CN108697096A - 对icam-1特异性的i结构域嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对细胞间粘附分子‑1(ICAM‑1)特异性的嵌合抗原受体(CAR)，其包含人淋巴细胞功能相关抗原1(LFA‑1)的αL亚基的I结构域。本发明特别涉及包含人I结构域的CAR，所述人I结构域对ICAM‑1具有不同的亲和力(1mM至1nM Kd)。包含对ICAM‑1具有低亲和力(1‑200μM Kd)的人I结构域的CAR T细胞可以避免靶向具有基础ICAM‑1表达的健康组织，同时表现出增加的对具有高ICAM‑1表达的肿瘤组织的效能和长期效力。本发明也涉及用于治疗癌症的过继性细胞治疗方法，所述方法包括将包含人I结构域的CAR‑T细胞施用给遭受癌症的受试者，其中所述CAR T细胞结合过表达ICAM‑1的癌细胞并杀死所述癌细胞。

Description

对ICAM-1特异性的I结构域嵌合抗原受体
对序列表、表或计算机程序的引用
在此与说明书一起并行地经由EFS-Web呈送作为ASCII格式文本文件的序列表，其具有序列表.txt的文件名称，具有2017年7月17日的创建日期和9.89千字节的大小。经由EFS-Web提交的序列表是说明书的部分，且特此通过引用以其整体并入本文中。
技术领域
本发明涉及包含人I结构域的对ICAM-1特异性的嵌合抗原受体。本发明具体地涉及对ICAM-1具有不同亲和力(1mM至1nM)的包含人I结构域的嵌合抗原受体。
背景技术
免疫疗法作为一种非常有前途的用于治疗癌症的方案出现。
用CAR遗传修饰T细胞是一种常见的设计肿瘤特异性T细胞的方案。可以将靶向肿瘤相关抗原的CAR(嵌合抗原受体)-T细胞输入患者(过继性细胞转移或ACT)中，从而代表一种有效的免疫疗法方案。CAR-T技术相对于化学疗法或抗体的优点是，重新程序化的经工程改造的T细胞可以在患者中繁殖和持续，并象活药物一样工作。
CAR分子由合成的结合部分组成，所述结合部分通常是抗体衍生的单链可变区片段(svFv)或任何天然抗原感知元件，其与由TCRζ链和共刺激分子(诸如CD28和/或4-1BB)组成的细胞内信号传递结构域融合1,2。CAR介导的靶向的优点包括：1)与天然的非整合的TCR和共刺激信号传递相比，经由单个结合事件提供顺式(in-cis)活化、增殖和存活信号；2)通过独立于MHC的抗原识别绕过肿瘤细胞对MHC的下调的能力；和3)减小的活化阈值以及由CAR和抗原之间的高亲和力相互作用实现的对具有低抗原密度的肿瘤细胞的识别3,4。
理想的CAR靶抗原将是天然的表面暴露的肿瘤新抗原，其被高度表达且在健康的组织中不可检测到。但是，由于这样的抗原的绝对稀少，许多通常被靶向的实体瘤抗原也由非肿瘤组织表达，尽管在较低的水平。对这样的抗原具有高亲和力的CAR分子可以导致健康组织的并行靶向，从而导致靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性，即迄今为止CAR T细胞疗法的进展的一个主要限制因素。
使用单链抗体形式构建常规CAR，并选择性地工程改造成对靶抗原具有亚-至低纳摩尔亲和力。但是，仅当靶向真实肿瘤抗原或具有最高限制水平的那些时，增加的CAR T细胞敏感性可以是一个优点17,36。否则，增加的敏感性以降低的选择性为代价，以对抗原密度在很大程度上不敏感的方式裂解表达靶标的细胞18。
需要具有改善的治疗指数的CAR，即，可以杀死肿瘤并同时使全身毒性最小化的CAR。
附图说明
图1A-1G显示了在亲和力方面具有逐步106倍变化的ICAM-1特异性的CAR的构建和它们的体外结果。
图1A:与ICAM-1形成复合物的LFA-1的示意图。将LFA-1整联蛋白的α和β链和模块结构域标记。将LFA-1和ICAM-1相互作用必需的金属离子显示在圆圈中。
图1B:以条带简图描绘了LFA-1I结构域和ICAM-1(D1)的N-端结构域的结构模型。指示了N和C-端和突变热点。
图1C:与固定化的人ICAM-1结合的I结构域变体的SPR感应图，除了F265S/F292G*以外，其在鼠ICAM-1上面流动(取自Jin等人的图254,和Wong等人的图155)。
图1D:编码I结构域CAR的慢病毒载体的示意图.LTR＝长末端重复序列；SD＝剪接供体；SA＝剪接受体；ψ+＝包装信号；SS＝信号序列；TM＝跨膜；Cyt＝细胞溶质结构域。
图1E:与用Myc-标记的CAR(TM、F292G、F292A和WT I结构域)转导的Jurkat T细胞结合的抗-Myc抗体。NT＝未转导。
图1F:与在HEK 293T细胞中表达的CAR结合的重组ICAM-1-Fc。
图1G:测量在Jurkat T细胞中表达的I结构域CAR与可溶性人(顶)和鼠(底)ICAM-1(CD54)包被的表面之间的相对结合亲合力的V-底粘附测定。n＝3；对于*，相对于NT而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。
图2A-2D显示了体外原代CAR T细胞的亲和力和抗原密度依赖性活化.
图2A:用于测量用不同的I结构域CAR转导的原代T细胞的靶标杀死的效应物:靶标(E:T)测定。将每种靶标分别与TM、F292G、F292A或WT CART细胞一起以5:1E:T比率温育。将生存力百分比归一化至来自与NT T细胞一起温育的靶细胞的发光(n＝3,±＝标准差(SD))。使用可变斜率S形曲线方程式拟合数据。对于*，相对于NT而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。图2B:将50％杀死的最佳拟合值和S形方程式的Hill斜率相对于I结构域CAR的亲和力绘图。绘制了具有高于0.85的r-平方值的最佳拟合值。
图2C:与HeLa细胞相比在原代T细胞中的ICAM-1表达。灰色和黑色直方图分别对应于未标记的细胞和R6.5抗体标记的细胞。
图2D:在与不同的靶细胞一起共温育24h以后，为每种CAR T变体通过ELISA测量IFN-γ释放(n＝3)。对于*，相对于8505C/-ICAM-1而言，p<0.01，通过Dunnett氏多重比较检验。
图3A-3C表明微摩尔亲和力CAR T细胞会提供优良的肿瘤根除、肿瘤复发抑制和存活益处.
图3A:使用全身发光成像来估计肿瘤植入后8天输入不同的CAR T细胞变体的小鼠中的肿瘤负荷。无T＝小鼠不接受T细胞。
图3B:肿瘤植入后10天用CAR T细胞治疗的小鼠。NT＝未转导的T细胞。
图3C:接受不同治疗的小鼠的存活曲线。对于无T和TM，相对于NT的Log-rank(Mantel-Cox)检验P值是非显著的，且对于F292G而言p＝0.008，对于R6.5而言p＝0.025，和对于F292A而言p＝0.0016。
图4A-4D显示了肿瘤负荷、T细胞分布和细胞因子释放的纵向并行测量。
图4A:SSTR2-I结构域载体的示意图。
图4B:通过PET/CT对NOTAOCT摄取(每个小图的上半)和通过全身发光成像对肿瘤负荷(每个小图的下半)的纵向测量。图像是每个组群中的四只小鼠的代表。在最大示踪剂摄取当天拍摄的全身PET/CT图像显示在最右侧。在底小图下面指示了成像时间点。例如，15代表肿瘤异种移植以后15天(和T细胞输注以后7天)。
图4C:如指示治疗的小鼠的肺中的发光和示踪剂摄取的定量。顶小图:NT(未转导的)T细胞。底水平:CAR-F292A。
图4D:描绘了在不同时间点从‘b’和‘c’中的相同小鼠抽取的血液所测得的细胞因子水平(平均值±SD，一式两份测量)。顶小图:NT(未转导的)T细胞。底水平:CAR-F292A。
具体实施方式
定义
本文中使用的“约”表示列举的值±10％。
本文中使用的“过继性T细胞疗法”包括肿瘤特异性的T细胞的分离和离体繁殖以达到比通过单独疫苗接种得到的结果更大数目的T细胞。然后将肿瘤特异性的T细胞输入具有癌症的患者中，以尝试给他们的免疫系统赋予通过T细胞(其可以攻击和杀死癌症)挫败剩余肿瘤的能力。
本文中使用的“亲和力”是单个分子(例如，I结构域)与其配体(例如，ICAM-1)的结合的强度。通常通过平衡解离常数(KD或Kd)测量和报道亲和力，所述平衡解离常数用于评价双分子相互作用的强度等级并排序。
本文中使用的“嵌合抗原受体(CAR)”是指融合蛋白，其包含能够结合抗原的细胞外结构域、从多肽(其不同于衍生出细胞外结构域的多肽)衍生出的跨膜结构域、和至少一个细胞内结构域。“能够结合抗原的细胞外结构域”是指可以结合某种抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知作为结构域起作用的任何寡肽或多肽，所述结构域传递信号以造成细胞中的生物学过程的活化或抑制。
本文中使用的“结构域”是指多肽中的一个区域，其独立于其它区域折叠成特定结构。
本文中使用的“整联蛋白”或“整联蛋白受体”(互换使用)表示许多细胞表面受体蛋白中的任一种，也被称作粘附受体，其结合细胞外基质配体或其它细胞粘附蛋白配体由此介导细胞-细胞和细胞-基质粘附过程。整联蛋白与它们的配体的结合亲和力由整联蛋白中的构象变化调节。整联蛋白参与生理学过程例如胚胎发生、止血、伤口愈合、免疫应答和组织体系结构的形成/维持。整联蛋白亚家族含有与不同的α-亚基组合的β-亚基以形成具有不同特异性的粘附蛋白受体。
“细胞间粘附分子-1”或“ICAM-1”，即GenBank登记号NM_000201、NP_000192，是αLβ2整联蛋白的配体，且它的N-端结构域(D1)通过ICAM-1残基Glu-34与MIDAS金属的配位作用结合αL I结构域。ICAM1通常在内皮细胞和免疫系统的细胞上表达。ICAM1结合αLβ2和αMβ2型的整联蛋白。ICAM-1在几种癌和有关的间质中24以及在炎性病症中25上调。除了患病的组织以外，ICAM-1基本上在几种细胞类型中表达，包括内皮细胞、免疫细胞和某些上皮细胞25。
“淋巴细胞功能相关抗原-1”、“LFA-1”、“αLβ2整联蛋白”或“CD18/CD11a”表示白细胞整联蛋白亚家族的一个成员。LFA-1存在于所有T-细胞上，并且也存在于B-细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞上，并参与募集至感染部位。它结合抗原呈递细胞上的ICAM-1并作为粘附分子起作用。
本文中使用的“I结构域”表示LFA-1的αL亚基的插入的或I结构域，并且是结合LFA-1的配体的变构介质。I结构域是ICAM-1的天然配体。I结构域的配体结合位点(被称作金属离子依赖性的粘附位点(MIDAS))作为由C-端α7螺旋变构地调节的两种独特构象存在。野生型(WT)I结构域包括1145个氨基酸长的成熟αL整联蛋白亚基蛋白(SEQ ID NO:1，其为GenBank登记号NP_002200的氨基酸残基26-1170)的氨基酸残基130-310。本文中使用的氨基酸残基的所有编号是指成熟的αL整联蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:1的残基1对应于GenBank登记号NP_002200的序列的残基26。
本文中使用的“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达造成癌症。
描述
本发明提供了使用它的生理学配体LFA-1靶向ICAM-1的嵌合抗原受体，所述ICAM-1是一种宽泛的肿瘤生物标志物。发明人已经构建了一组包含人I结构域的亲和力变体CAR；所述CAR对ICAM-1具有1mM至1nM亲和力。本发明提供了具有宽泛抗肿瘤适用性的ICAM-1-特异性的CAR。包含I结构域(其具有靶向ICAM-1的微摩尔亲和力)的CAR T细胞具有与常规CAR相比改善的效力和安全性，因为它们能够裂解过表达靶抗原的细胞，同时饶恕具有低得多的密度的正常细胞。
本发明涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N-端至C-端包含：(i)淋巴细胞功能相关抗原-1的αL亚基的人I结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激性的结构域，和(iv)活化结构域。
本发明的CAR包含：(i)特异性地结合ICAM-1的人I结构域。使用从LFA-1衍生出的I结构域，可以构建对ICAM-1特异性的I结构域(图1A和1B)。在I结构域中的不同活化点突变位于结合界面之外，所述结合界面包括被称作金属离子依赖性粘附位点(MIDAS)的区域(图1B)。通过针对它们与ICAM-1包被的表面、珠子或细胞的更高结合来筛选突变体文库，可以得到含有对ICAM-1从1mM至1nM的I结构域亲和力的逐步升高的突变体。例如，使用酵母展示系统可以分离不同的亲和力突变体(参见Jin等人27)。首先通过表面等离子体共振(例如，Biacore)测量亲和力以评估I结构域和ICAM-1之间的1:1结合亲和力。通过流式细胞计量术和使用兰格缪尔等温线方程式，可以测量ICAM-1对在细胞上表达的CAR的亲和力。同样地，通过测量游离的和细胞表面结合的配体(在该情况下，辐射-或荧光-标记的ICAM-1)的量，可以执行Scatchard分析来估计CAR亲和力。
表1显示了测量的野生型和突变体的LFA-1I结构域对ICAM-1的亲和力。大多数突变是将疏水的庞大侧链(F,L,I)变成更亲水的(A,S,T)，由此破坏更紧凑的低亲和力I结构域构象的结构。例如，将位于C-端α7-螺旋中的Phe-292用Ala(F292A)和Gly(F292G)置换会分别提供～20μM和0.1μM的亲和力(KD)(表1)。F292G与在Phe-265中的另一个可比较活化突变的组合(F265S/F292G)会提供6nM的亲和力，是野生型(WT)I结构域(KD＝1.5mM)的大约200,000倍(图1C)。为了将F265S/F292G的C-端α7-螺旋锁定在开放位置(图1A)，可以在F265S/F292G突变体(F265S/F292G/G311C，所谓的三突变体或TM)中将Gly-311用Cys替代(G311C)以与天然地未配对的Cys-125形成二硫键(表1)。因此，可以将各个I结构域变体对ICAM-1的单价亲和力设计成跨大约6个数量级(KD～1nM至1mM)，如通过表面等离子体共振(SPR)测得的或通过流式细胞计量术估计的(图1C,表1)。在表1中的突变体仅用于例证目的；本发明的CAR不限于这些具体突变体。根据技术人员已知的方法，可以制备、试验和选择具有其它突变且对ICAM-1具有1mM至1nM的亲和力的突变体。
表1.
在一个实施方案中，本发明的CAR包含这样的I结构域：其为野生型人I结构域，具有1-3个氨基酸突变的野生型人I结构域的突变体，或与所述野生型I结构域或所述突变体的序列具有至少95％、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％同一性的序列，具有1mM或更强的结合人ICAM-1的亲和力。在一个实施方案中，所述突变体可以具有在野生型I结构域的氨基酸残基265、288、289、292、295、309或311处的一个或多个突变。例如，所述突变体可以具有野生型I结构域的I288N、I309T、L295A、F292A、F292S、L289G、F292G、F265S、F265S/F292G或F265S/F292G/G311C中的一个或多个突变。在一个实施方案中，组合两个I结构域突变会产生具有比每个亲本突变体更高的亲和力的突变体。例如，组合两个各自具有约100μM Kd的突变体通常会产生具有约1至约10μM Kd范围的突变体。F292G是一种非常有效的点突变；将F292G与其它突变组合会使对ICAM-1的I结构域亲和力增加至强于100nM Kd。氨基酸残基的以上编号是参考SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列，且残基编号1对应于GenBank登记号NP_002200的氨基酸残基26。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以1mM至1nM Kd、优选1-200μM Kd或1-20μMKd的亲和力结合ICAM-1的I结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约120nM至约1nM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，F292G、F265S、F265S/F292G和F265S/F292G/G311C。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约20μM至约120nM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，F292A、F292S和I289G。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约200μM至约20μM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，I288N、I309T、L295A和F292A。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约1μM至约100μM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，L296A、F292A和F292S。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约1mM至约200μM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，野生型和I288N。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含以约1mM至约100μM Kd的亲和力结合ICAM-1的I结构域，例如，野生型、I288N和I309T。在以上实施方案中的亲和力表示在溶液中的I结构域和ICAM-1之间的相互作用。
在CAR构建中使用人I结构域的一个优点是，人I结构域以与人ICAM-1相当的亲和力结合鼠ICAM-1(分别是6nM相对于2nM)。与它的鼠同系物的交叉反应性会在具有人肿瘤异种移植物的临床前小鼠模型中实现I结构域CAR T细胞的靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性以及靶标上(on-target)肿瘤上(on-tumor)效力的检查。这是人I结构域在临床前模型中预测临床毒性的一个优点。相对比，R6.5scFv(源自小鼠杂交瘤克隆，R6.533)对人ICAM-1具有10nM的Kd(表1)，但是不与鼠ICAM-1交叉反应。
本发明的CAR包含(ii)一个跨膜的跨膜结构域。所述跨膜结构域可以源自天然多肽，或可以人工地设计。源自天然多肽的跨膜结构域可以得自任何膜结合或跨膜蛋白。例如，可以使用T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3-ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是主要包含疏水残基(诸如亮氨酸和缬氨酸)的多肽。在优选的实施方案中，所述跨膜结构域源自CD28或CD8，它们提供好的受体稳定性。
本发明的CAR包含(iii)一个或多个选自人CD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX40(CD137)、DAP10和GITR(AITR)的共刺激性结构域。在实施方案中，所述CAR包含CD28和4-1BB的两个共刺激性结构域。
胞内结构域(活化结构域)是CAR的信号传递部分。抗原识别以后，将受体簇和信号传递给细胞。最常用的胞内结构域组分是含有3个ITAM的CD3-ζ(CD3Z或CD3ζ)的胞内结构域组分。在抗原结合以后，其将活化信号传递给T细胞。CD3-ζ不可能提供完全感受态的活化信号，且可能需要另外的共刺激性信号传递。例如，一个或多个共刺激性结构域可以与CD3-ζ一起使用以传递增殖/存活信号。
本发明的CAR可以包含在I结构域的N-端的信号肽，使得当所述CAR在细胞(诸如T-细胞)内表达时，新生的蛋白被引向内质网并随后引向细胞表面，它在该处表达。所述信号肽的核心可以含有疏水氨基酸的长段，其具有形成单个α-螺旋的趋势。所述信号肽可以开始于短的带正电荷的氨基酸段，其帮助在易位过程中实施多肽的适当拓扑学。在信号肽的末端处，通常存在被信号肽酶识别和切割的氨基酸段。信号肽酶可以在易位过程中或易位结束后切割以产生游离的信号肽和成熟的蛋白。所述游离的信号肽然后被特异性蛋白酶消化。作为一个例子，所述信号肽可以源自人CD8或GM-CSF或其具有1或2个氨基酸突变的变体，前提条件是，所述信号肽仍然起作用以造成CAR的细胞表面表达。
本发明的CAR可以包含间隔序列作为铰链以连接I结构域和跨膜结构域，并在空间上使抗原结合结构域与胞内结构域分开。柔性间隔物允许结合结构域以不同的方向朝向从而实现它与肿瘤抗原的结合。所述间隔序列可以例如包含IgG1Fc区、IgG1铰链或CD8茎或它们的组合。人CD28或CD8茎是优选的。
本发明提供了编码上述CAR的核酸。通过常规方法可以从指定的CAR的氨基酸序列制备编码所述CAR的核酸。从前述NCBI RefSeq ID或每个结构域的氨基酸序列的GenBenk登录号，可以得到编码氨基酸序列的碱基序列，并可以使用标准的分子生物学和/或化学操作来制备本发明的核酸。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，且通过组合DNA片段(其使用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA文库得到)可以制备本发明的核酸。
可以将编码本发明的CAR的核酸插入载体中，并可以将所述载体引入细胞中。例如，可以使用病毒载体诸如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选地使用缺乏复制能力因而不能在被感染的细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以如下实现本发明的方法：基于载体具有的LTR序列和包装信号序列而选择合适的包装细胞，和使用所述包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的例子包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和可以用于包装逆转录病毒载体的包装细胞而生产的许多种类的逆转录病毒载体可广泛地商购得自许多公司。
本发明提供了被修饰成表达上述CAR的T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)。本发明的CAR-T细胞或CAR-NK细胞经由CAR的I结构域结合ICAM-1，由此将信号传递进细胞，并从而将细胞活化。表达CAR的细胞的活化随宿主细胞的种类和CAR的细胞内结构域而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖速率的提高、细胞表面分子的变化、杀死靶细胞等作为指标来证实。
被修饰成表达I结构域-CAR的T细胞或NK细胞可以用作疾病的治疗剂。所述治疗剂包含表达I结构域-CAR的T细胞作为活性成分，且可以进一步包含合适的赋形剂。赋形剂的例子包括本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种用于治疗癌症的过继性细胞治疗方法。所述方法包括以下步骤：将本发明的CAR-T细胞或CAR-NK细胞施用给遭受癌症的受试者，其中所述受试者的癌细胞过表达ICAM-1，且所述CAR-T细胞或CAR-NK细胞结合癌细胞以杀死所述癌细胞。本文中使用的“过表达”表示具有至少105个分子/细胞的ICAM-1表面表达的癌细胞。在一个实施方案中，所述CAR包含对ICAM-1具有约1至约1000μM、优选约1至约200μM、或约1至约20μM的亲和力的I结构域。适合通过本发明治疗的癌症包括、但不限于甲状腺癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
通过在功能上研究CAR亲和力(其逐步跨106倍范围)，并行地使用具有不同抗原表达水平的靶细胞，发明人在体外和在体内系统地检查了CAR亲和力和抗原密度对T细胞效力的影响。体外T细胞活化状态(如通过CD25、细胞因子释放和细胞毒性所测量的)依赖于亲和力和靶抗原密度，从而导致随着CAR亲和力和抗原密度的增加更有效的T细胞活化和靶标杀死。与微摩尔亲和力CAR T细胞(F292A)相比，纳摩尔亲和力CAR T细胞(TM,F292G)的活化阈值更少地依赖于抗原密度，与低至104个分子/细胞的抗原密度反应。相反，F292A CAR T细胞迅速地丧失裂解表达低于105个分子/细胞的靶抗原的细胞的能力。毫摩尔亲和力CAR T细胞(野生型,WT)在很大程度上不与具有低至中等抗原水平的靶细胞反应，需要106个分子/细胞的阈值抗原密度才会发生可检测的活化、细胞因子释放和靶标裂解。
表2显示了为了靶向具有指定的ICAM-1抗原密度的细胞，包含I结构域的CAR T细胞对ICAM-1的期望亲和力的范围。
表2.
CAR亲和力和体外抗肿瘤效能之间的定量和谐(harmony)与定量体内观察结果不一致，由此微摩尔亲和力(1-200μM或1-20μM)CAR-T细胞或CAR-NK细胞优于高亲和力CAR-T细胞或CAR-NK细胞，如通过在肿瘤部位处的繁殖速率、肿瘤根除速率、肿瘤复发频率和靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性水平所测量的。
I结构域CAR-T细胞或CAR-NK细胞与鼠ICAM-1交叉反应的能力允许精确地并同时地评估CAR-T细胞或CAR-NK对人肿瘤细胞的效力和对健康组织上的鼠ICAM-1的靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性。通过在T细胞上同时表达报告基因人生长抑素受体2(SSTR2)和I结构域CAR，继之以纵向正电子发射断层摄影术(PET)成像，可以实现过继转移的T细胞的体内时空成像。
毒性的开始似乎依赖于CAR亲和力和肿瘤负荷，如通过用最高亲和力(TM)CAR T细胞治疗的小鼠中的均匀死亡率、在F292G CAR治疗的具有较大肿瘤负荷的小鼠中观察到的毒性比率增加、和用微摩尔亲和力F292A CART细胞治疗以后可检测的毒性的缺少所证实的。
包含高亲和力突变体(约120nM-1nM)的CAR具有高效能，且它们能够以小于104/细胞的低ICAM密度结合T细胞。
与具有在纳摩尔范围(例如，约1-200nM Kd)内的亲和力的CAR相比，具有在微摩尔范围(例如约1-200μM Kd)内的亲和力的CAR会使对正常组织中的基础表达抗原的肿瘤外(off-tumor)毒性最小化，并且也增加治疗指数。具有在微摩尔范围内的靶标亲和力的CART细胞可以避免靶向具有基础抗原表达的健康组织，同时表现出对具有高靶标表达的肿瘤组织的增加的效能和长期效力。微摩尔亲和力CAR(诸如F292A-I结构域)使T细胞能够忽略表达小于105个分子/细胞的组织，该阈值会被间变性甲状腺肿瘤超过，但是健康组织通常不会超过。纳摩尔亲和力CAR T细胞(例如，TM、F292G和R6.5CAR)与靶抗原的接合可能导致非天然地较慢的解离速率(off rate)，从而偏离在TCR和pMHC之间天然地发现的相互作用的短暂和动态性质48。CAR的高亲和力和亲合力相互作用可以减少T细胞的连续杀死倾向，可能造成耗竭或增加的对活化诱导的细胞死亡的易感性49。尽管对ICAM-1具有纳摩尔亲和力的CAR T细胞可以工作，它们可能次优地工作，并且可能更易于耗竭和过度细胞因子释放，最终促进肿瘤外(off-tumor)毒性或肿瘤复发。
下述实施例进一步例证了本发明。这些实施例仅仅意图成为本发明的示例，不应解释为限制性的。
实施例
材料和方法
实施例1.细胞系和原代人淋巴细胞
从疾病控制中心(Center for Disease Control)得到人真皮微血管内皮细胞(HMEC-1)，并在补充了10％(v/v)胎牛血清(FBS,Atlanta Biologicals)、10mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽(Gibco)、100单位/ml青霉素-链霉素(Pen-strep)、1μg/ml氢化可的松(MP Biomedicals)和10ng/ml重组人表皮生长因子(Invitrogen)的MCDB 131培养基(Invitrogen)中培养。将小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3,ATCC)维持在补充了4mM L-谷氨酰胺、100单位/ml Pen-strep和10％FBS的Advanced Dulbecco氏改良的伊格尔培养基(ADMEM,Invitrogen)中。在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100单位/ml Pen-strep的ADMEM中培养HeLa细胞(ATCC)。在含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100单位/ml Pen-strep的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中培养8505C细胞(DSMZ)。将HMEC-1、bEnd.3、HeLa和8505c细胞用编码荧火虫萤光素酶-F2A-GFP(Biosettia)的慢病毒转导并基于荧光进行分选。
通过静脉穿刺术从健康志愿者供体得到人外周血。使用Ficoll-Paque PLUS(GEHealthcare)分离外周血单核细胞，并在补充了5％人AB血清(Sigma)、2mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽和30IU/ml人IL-2(Cell Sciences)的Optimizer CTS T-cell ExpansionSFM(Thermo)(T细胞培养基)中培养。24h以后除去非粘附细胞，并用Dynabeads CD3/CD28T细胞扩增仪(Thermo)以2:1的珠子:T细胞比率富集T细胞。随后将Dynabead-结合的T细胞以1x 106个细胞/ml的密度在含有IL-2的培养基中培养。将所有细胞在5％CO2保湿培养箱中在37℃温育。
实施例2.I结构域CAR载体的构建
从以前的研究衍生出遗传序列，其编码对ICAM-1具有不同亲和力的LFA-1I结构域27。将I结构域变体在C-端直接融合至CD8铰链、CD28跨膜结构域和包含CD28、CD137和CD3ζ的细胞质结构域的第3代CAR体系结构的细胞内部分。然后将完整CAR插入物亚克隆进pLenti主链29。使用‘核糖体跳跃’猪捷申病毒-1 2A(P2A)序列将用于CAR T细胞成像的报道基因SSTR2在N-端连接至I结构域以确保从相同mRNA可比较地产生CAR和SSTR2。
实施例3.慢病毒生产和T细胞转导
通过使用磷酸钙瞬时转染HEK 293T细胞来生产慢病毒。简而言之，将10μg转移基因、7.5μg pCMV-dR8.2(Addgene)和5μg pCMV-VSVG(Addgene)混合并与2M CaCl2一起温育，随后与2x HBSS一起温育。将得到的溶液逐滴加入在24h前接种了在10ml DMEM中的3.2x106HEK 293T细胞的10cm2细胞培养皿中。6h以后更换转染培养基。将含有慢病毒的培养基在转染后48和72h收获，穿过0.45μm过滤器过滤，并通过超速离心(在4℃在75,000x g 2h)浓缩。然后将慢病毒重新悬浮于含血清的培养基中并在-80℃冷冻。通过旋转感染(spinfection)(在32℃1,000g 1h)或通过与慢病毒一起温育过夜，在用抗-CD3/CD28Dynabeads活化后24-72h转导人T细胞。在第一次转导以后24h，将T细胞转导另外一次。在转导过程中和以后，将含有IL-2的培养基用含有人IL-7(10ng/ml)和IL-15(5ng/ml)(Peprotech)的培养基替换。通过与慢病毒一起单次温育过夜，转导Jurkat T细胞。
实施例4.体外靶细胞杀死测定
将2x 105个被稳定地转导以表达GFP和荧火虫萤光素酶的靶细胞(HMEC-1、bEnd.3、HeLa和8505c)以不同的效应物:靶标比率(E:T)与未转导的细胞或I结构域CAR T细胞一起共培养。在某些条件下，使用CRISPR/Cas9(Santa Cruz,#sc-400098；表示为8505C/-ICAM-1)分裂8505C细胞中的ICAM-1基因，或者可替换地，将8505C细胞暴露于1μg/ml脂多糖(LPS；大肠杆菌O26:B6,Sigma)12h以诱导ICAM-1的过表达(表示为8505C/LPS)。在含有150μg/ml D-萤光素(Gold Biotechnology)且没有补充细胞因子的T细胞培养基中进行共培养。使用平板读数器(TECAN infinite M1000PRO)测量发光，将在每种E:T条件下的读数归一化至未转导的T细胞:靶标共培养对照。
实施例5. 8505C小鼠模型、全身肿瘤成像和血清细胞因子分析
经由尾静脉将7.5x 105个8505C细胞注射进NSG小鼠中。在肿瘤细胞注射以后8-10天经由尾静脉注射1-3x 106个T细胞。基于使用R6.5CAR T细胞的先前研究选择注射时机，所述先前研究使用类似的CAR剂量直到异种移植后10天表现出肿瘤消除29。使用全身光学成像仪(In-Vivo Extreme,Bruker)执行活小鼠中的肿瘤异种移植物的发光成像。将小鼠用在2L/min O2中的2％的异氟烷麻醉。通过在胸腔和整个小鼠身体上的发光的积分，定量肿瘤负荷。对于血清细胞因子分析，经由尾静脉将50-100μl血液收集进在冰上的Eppendorf试管中。在通过在4℃在2,000g离心10min除去细胞沉淀物以后立即分离血浆，并在-80℃储存。使用Bio-Plex MAGPIX(Bio Rad)根据生产商的说明书一式两份地测量人细胞因子(GM-CSF、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α、CXCL10)。
实施例6.离体细胞分析
在适当的时间点从小鼠切除肿瘤异种移植物。将切除的肿瘤切碎，并冲洗穿过80μm细胞过滤网以得到单细胞混悬液。通过与1x RBC裂解缓冲液(eBiosciences)一起温育，裂解红血细胞。将剩余的细胞洗涤，重新悬浮于含有2％正常山羊血清的1x HBSS中，并用2μg/ml的小鼠IgG封闭10min。这之后用与2μg/ml小鼠抗-人CD3-Alexa Fluor 647(Biolegend)或2μg/ml兔抗-c-myc-Alexa Fluor 647(Biolegend)组合的1μg/ml碘化丙啶(Invitrogen)染色。在Gallios流式细胞计(Beckman Coulter)上获得得到的细胞。基于活细胞门控(碘化丙啶阴性的)确定最初的流式细胞计量术门。
实施例7.ICAM-1和CAR表达定量
使用得自杂交瘤(ATCC)的小鼠抗-人R6.5单克隆抗体(10μg/ml)确定不同细胞系上的ICAM-1表达。使用2μg/ml兔抗-c-myc-Alexa Fluor 647(Biolegend)检测T细胞上的I结构域CAR表达。将I结构域Jurkat T细胞变体与10μg/ml的融合至人Fcγ的重组人ICAM-1(R&D Systems)一起温育。然后将细胞洗涤，并在流式细胞计量术分析之前重新悬浮于1μg/ml兔抗-人PE(Santa Cruz生物技术)中。
实施例8.IFN-γ的体外测量
将靶细胞洗涤和以1×106个细胞/ml悬浮于不含细胞因子的T细胞培养基中。将100μl每种靶细胞一式三份地加入96-孔圆底板(Corning)中。将以5×106个细胞/ml重新悬浮在T细胞培养基中的T细胞与适当孔中的靶细胞组合。将平板在37℃温育24-48h。温育以后，将上清液收集用于ELISA以检测IFN-γ(Biolegend)。
实施例9.CD25和CD69染色
在96-孔板中将用I结构域CAR修饰的Jurkat细胞与靶细胞以1:1的效应物:靶标比率(1×105效应物:1×105靶标)共培养。将平板在37℃温育6h。温育以后，洗涤细胞，然后在冰上用2μg/ml抗-人CD25-别藻蓝蛋白(APC；Biolegend)标记30min。温育以后，洗涤样品，并通过流式细胞计量术分析。作为表达ICAM-1的细胞的替代，我们还使用用已知量的ICAM-1包被的微珠。将1x 106个硫酸盐胶乳微珠(8μm,ThermoFisher Scientific)重新悬浮于100uL PBS中在轻轻混合下在室温过夜，所述PBS含有指示量的与Cy5.5(Sulfo-Cyanine5.5NHS酯,Lumiprobe)缀合的人或鼠重组ICAM-1-Fcγ(R&DSystems)。将蛋白标记的颗粒沉淀并重新悬浮于含有0.1M甘氨酸pH 7.4的新鲜PBS中1h，同时使用上清液通过荧光(TECAN infinite M1000PRO)测量珠子吸附效率。用甘氨酸饱和珠子表面以后，将珠子沉淀并重新悬浮于含有5mM MgCl2的PBS中。将用每种I结构域CAR变体修饰的Jurkat细胞与ICAM-1-结合的胶乳珠子一起以1:3(细胞:珠子)比率在37℃温育过夜。然后将细胞收集，用2μg/ml抗-人CD69-APC(Biolegend)标记用于通过流式细胞计量术分析。
实施例10.V-底粘附测定
将V-底96-孔板(Corning)用鼠或人ICAM-1-Fcγ(10μg/ml在PBS中,pH7.4)或2％BSA在4℃包被过夜。然后将平板用2％BSA在37℃封闭1h。将I结构域CAR T克隆首先用CellTracker Orange根据生产商的方案染色，并然后在50μl含有5mM MgCl2和1％BSA的PBS中加入ICAM-1-包被的孔中。立即将平板在室温在200g离心15min。通过荧光平板读数器(TECAN infiniteM1000PRO)定量积累在V-底平板的底部的非粘附细胞。从实验测量结果的荧光强度值(FCAR和FNT)计算与ICAM-1结合的细胞，并归一化至来自用单独BSA包被的孔的荧光(FBSA):100x((FBSA-FCAR)/FBSA)/((FBSA-FNT)/FBSA)。
实施例11.18F-NOTA-奥曲肽(NOTAOCT)的标记
将NOTAOCT(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸-奥曲肽30,GMP级)作为1mg低压冻干的粉末(目录号9762,ABX Pharmaceuticals)得到。将NOTAOCT瓶内容物用18MW水稀释至200μl(5mg/ml溶液)并在4℃作为储备溶液储存。关于NOTA与氟-18的螯合31，将5μl NOTAOCT加入10μl 0.1M醋酸钠(pH 4)、6μl 2mM AlCl3和100μl含有约30mCi 18F。将溶液立即放在100℃的恒温混合器(Eppendorf)中并温育15分钟，随后冷却至室温并在15mlddH2O中稀释。将Sep-Pak light C18柱在3ml 100％乙醇中再生，并在5mlddH2O中洗涤2次，观察到的流速为10滴/分钟。然后将NOTAOCT加载至Sep-Pak柱，随后将其在15ml 18MW水中洗涤以消除任何残余的游离18F。将捕集的NOTAOCT使用300μl乙醇从柱洗脱并用注射用PBS稀释至1.5ml，得到在～15％乙醇等渗可注射溶液中的终产物。使洗脱液穿过0.2μm过滤器。通过反相HPLC检查终产物的纯度。
实施例12.PET/CT成像
在NOTAOCT注射后1-2h使用微-PET/CT扫描仪(Inveon,Siemens)获取登记的CT图像。以大约1s阶梯在1度角增量以圆锥-光束几何形状获取投影数据。使用250-750keV能量窗和6ns计时窗为每个研究获得至少1000万个一致事件用于PET。含有100μl 10％ID/cm3等同剂量的参比管用于定量体内NOTATOC摄取。为了计算小鼠肺内的NOTAOCT摄取，分别在肺的左和右侧画出椭圆以包封它们的覆盖区的大部分。假定100％的注射效率和25g体重，通过将％ID/cm3除以4，将％ID/cm3值(相对于在参比管中得到的计数计算)取近似值至标准摄取值(SUV 32)。使用AMIDE软件(http://amide.sourceforge.net)执行PET/CT图像的显影和分析。
实施例12.组织学
安乐死以后，经由气管给小鼠肺灌注4％低聚甲醛，并将五个肺叶中的每一个在固定后分离和包埋在石蜡中。将组织切割以产生5μm切片(Microtome,Leica)。将石蜡包埋的切片用苏木精和伊红(H&E)或仅苏木精染色用于CD3和GFP免疫染色(由HistoWiz,Inc.执行)。由有经验的病理学家执行组织学分析。
结果
统计分析
使用Prism(GraphPad)在指示的数据上执行单因素方差分析、Dunnett氏多重比较检验和未配对Student氏t-检验。
实施例13.具有亲和力的106倍逐步变化的ICAM-1特异性的CAR T细胞
根据Jin等人27和美国专利号8,021,668，使用源自LFA-1的I结构域(图1A-B；表1)构建对ICAM-1特异性的CAR构建体。为了试验突变体I结构域亲和力是否与CAR亲和力相关联，将HEK 293T和Jurkat T细胞用编码含有TM、F292G、F292A或WT I结构域的第3代CAR的慢病毒转导，并测定ICAM-1结合。将myc标签附加至每个I结构域变体的N-端以辅助CAR表达的测量(图1D-E)。为了避免Jurkat T细胞中与内源性LFA-1的背景ICAM-1结合，使用I结构域CAR-转导的HEK 293T细胞估计对ICAM-1的CAR亲和力。与表达I结构域CAR的HEK 293T细胞结合的重组人ICAM-1的水平与溶液亲和力测量结果相关联，其中相对于未转导的(NT)T细胞，TM表现出最强结合，继之以F292G和F292A，且没有可检测的与WT的结合(图1F)。还通过测量与重组人或鼠ICAM-1包被的V-底平板的细胞粘附，检查了对ICAM-1的差别CAR亲和力和与鼠ICAM-1的交叉反应性(图1G)。与未转导的细胞相比，用TM和F292G CAR转导的Jurkat细胞表现出更高的与人和鼠ICAM-1的结合水平。但是，尽管重组ICAM-1与表达F292A CAR的HEK 293T细胞的结合增加(与它们的表达WT I结构域的相应物相比)(图1F)，与表达NT或WTI结构域的细胞相比F292A CAR-Jurkat细胞缺乏与平板-结合的ICAM-1的任何另外结合(图1G)。在表现出与F292G相当的可溶性ICAM-1-结合(119相对于145nM，表1)的F265S I结构域的情况下，F265SCAR T细胞没有表现出与平板-结合的人ICAM-1的任何另外结合，而升高的结合对于鼠ICAM-1是更明显的。如预期的，被转导成表达R6.5CAR(其仅对人ICAM-1是特异性的)的T细胞表现出升高的与人ICAM-1的结合，但是对鼠ICAM-1却没有(图1G)。
实施例14.CAR亲和力和靶抗原密度对体外CAR T细胞活化的影响
使用表达I结构域CAR的Jurkat T细胞检查CAR亲和力和靶细胞中的ICAM-1抗原密度影响CAR T细胞活化的程度。将Jurkat T细胞与具有不同ICAM-1表达水平的各种靶细胞系一起温育。如下估计靶细胞系的ICAM-1表面密度：首先测定与它们结合的抗-ICAM-1抗体的水平，并将这些信号与使用8μm胶乳珠子得到的那些信号对比，所述胶乳珠子与已知量的缀合了cy5.5的R6.5抗体偶联(103-107个抗体/珠子)。使用与R6.5(黑色)一起温育以后从未标记(灰色)的偏移水平估计每个指示的靶细胞系中的ICAM-1密度。
靶细胞的组包括：HMEC-1和bEnd.3，分别代表具有ICAM-1的生理学水平的健康人和小鼠细胞(～104个分子/细胞)；表达中等水平(～105个/细胞)的间变性甲状腺癌(8505C)；和表达高ICAM-1水平(～106个/细胞)的宫颈癌(HeLa)细胞系。对于另外的对比，我们包括了具有CRISPR/Cas9介导的ICAM-1基因灭活的8505C(8505C/-ICAM-1)和用LPS处理过的8505C以上调ICAM-1表达(8505C/LPS)。表3总结了在本文所用的靶细胞中的ICAM-1位点密度。
表3.
通过测量CD25(IL-2受体α)和CD69表达，检查与靶细胞相互作用后CAR T细胞的活化。在与不同靶细胞系一起共温育24h以后，检查JurkatCAR T细胞(WT、F292A、F292G和TM)中的CD25表达(n＝3-4)。在与用106重组人ICAM-1-Fc分子包被的胶乳珠子一起温育以后，诱导CD69。在与LPS-刺激的8505C一起温育以后，在WT I结构域CAR T细胞中观察到升高的CD25水平，但是用表达更低水平的ICAM-1的其它细胞系没有。相反，当将高亲和力TM CAR T细胞与高ICAM-1表达细胞一起以及与表达基础水平的ICAM-1的HMEC-1和bEnd.3细胞一起温育时，看到增加的CD25表达。与缺乏ICAM-1表达的靶细胞(8505C/-ICAM-1)一起温育以后，在TMCAR T细胞上检测到低水平的CD25表达，可能是由于由TM CAR和Jurkat细胞上的ICAM-1的基础表达(～104个分子/细胞)之间的分子相互作用介导的同型细胞接触。除了与8505C/-ICAM-1一起共温育以后CD25表达接近背景水平以外，表达F292G的T细胞与TM类似地表现。微摩尔亲和力F292AT细胞表现出选择性活化，其表明仅在与8505C和8505C/LPS细胞一起温育后升高的CD25表达。这指示，F292A CAR T细胞活化需要>105ICAM-1分子/细胞的阈值靶抗原密度。不同于CD25的ICAM-1密度依赖性活化，甚至在没有靶细胞存在下观察到增加的CD69表达，表达水平与对ICAM-1的CAR亲和力密切相关，其没有被与ICAM-1包被的胶乳珠子一起温育进一步增强。相对于CD25，CD69诱导似乎需要更低水平的抗原密度阈值才能活化，其由CAR T细胞之间的同型相互作用提供。
实施例15.CAR亲和力和靶抗原密度对体外CAR T细胞细胞毒性的影响
验证CAR修饰的Jurkat T细胞的亲和力和抗原依赖性活化以后，我们试图检查CAR亲和力和抗原密度对体外原代T细胞活化和细胞毒性的影响。将原代T细胞用TM、F292A、F292G和WT I结构域CAR转导，并加给各种靶细胞以确定它们的体外细胞毒性效力。总体上，在所有I结构域变体CART细胞中在靶细胞裂解速率和ICAM-1表达之间存在正相关(HeLa>8505C/LPS>8505C>HMEC-1>bEND.3)(图2A)。当T细胞表达对ICAM-1具有更高亲和力的CAR时(TM>F292G>F292A>WT)，杀死速率也更快。
为了定量地对比亲和力变体CAR T细胞的杀死效力，使用可变斜率S形曲线(％活＝100/[1+10(t-τ_50％)*斜率])找到最佳拟合值，其描述达到50％杀死(τ_50％)所需的时间和Hill斜率(图2B)。对于更低亲和力CAR T细胞或相同CAR T细胞的更低抗原密度，达到50％靶标杀死的时间更长。随着相同靶细胞的亲和力增加(更低Kd)，Hill斜率(其对应于CAR T细胞的靶标杀死速率)更高。随着相同CAR T细胞的抗原密度增加，Hill斜率也更大。靶细胞的CAR T细胞杀死是特异性的，如通过观察到的除了TM以外的所有I结构域变体CAR对ICAM-1阴性的8505C细胞的杀死的缺乏所证实的。TM T细胞对8505C/-ICAM-1的低但是逐步杀死可能是由于由TM与T细胞中的ICAM-1的相互作用介导的同型细胞接触造成的细胞毒性活化。表4总结了通过将数据拟合至可变斜率S形曲线所确定的达到50％杀死的时间(小时)。
表4.
表5显示了通过将数据拟合至可变斜率S形曲线所确定的Hill斜率值。
表5.
在T细胞活化以后，诸如通过与CD3/CD28珠子一起温育(～105个分子/细胞)，可以诱导原代T细胞中的ICAM-1表达。与此相比，具有毫摩尔亲和力(Kd＝1.5mM)的WT CAR T细胞仅特异性地裂解HeLa细胞，从而指示对于～1mM Kd CAR T细胞而言大约106个分子/细胞的阈值抗原密度。重要的是，F292A和WT I结构域CAR T细胞(Kd>10μM)不与人和鼠健康对照细胞HMEC-1和b.END3反应(～104/细胞；图2A)。
CAR T细胞的IFN-γ释放与靶细胞死亡速率密切相关，其中在含有较高亲和力CART细胞和/或较高水平的靶抗原表达的共培养物中发现了递增的水平(图2D)。靶抗原密度依赖性的IFN-γ释放的一个例外是TM和F292G，其在没有靶分子存在下表现出显著量的IFN-γ释放(>1ng/ml)(8505C/-ICAM-1)。这再次可能由于T细胞之间的同型相互作用，这也得到难以繁殖TM CAR T细胞的观察结果的支持，特别当CAR表达水平较高时。微摩尔亲和力CART细胞(F292A)对IFN-γ的释放与靶细胞中的ICAM-1密度成比例，这通过与8505C/-ICAM-1一起温育后释放的缺乏和与HMEC-1、8505C、8505C/LPS和HeLa一起温育以该次序的逐渐增加来证实(图2D)。与WT I结构域对HeLa细胞的细胞毒性一致，与HeLa一起温育后的IFN-γ释放与其它较高亲和力CAR T细胞分泌的水平相当。
实施例16.调节亲和力的I结构域CAR T细胞的体内效力
我们检查了如何将亲和力依赖性的CAR T细胞体外细胞毒性谱转移至体内肿瘤异种移植物模型。在实体瘤中，CAR T细胞效力受它们的运输至肿瘤部位、穿透、连续裂解肿瘤细胞和根据肿瘤负荷经历扩张和收缩的能力影响。在这里，通过全身静脉内注射0.75x1068505C-FLuc+GFP+细胞对小鼠异种移植，随后在异种移植后8-10天用～1-3x106I结构域CART细胞(WT、F292A、F265S、F292G和TM)、SSTR2-R6.5CAR29、NT(未转导的)T细胞和无T细胞治疗(5-20％CAR表达)。通过荧火虫萤光素酶活性的全身发光成像来评价肿瘤负荷。原发肿瘤位于肺和肝，远处转移性病灶在全身可见(图3A)。接受无T细胞或NT T细胞的组群在肿瘤接种的3-4周内屈服于肿瘤负荷。用TM CAR T细胞治疗的小鼠表现出肿瘤负荷的快速最初减少；但是，在T细胞注射后大约7天，小鼠开始表现出由嗜睡和重量减轻指示的全身毒性的征状，导致在治疗后第15天之前死亡(图3A-B)。F292G CAR T细胞能够消除肿瘤，具有不一致的毒性发展，这似乎部分地依赖于在CAR T细胞治疗时的肿瘤负荷。例如，F292G(119nM亲和力)CAR T细胞的延迟输注(第10天)或在治疗时的较高肿瘤负荷导致更频繁的死亡。表达F265S(145nMKd)CAR的T细胞消除了肿瘤，没有可观察的毒性。这提示，～100nM Kd的I结构域CAR亲和力会限定近似阈值亲和力，在此以上(Kd小于100nM，诸如1-10nM)的治疗导致减少的高和低抗原密度之间的区分和增加的靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性的可能性。与体外WT CAR T细胞对8505C的杀死的有限或缺乏相一致，WT CAR T细胞治疗没有阻碍体内肿瘤进展，类似于NT T细胞(图3B)。相反，F292A CAR T细胞(其表现出与它的更高亲和力相应物相比慢得多的体外8505C杀死速率)实现了肿瘤负荷的快速减少，没有明显毒性，不论治疗时机如何(图3A-3B)。此外，F292A CART体内效力优于基于scFv的R6.5CAR，尽管与ICAM-1的亲和力降低了>1,000倍(10nM相对于20μM)，如通过更快的肿瘤清除速率和持久的肿瘤复发抑制所证实的(图3A)。
总之，与无T或NT T细胞治疗的小鼠相比，I结构域CAR T细胞的抗肿瘤效力导致统计上显著的组群存活增加(图3C)。但是，CAR T细胞治疗的甚至具有零至微小肿瘤负荷的小鼠开始表现出毒性征象(例如，重量减轻、掉毛)，其最终导致T细胞注射以后～10周的频繁死亡。这疑似与移植物抗宿主病有关34，与靶标上(on-target)肿瘤外(off-tumor)毒性无关，因为在用排它地靶向人ICAM-1的R6.5CAR T细胞治疗的小鼠中观察到类似的毒性。
实施例17.CAR T细胞动力学、效力和毒性的实时成像
为了通过PET/CT在时空上实时监测T细胞分布，我们使用核糖体跳跃P2A序列将成像报道基因SSTR2引入I结构域CAR载体中以确保CAR和报道物在T细胞表面上的相等表达(图4A)。SSTR2的表达能够实现灌注的、发射正电子的、SSTR2-特异性的放射性示踪剂18F-NOTA-奥曲肽的结合和细胞内积累30。然后通过微PET扫描仪以没有组织穿透问题的高分辨率检测发射的信号。SSTR2报道基因和Myc-标签表达的流式细胞计量术测量结果代表原代人T细胞的表面上的CAR。通过代表原代人T细胞表面上的CAR的SSTR2报道基因和Myc-标签表达的流式细胞计量术测量结果，通过抗体染色证实SSTR2和Myc标记的I结构域的表达。
如前给小鼠异种移植8505C肿瘤，并用NT或F292A CAR T细胞治疗。执行全身发光成像来估计肿瘤负荷，在同一天执行PET/CT成像来跟踪CART细胞分布(图4B)。在每个时间点，收集血液来测量人细胞因子用于与T细胞动力学关联。在小鼠中的PET/CT图像显示由放射性示踪剂排泄造成的胆囊、肾和膀胱中的预期背景水平(图4B；最右)。在NT治疗的对照组群中，观察到非特异性示踪剂摄取的小的但是逐渐的增加，这是由于递增的肿瘤负荷和有关的血液汇集的增加(图4B)。相反，在用SSTR2-F292A CAR T细胞治疗的小鼠中观察到特异性示踪剂摄取，从而证实了肺中的扩张和收缩期，高峰CAR T细胞信号大约出现在异种移植后22天，这是高峰肿瘤负荷以后4天(异种移植后18天)，并逐渐下降至背景水平(图4B-4C)。这表明了双相T细胞扩张和收缩现象。
得自治疗过的小鼠的血清的细胞因子分析证实了在高峰T细胞繁殖之前IFN-γ、IL-6和CXCL10浓度的激增，其也在肿瘤消除后和肺中的T细胞密度下降至背景水平以后恢复至背景水平(图4D)。
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<213> 智人
<400> 1
Tyr Asn Leu Asp Val Arg Gly Ala Arg Ser Phe Ser Pro Pro Arg Ala
1 5 10 15
Gly Arg His Phe Gly Tyr Arg Val Leu Gln Val Gly Asn Gly Val Ile
20 25 30
Val Gly Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Thr Gly Ser Leu Tyr Gln Cys
35 40 45
Gln Ser Gly Thr Gly His Cys Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Ser Asn
50 55 60
Tyr Thr Ser Lys Tyr Leu Gly Met Thr Leu Ala Thr Asp Pro Thr Asp
65 70 75 80
Gly Ser Ile Leu Ala Cys Asp Pro Gly Leu Ser Arg Thr Cys Asp Gln
85 90 95
Asn Thr Tyr Leu Ser Gly Leu Cys Tyr Leu Phe Arg Gln Asn Leu Gln
100 105 110
Gly Pro Met Leu Gln Gly Arg Pro Gly Phe Gln Glu Cys Ile Lys Gly
115 120 125
Asn Val Asp Leu Val Phe Leu Phe Asp Gly Ser Met Ser Leu Gln Pro
130 135 140
Asp Glu Phe Gln Lys Ile Leu Asp Phe Met Lys Asp Val Met Lys Lys
145 150 155 160
Leu Ser Asn Thr Ser Tyr Gln Phe Ala Ala Val Gln Phe Ser Thr Ser
165 170 175
Tyr Lys Thr Glu Phe Asp Phe Ser Asp Tyr Val Lys Trp Lys Asp Pro
180 185 190
Asp Ala Leu Leu Lys His Val Lys His Met Leu Leu Leu Thr Asn Thr
195 200 205
Phe Gly Ala Ile Asn Tyr Val Ala Thr Glu Val Phe Arg Glu Glu Leu
210 215 220
Gly Ala Arg Pro Asp Ala Thr Lys Val Leu Ile Ile Ile Thr Asp Gly
225 230 235 240
Glu Ala Thr Asp Ser Gly Asn Ile Asp Ala Ala Lys Asp Ile Ile Arg
245 250 255
Tyr Ile Ile Gly Ile Gly Lys His Phe Gln Thr Lys Glu Ser Gln Glu
260 265 270
Thr Leu His Lys Phe Ala Ser Lys Pro Ala Ser Glu Phe Val Lys Ile
275 280 285
Leu Asp Thr Phe Glu Lys Leu Lys Asp Leu Phe Thr Glu Leu Gln Lys
290 295 300
Lys Ile Tyr Val Ile Glu Gly Thr Ser Lys Gln Asp Leu Thr Ser Phe
305 310 315 320
Asn Met Glu Leu Ser Ser Ser Gly Ile Ser Ala Asp Leu Ser Arg Gly
325 330 335
His Ala Val Val Gly Ala Val Gly Ala Lys Asp Trp Ala Gly Gly Phe
340 345 350
Leu Asp Leu Lys Ala Asp Leu Gln Asp Asp Thr Phe Ile Gly Asn Glu
355 360 365
Pro Leu Thr Pro Glu Val Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Tyr Thr Val Thr
370 375 380
Trp Leu Pro Ser Arg Gln Lys Thr Ser Leu Leu Ala Ser Gly Ala Pro
385 390 395 400
Arg Tyr Gln His Met Gly Arg Val Leu Leu Phe Gln Glu Pro Gln Gly
405 410 415
Gly Gly His Trp Ser Gln Val Gln Thr Ile His Gly Thr Gln Ile Gly
420 425 430
Ser Tyr Phe Gly Gly Glu Leu Cys Gly Val Asp Val Asp Gln Asp Gly
435 440 445
Glu Thr Glu Leu Leu Leu Ile Gly Ala Pro Leu Phe Tyr Gly Glu Gln
450 455 460
Arg Gly Gly Arg Val Phe Ile Tyr Gln Arg Arg Gln Leu Gly Phe Glu
465 470 475 480
Glu Val Ser Glu Leu Gln Gly Asp Pro Gly Tyr Pro Leu Gly Arg Phe
485 490 495
Gly Glu Ala Ile Thr Ala Leu Thr Asp Ile Asn Gly Asp Gly Leu Val
500 505 510
Asp Val Ala Val Gly Ala Pro Leu Glu Glu Gln Gly Ala Val Tyr Ile
515 520 525
Phe Asn Gly Arg His Gly Gly Leu Ser Pro Gln Pro Ser Gln Arg Ile
530 535 540
Glu Gly Thr Gln Val Leu Ser Gly Ile Gln Trp Phe Gly Arg Ser Ile
545 550 555 560
His Gly Val Lys Asp Leu Glu Gly Asp Gly Leu Ala Asp Val Ala Val
565 570 575
Gly Ala Glu Ser Gln Met Ile Val Leu Ser Ser Arg Pro Val Val Asp
580 585 590
Met Val Thr Leu Met Ser Phe Ser Pro Ala Glu Ile Pro Val His Glu
595 600 605
Val Glu Cys Ser Tyr Ser Thr Ser Asn Lys Met Lys Glu Gly Val Asn
610 615 620
Ile Thr Ile Cys Phe Gln Ile Lys Ser Leu Tyr Pro Gln Phe Gln Gly
625 630 635 640
Arg Leu Val Ala Asn Leu Thr Tyr Thr Leu Gln Leu Asp Gly His Arg
645 650 655
Thr Arg Arg Arg Gly Leu Phe Pro Gly Gly Arg His Glu Leu Arg Arg
660 665 670
Asn Ile Ala Val Thr Thr Ser Met Ser Cys Thr Asp Phe Ser Phe His
675 680 685
Phe Pro Val Cys Val Gln Asp Leu Ile Ser Pro Ile Asn Val Ser Leu
690 695 700
Asn Phe Ser Leu Trp Glu Glu Glu Gly Thr Pro Arg Asp Gln Arg Ala
705 710 715 720
Gln Gly Lys Asp Ile Pro Pro Ile Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Glu
725 730 735
Thr Trp Glu Ile Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Glu Asp Lys Lys Cys
740 745 750
Glu Ala Asn Leu Arg Val Ser Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Ala Leu
755 760 765
Arg Leu Thr Ala Phe Ala Ser Leu Ser Val Glu Leu Ser Leu Ser Asn
770 775 780
Leu Glu Glu Asp Ala Tyr Trp Val Gln Leu Asp Leu His Phe Pro Pro
785 790 795 800
Gly Leu Ser Phe Arg Lys Val Glu Met Leu Lys Pro His Ser Gln Ile
805 810 815
Pro Val Ser Cys Glu Glu Leu Pro Glu Glu Ser Arg Leu Leu Ser Arg
820 825 830
Ala Leu Ser Cys Asn Val Ser Ser Pro Ile Phe Lys Ala Gly His Ser
835 840 845
Val Ala Leu Gln Met Met Phe Asn Thr Leu Val Asn Ser Ser Trp Gly
850 855 860
Asp Ser Val Glu Leu His Ala Asn Val Thr Cys Asn Asn Glu Asp Ser
865 870 875 880
Asp Leu Leu Glu Asp Asn Ser Ala Thr Thr Ile Ile Pro Ile Leu Tyr
885 890 895
Pro Ile Asn Ile Leu Ile Gln Asp Gln Glu Asp Ser Thr Leu Tyr Val
900 905 910
Ser Phe Thr Pro Lys Gly Pro Lys Ile His Gln Val Lys His Met Tyr
915 920 925
Gln Val Arg Ile Gln Pro Ser Ile His Asp His Asn Ile Pro Thr Leu
930 935 940
Glu Ala Val Val Gly Val Pro Gln Pro Pro Ser Glu Gly Pro Ile Thr
945 950 955 960
His Gln Trp Ser Val Gln Met Glu Pro Pro Val Pro Cys His Tyr Glu
965 970 975
Asp Leu Glu Arg Leu Pro Asp Ala Ala Glu Pro Cys Leu Pro Gly Ala
980 985 990
Leu Phe Arg Cys Pro Val Val Phe Arg Gln Glu Ile Leu Val Gln Val
995 1000 1005
Ile Gly Thr Leu Glu Leu Val Gly Glu Ile Glu Ala Ser Ser Met
1010 1015 1020
Phe Ser Leu Cys Ser Ser Leu Ser Ile Ser Phe Asn Ser Ser Lys
1025 1030 1035
His Phe His Leu Tyr Gly Ser Asn Ala Ser Leu Ala Gln Val Val
1040 1045 1050
Met Lys Val Asp Val Val Tyr Glu Lys Gln Met Leu Tyr Leu Tyr
1055 1060 1065
Val Leu Ser Gly Ile Gly Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Phe
1070 1075 1080
Ile Val Leu Tyr Lys Val Gly Phe Phe Lys Arg Asn Leu Lys Glu
1085 1090 1095
Lys Met Glu Ala Gly Arg Gly Val Pro Asn Gly Ile Pro Ala Glu
1100 1105 1110
Asp Ser Glu Gln Leu Ala Ser Gly Gln Glu Ala Gly Asp Pro Gly
1115 1120 1125
Cys Leu Lys Pro Leu His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Gly Gly Gly
1130 1135 1140
Lys Asp
1145

Claims (13)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其从N-端至C-端包含：
(i)人淋巴细胞功能相关抗原-1的αL亚基的I结构域，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激性结构域，和
(iv)活化结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述I结构域是野生型I结构域或其具有1-3个氨基酸突变的突变体。
3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述I结构域以约1mM至约1nM的亲和力结合ICAM-1。
4.根据权利要求2所述的CAR，其中所述野生型I结构域包含SEQ ID NO:1的130-310个氨基酸的序列。
5.根据权利要求4所述的CAR，其中所述突变体具有在野生型I结构域的氨基酸残基265、288、289、292、295或309处的一个或多个突变，或其具有至少95％同一性的序列，其中所述氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基。
6.根据权利要求5所述的CAR，其中所述突变体具有I288N、I309T、L295A、F292A、F292S、L289G、F292G和F265S的一个或多个突变。
7.根据权利要求5所述的CAR，其中所述突变体具有F265S/F292G、或F265S/F292G/G311C的突变。
8.根据权利要求1所述的CAR，其中所述共刺激性结构域选自CD28、4-1BB、ICOS-1、CD27、OX-40、GITR和DAP10。
9.根据权利要求1所述的CAR，其中所述活化结构域是CD3ζ。
10.一种分离的核酸序列，其编码根据权利要求1所述的CAR。
11.被修饰成表达根据权利要求1所述的CAR的T细胞或天然杀伤细胞。
12.一种用于治疗癌症的过继性细胞治疗方法，所述方法包括下述步骤：将根据权利要求11所述的CAR-T细胞施用给遭受癌症的受试者，其中所述受试者的癌细胞过表达ICAM-1，且所述CAR T细胞结合所述癌细胞以杀死所述癌细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症是甲状腺癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
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