃攪拌3小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=3:1）得到標題化合物（100 mg）。

MS m/z (ESI):257.0 [M+H] ⁺。

步驟3 ：1-(5- 胺基-2- 溴吡啶-4- 基)-2- 溴乙酮（中間體15-4 ） 的合成

將 中間體 15-3（95.00 mg, 273.45 μmol）溶於乙酸（2 mL）中，向其中加入溴化氫的乙酸溶液（100.57 g，410.18 μmol，33%純度），再緩慢向其中加入液溴（48.07 mg, 300.80 μmol）反應液於25°C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=3:1）得到標題化合物（45 mg）。

MS m/z (ESI): 292.9 [M+H] ⁺。

步驟4 ：1-(5- 胺基-2- 溴吡啶-4- 基)-2- 氯乙酮 （中間體15-5 ） 的合成

將 中間體 15-4（50.00 mg, 170.10 μmol）溶於濃鹽酸（1 mL）中，反應液於60 °C攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（10 mL）及飽和碳酸氫鈉（10 mL），再加入二氯甲烷（30 mL）,有機相用水（20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮至乾得到標題化合物（25 mg）。

MS m/z (ESI): 248.9 [M+H] ⁺。

步驟5 ：( S)-9- 溴-11-( 氯甲基)-4- 乙基-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b][1,7] 萘啶-3,14(4 H)- 二酮 （中間體15-6 ） 的合成

將 中間體 15-5（25 mg, 100.20 μmol）及 中間體 1-3（26.38 mg, 100.20 μmol）溶於甲苯（0.5 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（2.52 mg, 10.02 μmol）。反應液在90 ℃攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2mL*2）洗滌得到標題化合物（30 mg）。

MS m/z (ESI): 475.9 [M+H] ⁺。

步驟6 ：( S)-11-( 胺基甲基)-9- 溴-4- 乙基-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b][1,7] 萘啶-3,14(4 H)- 二酮 （中間體15-7 ） 的合成

將 中間體 15-6（30 mg, 62.93 μmol）溶於乙醇（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（17.64 mg, 125.86 μmol）。反應液在80℃攪拌2小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及甲醇的極性遞減的混合物作為溶析液；甲醇梯度比例0%-25%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（4 mg）。

MS m/z (ESI): 457.0 [M+H] ⁺。

步驟7 ：( S)- N-((9- 溴-4- 乙基-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b][1,7] 萘啶-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物15 ） 的合成

將 中間體 15-7（4 mg, 8.75 μmol）及羥基乙酸（3.33 mg, 43.74 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （4.99 mg, 13.12 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（3.39 mg，26.24 μmol），反應液於25 °C攪拌2小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例8%-28%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.00 mg）。

MS m/z (ESI): 515.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 9.38 (s, 1H), 8.88 (t, J= 6.2 Hz, 1H), 8.76 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.64-5.61 (m, 1H), 5.60 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.80 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.83 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 1.92-1.80 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例16 、( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-1- 羥基環丙烷-1- 甲醯胺（化合物16 ）

步驟1 ：1-(6- 胺基-3- 氯-2,4- 二氟苯基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體16-2 ）的合成

將三氯化硼（1M，6.11 mL）溶於1,2-二氯乙烷（12 mL）中，反應液降溫至0 ℃，向其中加入 反應物 16-1（1 g，6.11 mmol）及氯乙腈（784.73 mg，10.39 mmol），反應在0 ℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（1.06 g，7.95 mmol）。之後反應液在氮氣保護下升至25 ℃攪拌10分鐘。反應液於氮氣保護下90 ℃攪拌18小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（25 mL）及5%鹽酸（5mL）於25℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（50mL），有機相用水（2 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。減壓濃縮至乾，粗產物經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：乙酸乙酯=9:1）得到標題化合物（340 mg）。

MS m/z (ESI): 240.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：( S)-9- 氯-11-( 氯甲基)-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮（中間體16-3 ）的合成

將 中間體 16-2（0.2 g，833.22 μmol）及 中間體 1-3（219.34 mg，833.22 μmol）溶於甲苯（4 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（20.94 mg，83.32 μmol）。反應液在100℃攪拌18小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2mL*2）洗滌得到標題化合物粗產物（190 mg）。

MS m/z (ESI): 467.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-11-( 胺基甲基)-9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-1,12- 二氫-14 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-3,14(4 H)- 二酮 （16-4 ）的合成

將 中間體 16-3（50 mg，107.01 μmol）溶於乙醇（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（45.00 mg，321.03 μmol）。反應液在80℃攪拌1.5小時。LC-MS檢測反應完畢。待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例2%-32%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.22mg）。

MS m/z (ESI): 448.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.14 (d, J= 9.8 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.55 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 4.35 (d, J= 3.0 Hz, 2H), 1.94-1.83 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

步驟4 ：( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-1- 羥基環丙烷-1- 甲醯胺 （化合物16 ）的合成

將 化合物 16-4（5.75 mg, 12.84 μmol）及 中間體 9-2（3.93 mg, 38.52 μmol）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入HATU （7.32 mg, 19.26 μmol）及二異丙基乙基胺（4.98 mg, 38.52 μmol），反應液30 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例14%-34%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（3 mg）。

MS m/z (ESI): 532.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.46 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.16 (d, J= 9.8 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.33 (s, 1H), 5.53 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.93 (d, J= 3.6 Hz, 2H), 1.92-1.82 (m, 2H), 1.04-0.99 (m, 2H), 0.90-0.87 (m, 2H), 0.87-0.82 (m, 3H)。

實施例 17 、( S)- N-((8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基-2- 甲基丙醯胺 （化合物17 ）

將 中間體 6-4（5 mg , 11.74 μmol）及 中間體 17-1（2.44 mg , 23.48 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （8.95 mg , 23.48 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（1.19 mg , 11.74 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm二氧化矽，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例22%-42%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1 mg）。

MS m/z (ESI): 512.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, Methanol- d ₄) δ = 8.32 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 5.62 (d, J= 16.4 Hz, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.42 (d, J= 16.4 Hz, 1H), 5.01 (s, 2H), 2.65 (s, 3H), 2.05-1.94 (m, 2H), 1.38 (s, 6H), 1.03 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。

實施例 18 、 N -((( S)-8- 氯-4- 乙基-4- 羥基-9- 甲基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基-3- 甲基丁醯胺 （化合物18 ）

將 中間體 6-4（5 mg , 11.74 μmol）及 中間體 18-1（2.77 mg , 23.48 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （8.95 mg , 23.48 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（1.19 mg , 11.74 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例25%-45%，溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.20 mg）。

MS m/z (ESI): 526.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, Methanol- d ₄) δ = 8.30 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 5.60 (d, J= 16.3 Hz, 1H), 5.56-5.45 (m, 2H), 5.42-5.37 (m, 1H), 5.00-4.90 (m, 2H), 3.91 (d, J= 3.3 Hz, 1H), 3.13 (d, J= 6.5 Hz, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.01-1.94 (m, 2H), 1.05-1.00 (m, 6H), 0.77-0.70 (m, 3H)。

實施例19-1 、2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物19, 化合物19-P1/P2 ）

步驟1 ：1-( 苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基-2,2- d ₂) 乙烷-1- 酮（中間體19-2 ）的合成

將 中間體 19-1（3 g）溶於無水DMF溶液（25 mL）中，加入氘代二氯甲烷（8.57 g）及碳酸鉀（8.18 g），加畢，升溫至90°C攪拌16h。隨後將反應液加入到水（100 mL）中，並用乙酸乙酯（200 mL*2）萃取，合併有機相用飽和食鹽水（100 mL）洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由柱層析色譜法純化（乙酸乙酯/石油醚 = 5:1），得到標題化合物（2.4 g）。

MS m/z (ESI): 167.1[M+H] ⁺。

步驟2 ：1-(6- 硝基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基-2,2- d ₂) 乙烷-1- 酮（中間體19-3 ）的合成

將 中間體 19-2（2.4 g）溶於無水醋酸（10 mL）中，在0℃滴加濃硝酸（32.50 g, 70%含量），加完0°C攪拌10分鐘。隨後升溫至室溫，攪拌1h。反應完畢後，將反應液滴加入到冰水（200 mL）中，過濾後，濾餅乾燥得到標題化合物（1.9 g）。

MS m/z (ESI): 212.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆) δ 7.69 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 2.49 (s, 3H).

步驟3 ： N-(6- 乙醯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基-2,2- d ₂) 乙醯胺（中間體19-4 ）的合成

將 中間體 19-3（1.8 g）溶於醋酸（25 mL）中，加入醋酸酐（1.84 g）及還原鐵粉（4.76 g），室溫攪拌1小時。反應完畢後，過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由柱層析色譜法純化（乙酸乙酯/石油醚 = 5:1），得到標題化合物（1.5 g）。

MS m/z (ESI): 224.1 [M+H] ⁺。

步驟4 ： N-(6-(2- 溴乙醯基) 苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基-2,2- d ₂) 乙醯胺（中間體19-5) 的合成

將HBr的乙酸溶液（2.39 g, 33%含量）滴加到 中間體 19-4（1.45 g）的無水醋酸（25 mL）溶液中，然後再滴加Br ₂（1.07 g），滴加完，室溫攪拌1小時。反應完畢後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物加入到水（50 mL）中，用乙酸乙酯（50 mL*2）萃取，有機相用飽和食鹽水（50 mL）洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾後，殘餘物藉由柱層析色譜法純化（乙酸乙酯/石油醚 = 5:1），得到標題化合物（1.3 g）。

MS m/z (ESI): 302.1 [M+H] ⁺。

步驟5 ：1-(6- 胺基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基-2,2- d ₂)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體19-6 ）的合成

將 中間體 19-5（1.2 g）及濃鹽酸（144.82 mg）溶於乙醇（15 mL）中，反應液在60℃下攪拌16小時。反應完畢後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物藉由高效液相色譜法純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.05%NH ₄HCO ₃）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例40%-50%），得到標題化合物（577 mg）。

MS m/z (ESI): 216.0 [M+H] ⁺。

步驟6 ：( S)-14-( 氯甲基)-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮-2,2- d ₂ （中間體19-7 ）的合成

將 中間體 19-6（100.0 mg）及 中間體 1-3（109.87 mg）溶於甲苯（1 mL）及乙酸（1 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（5.24 mg）。反應液在100 ℃攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，直接將反應液經減壓濃縮至乾。加入乙醇（5 mL）, 反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（5mL*2）洗滌得到標題化合物（100.0 mg）。

MS m/z (ESI): 443.0 [M+H] ⁺。

步驟7 ：( S)-14-( 胺基甲基)-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮-2,2- d ₂ （中間體19-8 ）的合成

將 中間體 19-7（100.00 mg）溶於無水乙醇（1.5 mL）及無水 N, N-二甲醯甲醯胺（1.5 mL）中，向其中加入烏洛托品（94.97 mg）。反應液在50℃攪拌6小時。反應結束後，反應液經減壓濃縮至乾，殘餘物經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Green ODS 150*30mm*5μm; 流動相: [A: 水（甲酸），B: 乙腈]; B%: 0%-30%, 12min）得到標題化合物（25.0 mg）。

MS m/z (ESI): 424.0 [M+H] ⁺。

步驟8 ：2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物19 ）的合成

將 中間體 19-8（7 mg）及 中間體 11-1（5.76 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（12.57 mg）及二異丙基乙胺（4.27 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例20%-50% , 溶析時間12分鐘），得到標題化合物（2.60 mg）。

MS m/z (ESI): 522.1[M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.62 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.48-5.41 (m, 5H), 4.72 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 3.59-3.52 (m, 1H), 2.00-1.76 (m, 2H), 1.05-0.96 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.37-0.30 (m, 2H), 0.29-0.19 (m, 2H)。

步驟9 ：2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物19-P1/P2 ）的合成

將 中間體 19-8（7 mg）及 中間體 14-10-P1（5.76 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑）- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（12.57 mg）及二異丙基乙胺（4.27 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例15%-45%，溶析時間12分鐘），得 化合物 19-P1（3.30 mg）。

MS m/z (ESI): 522.1[M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.62 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.54-5.51 (m, 1H), 5.47 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.72 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.55-3.53 (m, 1H), 1.94-1.78 (m, 2H), 1.05-0.96 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.40-0.30 (m, 2H), 0.29-0.19 (m, 2H)。

將 中間體 19-8（7 mg）及 中間體 14-10-P2（5.76 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（12.57 mg）及二異丙基乙胺（4.27 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例15%-45%，溶析時間12分鐘）得 化合物 19-P2（4.0 mg)。

MS m/z (ESI): 522.1[M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.62 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.54-5.51 (m, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.72 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.55-3.52 (m, 1H), 1.94-1.80 (m, 2H), 1.04-0.95 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.39-0.30 (m, 2H), 0.29-0.21 (m, 2H)。

柱子	Chiralcel OD-3 50A 4.6mm I.D., 3μm
流動相	A:二氧化碳
B:乙醇（0.05% 二乙胺）
流速	4 毫升/分鐘
波長	PDA 254nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector and QDa Detector

化合物19-P1：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為2.877分鐘；

化合物19-P2：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為2.690分鐘。

化合物19-P1構型確證（X射線單晶衍射方法）

單晶培養方法：秤取10mg化合物19-P1樣品置於1.5ml離心管中，加入300 μl吡啶，超聲波溶清後用封口膜封口，用針頭在封口膜上扎三個小孔，於20~30℃下緩慢揮發48小時，得針狀晶體。

所得單晶樣品進行X-射線分析，測試結果見表1及圖1。

表1 化合物19-P1的單晶樣品及晶體數據

化學式	C ₂₇H ₂₃D ₂N ₃O ₈, H ₂O, 2(C ₅H ₅N)
化學式量	697.73
晶系	單斜
空間群	P 1 21 1
a，Å	a=13.7058(5)
b，Å	b= 6.7026(3)
c，Å	c= 18.6204(7)
α，deg	90
β，deg	97.727(3)
γ，deg	90
體積，Å ³	1695.02(12)
Z	2
D _calc, g cm ^-3	1.367
溫度，K	193
輻射（波長）	Cu Kα(1.54178)
儀器	BRUKER D8 VENTURE
h，k，l範圍	-15＜=h＜=17, -8＜=k＜=7, -23＜=l＜=23
θ範圍	3.254-79.721
程序	SHELXL-2014
採集的數據	25136
Unique data	6674
R(Ｆ _o)	0.0571
R _W(Ｆ _o ²)	0.1713
擬合優度	1.045
絕對構型測定	0.04(11)

藉由上述X-射線晶體衍射實驗，確定 化合物 19-P1的化學結構為：

實施例19-2 、( S)-2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物19-S ） 的合成

將 中間體 19-8（2.4 g）及 中間體 9（1645.5 mg）溶於無水N,N-二甲基甲醯胺（25 mL），向其中加入O-(7-氮雜苯並三氮唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲六氟膦鹽（3.24 g）及N,N-二異丙基乙胺（1465.11 mg），反應液於25 °C攪拌3小時。反應結束後，反應液經減壓濃縮至乾，向殘餘物中加入乙酸乙酯（100 mL）攪拌16小時。過濾後，向濾餅中加入甲醇（50 mL）攪拌16小時。過濾後，得標題化合物（1.6 g）。

MS m/z (ESI): 522.1[M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.60 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.49 (d, J= 5.1 Hz, 1H), 5.47-5.37 (m, 4H), 4.71 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.54 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 1.97-1.75 (m, 2H), 1.07-0.94 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.40-0.29 (m, 2H), 0.29-0.20 (m, 2H)。

藉由以下手性超臨界流體色譜分析方法分別對 化合物 19-S進一步分析。

本實施例製得的 化合物 19-S在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為2.853分鐘；與實施例19-1製得的 化合物19-P1在相同色譜分析條件下的保留時間（2.877分鐘）基本一致。因此判斷 化合物 19-S 及化合物19-P1構型相同，為相同的化合物。

實施例20 、( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-8,9,12,14- 四氫-11 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物20 ）

步驟1 ：1-(5- 胺基苯並呋喃-4- 基)-2- 氯乙酮 （中間體20-2 ） 的合成

將三氯化硼（1 M，9.61 mL）溶於二氯乙烷（14 mL）中，反應液降溫至0℃，向其中加入 中間體 20-1（1.6 g，12.02 mmol）及氯乙腈（1.36 g，18.03 mmol），反應在0℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（1.92 g，14.42 mmol）。反應液在氮氣保護下升至25℃攪拌10分鐘。反應液於氮氣保護下90℃攪拌18小時。反應結束後，反應液冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（50 mL）及5% HCl （10 mL）於25℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（60 mL），有機相用水（30 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。經製備薄層色譜法（石油醚：（乙酸乙酯+乙醇=3:1） = 9:1）得到標題化合物（300 mg）。

MS m/z (ESI): 210.0 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, 氯仿-d)δ = 7.72 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J= 1.4 Hz, 1H), 6.66 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 4.78 (s, 2H)

步驟2 ：( S)-15-( 氯甲基)-8- 乙基-8- 羥基-11,14- 二氫-12 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮 （中間體20-3 ） 的合成

將 中間體 20-2（200 mg，954.07 μmol）及 中間體 1-3（251.15 mg，954.07 μmol）溶於無水甲苯（4 mL）中，向其中加入對甲苯磺酸吡啶鹽（23.98 mg，95.41 μmol），反應液於氮氣保護下90 °C攪拌16小時。反應結束後，反應液冷卻至室溫，反應液過濾，濾餅用乙醇（3 mL *2）洗滌，得到標題化合物（300 mg）。

MS m/z (ESI): 437.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ：( S)-15-( 胺基甲基)-8- 乙基-8- 羥基-11,14- 二氫-12 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮（中間體20-4 ） 的合成

將 中間體 20-3（70 mg, 160.24 μmol）溶於乙醇（0.5 mL）及無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入烏洛托品（89.85 mg, 640.96 μmol）。反應液在25℃攪拌3小時。反應結束後，反應液冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及甲醇的極性遞減的混合物作為溶析液; 甲醇梯度比例5%-25%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（17 mg）。

MS m/z (ESI):418.1 [M+H] ⁺。

步驟4 ：( S)- N-((8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-8,9,12,14- 四氫-11 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物20 ）

將 中間體 20-4（5.00 mg, 11.98 μmol）及羥基乙酸（4.55 mg, 59.89 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （6.83 mg, 17.97 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（4.64 mg，35.94 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例15%-35%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（3 mg）。

MS m/z (ESI): 476.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.48-8.41 (m, 1H), 8.35 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.22 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.14 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.58 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 5.10 (d, J= 5.3 Hz, 2H), 3.88 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 1.93-1.82 (m, 2H), 0.89 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。

實施例 21 、( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物21 ）

將 化合物 16-4（7 mg , 15.63 μmol）及羥基乙酸（1.78 mg , 25.48 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （11.89 mg , 31.26 μmol）及二異丙基乙胺（2.02 mg , 15.63 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例20%-40% , 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1 mg）。

MS m/z (ESI): 506.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, Methanol-d ₄) δ = 8.35 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.15 (dd, J= 1.8, 9.8 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.59-5.50 (m, 3H), 5.45 (s, 2H), 4.91 (d, J= 3.2 Hz, 2H), 3.84 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 1.90-1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例22 、( S)- N-((9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基-2- 甲基丙醯胺（化合物22 ）

將 化合物 16-4（20 mg, 44.66 μmol）及 中間體 17-1（13.95 mg, 133.98 μmol）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入HATU （25.47 mg, 66.99 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（17.32 mg, 133.98 μmol），反應液25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例20%-40%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.07 mg）。

MS m/z (ESI): 534.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.30 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.19-8.07 (m, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.55-5.45 (m, 3H), 5.45 (s, 2H), 4.90 (d, J= 3.7 Hz, 2H), 1.90-1.82 (m, 2H), 1.24 (d, J= 4.3 Hz, 6H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例23 、 N-((( S)-9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯胺（化合物23 ）

將 化合物 16-4（7.0 mg, 15.63 μmol）及 中間體 11-1（9.08 mg, 78.16 μmol）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入HATU （8.92 mg, 23.45 μmol）及二異丙基乙胺（6.06 mg, 46.89 μmol），反應液25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（YMC-Actus Triart C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例41%-61%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（7 mg）。

MS m/z (ESI): 546.2 [M+H] ⁺。

化合物23（7 mg）經過製備超臨界流體色譜分離純化（柱子: DAICEL CHIRALCEL OD-H（250mm*30mm,5μm）; 流動相: A: 二氧化碳; B: 乙醇 ; B%: 50%; 流速: 80毫升/分鐘），得到化合物 23-1（2.1 mg, RT: 5.106分鐘）及化合物 23-2（2.09 mg, RT: 5.641分鐘）。

化合物23-1：

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.32 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 8.15 (d, J= 9.7 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.53 (s, 2H), 5.47 (d, J= 5.1 Hz, 1H), 5.45 (s, 2H), 4.93-4.86 (m, 2H), 2.02-1.96 (m, 1H), 1.91-1.81 (m, 2H), 1.04-0.96 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.37-0.31 (m, 2H), 0.29-0.23 (m, 2H)

MS m/z (ESI): 546.2 [M+H] ⁺。

化合物23-2：

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.37-8.29 (m, 1H), 8.15 (d, J= 9.9 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.53 (s, 2H), 5.50-5.46 (m, 1H), 5.45 (s, 2H), 4.96-4.86 (m, 2H), 2.10-1.95 (m, 1H), 1.92-1.81 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.40-0.31 (m, 2H), 0.30-0.25 (m, 2H)

MS m/z (ESI): 546.2 [M+H] ⁺。

實施例25 、( R)- N-((( S)-9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基丙醯胺 （化合物25 ）

將 化合物 16-4（6 mg , 13.40 μmol）及 中間體 25-1（2.41 mg , 26.80 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （10.09 mg , 26.80 μmol）及二異丙基乙胺（1.73 mg , 13.49 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液 ; 乙腈梯度比例20%-40% , 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.80 mg）。

MS m/z (ESI): 520.1[M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.34 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.15 (d, J= 9.9 Hz, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.59 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 5.51 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.90 (s, 2H), 4.13-3.89 (m, 1H), 1.95-1.77 (m, 2H), 1.21 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例26 、( S)- N-((( S)-9- 氯-4- 乙基-8,10- 二氟-4- 羥基-3,14- 二氧代-3,4,12,14- 四氫-1 H- 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-11- 基) 甲基)-2- 羥基丙醯胺 （化合物26 ）

將 化合物 16-4（6 mg , 13.40 μmol）及 中間體 26-1（2.41 mg , 26.80 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （10.09 mg , 26.80 μmol）及 N, N-二異丙基乙胺（1.73 mg , 13.49 μmol），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例20%-40%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（1.60 mg）。

MS m/z (ESI): 520.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.34 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.23-8.03 (m, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.59 (d, J= 5.0 Hz, 1H), 5.51 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 4.90 (s, 2H), 4.07-3.96 (m, 1H), 1.93-1.81 (m, 2H), 1.21 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例27 、( S)- N-((4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-8,9,12,14- 四氫-11 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物27 ）

步驟1 ：(3- 氯-2- 羥基-5- 硝基苯基) 甲二醇 （中間體27-2 ） 的合成

將 中間體 27-1（6 g）溶於乙酸（25 mL）中，反應液降溫到0 ℃向其中緩慢加入硝酸（9.64 g）。反應液在25 ℃攪拌4小時。反應結束後，反應液緩慢低滴加到冰水中，然後用乙酸乙酯（60 mL）萃取三次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮至乾得到標題化合物（5.88 g）。

¹ H NMR (400MHz, METHANOL- d4) δ = 8.16 (d, J=1.4, 2.4 Hz, 1H), 8.07-8.01 (m, 1H), 5.68 (s, 1H)

步驟2 ：7- 氯-5- 硝基苯並呋喃-2- 甲酸乙酯 （中間體27-4 ） 的合成

將 中間體 27-2（5.88 g）， 中間體 27-3（7.69 g）及碳酸鉀（7.41g）溶於丙酮（60 mL）中，反應液在70 ℃攪拌6小時。反應結束後，向其中加入水（50 ml），然後用乙酸乙酯（50 mL）萃取三次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮至乾得到標題化合物（4.5 g）。

¹ H NMR (400MHz , 氯仿 - d) δ = 8.55 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 8.39 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 4.49 (q, J= 7.1 Hz, 2H), 1.46 (t, J= 7.1 Hz, 3H)

步驟3 ：7- 氯-5- 硝基苯並呋喃-2- 羧酸 （中間體27-5 ） 的合成

將 中間體 27-4（4.5 g）溶於甲醇（50 mL）中，向其中緩慢滴加氫氧化鈉水溶液（2 g in 25 ml H ₂O），反應液在25 ℃攪拌3小時。反應結束後，向其中加入水（120 ml），然後用乙酸乙酯（50 mL）萃取兩次。水相用稀鹽酸調節pH值到1，再用乙酸乙酯（50 mL）萃取三次，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮至乾得到標題化合物（4.0 g）

¹ H NMR (400MHz , 氯仿 - d) δ = 8.45 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 8.25 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H)

步驟4 ：7- 氯-5- 硝基苯並呋喃 （中間體27-6 ） 的合成

將 中間體 27-5（4 g）及氧化銅（1.05 g）溶於喹啉（28 mL）中，反應液通入氮氣並在200 ℃攪拌0.5小時。反應結束後，降溫到0 ℃向其中緩慢滴加入稀鹽酸（80 ml），然後加水（30 ml）並用乙酸乙酯（30 mL）萃取三次。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮至乾得到標題化合物（2.4 g）

¹ H NMR (400MHz , 氯仿 - d) δ = 8.49 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 8.31 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 7.02 (d, J= 2.3 Hz, 1H)

步驟5 ：7- 氯苯並呋喃-5- 胺 （中間體27-7 ） 的合成

將 中間體 27-6（2.4 g）及鐵粉（1.55 g）溶於甲醇（5 mL）中，向其中滴加氯化銨水溶液（148.91 mg , 5 ml），反應液通入氮氣並在80 ℃攪拌0.5小時。反應結束後，降溫到25 ℃向其中加入水（10 ml），並用乙酸乙酯（10 mL）萃取三次。有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後，減壓濃縮至乾得到標題化合物（1.2 g）。

MS m/z (ESI): 167.8[M+H] ⁺。

步驟6 ：1-(5- 胺基-7- 氯苯並呋喃-4- 基)-2- 氯乙-1- 酮 （中間體27-8 ） 的合成

將三氯化硼（671.17 mg）溶於1.2二氯乙烷（8 mL）中，反應液降溫至0 ℃，向其中加入 中間體 27-7（1.2 g）及氯乙腈（702.75 mg），反應在0 ℃下攪拌10分鐘，向其中加入三氯化鋁（1.24 g）。之後反應液在氮氣保護下升至25 ℃攪拌10分鐘。反應液於氮氣保護下90 ℃攪拌18小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（5 mL）及5 % HCl （1 mL）於25 ℃下攪拌30分鐘，再加入二氯甲烷（4 mL），有機相用水（2 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。過濾後，減壓濃縮至乾，殘餘物經製備薄層色譜法（二氧化矽，石油醚：（乙酸乙酯與乙醇的3/1混合溶劑） =9:1）得到標題化合物（500 mg）。

MS m/z (ESI): 243.8 [M+H] ⁺。

步驟 7: ( S)-4- 氯 -15-( 氯甲基 )-8- 乙基 -8- 羥基 -11,14- 二氫 -12 H- 呋喃並 [3,2- f] 吡喃並 [3',4':6,7] 吲哚嗪並 [1,2- b] 喹啉 -9,12(8 H)- 二酮（ 中間體 27-9 ） 的合成

將 中間體 27-8（450 mg）及 中間體 1-3（480.35 mg）溶於甲苯（5 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（23.17 mg）。反應液在90 ℃攪拌18小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25 ℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用石油醚（2mL*2）洗滌，乾燥後得到標題化合物（500 mg）。

MS m/z (ESI): 471.0 [M+H] ⁺。

步驟8 ：(S)-15-( 胺基甲基)-4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-11,14- 二氫-12 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12(8 H)- 二酮 （中間體27-10 ） 的合成

將 中間體 27-9（450 mg）溶於甲醇（1 mL）及 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL）的混合溶液中，向其中加入烏洛托品（267.71 mg）。反應液在50 ℃攪拌4小時。反應結束後，反應液冷卻至室溫，加入濃鹽酸（2 mL）攪拌，然後減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.225% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液;乙腈梯度比例13%-43%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（60.0 mg）。

MS m/z (ESI): 451.9 [M+H] ⁺。

步驟9 ：( S)- N-((4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-8,9,12,14- 四氫-11 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺 （化合物27 ） 的合成

將 中間體 27-10（10 mg）及2-羥基乙酸（5.05 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （16.83 mg）及二異丙基乙胺（2.86 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液 ; 乙腈梯度比例28%-48% , 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（6.0 mg）。

MS m/z (ESI):510.1 [M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.46 (s, 2H), 8.36-8.20 (m, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.58 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 5.49 (d, J= 2.9 Hz, 2H), 5.45 (s, 2H), 5.07 (s, 2H), 3.88 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.02-1.75 (m, 2H), 0.89 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例28 、 N-((( S)-4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-8,9,12,14- 四氫-11 H- 呋喃並[3,2- f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯胺 （化合物28 ）

將 中間體 27-10（10 mg）及 中間體 11-1（8.34 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （13.65 mg）及二異丙基乙胺（3.10 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5 μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液 ; 乙腈梯度比例34%-54% , 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（6.2 mg）。

MS m/z (ESI): 550.1[M+H] ⁺。

¹ H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.48-8.43 (m, 2H), 8.29 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.51 (s, 2H), 5.45 (s, 2H), 5.15-4.98 (m, 2H), 3.57 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 1.95-1.80 (m, 2H), 1.10-1.00 (m, 1H), 0.89 (t, J=7.3 Hz, 3H), 0.41-0.32 (m, 2H), 0.32-0.24 (m, 2H)。

實施例29 、2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-15- 硝基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物29 ）

步驟1 ：( S)-14-( 氯甲基)-7- 乙基-7- 羥基-15- 硝基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮（中間體29-1 ）的合成

將 中間體 14-7（500.0 mg）溶於硫酸（15 mL）中，反應液冷卻至0℃。再緩慢向其中加入硝酸（357.35g，70%純度），反應液於25 °C攪拌1.5小時，反應完畢後，依次緩慢加入冰水（10 mL）再加入二氯甲烷（30 mL），有機相用水40mL （20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。過濾後，濾液經減壓濃縮至乾得到標題化合物粗產物（280.0 mg）。

MS m/z (ESI): 486.0 [M+H] ⁺。

步驟2 ：( S)-14-( 胺基甲基)-7- 乙基-7- 羥基-15- 硝基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮（中間體29-2 ）的合成

將 中間體 29-1（270.0 mg）溶於甲醇（2 mL）及四氫呋喃（2 mL）中，向其中加入烏洛托品（233.73 mg）。反應液在60℃攪拌16小時。反應完畢後，待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（YMC-Pack CN C18柱 5 μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%FA）及甲醇的極性遞減的混合物作為溶析液; 甲醇梯度比例9%-29%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（15.0 mg）。

MS m/z (ESI): 467.1 [M+H] ⁺。

步驟3 ：2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-7- 羥基-15- 硝基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物29 ）的合成

將 中間體 29-2（12.00 mg）及 中間體 11-1（14.94 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），向其中加入HATU （14.67 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（9.98 mg），反應液於25 °C攪拌1.5小時。反應完畢後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5 μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例15%-45%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（5.20 mg）。

MS m/z (ESI): 565.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.25 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.52 (d, J= 2.6 Hz, 3H), 5.55 (d, J= 4.9 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.48 (d, J= 5.1 Hz, 2H), 3.53 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 1.91-1.83 (m, 2H), 1.10-0.98 (s, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.42-0.28 (m, 4H)。

實施例30 、 N-((( S)-15- 氯-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯胺（化合物30 ）

步驟1 ：2- 氯-3,4- 二羥基苯甲醛（中間體30-2 ）的合成

將 中間體 30-1（20.0 g）溶於無水二氯甲烷（100 mL）中，反應液冷卻至0 °C，向其中緩慢加入三溴化硼（87.41 g），反應液於25 °C攪拌4小時。反應結束後，反應液緩慢倒入冰水中，再加入乙酸乙酯（200 mL）,有機相用水（100 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經乙酸乙酯：石油醚=1：4溶液攪洗，過濾後得到標題化合物（14 g）。

MS m/z (ESI): 173.1 [M+H] ⁺。

步驟2 ：4- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 甲醛（中間體30-3 ）的合成

將 中間體 30-2（10.0 g）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（100 mL）中，向其中加入碳酸銫（28.32 g）及二碘甲烷（23.28 g）。反應液於100℃攪拌1小時。反應完畢後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入水（100 mL），再加入乙酸乙酯（150 mL），有機相用水（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液經減壓濃縮至乾得到標題化合物（5.2 g）。

MS m/z (ESI):185.4 [M+H] ⁺。

步驟3 ：1-(4- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙-1- 醇（中間體30-4 ）的合成

將 中間體 30-3（5.0 g）溶於無水四氫呋喃（100 mL）中，反應液冷卻至-78 °C，向其中緩慢加入甲基溴化鎂（4.85 g, 3M）。氮氣保護下反應液於25 °C攪拌4小時。反應結束後，依次緩慢加入水（50 mL），再加入乙酸乙酯（100 mL），有機相用水（50 mL*2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液經減壓濃縮至乾，殘餘物經製備柱層析色譜法純化（石油醚：乙酸乙酯=2:1）得到標題化合物（5.3 g）。

¹H NMR (400MHz, 氯仿- d) δ = 6.99 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 6.69 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 5.97 (s, 2H), 5.13 (q, J= 6.4 Hz, 1H), 1.41 (d, J= 6.4 Hz, 3H)

步驟4 ：1-(4- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙-1- 酮（中間體30-5 ） 的合成

將 中間體 30-4（5.2 g）溶於無水二氯甲烷（100 mL）中，反應液冷卻至0 °C，向其中緩慢加入戴斯-馬丁試劑（DMP）（16.49 g）。氮氣保護下反應液於25 °C攪拌2小時。反應結束後，依次緩慢加入水（50 mL），再加入乙酸乙酯（100 mL），有機相用水（50 mL*2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備柱層析色譜法純化（石油醚：乙酸乙酯 = 3:1）得到標題化合物（3.0 g）。

MS m/z (ESI): 199.2 [M+H] ⁺。

步驟5 ：1-(4- 氯-6- 硝基苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙-1- 酮（中間體30-6 ）的合成

將 中間體 30-5（2.50 g）溶於無水二氯甲烷（20 mL）中，向其中緩慢加入濃硫酸（1.23 g）及硝酸（5.67 g）。反應液在25 ℃攪拌3小時。反應結束後，反應液緩慢倒入冰水中，再加入乙酸乙酯（150 mL），有機相用水（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥，過濾後，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備柱層析色譜法（石油醚：乙酸乙酯=2:1）得到標題化合物（1.8 g）。

MS m/z (ESI): 244.1 [M+H] ⁺。

步驟6 ：1-(6- 胺基-4- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙-1- 酮（中間體30-7 ） 的合成

將 中間體 30-6（0.80g）溶於無水甲醇（6 mL）中，向其中加入Raney Ni （400.0 mg）。反應液在氫氣氛圍下25 ℃攪拌16小時。反應結束後，反應液經過濾，濾液減壓濃縮至乾得到標題化合物（510.0 mg）。

MS m/z (ESI): 214.2 [M+H] ⁺。

步驟7 ： N-(6- 乙醯基-7- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺（中間體30-8 ）的合成

將 中間體 30-7（260.0 mg）溶於無水二氯甲烷（5 mL）中，反應液冷卻至0°C向其中加入 N, N-二異丙基乙胺（235.95 mg）及氯乙醯（143.32 mg）。反應液在25 ℃攪拌1.5小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備層析色譜法純化（石油醚：乙酸乙酯=5:1）得到標題化合物（140.0 mg）。

MS m/z (ESI): 256.0 [M+H] ⁺。

步驟8 ： N-(6-(2- 溴乙醯基)-7- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基) 乙醯胺（中間體30-9 ）的合成

將 中間體 30-8（110.00 mg）溶於乙酸（2 mL）中，向其中加入溴化氫的乙酸溶液（158.24 mg, 33%含量），再緩慢向其中加入液溴（72.20 mg）反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液緩慢倒入冰水中，再加入乙酸乙酯（30 mL），有機相用水（20 mL*2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮至乾得到標題化合物（110.0 mg）。

MS m/z (ESI): 334.0 [M+H] ⁺。

步驟9 ：1-(6- 胺基-4- 氯苯並[ d][1,3] 二氧雜環戊烯-5- 基)-2- 氯乙-1- 酮（中間體30-10 ）的合成

將 中間體 30-9（110.00 mg）溶於無水乙醇（1 mL）及濃鹽酸（1 mL）中，反應液於60 °C攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，依次緩慢加入冰水（10 mL）及飽和碳酸氫鈉（10 mL），再加入二氯甲烷（30 mL）,有機相用水（20 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。過濾後，濾液經減壓濃縮至乾，殘餘物經製備薄層色譜法純化（石油醚：乙酸乙酯=3:1）得到標題化合物（75 mg）。

MS m/z (ESI): 248.0 [M+H] ⁺。

步驟10 ：( S)-15- 氯-14-( 氯甲基)-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮（中間體30-11 ） 的合成

將 中間體 30-10（75.00 mg）及 中間體 1-3（83.57 mg）溶於甲苯（3 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（PPTS）（11.4 mg）。反應液在90 ℃攪拌16小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2 mL* 2）洗滌，乾燥後得到標題化合物（75.0 mg）。

MS m/z (ESI): 475.1 [M+H] ⁺。

步驟11 ：( S)-14-( 胺基甲基)-15- 氯-7- 乙基-7- 羥基-10,13- 二氫-11 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-8,11(7 H)- 二酮（中間體30-12 ） 的合成

將 中間體 30-11（70.00 mg）溶於無水甲醇（2 mL）及無水四氫呋喃（1 mL）中，向其中加入烏洛托品（61.94 mg）。反應液在80℃攪拌2小時。反應結束後，待反應冷卻至室溫，減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5 μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例5%-25%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（16.0 mg）。

MS m/z (ESI): 456.1 [M+H] ⁺。

步驟12 ： N-((( S)-15- 氯-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 環丙基-2- 羥基乙醯胺（化合物30 ）的合成

將 中間體 30-12（5.00 mg）及 中間體 11-1（6.37 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （6.26 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（4.25 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5 μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.05%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例31%-51%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.30 mg）。

MS m/z (ESI): 554.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 7.78 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.30-6.25 (m, 1H), 6.16 (d, J= 1.5 Hz, 2H), 5.27-5.21 (m, 2H), 5.19 (s, 2H), 4.93-4.78 (m, 2H), 3.29 (dd, J= 2.4, 6.1 Hz, 1H), 1.68-1.56 (m, 2H), 0.81-0.72 (m, 1H), 0.63 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.14-0.06 (m, 2H), 0.05-0.03 (m, 2H)。

實施例31 、( S)- N-((15- 氯-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物31 ）

將 中間體 30-12（5 mg）及羥基乙酸（4.17 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入HATU（6.26 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（4.25 mg），反應液25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液過濾，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5 μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例20%-40%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.50 mg）。

MS m/z (ESI): 514.2 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.03 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.54-6.48 (m, 1H), 6.41 (s, 2H), 5.48 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.12 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 3.82 (s, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H)

實施例33 、( S)- N-((4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-1 H,11 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物33 ）

步驟1 ：7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 醇（中間體33-2 ）的合成

將 中間體 33-1（500 mg）溶於無水乙腈（5 mL）中，向其中加入NCS （547 mg），加畢，在25°C條件下攪拌2小時。反應結束後，向反應液加入水（10 mL），用乙酸乙酯萃取（10 mL *3次），飽和食鹽水（30 mL）洗滌有機層，有機層用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚:乙酸乙酯=100:1~10:1）得到標題化合物（600 mg）。

MS m/z (ESI): 169.0 [M+H] ⁺.

步驟2 ：7- 氯-5- 硝基-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 醇（中間體33-3 ）的合成

將 中間體 33-2（10 g）溶於AcOH （50 mL）及H ₂O （10 mL）中，在0°C向其中加入HNO ₃（8.62 g, 65%質量分數）。反應液於0°C下攪拌2小時。待反應完畢，緩慢將反應液加入冰水（200 mL）。過濾後，經減壓濃縮除去溶劑得到標題化合物（10 g）。

MS m/z (ESI): 214.0 [M+H] ⁺.

步驟3 ：5- 胺基-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 醇（中間體33-4 ）的合成

將 中間體 33-3（5 g）溶於無水DCM（50 mL），向其中加入AcOH （14.04 g）及Zn （7.61 g），反應液於25°C下攪拌12小時。待反應完畢，依次加入水（200 mL）及乙酸乙酯（200 mL），有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮除去溶劑得到標題化合物（4 g）。

MS m/z (ESI): 184.0 [M+H] ⁺.

步驟4 ：5- 乙醯胺基-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 基乙酸酯（中間體33-5 ）的合成

將 中間體 33-4（4 g）溶於無水二氯甲烷（40 mL），向其中加入乙酸酐（Ac ₂O）（6.67 g）及三乙胺（TEA）（6.61 g），反應液於25°C下攪拌12小時。待反應完畢，依次加入水（200 mL）及乙酸乙酯（200 mL），有機相用飽和NaCl水溶液（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚:乙酸乙酯=20:1~5:1）得到標題化合物（4 g）。

MS m/z (ESI): 268.0 [M+H] ⁺.

步驟5 ： N-(7- 氯-4- 羥基-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體33-6 ）的合成

將 中間體 33-5（4 g）溶於無水甲醇（20 mL），向其中加入K ₂CO ₃（6.19 g），反應液於25°C下攪拌12小時。待反應完畢，依次加入水（200 mL）及乙酸乙酯（200 mL），有機相用飽和NaCl水溶液（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚:乙酸乙酯=20:1~1:1）得到標題化合物（2.8 g）。

MS m/z (ESI): 226.0 [M+H] ⁺.

步驟6 ：5- 乙醯胺基-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 基三氟甲烷磺酸酯（中間體33-7 ）的合成

將 中間體 33-6（500 mg）溶於二氯甲烷（5 mL），向其中加入三氟甲磺酸酐（Tf ₂O）（749 mg）及三乙胺（TEA）（672 mg），反應液於25°C下攪拌12小時。待反應完畢，依次加入水（50 mL）及乙酸乙酯（50mL），有機相用飽和NaCl水溶液（50 mL *2）洗滌，洗滌後的有機相用適量無水硫酸鈉乾燥。有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚:乙酸乙酯=20:1~1:1）得到標題化合物（580 mg）。

MS m/z (ESI): 358.0 [M+H] ⁺.

步驟7 ： N-(4-(1- 丁氧基乙烯基)-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體33-8 ）的合成

將 中間體 33-7（430 mg）及乙烯基正丁醚（360.60 mg）溶於二氧六環（20 mL）中，加入二異丙基乙胺（DIEA）（466 mg），1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵（DPPF）（66 mg）及三(二亞苄基丙酮)二鈀（Pd ₂(dba) ₃）（110 mg），反應液於80°C氮氣保護下攪拌反應16小時。反應結束後，反應液用水（50 ml）稀釋，乙酸乙酯萃取（50 ml*3次），合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥。過濾後，有機相經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經矽膠柱層析法純化（石油醚:乙酸乙酯=20:1~1:1）得到標題化合物（300 mg）。

MS m/z (ESI): 308.0 [M+H] ⁺.

步驟8 ： N-(4- 乙醯基-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體33-9 ）的合成

將 中間體 33-8（200 mg）溶於二氧六環（5 mL）中，加入1N HCl（5 mL）, 25 ^oC下攪拌反應2小時。反應結束後，有機相經減壓濃縮除去溶劑得到標題化合物（150 mg）。

MS m/z (ESI): 252.0 [M+H] ⁺.

步驟9 ： N-(4-(2- 溴乙醯基)-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-5- 基) 乙醯胺（中間體33-10 ）的合成

將 中間體 33-9（300 mg）溶於HBr/AcOH （4 mL，33%質量分數）中，加入NBS （318.20 mg），反應液於25°C下攪拌反應2小時。待反應完畢，反應液經減壓濃縮除去溶劑，得到標題化合物（390 mg）。

MS m/z (ESI): 330.0 [M+H] ⁺.

步驟10: 1-(5- 胺基-7- 氯-2,3- 二氫-1 H- 茚-4- 基)-2- 氯乙烷-1- 酮（中間體33-11 ）的合成

將 中間體 33-10（300 mg）溶於無水乙醇加入HCl （12 M, 8.00 mL），反應液於80 °C下攪拌反應2小時。待反應完畢，反應液經減壓濃縮除去溶劑，殘餘物經製備高效液相色譜純化（色譜柱: Gemini NX C18 5μm*10*150mm; 流動相: A: 水（0.225%甲酸 v/v）, B: 乙腈; B%: 30%-70%）純化得到標題化合物（64 mg）。

MS m/z (ESI): 244.0 [M+H] ⁺.

步驟11 ：( S)-4- 氯-15-( 氯甲基)-8- 乙基-1,2,3,8,11,14- 六氫-9 H,12 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12- 二酮（中間體33-12 ） 的合成

將 中間體 33-11（45.00 mg）及 中間體 1-3（48.53 mg）溶於甲苯（1 mL）中，向其中加入對甲基苯磺酸吡啶鹽（4.63 mg）。反應液在90 ℃攪拌16小時。反應完畢後，冷卻至室溫，加入乙醇（1 mL），反應液於25℃攪拌0.5小時。反應液過濾，濾餅用乙醇（2 mL*2）洗滌，乾燥得到標題化合物（80.0 mg）。

MS m/z (ESI): 471.1 [M+H] ⁺.

步驟12 ：( S)-15-( 胺基甲基)-4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-1,2,3,8,11,14- 六氫-9 H,12 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-9,12- 二酮（中間體33-13 ） 的合成

將 中間體 33-12（40.00 mg）溶於無水甲醇（1 mL）及無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入烏洛托品（35.69 mg）。反應液在50℃攪拌16小時。反應完畢後，冷卻至室溫，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%FA）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例35%-55%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（15.0 mg）。

MS m/z (ESI): 452.1 [M+H] ⁺.

步驟13 ：( S)- N-((4- 氯-8- 乙基-8- 羥基-9,12- 二氧代-2,3,8,9,12,14- 六氫-1 H,11 H- 環戊二烯並[ f] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-15- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物33 ） 的合成

將 中間體 33-13（5.00 mg）及羥基乙酸（4.21 mg, 55.30 μmol）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU（6.31 mg）及 N, N-二異丙基乙胺（4.29 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應完畢，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Boston Green ODS C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.05%FA）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例32%-52%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.0 mg）。

MS m/z (ESI): 510.3 [M+H] ⁺.

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.36-8.30 (m, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.38 (s, 2H), 4.96 (d, J= 5.3 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.74-3.66 (m, 2H), 3.14 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.27-2.19 (m, 2H), 1.92-1.82 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H).

實施例34、 N-((( S)-4-氯-8-乙基-8-羥基-9,12-二氧代-2,3,8,9,12,14-六氫-1 H,11 H-環戊二烯並[ f]吡喃並[3',4':6,7]吲哚嗪並[1,2- b]喹啉-15-基)甲基)-2-環丙基-2-羥基乙醯胺（化合物34）

將 中間體 33-13（5.00 mg）及 中間體 11-1（6.42 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入HATU （6.31 mg）及二異丙基乙胺（4.29 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應完畢後，反應液過濾，經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.05%FA）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液; 乙腈梯度比例35%-55%, 溶析時間12分鐘）得到標題化合物（2.0 mg）。

MS m/z (ESI): 550.3 [M+H] ⁺.

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.36-8.31 (m, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.47-5.41 (m, 3H), 5.38 (s, 2H), 4.96-4.90 (m, 2H), 3.69 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 3.56 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 3.14 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.27-2.18 (m, 2H), 1.93-1.81 (m, 2H), 1.09-1.03 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.41-0.26 (m, 4H).

實施例35 、2- 環丙基- N-((( S)-7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物35 ）

將 中間體 12-11（6 mg）及 中間體 11-1（7.93 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL）中，向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（7.79 mg）及 N, N-二甲基二異丙胺（5.29 mg），反應液25°C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Prime C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例15%-45%, 溶析時間12分鐘），得到標題化合物（6.50 mg）。

MS m/z (ESI): 538.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.21 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.84 (d, J= 3.8 Hz, 2H), 3.53 (d, J= 6.3 Hz, 1H), 1.90-1.81 (m, 2H), 1.01 (d, J= 5.5 Hz, 1H), 0.89-0.85 (m, 3H), 0.33 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 0.30-0.25 (m, 2H)。

化合物35-P1 及35-P2 的合成

將 中間體 12-11（6 mg）及 中間體 14-10-P1（7.93 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL）中，向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（7.79 mg）及 N, N-二甲基二異丙胺（5.29 mg），反應液25°C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Green ODS C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例17%-47%, 溶析時間12分鐘），得化合物35-P1 （2.87 mg）。

MS m/z (ESI): 538.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ =8.19 (t, J =5.9 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.84 (d, J =4.6 Hz, 2H), 3.53 (d, J =6.4 Hz, 1H), 1.91 -1.80 (m, 2H), 1.06 -0.97 (m, 1H), 0.87 (t, J =7.3 Hz, 3H), 0.38 -0.31 (m, 2H), 0.31 -0.24 (m, 2H)。

將 中間體 12-11（6 mg）及 中間體 14-10-P2（4.76 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL）中，向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（10.38 mg）及 N, N-二甲基二異丙胺（1.76 mg），反應液25°C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Boston Green ODS C18柱 5μm二氧化矽，30 mm直徑，150 mm長度；用水（含有0.225%甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液；乙腈梯度比例17%-47%, 溶析時間12分鐘），得化合物35-P2 （2.01 mg）。

MS m/z (ESI): 538.1 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.26-8.16 (m, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.40 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.87-4.82 (m, 2H), 3.53 (d, J= 6.2 Hz, 1H), 1.94-1.80 (m, 2H), 1.05 -0.96 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.39 -0.30 (m, 2H), 0.31 -0.20 (m, 2H)。

柱子	Chiralcel OJ-3 100A 4.6mm I.D., 3μm
流動相	A:二氧化碳
B:乙醇（0.05% 二乙胺）
流速	2.8 毫升/分鐘
波長	PDA 220nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector

化合物35-P1 ：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為3.519分鐘；

化合物35-P2 ：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為3.573分鐘。

實施例36 、( S)- N-((7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基) 甲基)-2- 羥基乙醯胺（化合物36 ）

將 中間體 12-11（6 mg）及羥基乙酸（3.21 mg）溶於無水 N, N-二甲基甲醯胺（0.5 mL），向其中加入2-(7-氮雜苯並三氮唑)- N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸酯（10.38 mg）及二異丙基乙胺（1.76 mg），反應液於25 °C攪拌1小時。反應結束後，反應液減壓濃縮至乾，殘餘物經製備高效液相色譜純化（Waters Xbridge C18柱 5μm，25 mm直徑，100 mm長度；用水（含有0.05% 甲酸）及乙腈的極性遞減的混合物作為溶析液（乙腈梯度比例18%-48% , 溶析時間12分鐘），得到標題化合物（2.40 mg）。

MS m/z (ESI): 498.1[M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d6) δ = 8.20 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.39 (s, 2H), 5.46 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.85 (d, J= 4.3 Hz, 2H), 3.83 (s, 2H), 1.92-1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。

實施例37 、 N-((12 S)-12- 苄基-4- 環丙基-1-(( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基)-3,8,11,14,17- 五氧代-5- 氧基-2,7,10,13,16- 五氮雜十八烷-18- 基)-6-(2,5- 二氧代-2,5- 二氫-1 H- 吡咯-1- 基) 己醯胺 （化合物L1-14 ）、異構體L1-14-P1 及L1-14-P2 的合成

步驟1 ：中間體L1-14-2 的合成

將 起始原料 L1-14-1（25 g），醋酸鉛（43.79 g）及吡啶（6.98 g）溶於四氫呋喃（600 mL）及甲苯（200 mL）的混合溶劑中，在氮氣氛圍下加熱到85 °C，攪拌反應18小時。反應結束後冷卻至室溫，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經柱層析色譜法純化（色譜柱：ISCO®; 330 g SepaFlash® Silica Flash Column, 流動相梯度 0~75% 乙酸乙酯/石油醚，流速100 mL/min）得到標題化合物（18 g）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ =7.82 (d, J =7.5 Hz, 2H), 7.69 (d, J =7.3 Hz, 2H), 7.44-7.38 (m, 2H), 7.36-7.31 (m, 2H), 5.22 (s, 2H), 4.39 (d, J =6.8 Hz, 2H), 4.28-4.22 (m, 1H), 3.81 (s, 2H), 2.03 (s, 3H)。

MS m/z (ESI): 391.1 [M+Na] ⁺。

步驟2 ：中間體L1-14-3 的合成

將 中間體 L1-14-2（5 g）, 2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯（8.40 g）, 對甲基苯磺酸吡啶鹽（PPTS, 341.09 mg）溶於二氯甲烷（150 mL），反應液在氮氣氛圍下加熱到65 °C，攪拌反應48小時。反應結束後，冷卻至室溫，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經柱層析色譜法純化（色譜柱：ISCO®; 120 g SepaFlash® Silica Flash Column, 流動相梯度0~45%乙酸乙酯/石油醚，流速80 mL/min），隨後進一步經高效液相色譜純化（色譜柱: Boston Prime C18 150*30mm*5 μm; 流動相: [A：水（0.225%甲酸），B：乙腈]; B%: 42%-82%, 13min），得到標題化合物（1.4 g）。

MS m/z (ESI): 537.2 [M+Na] ⁺。

步驟 3 ： 中間體 L1-14-4-P1 及 L1-14-4-P2 的合成

將 中間體 L1-14-3（1.4 g）溶於混合溶劑甲醇（15 mL）及水（15 mL），加入濕鈀碳（10%質量含量，0.15 g），反應液在氫氣氛圍下25 °C攪拌反應16小時。反應結束後，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經高效液相色譜法純化（色譜柱：Boston Prime C18 150*30mm*5 μm; 流動相: [A: 水（0.225%甲酸），B: 乙腈]; B%: 24%-64%, 13分鐘），隨後進一步經超臨界流體色譜製備純化（色譜柱：DAICEL CHIRALPAK IC柱，10 μm二氧化矽，30mm直徑，250mm長度；使用異丙醇（含有0.1%氨水）作為溶析液），純化得到 中間體 L1-14-4-P1（130 mg）及 中間體 L1-14-4-P2（130 mg）。

藉由以下手性高效液相色譜分析方法分別對兩個異構體進一步分析。

手性高效液相色譜條件如下：

色譜柱	Chiralpak IC-3 100A, 4.6mm I.D., 3um
流動相	A:二氧化碳
B:異丙醇（0.05% 二乙胺）
流速	2.8毫升/分鐘
波長	PDA 220nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector and QDa Detector

中間體L1-14-4-P1 ：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為4.471分鐘；

MS m/z (ESI): 447.5 [M+Na] ⁺。

中間體L1-14-4-P2 ：

在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為5.692分鐘；

MS m/z (ESI): 447.3 [M+Na] ⁺。

步驟 4 ： 中間體 L1-14-5-P1 及 L1-14-5-P2 的合成

將2-氯三苯甲基氯樹脂（2-CTC-resin）（規格：約1.19mmol/g）（257 mg）加入二氯甲烷（3 mL）中，再加入 中間體 L1-14-4-P1（130 mg）及二異丙基乙基胺（59.37 mg）。反應液在氮氣氛圍下25 °C搖床搖晃反應16小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 中間體 L1-14-5-P1（330 mg）。

以中間體L1-14-4-P2（130 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-5-P2（350 mg）。

步驟5 ：中間體L1-14-6-P1 及L1-14-6-P2 的合成

將 中間體 L1-14-5-P1（330 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，加入哌啶（1.08 g）。反應液在25 °C放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 L1-14-6-P1（220 mg）。

以中間體L1-14-5-P2（350 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-6-P2（220 mg）。

步驟6 ：中間體L1-14-7-P1 及L1-14-7-P2 的合成

將 中間體 L1-14-6-P1（220 mg）及(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)- L-苯丙胺酸（230.17 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，向反應液中加入苯並三氮唑- N, N, N’, N’-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）（225.31 mg）及二異丙基乙基胺（99.96 mg）。反應液在25 °C放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 L1-14-7-P1（377 mg）。

以中間體L1-14-6-P2（220 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-7-P2（361 mg）。

步驟7 ：中間體L1-14-8-P1 及 L1-14-8-P2 的合成

將 中間體 L1-14-7-P1（377 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，加入哌啶（37.22 mg）。反應液在25°C放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 L1-14-8-P1（270 mg）。

以中間體L1-14-7-P2（361 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-8-P2（260 mg）。

步驟8 ：中間體L1-14-9-P1 及L1-14-9-P2 的合成

將 中間體 L1-14-8-P1（270 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，依次加入 N-((9 H-芴-9-基甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺酸（209.58 mg）及苯並三氮唑- N, N, N’, N’-四甲基脲六氟磷酸鹽（224.29 mg），二異丙基乙基胺（99.51 mg）。反應液在25 °C放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 中間體 L1-14-9-P1（403 mg）。

以中間體L1-14-8-P2（260 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-9-P2（420 mg）。

步驟9 ：中間體L1-14-10-P1 及L1-14-10-P2 的合成

將 中間體 L1-14-9-P1（403 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，加入哌啶（1.08 g）。反應液在25 °C放置於搖床搖晃1小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 L1-14-10-P1（300 mg）。

以中間體L1-14-9-P2（420 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-10-P2（320 mg）。

步驟10 ：中間體L1-14-12-P1 及L1-14-12-P2 的合成

將 中間體 L1-14-10-P1（300 mg）溶於 N, N-二甲基甲醯胺（5 mL）中，依次加入 化合物 L1-14-11（182.13 mg）及二異丙基乙基胺（99.41 mg）。反應液在25 °C放置於搖床搖晃16小時。反應結束後，樹脂用甲醇（10 mL）及二氯甲烷（10 mL）依次洗滌，重複3次。過濾，濾餅乾燥後得 L1-14-12-P1（374 mg）。

以中間體L1-14-10-P2（320 mg）及 中間體 L1-14-11（194.27 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-12-P2（387 mg）。

步驟11 ：中間體L1-14-13-P1 及L1-14-13-P2 的合成

將 中間體 L1-14-12-P1（374 mg）加入混合溶劑二氯甲烷（8 mL）及六氟異丙醇（HFIP，2 mL）中，反應液在25 °C下搖床搖晃反應0.5小時。反應結束後，過濾反應液去除樹脂，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物用高效液相色譜法純化（色譜柱: Boston Prime C18 150*30mm*5 μm; 流動相: [A: 水（0.225%甲酸），B: 乙腈]; B%: 15%-35%, 9分鐘），得 中間體 L1-14-13-P1（74 mg）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ =7.33 -7.20 (m, 5H), 6.81 (s, 2H), 4.77 -4.70 (m, 2H), 4.60-4.52 (m, 1H), 3.96 -3.70 (m, 6H), 3.61 (d, J =7.6 Hz, 1H), 3.55-3.47 (m, 2H), 3.27-3.23 (m, 1H), 3.05-2.98 (m, 1H), 2.30 (t, J =7.4 Hz, 2H), 1.72 -1.55 (m, 4H), 1.38 -1.29 (m, 2H), 1.16 -1.07 (m, 1H), 0.60 -0.47 (m, 4H).

MS m/z (ESI): 679.7 [M+Na] ⁺。

以中間體 L1-14-12-P2（387 mg）為原料，根據上述方法製備得到 中間體 L1-14-13-P2（86 mg）。

¹H NMR (400MHz, METHANOL- d ₄) δ = 7.40-7.21 (m, 5H), 6.82 (s, 2H), 4.81-4.67 (m, 2H), 4.60-4.50 (m, 1H), 3.97-3.70 (m, 6H), 3.66-3.57 (m, 1H), 3.56-3.47 (m, 2H), 3.27-3.22 (m, 1H), 3.08-2.97 (m, 1H), 2.35-2.26 (m, 2H), 1.75-1.55 (m, 4H), 1.41 -1.32 (m, 2H), 1.16 -1.06 (m, 1H), 0.60 -0.45 (m, 4H).

MS m/z (ESI): 679.5 [M+Na] ⁺。

步驟 12 ： 化合物 L1-14-P1 及 L1-14-P2 的合成

將 中間體 L1-14-13-P1（31.17 mg）， 中間體 14-8（20 mg），1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）（18.20 mg），吡啶（11.26 mg）及1-羥基苯並三唑（12.83 mg）溶解於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），反應液在氮氣氛圍下25°C攪拌反應2小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（色譜柱: Boston Green ODS 150*30mm*5 μm; 流動相: [A: 水（0.225%甲酸），B: 乙腈]; B%: 26%-46%, 12min）， 化合物 L1-14-P1（12.3 mg）。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ =8.65 (t, J =5.9 Hz, 1H), 8.58 (t, J =6.6 Hz, 1H), 8.27 (t, J =5.6 Hz, 1H), 8.17-8.02 (m, 2H), 7.99 (t, J =5.6 Hz, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.28 -7.19 (m, 5H), 7.19 -7.14 (m, 1H), 6.98 (s, 2H), 6.49 (s, 1H), 6.29 (d, J =3.7 Hz, 2H), 5.48 -5.37 (m, 4H), 4.85 -4.70 (m, 2H), 4.70-4.65 (m, 1H), 4.52-4.45 (m, 1H), 4.43-4.37 (m, 1H), 3.79 -3.54 (m, 7H), 3.49 (d, J =7.1 Hz, 1H), 3.08-3.01 (m, 1H), 2.85-2.74 (m, 1H), 2.14 -2.06 (m, 2H), 1.94 -1.80 (m, 2H), 1.52-1.42 (m, 4H), 1.27 -1.13 (m, 2H), 1.01 -0.92 (m, 1H), 0.88 (t, J =7.3 Hz, 3H), 0.41 -0.28 (m, 4H)。

MS m/z (ESI): 1060.3 [M+H] ⁺。

以中間體L1-14-13-P2（31.17 mg）及 中間體 14-8（20 mg）為原料，根據上述方法製備得到 化合物 L1-14-P2（11.4 mg）。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.72-8.52 (m, 2H), 8.33-8.25 (m, 1H), 8.17-7.94 (m, 3H), 7.80 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.32-7.19 (m, 5H), 7.18-7.12 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.49 (s, 1H), 6.35-6.25 (m, 2H), 5.48 -5.36 (m, 4H), 4.84 -4.59 (m, 3H), 4.54-4.45 (m, 1H), 4.44-4.35 (m, 1H), 3.81-3.54 (m, 7H), 3.49 (d, J= 6.7 Hz, 1H), 3.08-3.01 (m, 1H), 2.87-2.73 (m, 1H), 2.14 -2.05 (m, 2H), 1.95-1.77 (m, 2H), 1.53-1.39 (m, 4H), 1.25-1.13 (m, 2H), 1.03-0.82 (m, 4H), 0.43-0.25 (m, 4H)

MS m/z (ESI): 1060.3 [M+H] ⁺。

藉由以下手性高效液相色譜法分別對兩個異構體進一步分析。

手性高效液相色譜條件如下：

色譜柱	Chiralcel OJ-3 100A, 4.6mm I.D., 3um
流動相	A:二氧化碳
B:乙醇（0.05% 二乙胺）
流速	2.8毫升/分鐘
波長	PDA 220nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector and QDa Detector

化合物L1-14-P1在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為3.735分鐘。

化合物L1-14-P2在上述手性高效液相色譜條件下，其保留時間為3.901分鐘。

實施例38 ： N-((12 S)-12- 苄基-4- 環丙基-1-(( S)-7- 乙基-15- 氟-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基)-3,8,11,14,17- 五氧代-5- 氧基-2,7,10,13,16- 五氮雜十八烷-18- 基)-6-(2,5- 二氧代-2,5- 二氫-1 H- 吡咯-1- 基) 己醯胺（化合物L1-35-P1 ）

將 中間體 L1-14-13-P1（8 mg）、 中間體 12-11（5.89 mg）、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（4.67 mg）、吡啶（2.89 mg）及1-羥基苯並三唑（3.29 mg）溶解於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），反應液在氮氣氛圍下25°C攪拌反應2小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Prime C18 150*30mm*5um; 流動相: [A: 水（0.225%甲酸），B: 乙腈]; B%: 23%-45%, 10min），得 L1-35-P1（2.3 mg）。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.59 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 8.36-8.31 (m, 1H), 8.28 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.14-8.02 (m, 2H), 8.00 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.27-7.16 (m, 6H), 6.99 (s, 2H), 6.52 (s, 1H), 6.38 (d, J= 2.0 Hz, 2H), 5.49-5.41 (m, 4H), 4.90-4.82 (m, 2H), 4.69-4.62 (m, 1H), 4.53-4.43 (m, 2H), 3.79-3.54 (m, 7H), 3.47 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 3.06-3.00 (m, 1H), 2.80-2.74 (m, 1H), 2.10 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.91-1.79 (m, 2H), 1.51-1.41 (m, 4H), 1.22-1.14 (m, 2H), 1.02-0.94 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.40-0.27 (m, 4H)。

MS m/z (ESI): 1078.2 [M+H] ⁺。

藉由以下超臨界流體色譜法進一步分析。

超臨界流體色譜條件如下：

柱子	Chiralcel OJ-3 100A, 4.6mm I.D., 3um
流動相	A:二氧化碳
B乙醇（0.05% 二乙胺）
時間（分鐘）	B相%
0	5
4	40
2.5	40
1.5	5
流速	2.8毫升/分鐘
波長	PDA 220nm
柱溫	35℃
柱壓	1500 Psi
儀器型號	Waters UPCC with PDA Detector and QDa Detector

化合物L1-35-P1在上述超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.732分鐘。

實施例39-1 ： N-((12 S)-12- 苄基-4- 環丙基-1-(( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂)-3,8,11,14,17- 五氧代-5- 氧基-2,7,10,13,16- 五氮雜十八烷-18- 基)-6-(2,5- 二氧代-2,5- 二氫-1 H- 吡咯-1- 基) 己醯胺（化合物L1-19-P1 ）、異構體L1-19-P2 及消旋體L1-19 的合成

將 中間體 L1-14-13-P1（7.75 mg）， 中間體 19-8（5.0 mg），1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（4.53 mg），吡啶（2.80 mg）及1-羥基苯並三唑（3.19 mg）溶解於 N, N-二甲基甲醯胺（1 mL），反應液在氮氣氛圍下25°C攪拌反應2小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Green ODS 150*30mm*5um; 流動相: [A: 水（0.225%甲酸），B: 乙腈]; B%: 22%-52%, 12min），得 L1-19-P1（6.0 mg）。

MS m/z (ESI): 1062.3 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆) δ = 8.74-8.69 (m, 1H), 8.59 (t, J= 6.7 Hz, 1H), 8.32-8.26 (t, J =5.6 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 8.06 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.99-7.94 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.27-7.20 (m, 5H), 7.19-7.11 (m, 1H), 6.99 (s, 2H), 6.50 (s, 1H), 5.49-5.41 (m, 4H), 4.84-4.72 (m, 2H), 4.71-4.63 (m, 1H), 4.53-4.48 (m, 1H), 4.44-4.36 (m, 1H), 3.77-3.56 (m, 6H), 3.49 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 3.06-3.02 (m, 1H), 2.83-2.74 (m, 1H), 2.10 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 1.91-1.82 (m, 2H), 1.50-1.42 (m, 4H), 1.22-1.13 (m, 2H), 1.02-0.90 (s, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.38-0.29 (m, 4H)。

以中間體L1-14-13-P2（30.0 mg）及 中間體 19-8（25.2 mg）為原料，根據上述方法製備得到 化合物 L1-19-P2（19.0 mg）。

MS m/z (ESI): 1062.3 [M+H] ⁺。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.73-8.63 (m, 1H), 8.58 ( t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.30 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.13 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 8.07 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.01 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.28-7.19 (m, 5H), 7.19-7.12 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.50 (s, 1H), 5.48-5.39 (m, 4H), 4.84-4.71 (m, 2H), 4.68-4.55 (m, 1H), 4.53-4.43 (m, 1H), 4.42-4.35 (m, 1H), 3.77-3.54 (m, 6H), 3.49 (d, J=7.0 Hz, 1H), 3.08-3.02 (m, 1H), 2.85-2.76 (m, 1H), 2.09 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 4H), 1.25-1.12 (m, 2H), 1.02-0.94 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.44-0.24 (m, 4H)。

手性高效液相色譜條件如下：

L1-19-P1在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.775分鐘；

L1-19-P2在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.973分鐘。

消旋體化合物L1-19的合成

將 中間體 L1-14-13（30.00 mg, 參考 L1-14-13-P1合成方法以2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯（消旋體）為原料進行合成）、 中間體 19-8（25.15 mg）、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（17.52 mg）、吡啶（10.84 mg）及1-羥基苯並三唑（12.35 mg）溶解於N,N-二甲基甲醯胺（1 mL），反應液在25 °C氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Green ODS 150*30mm*5um; 流動相: [A: 水（甲酸），B: 乙腈]; B%: 33%-33%, 14min）得消旋體化合物L1-19 （15.4 mg）。

¹H NMR (400MHz, DMSO-d ₆) δ = 8.76-8.66 (m, 1H), 8.59 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 8.36-8.27 (m, 1H), 8.12 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 8.09-8.05 (m, 1H), 8.04-8.00 (m, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.27-7.19 (m, 5H), 7.17-7.12 (m, 1H), 7.00 (s, 2H), 6.50 (s, 1H), 5.49-5.42 (m, 4H), 4.84-4.71 (m, 2H), 4.71-4.63 (m, 1H), 4.53-4.42 (m, 1H), 4.44-4.35 (m, 1H), 3.83-3.54 (m, 6H), 3.49 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 3.08-3.02 (m, 1H), 2.86-2.73 (m, 1H), 2.10 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.93-1.79 (m, 2H), 1.49-1.37 (m, 4H), 1.25-1.13 (m, 2H), 1.01-0.92 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 0.43-0.25 (m, 4H)。

MS m/z (ESI): 1062.4 [M+H] ⁺。

實施例39-2 ： N-((4 S, 12 S)-12- 苄基-4- 環丙基-1-(( S)-7- 乙基-7- 羥基-8,11- 二氧代-7,8,11,13- 四氫-10 H-[1,3] 二氧雜環戊烯並[4,5- g] 吡喃並[3',4':6,7] 吲哚嗪並[1,2- b] 喹啉-14- 基-2,2- d ₂)-3,8,11,14,17- 五氧代-5- 氧基-2,7,10,13,16- 五氮雜十八烷-18- 基)-6-(2,5- 二氧代-2,5- 二氫-1 H- 吡咯-1- 基) 己醯胺（化合物L1-19-S ）

步驟1 ：L1-14-3-S 的合成

將 中間體 L1-14-2（28 g）、 中間體 9（23.5 g，由實施例14-2製得）溶於二氯甲烷（25 mL），向反應液加入三氟甲烷磺酸銀（139.50 mg），反應液在氮氣保護下，在25 °C攪拌反應108小時。反應結束後，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，殘餘物經快速矽膠柱純化（流動相梯度四氫呋喃/二氯甲醇：0~7%，流速70 mL/min），得標題化合物（10.3 g）。

MS m/z (ESI): 537.3 [M+Na] ⁺。

步驟2 ：L1-14-4-S 的合成

將 中間體 L1-14-3-S（10 g）溶於四氫呋喃（100 mL），加入濕鈀碳（10%質量含量，1 g），反應液在氫氣氛圍下，0°C 氫氣氛圍中攪拌反應16小時。反應結束後，過濾反應液，濾液減壓濃縮至乾，向殘餘物中加入石油醚/乙酸乙酯（10 mL/0.5mL）攪拌2小時，過濾後，得標題化合物（6 g）。

MS m/z (ESI): 447.2 [M+Na] ⁺。

藉由以下手性高效液相色譜分析方法分別對 L1-14-4-S進一步分析。

手性高效液相色譜條件如下：

L1-14-4-S在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為4.385分鐘；與 化合物L1-14-4-P1在相同色譜分析條件下的保留時間（4.471分鐘）基本一致。因此 L1-14-4-S與 L1-14-4-P1構型相同，為同一化合物。

步驟3 ：L1-19-S 的合成

將 中間體 L1-14-13-S（600 mg，以 L1-14-4-S為原料，參考 L1-14-13-P1合成方法製備獲得）， 中間體 19-8（502.93 mg），1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）（350.31 mg），吡啶（216.82 mg）及1-羥基苯並三唑（246.91 mg）溶解於N,N-二甲基甲醯胺（2 mL），反應液在25°C氮氣保護下，攪拌反應2小時。反應結束後，反應液經高效液相色譜法純化（柱子: Boston Green ODS 150*30mm*5um; 流動相: [A: 水（0.05%甲酸），B: 乙腈]; B%: 24%-54%, 12min），得標題化合物（286 mg）。

¹H NMR (400MHz, DMSO- d ₆ ) δ = 8.72-8.63 (m, 1H), 8.62-8.52 (m, 1H), 8.34-8.26 (m, 1H), 8.16-7.94 (m, 3H), 7.78 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.26-7.13(m, 6H), 6.99 (s, 1H), 6.56-6.42 (m, 1H), 5.52-5.40 (m, 4H), 4.85-4.60 (m, 3H), 4.59-4.46 (m, 1H), 4.44-4.38 (m, 1H), 3.79-3.53 (m, 6H), 3.52-3.44 (m, 2H), 3.08-3.02 (m, 1H), 2.85-2.75 (m, 1H), 2.09 (t, J=7.8 Hz, 2H), 1.95-1.75 (m, 2H), 1.58-1.38 (m, 4H), 1.26-1.09 (m, 2H), 1.04-0.96 (m, 1H), 0.88 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 0.42-0.26 (m, 4H)。

MS m/z (ESI): 1062.5 [M+H] ⁺。

藉由以下手性高效液相色譜法分別對 L1-19-S進一步分析。

手性高效液相色譜條件如下：

L1-19-S在上述手性超臨界流體色譜條件下，其保留時間為3.748分鐘；與實施例39-1製得的 化合物L1-19-P1在相同色譜分析條件下的保留時間（3.775分鐘）基本一致。因此判斷 L1-19-S與 L1-19-P1為同一構型，屬於相同的化合物。

化合物LI-0及L1-00的合成分別參考專利文獻WO2019195665A1及WO2020063676A1。

實施例40 ：抗體- 藥物偶聯物的製備

40.1 抗體：

40.1.1 抗人類HER2單株抗體的構建及生產

抗人類HER2單株抗體的序列如下表2所示，將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列重組至帶有訊號肽及重鏈恆定區/輕鏈恆定區序列的表現載體pTT5上，得到表現VH-CH1-Fc/VL-CL的重組質體。經測序驗證後，提取質體，並轉染宿主細胞。經培養，獲得分泌抗體的細胞培養上清。

表2 抗人類HER2抗體序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

抗體名稱	編號	序列訊息
trastuzumab-VH	SEQ ID NO:1	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
trastuzumab-VL	SEQ ID NO:2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
pertuzumab-VH	SEQ ID NO:3	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS
pertuzumab-VL	SEQ ID NO:4	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK
human CH1-Fc	SEQ ID NO:5	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
human CL	SEQ ID NO:6	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗體名稱	CDR1	CDR2	CDR3
trastuzumab-VH	DTYIH （SEQ ID NO:7）	RIYPTNGYTRYADSVKG （SEQ ID NO:8）	WGGDGFYAMDY （SEQ ID NO:9）
trastuzumab-VL	RASQDVNTAVA （SEQ ID NO:10）	SASFLYS （SEQ ID NO:11）	QQHYTTPPT （SEQ ID NO:12）
pertuzumab-VH	DYTMD （SEQ ID NO:13）	DVNPNSGGSIYNQRFKG （SEQ ID NO:14）	NLGPSFYFDY （SEQ ID NO:15）
pertuzumab-VL	KASQDVSIGVA （SEQ ID NO:16）	SASYRYT （SEQ ID NO:17）	QQYYIYPYT （SEQ ID NO:18）

40.1.2 抗人類p95HER2單株抗體篩選

抗人類p95HER2單株抗體藉由免疫小鼠產生。免疫原為hu p95HER2.ECD-Fc蛋白，選擇血清中抗體效價高並且效價趨於平臺的小鼠的脾淋巴細胞製備雜交瘤細胞，藉由ELISA、FACS等所屬技術領域常規方法篩選得到陽性雜交瘤株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，並純化抗體及測序。經測序得到鼠源抗人類p95HER2抗體。

藉由比對IMGT（http://imgt.cines.fr）人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫及MOE（Molecular Operating Environment, 分子操作環境）軟體，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈及輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列，在此基礎上，根據需要，進行回復突變以保證原有的親和力及/或進行熱點突變以消除分子修飾風險。最終優化的人源化抗體及對應序列如表3所示。

表3優化的人源化抗體序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

抗體名稱	編號	序列訊息
P95-Hab01-VH	SEQ ID NO:19	EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLYTSGMGVSWIRQPPGKALEWLANIYWDNDKRYNPSLKSRLTISKDTSGNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARSFLYYGNSHWYFDVWGQGTTVTVSS
P95-Hab01-VL	SEQ ID NO:20	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYRTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYHSYPPTFGQGTKLEIK
P95-Hab02-VH	SEQ ID NO:21	EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGLGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDTAKNFNPVLKSRLTVSKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVRIGNYGSPYFDYWGQGTTVTVSS
P95-Hab02-VL	SEQ ID NO:22	LIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLTDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVHSSPYSFGGGTKVEIK
抗體名稱	CDR1	CDR2	CDR3
P95-Hab01-VH	TSGMGVS （SEQ ID NO:23）	NIYWD NDKRYNPSLKS （SEQ ID NO:24）	SFLYYGNSHWYFDV （SEQ ID NO:25）
P95-Hab01-VL	SASSSVSYMY （SEQ ID NO:26）	RTSNLAS （SEQ ID NO:27）	QQYHSYPPT （SEQ ID NO:28）
P95-Hab02-VH	TFGLGVG （SEQ ID NO:29）	HIWWDTAKNFNPVLKS （SEQ ID NO:30）	IGNYGSPYFDY （SEQ ID NO:31）
P95-Hab02-VL	LASQSIGTYLA （SEQ ID NO:32）	AATSLTD （SEQ ID NO:33）	QQVHSSPYS （SEQ ID NO:34）

40.1.3 p95HER2/HER2雙特異性抗體的構建及生產

由VH1-linker-VH2-CH1-Fc及VL1-linker-VL2-CL組成DVD-Ig形式的抗體，其中，VH1及VL1靶向HER2，VH2及VL2靶向p95HER2，linker可省略。雙特異性抗體具體序列參見表4。按所設計結構，分別在pTT5載體上構建雙特異性抗體輕重鏈表現質體，並於HEK293細胞中表現。

表4 p95HER2/HER2雙特異性抗體的序列訊息

抗體名稱	編號	序列訊息
BsAb02-P重鏈全長序列	SEQ ID NO:35	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGLGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDTAKNFNPVLKSRLTVSKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCVRIGNYGSPYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
BsAb02-P輕鏈全長序列	SEQ ID NO:36	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSLIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQSIGTYLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLTDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVHSSPYSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

40.1.4 抗人類CDH6抗體的構建及生產

抗人類CDH6單株抗體CDH6-Ab及CDH6-Ab-1的序列如下表5所示（抗體序列來自US20200171163A1）。

表5 抗人類CDH6抗體CDH6-Ab及CDH6-Ab-1序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

抗體名稱	編號	序列訊息
CDH6-Ab-VH	SEQ ID NO:37	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRNFMHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGETEYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVYGGFAGGYFDFWGQGTLVTVSS
CDH6-Ab-VL	SEQ ID NO:38	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNIYKNLAWYQQKPGKAPKLLIYDANTLQTGVPSRFSGSGSGSDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYYSGWAFGQGTKVEIK
CDH6-Ab-1-VH	SEQ ID NO:46	QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHGMHWVRQAPGKGLEWVSVISGSGSNTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQWGSYAFDSWGQGTLVTVSS
CDH6-Ab-1-VL	SEQ ID NO:47	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAVSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSGTFPPTTFGQGTKVEIK
human CH1-Fc-1	SEQ ID NO:39	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
human CL	SEQ ID NO:6	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗體名稱	CDR1	CDR2	CDR3
CDH6-Ab-VH	RNFMH （SEQ ID NO:40）	WIYPGDGETEYAQKFQG （SEQ ID NO:41）	GVYGGFAGGYFDF （SEQ ID NO:42）
CDH6-Ab-VL	KASQNIYKNLA （SEQ ID NO:43）	DANTLQT （SEQ ID NO:44）	QQYYSGWA (SEQ ID NO:45）
CDH6-Ab-1-VH	SHGMH （SEQ ID NO:48）	VISGSGSNTGYADSVKG （SEQ ID NO:49）	QWGSYAFDS （SEQ ID NO:50）
CDH6-Ab-1-VL	RASQSISSYLN （SEQ ID NO:51）	AVSTLQS （SEQ ID NO:52）	QQSGTFPPTT （SEQ ID NO:53）

CDH6-Ab-2及CDH6-Ab-3藉由免疫小鼠產生。免疫原為人類CDH6-hFc蛋白及過表現人類CDH6的HEK293T細胞，選擇血清中抗體效價高的小鼠的脾淋巴細胞製備雜交瘤細胞，藉由ELISA、FACS等所屬技術領域常規方法篩選得到陽性雜交瘤株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，並純化抗體及測序，得到鼠源抗人類CDH6抗體及其可變區序列。藉由比對IMGT（http://imgt.cines.fr）人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫及MOE（Molecular Operating Environment）軟體，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈及輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列，在此基礎上，根據需要，進行回復突變以保證原有的親和力及/或進行熱點突變以消除分子修飾風險。最終優化的人源化抗體CDH6-Ab-2及CDH6-Ab-3對應的VH及VL以及根據Kabat形式劃分的CDR序列如表6所示。

表6抗人類CDH6抗體CDH6-Ab-2及CDH6-Ab-3序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

抗體名稱	編號	序列訊息
CDH6-Ab-2-VH	SEQ ID NO:54	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDNYINWVRQAPGQRLEWMGWIYPGTGNSYYNEKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYLCASSYGDSFDYWGQGTTVTVSS
CDH6-Ab-2-VL	SEQ ID NO:55	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQDIRNYLNWYQQKPGQTPKLLISYTSRLHSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYSQLPWTFGGGTKVEIK
CDH6-Ab-3-VH	SEQ ID NO:56	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMAWVRQAPGQGLEWMGYIFPNSGGTDYSQKFKGRVTLTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELGADYGDYYAMDHWGQGTTVTVSS
CDH6-Ab-3-VL	SEQ ID NO:57	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIDSYLAWYQQKPGKSPKLLVYSATLLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHYYRTPPTFGQGTKLEIK
human CH1-Fc-1	SEQ ID NO:5	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
human CL	SEQ ID NO:6	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗體名稱	CDR1	CDR2	CDR3
CDH6-Ab-2-VH	DNYIN （SEQ ID NO:58）	WIYPGTGNSYYNEKFKG （SEQ ID NO:59）	SYGDSFDY （SEQ ID NO:60）
CDH6-Ab-2-VL	RASQDIRNYLN （SEQ ID NO:61）	YTSRLHS （SEQ ID NO:62）	QQYSQLPWT （SEQ ID NO:63）
CDH6-Ab-3-VH	DYYMA （SEQ ID NO:64）	YIFPNSGGTDYSQKFKG （SEQ ID NO:65）	ELGADYGDYYAMDH （SEQ ID NO:66）
CDH6-Ab-3-VL	RASENIDSYLA （SEQ ID NO:67）	SATLLAD （SEQ ID NO:68）	QHYYRTPPT （SEQ ID NO:69）

將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列重組至帶有訊號肽（MGWSWILLFLLSVTAGVHS，SEQ ID NO：70）及重鏈恆定區/輕鏈恆定區序列的表現載體pTT5上，得到表現VH-CH1-Fc/VL-CL的重組質體。將質體及轉染試劑PEI （Polysciences，貨號：24765-1）加入OPTI-MEM（Gibco，貨號：11058021）中混勻後靜置15min，加入Expi293F細胞（廠商：Thermofisher，貨號：A14527）中，放入5% CO ₂，120rpm，37℃ 搖床培養。轉染第二天，加入OPM-293 ProFeed（上海奧浦邁，貨號：F081918-001）及6g/L葡萄糖（廠商：Sigma，貨號: G7528）。轉染第六天，獲得分泌抗體的細胞培養上清。

40.1.5 抗人類LIV-1單株抗體的構建及生產

抗人類LIV-1單株抗體LIV1-Ab-1的序列如下表7所示（抗體序列來源US20200165335A），將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列重組至帶有訊號肽及重鏈恆定區（序列）/輕鏈恆定區序列的表現載體pTT5上，得到表現LIV1-Ab-1的重組質體。經測序驗證後，提取質體。將質體及轉染試劑PEI （Polysciences，貨號：24765-1 ）加入OPTI-MEM（Gibco，貨號：11058021）中混勻後靜置15min，加入Expi293細胞（廠商：Thermofisher，貨號：A14527）中，放入5% CO2，120rpm，37℃ 搖床培養。轉染第二天，加入OPM-293 ProFeed（上海奧浦邁，貨號：F081918-001）及6g/L葡萄糖（廠商：Sigma，貨號: G7528）。轉染第六天，收集細胞上清。

表7 抗人類LIV-1抗體序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

序列名稱	編號	序列訊息
LIV1-Ab-1-VH	SEQ ID NO:71	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGLTIEDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIDPENGDTEYGPKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSRLRSDDTAVYYCAVHNAHYGTWFAYWGQGTLVTVSS
LIV1-Ab-1-VL	SEQ ID NO:72	DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLLHSSGNTYLEWYQQRPGQSPRPLIYKISTRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIKR
human CH1-Fc-2	SEQ ID NO:73	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
human CL	SEQ ID NO:6	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列名稱	CDR1	CDR2	CDR3
LIV1-Ab-1-VH	DYYMH （SEQ ID NO:74）	WIDPENGDTEYGPKFQG （SEQ ID NO:75）	HNAHYGTWFAY （SEQ ID NO:76）
LIV1-Ab-1-VL	RSSQSLLHSSGNTYLE （SEQ ID NO:77）	KISTRFS （SEQ ID NO:78）	FQGSHVPYT （SEQ ID NO:79）

40.1.6抗人類ROR1單株抗體的構建及生產

抗人類ROR1單株抗體ROR1-Ab-1可變區序列來自專利WO2020198531A2，ROR1-Ab-2可變區序列來自專利CN113521300A，並且ROR1-Ab-3可變區序列來自專利WO2020074724A1（見表8）。將編碼前述抗體VH及VL的核酸序列重組至帶有人類IgG1的CH及CL的pTT59表現載體中，分別獲得表現ROR1-Ab-1、ROR1-Ab-2及ROR1-Ab-3的重組質體。

將質體及轉染試劑PEI （Polysciences，24765-1 ）加入OPTI-MEM（Gibco，貨號：11058021）中混勻後靜置15min，加入Expi293細胞（Thermofisher，A14527）中，放入5% CO2，120rpm，37℃ 搖床培養。轉染第二天，加入OPM-293 ProFeed（上海奧浦邁，F081918-001）及6g/L葡萄糖（Sigma，G7528）。轉染第六天，收集細胞上清。

表8 抗人類ROR1抗體序列訊息及其CDR分析（根據Kabat劃分）

序列名稱	序列編號	胺基酸序列
ROR1-Ab-1-VH	（SEQ ID NO:80）	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYAFTAYNIHWVRQAPGQGLEWMGSFDPYDGGSSYNQKFKDRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGWYYFDYWGHGTLVTVSS
ROR1-Ab-1-VL	（SEQ ID NO:81）	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKSISKYLAWYQQKPGQAPRLLIYSGSTLQSGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCQQHDESPYTFGEGTKVEIK
ROR1-Ab-2-VH	（SEQ ID NO:82）	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISHNSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFISARKSLGRSYSNGMDVWGQGTLVTVSS
ROR1-Ab-2-VL	（SEQ ID NO:83）	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVTWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVL
ROR1-Ab-3-VH	（SEQ ID NO:84）	QVQLRESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDISSYYMSWVRQPPGKGLEWIGAIGISGNAYYASWAKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDHPTYGMDLWGPGTLVTVSS
ROR1-Ab-3-VL	（SEQ ID NO:85）	SYELTQPPSVSVAPGKTARITCEGNNIGSKAVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSAYVFGGGTKLTVL
human CH1-Fc	SEQ ID NO:5	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
human CL	SEQ ID NO:6	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列名稱	CDR1	CDR2	CDR3
ROR1-Ab-1-VH	AYNIH （SEQ ID NO:86）	SFDPYDGGSSYNQKFKD （SEQ ID NO:87）	GWYYFDY （SEQ ID NO:88）
ROR1-Ab-1-VL	RASKSISKYLA （SEQ ID NO:89）	SGSTLQS （SEQ ID NO:90）	QQHDESPYT （SEQ ID NO:91）
ROR1-Ab-2-VH	NYAMS （SEQ ID NO:92）	SISHNSGSTYYADSVKG （SEQ ID NO:93）	FISARKSLGRSYSNGMDV （SEQ ID NO:94）
ROR1-Ab-2-VL	TGSSSNIGSNDVT （SEQ ID NO:95）	ADSKRPS （SEQ ID NO:96）	GTWDYSLSGYV （SEQ ID NO:97）
ROR1-Ab-3-VH	SYYMS （SEQ ID NO:98）	AIGISGNAYYASWAKS （SEQ ID NO:99）	DHPTYGMDL （SEQ ID NO:100）
ROR1-Ab-3-VL	EGNNIGSKAVH （SEQ ID NO:101）	DDDERPS （SEQ ID NO:102）	QVWDSSAYV （SEQ ID NO:103）

40.2 抗體純化：利用ProteinA親和層析，從細胞培養上清中純化上述抗體。Protein A親和柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍柱體積，然後利用純水清洗3-5倍柱體積。利用如1×PBS（pH7.4）緩衝體系作為平衡緩衝液對層析柱平衡3-5倍柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1分鐘或更長時間，結合完畢後利用1×PBS（pH7.4）洗滌層析柱3-5倍柱體積至紫外吸收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉（pH3.0-3.5）緩衝液進行樣品溶析，根據紫外監測收集溶析峰，溶析產物利用1M Tris-HCl（pH8.0）快速調節pH至5-6暫存。對於溶析產物可以利用所屬技術領域中具有通常知識者熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除溶析產物中的聚體成分以提高樣品純度。純化後符合純度要求的蛋白，透析換液並進行後續偶聯及檢測。

40.3 偶聯：將上述抗體加入超濾管Amicon-Ultra-30kD並濃縮換液至50mM磷酸鹽，150mM NaCl，1mM EDTA，pH 6.5的緩衝液中，向抗體溶液中加入7~8 倍的10mM 三(2-羧乙基)膦溶液（TCEP），將混合溶液於恆溫金屬搖床在25℃下還原抗體2~3小時。將15~20倍（DMSO溶解）的對應藥物-連接子化合物（由實施例37-39製備獲得，或參照實施例37-39的方法製備獲得）加入反應體系，反應液在25℃偶聯2~16小時。對反應產物超濾濃縮換液至磷酸鹽（PBS）緩衝液，去除未反應游離小分子毒素。採用SEC及LC-MS方法對ADC產品進行純度及DAR值分析。

40.4 SEC純度分析: 應用SEC-HPLC法分析待測蛋白樣品，表徵重組蛋白的分子大小均一性，測定重組蛋白的純度。本法所用的HPLC為Agilent 1260，色譜柱為TSKgel G3000SWXL（購自Tosoh Bioscience），流動相為200 mM磷酸緩衝液，pH 7.0/異丙醇（v/v 9:1），檢測溫度為25°C，流速為0.5 mL/min，檢測波長為280 nm，目標蛋白上樣量為50 µg，分析時間為40分鐘。

40.5 DAR值測定：應用超高效液相色譜-質譜（UHPLC-MS）聯用法測量ADC分子的DAR值。首先將待測ADC分子經過PNGase F處理，脫掉N醣修飾，再用二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）處理，37°C培養1小時，還原成輕重鏈，然後用Thermo Vanquish UHPLC-Q Exactive Plus 質譜系統進行分析，取2 µg蛋白注射到Waters ACQUITY Protein BEH分子排阻色譜柱，流動相為含0.1%甲酸、0.05%TFA、25%乙腈的水溶液，流速為0.2 mL/min，分析時間30分鐘，質譜儀為Thermo Q Exactive Plus，質譜主要參數分別為噴霧電壓3.8 kV，毛細管加熱溫度300℃，鞘氣流速35 arb，母離子掃描範圍800-3000等，最後，應用質譜數據分析軟體Biopharma Finder 4.1，藉由Respect算法去卷積處理，分別計算出輕重鏈質譜峰的分子量訊息及各組分的質譜響應訊號，以此計算出待測ADC樣品的DAR值。

用上述同樣的方法製備同型對照抗體Ab-ISO（anti-FITC-hIgG1抗體），並偶聯Linker+Payload化合物，得到相應ADC的同型對照。

用上述同樣的方法，將抗體ROR1-Ab-1、ROR1-Ab-2及ROR1-Ab-3分別與化合物L1-0偶聯，製備得到ADC-L1-0-8、ADC-L1-0-9、ADC-L1-0-10，DAR值分別為6.6、5.5、7.5；將抗體LIV1-Ab-1與化合物L1-0偶聯得到ADC-L1-0-7，DAR值分別為6.7；將抗體trastuzumab、pertuzumab分別與化合物L1-00偶聯得到ADC-L1-00-2及ADC-L1-00-11，DAR值分別為6.8及7.3；將抗體trastuzumab、pertuzumab分別與化合物L1-0偶聯得到ADC-L1-0-2及ADC-L1-0-11，DAR值均為7.3；將抗體CDH6-Ab、CDH6-Ab-2、CDH6-Ab-3分別與化合物L1-0偶聯得到ADC-L1-0-3、ADC-L1-0-5及ADC-L1-0-6，DAR值分別為7.4、7.4及7.2。

表9 抗體-藥物偶聯物、其DAR值及SEC純度

偶聯物編號	ADC結構	DAR	SEC純度（單體%）
ADC-L1-14-P2-1		8.0	95.7
ADC-L2-14-P2-1		8.4	97.0
ADC-L1-21-1		7.6	94.3
ADC-L2-21-1		6.7	92.3
ADC-L2-31-2		7.4	91.4
ADC-L1-14-P1-2		7.0	90.1
ADC-L1-14-P2-2		7.4	83.7
ADC-L1-14-P1-3		8.5	93.1
ADC-L1-35-P1-3		8.0	93.1
ADC-L1-19-P1-3		7.2	93.7
ADC-DS		7.5	92.83
ADC-L1-19-P1-4		6.9	95.25
ADC-L1-19-P1-5		8.2	96.03
ADC-L1-14-P1-5		7.8	97.05
ADC-L1-19-P1-6		8.0	92.86
ADC-L1-14-P1-6		7.6	92.89
ADC-L1-19-P1-2		7.6	83.33
ADC-L1-19-2		7.0	88.3
ADC-L1-19-3		7.1	94.09
ADC-L1-19 -4		6.3	94.25
ADC-L1-19 -5		6.8	93.95
ADC-L1-19 -6		7.4	91.92
ADC-L1-19-P1-7		8.3	95.2
ADC-L1-19 -7		6.5	90.1
ADC-L1-19-P1-8		7.7	93.7
ADC-L1-19 -8		7.1	91.38
ADC-L1-19-P1-9		7.7	98.96
ADC-L1-19 -9		7.3	94.62
ADC-L1-19-P1-10		8.0	93.9
ADC-L1-19 -10		7.2	88.1
ADC-L1-19-P1-11		7.3	90.71
ADC-L1-19 -11		7.0	90.04

實施例41 ：生物學活性及相關性質測試

以下測試例中的化合物均根據本發明上述實施例的方法製備獲得。

測試例1 、式（D-H ）化合物抗腫瘤細胞增殖活性測試

細胞與材料：人類結直腸癌細胞株HCT116購於康源博創，人類乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，人類卵巢癌細胞株OVCAR3購於ATCC，牛血清（Gibco#10099-141C），McCoy's 5a培養基（Gibco#16600-082），1640培養基（Gibco#A10491-01），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA（Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），牛胰島素（Solarbio#I8040）購於Solarbio公司，96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：HCT116 細胞及SKBR3細胞均用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，OVCAR3細胞用含20%胎牛血清+2 μg/mL牛胰島素+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養。處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測化合物對HCT116、SKBR3及OVCAR3三個細胞株增殖的抑制活性。將HCT116細胞（每孔1500個）、SKBR3細胞（每孔3000個）及OVCAR3細胞（每孔5000個）接種於96孔板中，置於37℃、5% CO ₂條件下培養24小時。加入待測化合物溶液後（化合物用DMSO溶解，使化合物濃度為1 mM，然後利用DMSO將化合物稀釋至3 μM，3倍稀釋共9個濃度，轉移10 μL配置好的化合物溶液至96孔板中，使之終濃度為0-300 nM），置於37 ℃、5% CO ₂條件下繼續培養。HCT116 細胞培養3天，SKBR3細胞及OVCAR3細胞培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試藥物，其他操作與實驗組一致。

數據分析：計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合化合物IC ₅₀。

抑制百分數（% Inhibition）=1-100% * （Signal-Bottom） / （Top-Bottom）

Signal指實驗組的訊號值，Bottom指陰性對照組的平均訊號值，Top指陽性對照組的平均訊號值。

實驗結果：

在本實驗條件下，本發明化合物對HCT116 細胞、SKBR3細胞及OVCAR3細胞均展現出較強的增殖抑制活性。本發明化合物相應的抗細胞增殖活性具體見表10。

表10式（D-H）化合物抗腫瘤細胞增殖活性

化合物	HCT116 抗增殖活性 IC ₅₀（nM）	SKBR3 抗增殖活性 IC ₅₀（nM）	OVCAR3 抗增殖活性 IC ₅₀（nM）
化合物 1	N/A	8.5	N/A
化合物 3	N/A	3.6	N/A
化合物 5	N/A	3.3	N/A
化合物 6	N/A	4.8	2.1
化合物 7	++	N/A	N/A
化合物 9	+++	2.1	N/A
化合物 10	+++	2.3	N/A
化合物 11	N/A	3.2	N/A
化合物 13	+++	N/A	0.7
化合物 14	+++	2.2	0.9
化合物 14-P1	+++	2.1	0.6
化合物 14-P2	++	3.5	1.0
化合物 15	++	N/A	N/A
化合物 16	+++	2.3	N/A
化合物 17	+++	2.7	N/A
化合物 18	++	5.1	N/A
化合物 19	+++	2.9	1.0
化合物 19-P1	+++	1.9	0.6
化合物 19-P2	+++	2.9	1.0
化合物 20	++	10.5	N/A
化合物 21	+++	4.0	1.7
化合物 22	+++	3.5	1.4
化合物 23	+++	5.3	3.9
化合物 25	+++	3.7	2.0
化合物 26	+++	4.2	1.6
化合物 27	++	N/A	N/A
化合物 28	+++	N/A	N/A
化合物 29	++	N/A	N/A
化合物 30	+++	N/A	0.4
化合物 31	+++	N/A	0.2
化合物 33	+++	N/A	0.8
化合物 34	+++	N/A	0.6
化合物 35	+++	3.5	1.2
化合物 35-P1	+++	2.1	0.5
化合物 35-P2	N/A	3.6	1.8

在上表中，用於指示結合活性的符號所表示含義為：

「+++」表示待測化合物對細胞的增殖抑制活性IC ₅₀範圍為＜ 10 nM。

「++」表示待測化合物對細胞的增殖抑制活性IC ₅₀範圍為10 ~100 nM。

「N/A」表示未測試。

測試例2 、抗p95HER2/HER2 雙抗BsAb02-P 的Biacore 測定

該實驗用Biacore 8K （GE）儀器，採用多循環動力學測定待測抗體BsAb02-P與人類p95HER2（hu p95HER2.ECD-Fc，SEQ ID NO: 104，斜體為人類p95HER2胞外區，下劃線為Fc標籤： MPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK，自行表現製備該蛋白）及HER2（購自Acro，HE2-H5225）的親和力。

實驗運行緩衝液為1×HBS-EP+緩衝溶液（10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfactant P20）（Cat. # BR-1006-69，GE），流經池溫度設置為25℃，樣品倉溫度設置為16℃。兩者都用運行緩衝液預處理。用Protein A生物傳感晶片（Cat. # 29127556, GE）親和捕獲一定量的待測抗體，然後於晶片表面流經一定濃度的人類p95HER2抗原或人類HER2抗原，利用Biacore 8K儀器（GE）實時檢測反應訊號從而獲得結合及解離曲線。在每個循環解離完成後，pH1.5的甘胺酸-鹽酸再生溶液（Cat. # BR-1003-54, GE）將抗原-抗體複合物洗淨再生。具體地，藉由注射溶液中不同濃度的人類p95HER2及人類HER2抗原240s來檢測其結合過程，流速為30μL/min，從50nM起始，以1:1稀釋，設置一系列濃度梯度；解離時間長達900s，最後用10mM甘胺酸-鹽酸溶液（pH 1.5）以30μL/min的流速洗滌30s完成晶片表面的再生。

實驗得到的數據用GE Biacore 8K Evaluation version 2.0軟體以（1:1）Langmuir模型進行擬合，得出結合速率（Ka）、解離速率（Kd）及親和力數值（KD），具體見表11-12所示。實驗結果表明，本發明的p95HER2/HER2雙抗能與人類p95HER2及HER2以高親和力結合。

表11 p95HER2/HER2雙抗與人類p95HER2蛋白的反應親和力

抗體	Ka （1/Ms）	Kd （1/s）	KD （M）
BsAb02-P	6.23E+04	6.03E-05	9.68E-10

表12 p95HER2/HER2雙抗與人類HER2蛋白的反應親和力

抗體	Ka （1/Ms）	Kd （1/s）	KD （M）
BsAb02-P	2.07E+05	6.11E-05	2.95E-10

測試例3-1 、 流式細胞實驗（FACS ）檢測抗HER2 ADC 及抗體與SKBR3 腫瘤細胞結合活性

將SKBR3細胞（來源於ATCC）收集後計數，以2×10 ⁵個/孔鋪於96孔板（Corning，3795）。加入梯度稀釋的待測樣品，於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，加入Alexa Fluor-647 山羊抗人類Fc二抗（JacksonImmuno，109-605-098），於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，再懸浮細胞，用流式細胞儀（BD FACSCanto™ II）分析平均螢光強度（MFI）。使用Graphpad Prism軟體對數據進行四參數曲線擬合分析，得到EC ₅₀值，結果如表13所示。

表13. FACS檢測抗HER2 ADC及抗體與SKBR3腫瘤細胞的結合反應

偶聯物/抗體編號	EC ₅₀（nM）
ADC-L1-19-2	3.34
ADC-L1-19-P1-2	3.26
Trastuzumab	3.38
ADC-L1-19-11	4.75
ADC-L1-19-P1-11	4.51
Pertuzumab	3.73

測試例3-2 、抗ROR1 ADC 及抗體與穩轉株細胞MCF7-hROR1 clone 2G2 結合活性測試

穩轉株細胞構建

編碼人類ROR1胺基酸序列（SEQ ID NO：105）的核苷酸序列被轉殖到pLVX慢病毒載體，並在HEK293T細胞中製備病毒顆粒。對MCF7細胞株（購自中科院）進行慢病毒感染後，在含5μg/ml嘌呤黴素（Gibco，貨號A1113803）的含10%（w/w）胎牛血清（ExCell Bio，貨號FND500）的DMEM（Gibco，貨號11995073）培養基中選擇性培養1周，用ROR1-Ab-1及山羊抗鼠IgG（H+L）抗體（Jackson，貨號：115605006）在流式細胞儀FACS Aria III（購自BD Biosciences）上分選不同表現水準陽性細胞群到96孔板，並置於37℃，5%（v/v）CO2培養，大約2周後選擇部分細胞進行擴增選擇生長狀況較好、螢光強度較高、均一性較好的陽性細胞群繼續擴大培養並液氮凍存。單株穩轉株細胞鑑定見表14。

表14 人類ROR1蛋白的MCF7穩轉細胞株FACS檢測結果

序號	穩定轉染陽性細胞群	細胞平均螢光密度
IgG亞型對照	ROR1-Ab-1
1	MCF7-hROR1 clone 2G2	54.7	26497

全長人類ROR1胺基酸序列（SEQ ID NO：105）： QETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY

流式細胞實驗（FACS）檢測抗ROR1 ADC及抗體與穩轉株細胞MCF7-hROR1 clone 2G2結合活性

將上述步驟中構建的穩轉株細胞MCF7-hROR1 clone 2G2在T-75細胞培養瓶中擴大培養至對數生長期，離心丟棄培養基上清，細胞沉澱用PBS洗滌2次，加入待測ADC及抗體，起始濃度為100nM，5倍梯度稀釋8個點，4°培養1小時後。用PBS洗兩遍後，加入二抗：Alexa Fluor® 647 AffiniPure Goat Anti-Human IgG （H+L）（購自Jackson Immuno，貨號：109-605-088），於4℃培養1小時。用PBS洗兩遍後，再懸浮細胞，經FACS（FACS CantoTM，購自BD公司）檢測及分析。使用Graphpad Prism軟體對數據進行四參數曲線擬合分析，得到EC ₅₀值，結果如表15所示。

表15. FACS檢測抗ROR1 ADC及抗體與MCF7-hROR1 clone 2G2細胞的結合活性

偶聯物/抗體編號	EC ₅₀（nM）
ADC-L1-19-8	0.68
ADC-L1-19-P1-8	0.34
ADC-L1-0-8	0.75
ROR1-Ab-1	0.99
ADC-L1-19-9	0.42
ADC-L1-19-P1-9	0.50
ADC-L1-0-9	0.43
ROR1-Ab-2	0.98
ADC-L1-19-10	0.98
ADC-L1-19-P1-10	0.57
ADC-L1-0-10	1.25
ROR1-Ab-3	0.91

測試例3-3 、流式細胞實驗（FACS ）檢測抗LIV-1 ADC 及抗體與OVCAR3 腫瘤細胞結合活性

OVCAR3細胞（來源於ATCC）屬於LIV-1高表現的腫瘤模型，將OVCAR3細胞收集後計數，以2×10 ⁵個/孔鋪於96孔板（Corning，3795）。加入梯度稀釋的待測樣品，於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，加入Alexa Fluor-647 Goat anti-human Fc二抗（JacksonImmuno，109-605-098），於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，再懸浮細胞，用流式細胞儀（BD FACSCanto™ II）分析平均螢光強度（MFI）。使用Graphpad Prism軟體對數據進行四參數曲線擬合分析，得到EC ₅₀值，結果如表16所示。

表16. FACS檢測抗LIV-1 ADC及抗體與OVCAR3腫瘤細胞的結合反應

偶聯物/抗體編號	EC ₅₀（nM）
ADC-L1-19-7	0.83
ADC-L1-19-P1-7	0.67
ADC-L1-0-7	1.45
LIV1-Ab-1	0.53

測試例4-1 、抗HER2-ADC 腫瘤細胞增殖活性測試1

細胞與材料：人類乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，人類乳腺癌細胞株SKBR3-p95HER2構建於先聲藥業（構建方法參見專利申請CN202210094806.6），人類卵巢癌細胞株SKOV3購於ATCC，牛血清，McCoy's 5a 培養基，青黴素-鏈黴素及0.25% Trypsin-EDTA購於Gibco公司（美國，貨號同測試例1），96孔板購於康寧公司（美國，貨號同測試例1），Cell-Titer Glo試劑購於普洛麥格公司（美國，貨號同測試例1）。

細胞培養： SKBR3細胞、SKBR3-p95HER2細胞及SKOV3細胞均用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對SKBR3、SKBR3-p95HER2及SKOV3三個細胞株增殖的抑制活性。將SKBR3細胞（每孔3000個）、SKBR3-p95HER2細胞（每孔3000個）及SKOV3細胞（每孔600個）接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養24小時。加入待測ADC溶液後（ADC用上述對應細胞的培養基稀釋，調整ADC濃度為20 nM或200 nM, 然後繼續以培養基進行3倍梯度稀釋共8個濃度，轉移10 μL配置好的ADC溶液至96孔板中，使起始終濃度為2 nM或20 nM），置於37 ℃、5% CO ₂條件下繼續培養。SKBR3細胞、SKBR3-p95HER2細胞及SKOV3細胞培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合化合物IC ₅₀。

實驗結果：在本實驗條件下，本發明ADC對SKBR3細胞、SKBR3-p95HER2細胞及SKOV3細胞均展現出較強的增殖抑制活性，詳見表17。

表17 ADC抗腫瘤細胞增殖活性

偶聯物編號	SKBR3/p95 抗增殖活性（IC ₅₀, nM）	SKBR3 抗增殖活性（IC ₅₀, nM）	SKOV3 抗增殖活性（IC ₅₀, nM）
ADC-L1-14-P2-1	0.05187	N/A	N/A
ADC-L2-14-P2-1	0.03691	N/A	N/A
ADC-L1-21-1	0.1428	N/A	N/A
ADC-L2-21-1	0.1694	N/A	N/A
ADC-L2-31-2	N/A	0.04567	0.2052
ADC-L1-14-P1-2	N/A	0.03227	0.1249
ADC-L1-14-P2-2	N/A	0.03108	0.116

「N/A」表示未測試。

測試例4-2 、抗HER2-ADC 腫瘤細胞增殖活性測試2

細胞與材料：人類乳腺導管癌細胞株T47D（中表現細胞株）購於ATCC，人類乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，McCoy's 5a 培養基（Gibco#16600-082），1640培養基（Gibco#A10491-01），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：SKBR3細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液，T47D細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液，兩株細胞均在37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對SKBR3及T47D兩細胞株增殖的抑制活性。將SKBR3及T47D細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度。T47D細胞為2000個細胞/90 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至1000 nM，並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移10 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始終濃度為100 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養7天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

SKBR3細胞為5000個細胞/90 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至1000 nM，並進行5倍梯度稀釋，共9個濃度梯度，然後轉移10 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始終濃度為100 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養3天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

抑制百分數（% Inhibition）=1-100% * （Signal-Bottom） / （Top-Bottom）。

實驗結果：

在本實驗條件下，本發明抗HER2-ADC對人類乳腺導管癌細胞株T47D及人類乳腺癌細胞株SKBR3展現出較強的增殖抑制活性，見表18 。

表18 ADC抗腫瘤細胞增殖活性

偶聯物編號	T47D	SKBR3
IC ₅₀（nM）	最大抑制率（%）	IC ₅₀（nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-19-11	5.329	89.4	0.0005041	64.5
ADC-L1-19-P1-11	1.671	88.9	0.01225	55.4
ADC-L1-00-11	12.16	90.8	1.413	35.4
ADC-L1-19-2	6.93	90.6	0.0832	54.0
ADC-L1-19-P1-2	3.552	92.5	0.0852	54.3
ADC-L1-00-2	13.97	90.5	0.4424	41.7

測試例5 、抗CDH6 抗體及對應ADC 的細胞結合活性

將OVCAR3細胞收集後計數，以2×10 ⁵個/孔鋪於96孔板（Corning，3795）。加入梯度稀釋的待測樣品，於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，加入Alexa Fluor-647 Goat anti-human Fc二抗（JacksonImmuno，109-605-098），於4℃培養1小時。用冰PBS洗兩遍後，再懸浮細胞，用流式細胞儀（BD FACSCanto™ II）分析平均螢光強度（MFI）。使用Graphpad Prism軟體對數據進行四參數曲線擬合分析，得到EC ₅₀值，結果如表19所示。

表19 CDH6抗體及CDH6-ADC與OVCAR3細胞的結合活性

偶聯物/抗體編號	EC ₅₀（nM）
ADC-L1-14-P1-3	0.49
ADC-L1-19-3	0.34
ADC-L1-19-P1-3	0.36
CDH6-Ab	0.71
ADC-L1-19-5	0.51
ADC-L1-19-P1-5	0.53
CDH6-Ab-2	0.63
ADC-L1-19-6	0.85
ADC-L1-19-P1-6	0.80
CDH6-Ab-3	0.78

測試例6-1 、抗CDH6-ADC 抗腫瘤細胞增殖活性測試

細胞與材料：人類卵巢癌細胞株OVCAR3（CDH6高表現細胞株）購於ATCC，人類卵巢畸胎瘤細胞株PA-1購於ATCC，牛血清，1640培養基（Gibco#A10491-01），MEM 培養基（Gibco#11095-080），MEM NEAA （Gibco#11140-050），丙酮酸鈉（Gibco#11360-070），青黴素-鏈黴素及0.25% Trypsin-EDTA（Gibco#25200-056）購於Gibco公司，牛胰島素購於Solarbio公司，96孔板購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：OVCAR3細胞用含20%胎牛血清+2 μg/mL牛胰島素+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，PA-1細胞均用含10%胎牛血清+1%MEM NEAA+1%丙酮酸鈉+1%青黴素-鏈黴素的MEM培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養。處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對OVCAR3及PA-1兩個細胞株增殖的抑制活性。將OVCAR3及PA-1細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度，將OVCAR3細胞（每孔5000個）及PA-1（每孔800個）接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養24小時。加入待測ADC溶液後（ADC用上述對應細胞的培養基稀釋，使ADC濃度為100 nM，然後繼續以培養基進行3倍梯度稀釋共8個濃度，轉移10 μL配置好的ADC溶液至96孔板中，使之終濃度為0-10 nM），置於37 ℃、5% CO ₂條件下繼續培養。OVCAR3細胞及PA-1細胞培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

實驗結果：在本實驗條件下，本發明抗CDH6-ADC對人類卵巢癌細胞株OVCAR3及人類卵巢畸胎瘤細胞株PA-1細胞均展現出較強的增殖抑制活性，詳見表20。

表20 ADC抗腫瘤細胞增殖活性

偶聯物編號	OVCAR3	PA-1
IC ₅₀（nM）	IC ₅₀（nM）
ADC-L1-14-P1-3	0.012	0.063
ADC-L1-35-P1-3	0.018	0.043
ADC-L1-19-P1-3	0.015	0.018
ADC-L1-19-3	0.015	0.0094
ADC-L1-14-P1-6	0.031	0.070
ADC-L1-19-P1-6	0.015	0.017
ADC-L1-19-6	0.022	0.023
ADC-L1-14-P1-5	0.028	0.030
ADC-L1-19-P1-5	0.019	0.018
ADC-L1-19-5	0.021	0.017

測試例6-2 、抗LIV-1-ADC 抗腫瘤細胞增殖活性測試

細胞與材料：人類卵巢癌細胞株OVCAR3、人類非小細胞肺癌細胞株H838購於ATCC，1640培養基（Gibco#A10491-01），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），牛胰島素（Solarbio#I8040）購於Solarbio公司，96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：OVCAR3細胞用含20%胎牛血清+2 μg/mL牛胰島素+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，H838細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對OVCAR3及H838細胞株增殖的抑制活性。將OVCAR3或H838細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度，OVCAR3細胞為1500個細胞/90 μL/孔，H838細胞為450個細胞/90 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000 nM, 並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移10 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始終濃度為500 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，本發明抗LIV-1-ADC對人類卵巢癌細胞株OVCAR3、人類非小細胞肺癌細胞株H838展現出較強的增殖抑制活性，詳見表21。

表21 ADC抗腫瘤細胞增殖活性

偶聯物編號	H838	OVCAR3
IC ₅₀（nM）	最大抑制率（%）	IC ₅₀（nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-19-7	21.8	97.5	5.126	90.7
ADC-L1-19-P1-7	17.3	96.6	3.195	91.6
ADC-L1-0-7	127.8	90.9	10.5	85.3

測試例6-3 、抗ROR1-ADC 抗腫瘤細胞增殖活性測試

細胞與材料：人類乳腺癌細胞株hROR1-MCF7由先聲再明構建，DMEM 培養基（Gibco#11995-065），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：hROR1-MCF7細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的DMEM培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

細胞增殖活性檢測：利用Cell-Titer Glo試劑檢測ADC對hROR1-MCF7細胞株增殖的抑制活性。將hROR1-MCF7細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度，hROR1-MCF7細胞為1700個細胞/90 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至500 nM，並進行4倍梯度稀釋，共9個濃度梯度，然後轉移10 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始終濃度為50 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

另設陰性對照組及陽性對照組分別作為Bottom及Top。陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致；陽性對照組為不加受試藥物藥物，其他操作與實驗組一致。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，本發明抗ROR1-ADC對人類卵巢癌細胞株hROR1-MCF7展現出較強的增殖抑制活性，詳見表22。

表22 ADC抗腫瘤細胞增殖活性

偶聯物編號	hROR1-MCF7
IC ₅₀（nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-19-8	0.18	39.88
ADC-L1-19-P1-8	0.10	38.61
ADC-L1-19-9	0.31	42.34
ADC-L1-19-P1-9	0.22	44.73
ADC-L1-19-10	0.04	37.45
ADC-L1-19-P1-10	0.03	44.77

測試例7 、OVCAR3 皮下瘤模型藥效評價-1

實驗試劑：人類卵巢癌OVCAR3細胞購自ATCC，RPMI-1640培養基購自Gibco（貨號A104910），胎牛血清購自Excell（貨號FND500），青黴素-鏈黴素購自Gibco（貨號15140122），牛胰島素購自Yeasen（貨號40107ES60），0.25%胰酶-EDTA購自Gibco（貨號25200-072），D-PBS（無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液）購自Hyclone（貨號SH30256.01），Matrigel（基質膠）購自Corning（貨號356237）。

實驗方法：

動物訊息：Balb/c nude 小鼠，雌性，5-6周，體重約14-20克，動物購自北京維通利華生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。

細胞培養：人類卵巢癌OVCAR3細胞株體外培養，培養條件為RPMI-1640中加入20%胎牛血清，1%青黴素-鏈黴素，10 μg/ml 牛胰島素，37℃、5%CO ₂培養箱。一周一次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。

細胞接種：將0.1ml的OVCAR3細胞懸液（含1×10 ⁷個細胞，RPMI-1640：Matrigel體積比為1:1）皮下接種於每隻小鼠的腋下。在接種細胞後第26天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day 0。

腫瘤測量及實驗指標：

每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a x b ²，a及b分別表示腫瘤的長徑及短徑。每周兩次測量小鼠體重。

受試藥物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI（%）來評價。TGI（%）= [（1-（某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積）/（溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積）]x100%。

實驗結果：

在小鼠皮下移植瘤OVCAR3模型中， ADC-L1-14-P1-5 在3 mg/kg劑量下，單次靜脈給藥後均對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.0001）。結果見表23及圖2。

表23 OVCAR3皮下瘤模型腫瘤體積

受試藥物	給藥劑量（mg/kg）	給藥方式	給藥頻率	平均腫瘤體積（mm ³）	TGI （%）
Day0	Day4	Day7	Day 11	Day 14	Day 18	Day 22	Day 25	Day 28	Day 28
溶劑對照組	/	靜脈注射（IV）	單次	154.3	247.1	297.8	335.8	420.3	568.8	598.1	734.3	873.7	/
ADC-DS	3	154.4	211.3	194.1	159.5	131.5	95.5	73.6	66.0	77.8	110.6
ADC-L1-14-P1-5	3	151.4	207.0	183.5	143.4	113.3	71.3	64.1	69.7	66.9	111.7

在小鼠皮下移植瘤OVCAR3模型中， ADC-L1-19-P1-5在3 mg/kg劑量下，單次靜脈給藥後均對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.0001）。結果見表24及圖3。

表24 OVCAR3皮下瘤模型腫瘤體積

受試藥物	給藥劑量（mg/kg）	給藥方式	給藥頻率	平均腫瘤體積（mm ³）	TGI （%）
Day0	Day5	Day8	Day 12	Day 16	Day 19	Day 22	Day 27	Day 27
溶劑對照組	/	靜脈注射（IV）	單次	151.7	223.8	246.0	299.3	370.5	409.4	462.8	506.9	/
ADC-DS	3	145.0	165.9	153.4	91.4	56.2	41.2	28.9	23.4	134.2
ADC-L1-19-P1-5	3	153.4	165.0	149.3	97.3	68.7	56.6	49.4	27.3	135.5

測試例8 、ADC 血漿穩定性測試

將ADC分子（終濃度為100 µg/ml）分別與人類血漿（澳能生物，PB021-C）及猴血漿（仕諾達生物，SND-X0107）於37°C培養箱中培養。將培養當天標記為第0天，隨後分別在第7天、第14天及第28天取出樣品，進行游離小分子的檢測。

取20 µL樣品，加入300 µL內標工作液（乙腈配置），渦旋混勻5分鐘，離心5分鐘（14000 rpm），4 µL上清液LC-MS/MS（API 6500+）進樣分析，結果見表25。結果表明測試的ADC分子在人類及猴血漿中均較為穩定。

表25 CDH6-ADC的血漿穩定性

血漿類型	培養時間（天）	游離小分子%
ADC-DS	ADC-L1-19-P1-5
人類血漿	0	0.59	N/A
7	0.72	0.32
14	1.21	0.54
28	1.90	0.99
猴血漿	0	0.64	N/A
7	2.28	0.34
14	4.03	0.75
28	9.66	1.53

N/A表示未檢測到游離小分子，無法計算游離小分子%。

測試例9、OVCAR3皮下瘤模型藥效評價-2

實驗試劑：

人類卵巢癌OVCAR3細胞：ATCC

RPMI-1640培養液：Gbico; Cat No.: A104910

胎牛血清：Excell，FND500

牛胰島素：Yeasen，40107ES60

0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072

D-PBS（無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液）：Hyclone, Cat. No.: SH30256.01

Matrigel: Corning, Cat. No.: 356237

實驗方法：

細胞培養：人類卵巢癌OVCAR3細胞株體外培養，培養條件為RPMI-1640（細胞培養液）中加入20%胎牛血清，1% Pen Strep，10 μg/ml 牛胰島素，37℃、5%CO2培養箱。一周一次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。

細胞接種：將0.1ml/（含1×107）OVCAR3細胞懸液（RPMI-1640：Matrigel，體積比為1:1）皮下接種於每隻小鼠的腋下。在接種細胞後第23天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day 0。

給藥：ADC-L1-19-P1-7及同型對照ADC-L1-19-P1-ISO的給藥劑量均為3 mg/kg，腹腔給藥（Q4D）。每組6隻小鼠。

腫瘤測量及實驗指標：

化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI（%）來評價。TGI（%）= [（1-（某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積）/（溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積）]x100%。

實驗結果：

見表26、圖4及圖5。

表26 OVCAR3皮下瘤模型腫瘤體積

受試藥物	給藥劑量（mg/kg）	給藥方式	給藥頻率	平均腫瘤體積（mm ³）	TGI （%）
0天	4天	7天	11天	14天	26天	33天	40天
溶劑對照組	/	腹腔注射	四天一次	129	175	229	287	319	597	778	912	/
ADC-L1-19-P1-ISO	3	124	171	174	183	182	155	175	248	84.2
ADC-L1-19-P1-7	3	126	161	140	108	79	55	63	65	107.93

實驗結論：

在小鼠皮下移植瘤OVCAR3模型中，本發明化合物ADC-L1-19-P1-7及同型對照ADC-L1-19-P1-ISO在3 mg/kg，四天一次腹腔給藥對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.0001）；但同型對照ADC-L1-19-P1-ISO抑瘤顯著弱於ADC-L1-19-P1-7（P＜0.001）。本實施例在所嘗試劑量下未發現影響小鼠體重，也未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。

測試例10 、NCI-H838 皮下瘤模型藥效評價

實驗試劑：

人類肺癌NCI-H838細胞：科佰

RPMI-1640培養液：Gbico; Cat No.: 61870-036

胎牛血清：Gibco; Cat No.:10099-141C

0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072

D-PBS（無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液）：Hyclone, Cat. No.: SH30256.01

Matrigel: Corning, Cat. No.: 356237

實驗方法：

動物訊息：B-NDG小鼠，雌性，5-6周，體重約14-20克，動物購自百奧賽圖，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食及自由飲水。

細胞培養：人類肺癌NCI-H838細胞株體外培養，培養條件為RPMI-1640（細胞培養液）中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep， 37℃、5%CO2培養箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。

細胞接種：將0.1ml/（含1×107）NCI-H838細胞懸液（RPMI-1640：Matrigel，體積比為1:1）皮下接種於每隻小鼠的腋下。在接種細胞後第23天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為Day 0。

給藥：ADC-L1-19-P1-7及同型對照ADC-L1-19-P1-ISO 的給藥劑量均為3 mg/kg，均為腹腔給藥（Q4D）。每組6隻小鼠。

腫瘤測量及實驗指標：

實驗結果：

見表27、圖6及圖7。

表27 H838皮下瘤模型腫瘤體積

受試藥物	給藥劑量（mg/kg）	給藥方式	給藥頻率	平均腫瘤體積（mm ³）	TGI （%）
0天	3天	8天	11天	14天	17天	21天
溶劑對照組	/	腹腔注射	四天一次	99	137	322	449	758	959	1444	/
ADC-L1-19-P1-ISO	3	98	126	202	240	315	461	707	54.8
ADC-L1-19-P1-7	3	99	138	149	163	163	200	290	85.8

實驗結論：

在小鼠皮下移植瘤NCI-H838模型中，本發明化合物ADC-L1-19-P1-7及同型對照ADC-L1-19-P1-ISO在3 mg/kg，四天一次腹腔給藥對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.0001）；但同型對照ADC-L1-19-P1-ISO的抑瘤顯著弱於ADC-L1-19-P1-7（P＜0.001）。本實施例在所嘗試劑量下未發現影響小鼠體重，也未引起任何小鼠死亡，小鼠可以耐受。

測試例11 、抗LIV-1-ADC 的旁觀者效應測試

細胞與材料：人類卵巢癌細胞株OVCAR3購於ATCC，人類非小細胞肺癌細胞株NCI-H838-hLIV1-KO為自行構建，牛血清（Gibco#10099-141C），1640培養基（Gibco#A10491-01），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA（Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），牛胰島素（Solarbio#I8040）購於Solarbio公司，96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

NCI-H838-hLIV1-KO的構建方法：針對人類LIV1基因設計六種sgRNA，然後將sgRNA轉殖到pLVX慢病毒載體, 並在HEK293T（購自中科院）細胞中製備病毒顆粒。對NCI-H838（購自ATCC）細胞株進行慢病毒感染後，在含1.5μg/ml 嘌呤黴素（購自Gibco，貨號: A1113802）的含10%（w/w）胎牛血清的RPMI 1640培養基中選擇性培養2周，獲得H838-LIV1 KO pool細胞株。用人類抗LIV1抗體（Ladiratuzumab，自產）及山羊抗人類IgG（H+L）抗體（Jackson，貨號：109605088）標記，在流式細胞儀FACSAriaII（購自BD Biosciences）上分選H838-LIV1 KO單株細胞到96孔板，並置於37℃，5%（v/v）CO ₂培養，大約2周後選擇部分單株孔進行擴增。對擴增後的殖株經流式細胞分析法進行篩選。選擇生長狀況較好、螢光強度低、單株細胞株繼續擴大培養並液氮凍存。

細胞培養：OVCAR3細胞用含20%胎牛血清+2 μg/mL牛胰島素+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液，NCI-H838-hLIV1-KO細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液，兩株細胞均在37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

旁觀者效應檢測：藉由將待測ADC與LIV-1陽性細胞OVCAR3培養後的上清液轉移至LIV-1陰性細胞NCI-H838-hLIV1-KO中繼續培養，並利用Cell-Titer Glo試劑檢測該上清液對NCI-H838-hLIV1-KO細胞增殖活性的影響，進而反映ADC的旁觀者效應。將OVCAR3細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度為10000個細胞/180 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000 nM, 並進行5倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移20 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始濃度為500 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。吸取150 μL OVCAR3細胞培養板中的上清液，轉移至提前一天接種的NCI-H838-hLIV1-KO細胞板中（450個細胞/50 μL/孔），置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，將待測ADC與LIV-1陽性細胞OVCAR3培養後的上清液繼續與LIV-1陰性細胞NCI-H838-hLIV1-KO培養，藉由加入Cell-Titer Glo試劑檢測其對陰性細胞的殺傷，結果如表28所示，表明本發明抗LIV1-ADC具有較好的旁觀者效應。

表28 抗LIV1-ADC旁觀者效應

偶聯物編號	IC ₅₀（NCI-H838-hLIV1-KO陰性細胞，nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-19-7	13.7	95.3
ADC-L1-19-P1-7	4.351	97.0
ADC-L1-0-7	48.64	88.0

測試例12 、抗ROR1-ADC 的旁觀者效應測試

細胞與材料：人類乳腺癌細胞株hROR1-MCF7由先聲再明構建，人類乳腺癌細胞株MCF7購於ATCC，牛血清（Gibco#10099-141C），DMEM 培養基（Gibco#11995-065），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：hROR1-MCF7細胞及MCF7細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的DMEM培養液於37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

旁觀者效應檢測：藉由將待測ADC與ROR1陽性細胞hROR1-MCF7培養後的上清液轉移至ROR1陰性細胞MCF7中繼續培養，並利用Cell-Titer Glo試劑檢測該上清液對MCF7細胞增殖活性的影響，進而反映ADC的旁觀者效應。將hROR1-MCF7細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度為20000個細胞/180 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000 nM，並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移20 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始濃度為500 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。吸取150 μL hROR1-MCF7細胞培養板中的上清液，轉移至提前一天接種的MCF7細胞板中（1500個細胞/50 μL/孔），置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，將待測ADC與ROR1陽性細胞hROR1-MCF7培養後的上清液繼續與ROR1陰性細胞MCF7培養，藉由加入Cell-Titer Glo試劑檢測其對陰性細胞的殺傷，結果如表29所示，表明本發明抗ROR1-ADC具有較好的旁觀者效應。

表29 抗ROR1-ADC旁觀者效應

偶聯物編號	IC ₅₀(陰性細胞，nM)	最大抑制率 (%)
ADC-L1-19-8	0.03	56.83
ADC-L1-19-P1-8	0.05	53.62
ADC-L1-19-9	0.10	57.76
ADC-L1-19-P1-9	0.07	53.70
ADC-L1-19-10	0.02	61.37
ADC-L1-19-P1-10	0.03	57.86

測試例13 、抗HER2-ADC 的旁觀者效應測試

細胞與材料：人類乳腺癌細胞株SKBR3購於ATCC，人類小細胞肺癌細胞株NCI-H2171購於ATCC，牛血清（Gibco#10099-141C），McCoy's 5a 培養基（Gibco#16600-082），1640培養基（Gibco#A10491-01），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：SKBR3細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液，NCI-H2171細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液，兩株細胞均在37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

旁觀者效應檢測：藉由將ADC與HER2陽性細胞SKBR3培養後的上清液轉移至HER2陰性細胞NCI-H2171中繼續培養，並利用Cell-Titer Glo試劑檢測該上清液對NCI-H2171細胞增殖活性的影響，進而反映ADC的旁觀者效應。將SKBR3細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度為10000個細胞/180 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至5000 nM, 並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移20 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始濃度為500 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養3天。吸取150 μL SKBR3細胞培養板中的上清液，轉移至提前一天接種的NCI-H2171細胞板中（6000個細胞/50 μL/孔），置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，將待測ADC與HER2陽性細胞SKBR3培養後的上清液繼續與HER2陰性細胞NCI-H2171培養，藉由加入Cell-Titer Glo試劑檢測其對陰性細胞的殺傷，結果如表30所示，表明本發明抗HER2-ADC具有較好的旁觀者效應。

表30 抗HER2-ADC旁觀者效應

偶聯物編號	IC ₅₀（陰性細胞，nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-0-11	1.90	89.17
ADC-L1-19-11	0.16	81.43
ADC-L1-19-P1-11	0.12	84.55
ADC-L1-0-2	3.42	99.14
ADC-L1-19-2	0.15	81.33
ADC-L1-19-P1-2	0.17	86.51

測試例14 、抗CDH6-ADC 的旁觀者效應測試

細胞與材料：人類卵巢癌細胞株OVCAR3購於ATCC，人類卵巢癌細胞株SKOV3購於ATCC，牛血清（Gibco#10099-141C），1640培養基（Gibco#A10491-01），McCoy's 5a 培養基（Gibco#16600-082），青黴素-鏈黴素（Gibco#15140-122）及0.25% Trypsin-EDTA （Gibco#25200-056）購於Gibco公司（美國），牛胰島素（Solarbio#I8040）購於Solarbio公司，96孔板（Greiner Bio-one#655098）購於康寧公司（美國），Cell-Titer Glo試劑（Promega#G7568）購於普洛麥格公司（美國）。

細胞培養：OVCAR3細胞用含20%胎牛血清+2 μg/mL牛胰島素+1%青黴素-鏈黴素的1640培養液於，SKOV3細胞用含10%胎牛血清+1%青黴素-鏈黴素的McCoy's 5a培養液，兩株細胞均在37℃、5%CO ₂條件下培養，處於對數生長期細胞方可用於實驗。

旁觀者效應檢測：藉由將ADC與CDH6陽性細胞OVCAR3培養後的上清液轉移至CDH6陰性細胞SKOV3中繼續培養，並利用Cell-Titer Glo試劑檢測該上清液對SKOV3細胞增殖活性的影響，進而反映ADC的旁觀者效應。將OVCAR3細胞從細胞培養瓶內消化吹散處理，用對應的新鮮培養基再懸浮，調整細胞密度為20000個細胞/180 μL/孔，接種於96孔板中，置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養過夜。用完全培養基稀釋ADC濃度至4500 nM, 並進行3倍梯度稀釋，共8個濃度梯度，然後轉移20 μL ADC稀釋溶液至96孔板中，即ADC起始濃度為450 nM。96孔板置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養5天。吸取150 μL OVCAR3細胞培養板中的上清液，轉移至提前一天接種的SKOV3細胞板中（700個細胞/50 μL/孔），置於37 ℃、5% CO ₂條件下培養7天。加入Cell-Titer Glo試劑，檢測細胞活性。

數據分析：

計算抑制百分數（% Inhibition）並擬合得到化合物的IC ₅₀。

實驗結果：

在本實驗條件下，將待測ADC與CDH6陽性細胞OVCAR3培養後的上清液繼續與CDH6陰性細胞SKOV3培養，藉由加入Cell-Titer Glo試劑檢測其對陰性細胞的殺傷，結果如表31所示，表明本發明抗CDH6-ADC具有較好的旁觀者效應。

表31 抗CDH6-ADC旁觀者效應

偶聯物編號	IC ₅₀（陰性細胞，nM）	最大抑制率（%）
ADC-L1-0-3	4.70	99.76
ADC-L1-19-3	1.39	102.7
ADC-L1-19-P1-3	1.37	105.4
ADC-L1-0-6	3.76	100.9
ADC-L1-19-6	2.21	104
ADC-L1-19-P1-6	1.80	104.9
ADC-L1-0-5	12.74	100.9
ADC-L1-19-5	1.01	103.1

本申請案主張於2022年5月12日提交的申請號為202210515898.0的中國專利申請案、2022年8月19日提交的申請號為202210999585.7的中國專利申請案以及2023年4月14日提交的申請號為202310406469.4的中國專利申請案的優先權權益，此等專利申請文件藉由引用整體併入本文，用於所有目的。

無

〔圖1〕圖1顯示化合物19-P1 X射線單晶衍射分析結果。〔圖2〕圖2顯示OVCAR3皮下瘤模型的腫瘤生長曲線。〔圖3〕圖3顯示OVCAR3皮下瘤模型的腫瘤生長曲線。〔圖4〕圖4顯示OVCAR3皮下瘤模型的腫瘤生長曲線。〔圖5〕圖5顯示OVCAR3皮下瘤模型的小鼠體重變化曲線。〔圖6〕圖6顯示H838皮下瘤模型的腫瘤生長曲線。〔圖7〕圖7顯示H838皮下瘤模型小鼠體重變化曲線。

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Claims

一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其特徵係，其結構通式為Pc-(L-D) _n，其中： Pc為配體單元； L為連接子單元； D為以下式（D-I）所示的藥物單元：（D-I）其中， X選自NH或O； R ¹選自鹵素、CN、C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₆炔基，該C ₁-C ₆烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₆炔基任意被一個或多個R ^a1取代； X ₁選自CR ²或N； R ²選自H、鹵素、CN，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基，該5-6元雜環基任意被一個或多個R ^a2取代； R ⁴選自H、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基，該C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基任意被一個或多個R ^a4取代； R ⁵選自H、鹵素、CN、NH ₂或NO ₂，或者R ¹、R ⁵與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基、5-6元雜芳基或C ₅-C ₇環烯基，該5-6元雜環基、5-6元雜芳基或C ₅-C ₇環烯基任意被一個或多個R ^a5取代； R ⁶選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者C ₃-C ₆環烷基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成C ₃-C ₆環烷基，該C ₃-C ₆環烷基任意被一個或多個R ^a7取代；每一個R ^a1、R ^a2、R ^a4、R ^a5、R ^a7獨立地選自D、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基，該OH、NH ₂、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或4-7元雜環基任意被一個或多個R ^b取代；每一個R ^b獨立地選自鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₃烷基、OH、O(C ₁-C ₃烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₃烷基)或N(C ₁-C ₃烷基) ₂；條件是：i) 當R ¹選自甲基，R ²選自F時，R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成環丙基；ii)當X選自NH時，R ⁵不選自H；iii)式（D-I）所示化合物不包含；並且，n為1~16的實數。
如請求項1所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ¹選自鹵素、C ₁-C ₃烷基、C ₃-C ₆環烷基或C ₂-C ₃炔基。
如請求項1或2所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ²選自H、鹵素、CN，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成5-6元雜環基，該5-6元雜環基含有1或2個氧原子作為環原子，該5-6元雜環基任意被一個或多個D原子取代。
如請求項1或2所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ²選自H、F或Cl，或者R ¹、R ²與其等連接的原子共同形成、或。
如請求項1至4中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ⁵選自H、Cl、F、NH ₂或NO ₂，或者R ¹、R ⁵與其等連接的原子共同形成或。
如請求項1至5中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ⁴選自H或C ₁-C ₃烷基。
如請求項1至6中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者任意被一個或多個D取代的C ₃-C ₆環烷基，或者R ⁶、R ⁷與其連接的C原子共同形成C ₃-C ₆環烷基。
如請求項1至7中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中結構單元選自、、、、、、、、、或。
如請求項1至8中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中式（D-I）所示的藥物單元選自式（D-Ia）所示的藥物單元：（D-Ia）其中，R ¹、R ²、R ⁴、R ⁵、R ⁶、R ⁷如請求項1至8中任一項所定義。
如請求項1至9中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中式（D-I）所示化合物選自以下所示化合物：或。
如請求項1至10中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，連接子單元L選自或，其a端與配體單元Pc共價連接，b端與藥物單元D共價連接，其中，m1、m2各自獨立地選自整數2~8，m3選自整數1~16，L ¹、L ²各自獨立地選自由1至8個胺基酸構成的肽殘基，該肽殘基進一步任意被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基及4-7元雜環基中的一個或多個取代基取代。
如請求項11所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該L ¹、L ²各自獨立地選自由2、3或4個胺基酸構成的肽殘基，該肽殘基進一步任意被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基及4-7元雜環基中的一個或多個取代基取代。
如請求項11或12所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該L ¹為Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Ala-Ala-Ala三肽殘基，該L ²為Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Val-Lys二肽殘基。
如請求項11至13中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，m1選自5，m2選自2，m3選自8。
如請求項11至14中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，連接子單元L選自、、或，其a端與配體單元Pc共價連接，b端與藥物單元D共價連接。
如請求項1至15中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：或其中Pc及n如請求項1定義。
如請求項1至16中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該配體單元Pc選自多肽、抗體或其抗原結合片段。
如請求項1至17中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該配體單元Pc可特異性結合選自以下組的一種或多種抗原：HER2、p95HER2、HER3、CD3、CD16、ROR1、DLL3、CDH6、CD70、CD5、CD20、BCMA、EGFR、VEGF及LIV-1。
如請求項17或18所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該Pc為特異性結合HER2、p95HER2、CDH6、ROR1或LIV-1的抗體或其抗原結合片段；該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）或/及輕鏈可變區（VL），選擇性地，其中：（1）該重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、3、19、21、37、46、54、56、71、80、82或84所示的VH中所含的HCDR1、HCDR2及HCDR3；或/及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2、4、20、22、38、47、55、57、72、81、83或85所示的VL中所含的LCDR1、LCDR2及LCDR3；或（2）該重鏈可變區或/及該輕鏈可變區包含與第（1）組中該HCDR1-3或/及LCDR1-3中的每個CDR相比，具有至少80%同一性的胺基酸序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列。
如請求項19所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）或/及輕鏈可變區（VL），該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，或/及該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中，該HCDR1-3或/及該LCDR1-3選自以下；（1）該HCDR1-3為SEQ ID NO:7-9；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:10-12；（2）該HCDR1-3為SEQ ID NO:13-15；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:16-18；（3）該HCDR1-3為SEQ ID NO:23-25；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:26-28；（4）該HCDR1-3為SEQ ID NO:29-31；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:32-34；（5）該HCDR1-3為SEQ ID NO:40-42；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:43-45；（6）該HCDR1-3為SEQ ID NO:48-50；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:51-53；（7）該HCDR1-3為SEQ ID NO:58-60；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:61-63；（8）該HCDR1-3為SEQ ID NO:64-66；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:67-69；（9）該HCDR1-3為SEQ ID NO:74-76；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:77-79；（10）該HCDR1-3為SEQ ID NO:86-88；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:89-91；（11）該HCDR1-3為SEQ ID NO:92-94；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:95-97；（12）該HCDR1-3為SEQ ID NO:98-100；或/及該LCDR1-3為SEQ ID NO:101-103；或（13）該HCDR1-3或/及該LCDR1-3具有與第（1）-（12）組中任一組該HCDR1-3或/及LCDR1-3中的每個CDR相比，至少80%同一性，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的胺基酸序列。
如請求項17或18所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區（VH）或/及輕鏈可變區（VL），該重鏈可變區包含SEQ ID NO：1、3、19、21、37、46、54、56、71、80、82或84所示的胺基酸序列，或/及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：2、4、20、22、38、47、55、57、72、81、83或85所示的胺基酸序列；或該重鏈可變區及該輕鏈可變區分別包含與上述任一重鏈可變區及輕鏈可變區相比，具有至少80%同一性的胺基酸序列。
如請求項17至21中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區序列及/或輕鏈恆定區序列，選擇性地，該重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區選自完整的恆定區序列或其片段，該恆定區片段包含CH1，鉸鏈區，CH2，CH3或Fc；選擇性地，該重鏈恆定區選自人類或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，該輕鏈恆定區選自人類或鼠kappa恆定區或lamda恆定區；選擇性地，該抗體或抗原結合片段包含完整的重鏈及輕鏈，該重鏈由該VH及重鏈恆定區組成，該重鏈恆定區具有如SEQ ID NO:5、39或73所示的胺基酸序列，該輕鏈由該VL及輕鏈恆定區組成，該輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
如請求項17至22中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，該抗體選自Trastuzumab、Pertuzumab或Rituximab。
一種藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為L’-D，其中：藥物單元D如請求項1至10中任一項所定義；連接子單元L’選自或，其b端與藥物單元D共價連接，L ¹、L ²、m1、m2、m3如請求項11-15中任一項所定義。
如請求項24所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，L’選自，其b端與藥物單元D共價連接，m1選自5，並且L ¹選自Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Ala-Ala-Ala三肽殘基。
如請求項24所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，L’選自，其b端與藥物單元D共價連接，m2選自2，m3選自8，並且L ²選自Gly-Gly-Phe-Gly四肽殘基或Val-Lys二肽殘基。
如請求項24至26中任一項所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，L’選自以下化學結構：或，其b端與藥物單元D共價連接。
如請求項24至27中任一項所述之藥物-連接子化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，其選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：或。
一種藥物組成物，其特徵係該組成物包含請求項1至23中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的輔料。
一種請求項1至23中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項29所述之藥物組成物在製備治療腫瘤藥物中的用途。
一種請求項1至23中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的製備方法，其特徵係包含將請求項24至28中任一項所述之藥物-連接子化合物與配體偶聯的步驟，選擇性地，該配體為抗體或其抗原結合片段。
一種治療有需要的受試者的腫瘤的方法，其特徵係包含將請求項1至23中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項29所述之藥物組成物施用於該受試者。
一種請求項1至23中任一項所述之配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項29所述之藥物組成物用於治療受試者的腫瘤的用途。