JP6996772B2

JP6996772B2 - Ｉｃａｍ－１に特異的なｉドメインキメラ抗原受容体

Info

Publication number: JP6996772B2
Application number: JP2019512782A
Authority: JP
Inventors: ムンソチン
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2016-09-02
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2022-02-21
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: WO2018044534A1; JP2019530441A; US20180066037A1; CA3033846A1; AU2017325678B2; US20230265165A1; EP3522718A1; EP3522718A4; AU2017325678A1; US20200181238A1; US10577408B2; US11046748B2; KR102613109B1; US10428136B2; US11634471B2; EP3522718B1; KR20190057072A; SG11201901505SA; CN108697096B; CN108697096A

Description

配列表、表またはコンピュータプログラムへの参照
配列表は、作成日２０１７年７月１７日、サイズ９．８９キロバイトの、「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」というファイル名を有する、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介したＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ヒトＩドメインを含むＩＣＡＭ－１に特異的なキメラ抗原受容体に関する。本発明は特に、ＩＣＡＭ－１に対して異なる親和性（１ｍＭ～１ｎＭ）を有するヒトＩドメインを含むキメラ抗原受容体に関する。

免疫療法は、癌の治療のための非常に有望なアプローチとして浮上している。

Ｔ細胞をＣＡＲで遺伝子改変することは、腫瘍特異的Ｔ細胞を設計するための一般的なアプローチである。腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲ（キメラ抗原受容体）－Ｔ細胞は、効率的な免疫療法アプローチを代表して、患者に注入することができる（養子細胞移植またはＡＣＴ）。化学療法または抗体と比較したＣＡＲ－Ｔ技術の利点は、再プログラムされた操作されたＴ細胞が患者内で増殖および持続することができ、生きた薬のように作用することができることである。

ＣＡＲ分子は、ＴＣＲゼータ鎖とＣＤ２８および／または４－１ＢＢのような共刺激分子とからなる細胞内シグナル伝達ドメインへ融合した合成結合部分、典型的には抗体由来一本鎖フラグメント可変（ｓｖＦｖ）要素または任意の天然抗原感知要素からなる^１、２。ＣＡＲ媒介性標的化の利点には、以下のものが含まれる：１）天然の非統合型ＴＣＲおよび共刺激シグナル伝達と比較した場合の、単一の結合事象を介した活性化、増殖、および生存シグナルのシス内での提供、２）ＭＨＣ非依存性抗原認識を介した腫瘍細胞によるＭＨＣの下方調節を迂回する能力、ならびに３）ＣＡＲと抗原との間の高親和性相互作用によって可能となる活性化閾値の低下および低い抗原密度の腫瘍細胞の認識^３、４。

理想的なＣＡＲ標的抗原は、多量に発現し、健常組織においては検出できない、天然の表面露出腫瘍新抗原であろう。しかしながら、このような抗原の絶対的な希少性のために、多くの一般的に標的とされる固形腫瘍抗原は、低レベルではあるにもかかわらず、非腫瘍組織によっても発現する。このような抗原に対して高い親和性を有するＣＡＲ分子は、健常組織の付帯的な標的化をもたらし得、その結果、これまでのＣＡＲＴ細胞療法の進歩に対する主要な制限要因である、オンターゲットオフ腫瘍毒性が生じる。

従来のＣＡＲは、一本鎖抗体フォーマットを使用して構築されており、標的抗原に対してナノモル濃度未満から低ナノモル濃度の親和性を有するように選択的に操作されている。しかし、ＣＡＲＴ細胞の感度の上昇は、真の腫瘍抗原または最高レベルの制限を有する腫瘍抗原を標的とするときにだけ利点であり得る^{１７、３６}。そうでなければ、感度の上昇は、抗原密度にほとんど敏感ではない様式で、標的発現細胞の溶解による選択性の低下という代償を払う^１８。

改善された治療指数を有するＣＡＲ、すなわち全身レベルの毒性を最小限にしながら腫瘍を殺滅することができるＣＡＲに対する需要が存在する。

段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。ＩＣＡＭ－１との複合体におけるＬＦＡ－１の概略図。αおよびβ鎖、およびＬＦＡ－１インテグリンのモジュールドメインが標識される。ＬＦＡ－１とＩＣＡＭ－１との相互作用に必要な金属イオンは円で示される。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。ＩＣＡＭ－１（Ｄ１）のＬＦＡ－１ＩドメインとＮ末端ドメインとの構造モデルがリボン図で描かれている。Ｎ末端およびＣ末端、ならびに変異ホットスポットが示されている。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。マウスＩＣＡＭ－１上に流されたＦ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ^＊を除く、固定化ヒトＩＣＡＭ－１に結合するＩドメイン変異体のＳＰＲセンサーグラム（Ｊｉｎら^５４の図２、およびＷｏｎｇら^５５の図１を改変）。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。ＩドメインＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの概略図。ＬＴＲ＝長い末端反復、ＳＤ＝スプライスドナー、ＳＡ＝スプライスアクセプター、ψ^＋＝パッケージングシグナル、ＳＳ＝シグナル配列、ＴＭ＝膜貫通、Ｃｙｔ＝サイトゾルドメイン。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。Ｍｙｃタグ付きＣＡＲ（ＴＭ、Ｆ２９２Ｇ、Ｆ２９２Ａ、ＷＴＩドメイン）を形質導入したジャーカットＴ細胞へ結合する抗Ｍｙｃ抗体。ＮＴ＝形質導入されていない。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現したＣＡＲに対する組換えＩＣＡＭ－１－Ｆｃの結合。段階的に１０^６倍の親和性の変化を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲの構造およびこのＣＡＲの試験管内での結果を示す。ジャーカットＴ細胞で発現したＩドメインＣＡＲと可溶性ヒト（上）およびマウス（下）ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）被覆表面との間の相対的な結合親和性を測定するＶ底接着アッセイ。ｎ＝３、ダネットの多重比較検定による^＊対ＮＴについてｐ＜０．０１。初代ＣＡＲＴ細胞の試験管内での親和性および抗原密度依存的活性化を示す。異なるＩドメインＣＡＲを形質導入された初代Ｔ細胞による標的死滅を測定するためのエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）アッセイ。各標的を５：１のＥ：Ｔ比でＴＭ、Ｆ２９２Ｇ、Ｆ２９２ＡまたはＷＴＣＡＲＴ細胞とともに個別にインキュベートした。生存百分率をＮＴＴ細胞とともにインキュベートした標的細胞からの発光に対して正規化した（ｎ＝３、±＝標準偏差（ＳＤ））。可変傾斜シグモイド曲線式を使用して、データを当てはめた。^＊は、ダネットの多重比較検定により、ＮＴに対してｐ＜０．０１である。初代ＣＡＲＴ細胞の試験管内での親和性および抗原密度依存的活性化を示す。５０％殺滅とシグモイド式のヒル傾斜との最適当てはめ値をＩドメインＣＡＲの親和性に対してプロットした。０．８５よりも大きなｒ二乗値を有する最適当てはめ値をプロットした。初代ＣＡＲＴ細胞の試験管内での親和性および抗原密度依存的活性化を示す。ＨｅＬａ細胞と比較した初代Ｔ細胞におけるＩＣＡＭ－１の発現。灰色および黒色のヒストグラムはそれぞれ、非標識細胞およびＲ６．５抗体標識細胞に対応する。初代ＣＡＲＴ細胞の試験管内での親和性および抗原密度依存的活性化を示す。ＩＦＮ－γ放出を、２４時間の異なる標的細胞との共インキュベーション後に、各ＣＡＲＴ変異体についてのＥＬＩＳＡにより測定した（ｎ＝３）。^＊は、ダネットの多重比較検定により、８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１に対してｐ＜０．０１である。マイクロモル濃度レベルの親和性を示すＣＡＲＴ細胞が、優れた腫瘍根絶、腫瘍の再発の抑制、および生存の利益を提供することを示す。全身発光撮像を用いて、腫瘍植込みの８日後に、異なるＣＡＲＴ細胞変異体を注入したマウスにおける腫瘍量を推定した。Ｔなし＝Ｔ細胞を注入していないマウス。マイクロモル濃度レベルの親和性を示すＣＡＲＴ細胞が、優れた腫瘍根絶、腫瘍の再発の抑制、および生存の利益を提供することを示す。腫瘍植込み１０日後にマウスをＣＡＲＴ細胞で処置した。ＮＴ＝形質導入されていないＴ細胞。マイクロモル濃度レベルの親和性を示すＣＡＲＴ細胞が、優れた腫瘍根絶、腫瘍の再発の抑制、および生存の利益を提供することを示す。異なる処置を受けたマウスの生存曲線。ＮＴに対する対数階級（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定のＰ値は、ＴなしおよびＴＭでは有意ではなく、Ｆ２９２Ｇではｐ＝０．００８、Ｒ６．５ではｐ＝０．０２５、およびＦ２９２Ａではｐ＝０．００１６である。腫瘍量、Ｔ細胞分布、およびサイトカイン放出の縦断的な同時測定を示す。ＳＳＴＲ２－Ｉドメインベクターの概略図。腫瘍量、Ｔ細胞分布、およびサイトカイン放出の縦断的な同時測定を示す。ＰＥＴ／ＣＴによるＮＯＴＡＯＣＴの取り込み（各パネルの上半分）、および全身発光撮像による腫瘍量（各パネルの下半分）の縦断的測定。画像は各コホートにおける４匹のマウスを代表するものである。トレーサーの最大取り込み当日に撮影された全身のＰＥＴ／ＣＴ画像を一番右に示す。撮像時点は下半分のパネルの下に示す。例えば、１５は、腫瘍異種移植の１５日後（およびＴ細胞注入の７日後）を表す。腫瘍量、Ｔ細胞分布、およびサイトカイン放出の縦断的な同時測定を示す。示す通りに処置したマウスの肺における発光およびトレーサー取り込みの定量。上のパネル：ＮＴ（非形質導入）Ｔ細胞。下のレベル：ＣＡＲ－Ｆ２９２Ａ。腫瘍量、Ｔ細胞分布、およびサイトカイン放出の縦断的な同時測定を示す。「ｂ」および「ｃ」の同じマウスから種々の時点で採取された血液から測定されたサイトカインレベルをプロットする（平均±ＳＤ、二つ組測定）。上のパネル：ＮＴ（非形質導入）Ｔ細胞。下のレベル：ＣＡＲ－Ｆ２９２Ａ。

定義
本明細書で使用する場合、「約」は、列挙された値の±１０％を指す。

本明細書で使用する場合、「養子Ｔ細胞療法」は、ワクチン接種単独で得られ得るものよりも多数のＴ細胞を達成するための腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および生体外増殖を含む。次に、癌を攻撃し殺滅することができるＴ細胞を介して、癌患者の免疫系に、腫瘍を留まらせるのを圧倒する能力を与える試みで、腫瘍特異的Ｔ細胞を癌患者へ注入する。

本明細書中で使用される場合、「親和性」は、単一分子（例えば、Ｉドメイン）のそのリガンド（例えば、ＩＣＡＭ－１）への結合の強度である。親和性は、典型的には、平衡解離定数（Ｋ_ＤまたはＫｄ）によって測定および報告され、この平衡解離定数を使用して、二分子間相互作用の強度を評価して順位決定する。

本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、抗原へ結合することができる細胞外ドメインと、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内ドメインと、を含む、融合したタンパク質を意味する。「抗原へ結合することができる細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原へ結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」は、細胞中の生物学的プロセスの活性化または抑制を引き起こすためのシグナルを伝達するドメインとして機能することが既知である任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。

本明細書で使用する場合、「ドメイン」は、１つの領域とは無関係に特定の構造へと折り畳まれたポリペプチド中の他の領域を意味する。

本明細書で使用する場合、「インテグリン」または「インテグリン受容体」（相互互換可能に使用される）は、細胞外マトリックスリガンドまたは他の細胞接着タンパク質リガンドへ結合して、それにより細胞間および細胞－マトリックス間接着プロセスを仲介する接着受容体とも呼ばれる多くの細胞表面受容体タンパク質のうちのいずれかを指す。インテグリンがそれらのリガンドへ結合する親和性は、インテグリンの立体配座の変化によって調節される。インテグリンは、例えば、胚発生、止血、創傷治癒、免疫応答および組織構造の形成／維持などの生理的プロセスに関与している。インテグリンサブファミリーは、異なる特異性を有する接着タンパク質受容体を形成するために、異なるアルファサブユニットと組み合わされたベータサブユニットを含む。

「細胞間接着分子１」または「ＩＣＡＭ－１」、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００２０１、ＮＰ＿０００１９２とは、α_Ｌβ_２インテグリンのリガンドであり、そのＮ末端ドメイン（Ｄ１）は、ＭＩＤＡＳ金属に対するＩＣＡＭ－１残基Ｇｌｕ－３４の配位を通じてα_ＬＩドメインへ結合する。ＩＣＡＭ１は典型的には、内皮細胞および免疫系細胞の上に発現する。ＩＣＡＭ１は、α_Ｌβ_２およびα_Ｍβ_２型のインテグリンへ結合する。ＩＣＡＭ－１は、いくつかの癌腫および関連する間質^２４ならびに炎症性容態^２５において上方調節されている。罹患組織とは別に、ＩＣＡＭ－１は内皮細胞、免疫細胞、およびいくつかの上皮細胞を含むいくつかの細胞型において基本的に発現する^２５。

「リンパ球機能関連抗原１」、「ＬＦＡ－１」、「α_Ｌβ_２インテグリン」または「ＣＤ１８／ＣＤ１１ａ」は、白血球インテグリンサブファミリーのメンバーを指す。ＬＦＡ－１はすべてのＴ細胞上で、ならびにＢ細胞、マクロファージ、好中球およびＮＫ細胞の上でも認められ、感染部位への動員に関与している。ＬＦＡ－１は、抗原提示細胞上のＩＣＡＭ－１へ結合し、接着分子として機能する。

本明細書で使用する場合、「Ｉドメイン」は、ＬＦＡ－１のα_Ｌサブユニットの挿入されたドメインまたはＩドメインを指し、ＬＦＡ－１へ結合するリガンドのアロステリックメディエーターである。Ｉドメインとは、ＩＣＡＭ－１の天然リガンドである。金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）として既知のＩドメインのリガンド結合部位は、Ｃ末端α７らせんによってアロステリックに調節される２つの異なる立体配座として存在する。野生型（ＷＴ）Ｉドメインは、１１４５アミノ酸長の成熟α_Ｌインテグリンサブユニットタンパク質（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２２００のアミノ酸残基２６～１１７０である）のアミノ酸残基１３０－３１０を包含する。本明細書で使用する場合のアミノ酸残基のすべての番号付けは、成熟したα_Ｌインテグリン（配列番号１）のアミノ酸配列を指し、ここで配列番号１の残基１は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２２００の配列の残基２６に相当する。

本明細書で使用する場合、「腫瘍抗原」は、その発現が癌を引き起こす抗原性を有する生物学的分子を意味する。

説明
本発明は、広範な腫瘍のバイオマーカーであるＩＣＡＭ－１の生理的リガンドであるＬＦＡ－１を用いて、ＩＣＡＭ－１を標的とする、キメラ抗原受容体を提供する。本発明者らは、ヒトＩドメインを含み、ＩＣＡＭ－１に対して１ｍＭ～１ｎＭの親和性を有する、親和性変異体ＣＡＲのパネルを構築した。本発明は、広範な抗腫瘍適用性を有するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲを提供する。ＩＣＡＭ－１を標的とするマイクロモルレベルの親和性を有するＩドメインを含むＣＡＲＴ細胞は、はるかに低い密度で正常細胞を節約しながら、標的抗原を過剰発現している細胞を溶解することができるので、従来のＣＡＲよりも改善された効能および安全性を有する。

本発明は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ｉ）リンパ球機能関連抗原１のα_ＬサブユニットのヒトＩドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインと、（ｉｖ）活性化ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体融合タンパク質を対象とする。

本発明のＣＡＲは、（ｉ）ＩＣＡＭ－１へ特異的に結合するヒトＩドメインを含む。ＩＣＡＭ－１に特異的なＩドメインは、ＬＦＡ－１由来のＩドメインを用いて構築することができる（図１Ａおよび１Ｂ）。Ｉドメイン中の種々の活性化点変異は、金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）として既知の領域を含む結合界面の外側に局在する（図１Ｂ）。１ｍＭ～１ｎＭのＩＣＡＭ－１に対するＩドメイン親和性の段階的上昇を含む変異体は、ＩＣＡＭ－１で被覆した表面、ビーズまたはセルに対するこれらの変異体のより高い結合について変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。例えば、異なる親和性の変異体は、酵母ディスプレイシステムを用いて単離することができる（Ｊｉｎら^２７を参照されたい）。親和性を表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）によってまず測定して、ＩドメインとＩＣＡＭ－１との１：１結合親和性を評価する。細胞上に発現したＣＡＲに対するＩＣＡＭ－１の親和性は、フローサイトメトリーおよびＬａｎｇｍｕｉｒの等温式を用いて測定することができる。同様に、遊離リガンドおよび細胞表面結合リガンド（この場合、放射性標識または蛍光標識したＩＣＡＭ－１）の量を測定することによって、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析を行って、ＣＡＲ親和性を推定することができる。

表１は、ＩＣＡＭ－１に対する野生型および変異体のＬＦＡ－１のＩドメインの測定された親和性を示す。大部分の変異は、疎水性のかさ高い側鎖（Ｆ、Ｌ、Ｉ）をより親水性（Ａ、Ｓ、Ｔ）へと変化させ、それによってよりコンパクトで低親和性のＩドメイン立体配座の構造を崩壊させる。例えば、Ｃ末端のα７らせんに位置するＰｈｅ－２９２の、Ａｌａ（Ｆ２９２Ａ）およびＧｌｙ（Ｆ２９２Ｇ）との置換は、それぞれ約２０μＭおよび０．１μＭの親和性（Ｋ_Ｄ）を提供する（表１）。Ｆ２９２ＧとＰｈｅ－２６５における他の同等に活性化型変異（Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ）との組み合わせは、６ｎＭの親和性を提供し、野生型（ＷＴ）Ｉドメイン（Ｋ_Ｄ＝１．５ｍＭ）よりもおよそ２００，０００倍高い（図１Ｃ）。Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２ＧのＣ末端α７らせんを開いた位置に固定するために（図１Ａ）、Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ変異体においてＧｌｙ－３１１をＣｙｓと置き換えて（Ｇ３１１Ｃ）（Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ／Ｇ３１１Ｃ、ダビング三重変異体（ＴＭ））、天然に不対のＣｙｓ－１２５とジスルフィド結合を形成することができる（表１）。それゆえ、ＩＣＡＭ－１に対する個々のＩドメイン変異体の一価の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、またはフローサイトメトリーによって推定されるように、およそ６桁の程度（約１ｎＭ～１ｍＭのＫ_Ｄ）に及ぶように設計することができる（図１Ｃ、表１）。表１中の変異体は、説明目的のためにあるのであって、本発明のＣＡＲはこれらの具体的な変異体に限定されない。他の変異を有し、１ｍＭ～１ｎＭのＩＣＡＭ－１に対する親和性を有する変異体は、当業者に既知の方法によって作製、検査および選択することができる。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、野生型ヒトＩドメイン、１～３個のアミノ酸変異を有する野生型ヒトＩドメインの変異体、または野生型Ｉドメインもしくはこの変異体の配列と少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％の同一性、もしくは少なくとも９７％の同一性、もしくは少なくとも９８％の同一性、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列であって、１ｍＭ以上の強さのヒトＩＣＡＭ－１の結合親和性を有する、Ｉドメインを含む。一実施形態において、変異体は、野生型Ｉドメインのアミノ酸残基２６５、２８８、２８９、２９２、２９５、３０９、または３１１において１つ以上の変異を有し得る。例えば、変異体は、野生型ＩドメインのＩ２８８Ｎ、Ｉ３０９Ｔ、Ｌ２９５Ａ、Ｆ２９２Ａ、Ｆ２９２Ｓ、Ｌ２８９Ｇ、Ｆ２９２Ｇ、Ｆ２６５Ｓ、Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ、またはＦ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ／Ｇ３１１Ｃのうちの１つ以上の変異を有し得る。一実施形態において、２つのＩドメイン変異を組み合わせることにより、それぞれの親変異体よりも高い親和性を有する変異体が生じる。例えば、約１００μＭのＫｄをそれぞれ有する２つの変異体を組み合わせることにより、典型的には約１～約１０μＭのＫｄ範囲を有する変異体が生じる。Ｆ２９２Ｇは非常に強力な点変異であり、Ｆ２９２Ｇを他の変異と組み合わせると、ＩＣＡＭ－１に対するＩドメイン親和性が１００ｎＭのＫｄよりも高くなる。上述のアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１の成熟アミノ酸配列に関するものであり、残基番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２２００のアミノ酸残基２６に相当する。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、１ｍＭ～１ｎＭのＫｄ、好ましくは１～２００μＭのＫｄまたは１～２０μＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１を結合させるＩドメインを含む。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、約１２０ｎＭ～約１ｎＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えばＦ２９２Ｇ、Ｆ２６５Ｓ、Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ、およびＦ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ／Ｇ３１１Ｃを含む。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、約２０μＭ～約１２０ｎＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えばＦ２９２Ａ、Ｆ２９２Ｓ、およびＩ２８９Ｇを含む。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、約２００μＭ～約２０μＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えばＩ２８８Ｎ、Ｉ３０９Ｔ、Ｌ２９５Ａ、およびＦ２９２Ａを含む。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、約１μＭ～約１００μＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えばＬ２９６Ａ、Ｆ２９２ＡおよびＦ２９２Ｓを含む。

一実施態様において、本発明のＣＡＲは、約１ｍＭ～約２００μＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えば野生型およびＩ２８８Ｎを含む。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、約１ｍＭ～約１００μＭのＫｄの親和性でＩＣＡＭ－１へ結合するＩドメイン、例えば野生型、Ｉ２８８Ｎ、およびＩ３０９Ｔを含む。

上述の実施形態における親和性は、溶液中のＩドメインとＩＣＡＭ－１との相互作用を指す。

ＣＡＲ構造においてヒトＩドメインを使用する１つの利点は、ヒトＩドメインがマウスＩＣＡＭ－１をヒトＩＣＡＭ－１と同程度の親和性で結合させることである（それぞれ２ｎＭ対６ｎＭ）。ヒトＩＣＡＭのマウス相同体との交差反応性により、ヒト腫瘍異種移植片を有する前臨床マウスモデルにおいて、オンターゲットオン腫瘍効能と同時にＩドメインＣＡＲＴ細胞のオンターゲットオフ腫瘍毒性の試験が可能となる。これは、前臨床モデルにおいて臨床毒性を予測する上でのヒトＩドメインの利点である。対照的に、Ｒ６．５ｓｃＦｖ（マウスハイブリドーマクローンＲ６．５３３由来）は、ヒトＩＣＡＭ－１について１０ｎＭのＫｄを有する（表１）が、マウスＩＣＡＭ－１とは交差反応しない。

本発明のＣＡＲは、（ｉｉ）膜にまたがる膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然ポリペプチドに由来してもよく、または人工的に設計されてもよい。天然ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質から得ることができる。例えば、Ｔ細胞受容体α鎖もしくはβ鎖、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。人工的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主として含むポリペプチドである。好ましい実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８またはＣＤ８に由来し、これらは良好な受容体安定性を与える。

本発明のＣＡＲは、（ｉｉｉ）ヒトＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、およびＧＩＴＲ（ＡＩＴＲ）からなる群より選択される１つ以上の共刺激ドメインを含む。実施形態において、ＣＡＲはＣＤ２８および４－１ＢＢの２つの共刺激ドメインを含む。

エンドドメイン（活性化ドメイン）は、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ＺまたはＣＤ３ζ）のそれである。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞へ伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に応答能のある活性化シグナルを提供しないことがあり、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされることがある。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するために１つ以上の共刺激ドメインをＣＤ３－ゼータとともに使用することができる。

本発明のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞内で発現する場合、新成タンパク質が小胞体に向けられ、その後、細胞表面へと向けられ、そこで発現するように、ＩドメインのＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドのコアは、単一のアルファへリックスを形成する傾向を有する長鎖疎水性アミノ酸を含有し得る。シグナルペプチドはアミノ酸の正に帯電した短鎖で始まることができ、これは、転位の間にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのを助ける。シグナルペプチドの末端には、典型的にはシグナルペプチダーゼによって認識され切断されるアミノ酸鎖がある。シグナルペプチダーゼは、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成するために、転位の完了中または完了後のいずれかで切断し得る。遊離シグナルペプチドは次に特異的プロテアーゼにより消化される。一例として、シグナルペプチドは、シグナルペプチドが依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能することを条件として、ヒトＣＤ８もしくはＧＭ－ＣＳＦ、または１もしくは２個のアミノ酸変異を有するそれらの変異体に由来し得る。

本発明のＣＡＲは、Ｉドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのヒンジとしてスペーサー配列を含み得る。可撓性のあるスペーサーは、腫瘍抗原への結合を可能にするために結合ドメインが異なる方向に向くことを可能にする。スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８柄、またはそれらの組み合わせを含み得る。ヒトＣＤ２８またはＣＤ８柄が好ましい。

本発明は、上述のＣＡＲをコードする核酸を提供する。ＣＡＲをコードする核酸は、指定したＣＡＲのアミノ酸配列から従来法により調製することができる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、それぞれのドメインのアミノ酸配列について、上述のＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑＩＤまたはＧｅｎＢｅｎｋの受入番号から得ることができ、本発明の核酸は、標準的な分子生物学的および／または化学的手順を用いて調製することができる。例えば、塩基配列に基づいて核酸を合成することができ、本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてｃＤＮＡライブラリーから得られるＤＮＡフラグメントを組み合わせることによって調製することができる。

本発明のＣＡＲをコードする核酸は、ベクターへと挿入することができ、このベクターは細胞へと導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコアレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および擬似型ベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルスベクター、ワクシニアウイルスまたはセンダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターのようなウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしては、感染細胞内で自己複製しないように複製能を欠いているウイルスベクターが好ましくは使用される。

例えば、レトロウイルスベクターを使用する場合、そのベクターが有するＬＴＲ配列およびパッケージングシグナル配列に基づいて、適切なパッケージング細胞を選択し、そのパッケージング細胞を用いてレトロウイルス粒子を調製することにより本発明の方法を実施することができる。パッケージング細胞の例としては、ＰＧ１３（ＡＴＣＣＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２、ならびにＰｓｉ－Ｃｒｉｐが挙げられる。高いトランスフェクション効率を有する２９３細胞または２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を調製することもできる。レトロウイルスとレトロウイルスベクターのパッケージングに使用することができるパッケージング細胞とに基づいて産生される多くの種類のレトロウイルスベクターが、多くの企業から広く市販されている。

本発明は、上述のようにＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を提供する。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲのＩドメインを介してＩＣＡＭ－１へ結合し、それにより細胞内にシグナルが伝達され、その結果、細胞が活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類およびＣＡＲの細胞内ドメインによって異なり、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖速度の向上、細胞表面分子の変化、標的細胞を殺滅することなどに基づいて、指数として確認することができる。

Ｉドメイン－ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、疾患のための治療薬として使用することができる。治療薬は、Ｉドメイン－ＣＡＲ有効成分として発現するＴ細胞を含んでおり、さらに適切な賦形剤を含んでいてもよい。賦形剤の例としては、当業者に既知の医薬として許容され得る賦形剤が挙げられる。

本発明はさらに、癌を治療するための養子細胞療法の方法を提供する。この方法は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞を癌に罹患している対象へ投与するステップを含み、ここで対象の癌細胞はＩＣＡＭ－１を過剰発現し、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞は癌細胞へ結合して癌細胞を殺滅する。「過剰発現する」は、本明細書で使用する場合、癌細胞が細胞１個あたり少なくとも１０^５個の分子のＩＣＡＭ－１の表面発現を有することを指す。一実施形態において、ＣＡＲは、約１～約１０００μＭ、好ましくは約１～約２００μＭ、または約１～約２０μＭのＩＣＡＭ－１に対する親和性を有するＩドメインを含む。本発明によって治療されるのに適した癌には、甲状腺癌、胃癌、膵癌、および乳癌が含まれるが、これらに限定されない。

様々なレベルの抗原発現を有する標的細胞と同時に、１０^６倍の範囲にわたって段階的に及ぶＣＡＲ親和性を機能的に調べることによって、試験管内でおよび生体内でＴ細胞の有効性に対するＣＡＲ親和性および抗原密度の影響を系統的に検討した。ＣＤ２５、サイトカイン放出、および細胞毒性によって測定される試験管内でのＴ細胞活性化状態は、親和性および標的抗原密度に依存し、結果的に、ＣＡＲ親和性および抗原密度の増大とともにより強力なＴ細胞活性化および標的殺滅に至った。ナノモルレベルの親和性のＣＡＲＴ細胞（ＴＭ、Ｆ２９２Ｇ）の活性化閾値は、マイクロモルレベルの親和性のＣＡＲＴ細胞（Ｆ２９２Ａ）と比較して抗原密度に関して依存性が低く、１０^４個の分子／１個の細胞という低い抗原密度に反応した。対照的に、Ｆ２９２ＡＣＡＲＴ細胞は１０^５個の分子／１個の細胞未満の標的抗原を発現する細胞を溶解する能力を急速に失った。ミリモルレベルの親和性のＣＡＲＴ細胞（ワイドタイプ、ＷＴ）は、低～中等度のレベルの抗原を有する標的細胞に対してほとんど反応性がなく、検出可能な活性化、サイトカイン放出、および標的溶解が生じるために、１０^６個の分子／１個の細胞の閾値抗原密度を必要とした。

表２は、特定のＩＣＡＭ－１抗原密度を有する細胞を標的とするための、ＩＣＡＭ－１に対するＩドメイン含有ＣＡＲＴ細胞の所望の親和性の範囲を示す。

試験管内でのＣＡＲ親和性と抗腫瘍効力との間にある定量的調和は、定量的な生体内での観察と一致しておらず、それにより、マイクロモルレベルの親和性（１～２００μＭまたは１～２０μＭ）のＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞は、腫瘍部位での増殖速度、腫瘍根絶率、腫瘍再発の頻度、およびオンターゲットオフ腫瘍毒性のレベルによって測定されるように、より高い親和性のＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞よりも優れている。

ＩドメインＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫ細胞がマウスＩＣＡＭ－１と交差反応する能力は、ヒト腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－ＮＫの有効性、および健常組織上のマウスＩＣＡＭ－１に対するオンターゲットオフ腫瘍毒性の厳密かつ同時の評価を可能にする。Ｔ細胞上でのレポーター遺伝子、ヒトソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、およびＩドメインＣＡＲの同時発現とそれに続く縦断的位置放射断層撮影（ＰＥＴ）法によって、養子移入Ｔ細胞の生体内での時空間マッピングを達成することができる。

最高親和性（ＴＭ）ＣＡＲＴ細胞で処置したマウスにおける一様な致死率、より多量の腫瘍量を有するＦ２９２ＧＣＡＲ処置マウスにおいて観察された毒性率の増大、およびマイクロモルレベルの親和性のＦ２９２ＡＣＡＲＴ細胞を用いた処置後の検出可能な毒性の欠如によって実証されているように、毒性の開始はＣＡＲ親和性および腫瘍量に依存するようである。

高親和性変異体（約１２０ｎＭ～１ｎＭ）を含むＣＡＲは高い効力を有し、このＣＡＲは細胞１個当たり１０^４未満という低いＩＣＡＭ密度でＴ細胞を結合させることができる。

マイクロモルレベルの範囲（例えば、約１～２００μＭのＫｄ）の親和性を有するＣＡＲは、正常組織において基本的に発現する抗原に対するオフ腫瘍毒性を最小限にし、またナノモルレベルの範囲の親和性を有するＣＡＲ（例えば、約１～２００ｎＭのＫｄ）と比較して治療指数を高める。マイクロモルレベルの範囲の標的親和性を有するＣＡＲＴ細胞は、高い標的発現を有する腫瘍組織に対する効力の増大および長期的な有効性を同時に呈しながら、基本的な抗原発現を有する健常組織の標的化を回避することができる。マイクロモルレベルの親和性のＣＡＲ（Ｆ２９２Ａ－Ｉドメインなど）は、Ｔ細胞が、未分化甲状腺腫瘍が健常組織を典型的には超えない閾値である１０^５個の分子／１個の細胞を下回って発現する組織を無視することを可能にする。ナノモルレベルの親和性のＣＡＲＴ細胞（例えば、ＴＭ、Ｆ２９２Ｇ、およびＲ６．５ＣＡＲ）による標的抗原の関与は、ＴＣＲとｐＭＨＣとの間に本来認められる相互作用の一過性かつ動的な性質から逸脱して、不自然に低い解離速度をもたらし得る^４８。ＣＡＲによる高親和性および結合活性の相互作用は、Ｔ細胞が連続的に殺滅する傾向を低下させ、消耗または、活性化誘導性細胞死に対する感受性の上昇を引き起こすことができる^４９。ＩＣＡＭ－１に対してナノモルレベルの親和性を有するＣＡＲＴ細胞は作用しているかもしれないが、このＣＡＲＴ細胞は至適レベルを下回って作動している可能性があり、消耗および過剰なサイトカイン放出をより受けやすく、最終的にオフ腫瘍毒性または腫瘍再発を促進し得る。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は、単に本発明を説明するよう企図されており、本発明を限定するものとして解釈されることにはなっていない。

材料および方法
実施例１．細胞株および初代ヒトリンパ球
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）はＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌから入手し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＡｔｌａｎｔａＢｉｏｌｏｇｏｃａｌｓ）、１０ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ）、１μｇ／ｍｌのヒドロコルチソーム（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、および１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト表皮成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＭＣＤＢ１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。マウス脳微小血管内皮細胞（ｂＥｎｄ．３、ＡＴＣＣ）を、４ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍｌのＰｅｎ－ｓｔｒｅｐ、および１０％のＦＢＳを補充した応用Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＡＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００単位／ｍｌのＰｅｎ－ｓｔｒｅｐを含有するＡＤＭＥＭ中で培養した。８５０５Ｃ細胞（ＤＳＭＺ）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００単位／ｍｌのＰｅｎ－ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＨＭＥＣ－１、ｂＥｎｄ．３、ＨｅＬａ、および８５０５ｃ細胞に、ホタルルシフェラーゼ－Ｆ２Ａ－ＧＦＰをコードするレンチウイルス（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を形質導入し、蛍光に基づいて分類した。

ヒト末梢血は、静脈穿刺によって健常ボランティアドナーから得た。末梢血単核球を、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離し、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、および３０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２（ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したＯｐｔｉｍｉｚｅｒＣＴＳＴ細胞増量ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）（Ｔ細胞培地）中で培養した。非接着細胞を２４時間後に除去し、２：１のビーズ対Ｔ細胞比でＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増量剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＴ細胞を濃縮した。続いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ結合Ｔ細胞をＩＬ－２含有培地中で１×１０^６個／ｍｌの密度で培養した。すべの細胞を５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。

実施例２．ＩドメインＣＡＲベクターの構築
ＩＣＡＭ－１に対して様々な親和性のＬＦＡ－１のＩドメインをコードする遺伝子配列は、先行研究^２７から得られた。Ｉドメイン変異体は、ＣＤ８ヒンジと、ＣＤ２８膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ３ζの細胞質ドメインを組み込んだ第３世代ＣＡＲ構造の細胞内部分とに直接的にＣ末端で融合した。次いで、完全なＣＡＲインサートをｐＬｅｎｔｉ骨格へとサブクローニングした^２９。ＣＡＲＴ細胞撮像のためのレポーター遺伝子であるＳＳＴＲ２を、「リボソームをスキップする」ブタテッショウウイルス（ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ）－１２Ａ（Ｐ２Ａ）配列を用いてＮ末端のＩドメインに連結して、同じｍＲＮＡからのＣＡＲおよびＳＳＴＲ２の同程度の産生を確実にした。

実施例３．Ｔ細胞のレンチウイルス産生および形質導入
レンチウイルスは、リン酸カルシウムを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって産生した。簡潔には、１０μｇの伝達遺伝子、７．５μｇのｐＣＭＶ－ｄＲ８．２（Ａｄｄｇｅｎｅ）および５μｇのｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を混合し、２ＭのＣａＣｌ_２、次いで２×ＨＢＳＳとともにインキュベートした。得られた溶液を、１０ｍｌのＤＭＥＭ中に３．２×１０^６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４時間前に播種しておいた１０ｃｍ^２の細胞培養皿へ滴下した。トランスフェクション培地を６時間後に交換した。レンチウイルスを含有する培地をトランスフェクションの４８時間後および７２時間後に収集し、０．４５μｍフィルターで濾過し、４℃、７５，０００×ｇで２時間の超遠心分離により濃縮した。次に、レンチウイルスを血清含有培地中に再懸濁し、－８０℃で凍結した。活性化の２４～７２時間後に、ヒトＴ細胞に抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、スピン感染（１，０００ｇ、３２℃で１時間）またはレンチウイルスとの一晩のインキュベーションのいずれかにより形質導入した。Ｔ細胞を初回の形質導入の２４時間後にもう一度形質導入した。形質導入中および形質導入後、ＩＬ－２を含有する培地を、ヒトＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と交換した。ジャーカットＴ細胞をレンチウイルスとの単回の一晩のインキュベーションにより形質導入した。

実施例４．試験管内標的細胞殺滅アッセイ
ＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現するように安定して形質導入された２×１０^５個の標的細胞（ＨＭＥＣ－１、ｂＥｎｄ．３、ＨｅＬａ、および８５０５ｃ）を、非形質導入型またはＩドメインＣＡＲＴ細胞とともに、様々なエフェクター対標的比（Ｅ：％）で共培養した。ある特定の条件において、ＩＣＡＭ－１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、＃ｓｃ－４０００９８）を用いて８５０５Ｃ細胞中で破壊された（８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１として示す）か、あるいは８５０５Ｃ細胞を１μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｏ２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）へ１２時間曝露して、ＩＣＡＭ－１の過剰発現を誘導した（８５０５Ｃ／ＬＰＳと示す）。共培養は、１５０μｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリン（ＧｏｌｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有しかつサイトカイン補充のないＴ細胞培地中で行った。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯ）を用いて発光を測定し、それぞれのＥ：Ｔ条件での読み取りを、非形質導入Ｔ細胞：標的共培養対照に対して正規化した。

実施例５．８５０５Ｃマウスモデル、全身腫瘍撮像、および血清サイトカイン分析
７．５×１０^５個の８５０５Ｃ細胞を、尾静脈を介してＮＳＧマウスへと注射した。腫瘍細胞注射の８～１０日後に、１～３×１０^６個のＴ細胞を、尾静脈を介して注射した。異種移植後最長１０日間、同様のＣＡＲ投与量を用いて腫瘍の除去を実証したＲ６．５ＣＡＲＴ細胞を用いた従来の研究に基づいて注射のタイミングを選択した^２９。生きているマウスにおける腫瘍異種移植片の発光撮像は、全身光学撮像装置（Ｉｎ－ＶｉｖｏＥｘｔｒｅｍｅ、Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて行った。マウスを２Ｌ／分のＯ_２中２％イソフルランで麻酔した。腫瘍量は、胸腔およびマウスの全身にわたる発光の積分によって定量化した。血清サイトカイン分析のために、５０～１００μｌの血液を、尾静脈を介して氷上のエッペンドルフチューブへと回収した。４℃で１０分間、２，０００ｇで遠心分離することによって細胞ペレットを除去した後、血漿を直ちに単離し、－８０℃で保存した。製造元の説明書により、Ｂｉｏ－ＰｌｅｘＭＡＧＰＩＸ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてヒトサイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＣＸＣＬ１０）を２つ組で測定した。

実施例６．生体外細胞分析
腫瘍異種移植片を適切な時点でマウスから摘出した。摘出した腫瘍をさいの目に切って８０μｍセルストレーナーに流して単細胞懸濁液を得た。赤血球を１×ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とのインキュベーションにより溶解した。残存細胞を洗浄し、２％正常ヤギ血清を含有する１×ＨＢＳＳ中に再懸濁し、２μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧで１０分間ブロッキングした。これに続いて、２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ３－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または２μｇ／ｍｌのウサギ抗ｃ－ｍｙｃ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）との組み合わせにおける１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた染色を行った。結果として生じる細胞をＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）で取得した。初期フローサイトメトリーゲートは、生細胞ゲート処理（ヨウ化プロピジウム陰性）に基づいて決定した。

実施例７．ＩＣＡＭ－１およびＣＡＲ発現の定量化
ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ）から得たマウス抗ヒトＲ６．５モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、種々の細胞株におけるＩＣＡＭ－１発現を測定した。Ｔ細胞上のＩドメインＣＡＲ発現は、２μｇ／ｍｌのウサギ抗ｃ－ｍｙｃ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて検出した。ＩドメインジャーカットＴ細胞変異体を、ヒトＦｃγに融合した１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＩＣＡＭ－１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、１μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＰＥ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に再懸濁した後、フローサイトメトリー分析を行った。

実施例８．ＩＦＮ－γの試験管内での測定
標的細胞を洗浄し、サイトカインを含まないＴ細胞培地中に１×１０^６個／ｍｌで懸濁した。１００μｌのそれぞれの標的細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へ３つ組で入れた。Ｔ細胞培地中に５×１０^６個／ｍｌで再懸濁したＴ細胞を適切なウェル中で標的細胞と組み合わせた。プレートを３７℃で２４～４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上清をＥＬＩＳＡのために回収してＩＦＮ－γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を検出した。

実施例９．ＣＤ２５およびＣＤ６９染色
ＩドメインＣＡＲで改変したジャーカット細胞を、９６ウェルプレート中で１：１のエフェクター対標的の比（１×１０^５個のエフェクター：１×１０^５個の標的）で標的細胞と共培養した。プレートを３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄した後、氷上で３０分間、２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２５－アロフィコシアニン（ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。インキュベーション後、試料を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ＩＣＡＭ－１発現細胞に対する代替物として、本発明者らは、既知量のＩＣＡＭ－１でコーティングしたマイクロビーズも使用した。１×１０^６個の硫酸塩ラテックスマイクロビーズ（８μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｃｙ５．５（Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５ＮＨＳエステル、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）と結合した指示量のヒトまたはマウス組換えＩＣＡＭ－１－Ｆｃγ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を含有する１００μＬのＰＢＳ中に、室温で一晩緩徐に混合しながら再懸濁した。タンパク質標識粒子をペレット化し、０．１ＭグリシンｐＨ７．４を含有する新鮮なＰＢＳ中に１時間再懸濁し、その間上清を使用して、蛍光によるビーズ吸着効率を測定した（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯ）。グリシンを用いたビーズ表面の飽和の後、ビーズをペレット化し、５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。それぞれのＩドメインＣＡＲ変異体で改変したジャーカット細胞を、ＩＣＡＭ－１結合ラテックスビーズとともに１：３（細胞：ビーズ）の比で、３７℃で一晩インキュベートした。次いで細胞を収集し、フローサイトメトリーによる分析のために２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ６９－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。

実施例１０．Ｖ底接着アッセイ
Ｖ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、マウスもしくはヒトＩＣＡＭ－１－Ｆｃγ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）または２％ＢＳＡのいずれかで４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを２％ＢＳＡで、３７℃で１時間ブロッキングした。製造元のプロトコルにより、ＩドメインＣＡＲＴクローンをまずＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅで染色し、次いで５ｍＭのＭｇＣｌ_２および１％ＢＳＡを含有する５０μｌのＰＢＳ中のＩＣＡＭ－１でコーティングしたウェルへ入れた。プレートを直ちに室温で１５分間、２００ｇで遠心分離した。Ｖ底プレートの底に蓄積した非接着細胞を蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ＰＲＯ）により定量した。ＩＣＡＭ－１への細胞結合を実験測定の蛍光強度値（Ｆ_ＣＡＲおよびＦ_ＮＴ）から計算し、ＢＳＡ単独でコーティングしたウェルからの蛍光（Ｆ_ＢＳＡ）に対して正規化した：１００×（（Ｆ_ＢＳＡ－Ｆ_ＣＡＲ）／Ｆ_ＢＳＡ）／（（Ｆ_ＢＳＡ－Ｆ_ＮＴ）／Ｆ_ＢＳＡ）。

実施例１１．^１８Ｆ－ＮＯＴＡ－オクトレオチド（ＮＯＴＡＯＣＴ）の標識
ＮＯＴＡＯＣＴ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸－オクトレオチド^３０、ＧＭＰ等級）を１ｍｇの凍結乾燥粉末（カタログ番号９７６２、ＡＢＸＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として得た。ＮＯＴＡＯＣＴバイアル内容物を１８ＭＷの水で２００μｌ（５ｍｇ／ｍｌ溶液）へ希釈し、ストック溶液として４℃で保存した。フッ素－１８^３１を用いたＮＯＴＡのキレート化のために、５μｌのＮＯＴＡＯＣＴを１０μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、６μｌの２ｍＭＡｌＣｌ３、および約３０ｍＣｉの^１８Ｆを含有する１００μｌへ添加した。溶液を直ちに１００℃のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れ、１５分間インキュベートした後、室温へ冷却し、１５ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中に希釈した。Ｓｅｐ－ＰａｋｌｉｇｈｔＣ１８カラムを３ｍｌの１００％エタノール中で再生し、毎分１０滴の観察された流量で５ｍｌのｄｄＨ_２Ｏ中で２回洗浄した。次に、ＮＯＴＡＯＣＴをＳｅｐ－Ｐａｋカラムへ負荷し、これを後で１５ｍｌの１８ＭＷの水中で洗浄して、いかなる残存遊離^１８Ｆも除去した。捕捉されたＮＯＴＡＯＣＴを３００μｌのエタノールを用いてカラムから溶出し、注射用ＰＢＳで１．５ｍｌに希釈し、最終生成物を約１５％エタノール等張注射用溶液中に提供した。溶離液を０．２μｍフィルターで濾過した。最終生成物の純度を逆相ＨＰＬＣにより確認した。

実施例１２．ＰＥＴ／ＣＴ撮像
登録されたＣＴ画像は、ＮＯＴＡＯＣＴ注射の１～２時間後にマイクロＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｉｎｖｅｏｎ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して取得した。投影データは、１度の角度増分でおよそ１秒のステップで、コーンビーム形状で取得した。２５０～７５０ｋｅＶのエネルギーウィンドウおよび６ナノ秒の調時ウィンドウを使用して、１回の試験につき少なくとも１０００万件の同時事象をＰＥＴについて取得した。生体内でのＮＯＴＡＴＯＣ取り込みの定量化のために、１００μｌの１０％ＩＤ／ｃｍ^３当量を含有する参照チューブ。マウス肺内でのＮＯＴＡＯＣＴ取り込みを計算するために、楕円形を肺の左右両側に個別に描いて、それらの足跡の大部分を囲んだ。参照チューブに得られた計数に対して計算した％ＩＤ／ｃｍ^３値は、％ＩＤ／ｃｍ^３を４で除することによって標準的な取り込み値（ＳＵＶ^３２）へ近似して、１００％の注射効率および体重２５ｇを想定した。ＰＥＴ／ＣＴ画像の可視化および解析は、ＡＭＩＤＥソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ａｍｉｄｅ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いて行った。

実施例１２．組織学的特徴
安楽死の後、マウスの肺に気管を介して４％パラホルムアルデヒドを灌流し、５つの葉のそれぞれを固定後に分離してパラフィン中に包埋した。組織を切断して５μｍの切片を作製した（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、Ｌｅｉｃａ）。パラフィン包埋切片を、ＣＤ３およびＧＦＰの免疫染色のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはヘマトキシリンのみで染色した（ＨｉｓｔｏＷｉｚ，Ｉｎｃ．により実施）。組織学的解析は経験豊富な病理学者によって行われた。

結果
統計解析
示されたデータにＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定、および対応のないスチューデントのｔ検定を行った。

実施例１３．親和性が１０^６倍に段階的に変動するＩＣＡＭ－１特異的ＣＡＲＴ細胞
ＩＣＡＭ－１に特異的なＣＡＲ構築物は、Ｊｉｎら^２７および米国特許第８，０２１，６６８号により、ＬＦＡ－１由来のＩドメインを用いて構築した（図１Ａ～Ｂ、表１）。

変異体Ｉドメインの親和性が、ＣＡＲの親和性と相関するかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびジャーカットＴ細胞をＴＭ、Ｆ２９２Ｇ、Ｆ２９２Ａ、またはＷＴのＩドメインを含有する第３世代ＣＡＲをコードするレンチウイルスを形質導入し、ＩＣＡＭ－１の結合についてアッセイした。ｍｙｃタグをそれぞれのＩドメイン変異体のＮ末端へ付加して、ＣＡＲ発現の測定を支援した（図１Ｄ～Ｅ）。ジャーカットＴ細胞における内在性ＬＦＡ－１への背景のＩＣＡＭ－１結合を回避するために、ＩＣＡＭ－１に対するＣＡＲ親和性を、ＩドメインＣＡＲ形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて概算した。ＩドメインＣＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への組換えヒトＩＣＡＭ－１の結合のレベルは溶液親和性測定と相関しており、ＴＭが最も強い結合を呈し、それにＦ２９２ＧおよびＦ２９２Ａが続き、非形質導入（ＮＴ）Ｔ細胞と比較してＷＴへの検出可能な結合はなかった（図１Ｆ）。ＩＣＡＭ－１に対する差次的ＣＡＲ親和性およびマウスＩＣＡＭ－１との交差反応性も、組換えヒトまたはマウスＩＣＡＭ－１でコーティングしたＶ底プレートへの細胞接着を測定することによって調べた（図１Ｇ）。ＴＭおよびＦ２９２ＧのＣＡＲを形質導入したジャーカット細胞は、非形質導入細胞と比較して、ヒトおよびマウスの両ＩＣＡＭ－１への高レベルの結合を実証した。しかしながら、ＷＴＩドメイン発現対応物と比較してＦ２９２ＡＣＡＲ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への組換えＩＣＡＭ－１の結合の増大にもかかわらず（図１Ｆ）、Ｆ２９２ＡＣＡＲ－ジャーカット細胞はＮＴまたはＷＴのＩドメイン発現細胞と比較して、プレート結合ＩＣＡＭ－１への任意のさらなる結合を欠いていた（図１Ｇ）。Ｆ２９２Ｇに匹敵する可溶性ＩＣＡＭ－１結合を実証したＦ２６５ＳＩドメインの場合（１４５ｎＭ対１１９ｎＭ、表１）、Ｆ２６５ＳＣＡＲＴ細胞は、上昇した結合がマウスＩＣＡＭ－１にとってより明白であったのに対し、プレートに結合したヒトＩＣＡＭ－１への任意のさらなる結合を実証し損ねた。予想したように、ヒトＩＣＡＭ－１にのみに特異的であるＲ６．５ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞は、ヒトＩＣＡＭ－１への結合上昇を呈したが、マウスＩＣＡＭ－１への結合上昇は呈さなかった（図１Ｇ）。

実施例１４．試験管内でのＣＡＲＴ細胞活性化に及ぼすＣＡＲ親和性および標的抗原密度の影響
ＩドメインＣＡＲを発現するジャーカットＴ細胞を用いて、ＣＡＲＴ細胞活性化が標的細胞におけるＣＡＲ親和性およびＩＣＡＭ－１抗原密度によって影響を受ける程度を調べた。ジャーカットＴ細胞を、異なるＩＣＡＭ－１発現レベルを有する種々の標的細胞株とともにインキュベートした。標的細胞株のＩＣＡＭ－１表面密度は、まず標的細胞株へ結合する抗ＩＣＡＭ－１抗体のレベルをアッセイし、これらのシグナルを、Ｃｙ５．５と結合した既知量のＲ６．５抗体（ビーズ１個当たり１０^３～１０^７の抗体）とカップリングした８μｍのラテックスビーズを用いて得られたシグナルと比較することによって調べた。非標識の（灰色）からＲ６．５（黒色）とともにインキュベートした後のシフトのレベルを使用して、それぞれの指示された標的細胞株におけるＩＣＡＭ－１密度を推定した。

標的細胞のパネルには、以下が含まれる：それぞれ生理的レベルのＩＣＡＭ－１（細胞１個当たり約１０^４分子）を有する健常なヒトおよびマウスの細胞を提示するＨＭＥＣ－１およびｂＥｎｄ．３、中程度のレベル（細胞１個当たり約１０^５）を発現する未分化甲状腺癌（８５０５Ｃ）、高レベルのＩＣＡＭ－１（細胞１個当たり約１０^６）を発現する子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞株。さらなる比較のために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９仲介性ＩＣＡＭ－１遺伝子不活性化を有する８５０５Ｃ（８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１）およびＩＣＡＭ－１発現を上方調節するためにＬＰＳで処理した８５０５Ｃ（８５０５Ｃ／ＬＰＳ）を含めた。表３は、本明細書で使用した標的細胞におけるＩＣＡＭ－１部位密度を要約する。

標的細胞との相互作用の際のＣＡＲＴ細胞の活性化は、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体α）およびＣＤ６９の発現を測定することによって調べた。ジャーカットＣＡＲＴ細胞（ＷＴ、Ｆ２９２Ａ、Ｆ２９２Ｇ、およびＴＭ）におけるＣＤ２５発現を、異なる標的細胞株との２４時間の共インキュベーション後に調べた（ｎ＝３～４）。ＣＤ６９は、１０^６個の組換えヒトＩＣＡＭ－１－Ｆｃ分子でコーティングしたラテックスビーズとのインキュベーション後に誘導した。ＣＤ２５レベルの上昇は、ＬＰＳ刺激８５０５Ｃとインキュベーション後のＷＴＩドメインＣＡＲＴ細胞で観察されたが、より低レベルのＩＣＡＭ－１を発現する他の細胞株とのインキュベーションでは観察されなかった。対照的に、高親和性ＴＭＣＡＲＴ細胞を高ＩＣＡＭ－１発現細胞、ならびに基線レベルのＩＣＡＭ－１を発現するＨＭＥＣ－１細胞およびｂＥｎｄ．３細胞とともにインキュベートしたとき、ＣＤ２５発現の上昇が見られた。ＩＣＡＭ－１発現を欠く標的細胞（８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１）とのインキュベーション後のＴＭＣＡＲＴ細胞上で、低レベルのＣＤ２５発現が検出され、これはおそらく、ＴＭＣＡＲとジャーカット細胞上のＩＣＡＭ－１の基線レベルの発現（約１０^４分子／個）との分子相互作用によって仲介される同型細胞接触によるものである。Ｆ２９２Ｇを発現するＴ細胞は、８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１との共インキュベーション後にＣＤ２５発現が背景レベルに近いことを除いて、ＴＭと同様に挙動した。マイクロモルレベルの親和性のＦ２９２ＡＴ細胞は、８５０５Ｃおよび８５０５Ｃ／ＬＰＳ細胞とのインキュベーションの際にのみ、ＣＤ２５発現の上昇を示す選択的活性化を実証した。これは、Ｆ２９２ＡＣＡＲＴ細胞活性化のために、細胞１個あたり１０^５個超のＩＣＡＭ－１分子の閾値標的抗原密度が必要であったことを示している。ＣＤ２５のＩＣＡＭ－１密度依存的活性化とは対照的に、ＣＤ６９の発現上昇は、標的細胞の非存在下でさえ観察され、発現レベルは、ＩＣＡＭ－１に対するＣＡＲ親和性と密接に整合しており、これは、ＩＣＡＭ－１でコーティングしたラテックスビーズとのインキュベーションによってさらに増強されることはなかった。ＣＤ２５と比較して、ＣＤ６９誘導は、活性化のためのより低レベルの抗原密度閾値を必要としているようであり、これはＣＡＲＴ細胞間の同型相互作用によって提供された。

実施例１５．試験管内でのＣＡＲＴ細胞の細胞毒性に及ぼすＣＡＲ親和性および標的抗原密度の影響
ＣＡＲ改変ジャーカットＴ細胞の親和性および抗原依存的活性化を検証した後、試験管内での初代Ｔ細胞の活性化および細胞毒性に及ぼすＣＡＲ親和性および抗原密度の影響を調べることを試みた。初代Ｔ細胞にＴＭ、Ｆ２９２Ａ、Ｆ２９２Ｇ、およびＷＴＩドメインのＣＡＲを形質導入し、種々の標的細胞へ添加してそれらの試験管内での細胞毒性の有効性を測定した。全体として、標的細胞溶解速度とすべのＩドメイン変異体ＣＡＲＴ細胞にわたるＩＣＡＭ－１発現（ＨｅＬａ＞８５０５Ｃ／ＬＰＳ＞８５０５Ｃ＞ＨＭＥＣ－１＞ｂＥＮＤ．３）との間には正の相関があった（図２Ａ）。Ｔ細胞がＩＣＡＭ－１に対してより高い親和性を有するＣＡＲを発現したとき、殺滅速度もより大きかった（ＴＭ＞Ｆ２９２Ｇ＞Ｆ２９２Ａ＞ＷＴ）。

親和性変異体ＣＡＲＴ細胞による殺滅の有効性を定量的に比較するために、可変傾斜シグモイド曲線（生存率（％）＝１００／［１＋１０^{（ｔ－τ＿５０％）＊傾斜}］）を用いて、５０％殺滅（τ＿５０％）およびヒル傾斜を達成するのに必要とされる時間を説明する最適値を見つけた（図２Ｂ）。５０％の標的殺滅までの時間は、同じＣＡＲＴ細胞について、より低い親和性のＣＡＲＴ細胞か、またはより低い抗原密度のいずれかでより長かった。ＣＡＲＴ細胞による標的殺滅の速度に対応するヒル傾斜は、同じ標的細胞に対する親和性の増大とともにより高かった（より低いＫｄ）。ヒル傾斜はまた、同じＣＡＲＴ細胞について抗原密度が増大するにつれて大きくなった。標的細胞のＣＡＲＴ細胞殺滅は、ＴＭを除くＩドメイン変異体ＣＡＲ全部によるＩＣＡＭ－１陰性８５０５Ｃ細胞の殺滅が観察されないことによって証明されるように、特異的であった。ＴＭＴ細胞による８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１の低いが漸次的な殺滅は、Ｔ細胞中のＴＭとＩＣＡＭ－１との相互作用によって仲介される同型細胞接触によって引き起こされる細胞毒性活性化による可能性が高かった。表４は、可変傾斜シグモイド曲線にデータを適合させることによって決定された５０％殺滅までの時間（時間）を要約する。

表５は、データを可変傾斜シグモイド曲線に当てはめることによって決定されたヒル傾斜値を示す。

一次Ｔ細胞におけるＩＣＡＭ－１発現は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（約１０^５分子／細胞１個）とのインキュベーションなどによってＴ細胞活性化後に誘導することができる。対照的に、ミリモルレベルの親和性（Ｋｄ＝１．５ｍＭ）を有するＷＴＣＡＲＴ細胞は、ＨｅＬａ細胞のみを特異的に溶解し得、これは、約１ｍＭのＫｄのＣＡＲＴ細胞について細胞１個あたりおよそ１０^６分子の閾値抗原密度を示す。重要なことに、Ｆ２９２ＡおよびＷＴＩドメインＣＡＲＴ細胞（Ｋｄ＞１０μＭ）は、ヒトおよびマウスの健常対照細胞、ＨＭＥＣ－１およびｂ．ＥＮＤ３と非反応性であった（細胞１個あたり約１０^４、図２Ａ）。

ＣＡＲＴ細胞によるＩＦＮ－γ放出は標的細胞死の速度と密接に整合しており、ここで、より高い親和性のＣＡＲＴ細胞を含有する共培養物における漸増レベルおよび／またはより高いレベルの標的抗原発現が認められた（図２Ｄ）。標的抗原密度依存的ＩＦＮ－γ放出に対する１つの例外は、ＴＭおよびＦ２９２Ｇであり、これらは標的分子の非存在下（８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１）で有意な量のＩＦＮ－γ放出（１ｎｇ／ｍｌ超）を示した。これもまた、Ｔ細胞間の同型相互作用によるものであり、これは、特にＣＡＲ発現のレベルが高かったとき、ＴＭＣＡＲＴ細胞を増殖させることの困難性の観察によっても支持されている。マイクロモルレベルの親和性のＣＡＲＴ細胞（Ｆ２９２Ａ）によるＩＦＮ－γの放出は、標的細胞中のＩＣＡＭ－１密度に比例しており、８５０５Ｃ／－ＩＣＡＭ－１とのインキュベーションの際の放出の欠如、ならびにＨＭＥＣ－１、８５０５Ｃ、８５０５Ｃ／ＬＰＳ、ＨｅＬａとのインキュベ０ションとともに、この順で漸増していることによって実証された（図２Ｄ）。ＨｅＬａ細胞に対するＷＴＩドメインの細胞毒性と一致して、ＨｅＬａとのインキュベーションの際のＩＦＮ－γ放出は、他のより親和性の高いＣＡＲＴ細胞によって分泌されたレベルに匹敵した。

実施例１６．親和性調整ＩドメインＣＡＲＴ細胞の生体内での有効性
本発明者らは、試験管内での親和性依存性ＣＡＲＴ細胞の細胞毒性パターンが生体内で腫瘍異種移植モデルにどのように変換されるのかを調べた。固形腫瘍において、ＣＡＲＴ細胞の有効性は、腫瘍部位に移動し、浸透し、腫瘍細胞を連続的に溶解し、腫瘍量に従って膨張および収縮を受ける能力によって影響される。ここでは、０．７５×１０^６個の８５０５Ｃ－ＦＬｕｃ^＋ＧＦＰ^＋細胞の全身静脈内注射、続いて異種移植８～１０日後（５～２０％のＣＡＲ発現）の約１～３×１０^６個のＩドメインＣＡＲＴ細胞（ＷＴ、Ｆ２９２Ａ、Ｆ２６５Ｓ、Ｆ２９２Ｇ、およびＴＭ）、ＳＳＴＲ２－Ｒ６．５ＣＡＲ^２９、ＮＴ（非形質導入）Ｔ細胞、およびＴ細胞なしによる処置によってマウスを異種移植した。腫瘍量は、ホタルルシフェラーゼ活性の全身発光撮像によって評価した。原発腫瘍は肺および肝臓に局在し、遠隔転移巣が全身に明らかであった（図３Ａ）。Ｔ細胞を投与しなかったコホートまたはＮＴＴ細胞を投与したコホートでは、腫瘍接種の３～４週間以内に腫瘍量に屈した。ＴＭＣＡＲＴ細胞で処置したマウスは、腫瘍量の急激な初期減少を示したが、Ｔ細胞注射のおよそ７日後に、マウスは昏睡および体重減少によって示される全身毒性の症状を示し始め、処置１５日後までに死に至った（図３Ａ～Ｂ）。Ｆ２９２ＧＣＡＲＴ細胞は一貫した毒性の発症がないまま、腫瘍を除去することができたが、これはＣＡＲＴ細胞処置時の腫瘍量に部分的に依存するように思われた。例えば、Ｆ２９２Ｇ（１１９ｎＭ親和性）ＣＡＲＴ細胞の注入の遅延（１０日後）または治療時のより多量の腫瘍量のいずれかは、より高頻度の死亡をもたらした。Ｆ２６５Ｓ（１４５ｎＭＫｄ）ＣＡＲを発現するＴ細胞は、観察可能な毒性なしに腫瘍を排除した。これは、約１００ｎＭのＫｄのＩドメインＣＡＲ親和性がおおよその閾値親和性を定義し、それを超えると（１００ｎＭ未満、例えば、１～１０ｎＭのＫｄ）、処置は、高いおよび低い抗原密度と、オンターゲットオフ腫瘍毒性の尤度の上昇との間の識別の低下をもたらす。試験管内でのＷＴＣＡＲＴ細胞による８５０５Ｃの殺滅の制限または欠如と一致して、生体内での腫瘍の進行は、ＮＴＴ細胞と同様に、ＷＴＣＡＲＴ細胞の処置によって妨げられることはなかった（図３Ｂ）。対照的に、より高い親和性の対応物と比較してはるかに低い試験管内での８５０５Ｃ殺滅速度を呈したＦ２９２ＡＣＡＲＴ細胞は、処置の時期にかかわらず明白な毒性なしに腫瘍量の急速な減少を達成した（図３Ａ～３Ｂ）。その上、より高い腫瘍クリアランス速度および腫瘍再発の耐久可能な抑制によって証明されるように、ＩＣＡＭ－１に対する＞１，０００倍低い親和性にもかかわらず、Ｆ２９２ＡＣＡＲＴの生体内での有効性は、ｓｃＦｖ系のＲ６．５ＣＡＲよりも優れていた（１０ｎＭ対２０μＭ）（図３Ａ）。

全体として、ＩドメインＣＡＲＴ細胞の抗腫瘍有効性は、Ｔ細胞またはＮＴＴ細胞で処置されていないマウスと比較して、コホート生存の統計的に有意な増加をもたらした（図３Ｃ）。しかしながら、ＣＡＲＴ細胞処置マウスは、腫瘍量が全くまたはほとんどない場合でさえ、毒性の徴候（例えば、体重減少、毛皮の減少）を示し始め、最終的にＴ細胞注射後約１０週間で頻繁に死に至る。これは、移植片対宿主病^３４に関連し、ヒトＩＣＡＭ－１のみを標的とするＲ６．５ＣＡＲＴ細胞で処置したマウスにおいて同様の毒性が観察されたため、オンターゲットオフ腫瘍毒性ではないと考えられた。

実施例１７．ＣＡＲＴ細胞の動態、有効性、および毒性のリアルタイム撮像
ＰＥＴ／ＣＴによってリアルタイムでＴ細胞分布を時空間的に監視するために、本発明者らは、撮像レポーター遺伝子であるＳＳＴＲ２をＩドメインＣＡＲベクターへと、リボソームスキップＰ２Ａ配列を用いて、Ｔ細胞表面上でのＣＡＲおよびレポーターの等しい発現を確実にした（図４Ａ）。ＳＳＴＲ２の発現は、注入された陽電子放出ＳＳＴＲ２特異的放射性トレーサーである^１８Ｆ－ＮＯＴＡ－オクトレオチド^３０の結合および細胞内蓄積を可能にした。次いで、マイクロＰＥＴスキャナーにより、組織貫通の問題なしに、放出されたシグナルを高解像度で検出した。ＳＳＴＲ２レポーター遺伝子のフローサイトメトリー測定および初代ヒトＴ細胞表面上のＣＡＲを表すＭｙｃタグ発現。ＳＳＴＲ２およびＭｙｃタグ付きＩドメインの発現は、ＳＳＴＲ２レポーター遺伝子のフローサイトメトリー測定による抗体染色、および初代ヒトＴ細胞の表面上のＣＡＲを表すＭｙｃタグ発現によって確認された。

上述のように、マウスに８５０５Ｃ腫瘍を異種移植し、ＮＴまたはＦ２９２ＡＣＡＲＴ細胞で処置した。全身発光撮像を実施して腫瘍量を推定する一方で、ＰＥＴ／ＣＴ撮像をＣＡＲＴ細胞分布を追跡するために同日実施した（図４Ｂ）。各時点で、Ｔ細胞動態との相関についてヒトサイトカインを測定するために血液を採取した。マウスにおけるＰＥＴ／ＣＴ画像は、放射性トレーサー排泄によって引き起こされる胆嚢、腎臓および膀胱における予想される背景レベルを示した（図４Ｂ、右端）。ＮＴ処置対照コホートでは、腫瘍量の増加およびそれに伴う血液プールの増加のため、非特異的トレーサー取り込みのわずかではあるが漸次増加が観察された（図４Ｂ）。対照的に、ＳＳＴＲ２－Ｆ２９２ＡＣＡＲＴ細胞で処置したマウスでは、特異的なトレーサーの取り込みが観察され、肺における膨張期および収縮期を示し、ピークＣＡＲＴ細胞シグナルは異種移植のおよそ２２日後に生じ、これはピーク腫瘍量後４日間であり（異種移植後１８日間）、背景レベルまで漸減した（図４Ｂ～４Ｃ）。これは、二相性のＴ細胞の膨張および収縮の現象を示す。

処置マウスから得られた血清のサイトカイン分析は、ピークＴ細胞膨張の前にＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、およびＣＸＣＬ１０の濃度の急上昇を示し、これはまた、背景レベルまで肺のＴ細胞密度の腫瘍除去後およびそれに続く背景レベルまでの収縮後に背景レベルへ戻った（図４Ｄ）。

参考文献
１．ＭａｈｅｒＪ，ＢｒｅｎｔｊｅｎｓＲＪ，ＧｕｎｓｅｔＧ，ＲｉｖｉｅｒｅＩ，ＳａｄｅｌａｉｎＭ．ＨｕｍａｎＴ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｄｉｒｅｃｔｅｄｂｙａｓｉｎｇｌｅｃｈｉｍｅｒｉｃＴＣＲｚｅｔａ／ＣＤ２８ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０，７０－７５（２００２）．
２．ＧｒｏｓｓＧ，ＷａｋｓＴ，ＥｓｈｈａｒＺ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｔ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｃｈｉｍｅｒｉｃｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｉｔｈａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔｙｐｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６，１００２４－１００２８（１９８９）．
３．ＨｕｄｅｃｅｋＭ，ｅｔａｌ．ＲｅｃｅｐｔｏｒａｆｆｉｎｉｔｙａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓａｆｆｅｃｔｔｕｍｏｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙＲＯＲ１－ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１９，３１５３－３１６４（２０１３）．
４．ＷａｔａｎａｂｅＫ，ｅｔａｌ．Ｔａｒｇｅｔａｎｔｉｇｅｎｄｅｎｓｉｔｙｇｏｖｅｒｎｓｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｎｔｉ－ＣＤ２０－ＣＤ２８－ＣＤ３ｚｅｔａｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄｅｆｆｅｃｔｏｒＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９４，９１１－９２０（２０１５）．
５．ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ，ｅｔａｌ．ＥｒａｄｉｃａｔｉｏｎｏｆＢ－ｌｉｎｅａｇｅｃｅｌｌｓａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｍａｉｎａｐａｔｉｅｎｔｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＴｃｅｌｌｓｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｔｏｒｅｃｏｇｎｉｚｅＣＤ１９．Ｂｌｏｏｄ１１６，４０９９－４１０２（２０１０）．
６．ＰｏｒｔｅｒＤＬ，ＬｅｖｉｎｅＢＬ，ＫａｌｏｓＭ，ＢａｇｇＡ，ＪｕｎｅＣＨ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ３６５，７２５－－７３３（２０１１）．
７．ＧｒｕｐｐＳＡ，ｅｔａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄＴｃｅｌｌｓｆｏｒａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３６８，１５０９－１５１８（２０１３）．
８．ＢｒｅｎｔｊｅｎｓＲＪ，ｅｔａｌ．ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄＴｃｅｌｌｓｒａｐｉｄｌｙｉｎｄｕｃｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓｉｎａｄｕｌｔｓｗｉｔｈｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ５，１７７ｒａ１３８（２０１３）．
９．ＢｒｕｄｎｏＪＮ，ＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒＪＮ．ＴｏｘｉｃｉｔｉｅｓｏｆｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓ：ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ１２７，３３２１－３３３０（２０１６）．
１０．ＣｈｅｅｖｅｒＭＡ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ：ａｎａｔｉｏｎａｌｃａｎｃｅｒｉｎｓｔｉｔｕｔｅｐｉｌｏｔｐｒｏｊｅｃｔｆｏｒｔｈｅａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ１５，５３２３－５３３７（２００９）．
１１．ＫａｋａｒｌａＳ，ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋＳ．ＣＡＲＴｃｅｌｌｓｆｏｒｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓ：ａｒｍｅｄａｎｄｒｅａｄｙｔｏｇｏ？ＣａｎｃｅｒＪ２０，１５１－１５５（２０１４）．
１２．ＬａｍｅｒｓＣＨ，ｅｔａｌ．ＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｗｉｔｈａｕｔｏｌｏｇｏｕｓＴ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｒｅｔａｒｇｅｔｅｄａｇａｉｎｓｔｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸ：ｆｉｒｓｔｃｌｉｎｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２４，ｅ２０－２２（２００６）．
１３．ＰａｒｋｈｕｒｓｔＭＲ，ｅｔａｌ．Ｔｃｅｌｌｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎｃａｎｍｅｄｉａｔｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｂｕｔｉｎｄｕｃｅｓｅｖｅｒｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｃｏｌｉｔｉｓ．ＭｏｌＴｈｅｒ１９，６２０－６２６（２０１１）．
１４．ＭｏｒｇａｎＲＡ，ＹａｎｇＪＣ，ＫｉｔａｎｏＭ，ＤｕｄｌｅｙＭＥ，ＬａｕｒｅｎｃｏｔＣＭ，ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡ．ＣａｓｅｒｅｐｏｒｔｏｆａｓｅｒｉｏｕｓａｄｖｅｒｓｅｅｖｅｎｔｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｗｉｔｈａｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇＥＲＢＢ２．ＭｏｌＴｈｅｒ１８，８４３－８５１（２０１０）．
１５．ＴｉａｎＳ，ＭａｉｌｅＲ，ＣｏｌｌｉｎｓＥＪ，ＦｒｅｌｉｎｇｅｒＪＡ．ＣＤ８＋ＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｓｇｏｖｅｒｎｅｄｂｙＴＣＲ－ｐｅｐｔｉｄｅ／ＭＨＣａｆｆｉｎｉｔｙ，ｎｏｔｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｒａｔｅ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７９，２９５２－２９６０（２００７）．
１６．ＨｅｂｅｉｓｅｎＭ，ＡｌｌａｒｄＭ，ＧａｎｎｏｎＰＯ，ＳｃｈｍｉｄｔＪ，ＳｐｅｉｓｅｒＤＥ，ＲｕｆｅｒＮ．ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇＩｎｄｉｖｉｄｕａｌＴＣｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒｓｏｆＯｐｔｉｍａｌＡｖｉｄｉｔｙｆｏｒＴｕｍｏｒＡｎｔｉｇｅｎｓ．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ６，５８２（２０１５）．
１７．ＺｈｏｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｔ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒａｆｆｉｎｉｔｙａｎｄａｖｉｄｉｔｙｄｅｆｉｎｅｓａｎｔｉｔｕｍｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎＴ－ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０，６９７３－６９７８（２０１３）．
１８．ＬｉｕＸ，ｅｔａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ－ＴｕｎｅｄＥｒｂＢ２ｏｒＥＧＦＲＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＴＣｅｌｌｓＥｘｈｉｂｉｔａｎＩｎｃｒｅａｓｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｎｄｅｘａｇａｉｎｓｔＴｕｍｏｒｓｉｎＭｉｃｅ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７５，３５９６－３６０７（２０１５）．
１９．ＣａｒｕｓｏＨＧ，ｅｔａｌ．ＴｕｎｉｎｇＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＣＡＲｔｏＥＧＦＲＤｅｎｓｉｔｙＬｉｍｉｔｓＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＮｏｒｍａｌＴｉｓｓｕｅＷｈｉｌｅＭａｉｎｔａｉｎｉｎｇＰｏｔｅｎｔＡｎｔｉｔｕｍｏｒＡｃｔｉｖｉｔｙ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７５，３５０５－－３５１８（２０１５）．
２０．ＡｒｃａｎｇｅｌｉＳ，ｅｔａｌ．ＢａｌａｎｃｅｏｆＡｎｔｉ－ＣＤ１２３ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＢｉｎｄｉｎｇＡｆｆｉｎｉｔｙａｎｄＤｅｎｓｉｔｙｆｏｒｔｈｅＴａｒｇｅｔｉｎｇｏｆＡｃｕｔｅＭｙｅｌｏｉｄＬｅｕｋｅｍｉａ．ＭｏｌＴｈｅｒ，（２０１７）．
２１．ＣｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉＭ，ＨｏｍｂａｃｈＡ，ＨｅｕｓｅｒＣ，ＡｄａｍｓＧＰ，ＡｂｋｅｎＨ．Ｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｉｎｃｒｅａｓｅｉｎａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｔｈｅｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｄｏｍａｉｎａｂｏｖｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｄｏｅｓｎｏｔｉｎｃｒｅａｓｅＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔａｎｔｉｇｅｎ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｂｕｔｄｅｃｒｅａｓｅｓｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７３，７６４７－７６５３（２００４）．
２２．ＳｃｈｍｉｄＤＡ，ｅｔａｌ．ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａＴＣＲａｆｆｉｎｉｔｙｔｈｒｅｓｈｏｌｄｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇｍａｘｉｍａｌＣＤ８Ｔｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８４，４９３６－４９４６（２０１０）．
２３．ＣｏｒｓｅＥ，ＧｏｔｔｓｃｈａｌｋＲＡ，ＫｒｏｇｓｇａａｒｄＭ，ＡｌｌｉｓｏｎＪＰ．ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏａｈｉｇｈ－ｐｏｔｅｎｃｙｌｉｇａｎｄｉｎｖｉｖｏ．ＰＬｏＳＢｉｏｌ８，（２０１０）．
２４．ＰａｒｋＳ，ｅｔａｌ．Ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｖｉａｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄｄｒｕｇｃａｒｒｉｅｒｓｔｈａｔｔａｒｇｅｔｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｕｍｏｒｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅａｎｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ３４，５９８－－６０５（２０１３）．
２５．ＤｕｓｔｉｎＭＬ，ＲｏｔｈｌｅｉｎＲ，ＢｈａｎＡＫ，ＤｉｎａｒｅｌｌｏＣＡ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＴＡ．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙＩＬ１ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ：ｔｉｓｓｕｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｎａｔｕｒａｌａｄｈｅｒｅｎｃｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＩＣＡＭ－１）．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１３７，２４５－２５４（１９８６）．
２６．ＳｈｉｍａｏｋａＭ，ｅｔａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙｌｏｃｋｉｎｇａｐｒｏｔｅｉｎｆｏｌｄｉｎａｎａｃｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈａｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ：ｉｎｔｅｇｒｉｎａｌｐｈａＬＩｄｏｍａｉｎｓｗｉｔｈｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙａｎｄａｎｔａｇｏｎｉｓｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｖｏ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９８，６００９－６０１４（２００１）．
２７．ＪｉｎＭ，ｅｔａｌ．ＤｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｏｐｒｏｂｅｐｒｏｔｅｉｎａｌｌｏｓｔｅｒｙａｎｄｉｎｔｅｇｒｉｎＩｄｏｍａｉｎｓｏｆ２００，０００－ｆｏｌｄｈｉｇｈｅｒａｆｆｉｎｉｔｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３，５７５８－５７６３（２００６）．
２８．ＷｏｎｇＲ，ＣｈｅｎＸ，ＷａｎｇＹ，ＨｕＸ，ＪｉｎＭＭ．ＶｉｓｕａｌｉｚｉｎｇａｎｄＱｕａｎｔｉｆｙｉｎｇＡｃｕｔｅＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＩＣＡＭ－１ＳｐｅｃｉｆｉｃＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄＭＲＩＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＭａｐｐｉｎｇ．ＡｎｎＢｉｏｍｅｄＥｎｇ４０，１３２８－１３３８（２０１１）．
２９．ＶｅｄｖｙａｓＹ，ｅｔａｌ．ＬｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌＰＥＴｉｍａｇｉｎｇｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｂｉｐｈａｓｉｃＣＡＲＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｓｕｒｖｉｖｏｒｓ．ＪＣＩＩｎｓｉｇｈｔ１，ｅ９００６４（２０１６）．
３０．ＬａｖｅｒｍａｎＰ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｆａｃｉｌｅｍｅｔｈｏｄｏｆｌａｂｅｌｉｎｇｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅｗｉｔｈ（１８）Ｆ－ｆｌｕｏｒｉｎｅ．ＪＮｕｃｌＭｅｄ５１，４５４－４６１（２０１０）．
３１．ＭｃＢｒｉｄｅＷＪ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｏｆ１８ＦｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇｆｏｒＰＥＴ．ＪＮｕｃｌＭｅｄ５０，９９１－９９８（２００９）．
３２．ＫｉｎａｈａｎＰＥ，ＦｌｅｔｃｈｅｒＪＷ．Ｐｏｓｉｔｒｏｎｅｍｉｓｓｉｏｎｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ－ｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｕｐｔａｋｅｖａｌｕｅｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄａｓｓｅｓｓｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈｅｒａｐｙ．ＳｅｍｉｎＵｌｔｒａｓｏｕｎｄＣＴＭＲ３１，４９６－５０５（２０１０）．
３３．ＬｅｅｌａｗａｔｔａｎａｃｈａｉＪ，ＫｗｏｎＫＷ，ＭｉｃｈａｅｌＰ，ＴｉｎｇＲ，ＫｉｍＪＹ，ＪｉｎＭＭ．Ｓｉｄｅ－ｂｙ－ＳｉｄｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣｏｍｍｏｎｌｙＵｓｅｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓＴｈａｔＤｉｆｆｅｒｉｎＳｉｚｅａｎｄＡｆｆｉｎｉｔｙｏｎＴｕｍｏｒＵｐｔａｋｅａｎｄＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＯｎｅ１０，ｅ０１２４４４０（２０１５）．
３４．ＰｏｉｒｏｔＬ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅ－ＥｄｉｔｅｄＴ－ｃｅｌｌＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｌａｔｆｏｒｍｆｏｒ “Ｏｆｆ－ｔｈｅ－Ｓｈｅｌｆ” ＡｄｏｐｔｉｖｅＴ－ｃｅｌｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７５，３８５３－３８６４（２０１５）．
３５．ＫａｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｖｉｒｕｓ－ｍｉｍｅｔｉｃｐｏｌｙｐｌｅｘｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｌａｒｇｅｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｔｅｎｔｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ２０，１０４２－１０５２（２０１３）．
３６．ＨｉｎｒｉｃｈｓＣＳ，ＲｅｓｔｉｆｏＮＰ．ＲｅａｓｓｅｓｓｉｎｇｔａｒｇｅｔａｎｔｉｇｅｎｓｆｏｒａｄｏｐｔｉｖｅＴ－ｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，９９９－１００８（２０１３）．
３７．ＮｅｗｉｃｋＫ，Ｏ’ＢｒｉｅｎＳ，ＭｏｏｎＥ，ＡｌｂｅｌｄａＳＭ．ＣＡＲＴＣｅｌｌＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＳｏｌｉｄＴｕｍｏｒｓ．ＡｎｎｕＲｅｖＭｅｄ６８，１３９－１５２（２０１７）．
３８．ＬｅｄｅｂｕｒＨＣ，ＰａｒｋｓＴＰ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１ｇｅｎｅｂｙｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＥｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｓｏｆａｖａｒｉａｎｔＮＦ－ｋａｐｐａＢｓｉｔｅａｎｄｐ６５ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７０，９３３－９４３（１９９５）．
３９．ＵｓａｍｉＹ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＩＣＡＭ－１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｏｒａｌｃａｎｃｅｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｍａｃｒｏｐｈａｇｅ／ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１３３，５６８－５７８（２０１３）．
４０．ＲｏｌａｎｄＣＬ，ＨａｒｋｅｎＡＨ，ＳａｒｒＭＧ，ＢａｒｎｅｔｔＣＣ，Ｊｒ．ＩＣＡＭ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｍａｌｉｇｎａｎｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃａｎｃｅｒ．Ｓｕｒｇｅｒｙ１４１，７０５－７０７（２００７）．
４１．ＧｕｏＰ，ｅｔａｌ．ＩＣＡＭ－１ａｓａｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｒｉｐｌｅｎｅｇａｔｉｖｅｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１１，１４７１０－１４７１５（２０１４）．
４２．ＣａｒｍａｎＣＶ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＴＡ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎａｖｉｄｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ａｒｅｃｈａｎｇｅｓｉｎａｆｆｉｎｉｔｙａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ？ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ１５，５４７－５５６（２００３）．
４３．ＢｏｉｓｓｏｎｎａｓＡ，ＦｅｔｌｅｒＬ，ＺｅｅｌｅｎｂｅｒｇＩＳ，ＨｕｇｕｅｓＳ，ＡｍｉｇｏｒｅｎａＳ．ＩｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇｏｆｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒ．ＪＥｘｐＭｅｄ２０４，３４５－３５６（２００７）．
４４．ＰｏｒｔｅｒＢＢ，ＨａｒｔｙＪＴ．ＴｈｅｏｎｓｅｔｏｆＣＤ８＋－Ｔ－ｃｅｌｌｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｉｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｔｈｅｐｅａｋｏｆＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｇｅｎｄｉｓｐｌａｙ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ７４，１５２８－１５３６（２００６）．
４５．ＫｅｕＫＶ，ｅｔａｌ．ＲｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｉｍａｇｉｎｇｏｆｔａｒｇｅｔｅｄＴｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｒｅｃｕｒｒｅｎｔｇｌｉｏｍａ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ９，（２０１７）．
４６．ＹａｇｈｏｕｂｉＳＳ，ｅｔａｌ．ＮｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｃｙｔｏｌｙｔｉｃＴｃｅｌｌｓｗｉｔｈ１８Ｆ－ＦＨＢＧＰＥＴｉｎａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｇｌｉｏｍａ．ＮａｔＣｌｉｎＰｒａｃｔＯｎｃｏｌ６，５３－５８（２００９）．
４７．ＤｒｅｎｔＥ，ｅｔａｌ．ＡＲａｔｉｏｎａｌＳｔｒａｔｅｇｙｆｏｒＲｅｄｕｃｉｎｇＯｎ－ＴａｒｇｅｔＯｆｆ－ＴｕｍｏｒＥｆｆｅｃｔｓｏｆＣＤ３８－ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒｓｂｙＡｆｆｉｎｉｔｙＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．ＭｏｌＴｈｅｒ，（２０１７）．
４８．ＫａｌｅｒｇｉｓＡＭ，ｅｔａｌ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｓａｎｏｐｔｉｍａｌｄｗｅｌｌ－ｔｉｍｅｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＴＣＲａｎｄｔｈｅｐＭＨＣｃｏｍｐｌｅｘ．ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ２，２２９－２３４（２００１）．
４９．ＶａｌｉｔｕｔｔｉＳ．ＴｈｅＳｅｒｉａｌＥｎｇａｇｅｍｅｎｔＭｏｄｅｌ１７ＹｅａｒｓＡｆｔｅｒ：ＦｒｏｍＴＣＲＴｒｉｇｇｅｒｉｎｇｔｏＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ３，２７２（２０１２）．
５０．ＭｃＭａｈａｎＲＨ，ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓＪＡ，ＪｏｒｄａｎＫＲ，ＤｏｗＳＷ，ＷｉｌｓｏｎＤＢ，ＳｌａｎｓｋｙＪＥ．ＲｅｌａｔｉｎｇＴＣＲ－ｐｅｐｔｉｄｅ－ＭＨＣａｆｆｉｎｉｔｙｔｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｆｏｒｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｔｕｍｏｒｖａｃｃｉｎｅｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１１６，２５４３－２５５１（２００６）．
５１．ＲｏｂｂｉｎｓＰＦ，ｅｔａｌ．ＳｉｎｇｌｅａｎｄｄｕａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｉｎＴＣＲＣＤＲｓｃａｎｅｎｈａｎｃｅａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８０，６１１６－６１３１（２００８）．
５２．ＣｏＭＳ，ＤｅｓｃｈａｍｐｓＭ，ＷｈｉｔｌｅｙＲＪ，ＱｕｅｅｎＣ．Ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒａｎｔｉｖｉｒａｌｔｈｅｒａｐｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８８，２８６９－２８７３（１９９１）．
５３．ＬｅｅｌａｗａｔｔａｎａｃｈａｉＪ，ＫｗｏｎＫ－Ｗ，ＭｉｃｈａｅｌＰ，ＴｉｎｇＲ，ＫｉｍＪ－Ｙ，ＪｉｎＭＭ．Ｓｉｄｅ－ｂｙ－ＳｉｄｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣｏｍｍｏｎｌｙＵｓｅｄＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓＴｈａｔＤｉｆｆｅｒｉｎＳｉｚｅａｎｄＡｆｆｉｎｉｔｙｏｎＴｕｍｏｒＵｐｔａｋｅａｎｄＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＯｎｅ１０，ｅ０１２４４４０（２０１５）．
５４．ＪｉｎＭ，ｅｔａｌ．ＤｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｏｐｒｏｂｅｐｒｏｔｅｉｎａｌｌｏｓｔｅｒｙａｎｄｉｎｔｅｇｒｉｎＩｄｏｍａｉｎｓｏｆ２００，０００－ｆｏｌｄｈｉｇｈｅｒａｆｆｉｎｉｔｙ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３，５７５８－５７６３（２００６）．
５５．ＷｏｎｇＲ，ＣｈｅｎＸ，ＷａｎｇＹ，ＨｕＸ，ＪｉｎＭＭ．ＶｉｓｕａｌｉｚｉｎｇａｎｄｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇａｃｕｔｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＩＣＡＭ－１ｓｐｅｃｉｆｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄＭＲＩｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｍａｐｐｉｎｇ．ＡｎｎＢｉｏｍｅｄＥｎｇ４０，１３２８－１３３８（２０１２）．

Claims

Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）ヒトリンパ球機能関連抗原１のα_ＬサブユニットのＩドメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインと、
（ｉｖ）活性化ドメインと、
を含み、前記Ｉドメインが、配列番号１の１３０～３１０アミノ酸の配列を含み、Ｆ２９２Ａ、Ｆ２９２Ｓ、Ｌ２８９Ｇ、Ｆ２９２Ｇ、またはＦ２６５Ｓのうちの１つの変異を有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ－４０、ＧＩＴＲ、およびＤＡＰ１０からなる群より選択される、請求項１に記載のＣＡＲ。
前記活性化ドメインがＣＤ３ゼータである、請求項１に記載のＣＡＲ。
請求項１に記載のＣＡＲをコードする単離された核酸。
請求項１に記載のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞またはナチュラルキラー細胞。
請求項５に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、癌を治療するための養子細胞療法のための医薬組成物であって、
癌に罹患している対象に投与され、
前記対象の前記癌細胞はＩＣＡＭ－１を過剰発現し、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、前記癌細胞を死滅させるために、前記癌細胞へ結合する、医薬組成物。
前記癌が甲状腺癌、胃癌、膵癌、または乳癌である、請求項６に記載の医薬組成物。
Ｎ末端からＣ末端にかけて、
（ｉ）ヒトリンパ球機能関連抗原１のα _ＬサブユニットのＩドメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインと、
（ｉｖ）活性化ドメインと、を含み、
前記Ｉドメインが、配列番号１の１３０～３１０アミノ酸の配列を含み、Ｆ２６５Ｓ／Ｆ２９２Ｇ／Ｇ３１１Ｃの３つの変異を有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。