TWI312368B - Mammalian cell culture processes for protein production - Google Patents

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TWI312368B TW092136008A TW92136008A TWI312368B TW I312368 B TWI312368 B TW I312368B TW 092136008 A TW092136008 A TW 092136008A TW 92136008 A TW92136008 A TW 92136008A TW I312368 B TWI312368 B TW I312368B
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William V Burnett
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Description

1312368 (1) <、發明說明 t胃明所屬之技術領域】 本發明關於用來培養可產製蛋白質產物（宜爲一種醣 化之蛋白質產物）之哺乳動物細胞的方法和過程。細胞培 _方法和過程的效能可造成高細胞存活力，且亦可產生具 高品質和高產量的產品，延長生長相，延遲死亡相之開始 ’及遏止死亡相。 【先前技術】 以重組方式產製之用於治療及/或預防用途的醣化蛋 白質宜使用動物細胞之培養，尤其是哺乳動物細胞之培養 來表現。重組之醣蛋白的醣化樣式很重要，因爲醣蛋白的 寡醣側鏈會影響蛋白質的功能，以及蛋白質之不同區間的 分子內交互作用。這類分子內交互作用係涉及醣蛋白之蛋 白質構造和三級構造。（見，如：A. Wittwer et al., 1 990, Biochemistry, 29: 4 1 75 -4 1 8 0; Hart, 1 992, Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023: Goochee e t a】.，1991, Bio/Technol., 9:1 347- 1 3 5 5;和 R. B. Parekh, 1991，Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754 ) 。另外，寡醣類可將一特殊多肽瞄準 某些以特殊之細胞碳水化合物受體爲基礎的構造（Μ. P. Bevilacqua e t a 1., 1 9 9 3, J. Clin. Invest., 91:379-387; R. M. Nelson et al., 1 9 9 3, J. Clin. Invest., 91:1157-1 166; K.E. Norgard et al., 1993, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90:1068-1072 ；和 Y. Imai et al·，1993，Nature,361 :555- 1312368 (2) 5 5 7 )。
已知醣蛋白之寡醣側鏈的終端涎酸成分對醣蛋白的許 多方面和性質都有作用，包括：吸附、溶解度、熱穩定性 、血淸半生期、從血淸淸除，以及其物理和化學構造/行 爲和其免疫性。（A_ Varki，1993，Glycobiology, 3:97-10 0; R.B. P a r e k h, Id., Gooch ee e t a 1., Id., J . Paulson et al., 1989, TIBS, 14:272-2 7 6; and A. Kobata, 1992， Eur. J. Biochem·，209:483-501 ; E. Q. Lawson et a 1., 1 983, Arch. Biochem. Biophys., 220:572-575; and E. Tsuda et a 1., 1990, Eur. J. Biochem., 1 8 8:405-4 1 1 )。
一般而言，在以哺乳動物細胞培養爲基礎之系統中的 蛋白質表現程度較微生物表現系統（如：細菌或酵母表現 系統）低得多。然而，細菌或酵母細胞受限於其下列能力 ，而無法使表現出之醣蛋白成熟，因而可影響產品之致免 疫性及淸除率··其無法理想表現高分子量蛋白質產物、適 當摺疊具複雜立體構造之蛋白質，及/或提供必須之後轉 譯修改的能力。 由於動物或哺乳動物細胞（尤其是可產製重組產品之 動物或哺乳動物細胞）之培養限制，因此，已對多種變數 之操作進行硏究，包括：使用大規格之培養容器；改變基 礎培養條件，如：培養溫度、溶解的氧濃度、p Η，等； 便用不同類型之介質及加入介質之添加劑；增加培養細胞 之密度。另外，發展出之培養哺乳動物細胞的方法可因延 長操作次數，來增加最終產物濃度，但仍維持高產物品質 (3) 1312368 的能力增加而受益。一種重要的產物品質變數爲多肽產物 之醣化構造的程度和完全性，而涎酸含量則常用來作爲醣 蛋白品質的測量質。 細胞培養程序’尤其是非-連續性程序的操作次數通 常受限於細胞之殘餘存活力，其通常會在操作過程中下降 。因此’儘可能將高細胞存活力延長是有需要的。由於細 胞死亡會將涎酸酶釋入培養上淸液中，而這可能會減少表 現出之蛋白質的涎酸含量，因此，關於產物品質的考量亦 爲將可存活細胞密度減少的情況降至最低的推動力。關於 蛋白質純化的考量亦提供另一將可存活細胞密度減少的情 況降至最低，並維持高細胞存活力的推動力。培養中有細 胞碎片及死細胞內容物存在時對於在培養運作終止時分離 及/或純化蛋白質的能力會有不良的影響。經由將培養中 之細胞維持存活較久可同時減少培養介質受到那些可引起 細胞變質，而使細胞產製之所需醣蛋白的品質降低的細胞 蛋白質和酶（如：細胞蛋白酶和涎酸酶）的污染。 現已硏究過多種變數，以在細胞培養中取得高細胞存 活力。一種變數係涉及在3 7 °C開始培養後’單次降低培 養溫度的方法（例如：R〇essler et aI·，]996，Enzyme and Microbial Technology，18:423-427 ;授讓給 T. Etch ever ry 等之美國專利第5,705,364和5，721，121號’ 1998;授讓 給K. Furukawa等之美國專利第5,976,83 3號；授讓給 L . A d a m s ο η等之美國專利弟5，8 5 1，8 0 0號，技讓給 Genentech 公司之 WO 99/6 1 65 0 和 WO 00/65 070;授讓給 (4) 1312368
Biogen公司之WO 00/36092;和授讓給Girard等之美國 專利第4,3 5 7,42 2號）。 其它硏究之變數涉及在培養中加入成分。生長因子抑 制劑蘇拉明（Suramin )顯示出可在CHO K1 : CycE細胞 之指數生長期間預防細胞凋亡（/11311§16131.,3丨〇16(；1111〇1· Prog. 2000, 1 6，3 1 9-3 2 5 )。然而，蘇拉明並不能保護細
胞在死亡相期間對抗細胞凋亡。因此，蘇拉明可維持生長 相期間之高存活力，但無法延長培養之壽命。該同一作者 報導：在CHO I 1 1-10PF細胞株方面，類似於蘇拉明，硫 酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物可增加第3天之存活細胞密度 及存活力（此係相對於對照組而言）。然而他並未報導硫 酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物在死亡相期間的效果。蘇拉明 、硫酸葡聚糖和聚乙烯硫酸化物亦被報導爲可有效預防細 胞之集結。
肝素曾被加入動物細胞培養介質中，以使停駐-倚賴 性細胞株能適應懸浮液環境（如：授讓給 Mckenna和 Granados之美國專利第5,3 4 8,8 7 7號，1 9 94 )。亦已知： 肝素可連接生長因子，如：似肝素-連接EGF生長因子（ HB-EGF ； Raab and Klagsbrun? Biochim. Biophys. Acta 1 997，1 3 3 3 ,F179-F199)。細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多 醣（HSPG )經報導可增强某些細胞類型（包括野生型 CH0細胞之 ΗΒ-EGF連接性和生物活性（Raab and KUgsbrun, ] 9 9 7 )〔硫酸乙醯肝素與肝素之不同處僅在於 硫酸乙醯肝素具有較少之N -和0 -硫酸化物基團及較多之 1312368 (5) N -乙醯基團（Mckenna和Granados，]994)。爲了本揭示 內容之目的，肝素和硫酸乙醯肝素被認爲係同等物，且一 般稱爲肝素〕。現已有人提出，連接H S P G可增加細胞表 面之局部的F G F _ 2濃度，此又可提高F G F _ 2連接細胞之 酪蛋白激酶受體的機會（（Raab and Klagsbrun，1 99 7 ) 。聚戊醣多硫酸化物已顯示出可阻斷在培養細胞上的肝 素-連接生長因子的作用（Zugmaier et al.，J. Nat. Cancer Inst. 1 992，84, 1 7 1 6- 1 724 )。 硫酸葡聚糖在動物細胞培養中之用途的專利文獻係關 於在介質中補充硫酸葡聚糖，以達到下列目的：1 )改良 人類內皮細胞之生長速率並在其老衰之前讓細胞數加倍（ 授讓給Levine等之美國專利第4,994,387和5,132,223號， 1 9 9 1，1 9 9 2 ); 2 )增加在哺乳動物細胞株中之重組蛋白 質產量（授讓給Israel之美國專利第5,318,898號，1994 );3 )在昆蟲細胞株中誘出單一細胞懸浮液（授讓給 Shule]•和 Dee 之美國專利第 5,728,580 號，1996) ; 4) 增加人類肝細胞-生長因子之生長促進活性，並抑制其變 質（授讓給Naka之美國專利第5,545,722和5,73 6,5 06號 ’ 1 9 9 6和1 9 9 8 ); 5 )增加存活細胞之密度及重組蛋白質 之表現（授讓給 Gorfien 之 W0 98/08 93 4，1 99 7 )。 在所有關於在介質中存在或補充硫酸葡聚糖的報告案 例中’硫酸葡聚糖條在全部培養時間中均存在於該指定 介質中。沒有關於延遲加入之優點的報告案例。再者，從 未有關於硫酸葡聚糖可延遲死亡相之開始、延長生長相或 1312368 (6) 阻止死亡相的報告。 隨著培養中之產物濃度增加，可在細胞培養過程中觀 察到產物品質降低（此係經由測量寡醣糖構造之涎酸含量 所測定出）。由藥物淸除硏究可測定出可接受之涎酸含量 通常存在著下限。理想上，培養中之細胞所產生的大量蛋 白質應具有高品質之最終欲回收使用的蛋白質。 以重組方式產生，經適當醣化之蛋白質產物在作爲治 療、處理和預防疾病試劑方面的醫學和臨床重要性逐漸增 加。因此，發展可在經濟上和效力上達到增加最終蛋白質 產物濃度及高品質產物之令人信賴的細胞培養方法可同時 滿足本技藝之需要和必須的目標。 發明摘述 本發明提供用於經由動物或哺乳動物細胞培養來產製 蛋白質的新方法’此蛋白質產物宜爲重組之蛋白質產物， 而以醣蛋白產物更佳。這些新方法可增加細胞之存活力。 本發明的一種觀點係關於使用二或多次溫度替換。在 此觀點中’本發明之細胞培養方法可容易地增加由培養細 胞所產製之產物（如：醣蛋白）的最終滴定濃度或濃度， 以及醣蛋白的涎酸含量。更具體地說，根據本發明，在細 胞培養期間二或多次更換溫度可維持培養中之細胞的高細 胞存活力，並可在整個培養運作中提供高產量和高品質之 所需產物。還有，根據本發明之一種觀點，包含二或多次 溫度更動之M 養方法可很谷易地延長培養之生產相。在 -10- (7) 1312368 延長之生產相中’所需之產物之滴定濃度增加；產物品質 (由涎酸含量決定其特性）維持在高水準；細胞存活力亦 維持在商水準。另外，與本發明之培養方法相關之延長的 生產相可生產超越在標準生產相中所產製之產品。 在本發明之一種觀點中係在培養哺乳動物細胞期間使 用多-步驟溫度更動（宜爲含有二或多次向下之溫度更動 的定時多-步驟溫度更動），以產製所需之蛋白質產物’ 尤其是醣蛋白產物。可在培養之生長相後實行之二或多次 溫度更動包含本發明之過程。藉由至少二次溫度更動（在 更換之間宜增加約4天）可取得所需蛋白質產物之高蛋白 質產量’並伴隨著高涎酸含量。包含多次溫度更動之培養 方法可同時取得高品質和大量之蛋白質產物，並在培養期 間維持細胞存活力。 根據本發明之另一種觀點，涉及二或多次溫度更動之 培養過程（方法）可讓細胞在培養中維持一段時間，以很 容易地延長培養操作來取得高品質和大量之蛋白質產物。 可藉本發明很容易地產生的這類延長蛋白質生產相的情況 係指一種較那些在培養操作中無溫度更動，或僅有一種溫 度更動時所達到之蛋白質生產相來得長的生產相。延長之 生產相係與包含所描述之細胞培養方法的多次溫度更動有 關。根據本發明之新細胞培養方法，在本發明之一種實施 態樣中’第一次溫度更動和第二、第三、第四次或進一步 之向下溫度更動的組合可使細胞培養維持高細胞存活力， 並可提供延長之生產相，在此延長之生產相中，蛋白質產 -11 - (8) 1312368 物的滴定濃度增加，且直到培養操作完畢均可維持產物之 高品質（如由涎酸含量所測定出之特性）。 此處所使用之培養操作係指一培養期，宜指整個培養 期。在包含二或多次溫度更動之培養操作方面，整個培養 操作的長度可持續短如僅在第二次溫度更動（如：約]Ο-ΐ 4 天） 後 即結束 ，亦可 長至約 2 8 -3 0 天， 或更久 。在包 含三（或更多）次溫度更動之培養操作方面，整個培養操 作的長度可持續短如僅在第三次（或最後一次）溫度更動 (如：約1 4 - 2 1天）後即結束，亦可長至約2 8 - 3 0天，或 更久。因此’根據本發明之方法，細胞培養之總操作期可 超過10天，超過14天，或超過21天。較合適的爲，該 培養之操作持續至少約1 0 · 1 4天到約2 1 - 3 0天，或更久。 總培養操作可包含二 '三、四或更多步驟之溫度更動 。一種非限制性之實例係依下述來進行二-步驟溫度更動 :從第0天至約第6天，先將培養溫度維持在3 7 °C，或 接近3 7 °C ;從約第6天至約第1 0天，將培養溫度維持在 3 4 ，或接近34 °C ;從約第]0天起，如：至約第14至 2 8天，至約第14至1 8天，或至培養操作結束，將培養 溫度維持在3 2。(： ’或接近3 2。(：。根據本發明之三-步驟溫 度更動的培養程序係包含下述之非限制性實例：從第〇天 至約第6天，先將培養溫度維持在3 71，或接近3 71 ; 從約第6天至約第1 〇天，將培養溫度維持在341：，或接 近3 4°C ;從約第1 0天至約第1 4天，將培養溫度維持在 3 2 °C ’或接近3 2 °C ;從約第】4天起，如：至約第2 ]至 1312368 Ο) 3 0天’或更久’或至培養操作結束，將培養溫度維持在 3 0 °C ，或接近 3 0 °C。 因此’使用本含二或多次溫度更動之細胞培養方法（ 其中可產製大量及高品質之蛋白質）不僅對具”較短”期間 ’如：標準期間（如：約1 〇至1 4天）的培養操作有利， 亦對較標準產製操作持續久的培養操作有利。由於本發明 之方法可延長培養細胞產製蛋白質的初始或標準生產相（ 一般而言’初始或標準生產相係在約第6天至第1 4天開 始），因此可取得這類較長期之培養操作。例如，與不 使用溫度更動或至多一次溫度更動之培養中的蛋白質生產 及產物品質相較下’根據本發明在培養操作中使用二、三 ’或更多次的溫度更動可維持高產量及高品質的蛋白質產 品及細胞存活力’且可維持並將細胞存活力從約1 〇 - 1 4天 之總操作時間持續至約2 1 - 2 8天或更久之總操作時間。 在本發明之另一種觀點中，本發明提供含有超過二或 三次如上述之溫度更動的細胞培養方法。在這類多·步驟 溫度更動操作中，細胞大體上係依關於三步驟培養期之描 述來進行培養，直到培養期結束時再進行額外之向下溫度 更動。例如：第四次向下溫度更動（也就是，降低溫度） 可在第三次溫度更動培養期之後進行，其中該細胞培養溫 度係在約培養開始後的第15-19天，宜爲第18天進一步 從約3 0 °C更換爲約2 8 °C或2 9 °C，宜爲約2 9 °C。在細胞培 養方法中可包含額外之溫度更動（其中細胞係維持在較低 之溫度，如：<29 °C下），以進一步延長蛋白質產製’直 -13- 1312368 (10) 到丨架作過程結束’宜長過2 8 · 3 0天。在所有情況中’通常 會在培養期結束時藉由如本文所描述之本技藝中例常使用 的技ill來回收（如：依需要將其分離出及/或大致上純化 )由細胞產製之蛋白質。另外，藉習知方法來評估涎酸含 量。 在一種特殊觀點中’本發明提供一種過程（或方法） ’其中經由使用二或多步驟之溫度更動過程來增進產物之 最終滴定濃度，且所產製之醣蛋白的涎酸含量較高。根據 此特殊觀點’二或多次定時之溫度更動的組合可支持培養 之高細胞存活力’藉此’可延長生產相，而在此生產相期 間’可增加產物（宜爲重組產物）之滴定濃度，並可將產 物品質（藉涎酸含量來決定其特性）維持在高水準。這類 二-或多-步驟之溫度更動可將細胞培養過程中產製產物時 普遍存在於蛋白質滴定濃度和涎酸含量間之交換情形降至 最少。因此，溫度更動對加強培養過程之重要表現變數， 也就是：”終點（即最終）滴定濃度”x"終點（即最終）涎 酸”終點滴定濃度X終點涎酸"）具有正面效果。 因此，在另一種特殊觀點中’在如此處所新描述之 二-步驟培養方法方面’從弟〇天至/或約第6天，培養中 之細胞係維持在3 7 °C，或接近3 7 °C之溫度下；在/或約 第6天時，細胞培養之溫度係降至34 °C ’或接近3 41 ; 在/或約第10-14天時’細胞培養之溫度再降至32 t， 或接近3 2 °C。在一種适類一-步驟之溫度更動方法的實施 態樣中，生產相延長超過約第1 4天’並持續至培養操作 -14- 1312368 (11) 過程完畢，如：直到約第2 1天，或至約第2 8至3 0天， 或更久，在此期間，細胞係維持在3 2 °C，或接近3 2 t 2 較低溫的培養中。蛋白質產物可依本文中之進一步說明， 在延長之生產相結束時回收。 本發明之另一種特殊觀點中提供一種藉由在培養操作 過程中使細胞接受二或多次之溫度更動來增加培養中之，細 胞的存活力的方法。若培養中之細胞的存活力在一種條件 存在時可較無此條件存在時，維持較高一段時間，則表$ 此條件可增加細胞之存活力。根據此觀點，所描述之二_ 或多次溫度更動細胞培養方法可使細胞在增加的期間（％ :超過標準產製期）維持存活。如此處所討論，在可用來 維持存活細胞之條件下增加培養細胞之細胞存活力的優點 爲可使細胞在培養期終了時產製較大量之（高品質）產物 〇 本發明之另一種觀點爲經由執行二-或多次溫度更動 細胞培養方法所造成之細胞存活力增加與在培養期間所產 生之細胞碎片及釋出之已死或將死細胞的內容物的減少量 呈相關性。培養中有細胞碎片及死亡細胞之內容物存在時 對培養終了時分離及/或純化蛋白質產物的能力有不良影 響。經由將培養中之細胞維持存活較久可同時減少細胞蛋 白質和酶（如：細胞蛋白酶和涎酸酶）對培養介質的污染 ，因這些污染會引起降解，最終使細胞產製之所需醣蛋白 的品質降低。 本發明的另一種觀點係關於將多陰離子性化合物延遲 -15- 1312368 (12) 加入細胞培養中。將多陰離子性化合物延遲加入細胞培養 中可增加細胞存活力。多陰離子性化合物係在接種後的一 個時間加入培養中。 在本發明的另一種觀點中，多陰離子性化合物係在接 種後，於初始死亡相開始前，或在初始生長相的期間，或 在初始生長相的後半段期間，或在或約在初始生長相結束 時加入培養中。根據本發明此觀點，可將生長相延長且/ 或可將死亡相的起點延遲一段時間，如··數天。另外，一 旦死亡相開始，死亡速率可大爲減低。 在本發明的另一種觀點中，多陰離子性化合物係在初 始死亡相的期間加入。根據本發明此一觀點，可將細胞死 ，亡遏止一段時間，如：數天。 在本發明的另一種觀點和此處之進一步說明中，該新 發展出之細胞培養方法，包括那些涉及二或多次之溫度更 動和涉及延遲加入多陰離子性化合物者，特別適合用來產 製可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突變種分子，如： CTLA4Ig和L104EA29YIg，這些蛋白質係由經遺傳工程 處理過，可表現及產製它們的宿主細胞所產製。（見實施 例1至Μ )。本發明之較佳實施態樣包含在培養操作過 程中利用多次溫度更動來培養產製 CTLA4Ig和[ L104EA29YIg之細胞，以取得大量之高品質CTLA4Ig和 LI04EA29YIg產物（由測量最終產物之涎酸含量來測定） 。本發明之較佳實施態樣包含利用延遲加入多陰離子性化 合物來培養產製CTLA4Ig和L104EA29YIg之細胞。 1312368 (13) 本發明之其它觀點、特性和優點可在硏讀本發明之詳 細說明及參考圖形和圖表後察知。 【發明內容】 本發明描述用於在哺乳動物或動物細胞培養中產製蛋 白質（宜爲重組之蛋白質產物，以醣蛋白產物更佳）之新 過程。這些過程可使細胞存活力增加。 涉及二或多次溫度更動之細胞培養過程 涉及二或多次溫度更動之根據本發明的細胞培養過程 可使細胞存活力增加，並可增加由培養中之細胞所產製之 .產物的最終滴定濃度或濃度。另外，由培養細胞所產製之 醣蛋白的涎酸含量高，這表示在培養期中可產製高品質之 蛋白質產物。 更具體地說’根據本發明，在細胞培養操作過程期間 進行一或多次溫度更動可維持並支持培養中之細胞的高細 胞存活力’如：取得增加之細胞存活力，並可在培養操作 過程中提供高產量和品質之所產製的產物。還有，根據本 發明’ 11或多次之溫度更動可延長培養之生產相。在延長 之生產相期間’可維持細胞存活力；所需產物之滴定濃度 增加’且產物品質（藉涎酸含量來決定其特性）可維持在 高水準。 根據本發明’與不涉及溫度更動或僅一次溫度更動的 &養方'/去相較下，在細胞培養期間之二或多次溫度更動（ -17- 1312368 (14) 且爲向下之溫度更動）可使培養期終了時產製出高產量和 品質之蛋白質產物。舉證說明；如實施例3中所示，與不 涉及溫度更動或僅一次溫度更動的培養方法相較下，不論 培養操作之總長度’根據本發明之具有二或三次溫度更動 的培養方法可增加蛋白質之產量（如：終點滴定濃度） 。另外，本發明的過程和方法特別適合依本文中所進一步 描述之分批餵養培養法生長和維持的細胞。 由於培養方法之二或多次溫度更動亦可維持和支持培 養中之細胞的高存活力，因此，本培養方法可延長蛋白質 之生產相。尤其是，在包含延長之生產相的細胞培養方法 期間，細胞可維持高存活力，所需產物之滴定濃度增加， 且產物品質（藉涎酸含量來決定其特性）亦可維持在高水 準。由於係由本發明所新提供，此細胞培養方法含有較不 涉及溫度更動或至多僅一次溫度更動的培養步驟提供之生 產相來得長的生產相。 涉及多次溫度更動之細胞培養方法 在本發明之實施態樣中，哺乳動物細胞之培養中係使 用定時之多步驟溫度更動來產製所需之蛋白質產物，尤其 是醣蛋白產物。更合適的爲，培養中之細胞產製一種經重 組產生之蛋白質、多肽或肽產物。然而’在某些情況中， 細胞可主動產製或過度產製一種能依照本發明之方法操作 來收成或回收之內生性或天然產物。如此處之說明，本發 明之過程中可使用二或多次溫度更動（以在培養期間’於 -18- 1312368 (15) 適當之定時間隔進行受控制之向下溫度更動較佳）來取得 具有高涎酸含量之高蛋白質產量。 經由在操作過程結束時測量終點滴定濃度和涎酸含量 得知：根據本發明之細胞培養方法和過程（亦稱爲產製或 醱酵操作過程），在培養操作過程中加上二或多次溫度更 動之方法所培養的細胞可在操作過程中產製高產量和高品 質之產物。相對於不使用溫度更動或至多一次溫度更動的 方法，本發明方法可取得高產量和高品質之蛋白質產物， 不論該培養操作過程之總操作時間係進行約1 〇-1 4天或超 過14天。再者，由於在培養過程中進行二或多次溫度更 動，細胞可在培養中維持實質上超過標準或初始生產相的 時間。標準或初始生產相通常約爲6至1 4天。在本涉及 二或多次溫度更動之培養方法的延長生產相中可達到增加 產製商品質蛋白質和支撐細胞存活力。 再者，根據本發明之培養方法，細胞培養之總培養期 可超過約]〇天，超過約14天，超過約21天，或超過約 28天，宜爲約〗4至30天，或更久。例如，在含有二或 多次溫度更動之本發明的培養操作過程中，整個操作過程 的長度可持續短如僅在第二次（或最後）溫度更動後即結 束（如：約1 4天）至長如約2 I -3 0天，或更久，宜爲約 28天，或更久。 在本發明之一種實施態樣中，延長之生產相係與包含 本發明之細胞培養方法的多次溫度更動有關。根據本發明 之新細胞培養方法，第一次溫度更動和第二 '第三次或進 -19- 1312368 (16) 一步之溫度更動的組合不僅可使細胞培養在整個培養操作 過程中產製高產量和高品質之產物’亦可使培養在整個操 作過程中及/或整個延長之生產相中維持高細胞存活力， 直到培養操作過程結束。在此培養操作過程中（包括延長 之生產相）’蛋白質產物的滴定濃度增加，且可維持產物 之高品質（由涎酸含量所測定出之特性）。 更特別地，在一種其特殊實施態樣中，本發明包含可 延長由培養細胞產製蛋白質之初始生產相（也就是包含約 第6至1 4天之標準生產相被延長）的細胞培養方法。經 由根據本發明在培養操作過程中使用二或多次溫度更動 ，可取得在約第1 4 - 2 1天之延長生產相。藉由在培養操作 過程中之三次（或多次）溫度更動，該培養操作過程可進 一步延長爲約21-28或30天，或更久，同時具有高產量 之局品質蛋白質產物（如：高涎酸含量），（如：實施例 3 ) ° 在本發明之另一種特殊實施態樣中，細胞培養（或酸 酵）過程包含二步驟之向下溫度更動，其中在全部培養操 作過程期間，細胞係維持在三種不同溫度下。在此實施態 樣中，在取得最終蛋白質產物（並測量涎酸含量）前，總 細胞培養期係持續超過約1 0天，更具體地說，約1 4至 28天或更久，也就是，約二至三週或更久。例如，在這 類二步驟方法中，從第〇天至約第6天之初始培養期中， 細胞係維持在約3 6 °C至3 8 t的第一種溫度下，宜爲3 7 t ’或接近371：。然後，在從約第5天至第7天起，宜爲 -20- 1312368 (17) 第6天’至約第]0天時，培養溫度係維持在約3 3 °C至3 ί °C的第二種溫度下，宜爲3 41，或接近3 41。在3 4 °C， 或在接近34°C培養後’將溫度進行第二次更換（第二次 T-更動）至約3 1 °C至33°C之第三種溫度，宜爲32°C，或 接近32°C。第二次T-更動係在/或約第6天至約第14天 ’且爲從約弟1 〇天至約桌1 4天’更合適的爲在/或約第 1 〇天’此在不同實施態樣中可能係在標準生產相期間， 在生長相期間’或在死亡相期間。較合適的爲，在第一次 和第二次溫度更動之間約增加4天，以增加4天更佳。細 胞維持在3 2 °C ’或接近3 2 °C之溫度下直到全部培養操作 過程終了，如：較約第1 〇天久，更具體地說，至約第 12-1 8天，或至約第14-1 8天，或至約第14-28或30天， 或更久。在培養過程終止時，通常將蛋白質產物分離出及 /或純化，如：若產物分泌入培養介質中時，則從培養上 淸液中分離出或純化。 或者，在本發明之多次溫度更動培養方法中，溫度可 首先根據培養相來降低。第一次溫度更動宜在死亡相開始 前進行。在一種實施態樣中’溫度在細胞生長減緩的同時 第一次降低。例如，當細胞不再爲指數生長相且培養係在 靜止相，如：在培養之第6天或約第6天時，將溫度從 3 7 °C，或接近3 7 °C更換爲3 4 °C，或接近3 4 t：。此時’存 活細胞濃度已達到適合產製蛋白質（宜爲蛋白質生產增加 )之細胞密度，例如：約2-12x1 〇6細胞/毫升，如：2_ 9 X 1 06細胞/毫升，3 - 7 X 1 06細胞/毫升，4 - 5 X 1 06細胞/ -21 - 1312368 (18) 毫升，3-4xl06細胞/毫升’ 2-4xl〇6細胞/毫升，4_ 6 X 1 0 6細胞/毫升，6 - 8 X 1 0細胞/毫升，8 _ 1 〇 χ丨〇 6細胞/ 毫升’或]0 - 1 2 X 1 0 6細胞/毫升。不希望受限於理論，細 胞生長減緩可能與細胞培養介質之養分及/或特殊成分用 盡有關（如：在介質中之氮的限制）。 在另一種實施態樣中’第一次溫度更動係在生長相之 期間進行，例如，當存活細胞濃度爲約2 - 1 2 X 1 0 6細胞/ 毫升時，如：2-9x1 06細胞/毫升，3-7x1 〇6細胞/毫升， 4-5χ106細胞/毫升’ 3-4χ106細胞/毫升，2-4χ106細胞 /毫升，4 - 6 X 1 0 6細胞/毫升，6 - 8 X 1 0 6細胞/毫升，8-ΐί) X 1 0 6 細胞 / 毫升 ，或 1 0 - 1 2 X 1 0 6 細胞 / 毫 升時。 而在另—種包含二-步驟溫度更動之培養過程的實施 態樣中係將細胞進行1 4天之培養操作，其中從第〇天至 第6天’培養溫度係維持在3 7 °C，或接近3 7。(：。從約第 6天至約第1 0天時’培養溫度係維持在3 4 °C，或接近3 4 °C ;從約第1 0天至約第1 4天，培養溫度係維持在3 21： ，或接近3 2 °C。而另一種實施態樣中係將細胞培養約2 I 天’其中從第0天至約第6天，培養溫度係維持在3 7 °C ’或接近3 7 °C ;從約第6天，至約第1 〇天時，培養溫度 係維持在3 4 °C ’或接近3 41 ;從約第1 0天至約第2 1天 ’培養溫度係維持在3 2 °C，或接近3 2 °C。而另一種實施 態樣中係將細胞培養約2 8天，其中從第0天至第6天， 培養溫度係維持在3 7 °C，或接近3 7 °C ;從約第6天，至 約第]〇天時’培養溫度係維持在3 41，或接近3 41 ;從 1312368 (19) 約第1 〇天至約第2 8天’培養溫度係維持在3 2 t，或接 近 3 2°C。
本發明亦包含其中該細胞培養方法含有三或多次溫度 更動的貫施態樣。在一種涉及三-步驟溫度更動之培養過 程的實施態樣中’細胞起先係在約3 6 t至3 8 t的第一種 溫度下（宜爲3 7 °C ’或接近3 71：)培養約6天；然後， 在指定之時間期’更動培養溫度並將其維持在約3 3 t至 35°C，宜爲34°C，或接近34°C ;然後，第二次將溫度更 動至約3 ] C至3 3 °C，宜爲3 2 °C，或接近3 2。在3 2 °C ’或接近3 2 °C之培養期後，第三次將溫度更動至約29〇c 至31°C ’宜爲30°C ’或接近30t ;然後將溫度維持在3〇 『C，或接近3 0 °C，直到操作結束。 在其它實施態樣中’進一步之溫度更動，宜爲向下之 溫度更動’可在該培養方法之第三次溫度更動後進行。例 如：第四次溫度更動可在第三次溫度更動後，於培養開始 後的第1 5天至第2 0天，或約第1 5天至第2 0天進行，宜 爲約第1 8天。第四次之向下更換係將培養溫度維持在2 8 t：至2 9 °C ’或接近2 8 °C至2 9 °C，宜爲約2 9 °C，並將培養 操作增加至超過約2 8天，如：約2 8至3 2天或更久，此 時，可取得產物。 由於根據本發明之二-步驟溫度更動培養操作程序中 ’在本發明之多次溫度更動過程中的第一次溫度更動可在 細胞實質上已停止生長，並已成爲靜止相（或類似於此） 時開始進行。舉例說明，溫度更動係在當存活細胞濃度爲 -23- 1312368 (20) 約2 -1 2 x 1 0 6細胞/毫升，如：2 - 9 x 1 06細胞/毫升，3 -7x]〇6細胞/毫升，4-5x1 〇6細胞/毫升，3-4x1 06細胞/ 毫升，2-4xl06細胞/毫升，4_6xl06細胞/毫升，6-8X106細胞/毫升，8-ΙΟχΐΟ6細胞/毫升，或10-12xl06 細胞/毫升時進行。或者，第一次溫度更動係在生長相期 間進行’例如’當存活細胞濃度爲約] 2x 1 06細胞/毫 升，如：2-9x]06細胞/毫升，3_7xl06細胞/毫升，4-5 x 1 〇 6細胞/毫升，3 - 4 X 1 〇 6細胞/毫升，2 - 4 X 1 06細胞/ 毫升，4-6xl06細胞/毫升，6-8xl06紐胞/毫升，8-! 〇 X 1 0 6細胞/毫升，或]〇 - 1 2 X 1 0 6細胞/毫升時。在另一 種較佳實施態樣中，多-步驟之細胞培養過程在約三至四 過之培養期間（如：2 1 - 3 0天，或更久，宜爲2 8天或更 久）含有三次定時及經過控制之溫度更動。舉例說明， 三-步驟之溫度更動過程含有從〇至約6天（宜爲6天） 之初始培養期，此時間內，細胞係培養在3 7 °C，或接近 3 7 °C。從約第6天，至約第1 〇天時，細胞係培養在3 4 °C ，或接近3 4 °C。從約第1 〇天至約第14天，培養溫度係 維持在3 2 °C ’或接近3 2 °C ;而從約第1 4天起，也就是至 約第21天’至第3 0天，或更久，或至操作過程結束時， 培養溫度係維持在3 0 °C，或接近3 0 °C。因此，相對於僅 有一次或無溫度更動之約6-14天的標準生產相，在本發 明之三-步驟溫度更動的培養過程中，亦可將生產相延長 成較約1 4天來得長的期間，以產生較高之蛋白質終點滴 定濃度和較高之細胞存活力。有利的是，藉三-步驟T-更 -24- 1312368 (21) 動方法可進一步將生產相及細胞存活力延長，也就是延長 至約三週或更久，且具有高品質之產物（藉埏酸含量來測 量）。 在本發明的不同實施態樣中，第二次溫度更動至3 2 °C ’或接近3 2 °C可使培養操作過程結束時有高產量和高 品質之蛋白質，並可在持續超過約二週之操作過程中延長 蛋白質之生產。二或多次之溫度更動可穩定培養之細胞存 活力緩慢下降（此情況可在培養前二週之間發生）。而另 —次定在約二週，或二週前後期間進行之從3 2 t：.，或接 近3 2 °C更換至3 0 °C，或接近3 0 °C的溫度更動可提供更延 長之生產相，因此，可將細胞培養之生產相延長至培養操 J乍過程結束，如：至約第2 1天，至約第3 0天，或更久， 同時仍維持細胞存活力，且不損害所產製之產物品質（藉 測量涎酸化來測定）。（見實施例3，表2和3)。額外 之溫度更動可將細胞生產延長至超過二或三次溫度更動之 操作過程的生產相。 在其它實施態樣中，本發明係針對涉及二或多次溫度 更動之（i )細胞培養過程，（i i )增加蛋白質生產之方法 ，宜與增加細胞存活力相關，（i ii )增進蛋白質產物之涎 酸化的方法，（i v )增進細胞存活力的方法，或（v )延 長蛋白質生產的方法，其包含：將表現所關注之蛋白質的 宿主細胞在或接近3 7 °C，於可讓細胞生長之條件下培養 一段時間；當培養在靜止相時，將細胞培養之溫度降低’ 並將細胞在或接近3 4 t之第二種溫度下培養；在約第6 -25- 1312368 (22) 天至第1 4天之標準生產相期間，如：在或約培養開始後 ]〇天，再度將細胞培養之溫度降低，並將細胞在或接近 3 2 t之第三種溫度下培養，直到培養期結束。如此處中已 提示者，培養期可包含超過天，超過14天，超過21 天，或超過2 8 - 3 0天之總操作時間。將細胞在3 2 °C培養 後，也就是培養操作過程結束時可取得所產製之蛋白質產 物，宜爲一種醣蛋白。 在其它實施態樣中，本發明係關於涉及二或多次溫度 更動之（i )細胞培養過程，（i i )增加蛋白質生產之方法 ，宜與增加細胞存活力相關’ （iii )增加蛋白質產物之涎 酸化的方法，（i v )增加細胞存活力的方法，或（v )延 長蛋白質生產的方法，其包含：將表現所關注蛋白質的宿 主細胞在或接近3 7 °C，於可讓細胞生長之條件下培養一 段時間；在約第5至第7天時，開始將細胞培養之溫度降 低，並將細胞在或接近3 4 °C之第二種溫度下培養；在約 第6天至第1 4天時，如：在或約培養開始後1 0天，開始 再度將細胞培養之溫度降低，並將細胞在或接近3 2 °C之 第三種溫度下培養，直到培養期結束。如此處中已提示者 ’培養期可包含超過10天，超過14天，超過21天，或 超過2 8 - 3 0天之總培養期。將細胞在3 2 °C培養後，也就 是培養操作過程結束時可取得所產製之蛋白質產物，宜爲 一種醣蛋白。 在本發明的另一種實施態樣中，本發明提供還包含另 一次向下更換溫度的培養方法，其係在或約培養開始之第 -26- 1312368 (23) 1 4天’將溫度從3 2 t：或接近3 2 °C，更換至3 0 t或接近 3 0 °C ’直到培養過程結束，以藉此將培養期延長超過標準 生產相。爲了在培養過程中延長蛋白質生產，和細胞存活 力’此方法可包含第四次向下之溫度更動，其係在或約培 養開始之第1 5 - 1 9天時（宜爲第i 8天），將溫度從3 01 或接近3 0 °C ’更換至2 9 t或接近2 9。(：，直到培養過程結 束。 本發明之溫度更動通常係在或約培養期之第6天（此 可能在培養之生長相期間或之後），然後，每次溫度更動 之間約增加4天（宜增加4天）。在某些實施態樣中，溫 度更動之時間可約在標準生產相開始（如：在或約第6天 )，中間（如：在或約第1 〇天）和結束（如：在或約第 1 4天）時。在根據本發明之培養方法和過程（其中係藉 由多-步驟（如：二步驟、三步驟或更多步驟）之溫度更 動略圖來增加所產製之醣蛋白的最終滴定濃度和涎酸含量 )中，至少二次定時之溫度更動可使總培養操作過程進行 超過10天，超過14天，超過21天，或超過28天或更多 天，但不會損害產物之最終滴定濃度和涎酸化。在根據本 發明之培養過程中’ 一或多次之溫度更動可支持培養之高 細胞存活力，且與不含二或多次之溫度更動，但具相同時 間期之培養相較下，其在培養操作過程中可產製更多高滴 定濃度和高品質之蛋白質。還有，二或多次之溫度更動可 使培養之生產相延長超過標準生產相，及/或超過不具溫 度更動或僅一次溫度更動之培養的生產相。這類多步驟溫 -27- (24) 1312368 度更動’如：二或更多步驟之溫度更動可將細胞培養過程 中’產製蛋白質產物時’介於滴定濃度終點滴定濃度，， )和涎酸含量間普遍之交易情形減至最少。因此，溫度更 動對增進終點滴定濃度X涎酸含量”之數學乘積具正面效 果（其可改良蛋白質產製過程）。 涉及二或多次溫度更動之根據本發明的細胞培養過程的其 它實施態樣 在一種實施態樣中，本發明包含一種細胞培養過程， 其包含將表現所關注之蛋白質的宿主細胞在或接近3 7 t 之第一種溫度下，於可讓細胞生長的條件及時間下進行培 養。在細胞生長期後，將細胞在或接近3 4 °C之第二種溫 度下培養，此時細胞生長已減緩，並接近靜止。之後，在 培養之標準生產相期間，也就是在或約在第6天至，或約 至第1 4天’將細胞在/或接近3 2 °C之第三種溫度下培養 。在培養過程終止時可取得所產製之蛋白質產物。 根據本發明之一種較佳實施態樣，細胞係以分批餵養 的過程培養，此過程包含數種相，也就是，一種生長相， 在此期間細胞係在或接近3 7 t之第一種溫度下培養；一 種初始或標準生產相，在此期間細胞係在或接近3 4 °C之 第二種溫度下，及在，或接近3 2 t之第三種溫度下培養 ，以提供延長之蛋白質生產相，其可包括在/或接近30 °C之第四種溫度，然後，隨意地，再另外降低溫度，如： 在/或接近2 9 t。在本發明之二或多步驟溫度更動之操 -28- 1312368 (25) 作過程的情況中，蛋白質生產相延長係與二或 溫度更動有關。如此處之說明，延長之生產相 —次將溫度從3 7 t或接近3 7 t更換成3 4 °C或 後，於不同的時間間隔下，將培養之溫度連續 次。相對於無溫度更動或僅更動一次溫度者， 些涉及在培養操作過程中進行二或多次向下溫 法可使蛋白質產量增加及取得高品質之產物（ 終產物之涎酸含量來測定）。 在細胞培養之生長相期間，如：從第〇天 ，由於細胞在此指數細胞生長或對數相期間通 裂，因此在培養中之細胞密度會增加。在本發 中所呈現之非-生長相關的細胞培養和蛋白質 ，生長相期間（其中在合適之生長條件下，細 質上達到最多）並沒有生產大量之蛋白質產物 於培養中之營養限制，細胞通常在約第4至6 相，其中快速之細胞生長變成停滯及/或衰退 養方法中，當細胞生長實質上結束時（也就是 第1 0天），蛋白質生產相開始。（實施例3 ) 根據一種實施態樣之培養方法，當細胞在 到靜止相時，將溫度從37°C或接近37°C向下 或接近3 4 °C。之後，在接近第一次溫度更動 )和延長之生產相開始（約第1 4天）之間的 度將溫度從3 4 °C或接近3 4 °C降低成3 2 °C或接 二次溫度更動使培養可穩定細胞存活力（其通 多次之向下 包含：在第 接近34t之 降低二或多 經由執行這 度更動的方 經由測量最 至約第6天 常會快速分 明某些觀點 產製方法中 胞之生長實 。因此，由 天進入靜止 。在這些培 約第6至約 〇 約第6天達 更換成3 4 °C (約第6天 中點時，再 近32°C。第 常會緩慢降 -29- 1312368 (26) 低至約弟1 4天）；然後1開始延長之生產相（在約第14 至約第2]天，至約第3 0天，或更久，宜爲至約第2 1天 ’至約第2 8天，或更久）。如上述已說明者，可在培養 操作過程之延長的生產相期間使用其它溫度更動，如：第 三、四或更多次。 涉及延遲加入多陰離子性化合物之細胞培養方法 根據本發明提供一種涉及延遲加入多陰離子性化合物 之細胞培養方法。本方法包含在接種後的一個時間將多陰 離子性化合物加入細胞培養中。與不加入多陰離子性化合 物或在接種時加入多陰離子性化合物所觀察到者相較下， 延遲加入多陰離子性化合物可增加細胞之存活力。 因此，在一種實施態樣中，本發明係針對一種細胞培 養過程’其包含：培養表現出所關注之蛋白質的宿主細胞 ;及在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培 養中。 已發現（見實施例6):當進行本發明時，細胞培養 之細胞存活力百分比增加。細胞存活力百分比（亦稱爲細 胞存活力）爲在總細胞數中之存活細胞的百分比。當_種 條件（如：延遲加入多陰離子性化合物）存在時，若培養 中之細胞存活力可較無該條件存在時維持高過一段時間， 則表示此條件可增加細胞存活力。 因此’在其它實施態樣中，本發明係針對（1 ) 一種 細胞培養方法’及（2 ) —種增加培養中之細胞存活力的 -30- 1312368 (27) 方法，其包含：培養表現出所關注之蛋白質的宿主細胞； 及在接種後的一個時間將多陰離子性化合物加入細胞培養 中；其中該細胞培養之細胞存活力增加。 多陰離子性化合物包括，但不限於：硫酸葡聚糖（可 從史格馬-歐德里克公司（Sigma-Aldrich)，密蘇里州聖 路易市取得），肝素（可從史格馬-歐德里克公司取得） ，硫酸乙醯肝素（可從史格馬-歐德里克公司取得），硫 酸甘露蜜，硫酸軟骨膠（可從史格馬-歐德里克公司取得 )，硫酸皮膚素（可從史格馬-歐德里克公司取得），硫 酸角蛋白素（keratan sulfate )(可從史格馬-歐德里克公 司取得），玻尿酸化物（可從史格馬-歐德里克公司取得 ·)，聚（硫酸乙烯酯）（可從史格馬-歐德里克公司取得 )’ K-鹿角膠（可從史格馬-歐德里克公司取得）.，和蘇 拉明（可從史格馬-歐德里克公司取得）。這些化合物可 很容易地從列出之來源取得，或很容易地透過本技藝中之 技術熟習人士已知的方式取得。這些化合物常以鹽之形式 取得’包括但不限於：鈉鹽，但亦可以非鹽形式使用。多 陰離子性化合物包括其所有形式，包括但不限於鹽的形式 ，如：鈉鹽。 較佳之多陰離子性化合物爲多硫酸化之化合物，包括 ’但不限於：硫酸葡聚糖，肝素，硫酸乙醯肝素，硫酸甘 露蜜’硫酸軟骨膠’硫酸皮膚素，硫酸角蛋白素，聚（硫 酸乙烯酯）’ & -鹿角膠’和蘇拉明。硫酸葡聚糖可具有 5,000至5〇C，〇()()道耳頓之平均分子量。較佳之硫酸葡聚 -31 · 1312368 (28) 糖爲具分子量5 000道爾頓者。 根據本發明’多陰離子性化合物係在接種後的一個時 間加入’也就是’其不存在於基礎介質中，且在接種時不 存在。較合適的爲，多陰離子性化合物係在培養第1天或 稍後加入。接種係在第〇天進行。 根據本發明’多陰離子性化合物可在具體指明之時間 期中（如：接種後的一個時間），加入細胞培養中一次、 二次、三次’或任何次數。可聯合使用一或多種多陰離子 性化合物。也就是，任何指定之一次加入的多陰離子性化 合物可包含加入一或多種其它多陰離子性化合物。類似地 ，若加入多陰離子性化合物超過一次，則不同之多陰離子 性化合物可在不同次中加入。其它化合物和物質，包括多 陰離子性化合物，可在加入多陰離子性化合物之前、同時 或之後加入培養中一可在或不在該具體指明之時間期中。 在一種較佳之實施態樣中係單次，也就是一次加入多陰離 子性化合物。在一種較佳之實施態樣中係加入一種多陰離 子性化合物。 根據本發明，多陰離子性化合物可藉任何方式加入細 胞培養中。加入多陰離子性化合物之方式包括但不限於： 溶解於水中 '溶解於培養介質中、溶解於餵養介質中、溶 解於合適之介質中，及以其被取得之形式加入。較合適的 爲，將多陰離子性化合物溶解在水中加入。 根據本發明，將多陰離子性化合物加入培養中，以使 其在培養中之濃度達到合適的水準。非限制性之實施例有 -32- 1312368 (29) :加入多陰離子性化合物，使其濃度爲]_ 1 〇〇〇毫克/升 ’如：1-2 00毫克/升，或bioo毫克/升。較合適的爲 ’加入多陰離子性化合物以使濃度爲2 5 - 2 00毫克/升， 以50-100毫克/升更佳’以50毫克/升或1〇〇毫克/升 最佳。 根據本發明，在加入多陰離子性化合物後，培養可進 行任何長之時間。培養操作時間可由本技藝中之技術熟習 人士根據相關因素，如：可回收之蛋白質的量和品質，以 及由細胞溶解所產生之上淸液中的細胞性物種（如：蛋白 質和D N A (其將使所關注之蛋白質的回收工作較複雜） )的污染程度來決定。 在本發明之增加細胞存活力的細胞培養過程和方法的 特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在接種後，於初始 死亡相開始前加入。較合適的爲，多陰離子性化合物係在 接種後，於初始生長相的期間加入。更合適的爲，多陰離 子性化合物係在初始生長相的後半段期間加入。更合適的 爲’多陰離子性化合物係在或約在初始生長相結束時加入 〇 初始生長相係指無具體指明加入之多陰離子性化合物 存在時所觀察到之生長相。初始死亡相係指無具體指明加 入之多陰離子性化合物存在時所觀察到之死亡相。 當初始死亡相開始時，初始生長相可能結束，或者是 ’在初始生長相和初始死亡相之間可能有任何時間長之靜 止相。 -33- 1312368 (30) 在一特殊實施態樣中’在其中該初始生長相係從第〇 天至第6天，而初始死亡相係從第7天開始之細胞培養中 ，在一種特殊實施態樣中多陰離子性化合物係在接種後及 第7天前的一個時間加入。在一種特殊實施態樣中，多陰 離子性化合物係在接種後及第6天之前加入。在一種特殊 實施態樣中，多陰離子性化合物係在第1和第6天之間加 入。在另一種特殊實施態樣中，多陰離子性化合物係在第 4、5或6天加入。在其它特殊實施態樣中，多陰離子性 化合物係在約第6天，或第6天加入。 已發現（見實施例6和1 0 ):當多陰離子性化合物 在接種後及初始死亡相開始前的一個時間加入時，生長相 可延長超過初始生長相。延長超過初始生長相之生長相具 有較初始生長相來得長之期間，也就是長過未加入多陰離 子性化合物時所觀察到之生長相。較合適的爲，該延長之 生長相可取得較初始生長相期間取得之尖峰存活細胞密度 來得高的存活細胞密度。 因此，在其它實施態樣中’本發明係針對：（I ) 一 種細胞培養過程，及（2 ) —種用於延長細胞培養之生長 相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞 ;及在接種後，於初始死亡相開始前的一個時間’將多陰 離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長。在 特殊之實施態樣中’本發明係針對：（1 ) 一種細胞培養 過程，及（2 )—種用於延長細胞培養之生長相的過程， 其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在接種 -34 - (31) 1312368 後，於初始生長相的期間將多陰離子性化合物加入細胞培 養中；其中該生長相被延長。在更特殊之實施態樣中，本 發明係針對：（1 ) 一種細胞培養過程，及（2 ) —種用 於延長細胞培養之生長相的過程，其包含：培養表現所關 注之蛋白質的宿主細胞；及在初始生長相的後半段期間將 多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中該生長相被延長 。在其它特殊實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一種細 胞培養過程，及（2 ) —種用於延長細胞培養之生長相 的過程’其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞； 及在或約在初始生長相結束時將多陰離子性化合物加入細 胞培養中；其中該生長相被延長。 生長相可延長至超過初始生長相期間至任何時間長。 僅只於用來例示說明：生長相可延長1-10天、2-9天、3-8天’或約5天。較合適的爲，生長相延長一或多天，更 合適的爲’延長二或多天’再更合適的爲，延長三或多天 ’最合適的爲’延長四或多天。例如：在實施例6中，生 長相係延長至第11天’其中初始生長相延長至第6天。 因此’在實施例6中’生長相已延長超過初始生長相$天 。延長之生長相後面可接續著死亡相或靜止相。同樣的， 初始生長相後面可接續著死亡相或靜止相。 現已發現（見實施例6和1 〇 ):當多陰離子性化合 物在接種後及初始死亡相開始的一個時間加入時，死亡相 之起點可延遅至超過初始死亡相之起點，也就是延遲至超 過未加入多陰離子性化合物時所觀察到之死亡相的起點。 -35- (32) 1312368 其起點延遲之死亡相係在較初始死亡相來得晚的時間開始 〇 因此，在其它實施態樣中，本發明係針對：（1 )— 種細胞培養過程，及（2 ) —種用於延遲細胞培養之死亡 相的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞 ;及在接種後，於初始死亡相開始前的一個時間，將多陰 離子性化合物加入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延 遲。在更特殊之實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一種 細胞培養過程，及（2 ) —種用於延遲細胞培養之死亡相 的過程，其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞； 及在接種後，於初始生長相的期間將多陰離子性化合物加 入細胞培養中；其中該死亡相之起點被延遲。在更特殊之 實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一種細胞培養過程， 及（2 ) —種用於延遲細胞培養之死亡相的過程，其包含 :培養表現所所關注之蛋白質的宿主細胞；及在初始生長 相的後半段期間將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其 中該死亡相之起點被延遲。在其它特殊實施態樣中，本發 明係針對一種用於延遲細胞培養之死亡相的過程，其包含 =培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞；及在或約在初始 生長相結束時將多陰離子性化合物加入細胞培養中；其中 該死亡相之起點被延遲。 死亡相之起點可延遲至任何之時間長。僅只於用來例 示說明：死亡相之起點可延遲1-10天、2-9天、3-8天， 或約5天。較合適的爲，死亡相之起點延遲一或多天，更 -36- (33) 1312368 合適的爲’延遲二或多天，再更合適的爲，延遲三或多天 ’最合適的爲’延遲四或多天。在另一種本發明上述之增 加細胞存活力的細胞培養過程和方法的特殊實施態樣中， 多陰離子性化合物係在接種後，於初始死亡相期間的一個 時間加入。 已發現（見實施例7和8 ):當多陰離子性化合物係 在初始死亡相的期間加入時’可遏止死亡相。遏止死亡相 意指將在未加入多陰離子性化合物時所觀察到之存活細胞 密度減少的情形停止~段時間。遏止效果可在加入多陰離 子性化合物後立即開始’或稍後開始。當死亡相被遏止時 ，後面可接續著生長相或靜止相。當然，培養最終將會再 進入一死亡相。 因此’在其它實施態樣中，本發明係針對：（1 ) 一 種細胞培養過程，及（2 ) —種用於遏止細胞培養之死亡 相的過程’其包含：培養表現所關注之蛋白質的宿主細胞 ;及在初始死亡相的期間將多陰離子性化合物加入細胞培 養中；其中該死亡相被遏止。 死亡相可被遏止至任何長之期間，直到再度進入死亡 相。僅只於用來例示說明：死亡相可被遏止1-20天、2-18天、5-15天’或8-13天。較合適的爲，生死亡相被遏 止一或多天’更合適的爲，遏止二或多天，再更合適的爲 ’遏止三或多天’最合適的爲，遏止四或多天。死亡受遏 止的情況並不一定有連續性，也就是，在二區固定或增加 存活細胞密度的範圍之間，可能有存活細胞密度"局部”減 -37- 1312368 (34) 少的情形。 細胞培養方法（尤其是非連續性方法）之操作時間通 常受限於剩餘之存活細胞密度（其在死亡相期間降低）° 較長之操作時間可取得較高之產物滴定濃度。因此’儘可 能延遲死亡相，包括延長生長相，或遏止死亡相是有需要 的。產物品質之考量亦爲延遲或遏止死亡相的動機之一’ 因爲細胞死亡會釋出涎酸酶至培養上淸液中’此可降低所 表現之蛋白質的涎酸含量。蛋白質之純化考量亦爲延遲或 遏止死亡相的動機。存在於培養中之細胞碎片和死細胞內 容物對於培養操作終了時分離及/或純化蛋白質產物的能 力有不良的影響。 在特殊之實施態樣中係將此處所描述之任何涉及二或 多次溫度更動的細胞培養過程和此處所描述之任何涉及延 遲加入多陰離子性化合物的細胞培養過程一起用於細胞培 養中。在特殊之實施態樣中’本發明係針對：（丨）一種 細胞培養過程，及（ii ) 一種用於增加細胞存活力的過程 ，其包含：a)將表現所關注之蛋白質的宿主細胞在’或 接近3 71下，於可讓細胞生長之條件中培養一段時間；b )從約第5至7天開始，將細胞培養之溫度降低’並將細 胞在或接近3 4 °C之第二種溫度下培養；c )從約第6天至 第]4天開始，將細胞在或接近3 2 °C之第三種溫度下培養 :及d )在接種後的一個時間’將多陰離子性化合物加入 細胞培養中。 -38- 1312368 (35) 與醣蛋白之純化和分析相關的技術和程序 在本發明所包含之培養方法（包括涉及二或多次溫度 更動的細胞培養方法和涉及延遲加入多陰離子性化合物的 細胞培養方法二者）中，由細胞所產製之蛋白質通常係依 需要在全部細胞培養期結束時，利用本技藝中所已知並使 用之分離和純化方法來收集、回收、分離，及/或純化， 或大體上純化。較合適的爲，將從培養細胞分泌出的醣蛋 白從培養介質或上淸液中分離出；然而，亦可利用本技藝 中所已知並使用之方法及下述之進一步說明，從宿主細胞 ，如：細胞之溶胞化物，回收蛋白質。 若需要時’可將含有藉由本發明過程所產製之醣蛋白 的複合碳水化合物藉由習知之碳水化合物分析技術進行例 行分析。例如：本技藝中所熟知之技術，如：可揭露出終 端甘露糖’或其它糖類，如：半乳糖之比例的外源凝集素 點墨法。利用無水肼或酶的方法將糖類從蛋白質釋出，及 經由離子交換色層分析、尺寸排除色層分析或本技藝中所 熟知之方法來將寡醣類分級分離的方法可用來確認由涎酸 終止之一-、二三-或四·觸角形寡醣。 亦可在以神經胺酸酶去除涎酸的處理之前和之後測量 醣蛋白之pi。以神經胺酸酶處理後，pI增加表示在醣蛋 白上有涎酸存在。在表現出之蛋白質上的碳水化合物構造 通常係以N -連接或〇 -連接之碳水化合物型式產生。n -連 接或〇-連接碳水化合物之主要不同處在於其核心構造。 N -連接之醣化作用係指該碳水化合物部分係經由G 1 cN A c -39- 1312368 (36) 連接至肽鏈中的天門冬素殘質。N -連接之碳水化合物類均 包含一共通之 Manl-6(Man]-3)Manfll-4GlcNAcfll-4GlcNAc6-R核心構造’其中在此核心構造中之R代表— 天門冬素殘質。所產製之蛋白質的肽序列將包含一天門冬 素-X-絲胺酸、天門冬素-X_蘇胺酸和天門冬素-X-半胱胺 酸’其中X爲除了脯胺酸外之任何胺基酸。 相反地’ 0 -連接之碳水化合物類的特徵爲一共通之連 接蘇胺酸或絲胺酸之羥基團的GalNAc核心構造。在N-連 接和0 -連接之碳水化合物類中，最重要的爲複合之N -連 接和〇-連接之碳水化合物類。這類複合之碳水化合物類 含有數種觸角形構造。一-、二-、三-和四-外構造對加上 終端涎酸而言是很重要的。這類外鏈構造可提供額外位置 給含有該蛋白質產物之碳水化合物類的特殊糖類和連接部 分。 所產生之碳水化合物類可藉本技藝中所已知之任何方 法進行分析。本技藝中已知有數種用於醣化分析的方法， 並可用於本發明的內容中。這些方法提供關於連接所產製 之肽的寡醣的鑑定方法和組成之資訊。可與本發明銜接之 碳水化合物的分析方法包括，但不限於：外源凝集素色層 分析法；Η P A E C - P A D，此係根據電荷，利用高P Η陰離子 交換色層分析法來將寡醣類分開；NMR ;質譜分析； HPLC ; GPC ;單醣組成分析；和依序之酶分解。 另外，用於釋出寡醣的方法爲本技藝所已知和使用。 這些方法包括：1 )酶的方法，其通常利用肽-Ν-糖苷酶 -40- 1312368 (37) F/內-β -半乳糖苷酶進行；2 ) β排除法，利 主要釋出0-連接之構造；及3)利用無水月 接和 0 -連接之寡醣類二者的化學方法。分 步驟進行：1 .將樣本對去離子化水進行透析 白勺緩衝鹽類，再進行凍乾。2 .以無水肼釋出 。3 ·以無水甲醇性H C 1處理完整的寡醣鏈 ¥基衍生物型式之個別單醣。4 )將任何之-乙醯基化。5.進行衍生以產生全-0-三甲基 苷。6.在 CP-SIL8管柱上，藉毛細氣體-液 (GLC )將這些衍生物分開。7.藉由GLC之 譜學，與已知標準進行比較，以鑑定個別之 8.藉由具內標準（13-0-甲基-D-葡萄糖）之 別之衍生物。 中性和胺基糖類可藉由高效能陰離子交 加上脈衝電流偵測（HPAE-PAD醣系統；廸 公司）來測定。例如：可經由在1 0 0 °C下，] 體積）三氟醋酸中水解6小時來釋出糖類。 乾法或以 Speed-Vac (沙文（Savant)儀器 乾燥。然後，將殘質溶解在1 %醋酸鈉三水 並在HPLC-AS6管柱上分析（依 Anumula Anal. Biochem·, 195 : 269-280 中之描述）。 或者，可進行免疫點墨碳水化合物分析 ，蛋白質·結合之碳水化合物類係利用市售 統（寶林格（Boehringer ))來偵測 用苛鹼環境來 牛來釋出N-連 析可利用下列 ，以移除所有 完整的寡醣鏈 ，以釋出爲〇 -級胺基團+ 矽烷基甲基糖 體色層分析法 持留時間和質 糖苷衍生物。 FID來定量個 換色層分析， 奈（Dionex) 玲20% (體積/ 然後，經由凍 )將水解產物 合物溶液中， et al_, 1991， 。在此程序中 之多醣偵測系 ，此係根據 -41 - 1312368 (38)
Haselbeck et al. ( ]993 G]ycoc〇jugate J.，7 : 63)所描述 之氧化免疫點墨程序來進行。依照該製造者所建議之染色 計劃進行’但將蛋白質轉移至聚亞二氟乙烯膜，而不轉移 至硝基纖維素膜’阻斷緩衝液中含有5 %在]〇 η1 Μ T r i s緩 衝液（p Η 7.4 )中之牛血淸白蛋白，以及0 · 9 %氯化鈉。以 連接一鹼性磷酸鹽共軛物之抗-異羥基洋地黃毒苷抗體（ 寶林格）（此抗體係在Tris緩衝之生理食鹽水中稀釋1 : 1000) ’並使用在 100mM Tris緩衝液，pH9.5 (含 lOOmM氯化鈉和50mM氯化鎂）中之磷酸酶受質，4 -硝基 藍四唑鎰氯化物，0.03% (重量/體積）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸化物，0.03% (重量/體積），來進行偵測。 含醣之蛋白賀帶通常可在約10-15分鐘內看到。 與蛋白質結合之碳水化合物亦可經由以肽-N _糖苷酶 F分解來分析。根據此程序，將殘質懸浮在1 4微升之含 0.1 8 % S D S、1 8 m Μ β -锍醇、9 0 m Μ 磷酸化物、3 . 6 m Μ EDTA的緩衝液（ρΗ8·6)中，並在l〇〇t：加熱3分鐘。在 冷卻至室溫後，將樣本分成二等份。一份（未進一步處理 )作爲對照組。使另一份能適應約1 % N P - 4 0去垢劑，再 加入0.2單位之肽-N·糖苷酶F (寶林格）。將二份樣本均 在3 7 °C加溫2小時，然後藉S D S _聚丙烯醯胺凝膠電泳法 分析。 另外，藉習知方法評估醣蛋白產物之涎酸含量。例如 :可藉由直接比色法來分別測定涎酸（Yao, et al.，1 9 89, Ana丨· Biochem.，179: 332-335)，較合適的爲使用三份樣 -42 - (39) 1312368 本。另一種測定涎酸的方法涉及依Warren et al.,] 9 5 9 ( J. Biol. Chem·，2 3 4:1 97 1 _ 1 975 )之描述，使用硫代巴比土酸 (TBA )測定。而另一種方法涉及高效能色層分析法，如 H.K.Ogawa et al.，1993, J. Chromatography, 612 : 145. 1 49中之描述。 舉例說明’在醣蛋白之回收、分離及/或純化方面， 將細胞培養介質或細胞溶胞化物離心，以去除顆粒細胞和 細胞碎片。错合適之純化技術’將所需多肽產物分離或純 化’以使其不受可溶性蛋白質和多肽污染。下列程序提供 示範性而非限制性之蛋白質純化方法：在免疫親和性或離 子-交換管柱上進行分離或分餾；乙醇沈澱法；逆相HP LC ’在樹脂’如：较石’或陽離子交換樹脂，如：DEAE上 進行色層分析；色層聚焦法；SDS-PAGE ;硫酸錢沈澱法 ;利用’如：聚葡糖凝膠（Sephadex) G-75、瓊;脂糖凝膠 進行凝膠過濾；用於去除免疫球蛋白污染物之蛋白質A 瓊脂糖凝膠色層分析法；等。亦可使用其它添加物，如： 蛋白酶抑制劑（如：P M S F或蛋白酶K)來抑制純化期間 之蛋白水解性降解反應。技術熟習人士將會了解用於純化 指定之所需肽的方法可能需要一些能使那些以重組方式表 現在細胞培養中之多肽產生改變的修改。那些可選擇碳水 化合物類及增進涎酸的純化程序爲特別佳者，如：利用陽 離子-或陰離子-交換樹脂之離子-交換軟凝膠色層分析或 Η P L C，其中可收集到更多之酸性分液。 (40) 1312368 細胞、蛋白質及細胞培養 在本發明之細胞培養過程或方法（包括涉及二或多次 溫度更動之細胞培養方法，和涉及延遲加入多陰離子性化 合物之細胞培養方法二者）中，細胞可維持在本技藝中所 習知之不同的細胞培養介質，也就是：基礎培養介質中。 例如：這些方法可應用至維持在細胞培養介質（其可補充 養分，等）中之大量細胞。通常，"細胞培養介質"（亦稱 爲”培養介質”）一詞在本技藝之技術熟習人士的認知中係 指一種營養介質，其中可生長細胞（宜爲動物或哺乳動物 細胞），且其通常可提供至少一或多種來自下列群體之成 分：能量來源（通常爲碳水化合物的形式，如：葡萄糖 );所有必須胺基酸，通常爲二十種基礎胺基酸，加上半 胱胺酸；維他命及/或其它有機化合物，其通常需要低濃 度；脂質或游離脂肪酸，如：亞麻油酸；和微量元素，如 :無機化合物或天然元素，其通常需要非常低之濃度，通 常係在微莫耳範圍內。細胞培養介質亦可經過補充，以含 有多種隨意之成分，如：荷爾蒙和其它生長因子，如：胰 島素、運鐵蛋白、表皮生長因子、血淸，等；鹽類，如： 鈣、鎂和磷酸鹽，及緩衝液，如：Η E P E S ;核苷和鹽基類 ’如：腺苷酸 '胸腺核苷、次黄嘌呤；及蛋白質和組織水 解產物’如：水解之動物蛋白質（蛋白脾或蛋白腺混合物 ，此可從動物副產品 '純化之明膠或植物物質取得）：抗 生素’如：正大黴素；及細胞保護劑，如：普朗尼（ Pluronic)多醇（普朗尼F68)。較合適的爲不含血淸及 1312368 (41) 不含動物源之產物或成分的細胞營養介質。 如本技藝中之人士所察知者，動物或哺乳動物細胞係 培養在適合培養特殊細胞的介質中，且此可由本技藝之技 術熟習人士來決定，不需做過度之實驗。可使用市售之介 質，包括，如.最低必須介質（Minimal Essential Medium) ( Μ Ε Μ，史格馬公司，密蘇里州聖路易市）； 漢氏（H a m' s ) F I 0介質（史格馬公司）；杜白可氏修改 之伊果氏介質（Dulbecco’ s Modified Eagles Medium)( DMEM，史格馬公司）；RPMI-1640介質（史格馬公司） ;海克隆（HyClone)細胞培養介質（海克隆公司，猶他 州洛根市）；及化學-限定（CD )介質，此係爲特殊細胞 型態調配，如：CD-CHO介質（因維特金（lnvitr〇gen ) 公司，加州卡斯貝市）。本技藝中之人士了解，且可利用 例行技術將上述之補充要素或成分，包括：隨意之要素， 依需要以合適之濃度或量加入前述示範介質中。 另外’適合本發明方法之細胞培養條件爲那些常用且 已知之用於細胞之分批培養、分批-餵養，或連續培養者 ，而要注意的項目除了溫度外，還有：p Η値，如：約6.5 至約7 · 5 ;溶解的氧（0 2 )，如：介於約5 · 9 0 %之空氣飽 和及二氧化碳（C02 )、攪動及濕度。舉例說明但非限制 用，例如：適合用於本發明之分批-餵養過程的細胞培養 介質包含修改之CD-CHO介質（因維特金，加州卡斯貝市 )’如：實施例1。亦可使用一種餵養介質，如：修改之 eRDF介質（因維特金’加州卡斯貝市），如：實施例1 -45- (42) 1312368 或實施例7。較合適的爲一種亦包含D-半乳糖之餵養介質
動物細胞，哺乳動物細胞、培養的細胞、動物或哺乳 動物宿主細胞、宿主細胞、重組細胞、重組宿主細胞，等 全部爲可根據本發明過程培養之細胞的名稱。這類細胞典 型上爲從哺乳動物取得或衍生之細胞株，且當其被置於含 合適之養分及/或生長因子之介質中的單層培養或懸浮液 培養中時，其可生長並存活。用於長成及維持特殊細胞培 養所需要之生長因子和養分可由相關技藝中之技術人士很 容易地根據經驗來決定，如：依下列文獻中之描述： Barnes and Sato, ( 1980, cell,22 : 64 9 ) ; Mammalian Cell Culture，Ed· J.P.Mathei·, Plenum Press, NY, 1984;和美國 專利第5 5 7 2 1，1 2 1號。
可根據本發明之方法培養的細胞型態有多種。這些細 胞通常爲可表現及分泌，或可經分子工程處理以表現及分 泌大量之所關注的特殊蛋白質（更特別的爲醣蛋白）至培 養介質中的動物或哺乳動物細胞。吾人了解：由宿主細胞 所產製之醣蛋白對宿主細胞可爲內生性或同質性。或者， 較合適的爲，醣蛋白對宿主細胞爲異源性，也就是外來性 ，例如：由中國大頰鼠卵巢（C Η 0 )宿主細胞所產製和分 泌之人類醣蛋白。較合適的情況還有，哺乳動物醣蛋白（ 也就是那些最初係從哺乳類有機體取得或衍生者）係藉由 本發明方法取得，且宜由細胞分泌至培養介質中。 可藉本發明方法很容易地產製之哺乳動物類醣蛋白的 -46 - (43) 1312368
實例包括，但不限於：細胞活素、細胞活素受體、生長因 子（如：EGF、HER-2、FGF-a、FGF-β、TGF- a、TGF-β ' PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF、NGF-β);生長因子受體 ，包括：融合或嵌合之蛋白質。其它非限制性實施例包括 :生長激素（如：人類生長激素 '牛生長激素）；胰島素 (如：胰島素A鏈和胰島素B鏈）、前胰島素；紅血球 生成素（EPO);群落刺激因子（如：G-CSF、GM-CSF、 M-CSF);間白素（如：IL-1至IL-2);血管內皮生長因 子（VEGF)及其受體（VEGF-R);千擾素（如：IFN-a 和β或γ);腫瘤壞死因子（如：TNF-o:和TNF-β)及其 受體，TNFR-1和TNFR-2 ;血小板生成素（ΤΡΟ ):凝血 酵素；腦部促尿鈉排泄肽（ΒΝΡ ):凝血塊因子（如：第 VIII因子、第IX因子、馮維布蘭德氏因子’等）；抗-凝 血塊因子；組織胞漿素原活化劑（τρ Α )，如：尿激素或 人類尿或組織型態TP A ;濾泡刺激激素（F S Η );黃體化 激素（LH);抑鈣素；CD蛋白質（如：CD3、CD4' CD8 、CD28、CD19，等）；CTLA 蛋白質（如：CTLA4 ) ； T- 細胞和B-細胞受體蛋白質；骨成形蛋白質（BNPs，如： BMP-1、BMP-2、BMP-3，等）；神經營養因子，如：由 骨衍生之神經營養因子（BDNF );神經營養素’如：3 - 6 腎活素；風濕樣因子；RANTES ;白蛋白：弛緩素；巨噬 細胞抑制蛋白質（如：MIP-1、MIP-2 );病毒蛋白質或 抗原；表面膜蛋白質；離子道蛋白質；酶；調節蛋白質； 抗體；免疫調節蛋白質（如：HLA、MHC、B7 —族）； -4/^ (44) 1312368 回歸受體；轉運蛋白質；過氧化物岐化酶（s〇D) ; G-蛋 白質偶合之受體蛋白質（GPCRs );神經調節蛋白質；阿 兹海默氏症相關之蛋白質和肽類（如：Α-β )及其它本技 藝中已知者。融合蛋白質和多肽類、嵌合蛋白質和多肽類 ’以及前述任一項蛋白質和多肽類之片段或部分，或突變 體 '變異體或同系物亦包括在可由本發明方法產製之合適 蛋白質、多肽及肽類中。
適合用於庇護、表現及產製用於接下去之分離及/或 純化作用中之蛋白質的動物或哺乳動物宿主細胞之非限制 性實例包括：中國大頰鼠卵巢細胞（CHO )，如：CHO-K1 ( ATCC CCL-61) ，DG44 ( Chasin e t a 1., 1 9 8 6, S 〇 m. Cell Molec. Genet., 1 2:5 5 5 -5 5 6 ;及 Kolkekar et al·, 1 997, Biochemistry, 3 6:1 090 1 - 1 0909 ) ，CHO-K1 Tet-On 細胞株（
Clontech )，命名爲 E C A C C 8 5 0 5 0 3 02 之 CH O ( C A MR， Salisbury，Wiltshire, UK ) ，（:HO 株落 13 ( GEIMG，
Genova, IT) ，CHO 株落 B ( GEIMG，Genova, IT)，命名 爲 ECACC 93 06 1 607 之 CHO-K1/SF ( CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK ) ，RR-命名爲 EC AC C 9 2 05 2 1 2 9 之11尺- CHOK1 ( CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)，二氫葉酸還原 酶陰性 CHO 細胞（CHO/DHFR，Urlaub and Chasin, 1 980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:42 1 6 )，及 dp 12.CHO 細胞 (U.S.專利號5,721，121);藉SV40轉形之猴腎CV1細胞 (COS細胞，COS-7，ATCC CRL-1651 );人類胚胎腎細胞 (如：用於在懸浮液培養中生長之2 9 3細胞’或分殖的 -48- 1312368 (45)
293 細胞 ’ Graham et a]·,1977，.1. Gen. Virol.，36 : 59); 幼大頰鼠腎細胞（BHK, ATCC CCL-10 );猴腎細胞（ C V 1 , ATCC CCL-70 )；非洲綠猴腎細胞（V E R 0 - 7 6 , ATCC CRL- 1 5 8 7 ； VERO，ATCC CCL-8 1 )；老鼠足細胞 (TM4，Mather，1 9 8 0，Biol. Reprod·, 23:243 -25 1 );人類 子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL-2 ):犬腎細胞（ MDCK，ATCC CCL-34 )；人類肺細胞（W】38, ATCC CCL-75 ):人類肝細胞（Η E P - G 2 , Η B - 8 0 6 5 );老鼠乳腺 瘤細胞（Μ Μ T 0 6 0 5 6 2，A T C C C C L - 5 1 );水牛大鼠肝細胞 (BRL 3 A, ATCC CRL- 1 442 ) ； TRI 細胞(Mather, 1 982,
Annals NY Acad Sci., 3 8 3:44-68 ) ； MCR5 細胞；FS4 細 胞。宜爲CHO細胞，尤其是CHO/-DHFR細胞。
適合在本發明之方法和過程中培養的細胞可含有，如 :經由轉形、轉染、感染或注射等方法引入之表現載體（ 構造物），如：質體，等，該表現載體中庇有編碼用於在 培養過程中表現及產製之蛋白質的編碼序列，或其部分。 這類表現載體含有用於轉錄及轉譯插入之編碼序列的必須 要素。本技藝中之技術熟習人士所熟知和實行之方法可用 來構造含有編碼所產製之蛋白質和多肽的序列，以及合適 之轉錄及轉譯控制要素的表現載體。這些方法包括：試管 內重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。這類技 術說明於：J. Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning， A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plain view，N.Y·及 f.M. Ausubel et al·，1989, Current -49 - 1312368 (46)
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 控制要素’或調節序列爲那些與宿主細胞蛋白質交互 作用’以進行轉錄及轉譯之載體非-轉譯區，如：增强因 子、啓動因子、5’和3,未轉譯區。這類要素之强度及特異 性可有不同。根據所使用之載體系統和宿主細胞，可使用 任何數目之合適的轉錄及轉譯要素，包括組成性及可誘導 之啓動因子。在哺乳動物細胞系統中，以來自哺乳動物基 因或哺乳動物病毒者較佳。用於蛋白質表現系統中之構造 物係設計成含有至少一啓動因子、增强因子序列（對哺乳 動物表現系統而言爲隨意含有）及其它爲了適當轉錄及調 節基因表現時所必須或需要之序列（如：轉錄起始及終止 序列、複製位置之起點、多腺苷形成序列，如：牛生長激 素（BGH )多腺苷酸序列。 如本技藝中之技術熟習人士可察知者，如何選擇可用 來適當地轉錄、表現及分離在真核（如：哺乳動物）表現 系統中所產製之蛋白質的合適載體，如質體，要素的方法 已爲吾人所知，且可由本技藝中之技術人員例行決定及使 用。由根據本發明方法所培養之細胞來表現蛋白質的作用 可受啓動因子之控制，如：病毒（如：巨細胞病毒（CMV )、勞斯氏肉瘤病毒（RSV ))啓動因子，磷酸甘油激酶 (PGK )、胸腺核苷激酶（TK))，或肌動蛋白啓動 因子。再者，經調節之啓動因子可藉特殊化合物或分子來 提供誘導力，如：老鼠乳腺瘤病毒（MMTV )之腎上腺促 -50- (47) 1312368 糖皮質激素反應要素（GRE )可由腎上腺促糖皮質 出（V. Chandler et al·，1983，Ce]l，33:489-499) ’若必須或需要時，可使用組織-特異性啓動因子 要素（G. Swift et al.3 1984, Cell, 38:639-646)。 表現構造物可藉由多種本技藝中之技術熟習人 知的基因轉移方法來引入細胞中，例如：磷酸鈣共 法、脂粒轉染法、顯微注射法、電穿孔法及感染或 導法。對於方法之選擇係在本技藝中之技術熟習人 力範圍內。本技藝中之技術熟習人士淸楚明白可將 種帶有DNA序列（用於在細胞中表現者）的構造 入細胞中，以接著在細胞中產製出及/或取得表現 在一種特殊觀點中，本發明之蛋白質-表現哺 細胞中較適合使用包含適當之控制和調節序列的哺 表現系統。常用於哺乳動物表現載體中之真核控制 括可與哺乳動物細胞相容之啓動因子和控制序列， 巨細胞病毒（CMV )啓動因子（CDM8載體）和鳥 毒（ASV) (TtLN)。其它常用之啓動因子包括來 病毒 4〇(SV40)之早期和晚期啓動因子（Fiers 1 973，Nature，273:1 1 3 ) ’或其它病毒啓動因子， 些從多瘤' 腺病毒2及牛乳頭狀瘤病毒衍生者。亦 可誘導之啓動因子，如：hMT Π ( Karin et al.: Natui.e，299:797-802 )。 適合真核宿主細胞之表現載體的實施例包括， 於：用於哺乳動物宿主細胞之載體（如BPV-], 激素誘 。還有 或調節 士所已 同沈澱 病毒轉 士的能 一或多 物轉染 產物。 乳動物 乳動物 序列包 例如： 肉瘤病 自猴子 et al_， 如：那 可使用 ,1982, 但不限 P H y g, -51 - (48) 1312368 pRSV，pSV2, pTK2 (曼尼亞提斯公司（Maniatis )); pIRES (克隆泰克公司（C]ontech ) ) ； pRc/CMV2. pRc/RSV, pSFVl (生命技術公司）；pVPakc 載體，PCMV 載體，pSG5載體（史特塔金公司（Stratagene))，逆轉 錄病毒載體（如pFB載體（史特塔金公司（Stratagene)) ，pcDNA-3 (因維特金公司（Invitrogen))，腺病毒載體 );腺-相關之病毒載體，桿狀病毒載體、酵母載體（如 :PESC載體（史特塔金公司）），或前述中之任一項的 改良型。載體亦可含有用於讓基因表現最優化之啓動因子 區序列的增強因子序列上游或下游。 亦可在重組載體（如：質體）中使用可選擇之標記來 提供抗性給庇住（較合適的情況爲已穩定地嵌入）該載體 之細胞，以使其可在合適之選擇介質中被選出。可使用之 系統有多種’包括但不限於：單純疱疹病毒胸腺核苷激酶 (HSV TK) ( Wi gl er et al ·，1 9 7 7，C e] I，1 1 :22 3 )，次黃 嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT ) ( Szybalska and S zybal ski et al ·，1 992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4 8:202 )’及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶（Lowy et ai.，1980, Cell， 22:817)基因’其可分別用於tk-、hgprt…或aprt-細胞 (APRT)中。
Acad. Sci. USA,
抗-代謝物抗性亦可作爲下列非限制性標記基因實例 的選擇根據：dhfr，其提供對胺基甲基葉酸之抗性（ Wigler et al·，]980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35 7 ; 及 〇 ’ Hare et a]., ]981， Proc. Nail. -52 - (49) 1312368 7 8 : ] 5 2 7 ) ; g p t，其提供對黴菌酚酸之抗性（μ u 11 i g a η and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072)； neo，其提供對胺基糖苷類 G418之抗性（Cnnicai Pharmacy, 12:488-505; Wu and Wu5 1991, Biotherapy, 3:8 7 - 9 5; Tolstoshev, 1993， Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573-596; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191-21; May, 1 993，TIB TECH，1 1(5):1 55-215 );及 hygro，其提 供對潮黴素之抗性（Santerre et al·，1984，Gene, 30:]47) 。在重組DN A技術之技藝中所普遍知道之方法可例行用 來選擇所需之重組細胞株落，且這類方法係描述於，如： Ausubel et a 1. (e d s .) 5 Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY ( 1 993); Kriegler, 1 990, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press，NY ;第 12 和 13 章中，Dracopoli et al. (e d s.). Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons, N Y (19 9 4); Colberre-Garapin et al.? 1981. J. Mol. Biol., 150:1中，其全文倂爲本文之參考資料。 另外，表現出之蛋白質分子的表現水準可藉載體之增 數放大來增加（回顧時可參考：Bebbington and Hentschel， ‘‘The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in m a mm a] i an cells in DN A cloning”， V o 1. 3， Academic P r e s s，N e w Y 〇 r k ^ I 9 8 7 )。當載體系統中表現蛋白質之標 -53· (50) 1312368 記被增數放大時，存在於宿主細胞培養中之抑制劑水準增 加時可增加標記基因的複本數。由於被增數放大之區與蛋 白質-編碼基因相關，因此可同時增加蛋白質之產量（ Ci-ouse et al.5 1983，Mol. Cell. Biol·，3:257)。 在藥物甲硫胺酸次硫酸亞胺或胺基甲基葉酸的存在下 ’可將庇護該作爲可選擇標記之麩醯胺合成酶（GS)或 二氫葉酸還原酶（DHFR )的編碼核酸的載體分別增數放 大。以麩醯胺合成酶爲基礎之載體的優點爲麩醯胺合成酶 陰性之細胞株（如：老鼠骨髓瘤細胞株，N S Ο )的可利用 性。麩醯胺合成酶表現系統亦可經由提供額外之抑制劑來 預防內生性基因之作用’而可在麩醯胺合成酶表現細胞（ 如：C Η Ο細胞）中作用。 可表現出作爲可選擇標記之DHFR的載體包括，但不 限於：pSV2-dhfr 質體（Subramani et al.5 Mo]. Cell. Biol.，1:854 (1981))。可表現出作爲可選擇標記之麩醯 胺合成酶的載體包括，但不限於：在Stephens and Cockett，1989，Nucl· Acids Res·，17:7110 中所描述之 pEE6表現質體。麩醯胺合成酶表現系統及其構成要素詳 細說明於 PCT 刊物中：WO87/04462; WO86/0 5807; W089/0 1 036 ; W089/1 0404 ;和 WO9 1 /0665 7，其全文倂爲 本文之參考資料。另外，可根據本發明使用之麩醯胺合成 酶表現載體可從供應商（包括，如：隆沙生物公司（ Lonza Biologies )，新罕布夏州波茲茂斯市）購得。 在一種特殊之實施態樣中，可將編碼可溶性CTLA4 (51) 1312368 分子或可溶性.C T L A 4突變種分子的核酸序列插入經過設 計，可在真核宿主中表現外來序列的載體中。載體之調節 要素可根據特殊之真核宿主而有不同。在真核宿主細胞中 表現可溶性CTLA4分子或可溶性CTLA4突變種的載體可 包含用來將蛋白質之表現最優化的增強因子序列。 細胞培養之類型 爲了便於瞭解，而非用來限制，本技藝中之技術熟習 人士可察知用於產製蛋白質之細胞培養和培養操作過程可 包括三種一般類型；也就是，連續培養、分批培養和分 批-餵養培養。例如：在連續培養中，新鮮培養補充品（ 也就是餵養介質）係在培養期間提供給細胞，並同時每天 去除舊培養介質’且將產物如：每日或連續收成。在連續 培養中’可每天加入餵養介質，且可以連續方式（也就是 以點滴或注入之型式）加入。在連續培養方面，細胞可依 需要維持在培養中’只要細胞仍維持存活，且細胞和環境 仍保持著。 在分批培養中，細胞先培養在介質中，且既不將此介 質移除、取代，也不補充營養，也就是：在培養操作過程 期間或結束前’並不以新介質”餵養，，細胞。所需產物係在 培養操作過程結束前收成。 在分批-餵養培養方面’培養操作時間可經由在操作 期間’每日補充培養介質一或多次（或連續地）新鮮介質 ，也就疋在培養期間，以新介質（’，餵養介質M ) ’’餵養”細 -55- (52) 1312368 胞。分批-饌養之培養法可包括不同之餵養養生法及次數 ，例如：每日’每隔一日，每二日’等’每日超過一次或 每曰少於一次’等。再者’分批-韻養之培養法可以饒養 介質連續餵養。 然後，在培養/生產操作結束時收成所需產物。本發 明宜包含如下述之分批-餵養細胞培養法：其中在培養期 間之二或多次溫度更動可使蛋白質產物之產量及品質增加 ，且可將蛋白質生產相延長超過未使用溫度更動或僅使用 一次溫度更動之培養所具者。本發明宜包含其中多陰離子 性化合物係在接種後的一個時間加入的分批-鶴養細胞培 養法。 亦可想見的是：在本發明之培養方法中，可補充餵養 介質’使其含有D-半乳糖，或者，除了加入餵養介質中 外，可透過某些方式將D-半乳糖餵入培養中。以含半乳 糖之餵養介質靜養’或其它餵養型式鶴養時，宜以每日爲 基礎（或連續地）來餵養直到培養操作結束，但亦可應用 其它餵養計劃。在這類包含D -半乳糖之連續餵養養生計 劃中’培養係以如：連續供應之"點滴”或注入，或其它自 動加至培養中的方法’以定時、調節過及/或規劃好的方 式接受餵養介質’以在培養中取得並維持適量之半乳糖。 最合適的養生計劃爲一種在培養操作的每一天（從培養操 作開始至收成細胞那天）中，以含半乳糖之餵養介質每曰 一次大九劑餵養細胞餵養。根據本發明之涉及以半乳糖餵 養的方法’餵養介質中所提供之D•半乳糖的濃度以能在 -56 -
正替換頁 附件3A:第92 136008號專利申請案 ---i中文說明書替換頁 民國98年4月24日修正 (53) 培養過程中，支持或維持培養或反應器中之D -半乳糖水 準的量較佳。適合用於餵養介質中之D -半乳糖的量含有 從約1克/升至約5〇克/升，宜爲約3克/升至約25克 /升’以約3克/升至約20克/升更佳。一種特殊且非 限制性之實施例爲，含有1 2 _ 5克/升之D -半乳糖.的餵養 介質可適用於本發明之培養方法中，尤其是，如：50升 之反應器規模中。再者，較合適的爲，在整'個培養操作過 程中，用於培養細胞（如：在反應器或培養容器中）之餵 養介質中@殘餘的半乳糖濃度係維持且支持在約0.1克/ 升至10克/升的量，宜爲約0.1克/升至5克/升，較 合適的爲約〇·2克/升至5克/升，更合適的爲約0.2克 /升至2.5克/升，再更合適的爲約0.5克/升至約2克 /升，而最合適的爲約0.5克/升至1.0克/升。（見， 於2002年12月23日提出之共同授讓的專利申請案U.S. 序號第 60/43 6,05 0號，及與其同時提出之 U.S.序號 1 0/740,645，這些內容全部倂爲本文之參考資料）。 在涉及二或多次溫度更動之本發明的觀點中，包含二 或多次溫度更動之本發明細胞培養過程可使培養中有更多 細胞存活至過程結束或生產操作結束。在非-生長相關之 蛋白質產製過程中（如：本文所示範的一些實例）·，存活 細胞數愈多則產製之蛋白質量愈多。因此，在這類案例中 ，在過程結束時可累積較多之所需產物。根據本發明，由 培養中之個別細胞產製蛋白質或醣蛋白之速度（也就是細 胞之特殊生產力）不受本發明之溫度更動培養過程影響， -57-
(54) 附件3 : 第92136〇〇8號專利申請案 中文說明書替換頁 民國98年4月24曰修正 或增加（如：見下述及實施例4)。
根據本發明，細胞培養可在用於大規模或小規模產製 蛋白質之條件下，利用傳統上用於動物或哺乳動物細胞培 養之培養容器及/或培養裝置來進行，並由細胞產製醣蛋 白。如本技藝中之技術人士所察知，實驗室規模通常係使 用組織培養盤、T-燒瓶和旋轉燒瓶。在大規模培養方面， (如：描述於下列文獻中之如：5 0 0升、5 0 0 0升，等：於 2002年12月23日提出之共同授讓的專利申請案U.S.序 號第 60/43 6,0 5 0號，及與其同時提出之 U.S.序號 1 0/74 0,645，這些內容全部倂爲本文之參考資料），其程 序包括，但不限於：可使用流體化床生物反應器、中空纖 維生物反應器、滾筒瓶培養或攪動槽生物反應器系統。顯 微載體可與或不與滾筒瓶或攪動槽生物反應器系統一起使 用。這些系統可以分批、連續，或分批-餵養模式操作。 另外，培養裝置可配備或不配備一種利用濾器、重力、離 心力，等之細胞分離器。 細胞培養相及相關變數 ”接種”一詞係指將細胞加入起始介質中’以開始培養 培養之生長相爲一種相，在此相的期間’在任何時間 點之存活細胞密度均較在任何先前時間點高° 培養之靜止相爲一種如下述之相：在此相的期間’存 活細胞密度在任何長的時間期內約爲一致（也就是在測量 -58- (55) 1312368 誤差內）。 培養之死亡相爲一種在生長相之後，或在生長相和靜 止相之後來臨的相，且在此相期間，在任何時間點之存活 細胞密度均較在任何先前時間點低。 在生長-相關之培養方法中，如：其中多陰離子性化 合物可延長生長相的案例，生產相可在延長之生長相期間 開始。 在非生長-相關之培養方法中，細胞培養之生產相可 爲靜止相。 較合適的爲，在生產相期間補充（”餵養”）培養介質 ，以支援蛋白質持續生產（尤其是在延長之生產相），並 取得大量之高品質醣蛋白產物（由回收蛋白質時高水準之 終點涎酸含量來示範及/或測定）。餵養可以每日爲基準 來進行，或可根據其它計劃來支撐細胞之存活力和蛋白質 產製。 在其溫度更動依次降低至低於生長及標準（初始）生 產相之溫度的延長的生產相期間，細胞被餵養且維持存活 。這使得其生產所需蛋白質產物的時間期可延長或總期間 長過那些在初始培養溫度下或從初始溫度開始，僅更動一 次溫度下之培養。根據本發明之培養過程在培養期結束時 可有更多之存活細胞存活下來。因此，在某些實施態樣中 ，有較多細胞存活則有較多可產製所需產物的細胞。換言 之，在培養過程結束時，可累積較多量之產物’且個別細 胞產製蛋白質的速率，也就是細胞之特殊生產力’仍維持 -59- (56) 1312368 相同。（見’如：實施例4 )。如本技藝中所已知，細胞 之特殊生產力’或細胞特殊速率’通常係指每一細胞，或 每一細胞團或體積計量所產製之產物的特殊表現速率。，細 胞之特殊生產力係以每天、每一細胞所產製之蛋白質克數 來測量，如：可根據涉及下式之整合方法來測量： dP/dt = qp X,或 P = qp Ιο1 Xdt 其中q p爲細胞之特殊生產力常數；x爲細胞數或細 胞體積，或細胞團當量；dP/dt爲蛋白質產製速率。因此 ’ Qp可從產物濃度對存活細胞之時間積分的圖形取得（ Xdt —、 ”存活細胞天數”）。根據此程式，當將所產製之醣 蛋白產物的量對存活細胞天數作圖時，斜度等於細胞之特 殊速率。存活細胞可藉數種測量來測定，如：生物團、氧 氣攝取速率、乳糖脫氫酶（LDH ) '壓緊之細胞體積或濁 度。（如：授讓給 T，E t c h e v e r r y等人之 U . S .專利第 5,705,364 號）。 藉本發明之培養方法產製可溶性CTLA4分子和可溶性 CTLA4突變種分子 在本發明所包含的其它實施態樣中，使用本發明之細 胞培養方法（包括涉及二或多次溫度更動及涉及延遲加入 多陰離子性化合物這二種方法）來製造如下述說明之可溶 性 CTLA4分子或可溶性 CTLA4突變種分子。可溶性 CTLA4分子宜爲一種CTLA4融合蛋白質，以CTLA4Ig較 -60- (57) 1312368 佳。更合適的爲含有胺基酸-]至3 5 7或+ 1至3 5 7 (如第3 圖中所示）之 CTLA4Ig。最合適的爲由胺基酸-1至357 或+1至3 5 7 (如第3圖中所示）所組成之CTLA4Ig。可溶 性CTLA4突變種分子宜爲含有胺基酸-]至3 5 7或+1至 357 (如第4圖中所示）之L104EA29YIg。最合適的爲由 胺基酸-1至3 5 7或+1至3 5 7 (如第4圖中所示）所組成 者。該涉及延長蛋白質產物之生產相的二和三-步驟溫度 更動細胞培養方法特別適合用來經由培養中之可溶性 CTLA4分子和可溶性CTLA4突變種分子的宿主細胞來產 生高品質和大量之可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突 變種分子。 在一種較佳之實施態樣中，CTLA4Ig係由以重組遺傳 工程處理過之宿主細胞來產生。CTL A4 Ig融合蛋白質可由 經含有編碼CTLA4Ig之DNA序列的載體轉染過的CHO 細胞以重組方式產生。（見，授讓給P . S . L i n s 1 e y等人之 U.S.專利第5,844,〇59號，及本文之實施例2)。當根據 本發明之多-步驟溫度更動過程培養時，可產製出大量， 且經適當涎酸化之CTL A 4 Ig融合蛋白質。本發明提供產 製高水準之可回收蛋白質產物，如：涎酸化之CTLA4Ig 蛋白質產物的方法。在另一種較佳之實施態樣中，含有如 第4圖中所示之胺基酸-1至357或+ ]至357的可溶性 CTLA4突變種分子’ L104EA29YIg，係由本發明之細胞培 養方法所生產。 B7分子爲一種CTLA4之配位體。本文中所使用之” (58) 1312368 配位體”係指一明確辦認並結合另一分子之分子。分子及 其配位體的交互作用可由本發明之培養過程的產物來調節 。例如：CTLA4與其配位體B7之交互作用可經由給予 CTLA4Ig分子來阻斷。另一種實施例爲，腫瘤壞死因子（ TNF )與其配位體，TNF受體（TNFR )，之交互作用， 可經由給予伊坦塞普（etanercept)或其它TNF/TNFR阻 斷分子來阻斷。
野生型CTLA4或’’非-突變之CTLA4”具有如第5圖中 所示之天然、全長 CTLA4的胺基酸序列（其亦描述於 US.專利第 5,434,131、5,844,095 和 5,851，795 號中，其全 文倂爲本文之參考資料），或其任何可辨識及結合B 7分 子，或干擾B7分子，以阻斷B7分子結合CD28及/或 CTLA4 (如：內生性CD28及/或CTLA4 )的部分。野生 型CTLA4包含特殊部分，包括，如：第5圖中所示之從 位置+]之甲硫胺酸開始至位置+ 1 2 4之天門冬酸結束的野 生型CTLA4胞外功能區，或從位置-1之胺基丙酸開始至 位置+ 1 2 4之天門冬酸結束的野生型C TLA4胞外功能區。 天然野生型CTLA4爲一種具有N -端胞外功能區、穿 膜功能區和C-端細胞質功能區之細胞表面蛋白質。胞外 功能區結合至一標的分子，如：B 7分子。在細胞中，天 然、野生型CTLA4蛋白質係以未成熟之多肽型式（其在 胺基或N -端包括一訊號肽）來轉譯。此未成熟之多肽進 行後轉譯處理，其包括分裂及去除訊號肽，以產生 CTLA4裂解產物，此產物具有新產生之與未成熟型式中 -62- (59) 1312368 之N -端不同的N -端。本技藝中之技術熟習人士可察知可 能發生額外之後轉譯處理，其可從新產生之CTLA4裂解 產物的N-端移除一或多個胺基酸。成熟之CTLA4蛋白質 可從位置+ 1之甲硫胺酸開始，或從位置-1之胺基丙酸開 始。CTLA4分子之成熟型式包括結合至B7的胞外功能區 或其任何部分。
本文中所使用之 CTLA4突變種分子係指含有如第 5 圖中所示之野生型 CTLA4，或其任何部分或衍生物（該 野生型CTLA4序列中，宜爲在野生型CTLA4之胞外功能 區中具有一或多種突變），且結合B7分子的分子。 CTLA4突變種分子具有一與野生型CTLA4分子之序歹丨J類 似但不相等，且仍結合B 7的序列。這些突變可包括一或 多種被具有保留性（如：白胺酸取代異白胺酸）或非-保 留性（如：色胺酸取代甘胺酸）構造或化學性質之胺基酸 取代的胺基酸殘質，胺基酸缺失、加入，移碼突變，或截 斷。 CTLA4突變種分子可包括在其中或附著於其上之非· CTLA4分子，也就是CTLA4突變種融合蛋白質。突變種 分子可爲可溶的（也就是流通的），或者其可結合接至細 胞表面（經膜結合的）。CTLA4 突變種分子包括 LI 04EA29YIg及那些描述於下歹IJ文獻中者：U.S.專利申請 序號第 09/865,32〗，60/214，065 及 60/287，576 號；W0 01/92337 A2;U.S.專利第 6,090,9]4、5，844,095 號和第 5,7 7 3:2 5 3 號；及 R.J. Peach et a]·，1 994, J Exp Med， -63- (60) 1312368 180·2(Μ9-2058中所描述者。CTLA4突變種分子可以合成 或重組方式產生。 CTLA4Ig爲一種聯結—免疫球蛋白（Ig )分子，或其 部分之可溶性融合蛋白質，其含有結合b 7之野生型 CTLA4的胞外功能區或其部分。CTLA4之胞外功能區或 其部分係聯結一含有免疫球蛋白分子之全部或部分的Ϊ g 部分’宜爲免疫球蛋白恆定區之全部或部分，如：全部或 部分之 IgC7 ]、IgCr 2、IgCr 3、IgC7 4、IgCp、IgCal 、IgCa2、IgCS或IgCe’以使融合分子成爲可溶。Ig部分 可包括前述恆定區或其它恆定區之絞鏈區、CH2和CH3 功能區’或C Η 1、絞鏈區、C Η 2和C Η 3功能區。較合適 的爲’ Ig部分爲人類或猴子，且含有絞鏈區' CH2和 CH3功能區。最合適的爲該ig部分含有人類IgCYl之絞 鏈區、CH2和CH3功能區，或由人類IgC r 1之絞鏈區、 C Η 2和C Η 3功能區所組成。在c T L A 4 I g之I g部分中，I g 恆定區或其部分可發生突變，以使其效應子之功能降低（ 見’如：U.S.專利第 5,637,481 ' 5,844，095 和 5,434,131 號）。本文所使用之Ig部分、Ig恆定區、IgC(恆定）功能 區、igCj 1、I g C 7 2 ' IgC?- 3 ' I g C 4 ' IgC//、IgCal 、IgC a: 2、IgC ό或IgC ε等名詞包括天然序列及已突變 之序列二種，如：在恆定區中具有降低效應子功能之突變 的序列。 一種與CTLΑ4相關之特殊實施態樣係包含從位置+ ] 之甲硫胺酸開始至位置+] 2 4之天門冬酸結束，或從位置 (61) 1312368
-]之胺基丙酸開始至位置+〗2 4之天門冬酸的野生型 CTLA4胞外功能區；一在位置+】25處之接合胺基酸殘質 麩醯胺；及一包含從位置+】2 6之麩胺酸開始至在位置 + 3 5 7之賴胺酸的免疫球蛋白部分，如第3圖中所示。編 碼此CTLA4Ig之DNA於1991年5日31日存放於美國類 型培養收集處（ATCC)(大學大道10801號，維吉尼亞 州馬那沙市20110-22 09 )，其受布達佩斯條約之監督， 且已給予 ATCC 編號 ATCC68629; P. Linsley et al.，1994, Immunity 1:793-80。一種表現 CTLA4Ig 之 CHO 細胞株於 1991年5月31日存放於ATCC，確認號碼CRL-10762。 根據此處所描述之方法所產製之可溶性CTLA4Ig分子可 能包括或不包括一訊號（領導）肽序列。第3和4圖包括 訊號（領導）肽序列之解說。通常，該種分子並不包括訊 號狀序列。
L104EA29YIg係一種爲可溶性CTLA4突變種分子的 融合蛋白質，此突變種分子包含一帶有連結至Ig尾端之 胺基酸變化A29Y (酪胺酸胺基酸殘質取代在位置29之胺 基丙酸）和 L 1 04E (麩胺酸胺基酸殘質取代在位置+ 1 04 之白胺酸）的野生型C T L A 4胞外功能區。第4圖說明 Ll04EA29YIg。L104EA29YIg之胺基酸序歹U包含如第4圖 所示之從胺基酸位置-1的胺基丙酸至在胺基酸位置+3 5 7 的賴胺酸。或者，L 1 0 4 E A 2 9 Y I g之胺基酸序列包含如第4 圖所示之從胺基酸位置+ 1的甲硫胺酸至胺基酸位置+ 3 5 7 的賴胺酸。L104EA29YIg包含一在位置+125處之接合胺 -65 - (62) 1312368 基酸殘質麩醯胺；及一包含從位置+]26之麩胺酸開始至 在位置+ 357之賴胺酸的Ig部分。編碼Li〇4EA29YIg之 DNA於2000年6日20日存放於美國類型培養收集處（ ATCC)(大學大道10801號，維吉尼亞州馬那沙市 2 2 0 1 1 0 - 2 2 0 9 )’受布達佩斯條約之監督，且已給予a T C C 編號PTA-2104。L104EA29YIg描述於共同申請之U.S.專 利申請案序號第 09/579,927、 60/287,576 和 60/214,065 號 ，及WO/01/923337 A2號中，其全文倂爲本文之參考資 料。藉本發明之培養方法所產製之可溶性L 1 0 4 E A 2 9 YI g 分子可能包括或不包括訊號（領導）肽序列。通常，根據 本發明所產製之分子並不包括訊號肽序列。 此處所使用之可溶一詞係指任何未結合或附著至細胞 (也就是流動的）之分子或其片段。例如：CTLA4、B7 或 CD28可分別經由將Ig部分附著至 CTLA4、B7或 CD28之胞外功能區而成爲可溶。或者，如CTLA4這類分 子可經由去除其穿膜功能區而成爲可溶。通常，根據本發 明所產製之可溶分子並不包括訊號（或領導）肽序列。 可溶性C TLA4分子係指一種含有結合B7之野生型 CTLA4或其任何部分或衍生物的非-細胞·表面-結合（也 就是流動的）分子，包括但不限於：可溶性CTLA4融合 蛋白質；其中C T L A 4之胞外功能區係融合至一可使該融 合分子成爲可溶之1g部分的可溶性CTLA4融合蛋白質’ 如：CTLA4Ig融合蛋白質（如：ATCC 68 629 ) ’而該Ig 部分爲免疫球蛋白分子之全部或部分’宜爲免疫球蛋白恒 -66 - (63) 1312368 定區之全部或部分，如：全部或部分之I g c 7 ]、I g c 7 2 、：IgCr3、lgCr4、IgC// 、IgCal、Igca2、IgC(5 或
IgC £ ;其中該胞外功能區係融合至或與—生物活性或化 學活性蛋白質結合之可溶性C T L A 4融合蛋白質，該生物 活性或化學活性蛋白質爲，如：U . S .專利第5，8 4 4，0 9 5號 (其全文倂爲此處之參考資料）中所描述之乳頭瘤病毒 E7基因產物（CTLA4-E7)、黑色瘤-相關之抗原p97( CTLA4-p97 )或 HIV e η v 蛋白質（C T L A 4 - e n v gp 120)； 雜交種（嵌合的）融合蛋白質，如：U. S.專利第 5,434,131號（其全文倂爲此處之參考資料）中所描述之 CD28/CTLA4Ig ；其穿膜功能區被去除，以使蛋白質成爲 可溶之 CTLA4 分子（見，如：M.K. Oaks et al·，2000, Cellular Immunology, 201:144-153，其全文倂爲此處之參 考資料）；可溶性CTLA4突變種分子L104EA29YIg。 可溶性CTLA4分子亦可爲可溶性CTLA4突變種分子 。根據本發明產生之可溶性CTLA4分子可包括或不包括 訊號（領導）肽序列。訊號肽可爲任何能使分子分泌之序 列，包括：來自抑制瘤素 Μ之訊號肽（Malik et al.， 1989， Mo]ec. Cell. Biol·， 9:2 84 7-2853)，或 CD5 (Ν·Η· Jones et a]., 1986, Nature，323:346-349)，或來自任何胞 外蛋白質之訊號肽。經由本發明之培養過程所產生之可溶 性CTLA4分子可包括連接在CTLA4之胞外功能區N-端的 制瘤素Μ之訊號肽。通常，在本發明中，該分子並不包 括訊號肽序列。 -67- (64) 1312368 此處所使用之CTLA4融合蛋白質係指一種含有結合 B7之野生型CTLA4或其部分的胞外功能區的分子’其融 合至可使CTLA4分子成爲可溶之非-CTLA4部分，如：ig 部分。例如：CTLA4融合蛋白質可包括融合至全部或部 分Ig恆定區的CTLA4胞外功能區。可融合至CTLA4之 I g恆定區（或其部分）的實例包括但不限於本文上述中 所有列出者。CTLA4融合蛋白質亦可爲CTLA4突變種分 -〇 此處所使用之"非-CTLA4部分"係指不會結合CD80 及/或CD 86，且不會干擾CTLA4結合至其配位體的分子 或其部分。實例包括’但不限於：爲I g分子之全部或一 部分的Ig部分，生物活性或化學活性蛋白質的一部分， 如.乳頭瘤病毒E7基因產物（CTLA4_E7)、黑色瘤·相 關之 ί几原 p97(CTLA4-P97)或 HIV env 蛋白質（CTLA4-env gp 120)(如：u.s•序號第5,84 4,〇95號，其全文併 爲此處之參考資料）。Ig部分之實例包括免疫球蛋白恒 疋功能區之全部或部分，如：全部或部分之^ 、
IgCy 2、IgCy 3、IgC^- igC /z 、IgC a
IgC a 2 ' igC δ 或 Igc
Ig部分可包括前述恆定區或其它恆定區 之絞鏈區、CH2和CH3功能區， 和CH3功能區。較合適的爲， 包括絞鏈區、CH2和CH3功能區 包括人類I g c r 1之絞鏈區 或CH1、絞鏈區、CH2 部分爲人類或猴子，且 。最合適的爲該Ig部分 CH2和CH3功能區’或爲人 類IgC r 1之絞鏈區' CH2和 C Η 3功能區。在一
Ig部分 -68- (65) 1312368 中，I g恆定區或其部分可發生突變，以使其效應子之功 能降低（見’如：U · S .專利第5,6 3 7，4 8 ]、5，8 4 4，0 9 5和 5，4 3 4，1 3 1 號）。 C T L A 4之胞外功能區係指可辨識及結合B 7之野生型 CTLA4的任何部分。例如：CTLA4之胞外功能區包含從 位置+ 1之甲硫胺酸開始至位置+] 2 4之天門冬酸（第5圖 )。例如：C T L A 4之胞外功能區包含從位置—1之胺基丙 酸至位置+124之天門冬酸（第5圖）。 此處所使用之突變一詞係指在野生型分子之核苷酸或 胺基酸序列中的變化，例如：在野生型CTLA4胞外功能 區之DNA及/或胺基酸序列中的變化。在DNA中之突變 可能改變一密碼子而導致所編碼之胺基酸序列改變。DNA 之改變可能包括：取代 '缺失、插入、替換之DNA剪接 或截斷。胺基酸改變可能包括取代、缺失、插入、加入、 截斷，或蛋白質之處理或裂解錯誤。或者，如本技藝中所 熟知’核苷酸序列中之突變可造成胺基酸序列中之無表型 突變。本技藝中亦知，某些核苷酸密碼子編碼相同之胺基 酸。其實例包括：編碼精胺酸（R )之核苷酸密碼子CGU 、CGG、CGC和CGA ;或編碼天門冬酸（D )之密碼子 GAU 和 GAC。 因此，一種蛋白質可由一或多種核酸分子編碼，這些 核酸分子之特異核苷酸序列不同，但仍編碼具相等序列之 蛋白質分子。突變種分子可具有一，或超過一種突變。作 爲指導之用，胺基酸編碼序列如下： -69 - (66) 1312368
胺基酸 符號 單字母 符號 密碼子 胺基丙酸 A 1 a A GCU,GCC,GCA,GCG 半胱胺酸 C y s C UGU,UGC 天門冬酸 Asp D G AU，GAC 麸胺酸 Glu E G A A，G A G 苯胺基丙酸 Phe F uuu,uuc 甘胺酸 Gly G GGU,GGC,GGA，GGG 組胺酸 His H C AU，CAC 異白胺酸 lie I AUU, AUC,AUA 賴胺酸 Ly s K AAA , A AG 白胺酸 Leu L UUA,UUG,CUU,CUC,CUA,CUG 甲硫胺酸 Met M AUG 天門冬素 A s n N A AU, AAC 脯胺酸 Pro P CCU，CCC，CCA,CCG 麩醯胺 Gin Q C AA,CAG 精胺酸 Arg R CGU,CGC,CGA，CGG,AGA,AGG 絲胺酸 S er S UCU^CC^CA^CG^GU.AGC 蘇胺酸 Thr T ACU:ACCSACA,ACG 纈胺酸 Val V GUU,GUC,GUA,GUG 色胺酸 Trp w UGG 酪胺酸 Tyr Y U AU，UAC
此處所使用之片段或部分一詞係指分子之任何部分或 -70- (67) 1312368 節段。在CTLA4或CD28方面，片段或部分宜爲可辨識 及結合B 7 ’或干擾B 7 ’以阻擋其結合至c D 2 8及/或 CTLA4之CTLA4或CD28’或其部分或節段的胞外功能區 。再者，此處所使用之”相對應”係指分享序列之同等性。 此處所使用之B 7 —詞係指分子之B 7族的任何成員 ，包括但不限於：可辨識及結合CTLA4及/或CD28之 B7- 1 ( CD80 ) ( Freeman et a]., 1989, J. Immunol.,
143:2714-2722，其全文倂爲此處之參考資料）、B7-2 ( CD 8 6 ) ( Freeman et al·，1 993，Science，262:909-9 1 1，其 全文併爲此處之梦考資料；Azum a et al.，1993, Nature, 366:76-79，其全文倂爲此處之參考資料）。如US.專利序 號第5,5 8 0,75 6和5,5 2 1,28 8號（其全文倂爲本文之參考 資料）中所描述者，CD28係指可辨識及結合B7之分子 。如此處所使用者，B 7 -陽性細胞包括任何帶有一或多種 ，表現在細胞表面上之B 7分子類型的細胞。
此處所使用之'’衍生物’'係指一種與其母分子分享序列 相似性及活性的分子。例如：CTLA4之衍生物包括一種 可溶性CTLA4分子，其胺基酸序列與野生型CTLA4之胞 外功能區至少有70%之相似性，且其可辨識並結合B7， 如：CTLA4Ig 或可溶性 CTLA4 突變種分子， Ll(HEA29YIg。衍生物意指胺基酸序列及/或胺基酸之化 學性質的任何變化，如：胺基酸同系物。 此處所使用之調節免疫反應一詞係指活化、刺激' 正-調節、抑制、阻斷、減少、減弱、負-調節或修改免疫 -71 - (68) 1312368 反應。多種疾病’如：自體免疫疾病，可經由調節免疫反 應來治療’如：調節功能性C T L A 4 -及/或C D - 2 8陽性細 胞與B 7 -陽性細胞之交互作用。例如：調節免疫反應的方 法包含將B7-陽性細胞與可溶性CTLa4分子（如：那些 根據本發明製備者）接觸’以形成可溶性CTLA4/B7複合 物’其中該可溶性CTLA4分子會干擾內生性ctlA4及/ 或C D 2 8分子與B 7 -分子之反應。此處所指之”阻斷”或’’抑 制”受體、訊號或分子意指干擾受體、訊號或分子之活化 (此係藉本技藝中所認知之試驗來偵察）。阻斷或抑制可 爲部分或全面。 此處所使用之”阻斷B 7交互作用”係指干擾b 7結合至 其配位體’如：CD28及/或CTLA4，以藉此妨礙T-細胞 和B 7 -陽性細胞交互作用。阻斷b 7交互作用之試劑的實 例包括’但不限於：分子’如一種可辨識及結合CTLA4 、CD28或B7 -分子（如：B7-1，B7-2)中之任一項的抗 體（或其部分）；這些分子之可溶型（或其部分），如： 可溶性CTLA4 ;經過設計以透過CTLA4/CD28/B7-傳介之 交互作用干擾細胞訊號的肽片段或其它小分子。在一種較 佳之實施態樣中，阻斷劑爲一種可溶性CTLA4分子，如 :CTLA4Ig ( ATCC 6 8 629 )或 L 1 0 4 E A 2 9 YI g ( A T C C P T A-2104);可溶性 CD28 分子，如：CD28Ig(ATCC 68628 );可溶性 B7 分子，如：B7-Ig(ATCC 68627);抗-B7 單株抗體（如：ATCC HB-2 5 3 > ATCC CRL-222 3，ATCC CRL-2226 > ATCC HB-301， ATCC HB-1 1 341 和如 U.S.專 (69) 1312368 利第 6，] 1 3，8 9 8 號或 γ 〇 k o c h i 等人，]9 8 2 : J . i m m u n 〇 1.， 1 2 8 (2 ):8 2 3 - 8 2 7中所描述之單株抗體）；抗_CTLA4單株 抗體（如：ATCC HB-304，和參考資料82-83中所描述之 單株抗體）；及/或抗-CD28單株抗體（如：如Hansen et a 1., 1 9 8 0, Iramunogenetics, 1 0:247-260 ,或 Martin et al_，1984，J· Clin. Immunol.，4(1):18-22 中所描述之 ATCC HB-11944 ’和Mab9.3)。阻斷B7之交互作用可經由本技 藝中所認知之試驗來偵測，如：經由測定T-細胞/B 7-細胞 間之交互作用減少，或經由測定B7與CTLA4/CD28間之 交互作用減少來測定與免疫疾病（如：類風濕性疾病）相 關之症狀的減少情形。阻斷可爲部分或全面。 如此處所使用之分子有效量係指能阻斷分子與其配位 體間之交互作用的量。例如：可阻斷B7與CTLA4及/或 CD28間之交互作用的分子有效量爲當分子結合至在B7-陽性細胞上之B 7分子時，可抑制B 7分子不與內生性配 位體（如：CTLA4和CD28 )結合的分子量。或者，阻斷 B7與CTLA4及/或CD28間之交互作用的分子有效量爲 當分子結合至在T細胞上之CTLA4及/或CD28時，可 抑制B7分子不與內生性配位體（如：CTLA4和CD28 ) 結合的分子量。抑制或阻斷可爲部分或全面。 在臨床實驗計劃方面，較合適的爲，融合蛋白質，如 :CTLA4 Ig或突變種CTLA4Ig，之Ig部分不會誘出個體 內之有害的免疫反應。較佳之部分爲Ig恆定區（包括人 類或非-人類靈長類Ig恆定區）的全部或一部分。合適之 -73- (70) 1312368 ig 區的實例包括 igCr ]、igc72、igCr3、igCr4、 IgC// ' igCal、IgCa2、lgC(5 或 igCe ，包括涉及效應 子功能之絞鏈區、C Η 2和C Η 3功能區，或c Η 1、絞鏈區 、CH2和CH3功能區’這些效應子功能有，如：結合至 Fc受體、補體-倚賴性細胞毒性（CDC )，或抗體-倚賴性 細胞-傳介之細胞毒性（ADCC ) 。Ig部分中可具有一或多 種突變（如：在CH2功能區中，以減少效應子功能，如 .c D C或A D C C ) ’其中突變係經由增加或降低I g結合 至Fc受體的能力來調節Ig結合其配位體的能力^例如： 在Ig部分中之突變可包括在其絞鏈區中之半胱胺酸殘質 內之任何或全部變化。例如：如第3圖中所示，在位置 + 1 3 0、+ 1 3 6、和+ 1 3 9之半胱胺酸被絲胺酸所取代。如第 3圖中所示’ I g部分亦可包括在位置+1 4 8被絲胺酸所取 代之脯胺酸。再者，在Ig部分中之突變可包括在位置 + 144之白胺酸被苯基胺基丙酸所取代；在位置+145之白 胺酸被麩胺酸所取代·，或在位置+〗4 7之甘胺酸被胺基丙 酸所取代。 【實施方式】 下列實施例舉出本發明之特殊觀點，以說明本發明， 並對本技藝中之技術熟習人士提供本發明方法之說明。這 些實施例不應用來限制本發明，因其僅提供特殊方法學及 例證，以用來了解及實行本發明及其不同觀點。 下列實施例1 -4描述關於在培養操作過程中涉及溫度 -74- (71) 1312368 更動之細胞培養過程的實驗。實施例6 - U描述關於渉及 將多陰離子性化合物延遲加入培養中之細胞培養過程的實 驗。 實施例1 此實施例提供在本發明之過程中用來培養可產製如本 文中實施例1 2 3-4中所描述之示範性CTLAUg融合蛋白質 的重組細胞的物質及試劑。 1 .細胞培養介質 2 用於細胞接種代之所有相’及養育在生物反應器（包 括5升（5L)及5〇升（5〇L)之生產反應器）中之培養 3 的基礎細胞培養介質爲如表1中所示範之CD-CHO修正介 4
質’其含有麩醯胺 '碳酸氫鈉、胰島素和胺基甲基葉酸（ 因維特金公司’加卅卡斯貝市）。以1N HC1將介質之pH 5 値調整爲7 . 〇。 (72) 1312368 表] 改良之CD-CHO 介質成分 濃度 C D - C Η 0 2 5 X 酸類 I (因維特金，加州卡斯貝市） 4 0毫升/升 CD-CHO 25χ 酸類 Π (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25χ 鹽類 I (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 CD-CHO 25x 鹽類 Π (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 L -魅胺 (因維特金） 0.5 8 5克/升 7〃 -人類胰島素 (10毫克/毫升） (因維特金） 0.1毫升/升 胺基甲基葉酸 (2 0 m Μ溶液） (ICN，加州卡塔梅莎市） 5微升/升 碳酸氫鈉 (馬蘭克洛貝可公司（Mallenkrodt Baker )，紐澤西州菲利浦柏格市） 2.22克/升 在分批餵養過程中係使用如表2中所示之含下列物質 -76- (73) 1312368 的修正之餵養介質，也就是eRDF-Ι介質（因維特金公司 )來餵養細胞：葡萄糖、麩醯胺、胰島素和TC酵母酸化 物（TC Yeastolate)(貝通-迪金生公司，紐澤西卅富蘭 克林湖市）。加入所有成分後，以]N 之pH値調整爲7.0。 表2 N a 0 Η將餵養介質 改良之eRDF介質成分 濃度 eRDF-I (因維特金，加州卡斯貝市） 16.8克/升 右旋糖 (VWR-馬蘭克洛貝可公司） 3 0.94克/升 L-麩胺 (因維特金） 4.1克/升 r -人類胰島素 (1〇毫克/毫升） (因維特金） 1毫升/升 TC酵母酸化物 (貝通迪金生公司， 紐澤西州富蘭克林湖市） 5克/升
2.在生物反應器中之生產相 生產之生物反應器先以分批反應器之型式操作’操作 時密切監測及控制溫度、壓力、pH和溶解之氧濃度。經 由測量存活細胞密度及數種關鍵代謝物之濃度來評估培養 -77- (74) 1312368 情況。餵養過程係在接種後一天開始。剩餘之醱酵過程係 以分批-餵養模式進行。 使用5升規模（具有一個海水推進器的玻璃反應器） 及5 0升規模（具有二個海水推進器的不鍵鋼反應器）之 生物反應器。（見實施例2 )。在整個操作過程中，以資 料取得系統（因特迅固定32 (Intelltion Fix 32))記錄 溫度、p Η和溶解之氧（D 0 )。經由轉子流速計來控制氣 流。經由一浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入 反應器中’並通過反應器頭部空間排出C 0 2。氧分子係透 過相同之玻璃料引入，以用來控制D 0。C 0 2係透過相同 之玻璃料引入’以用來控制ρ Η。 3.餵養策略 接種後2 4小時，若葡萄糖濃度> 3 〇克/升，則在反 應器中加入每日最低量之修正的eRDF-Ι餵養介質此爲1% 培養容積。在其中葡萄糖濃度. 〇克/升之情況中，計算 每曰之大九劑餵料的體積，以使葡萄糖濃度回升至3.0克 /升。將每日鎖養量記錄在分批工作單上。 4 .採樣 以每曰爲基準，從反應器中移出細胞樣本。以錐蟲藍 (史格馬公司’密蘇里州聖路易市）將用於細胞計數之樣 本染色。利用顯微鏡，經由血球細胞計算器來計算細胞並 測定細胞存活力。在代謝物分析方面，將另外之樣本在 -78 - (75) 1312368 2 OOOrpm ( 41 )下離心20分鐘，以分離出細胞。對上淸 液分析下列變數：滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物、 魅醯胺、魅胺酸化物' pH、p〇2' pC02'氨及隨意地加上 乳酸脫氫酶（LDH )。將其它備用樣本冷凍在-20°C。 實施例2 本實施例描述從培養之CHO細胞產製CTLA4Ig (如 第3圖中所示之-1至357或+1至357)(編碼DNA以 ATCC 6 8 629之編號存放）的方法。 本實施例亦描述用於產製高產量和高品質之CTLA4Ig 蛋白質的本發明方法，此方法涉及具有二-或三-步驟溫度 更動，且總操作時間爲1 4、2 1或2 8 - 3 0天的培養操作過 程。一次溫度更動（T-更動）係在第6天（對數生長相結 束時）’從37°C降至34°C，而第二次T-更動係在第1〇 天，從3 4 °C降至3 2 °C。該操作過程在第1 4天、第21天 或第28天結束，而在二-步驟更動方面，溫度從第1〇天 之更動開始，直到操作過程結束皆控制在3 2 °C。在三-步· 驟溫度更動方面，溫度從該次更動的那天開始，直到操作 過程結束皆控制在3 0°C。與一次溫度更動或無溫度更動 之操作過程相較下，所描述之過程可增加蛋白質產物之終 點滴定濃度、增加最終細胞存活力及容量生產力。根據ψ 發明，第二和第三次T_更動可將標準醱酵（培養）過程 之操作時間延長至二至三週（或更久），但仍維持高細胞 存活力。在整個產製期間可觀察到產物滴定濃度接近，線性 -79- (76) 1312368 增力口。
將用於表現CTLA4Ig之CHO細胞利用T-75燒瓶（ 康寧公司，紐約州康寧市），及2 5 0和5 0 0毫升旋轉燒瓶 (貝可公司，紐澤西州維尼蘭市）在含下列物質之修正的 CD-CHO介質中增殖：麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島素和胺基 甲基葉酸（見實施例1 )。將T-燒瓶，及旋轉燒瓶在37 °C、6%C02中培養。產生足夠接種量後，將培養轉移至分 別具有3升或30升操作容積之含上述介質的5升生物反 應器（艾普利康公司，加州佛斯特市）或5 0升生物反應 器（非米爾公司，紐約州西若可斯市）中。初始接種密度 爲約2x1 05存活細胞/毫升。
5升容器爲配備一個海水推進器的玻璃反應器（艾普 利康公司，加州佛斯特市）；5 0升容器爲一配備二個海 水推進器的不銹鋼反應器（非米爾公司，紐約州西若可斯 市）。在整個操作過程中，以利用因特迅固定3 2之資料 取得系統（因特迅公司，麻州佛斯布洛市）記錄溫度、 P Η和溶解之氧（D Ο )。經由轉子流速計（蔻帕馬公司（ Cole Prmer)，伊利諾州維儂丘市）來控制氣流。經由一 被浸沒之玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中 ’並通過反應器頭部空間排出C02。氧分子係透過相同之 玻璃料引入，以用來控制DO。C02係透過相同之玻璃料 引入，以用來控制高側P Η。經由加入1 N N a 0 Η來控制低 側ρ Η。不作爲限制用，可接受之ρ Η値範圍爲6 - 9，宜爲 6·8-7.2，而克分子滲透壓濃度方面爲2 00 - 5 00mOsm，較 -80- (77) 1312368 合適的爲2 8 Ο - 3 4 0 m 0 s m。 利用如實施例1、表2中所描述之含葡萄糖、麩醯胺 、胰島素、TC酵母酸化物（貝通迪金生公司）的修正的 eRDF介質（因維特金公司），依下述每日以大丸劑銀料 餵養反應器中之培養：在接種後第1天，加入]%培養容 積之最低量作爲餵養介質；葡萄糖濃度低於3克/升時， 則加入一計算過之容積，以使葡萄糖濃度回升至3.0克/ 升。 · 5升規模之醱酵過程期間爲2 1天，5 0升規模者爲2 8 天。5 0升規模之培養操作期較長與該操作過程所加之溫 度更動有關。以每日爲基準，從反應器中取出樣本以進行 分析。例如：以錐蟲藍（史格馬公司，密蘇里州聖路易市 )將用於細胞計數之樣本染色。利用血球細胞計算器來計 算細胞’並測定細胞存活力，在顯微鏡下計算存活之染色 細胞。在代謝物分析方面，將另外之樣本份在2〇〇〇rpm ( 4 C )下離心2 0分鐘，以將細胞沈澱成小九。利用本技藝 0 中傳統使用之技術和實驗計劃對上淸液分析下列變數：蛋 白質滴定濃度、涎酸、葡萄糖、乳酸化物、麩醯胺、麩胺 酸化物、pH、p〇2、pc〇2、氨及 LDH。 實施例3 此實施例描述及呈現比較性評估，以評定不同培養程 序’包括根據本發明進行之多步驟培養方法。醣蛋白產物 之取於滴疋濃度（以克/升計）係以蛋白質之最終滴定濃 -81 - (78) 1312368 度诞酸含量’操作過程結束時之細胞存活力（最終細胞存 活力）及操作過程結束時之細胞密度（存活之終點細胞密 度）來測定。 實驗 I - A、I - B 和 I - C ; 11 - A、Π - B 和 11* C ;及 UI - A ' HI - B和HI · C係指在不同時間評估之具相同溫度更動略圖 的相同細胞培養操作過程，也就是，在I _ A、11 - A及m - A 方面’產物和細胞變數係在1 4天後評估，在I · b、11 - B 及III- B方面’產物和細胞變數係在2 ；[天後評估，而在丨_ φ C、11 - C及III - C方面，產物和細胞變數係在2 8天後評估 。這些實驗係在一 5升生物反應器中進行，其中之培養條 件控制如下：pH爲7.0;溶解之氧爲40%;在60rpm攪動 ;而起始溫度爲3 7 °C。這些資料係從根據本發明之分批-餵養的細胞培養醱酵反應中取得。 實驗I、π和m之設計如下： 實驗I :從第〇天至第21天，細胞培養之溫度係控 制在3 7。(：（無溫度更動）。 Φ 實驗n :從第〇天至第6天，細胞培養之溫度係控制 在3 7 °C ;而從第6天至第21天，則在34 °c (—次溫度更 動）。 實驗m :從第〇天至第6天，細胞培養之溫度係控制 在37°C;從第6天至第1〇天，在34 °C;而從第10天至 第2 1天’則在32°C (本發明之二步驟溫度更動程序）。 實驗IV-A和V-A顯示在具初始（標準）生產相之14 天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞 -82- (79) 1312368 存活力及存活之終點細胞密度的結果；實驗IV-B和V-B 顯示具延長之生產相的2 1天培養操作過程結束時所評估 的這些結果；實驗IV-C和V-C顯示具第二次延長之生 產相的2 8天培養操作過程結束時所評估的結果。實驗IV 和V係在一 5 0升生物反應器中進行’其中之培養條件控 制如下：ρ Η爲7.0 ;溶解之氧爲4 0 % ;在3 0 r p m攪動；而 起始溫度爲3 7 °C。
實驗IV和V之設計如下： 實驗IV :從第0天至第6天，細胞培養之溫度係控 制在3 71 ;從第6天至第1 0天，在3 4 °C ;而從第1 0天 至第2 8天，則在3 2 °C (本發明之二步驟溫度更動程序）。
實驗V :從第0天至第6天，細胞培養之溫度係控制 在37 °C ;從第6天至第10天，在34 °C ;從第10天至第 14天，在32 °C ;從第14天至第28天’則在30 °C (本發 明之三-步驟溫度更動程序）。實驗V-A、V-B和V-C係 指在不同時間評估之具相同溫度更動略圖的相同細胞培養 操作過程，也就是，在V-A方面，產物和細胞變數係在 I4天後評估，在V-B方面，在21天後評估，而在V-C方 面，則在2 8天後評估。 實驗I-V代表如上述之5種不同培養操作過程。如上 述，14天之操作過程定名爲"A"，21天之操作過程定名爲 ” B ”，而2 8天之操作過程定名爲” C "。 表3呈現之實驗結果證明不同溫度更動略圖對5升反 應器規模之培養中的細胞產製CTLA4lg之能力的影響。 -83 - 1312368 存活之終點 細胞密度 (χΙΟ6細胞/毫升） 最終細胞 存活力 (%) 終點滴定濃度 *終點SA (NANA) 終點SA (NANA*) (莫耳比例） 難 Co' 谭色—— is Mm 窣 {in 終點滴定 (克/升） 溫度更動 反應器 規模 (升） 實驗 #
oo VO CN OO m 10.5 17.5 rn 卜· K O 1-- OO p _H V· < m 0.73 1.30 2.30 37"C(〇-14 天） _無T-更動- 37〇C(〇-6 天） 34°C(6-14 天） -單步驟T-更動- 37°C(〇-6 天） 34°C(6-10 天） 32°C(l〇-14 天） -二步驟T-更動- »·〇 < Λ II-A III-A cn 对· ο 卜 宕 〇〇 CN \〇 〇6 14.3 22.8 \ό r~) un 〇〇 卜 i 1 〇 C^) 480 1.30 2.70 3.50 ! H<爸 ^ Μ s A PS 卜 *TD' m 37〇C(〇-6 天） 34°C(6-21 天） -單步驟T-更動- 37°C(〇-6 天） 34°C(6-10 天） 32〇C( 10-21 天） -二步驟T-更動- m cq Dp h-H III-B * 。VMVH 511觀l-Nl^l^gll«iag^15ep-VKVM?i'(vs)ISM-^£Isfs-N-w:寧M) ：VNVN:: _ -r—--_--_-----——----ί.
-84 - (81) 1312368 表4呈現證明不同溫度更動略圖對在5 0升反應器規 模中之細胞產製CTLA4Ig之能力的影響的結果。
-85 - (82)1312368 表4 實驗 反應器 溫度更動 最終滴定 最終細胞 存活之終點 # 規模 濃度 存活力 細胞密度 [升] (克/升） (%) (χ1〇ό細胞/毫升） 在具初始（標準）生產相之Μ天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終 細胞存活力及存活之終點細胞密度 IV-A 50 37〇C(〇-6 天)； 34。。(6-10 天)； 32°C(l〇-14 天） -二步驟T-更動- 1.4 95 5.5 V-A 50 37〇C(〇-6 天)； 34。。(6-10 天)； 32°C(l〇-14 天)； 30°C(14-21 天） -三步驟T-更動· 1.4 91 5.4
在具延長之生產相的21天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終細胞存 活力及存活之終點細胞密度 IV-B 50 37〇C(〇-6 天)； 34°C(6-10 天)； 32°C (10-21 天） -—步驟T-更動- 2.5 67 2.5 V-B 50 37。(：(〇-6 天)； 34°C(6-10 天)； 32°C(l〇-14 天)； 及 30°C(14-21 天） -三步驟T-更動- 2.6 82 3.2
在具進一步延長之生產相的28天培養操作過程結束時所評估之產物滴定濃度、最終 細胞存活力及存活之終點細胞密度 IV-C 50 37t(〇-6 天)； 34t(6-10 天)； 32°C (10-28 天） -一步驟T-更動- 2.8 47 1.1 V-C 50 3TC(〇-6 天)； 34°C(6-10 天)； 32°C(l〇-14 天)； 30°C(14-28 天） -三步驟T-更動- 3.1 69 1.4 -86- (83) 1312368 從本實施例中之實驗已證明多-步驟溫度更動略圖可 在整個培養過程維持高細胞存活力。具體地說，在表3中 ’貫驗m-B顯示出在整個21天之培養過程（包括延長之 生產相）中使用定時之二步驟溫度更動略圖可維持高細胞 存活力（亦見第1圖）’讓滴定濃度在6.5[莫耳比]之高 诞酸含量時達到3.5克/升。二-步驟培養程序之成功亦 可從"終點滴定濃度X終點涎酸，，之高數學乘積値得到證明 〇 對照下’無溫度更動之培養過程（表3，實施例Ι_Β )導致細胞存活力早期衰退。再者，與根據本發明之二步 驟溫度更動略圖和過程相較下，使用單一-步驟之溫度更 動（表3 ’實施例Π - Β )會產生較低之最終滴定濃度 '終 點涎酸和（”終點滴定濃度X終點涎酸數學乘積値。 另外’表4中所呈現之涉及在5 〇升反應器規模中進 行的細胞培養的結果證明本發明之多步驟溫度更動培養技 術的優點。第三次溫度更動至3 0 t：係定時在第1 4天進行 。尤其是，與二次溫度更動相比下，利用三次更動所進行 之三次溫度更動對細胞存活力和最終滴定濃度的益處是可 見的（表4，實驗V-C;亦見第2圖）。根據本發明，與 無或一次更動之方法相比下，三次溫度更動可進一步延長 細胞存活力，及蛋白質生產。由於規模-放大效應（此常 見於細胞培養中），在5 0升反應器規模中產生滴定濃度 的速度較5升規模中者稍慢。然而，吾人可很容易地察知 :這類作用不會損害由本發明所提供之二或多次溫度更動 -87- (84) 1312368 培養操作的優點。 從實施例3中所呈現之結果證明，與無溫度更動之對 照操作過程相比下，那些其中在第6天（也就是在指數生 長相結束時）進行溫度更動之操作過程可取得較佳之最終 滴定濃度和細胞存活力。從這些結果可觀察到，經由使用 一次溫度更動可使容積生產力增加二倍。第10天進行之 第二次溫度更動可產生較高之細胞存活力，並進一步增加 容積生產力（與無T-更動之操作過程相比下，約爲其3 倍），而經由測定醣蛋白產物之涎酸含量可知產物仍可維 持闻品質 ° 實施例4 本實施例呈現之資料顯示出：根據本發明之包含二次 向下溫度更動的細胞培養過程對每單位時間每細胞所產製 之蛋白質（如：在本實施例中爲CTLA4Ig )量並無統計上 有意義的效果。根據本發明新呈現之細胞培養（醱酵）方 法，在本過程中之蛋白質的全部產量爲有較多細胞存活至 過程結束所得的結果。由於有更多細胞在延長之生產時間 存活，因此在過程結束時有較多細胞可存活著生產所需蛋 白質。換言之，可在過程或培養操作結束時產生較多量之 所需蛋白質。 表5說明在本發明所包含之過程的不同時間中的細胞 特異生產力。細胞特異生產力係藉上述程式來測定。因此 ，設計用來產製CTLA4Ig、其它可溶性CTLA4分子及可 -88- (85) 1312368 溶性CTLA4突變種分子的培養過程爲一種非-生長相關之 過程’其中蛋白質係在第6天或約第6天，也就是在指數 胞生長之後’約在靜止相開始時開始生產。呈現在表5 中之資料係關於實施例3中所進行之實驗。 表5 實施例/τ_更動 細胞特異性 細胞特異性蛋白質 變數 蛋白質生產 產製量 (時間） Ι-Α/無τ-审動 14天後 44.7微微克/細胞/天 I-B/無Τ_更動 21天後 64. 1微微克/細胞/天 II-Α/—次τ_更動 14天後 55.5微微克/細胞/天 I卜Β/—次τ_更動 21天後 6 0.9微微克/細胞/天 ΙΙΙ-Α/二次τ-更動 14天後 47.5微微克/細胞/天 ΙΙΙ-Β /二次Τ•更動 21天後 51.9微微克/細胞/天
在表5中之細胞特異性生產力係依本文前述，利用細 胞密度及滴定濃度測量値來計算。本技藝中之技術熟習人 士可察知’細胞密度測量値通常具有約1 〇 · 2 0 %標準差（ S D ) ’也就是高S D，因而並不精確。因此，細胞特異性 生產力之測定値具相對應之1 0-20%標準差。因此’由於 涉及這些計算類型之S D較高，因此在不同之操作時間中 -89 - (86) 1312368 ，每天每細胞所產製之產物量在無T-更動 '一次T-更動 或二次Τ-更動的過程間並無顯著差異。由本發明新提供 之細胞培養過程所產製之大量的高品質蛋白質產物’及全 部增加之蛋白質產量係歸因於在包含多次向下溫度更動的 整個培養過程中有較多存活細胞數。
實施例5 實施例5 A 本實施例提供在本發明過程中，用來培養可產製如實 施例5B-16中所描述之例示的L104EA29YIg的重組細胞 的物質和試劑。
1 .細胞培養介質用於細胞接種代之所有相，及用來養 育在生物反應器（包括5升（5L)及50升（50L)之生 產反應器）中之培養的基礎細胞培養介質爲如表6中所示 範之修正的CD-CHO介質，其含有麩醯胺、碳酸氫鈉、胰 島素和胺基甲基葉酸（因維特金公司，加卅卡斯貝市）。 以1NHC1將介質之PH値調整爲7.0。 -90- 1312368 (87) 表6 修正之c D - C Η 0 _ 介質成分 濃度 C D - C Η 0 2 5 X 酸類 I (因維特金，加州卡斯貝市） 4 〇毫升/升 C D - C Η 0 2 5 X 酸類 Π — (因維特金，加州卡斯貝巾） 4 0毫升/升 CD-CHO 25χ 鹽類 I 40毫升/升 (因維特金，加州卡斯貝市） CD-CHO 25χ 鹽類 Π 一 (因維特金，加州卡斯貝市） 40毫升/升 L -麩醯胺 _____ (因維特金） 0.5 85克/升 7 -人類膜島素 (1 0毫克/毫升） (因維特金） 0.1毫升/升 胺基甲基葉酸 (2 0 m Μ溶液） (IC Ν，力口少1、|卡塔梅莎市） 5微升/升 碳酸氫鈉 (馬蘭克洛貝可公司（Mallenkrodt Baker )，紐澤西州菲利浦柏格市） 2.22克/升
在除了實施例8外之所有實施例中’在分批餵養過程 -91 - (88) 1312368 中係使用如表7中所示之含有下列物質的修正餵養介質， 也就是eRDF-Ι介質（因維特金公司）來饌養細胞：葡萄 糖、麩醯胺、胰島素和TC酵母酸化物（貝通-迪金生公司 ，紐澤西卅富蘭克林湖市）。加入所有成分後，以1 N NaOH將餵養介質之pH値調整爲7.0。 表7 改良之eRDF介質的成分 濃度 eRDF-I (因維特金，加州卡斯貝市） 1 6.8克/升 右旋糖 (V WR-馬蘭克洛貝可公司） 3 0.94克/升 L-麩醯胺 (因維特金） 4.1克/升 7 -人類胰島素 (10毫克/毫升） (因維特金） 1毫升/升 TC酵母酸化物 (貝通迪金生公司， 紐澤西州富蘭克林湖市） 5克/升 半乳糖 (費洛-凡斯提公司（Ferro-Pfanstiehl) ，伊利諾州，瓦奇根市） 12.5克/升
-92- (89) 1312368 在實施例8方面，餵養介質爲如前述之介質再加1一 項修正：eRDF-Ι濃度爲25.2克/升。 2 .在生物反應器中之生產相 生產之生物反應器先以分批反應器之型式操作’操作 時密切監測及控制溫度、壓力、pH和溶解之氧濃度。經 由測量存活細胞密度及數種關鍵代謝物之濃度來評丨古纟吾養 情況。餵養過程係在接種後一天開始。剩餘之醱酵過程 係以分批-餵養模式進行。 使用5升規模（具有一個海水推進器的玻璃反應器） 、1 〇升規模（具有二個海水推進器的不鎊鋼反應器）及 5 〇升規模（具有二個海水推進器的不;銹鋼反應器）的生 物反應器。（見實施例2 )。在整個操作過程中，以資料 取得系統（因特迅固定3 2 )記錄溫度、pH和溶解之氧濃 度（D 0 )。經由轉子流速計來控制氣流。經由一浸沒之 玻璃料（5微米細孔大小）將空氣引入反應器中，並通過 反應器頭部空間排出C 0 2。氧分子係透過相同之玻璃料引 入’以用來控制DO。C02係透過相同之玻璃料引入，以 用來控制p Η。 -93 - 1312368 (90) 計算每日之大九劑餵料的容積，以使葡萄糖濃度回升至 3.0克/升。將每日餵養量記錄在分批工作單上。 4 .採樣
以每日爲基準，從反應器中移出細胞樣本。以錐蟲藍 (史格馬公司，密蘇里州聖路易市）將用於細胞計數之樣 本染色。利用顯微鏡，經由血球細胞計算器，或經由塞得 克（Ced ex )自動細胞計數器（伊諾瓦提斯，德國畢勒非 德市）來計算細胞並測定細胞存活力。在代謝物分析方面 ，將另外之樣本在2000rpm ( 4°C )下離心20分鐘，以將 細胞分開。對上淸液分析下列變數：滴定濃度、涎酸、葡 萄糖、乳酸化物、麩醯胺、麸胺酸化物.、pH、p〇2、pC02 、氨及隨意地加上乳酸脫氫酶 （LD Η )。將其它備用樣 本冷凍在-2 (TC 〇 實施例5 Β 本實施例 5Β 描述從培養之 CHO 細胞產製 L104EA29YIg (如第4圖中所示之-1至357或+ ]至3 5 7 ) ((編碼DNA以PTA-2 1 04之編號存放在ATCC )的方法 〇 本實施例5B亦描述涉及將多陰離子性化合物，更具 體地說爲硫酸葡聚糖加入細胞培養中的本發明方法。 將用於表現L104EA29YIg之CHO細胞利用丁-75燒 瓶，及搖動-燒瓶在含下列物質之修正的CD-CHO介質（ -94- 1312368 (91) 因維特金公司’加卅）中增殖：麩醯胺、碳酸氫鈉、胰島 素和胺基甲基葉酸。將T-75燒瓶及搖動-燒瓶在37°C和 6 % C Ο 2中培養。產生足夠之接種量後，將培養轉移至利用 上述之修正的CD-CHO介質的5升或1〇升生物反應器中 。起始接種密度爲約2 0 0，0 0 0個存活細胞/毫升或1 〇 6細 胞/毫升。 5升和1 〇升容器分別爲配備一個及二個海水推進器 的玻璃反應器（艾普利康，加州佛斯特市）。經由轉子流 速計來控制氣流。經由一浸沒之玻璃料（5微米細孔大小 )將空氣引入反應器中，並通過反應器頭部空間排出C02 。氧分子係透過相同之玻璃料引入，以用來控制DO。 C〇2係透過相同之玻璃料引入，以用來控制高側pH。低 側pH係經由加入IN NaOH或Na2C03來控制。 利用含葡萄糖、半乳糖' 麩醯胺、胰島素和TC酵母 酸化物（貝通-迪金生公司）之修正的eRDF介質（因維 特金公司）’以下述方式’每日以大九劑餵料來餵養反應 器中之培養：在接種後第1天，加入爲1 %培養容積之最 低量；或者，若葡萄糖濃度低於3克/升，則加入一計算 過之容積’以使葡萄糖濃度回升至3 · 0克/升。 在除了實施例Π外之所有實施例中，從第〇天至第 6天’溫度控制在37 °C ;從第6天至第1 〇天，溫度控制 在34 °C ;從第10天起，溫度控制在3 2 °C。 醱酵過程之典型期間爲14-19天。以每日爲基準，從 反應器中取出樣本以進行分析。以錐蟲藍（史格馬公司， -95 - 1312368 (92) 密蘇里州）將用於細胞計數之樣本染色。利用塞得克自動 細胞計數器（伊諾瓦提斯AG，德國畢勒菲德市）來計算 細胞，並測定細胞存活力。對上淸液進行下列分析： LEA29Y滴定濃度、葡萄糖、乳酸化物 '麩醯胺、麩胺酸 化物、卩11、卩〇2、？(：〇2、氨。
將硫酸葡聚糖（鈉鹽，來自平均分子量爲5 000道耳 頓之葡聚糖，史格馬公司，密蘇里州）溶入水中或介質中 。將溶液進行無菌過濾，並將其加入反應器中，使濃度爲 5〇毫克/升。加入之容積至多構成加入當時之反應器操 作容積的2 %。 實施例ό 本實施例描述及呈現比較性硏究之結果，以評估在接 種後的一個時間加入多陰離子性化合物（更具體地說爲硫 酸葡聚糖）之效果。
在5升和10升生物反應器中接種0·2χ106細胞/毫 升之L104EA29Y-產製細胞。 實驗6 - a和6 - b設§十如下· 實施例6a :培養中不加入硫酸葡聚糖（"對照組”培養 :有4個培養在5升生物反應器中’ 4個培養在10升生 物反應器中）。 實施例6 b :在第6天時’將培養中之硫酸葡聚糖的 濃度加成5 0毫克/升 （” D S第6天"培養：有2個培養 在5升生物反應器中，1個培養在10升生物反應器中） -96- 1312368 (93) 實施例6-a和6-b之平均存活力、存活細胞密度和總 細胞密度略圖，及其標準差記載於第6圖中。 在對照培養中，在第6和7天之間可觀察到存活細胞 密度之高原期，相當於靜止相。對照培養在第7天（平均 而言）後可觀察到存活細胞密度和存活力下降，相當於死 亡相。當第6天在培養中加入硫酸葡聚糖後，生長相可延 長至第1 1天.。相對於對照組之3 . 5 X 1 0 6細胞/毫升，加 入硫酸葡聚糖者之存活細胞密度可達到平均5.2x1 06細胞 /毫升。在此延長之生長相期間，存活力維持高於9 0 %。 第1 1天後，存活細胞密度及總細胞密度以比例方式下降 ，這表示有細胞溶解，結果，存活力指數直到第1 5天仍 維持高於90%。 第7圖爲加入硫酸葡聚糖之培養及對照操作中，以存 活細胞密度作爲時間函數的對數表示。死亡率（由第2圖 中之存活細胞密度的斜度得知）根據硫酸葡聚糖是否存在 而有不同。在硫酸葡聚糖之存在下，死亡率在第12天和 第19天之間約爲固定，數値爲0.00 121Γ1。相反的，對照 組之平均死亡率在第8天和第12天之間的數値最高， O.OO〗4!!·1。因此’在第6天加入硫酸葡聚糖可以2倍速度 減緩死亡相期間之細胞死亡率。 不管上述之硫酸葡聚糖的益處’加入或不加入硫酸葡 聚糖所得之產物Ll〇4EA29YIg的滴定濃度類似（表8 )。 -97- 1312368 (94) 表8:在第6天加入硫酸葡聚糖對第14天之產物 L104EA29YIg的Jg定濃度的影響。_ 條件 操作數 第14天平均 滴定濃度之 滴定濃度 標準差 對照過程 8 1.60 0.18 第6天硫酸葡聚糖 3 1.57 0.13
表9中記載不同操作過程中，L 1 0 4 E A 2 9 YI g涎酸化的 程度。由於操作過程間之變化性相當大，在第6天加入硫 酸葡聚糖可被認爲未顯著影響Ll(MEA29YIg之涎酸化。 表9 :在第6天加入硫酸葡聚糖對產物Ll(HEA29YIg之涎
酸化的影響。 條件 操作數# NANA莫耳比 對照過程 1 6.8(14) 對照過程 2 5.5(14) 對照過程 3 5.7(15) 對照過程 4 5.5(15) 對照過程 5 5.5(15) 對照過程 6 6.3(16) 第6天硫酸葡聚糖 7 5.4(14) 第6天硫酸葡聚糖 8 6.9(14) 第6天硫酸葡聚糖 9 6.9(16) -98- (95) 1312368 實施例7 此實施例顯示將硫酸葡聚糖加入在死亡相中之細胞培 養的效果。 在Ll(MEA29YIg -產製細胞之5升生物反應器中進行 接種’接種密度爲1 06細胞/毫升，而死亡相從第5天開 始。在第6天加入硫酸葡聚糖。 存活力、存活細胞密度及總細胞密度略圖呈現在第8 圖中。在這類培養之第6天加入硫酸葡聚糖可預防存活細 胞密度發生大幅下降’直到第17天。因此，當在死亡相 期間加入硫酸葡聚糖時，可將死亡相遏制數天。 在此操作過程中’可在第14天取得1.9克/升之滴 定濃度，其NANA莫耳比爲6.6。 ， 實施例8 此實施例顯示將硫酸葡聚糖加入在死亡相中之細胞培 養的效果。 在L104EA29YIg-產製細胞之10升生物反應器中進行 接種’接種密度爲0.2x1 〇6細胞/毫升。在此特殊實施例 中’每日韻養者爲一種更濃縮之調和物，結果，死亡相延 至第10天才開始（第9圖）。直到第14天才加入硫酸葡 聚糖。 存活力、存活細胞密度及總細胞密度略圖呈現在第9 圖中。在第1 4天加入硫酸葡聚糖可使存活細胞密度穩定 4天，之後便中斷培養。 -99 - 1312368 (96) 此實施例爲在死亡相期間將硫酸葡聚糖加入培養中來 遏制細胞死亡的另一說明。 實施例9 此實施例顯示在第0天加入硫酸葡聚糖的效果。經由 將本實驗中可見到之效果與其中延遲加入硫酸葡聚糖的其 它實驗中所見到的效果進行比較可知道延遲加入硫酸葡聚 糖的效果。 在2個重複之5升生物反應器中接種入0.2xl〇6細胞 /毫升之 L104EA29YIg-產製細胞，並在接種之同一天（ 第0天）加入濃度爲50毫克/升之硫酸葡聚糖。 存活力、存活細胞密度及總細胞密度略圖呈現在第 1 0圖中。沒有一個培養可達到比缺乏硫酸葡聚糖之培養 來得高的細胞密度（比較第6圖和第1 0圖）。相對於在 第6天加入硫酸葡聚糖之培養中的細胞於第1 1天進入死 亡相’此細胞係在第7或8天進入死亡相（比較第6圖和 第10圖）。在這些操作過程之第14天所取得之 Ll(MEA29YIg滴定濃度爲0.57克/升（操作過程#1)及 〇 - 8 6克/升（操作過程#2 )，其顯著低於在對照過程中， 或在第6天加入硫酸葡聚糖之過程中所取得之滴定濃度（ 見實施例6 )。 這些結果證明加入硫酸葡聚糖之時間對加入結果的重 要性。 不受限於任何理論，我們提出：加入硫酸葡聚糖所觀 -100- 1312368 (97) 察到之效果及這些效果對加入時間之倚賴性可由硫酸葡聚 糖以類似於多硫酸聚戊醣結合肝素-結合生長因子的方式 (Zugmaier et al.，1 992 )來結合多種自動分泌因子而獲 得解釋。我們提出：硫酸葡聚糖在這些因子之肝素-結合 功能區塊與這些因子結合’而使該功能區塊變成無法連接 細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多醣。因此，硫酸葡聚糖-結 合因子無法集中在細胞表面，這使得這些因子結合至其受 體之可能性大爲降低。最終效果爲這些因子無法再在細胞 上行使其正常作用。在接種後的最先幾天，細胞產生某些 生長因子，其功能爲傳遞細胞生長的訊息。在第〇天加入 之硫酸葡聚糖可在這些因子產生時即與其以不可逆轉的方 式結合。然而，硫酸葡聚糖與這些因子、結合不會以不利的 方式大大影響細胞的生長，這可能是因爲細胞可經由增加 產生生長因子來反應。在生長相期間後期，生長因子停止 產生，細胞開始產生不同型態之自動分泌因子，其在高濃 度之作用爲傳遞生長相結束及細胞死亡開始的訊號。這些 因子從第0天之低濃度累積至稍後之高濃度。那時，這些 因子可有效傳遞細胞停止生長，及進入靜止和死亡相的訊 息。我們提出：硫酸葡聚糖優先與這些死亡-傳訊因子結 合，因此使其無法傳訊，而使生長相延長。細胞死亡之進 行似乎需要由這些死亡-傳訊因子持續誘導，結果，當硫 酸葡聚糖使其無法作用時（即使是遲至培養之第1 4天） ’已進入死亡相之細胞仍可重新被安排進入靜止相（實施 例7和8 )。相反地’在第〇天加入之已與生長因子結合 -101 - 1312368 (98) 的硫酸葡聚糖在生長相結束時仍與這些因子結合，這使得 其無法與死亡-傳訊分子結合。因此，其中硫酸葡聚糖係 在第〇天加入培養中之情況（實施例9)並無法像硫酸葡 聚糖係在生長相結束時加入的情況般延長生長相及延遲死 亡相開始。 在實施例6中，造成該於第6天補充硫酸葡聚糖之培 養在第1〗天停止細胞生長，並開始細胞死亡的機制被假 設爲與該由硫酸葡聚糖-結合自動分泌因子所誘導者不同 。可能的情形爲，在生長1 1天後，介質中之特殊營養用 盡而使這些培養之生長相結束。 實施例1 0 本實施例比較在初始生長相期間的三種不同時間加入 硫酸葡聚糖的效果6 將Ll(MEA29YIg-產製細胞之培養以1〇6細胞/毫升 接種入5-升之生物反應器中。在不同時間將濃度爲50毫 克/升之硫酸葡聚糖加入培養中。在一種培養中，硫酸葡 聚糖係在第3天加入，在另一種培養中，在第4天加入， 而在第三種培養中，硫酸葡聚糖係在第5天加入。 存活力及存活細胞密度略圖記載於第1 1圖中。在所 有加入硫酸葡聚糖之三種情況（第3、4或5天）中均得 到高存活細胞密度（> 1 〇 7細胞/毫升），但較早加入（第 3或4天）者則無法預防存活細胞密度在生長相之後立即 下降。相反的’第5天加入可在生長相之後將存活細胞密 -102- 1312368 (99) 度穩定4天。在經過250小時後之時間點 硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度總是 硫酸葡聚糖之培養中的存活細胞密度來得 在測量誤差內），而在第4天加入硫酸葡 存活細胞密度總是較在第3天加入硫酸葡 存活細胞密度來得高或與其相等（在測量 ，從此實施例顯示出加入硫酸葡聚糖之理 長相（指可在未加入任何硫酸葡聚糖時所 )結束時。較早加入硫酸葡聚糖可延長生 由硫酸葡聚糖所誘導之延長生長相之後仍 存活細胞的密度，然而，較晚（在死亡相 葡聚糖可穩定存活細胞密度，但可能無法 胞密度（見實施例7和8 )。因此，在第 聚糖可在第14天取得2.7克/升之滴定 或第4天加入硫酸葡聚糖可在第14天取 滴定濃度，而在第6天加入硫酸葡聚糖可 1.9克/升之滴定濃度（在實施例7中） 過程中，NANA莫耳比分別爲6.3、6.6、< 示出在理想時間加入硫酸葡聚糖可得到較 並伴隨著固定之涎酸化水準。 實施例1 1 本實施例顯示一和二次溫度更動在產 之培養中的效果。此培養亦進行延遲加入 ，在第5天加入 較在第4天加入 高或與其相等（ 聚糖之培養中的 聚糠之培養中的 誤差內）。因此 想時間爲初始生 觀察到之生長相 長相，但無法在 一樣有效地穩定 期間）加入硫酸 實質增加存活細 5天加入硫酸葡 濃度，而在第3 得2 · 6克/升之 在第1 4天得到 。在上述之操作 5 · 0和6 · 6，其顯 局之滴定濃度， 製 LI04EA29YIg 硫酸葡聚糖的實 -103- 1312368灣 驗。 在5升反應器中接種細胞，密度爲2 0 0,0 0 0細胞/毫 升。 使用二次、一次或無T -更動。在一次溫度更動方面 ，溫度係在第6天從3 7 °C更動至3 4 °C。在二次溫度更動 方面，溫度係在第6天從37 °C更動至34 °C，並在第10天 從3 4 °C更動至3 2 °C。在所有情況中，硫酸葡聚糖係在第 6天加入。二次T-更動之情况爲三次操作過程之平均，而 標準差以粗帶表示。 存活細胞密度 '存活力和滴定濃度分別記載於第i 2 、1 3和1 4圖中。 結果顯不使用至少一次溫度更動的益處。在其中整個 操作過程溫度均維持在3 7 °C的情況中，培養在第1 〇天進 入死亡相’且存活細胞密度和存活力之下降快速。結果， 在培養12天後’ L104EA29YIg容積生產力明顯降低。在 1 4天和更久之培養時間方面，很明顯地，具一或二次溫 度更動之培養在滴疋濃度方面將勝過固定溫度之培養。 在其中僅進行一次溫度更動（在第6天，更動至3 4 °C )的情況中’在第]6天後可觀察到存活細胞密度和存 活力快速下降。其中除了第一次溫度更動外還進行第二次 溫度更動（在第10天’更動至32 °c)的培養中，在第16 天後未顯示存活細胞密度和存活力快速下降。培養時間經 過18天後’在一次T_更動之培養中的容積產製力不如在 二次Τ-更動之培養中的容積產製力。相反的，在介於第 -104 - (101) 1312368 1 1天和第1 5天之培養時間中，具一次τ-更動之培養中的 容積產製力優於具二次Τ-更動之培養中的容積產製力。 結論，第一次溫度更動之益處與所需之收成時間無關 ，然而，第二次溫度更動之益處則視所欲收成之時間及取 得有效之下游處理所需的存活力而定。無第二次溫度更動 將直到第20天才能達到較高之產物滴定濃度，但對操作 長過20天之培養而言，具二次溫度更動之培養在滴定濃 度方面將勝過具一次溫度更動之培養。另外，必須考慮到 :在具一次Τ-更動之培養中，超過第12天之收成將較具 二次Τ-更動之培養含有較多之細胞溶解產物，此點將使 下游處理複雜化。在具一次Τ-更動略圖之情況中，第1 2 天後所觀察到之存活細胞密度快速下降的情形將爲對產物 品質的顧慮之一，因爲相對應之細胞死亡可能在上淸液中 釋入大量之涎酸酶，而降低產物之涎酸化。· 所有此處所參考和列舉之核發及准予的專利、專利申 請書、出版之PCT和u.s_申請案、文章、書籍 '參考資 料和教育手冊及摘要的全文倂爲本文之參考，以更詳細描 述本發明相關之技藝狀態。 由於上述主題內容可做多種變化而不背離本發明之範 圍和精神’所有包含在上述說明，或附屬之申請專利範圍 中所定義者均解釋爲本發明之描述和說明。根據上述之教 不內容可對本發明做多種改良和變化。 【圖式簡單說明】 -105- 131236® 件3 : 第 92 13 60 08 號專利申請案 ---------- ----------—-丨 中文說明書替換頁 民國9 8年3月11日修正 f年4月I丨8^正替換頁| 第Iff爲不同之溫度更動輪廓對於在5升（5L)反應 器規模中培養的細胞之細胞存活力的影響。這些結果係從 本文實施例3中所描述之實驗中取得。所比較的爲不涉及 溫度更動（"無T-更動"）、一次溫度更動（"單一 T-更動 ")和二次向下溫度更動（”二次T-更動"）的培養方法。 第2圖爲不同之溫度更動輪廓對於在50升（50L) 反應器規模中培養的細胞之細胞存活力的影響。這些結果 係從本文實施例3中所描述之實驗中取得。所比較的爲涉 及三次向下溫度更動（"三次T-更動"）和二次向下溫度更 動（"二次T-更動"）的培養方法。 第3圖描述一核苷酸序列（S E Q ID Ν Ο : 1 )和所編 碼之 CTLA4Ig的胺基酸序列（SEQ ID NO : 2 )，此 CTLA4Ig具一訊號肽、一 CTLA4之胞外功能區塊的野生 型胺基酸序列（其係從位置+1之甲硫胺酸開始至位置 + 1 24之天門冬酸，或從位置-1之胺基丙酸開始至位置 + 124之天門冬酸），及一 Ig區。 第4圖描述一核苷酸序列（SEQ ID NO: 3)和所編 碼之CTLA4突變種分子（L104EA29YIg)的胺基酸序列 (SEQ ID NO: 4)，此 CTLA4 突變種分子 （ L104EA29YIg)具一訊號肽' 突變之CTLA4的胞外功能 區塊（其係從位置+ 1之甲硫胺酸開始至位置+ 1 24之天門 冬酸結束，或從位置-1之胺基丙酸開始至位置+124之天 門冬酸結束），及一 Ig區。 第5圖描述一核酸序列（SEQ ID NO: 5)和所編碼 -106- 1312368# 3 ：第 92 136008 號專利申請案 --------- η 中文說明書替換頁 民國98年3月11日修正 孑月（ί日蹲換頁 之人類CTLA4受體（此處稱爲”野生型” CTLA4)的完全 胺基酸序列（SEQ ID NO : 6 )，該人類CTLA4受體係融 合至抑制瘤素Μ訊號肽（位置-26至-2) (U.S.專利第 5,434，131 和 5,844,095 號）。 第6圖爲其中硫酸葡聚糖係在初始生長相結束時加入 之培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞 密度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例6中所 描述之實驗中取得。所比較的爲在初始生長相結束時加入 硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。標繪 平均値；誤差帶代表標準差。 第7圖爲延遲加入硫酸葡聚糖對死亡率的影響。此爲 存活細胞密度作爲時間函數的對數表示。這些結果係從本 文實施例6中所描述之實驗中取得。所比較的爲其中在初 始生長相結束時加入硫酸葡聚糖之培養和其中不加入硫酸 葡聚糖之培養。標繪平均値；誤差帶代表標準差。 第8圖爲其中硫酸葡聚糖係在初始死亡相期間加入之 培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞密 度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例7中所描 述之實驗中取得。所比較的爲在初始死亡相期間加入硫酸 葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。 第9圖爲其中硫酸葡聚糖係在初始死亡相期間加入之 培養中，延遲加入硫酸葡聚糖對存活細胞密度、總細胞密 度，和存活力的影響。這些結果係從本文實施例8中所描 述之實驗中取得。所比較的爲在初始死亡相期間加入硫酸 -107- 13123§fe 3 ： 修·^螂i 第 92 136008 號專利申請案 中文說明書替換頁 民國98年3月11日修正 葡聚糖之培養和其中不加入硫酸葡聚糖之培養。 第10圖爲其中硫酸葡聚糖係在培養第0天加入之培 養中的存活細胞密度、總細胞密度，和存活力。這些結果 係從本文實施例9中所描述之實驗中取得。 第11圖爲其中硫酸葡聚糖係在初始生長相之三種不 同時間（第3天、第4天和第5天）加入之培養中的存活 細胞密度和存活力。這些結果係從本文實施例10中所描 述之實驗中取得。 第1 2圖爲不同溫度更動輪廓對存活細胞密度之影響 。這些結果係從本文實施例11中所描述之實驗中取得。 所比較的爲不涉及溫度更動（"無T-更動”）、一次溫度更 動（” 一次T -更動"）和二次向下溫度更動（”二次T -更動 ”）的培養方法。 第13圖爲不同溫度更動輪廓對存活力之影響。這些 結果係從本文實施例1 1中所描述之實驗中取得。所比較 的爲不涉及溫度更動（"無T-更動"）、一次溫度更動（” 一次T-更動"）和二次向下溫度更動（”二次T-更動”）的 培養方法。 第14圖爲不同溫度更動輪廓對滴定濃度之影響。這 些結果係從本文實施例11中所描述之實驗中取得。所比 較的爲不涉及溫度更動（"無T-更動”）、一次溫度更動（ "一次T-更動”）和二次向下溫度更動（"二次T-更動"） 的培養方法。 -108- 1312 職第 92136008 -^^»ίΐ·ι···» ill - I ' ~f ~ 9Ϊ 『f 十乂斤yu我策年;^:]丨，曰修正本 號專利申請案 民國98年3月11日呈 序列表 < 110> 必治妥施貴寶公司 <12〇> 培養哺乳動物細胞以產製蛋白質之方法 <140> TW 092136008 <141> 2003-12-18 <150> 60/436,101 <151> 2002-12-23 <160> 6 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 1152 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223 > CTLA4 Ig,包括人CTLA4之細胞外結構區的融合蛋白 <220> <221> CDS <222> (1)…（1149) <220> <221> <222> (797.. 0 <400> 1 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 etc ctg ttt cca age atg geg age atg gca atg cac gtg gee cag cct Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 -11 5 get gtg gta ctg gee age age ega ggc ate get age ttt gtg tgt gag Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tet cca ggc aaa gee act gag gtc egg gtg aca gtg ett egg Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca acc tac atg atg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 48 96 144 192 240 1312368 ggg aat gag ttg acc ttc eta gat gat tcc ate tgc acg ggc acc tcc 288 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac 336 Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 acg gga etc tac ate tgc aag gtg gag etc atg tac cca ccg cca tac 384 Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432 Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tet gat cag gag ccc aaa tet tet gac aaa act cac 480 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130 aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa etc ctg ggt gga teg tea gtc 528 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150 ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc egg acc 576 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 155 160 165 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 624 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195 aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age acg tac egg gtg gtc age 720 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210 gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 768 Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230 tgc aag gtc tcc aac aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 816 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 235 240 245 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 864 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 cca tcc egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 912 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275
-2 1312368 gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat 960
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ctg gac tee 1008
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 gac ggc tee ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg 1056
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 3X5 320 325 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat gag get ctg 1104
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340
cac aac cac tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa tga 1152
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213 > 人造序列 <220> < 22 3 > CTLA4 Ig,包括人CTLA4之細胞外結構區的融合蛋白 <400> 2
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 -11 5
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arq Ala Met Asp 75 80 85 3- 1312368
Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100
Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 105 110 115
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 155 160 165
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 235 240 245
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 4- 1312368
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325
Trp Gin Gin Gly Asn Valj Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213 > 人造序列 <220> <223> L104EA29YIg,包括人CTLA4之突變細胞外結構區的融合蛋白
<220> <221> CDS <222> (1) .. (1149) <220> <221> <222> (79T-- 0 <400> 3 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 etc ctg ttt cca age atg geg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 -11 5 get gtg gta ctg gcc age age ega ggc ate get age ttt gtg tgt gag Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tet cca ggc aaa tat act gag gtc egg gtg aca gtg ett egg Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca acc tac atg atg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 ggg aat gag ttg acc ttc eta gat gat tee ate tgc aeg ggc acc tee Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70 48 96
144 192 240 -5- 288 1312368 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac 336 Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 acg gga etc tac ate tgc aag- gtg gag etc atg tac cca ccg cca tac 384 Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 tac gag ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432 Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val He Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tet gat cag gag ccc aaa tet tet gac aaa act cac 480 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130 aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga teg tea gtc 528 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150 ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc egg acc 576 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 155 160 165 cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag 624 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180 gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 672 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195 aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age 720 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210 gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag 768 Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230 tgc aag gtc tcc aac aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate 816 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 235 240 245 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc 864 Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260 cca tcc egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg 912 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275 gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat 960 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290 1008 1312368 1008 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 gac ggc tcc ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325 tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340 cac aac cac tac acg cag aag age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa tga His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 1056 1104 1152 <210> 4 <211> 383 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> L104EA29YIg,包括人CTLA4之突變細胞外結構區的融合蛋白 <400> 4
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15
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Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20
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Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 1312368
Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100
Tyr Glu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin He Tyr Val He Asp Pro Glu 105 110 115
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 120 125 130
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 135 140 145 150
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 155 160 165
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 170 175 180
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 185 190 195
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 200 205 210
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 215 220 225 230
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 235 240 245
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 250 255 260
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 265 270 275
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 280 285 290
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 295 300 305 310 -8- 1312368
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 315 320 325
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 330 335 340
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 345 350 355 <210> 5 <211> 636 <212> DNA <213> 人
<220> <221> CDS <222> (1)- .(636) <220> <221> mat 肽 <222> (79T ..Ο <400> 5 atg ggt gta ctg etc aca cag agg aeg ctg etc agt ctg gtc ett gca Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15 etc ctg ttt cca age atg geg age atg gca atg cac gtg gcc cag cct Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro -10 -5 -11 5 get gtg gta ctg gcc age age ega ggc ate gcc age ttt gtg tgt gag Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20 tat gca tet cca ggc aaa gcc act gag gtc egg gtg aca gtg ett egg Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35 cag get gac age cag gtg act gaa gtc tgt geg gca acc tac atg atg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 ggg aat gag ttg acc ttc eta gat gat tcc ate tgc aeg ggc acc tee Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 7 0 agt gga aat caa gtg aac etc act ate caa gga ctg agg gcc atg gac Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85 48 96 144 192 240 288
9- 336 1312368 acg ctc tac ate tgc 丑ag gtg gag etc atg tac cca ccg cca tac 384
Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100 tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa 432
Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 105 110 115 ccg tgc cca gat tet gac ttc etc etc tgg ate ett gca gca gtt agt 480
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Pile Leu Leu Trp lie Leu Ala Ala Val Ser 120 125 130 teg ggg ttg ttt ttt tat age ttt etc etc aca get gtt tet ttg age 528
Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 135 140 145 150 aaa atg eta aag aaa aga age cct ett aca aca ggg gtc tat gtg aaa 576
Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 155 160 165 atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct tat ttt 624
Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 170 175 180 att ccc ate aat 636 lie Pro lie Asn 185 <210> 6 <211> 212 <212> PRT <213> 人 <400> 6
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala -25 -20 -15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro 5
-5
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 10 15 20
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 25 30 35
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 40 45 50 -10- 1312368
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 55 60 65 70
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 75 80 85
Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 90 95 100
Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Glu 105 110 115
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp lie Leu Ala Ala Val Ser 120 125 130
Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 135 140 145 150
Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 155 160 165
Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 170 175 180 lie Pro lie Asn 185
-11 -

Claims (1)

1312
拾、申請專利範圍 附件5 : 第9 2 1 3 6 0 0 8號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 民國9 8年4月24日修正 1 . 一種培養細胞以產製融合蛋白之方法，其包含藉由 3次下調之溫度更動分別於3 6至3 8 °C、3 3至3 5 °C及3 1 至33 °C之溫度下培養能產製該融合蛋白之中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞株，其中係於培養之第1天於該36至3 8°C之 溫度下培養該CHO細胞’起始自該培養之第5至7天於 該3 3至3 5 °C之溫度下培養該CHO細胞，且起始自該培 養之第9至11天於該31至33 °C之溫度下培養該CHO細 胞，其中對呈穩定相之該細胞培養加入硫酸葡聚糖，且其 中該融合蛋白係具有 SEQ ID N〇: 2之胺基酸序列的 CTL A4Ig或係具有 SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的 L 1 04EA29Ylg。 2 .如申請專利範圍第1項之方法’其中起初係於3 7 °C 下培養該CHO細胞’隨後更動至34°C下培養該CHO細胞 ，再於32°C下培養該CHO細胞。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中起始自該培養 之第6天於該33至35 °C之溫度下培養該CHO細胞，且 起始自該培養之第天於該31至33 °C之溫度下培養該 C Η Ο細胞。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中經於該3 1至 1312368 3 3 °C之溫度下培養該CHO細胞後，可起始自該培養之第 13至15天於29至3 1°C之溫度下進一步培養該CHO細胞 直至該培養結束。 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該培養細胞之 方法係一餵料批式方法或連續方法。 6.如申請專利範圍第1項之方法，其中當該培養係呈 穩定相或呈2至12 X 1〇6細胞/ml之細胞濃度時，該培養 之溫度係自36至38t之溫度更動至33至3 5°C之溫度。 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中增加該融合蛋 白之涎酸化。 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中增強該CHO 細胞之細胞存活。 9 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中加入該硫酸葡 聚糖以使其於該培養中之濃度至1 - 1 000 mg/L。 1 0 .如申請專利範圍第9項之方法，其中遲延該C Η Ο «丨丨胞之死亡相的開始。 1312368 柒、（一）、本案指定代表圖為··第1圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明： 無
捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：
無 ^ 4 -
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