UA76695C2 - Химера il6ril6 для лікування нейродегенеративних захворювань - Google Patents

Abstract

Винахід належить до неврологічних хвороб та розладів і стосується застосування химери IL6RIL6 для виробництва лікарського препарату для лікування травматичної дегенерації нервів, демієлінізуючих хвороб ЦНС або ПНС і/або нейродегенеративних захворювань.

Description

Опис винаходу

Даний винахід загалом відноситься до області неврологічних хвороб і розладів. Зокрема винахід відноситься 2 до нейродегенеративних захворювань, нейропротекції, мієлінізації нервів і утворенню клітин, які продукують мієлінову оболонку. Більш конкретно, даний винахід передбачає застосування химер 1І.6КІІ 6 для виробництва лікарською препарату для лікування неврологічних хвороб і розладів, особливо для нейропротекції і для лікування демієлінізуючих хвороб і посилення регенерації нервів.

Мієлінізація нервів є найважливішим процесом в формуванні і функціонуванні відділів центральної нервової 70 системи (ЦНО) і периферичної нервової системи (ПНО). Мієлінова оболонка, що оточує аксон, необхідна для правильного проведення електричних імпульсів по нервах. Втрата мієліну походить при ряді захворювань, серед яких неуважний склероз (НС), що впливає на ЦНС синдром Гійєна-Барре, хронічна запальна демієлінізуюча полінейропатія (ХЗДН) і інші захворювання дивись АбгатеКу апа Омадіа, 1997; Тгоідарбого, 1998, Нагипа еї аї., 19981). Незважаючи на різні етіологічні причини, такі як інфекційні патогени або аутоімунні атаки, всі 12 демієлінізуючі захворювання викликають втрату неврологічних функцій і можуть привести до паралічу і смерті.

Хоч терапевтичні засоби, що є в цей час знижують запальні атаки при НС і сповільнюють розвиток хвороби, існує необхідність в розробці терапії, яка може приводити до ремієлінізації і відновленню неврологічних функцій

І(АбгатекКу апа Омадіа, 1997, Ропіац еї аї., 19981.

Синтез мієліну є функцією спеціалізованих гліальних клітин: олігодендроцитів в ЦНС і мієлінізуючих

Шшванновських клітин в ПНС. Вказані два типи клітин в їх повністю диференційованому стані можна назвати мієлінізуючими клітинами. Мієлін являє собою ліпідну мембранну структуру, що містить ряд різних білків.

Основні білки мієліну (МБР) представляють головні компоненти (3095) білків мієліну ЦНС, а також ПНО. Експресія генів МБР і інших генів, що кодують різні білки мієліну - (наприклад, РО, РМР-22, МАС в ПНО, РІР, МО в ЦНО), включається під час термінального диференціювання олігодендроцитів і мієлінізуючих шванновських клітин. с

Джерелом походження цих клітин є ембріональний нервовий гребінець (Ргазег, 1991), з якого вони мігрують і Ге) зазнають диференціювання, яке протікає в декілька стадій. У розвиток шванновських клітин (ЗС), мабуть, залучено три основних стадії: 1) утворення попередників (р5С) з мігруючих клітин; 2) проліферація і перетворення в ембріональні ЗС (езсС), експресуючі білок 5100; 3) постнатальне термінальне диференціювання частини популяції езС в мієлінізуючі ЗС, які експресують МБР і інші білки мієліну (Кіоизві апа Сгивз, 19961. о

Клітини, мігруючі з нервового гребінця, дають початок не тільки реС, але також сенсорним і симпатичним Ге»! нейронам, клітинам гладкої мускулатури і клітинам, які досягають шкіри і волосяних фолікулів і стають пігментованими меланоцитами. На долю клітин нервового гребінця впливають різні індукуючі фактори: ее, диференціювання в гліальні клітини, в нейрони і м'язи активується неурегулінами, такими як гліальний фактор Ге) росту (00.Е), ВМР2/А і ТОБ-В, відповідно (Апаеггеп, 19971). Диференціювання в меланоцити може активуватися 3о факторами росту, такими як БЕСЕ або РОСЕ або ЗОБЕ |ЗЮюскег еї а/!., 1991; Апаегзоп, 19971. в

Завершальне диференціювання попередників шванновських клітин і олігодендроцитів в активно мієлінізуючі клітини і сама мієлінізація, мабуть, залежать від сигналів, що генеруються при взаємодії між аксонами нейронів і гліальними клітинами (етКе апа Спао, 1988; Тгарр еї аІ., 1988). Коли уривається контакт між « аксоном і шванновськими клітинами, як, наприклад, після пошкодження нерва, клітини повертаються в З 50 немієлінізуючий стан, і експресія генів білків мієліну втрачається Шеззеп апа МігеКу, 1991). Щоб зуміти с стимулювати мієлінізацію або ремієлінізацію після нервового захворювання або травми, надзвичайно важливо

Із» ідентифікувати фактори, які здатні індукувати синтез мієліну.

Пошкодження ЦНС, індуковане гострими інсультами, включаючи травму, гіпоксію і ішемію, може впливати як на нейрони, так і на білу речовину. Хоч найбільша увага приділялася процесам, що приводять до загибелі нейронів, зростаюча кількість даних свідчить про те, що пошкодження олігодендроцитів, які мієлінізують це. аксони, також є характерною складовою пошкодження ЦнНе. Так, патологія олігодендроцитів була

Ге») продемонстрована в дуже ранній фазі після ішемії головного мозку (З години) у пацюків, свідчачи про те, що ці клітини навіть більш вразливі до ексцитотоксичних подій, чим нейронні клітини |Рапіопі еї аІ. 1996). Одним з б потенційних кандидатів, що опосередковують загибель клітин, є помітне підвищення концентрації глутамату, яке (Те) 20 супроводжує багато які гострі пошкодження ЦНС (іріоп еї аї. 1994). Дійсно, виявили, що навіть крім нейронів олігодендроцити експресують функціональні рецептори глутамату, що відносяться до підтипу АМРА/каїнату. сл Крім того, олігодендроцити виявляють високу вразливість до застосування глутамату |Мсеропагїа еї аї. 1998).

Нейрегуліни, такі як СОР, які діють на ембріональні попередники шванновських клітин, також є факторами виживання, росту і дозрівання постнатальних олігодендроцитів і шванновських клітин в пошкоджених нервах, і 29 ЗО є одним з мітогенних факторів, що надаються контактом аксона |Горіїсо еї а!., 1996). Рекомбінантний НОСЕ2

ГФ) може посилювати ремієлінізацію при тривалому введенні в моделі неуважного склерозу у мишей ІСаппеїа еї аї|., 1998)| або в роздробленому периферичному нерві |СНеп еї аї, 1998). Іншим цитокіном, який індукується в о шванновських клітинах контактом аксона, є циліарний нейротрофічний фактор СМТЕ (ее еї аї., 1995). Було показано, що СМТЕ, а також фактор, що інгібує лейкемію (ГІР). стимулюють виживаність олігодендроцитів 60 оптичного нерва, що культивуються іп міго з БЕОЕ або РОСБЕ, і збільшують кількість олігодендроцитів, які експресують МБР, в цих культурах |Мауег еї аї, 1994). Однак при додаванні до гліальних клітин-попередників

СМТЕ ї ПЕ, мабуть, переважно сприяють диференціюванню астроцитів і індукують експресію маркера СБАР астроцитів, тоді як на олігодендроцити вони надають в основному дію, пов'язану з виживаність, надаючи при цьому невеликий вплив на рівень експресії гена МБР |(Кайп апа Ое Меїйв, 1994, Воппі еї аїЇ, 1997). Проте, бо комбінації СМТЕ з нейротрофічним фактором, отриманим з головного мозку, ВМОЕ, поліпшують відновлення пошкодженого периферичного сідничного нерва |Но еї аї, 19981).

СМТЕ ії МЕ є цитокінами, діючими через загальну рецепторну систему, яка включає в себе рецептор ГІР (ЛЕК) ії ланцюг одр130, останній також с частиною рецепторного комплексу інтерлейкіну-б (І/-6) Пр еї аї., 1992). Тому СМТЕ і ПЕ є частиною ІІ -б-сімейства цитокінів. У випадку СМТЕ ії ГЕ сигнальна трансдукція здійснюється за допомогою димеризації ГІЕК з др130, тоді як у випадку з ІІ -6 сигнал генерується за допомогою димеризації двох ланцюгів др130 (МигаКаті еї а/!., 1993). Для того, щоб зв'язати др130,11І -6 утворює комплекс з ланцюгом рецептора ІІ -6, який існує на певних клітинах у вигляді трансмембранного білка дрв8о, але розчинна форма якого також може функціонувати як агоніст ІЇ/-б6 коли доставляється із зовнішньої " "сторони клітини /о Тада еї аї, 1989, Моміск еї аї, 1992). При злитті повних кодуючих районів кКДНК, що кодують розчинний рецептор ІІ -6 (81 -6К) і 1-6, рекомбінантну химеру ІІ 6КІІ 6 можна продукувати в клітинах СНО |СНебаїй еї аї|., 1997, МУО99/025521. Вказана химера ІІ 6КІІ Є володіє підвищеною біологічною активністю і зв'язується іп міо з ланцюгом др130 з набагато більшою ефективністю, ніж суміш ІІ -6 з 8вІ! -6К (КопПеї еї а/ї., 1999).

Оглядовий аналіз ефектів 1-6 на клітини центральної і периферичної нервової системи свідчить про те, що /5 Чцитокін може надавати захисну дію на нервові клітини, а також бере участь в запальних нейродегенеративних процесах |Садіепі апа ОМеп, 1997, Мепавеї еї аї, 1998). СМТЕ ї ПЕ були набагато більш активними при дії на гліальні клітини, ніж ІЇ/-6, при стимуляції диференціювання астроцитів, і не спостерігалося дії на клітини, іца продукують білки мієліну (Кайп апа Ое Меїйїз, 1994). Було виявлено, що 1/-6 запобігає індукованій глутаматом загибелі клітин в гіпокампі |(Матада еї аІ.,, 1994), а також стріарних нейронів |Гоцтопа еї аї., 1992). Механізм нейропротекції І/-6, направленої проти токсичності, що викликається КМОА, селективним агоністом рецепторів глутамату ММОА-підтипу, ще не відомий. Дійсно було виявлене, що 1І/-6 посилює опосередковане ММОА підвищення внутрішньоклітинного вмісту кальцію. У трансгенних мишей, що експресують більш високі рівні як І/-6, так і розчинного ІІ -6К (5ІЇ/-6К), спостерігали прискорену регенерацію нервів після пошкодження під'язичного нерва, як показане ретроградним міченням ядер під'язичного нерва в головному мозку с (Ніюїа еї аї, 1996). У вказаній роботі при доданні І/-б і 85І/-6К до культур клітин гангліїв дорсальних корінців (ОКО) показане підвищене подовження нейритів нейронів, але не повідомлялося про дію на мієлінізуючі і) клітини.

У світлі представлених вийде даних не було показано, що СМТЕЛІЕ або суміш 1-6 і 5І/-6К індукують термінальне диференціювання гліальних клітин в мієлінізуючі клітини. Однак, як підкреслено вище, стимуляція" ю зо Диференціювання мієлінізуючих клітин мала б величезну цілющу дію для пацієнтів, страждаючих демієлінізуючими або нейродегенеративними захворюваннями. б»

Цитування якого-небудь документа в даній роботі не означає визнання того, що такий документ відноситься «о до попереднього рівня техніки або матеріалів, що обговорюються відносно патентоспроможності якого-небудь пункту формули винаходу даної заявки. Будь-яке твердження відносно змісту або дати будь-якого документа ісе) зв засноване на інформації, доступній заявникам під час подачі заявки на видачу патенту, і не є визнанням ї- коректності такого твердження.

Метою даного винаходу є надання способів лікування і/або запобігання неврологічним захворюванням або розладам. Зокрема, метою даного винаходу є надання способів стимулювання або посилення диференціювання попередників або диференційованих гліальних клітин в мієлінізуючі клітини. Основою винаходу є застосування « рекомбінантного химерного білка ІІ 6КІІ 6, який володіє помітно більш високої афінністю до одр130, чим суміш з с І--6 ї БІ -6К.

Наступною метою даного винаходу є надання способів стимулювання або посилення мієлінізації або ;» ремієлінізації пошкоджених волокон, що показано за допомогою індукованої ремієлінізації аксонів після аксотомії сідничного нерва іп мімо в доповнення до мієлінізуючої дії Ії -Є-химери на індукцію генів мієліну іп міго.

Метою даного винаходу також є застосування химери ІІ 6КІІ 6 для збільшення кількості шванновських клітин, -І що розвиваються в культурах гангліїв дорсальних корінців (ОКО). Крім того, метою даного винаходу є застосування ІЇ ЄКІЇ Є для індукції диференціювання вказаних клітин до того моменту, коли вони накручуються

Ме, навколо аксонів і продукують основний білок мієліну, як показано в спільних культурах ліній шванновських

Ге» клітин і первинних ОКО.

Іншою метою даного винаходу є застосування химери ІІ 6КІ! 6 для індукції транскрипції генів основних білків ік мієліну (МЕР) в системі трансдифференціювання, в якій клітини з фенотипом меланоцитів перетворюються в сп клітини шванновського мієлінізуючого фенотипу, як показано при дії ІІ ЄКІІ 6 на меланому мишей.

Іншою метою даного винаходу є застосування химери ІІ 6КІІ 6 як агента нейропротекції і для запобігання загибелі нервових клітин в гіпокампі, районі, залученому до кодування пам'яті, і районі, який виявляє ранню ов дегенерацію при хворобі Альцгеймера і ішемії.

Іншою метою даного винаходу Її застосування химери І 6КІ!/б як протекторного засобу проти процесу (Ф, нейротоксичності, що ініціюється збуджуючими амінокислотами, як показано за допомогою захисту від ка нейротоксичності, що індукується глутаматом, що забезпечується химерою 1-6 в первинних культурах нейронів мозочка новонароджених пацюків. во Запропонований молекулярний механізм, по якому ІІ6КІ/б індукує і репресує специфічні фактори транскрипції, які викликають індукцію диференціювання генів МВР в гени мієлінізуючого фенотипу.

Таким чином, даний винахід пов'язаний із застосуванням химери ІІ 6КІЇ 6 для виробництва лікарського засобу для лікування і/або запобігання неврологічним захворюванням і розладам. Зокрема, даний винахід пов'язаний із застосуванням химери ІІ 6ЄКІІЇ б для виробництва лікарського засобу для лікування травматичної дегенерації 65 нерва, демієлінізуючих захворювань ЦНС або ПНО і/або нейродегенеративних захворювань.

Більш конкретний винахід пов'язаний із застосуванням химер ІІ 6КІІ/ 6 при лікуванні неуважного склерозу

(НО), хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона або бічного аміотрофічного склерозу (БАС, АЇ 5).

Винахід також пов'язаний з фармацевтичними композиціями, що містять "химеру ІІ 6КІІ 6, необов'язково разом з однією або більшою кількістю фармацевтично прийнятних наповнювачів, для лікування і/або запобігання неврологічному захворюванню або розладам. Зокрема, фармацевтична композиція являє собою композицію для лікування травматичної дегенерації нервів, демієлінізуючих захворювань ЦНС або ПНС (і/або нейродегенеративних захворювань.

Переважним застосуванням фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом є лікування НС, хвороби

Альцгеймера, хвороби Паркінсона або БАС. 70 На Фіг.1 показане збільшення МВР-РНК в культурах шванновських клітин, оброблених химерою ІІ КІ! 6 або форсколіном (ЕЗК), або - зліва - необроблених (НО).

На Фіг.2 показана проліферація недиференційованих клітин "оїї-пеи", виміряна через 24, 48 і 72 години після обробки різними кількостями химери ІІ 6КЛІ 6.

На Фіг.З показано, що ІІ 6КІІ 6 сильно індукує МРНК МБР (А) і знижує синтез мРНК Рах-3 (В) в клітинах Е10.9 /5 З плином часу. НО означає необроблені клітини.

На Фіг.4 показане порівняння нейропротекції під дією одного тільки І/-б6 і химерою 1-6 у відношенні нейротоксичності, опосередкованої ММА, в органотипових зрізах гіпокампу.

На Фіг.5 показано пролонгована нейропротекторна дія химери 1//-6 проти дії одного тільки 1/-6 в органотипових зрізах гіпокампу.

На Фіг.6 показана дія химери ІІ 6КЛІ Є на виживаність нейронів, позбавлених МОРЕ, після 24 годин обробки, як виміряно за допомогою МТ Т-аналізу.

Згідно з винаходом, було виявлено, що додавання рекомбінантного білка ІІ бІЇ 6К до культур клітин гангліїв дорсальних корінців або клітин меланоми стимулює диференціювання цих клітин в мієлінізуючі клітини. Також було виявлено, що додавання рекомбінантного білка || бІЇ 6К до спільних культур нейронів і шванновських клітин сч ов індукує останні до утворення регулярної оболонки навколо аксонів. Тому винахід стосується застосування химери ІЇ6КІЇ/б для виробництва лікарського засобу для того, щоб утворити мієлінізуючі клітини або і) стимулювати, посилити або прискорити утворення мієлінізуючих клітин.

Химера 1-6, крім того, індукує ремієлінізацію іп мімо перерізаних волокон після аксотомії сідничного нерва у пацюків. Тому винахід, крім того, відноситься до застосування химери ІІ/6КІ/б для виробництва ю зо лікарського засобу для індукції, посилення або прискорення ремієлінізації, зокрема, після пошкодження або травми нерва або пошкоджень аксонів. б»

Далі, було виявлено, що додавання рекомбінантного білка І/6І./бК до органотипових культур індукує Ге пролонговану захисну дію від нейротоксических агентів. Тому винахід також відноситься до застосування химери

ІЄКІЇ/б для виробництва лікарського засобу для індукції, посилення, пролонгації або прискорення ісе) нейропротекції, зокрема, від нейротоксичних агентів, і для інгібування, зниження або сповільнення загибелі ї- нейронів, яка може бути, наприклад, наслідком апоптозу.

Даний винахід стосується застосування "химери ІІ КІ! 6" (яку також називають "І 6КІІ 6" або химерою ІІ -6), яка являє собою рекомбінантний глікоиротеїд, отриманий злиттям повної кодуючої послідовності розчинного

І -б-рецептора 85-Ма! природного походження з повною кодуючою послідовністю зрілого ІЇ-6 природного « походження, при цьому, обидві вони походять з клітин людини. Химеру ІІ.6КІІ-6 можна продукувати в будь-яких шщ с придатних еукаріотичних клітинах, таких як клітини дріжджів, клітини комах і ним подібні. Химеру переважно й продукують в клітинах ссавців, найбільш переважно - в отриманих методами генної інженерії клітинах СНО, (як и? описано в УУО 99/025521. Незважаючи на те, що переважний білок, який походить з клітин людини, фахівцеві в даній області буде зрозуміло, що подібний злитий білок будь-якого іншого походження можна використати згідно

З винаходом, при умові, що він зберігає описану тут біологічну активність. -і Більш конкретно, даний винахід стосується застосування химери І/6бК.Л16, для того, щоб стимулювати диференціювання попередників або диференційованих гліальних клітин в мієлінізуючі клітини. Як показано в

Фо даній роботі, процес диференціювання мієлінізуючих клітин, індукований ІІ 6КІІ 6, залучає як активацію генів, б необхідних для утворення мієлінової оболонки навколо аксонів нейронів, так і репресію гена, необхідного для

Підтримки немієлінізуючих фенотипів. іс, Згідно з даним винаходом, експериментально було виявлено, що додавання химери ІІ 6КІІ/ 6 до культур 4 клітин ембріональних гангліїв дорсальних корінців (ерксо), виділених з ембріонів мишей на 14-15 день вагітності, впливає надзвичайно сильним чином на розвиток попередників шванновських клітин, присутніх в ОКО.

Після 2-5 днів в культурі має місце помітне збільшення кількості ембріональних шванновських клітин, помітна

Зміна фенотипу цих клітин, які починають утворювати з своїх мембран оболонку навколо аксонів ОКО, і індукція

МБР. Згідно з даним винаходом, крім гою, експериментально виявлене, що в спільній культурі шванновських іФ) клітин з нейронами химера 1-6 може індукувати значне збільшення скріплення шванновських клітин вздовж ко немієлінізованих аксонів протягом 5 годин. Шванновські клітини, які мітили РісогодоЇїд, довшали, і через декілька днів можна було бачити, як їх цитоплазма, що флуорисцує, формувала регулярну оболонку навколо бо аксонів. Без химери, або в присутності МОРЕ, шванновські клітини зв'язуються набагато менше і не утворюють оболонку.

Тому винахід, крім того, відноситься до застосування химери ІІ ЄКІІ 6 для виробництва лікарського засобу для індукції проліферації і/або, диференціювання шванновських клітин, а також мієлінізації шванновськими клітинами в периферичній нервовій системі. 65 Згідно з даним винаходом, крім того, було показано, що химера І//-6б може індукувати ремієлінізацію периферичних нервів іп мімо. Після аксотомії сідничного нерва у пацюків і накладення проксимального і дистального обрізків химера 1//-6б могла індукувати регенерацію периферичних нервів і ремієлінізацію перерізаних волокон іп мімо. У присутності химери І/-6 виявили 4-кратне збільшення кількості і товщини мієлінізованих волокон, і збільшення ремієлінізації більш віддалених волокон. Тому винахід крім того відноситься до застосування химери ІІ 6КІІ 6 для виробництва лікарського засобу для індукції ремієлінізації в периферичній нервовій системі.

Більш того, також було виявлено, згідно з даним винаходом, що химера І/-6 може індукувати експресію генів, що кодують компоненти білків мієліну, таких як гени МВР, РІР ії РО в мієлінізуючих клітинах периферичної нервової системи, таких як шванновські клітини, і в клітинах центральної нервової системи, таких у як олігодендроцити. Тому винахід, крім того, відноситься до застосування химери ІІ 6К.І 6 для виробництва лікарського засобу для індукції мієлінізації і/або ремієлінізації олігодендроцитами в центральній нервовій системі.

Згідно з даним винаходом, також було виявлено, що додавання химери ІІ 6КІІб до культур лінії клітин меланоми мишей В16/Е10.9 індукує експресію гена МБР в межах 6-12 годин. Індукуються інші гени, які кодують білки мієліну, такі як ген СьЬІРази, тоді як експресія генів, які залучені в меланогенез (утворення меланінових 7/5 Пігментів), таких як ген тирозинази, сильно репресована. Клітини Е10.9, оброблені ІІ! 6КІІ 6, також зазнають помітної морфологічної зміни, і придбавають фенотип, подібний фенотипу шванновських клітин. Фейотипічні зміни і індукція специфічних генів мієліну підтверджують гіпотезу про те, що 16КІ/б викликає трансдиференціювання клітин з стану меланоцитів в стан мієлінізуючих клітин. Оскільки в ембріонові клітини, мігруючі з нервового гребінця, можуть давати початок або меланоцитам, або мієлінізуючим шванновським клітинам і олігодендроцитам, передбачається, що І 6КІ/б може впливати на долю клітин і стимулювати утворення мієлінізуючих клітин. Тому винахід також відноситься до застосування химери ТІ6КІ/б для виробництва лікарського препарату для індукції, стимулювання, посилення або прискорення утворення мієлінізуючих клітин в периферичній і в центральній нервовій системі і/або для індукції трансдиференціювання меланоцитів в мієлінізуючі клітини. сч

Крім того, відповідно до даного винаходу, показано, що ІІ 6КІ/б діє при придушенні гомеобоксного гена

Рах-3, гена, який експресується в клітинах ембріонального нервового гребінця перед тим, як вони і) диференціюються в мієлінізуючі шванновські клітини І(Кіоивзві апа Огивв, 1996). Відомо, що Рах-3 репресує ген

МБР. Тому, мабуть, репресія Рах-3 є ключовою подією в кінцевому дозріванні мієлінізуючих клітин. Отже,

ІІ 6КІ.6 діє на ключове перемикання диференціювання (а саме, репресію рах-3). ю зо Рах-3 є транс-активатором фактора транскрипції МІТЕ, пов'язаного з мікрофтальмією, який, в свою чергу, індукує і підтримує експресію гена тирозинази і інших генів, які відповідають за меланоцитний фенотип. Тому Ме виявлення швидкої репресії Рах-3 за допомогою ІІ 6КІЇб може пояснити молекулярні події, які стимулюють Ге мієлінізуючу активність клітин, що походять з нервового гребінця. Після пошкодження нерва мієлінізовані аксони зазнають демієлінізації в ході валеровського переродження. Під час цього процесу в шванновських ісе) клітинах меншає експресія гена МВР і інших родинних білків мієліну. Має місце супутній процес стимуляції ї-

Рах-3 і ОРАР, який означає реверсію від мієлінізуючих ЗС до немієлінізуючих і проліферуючих 5С (Кіоизві апа

Сгивзв, 1996). Згідно з даним винаходом, химера ІІ 6КІІ 6, мабуть, є ефективним цитокіном для повернення в початковий стан після процесу валеровської дегенерації нервів за допомогою репресування Рах-3 і індукування

ЗС до відновлення їх мієлінізуючої активності. Такі ж міркування можуть бути застосовані до демієлінізуючих « захворювань головного мозку, оскільки, подібно процесам при травмі, нейродегенерація при цих захворюваннях 7) с посилюється внаслідок процесу демієлінізації, що здійснюється макрофагами і іншими запальними клітинами.

Тому винахід також стосується застосування химери ІІ 6КІІ Є для виробництва лікарського засобу для лікування ;» пошкодження нервів і/або травматичної дегенерації нервів і/або пошкодження аксонів.

І/6КІІ6 можна ін'єкувати мишам, в яких аутоїмунна демієлінізація була індукована імунізацією МВР, як модельна система хронічного рецидивуючого неуважного склерозу |Саппейа еї аї, 1998). Здатність ІІ-6КІІ6 -І індукувати гени білків мієліну і диференціювання мієлінізуючих гліальних клітин можна спостерігати іп мімо, використовуючи цей фармацевтичний зразок. Тому винахід, крім того, відноситься до застосування химери

Ме, І/ЄКІЇб для виробництва лікарського засобу для лікування і/або запобігання аутоїмунних демієлійізуючих б захворювань, зокрема, для лікування і/або запобігання неуважному склерозу.

Також було показано, що химера 1-6 володіє нейропротекторною дією, запобігаючи втраті життєздатності ік нервових клітин, індукованої ексцитотоксичними агентами в районах, залучених до кодування пам'яті і що сп виявляють ранню дегенерацію при хворобі Альцгеймера і ішемії. Виявлено, що химера 11 -6 захищає нейрони від нейротоксичності, індукованої глутаматом. Тому винахід відноситься до виробництва лікарського засобу для захисту нервових клітин від загибелі, зокрема, внаслідок дії нейротоксичних агентів, і для лікування і/або запобігання нейродегенеративних захворювань, подібних, наприклад, хворобі Альцгеймера, хворобі Паркінсона або БАС. (Ф) Крім того, до неврологічних захворювань, які можна лікувати химерою ІІ 6КІІ6, відносяться інсульти, ка порушення рухів, епілепсія, біль і тому подібне.

Мають на увазі, що визначення "фармацевтично прийнятний" охоплює будь-який носій, який не заважає во ефективності біологічної активності активного інгредієнта і який не токсичний для господаря, якому його вводять. Наприклад, для парентерального введення химера І б6КІ/б може бути приготована в дозованій лікарській формі для ін'єкції в таких наповнювачах як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін або розчин Рінгера.

Химеру ІІ 6КІІ 6 можна вводити пацієнту, який потребує такого введення, різними шляхами. Шляхи введення б5 Включають в себе інтрадермальний, трансдермальний (наприклад, в композиціях уповільненого вивільнення), внутрішньом'язовий, внутрішньочеревний, внутрішньовенний, підшкірний, пероральний, епідуральний,

локальний і інтраназальний шляхи. Можна використовувати будь-який інший терапевтично ефективний шлях введення, наприклад, абсорбцію через епітеліальні або ендотеліальні тканини, або за допомогою генної терапії, при якій пацієнту вводять молекулу ДНК, що кодує химеру ІІ 6КІІ 6 (наприклад, за допомогою вектора), яка

Викликає експресію і секрецію химери ІІ 6.1 6 іп мімо. Крім того, химеру ІІ 6КІЇ Є можна вводити разом з іншими компонентами біологічно активних агентів, таких як фармацевтично прийнятні поверхово-активні речовини, ексципієнти, носії, розріджувачі і наповнювачі.

Для парентерального (наприклад, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового) введення химеру

І/ЄКІЇб можна приготувати в композиції у вигляді розчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого порошку /о вазом з фармацевтично прийнятним парентеральним наповнювачем (наприклад, водою, фізіологічним розчином, розчином декстрози) і добавками, які підтримують ізотонічність (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консерванти або буфери). Композицію стерилізують способами, що традиційно використовуються. "Ефективна кількість" відноситься до кількості активних інгредієнтів, яка є достатньою, щоб вплинути на 7/5 течію і тяжкість описаних вище захворювань, приводячи до ослаблення або ремісії такої патології. Ефективна кількість буде залежати від шляху введення і стану пацієнта.

Доза, введена індивідууму у вигляді однократної або багаторазових доз, буде варіювати, в залежності від багатьох факторів, включаючи фармакокінетичні властивості химери ІЇ6КІ/б, шлях введення, стан і характеристики пацієнтів (стать, вік, маса тіла, здоров'я, ріст), міра виявлення симптомів, супутнє

Лікування, частота лікування і бажаний ефект. Можливе коректування і маніпулювання встановленими межами доз в рамках компетенції фахівців, а також способів іп мігго і іп мімо визначення ремієлінізації нервів.

Хоч винахід буде описаний в зв'язку з його конкретним варіантом, буде зрозуміло, що він допускає додаткові модифікації. Мається на увазі, що дана заявка охоплює будь-які варіації, застосування або переробки винаходу, які загалом слідують принципам винаходу і які включають в себе такі відступи від даного опису, які сч ов УЗГОДЯТЬСЯ З відомою або звичайною практикою в області, до якої відноситься винахід, і які можуть бути застосовані до основних елементів, вказаних вище, як викладено нижче в рамках прикладеної формули і) винаходу.

Всі цитовані тут матеріали, включаючи статті або анотації в журналах, опубліковані і неопубліковані заявки на видачу патенту, видані або іноземні патенти, або будь-які інші матеріали, включені тут у вигляді ю

Зо посилань в повному об'ємі, включаючи всі дані, таблиці, фігури і текст, представлені в дитованих матеріалах.

Крім того, повний зміст цитованих публікацій в межах матеріалів, що використовуються при підготовці даної Ме заявки, також включений у вигляді посилань в повному об'ємі. «о

Даний винахід тепер буде описаний більш детально на основі наступних не обмежувальних прикладів і супроводжуючих малюнків. ісе)

ПРИКЛАДИ ча

Приклад 1: Вплив ІІ ЄКІ! Є на мієлінізацію і ремієлінізацію іп міго

У спинному мозку дорсальний корінець містить по суті чутливі нейрони, які формують синапи в гангліях дорсальних корінців (ОКО). Під час ембріогенезу у мишей (на е14-е15 день), ОКО є відповідним джерелом нейронів і ембріональних шванновських клітин, які ще не диференційовані в мієлінізуючі С: Способи отримання « експлантатів ОКО для культур іп мйго описані Ії (1998). Культивування здійснювали на покрівних склах, з с вміщених в лунки планшетів Совзіаг, в середовищі Е12/ОМЕМ (бірсо). Покрівні скла покривали або колагеном, . або полі-О-лізином, по суті, з однаковими результатами. Культивування проводили або в середовищі без и?» добавок факторів росту або цитокінів, або в середовищі з добавкою фактора росту нервів (МОР/ 4Онг/мл), або в середовищі з добавкою химерних рекомбінантних білків ІІ 6ЄКІїЇ б (Змкг/мл). Культури перевіряли щодня за допомогою світлової мікроскопії, використовуючи інвертований мікроскоп ОіІутрив, з'єднаний з системою -І візуалізації за допомогою відеокамери (система іеіса ГІСА). Частину опокрівних стекол фіксували в формальдегіді, і білюиим МБР мітили першими моноклональними антитілами до основних білків мієліну і

Ме, кон'югованими з флуоресцеїном другими антитілами. Тіла нейронних клітин і аксони фарбували антитілами до

Ге» білків нейрофіламентів. Деяке покрівні стекла перевіряли скануючою електронною мікроскопією (ЕМ).

Через 2-5 днів на експлантатах ОКО, що культивуються без добавок, показали, що клітини, що зросли з ік експлантата були або полігональними, або що мають форму овалу. Однак в тому випадку, коли додавали МОБ, сп клітини овальної форми утворювали довгі паростки-аксони, які формували рідку мережу, що забарвлюється антитілами до нейрофіламентів. Деякі аксони були довгими і роздвоєними, але шванновських клітин вздовж аксонів не було видно. Навпаки, в культурах з додаванням ІІ/6КІ/б були видні не тільки нервові клітини з ов аксонами, забарвленими на нейрофіламенти, але також і шванновські клітини, що з'являються у вигляді плоских клітин, які мали довгі біполярні вирости з кінцевими розгалуженнями. Ці вирости не були забарвлені на білки

Ф) нейрофіламентів. При скануючій ЕМ ці шванновські клітини були чітко видні вздовж аксонних паростків з ка мембранними збираннями, що починають накручуватися навколо аксона.

Фарбування анти-МВР виявило позитивно забарвлені шванновські клітини в культурах, оброблених ІІ КІ 6, бо зокрема, в рядах клітин, які були вистроєні одна за іншою. З іншого боку, спостерігалася невелика специфічна для МБР флуоресценція в культурах, оброблених МОБ без ІІ 6КІ! 6.

Схожі результати спостерігали в культурах ОКО з ембріонів пацюків, отриманих на е15 день.

Шванновські клітини, отримані з сідничного нерва миші, також культивували іп мйго з І б6КОІ 6 в концентрації 1,4мкг/мл, і вимірювали рівень РНК-транскрипту МБР. Для порівняння такі ж культури обробляли 65 20мкМ форсколіном, хімічним агентом, який штучно збільшує рівні циклічного АМФ в клітинах, і, як відомо, індукує МБР (ГеткКе апа Спао, 1988). Результати показали, що ІІ ЄКІЇ 6 був так само ефективний, як і форсколін в індукції експресії гена МБР, і більш ефективним в підтримці рівнів РНК МЕР через З дні культивування (Фіг.1).

При дослідженні клітин гангліїв дорсальних корінців (ОКО) 18-денного ембріона було виявлено, що химера

І/-6 індукує експресію МРНК МБР і РО протягом З днів, тоді як мРНК Рах-3 в цій же клітинній системі була до сильно інгібована. Дозозалежна крива дії химери ІІ -6 на експресію генів РО і МБР свідчить про максимальну дію химери 1-6 при концентрації 5ООнг/мл. Отже, химера ІІ -6 виступає як важливий індуктор експресії гена мієліну в нормальних нейрогліальних клітинах.

Для подальшого дослідження дії химери 1ІЇ/-6 створили лінії шванновських клітин, отриманих з сідничного нерва пацюка або з клітин ганглія дорсальних корінців (ОКО) пацюка. 70 Виявили, що лінія шванновських клітин, отриманих з сідничного нерва пацюка, відповідає на дію химери

І/-6, як було визначено за допомогою ОТ-ПЛР і Нозерн-блот-аналізом, 2-3-кратною індукцією гена РО, білковий продукт якого формує приблизно 5095 мієліну периферичних нервів.

Для того, щоб дослідити активацію транскрипції компонентів гена мієліну химерою ІІ -6, ввели промотор МВР в експресуючий вектор вище за течією репортерного гена люциферази, і тестували в лінії шванновських клітин /5 бідничного нерва пацюка. У цих клітинах спостерігали індукцію транскрипційної активності з промотору МВР аж до 7-кратної індукції у відповідь на химеру 1-6 у відсутність форсколіну. В додатковому аналізі репортерного гена виявили, що химера 41 -6 викликає в цих клітинах 2,5-кратну індукцію транскрипції з промотору гена РО.

Приведені вище результати свідчать про те, що химера 1-6 надає пряму дію на транскрипцію генів мієліну в комітованих шванновських клітинах.

Була виділена додаткова лінія шванновських клітин з ганглія дорсального корінця (ОКО) пацюка і названа лінією клітин СН. Виявлено, що ця лінія клітин володіє низькою швидкістю росту, і її ріст залежить від химери

І--6 (14Онг/мл). Цікаво, що СН-клітини мали зірчасту морфологію, подібну олігодендроцитам. Клітини, мабуть, були функціональними по відношенню до індукції мієлінізації химерою 1ІІ/-6. Клітини експресували РО | МВР і гинули при вирощуванні в середовищі, що містить сироватку, у відсутність химери. сч

Приклад 2: Інгібування проліферації олігодендроцитів іп мйго

Досліджували вплив химери 1-6 на клітини центральної нервової системи. Встановлено, що і) диференціювання олігодедроцитів пов'язане з інгібуванням їх проліферації, і таким чином, із стимуляцією утворення оболонки і мієлінізації олігодендроцитами.

Тому тестували здатність химери І6КЛІб інгібувати проліферацію олігодендроцитів іп мйго. У цьому ю зо експерименті використали клітинну лінію первинних олігодендроцитів миші (олігодендрогліальні клітини), іморталізовані за допомогою онкогену Ї-пеи (лінія клітин "оїЇї-пей"). Створення і властивості лінії клітин Ме оЇї-пеим, а також умови культивування (описані дип еї аї!. (1995)). Ге

Вимірювали проліферацію недиференційованих клітин оїі-пеш через 1, 2 і З дні у відповідь на різні кількості химери Іб6КЛІб (мкг/мл, 5ООнг/мл, 25Онг/мл, 125нг/мл і Онг/мл (контроль). Кількісно визначали ісе) швидкість зростання за допомогою вимірювання метаболічної активності клітин за допомогою ї- флуориметричного/колориметричного індикатора зростання, АІатаг Віце. Вказаний агент містить індикатор окислення-відновлення, який виявляє як флуоресценцію, так і зміни свого забарвлення у відповідь на хімічне відновлення ростового середовища внаслідок зростання клітин. Агент, що використовується і аналіз (описані у

Аптесд, еї аї. (1994) і в патенті США 5501959). «

Результати показані на Фіг.2. Додавання химери ІІ.6К/11І.6 в культуральне середовище олігодендроцитів веде пт») с до різко вираженого зниження росту вже через 48 годин. Через 72 години ріст скорочувався до 40-5090, в порівнянні з контролем. Цікаво, що сама висока кількість химери ІІ ЄКЛІ Є (мкг) була менш ефективною, ніж з більш низькі кількості від 500 до 125нг/мл.

Експеримент показав, що химера ІІ 6КЛІ Є сильно інгібує проліферацію олігодендроцитів іп міїго, свідчачи про те, що вона стимулює диференціювання олігодендроцитів. Оскільки олігодендроцити є гліальними -І клітинами, що продукують мієлінові оболонки в ЦНС, химера ІІ 6КЛІ 6 може бути агентом, активно стимулюючим ремієлінізацію іп мімо.

Ме, Приклад 3: Вплив химери ІІ 6КЛІ 6 на морфологію олігодендроцитів

Ге» Для того, щоб дослідити вплив химери І 6 на морфологію олігодендроглії, клітини оїї-пеш (дивися приклад 5ор 2) культивували протягом З днів в присутності мкг/мл химери 1І-6КЛІ 6. ік Дибутил-дкЦАМФ (дбцАМФ) є агентом, який, як відомо, індукує диференціювання олігодедроцитів Ідивися, сп наприклад, Уипа еї аї. (1995)). Для того, щоб дослідити, який вплив на морфологію здійснює химера ІІ 6КЛІ 6 додатково до впливу дбцАМФ, клітини оїі-пеши заздалегідь обробляли протягом З днів дбцДМФ перед додаванням химери ІІ 6ЄКЛІ Є плюс дбцАМФ. У паралелі клітини обробляли химерою ІІ 6КЛІ 6 без попередньої

Б Обробки.

Зміни морфології оцінювали за допомогою фазово-контрастної мікроскопії або імуногістохімічним

Ф) фарбуванням на маркери олігодендроцитів СМРазу (діестеразу 2", 3'-циклічних нуклеозид-3'-фосфатів) і саЇС ка (сіалоганглюозиди і сульфатиди) і використовуючи антитіла А2В5, специфічні для ліпіду мієліну галактоцереброзиду. во Додавання химери ІІ 6К/ЛІ 6 явно індукувало морфологічні зміни в клітинах оїі-пеи. Тіла клітин збиралися рядами, і їх паростки ставали більш подовженими. Самі клітини довшали і здавалися злитими, що свідчило про досягнутий стан диференціювання.

Експресія маркерів олігодендроцитів була показана за допомогою імуногістохімії. Клітини були позитивні відносно специфічних маркерів олігодендроцитів - антигену А2В5 і ОМРази, але були негативними відносно 65 маркера астроглії СЕАР, таким чином, свідчачи, що дійсно підтримувався фенотип олігодендроцитів.

Попередня обробка дбцАМФ і комбінована обробка химерою ІП 6К/ЛІб і дбцАМФ збільшували кількість олігодедроцитів, утворюючих оболонку, через З дні. У порівнянні з подовженими клітинами, видимими в присутності однієї химери ІІ 6КЛІ 6, морфологічно клітини виглядали навіть більш диференційованими. Можна було спостерігати клітини, що мають вигляд листа, що свідчило про досягнутий стан диференціювання.

На закінчення, обробка химерою ІІ 6КЛІ Є в результаті приводила до морфологічної зміни олігодендроцитів іп міо, таким чином, далі підтверджуючи її роль як індуктора олігодендрогліального диференціювання і мієлінізації.

Приклад 4: Вплив химери ІІ -6 на взаємодію нейронів | шванновських клітин

При культивуванні ОКО мишей в присутності інгібіторів синтезу ДНК арабінози С (Агас) і фтордезоксіуридину (гак) нервові клітини можуть утворювати аксони, в той час як проліферація гліальних клітин інгібована. Такі 7/0 Культури ОКО можна використовувати як джерело нервових клітин з немієлінізованими аксонами. До цих культур екзогенно додають шванновські клітини, щоб дослідити взаємодію між нейронами і шванновськими клітинами.

Клітини ліній шванновських клітин сідничного нерва пацюка мітили Рійогодоід, міткою, яка проникає через бішарову ліпідну мембрану клітин і зберігається протягом протяжного періоду часу, не впливаючи на функцію клітин. Спільне культивування нейронів і вказаних шванновських клітин в присутності химери 1-6 приводить до /5 Значного збільшення скріплення шванновських клітин вздовж аксонів клітин в межах 5 годин. Клітини довшають, і через декілька днів можна спостерігати, як їх рфлуоресцуюча цитоплазма утворює регулярну оболонку навколо аксонів. У відсутність химери або у відсутність МОРЕ шванновські клітини зв'язуються набагато менше і не утворюють оболонку. Дані результати показують, що химера ІЇ-6 впливає дуже швидким чином на взаємодію гліальних клітин з нейронами, свідчачи про те, що індукуються або активуються адгезивні молекули. Вказана система дозволяє дослідити різні стадії процесу мієлінізації, на які впливає химера 1-6.

Приклад 5: Вплив химери ІЇ 6КЛІ 6 на мієлінізацію в змішаних культурах нейронів і олігодендроцитів

Для того, щоб далі дослідити активність химери ІІ 6КЛІб, що індукує мієлінізацію, готували дисоційовані культури з півкуль головного мозку мишей Е15 (15 ембріональній день). Підготовка і умови культивування (описані І иреїгкКі еї аї. (1993)). Первинні клітини підтримували в культурі протягом 8 днів перед додаванням сч дв ЛІвКЛІ 6 (1,5мкг/мл) протягом 11 днів.

МБР (основний білок мієліну) і специфічний для олігодендроцитів білок РІ Р (протеоліпідний білок) є і) маркерами зрілих і/або мієлінізованих олігодендроцитів і є головними компонентами мієліну ЦНС. Тому їх можна використати як маркери для оцінки активної мієлінізації, що має місце в культурі клітин.

В умовах культивування на 4 день мієлінізація не відбувається. Тому мРНК на 4 день використали в цьому ю зр експерименті як калібрувальний контроль. На 19 день в умовах культивування в культурі клітин спостерігається мієлінізація. Ме

Таким чином, для того, щоб кількісно виміряти мРНК МВР і РІР екстрагували мРНК з необроблених і Ге оброблених лунок на 4 і 19 день.

МРНК МВР, РІР ії САРОН, яка служила як РНК внутрішнього контролю, вимірювали за допомогою кількісної ісе)

ОТ-ПЛР в реальному часі (Медпитгзі еї аї. (2000)), використовуючи прилад для визначення послідовностей РЕ ї-

Арріїей Віозувіетвг Ргізт, модель 7700.

Результати підсумовані в таблиці І, приведеній нижче. Провели два незалежних експерименти. Експресія

МРНК показана у вигляді кратної експресії контрольної РНК на 4 день. В обох експериментах химера ІІ 6КЛІ 6 чітко посилювала експресію МВР і РІ Р в два рази, ще раз підтверджуючи роль химери ІІ 6КЛІ 6 як індуктора або « підсилювача мієлінізації. з ш ї» 777 контроль на я день Контроль на 19 день Химера ПЕК на 19 день, " - МВР 1 1265 2157

РІР й

МВР 1 1884 4198

Ге» РІР іс), 7о На закінчення, приклади з 1 по 5 показують, що химера ІІ 6КЛІ 6 володіє антипроліферативною, такою, що «п індукує диференціювання і мієлінізацію активністю. Вказана активність химери ІІ6КЛІб суворо свідчить про сприятливу дію химери ІІ КЛІ 6 на ремієлінізацію в периферичній і центральній нервовій системі. Цей ефект можна використовувати при всіх розладах, заснованих на дефектах мієлінізації; демієлінізації або недостатній мієлінізації нейронів ЦНС або ПНО. Тому химера ПІ 6ЄКЛІб може бути ефективним агентом для лікування порушень ремієлінізації і/або демієлінізації, подібних, наприклад, неуважному склерозу. (Ф) Приклад 6: Вплив химери 1-6 на регенерацію периферичних нервів іп мімо

ГІ Після аксотомії сідничного нерва у пацюків і накладення проксимального і дистального відрізків периферичні нерви можна індукувати до регенерації, і перерізані волокна можна індукувати до ремієлінізації іп во мімо Ізапепк еї аїЇ. 1994). Досліджували вплив химери ІІ 6КЛІб на ремієлінізацію периферичних нервів після аксотомії. Пацюкам (7 тварин) вводили химеру ІІ 6КЛІ 6 внутрішньочеревно через кожні два дні в дозі 10Омкг/кг протягом 12 днів, починаючи з дня операції. Контрольним тваринам (9 пацюків) ін'єкували РВ5. Через 12 днів частини регенеруючого нерва на 2,5 і бмм нижче за аксотомію аналізували за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії, і оцінювали кількість позитивних волокон. 65 У присутності химери І/-6 виявили 2,5-кратне збільшення кількості мієлінізованих волокон на відстані 2,5мм нижче за аксотомію, в порівнянні з контролями, обробленими РВ5. Крім того, було виявлено, що химера збільшує ремієлінізацію більш віддалених волокон, індукуючи 5,2-кратне збільшення кількості мієлінізованих волокон на мм дистальніше за розріз. Це важливе, оскільки ремієлінізація знижується по мірі того, як відстань від розрізу збільшується. Вплив СМТЕ спостерігали на відстані О,5мм від розрізу, а в присутності химери І--6 виявляється набагато більш віддалений вплив, і більш сильний - на відстані 5мм, ніж на відстані 2,5мм. Товщина мієлінізованих волокон також збільшувалася більш ніж в 2 рази після обробки химерою. Загалом химера 1-6, мабуть, індукує ремієлінізацію приблизно | 095 волокон, в порівнянні з інтактними пацюками без аксотомії.

Приклад 7: Індукція гена МВР за допомогою ІІ 6К/11 6 в культурах клітин меланоми В16-Е10.9 70 Ембріональним джерелом меланоцитів шкіри, які продукують меланінові пігменти, і шванновських клітин є спільні клітини-лопередники, мігруючі з нервового гребінця ембріонів мишей ев. Меланоми являють собою злоякісні пухлини, що розвиваються в шкірі з меланоцитів, і тому також походять з попередників нервового гребінця. Лінія клітин В1б6 отримана з спонтанної меланоми мишей Ваїр/с, і клон Е10.9 виділяли з В16 за їх фенотипом, відповідним високо злоякісним метастазам. Клітини Е10.9, як і інші клітини В16, продукують чорний 7/5 Пігмент еумеланін і багаті на тирозиназу, перший фермент меланогенного шляху |Вегіоїоно еї аї, 19961.

Клітини Е10.9 висівали в 9б-лункові мікропланшети при концентрації 30000 клітин/лунка і культивували протягом З днів в середовищі ОМЕМ з 1095 ЕС5 в присутності або у відсутність І 6ЄКЛІ б в концентраціях 0,3-їмкг/мл. Екстрагували сумарну клітинну РНК і аналізували за допомогою Нозерн-блотів із зондами ДНК для

МВР. У клітинах Е10.9 мРНК МВР були дуже сильно індуковані ІІ КЛІ 6 через 48 годин (Фіг.ЗА). Дослідження 2о часового ходу показало, що збільшення РНК МВР починалося через 12 годин після додавання химери ІІ 6КІ! 6 до культур кпітин.

Химера ІІ 6КІІ 6 індукує не тільки експресію гена МВР, але також фосфодіестерази циклічного 23 АМФ або

СмМрРази, яка є іншим компонентом мієліну і маркером диференційованих шванновських клітин. Клітини також утворюють подовжені паростки на протилежних полюсах тіла клітини, і шикуються в культурах в довгі ряди як с г Звичайні шванновські клітини.

Несподівано ІЇ6ЄКІЇб перемикала фенотип клітин Е10.9 з клітин, що продукують меланін, на шванновські і) клітини, що продукують мієлін. Ферментативна активність тирозинази і продукція меланіну повністю зникали через 48 годин після додавання химери ЇЇ 6КІЇ Є до клітин.

МІТЕ є транскрипційним фактором, який активує ген тирозинази |ВегіоЇонНо еї аї, 1996). Обробка клітин ю зо 10.9 химерою 1І6КІІб сильно репресує експресію гена МІТЕ. Сам МІТЕ трансактивується гомеотичним фактором транскрипції Рах-3 (УУа(апабе еї аї. 1998), і вимірювання мРНК Рах-3 в клітинах Е10.9, оброблених Ме

І. 6КІІ.6, показали, що експресія Рах-3 знижується, починаючи з б годин і аж до 48 годин (Фіг.3В). Відомо, що Ге

Рах-3 репресує ген МБР (Кіоизві апа Сгивв, 1996). Тому вплив химери ІІ 6КІІ 6 можна приписати впливу на генну регуляцію гомеобоксного гена Рах-3, який експресується під час розвитку ембріональних шванновських клітин ісе) зв перед мієлінізацією, і повинен бути репресований для того, щоб відбувалася мієлінізація. Крім того, в нервах, ї- що дегенерують і демієлінізуються Рах-3 знов експресується в шванновських клітинах, коли ці клітини перестають продукувати МБР. Тому дуже важливо, що І 6КТІ6б може як репресувати Рах-3, так і викликати диференціювання шванновських клітин в клітини, що мієлінізують за допомогою індукції генів білків мієліну.

Приклад 8: Ін'єкції ІІ ЄКІЇІ Є в моделі хронічного рецидивуючого неуважного склерозу у мишей «

У мишей лінії 5У/Л//) розвивається експериментальний аутоїмунний енцефаломієліт (ЕАЕ) після імунізації з с 0О,4мг бичачого МВР в неповному ад'юванті Фройнда, що містить бОмкг Мусобрасіегішт (ирегсціовіз НЗ7Ка (Оіїсо).

Захворювання можна пасивно перенести сингенному реципієнту за допомогою внутрішньовенної ін'єкції З0 ;» мільйонів клітин лімфатичного вузла, взятих через 10 днів після імунізації. Клінічні симптоми паралічу з'являються через період часу від тижня до 10 днів. Після гострої фази слідують ремісії і рецидиви. Цим мишам

Ін'єкують ІІ-6КІІ.6 внутрішньочеревно або підшкірно в дозах 1, З і 5мкг на мишу (маса тіла біля 25г). Ін'єкції -І вводять 4 рази на тиждень, щонайменше протягом З тижнів, починаючи або на 3, або на 7 день після пасивного перенесення. При клінічній оцінці тварин слідували і проводили класифікацію за наступними критеріями: 1)

Ме, втрата ригідності хвоста; 2) слабкість задніх кінцівок; 3) односторонній параліч кінцівок; 4) двосторонній

Ге» параліч кінцівок; 5) летальність. Головний мозок і спинний мозок тварин досліджували за допомогою світлової Мікроскопії після фарбування мієліну стійко блакитним люксолом. Можна встановити вплив ІІ 6КІ/б на ік пониження клінічної міри хвороби і зменшення демієлінізації білої речовини головного мозку. сп Приклад 9: Нейропротекторна дія химери б на нейротоксичність по відношенню до нейронів і олігодендроглії

Органотипові культури надають унікальну стратегію, за допомогою якої можна дослідити багато які аспекти дв фізіології і патології головного мозку. Довготривалі культури зрізів гіпокампу, району, залученого до кодування пам'яті і району, в якому виявляється рання дегенерація при хворобі Альцгеймера і ішемії, є

Ф) особливо корисними в цьому відношенні, внаслідок виразності механізмів синаптичної пластичності (наприклад, ка довготривалого потенціювання) і реагування на патологічні інсульти (наприклад, ексцитотоксичність).

Культури готували, |Як описано раніше Вайг еї аії. (Вайг 1995)), з невеликими модифікаціями. Гіпокампи бо вирізали у пацюків УМівіаг восьмиденного віку, і зрізи товщиною 400мкм накладали на пористу і прозору мембрану Мійісеї-СМ (Мійїроге) і культивували в б лунках багатолункових планшетів. На кожну мембрану вміщували чотири зрізи. Середовище для культивування складалася з 5095 мінімально необхідного середовища (425ММ НЕРЕ5, каммМ Мансоз, «Маон рн72), 2596 сироватки коня і 2595 розчину Хенкса, глюкози (6б,4г/л), пеніциліну/стрептоміцину (1Омл/л), І-глутаміну (2мМ). Культури тримали в 595 СО»-інкубаторі, встановленому бе при температурі 372С, щонайменше, протягом З тижнів до використання. Середовище міняли кожний тиждень.

Зрізи гіпокампу піддавали впливу 416 або химери І/6 при концентраціях в межах від 1Опг/мл до 1Омкг/мл протягом 15хв., потім додавали 5ХомкМ ММОА ще протягом ЗОхв. Культури вміщували в свіже середовище з додаванням або без ІІ 6 або химери ІІ 6. Для кожної експериментальної точки використали щонайменше чотири зрізи. Загибель клітин, індуковану ММОА, оцінювали або через 1, або через 3-7 днів після експериментального пошкодження, інкубуючі культури протягом 1 години в свіжому середовищі, що містить йодит пропідію (РІ

БбБмкл/мл). Завдяки своїм гідрофобним властивостям РІ входить в зруйновані клітини і зв'язується з ядерним хроматином. Оцінювали червону флуоресценцію, що випускається, (маркер загибелі клітин), використовуючи інвертований флуоресцентний мікроскоп (7еіз5), пов'язаний з камерою сполученого пристрою інтенсифікації заряду. Кількісну оцінку загальної флуоресценції проводили за допомогою системи аналізу зображення (Ітаде 7/0. Роо Рій).

Виявлено, що як І/-б, так і химера ІЇ/-6 захищають клітини гіпокампу від загибелі, індукованої ММОА.

Виявлено, що через один день в культурі ІЇ-6 в концентрації в межах від 0,1 до 1Онг/мл захищала приблизно 5О6-3095 нейронів, відповідно, тоді як химера ІЇ/-6б в концентрації в межах від 0,05 до пг/мл захищала приблизно 4095-7595 нейронів. Максимальна захисна дія химери 1-6 (захист 7590 клітин) спостерігалася при /5 Концентрації 0,5пг/мл (Фіг.3).

Виявлено, що захисна дія ІЇ/-б6 знижується згодом. Життєздатність нервових клітин знижувалася після обробки, і через два дні захисна дія І/-б6 зберігалася тільки при концентрації О,Тнг/мл І/-6, при цьому захисна дія виявлялася тільки на 30905 клітин на 5 день. У протилежність цьому, химера 1-6 в концентрації

О,бпг/мл володіла пролонгованою дією, зберігаючи приблизно 6095 клітин на 5 день (Фіг.4).

Присутність олігодендроцитів в органотипових зрізах визначали імуногістохімічним фарбуванням сСаї!-С, специфічним маркером олігодендроцитів. Через 2-3 тижні іп міго органотипові зрізи піддавали З0О-хвилинному впливу 50мкМ ММОБА, який індукує некротичну клітинну загибель клітин, присутніх в цих культурах. Дійсно, як було визначено за допомогою ОТ/ПЛР. після обробки ММОА в цих культурах припинялася експресія всіх МБР, яка характерна для олігодендроцитів. с

Активація іонотрофних рецепторів глутамату являє собою первинну подію в процесі нейротоксичності, ініційованої збуджуючими амінокислотами. Первинні культури нейронів мозочка новонароджених пацюків (які і) містять 29795 нейронів) використали для дослідження ефектів химери І/б на індуковану глутаматом нейротоксичність, і порівнювали з ефектами ІІ -6.

Первинні культури зернистих клітин мозочка готували з пацюків Зргадче-Оаулеу 8-денного віку, як описане му зо (Ріялі еї аі. 1993). Клітини висівали на чашки, покриті полі-І-лізіном Її культивували в основному середовищі

Ігла, що містить 1095 інактивованої теплом фетальної бичачої сироватки, глутамін (2мМ), гентаміцин (5Омкг/мл) Ме і КСІ (25мМ), при щільності 2,5х10клітин/см7. Цитозинарабінозид (10мкМ) додавали до культур через 18 годин (Те) після посіву, щоб не допустити проліферацію нервових клітин. Експерименти проводили після культивування нейронів протягом 10 днів. о

Якщо не обумовлено особливо, культури піддавали впливу 5О0мкМ глутамату протягом 15хв. в розчині Лока, - не утримуючому Мод". І.6 або химеру ІІ 6 додавали за 5хв. до обробки глутаматом. Потім в чашки повертали кондиціоноване культуральне середовище при 372С в атмосфері 9596-повітря/5906 СО о, і через 18-24 години вимірювали життєздатність клітин. «

Життєздатність клітин оцінювали через 18 годин за допомогою прижиттєвого фарбування сумішшю діацетату флуоресцеїну і йодиду пропідію, як описано раніше (Ріг7і еї аі. 1993). Процент нейронів, що вижили в моношарі - с підраховували, оцінюючи співвідношення між фарбуванням діацетатом флуоресцеїну (зелені життєздатні ч клітини) і фарбуванням діацетатом флуоресцеїну плюс йодидом пропідію (сумарні клітини) на мікрофотографіях я трьох репрезентативних полів кожного моношару. Значення брали для трьох аналогічних чашок.

У той час як І/-6 не індукував захисної дії на зернисті клітини мозочка пацюків в межах доз від 0,1 до ЗОнг/мл, химера І/-6 в концентрації О,Іпг/мл і Тпг/мл захищала, відповідно 40-2095 нервових клітин від -і нейротоксичності, індукованої глутаматом. бо Приклад 10: Вплив химери ІІ 6КЛІ 6 на виживаність нейронів верхніх шийних гангліїв після видалення МОГ

Нейропротекторну дія, що надається химерою І/6КЛІб, також досліджували в системі культивування (о) периферичних нейронів. с 50 Нейрони верхніх шийних гангліїв (500) виділяли з верхніх шийних гангліїв пацюків РО-РЗ (дні з 0 по З постнатального розвитку). Нейрони витримували протягом 4 днів в середовищі, утримуючому 595 сироватки сл пацюків і МОР. МО потрібно нейронам для виживання, оскільки позбавлення МОРЕ приводить до загибелі клітин внаслідок індукції апоптозу. Початкове середовище замінювали середовищем без МОБ, що містить нейтралізуючі антитіла до фактора росту. У цій тимчасовій точці додавали 0,1 або 1мкг/мл химери ІІ ЄКЛІ 6 в 190 ДМСО в кінцевій концентрації. Культури витримували при 372С протягом 24 годин. о Вплив химери 11 6КЛІ 6 на виживаність нейронів, позбавлених МО, через 24 години обробки оцінювали за допомогою мікроскопії, а також на основі мітохондріальної активності клітин, яку вимірювали в МтТ-аналізі, ю детально описаному Мозтапп (1983). Концентрації химери ІІ 6КЛІ6, що використовуються не виявляли ніякої токсичної дії або дії на морфологію нейронів 5СО, оброблених МОР. 60 Додавання химери ІІ КЛІ Є в концентрації 1ООнг/мл і їмкг/мл спасало до 4095 нейронів БСО від нейронної загибелі, яка була індукована видаленням МОР, як можна бачити за результатами МТТ-аналізу (Фіг.б). Таким чином, химера ІІ КЛІ. 6 володіє нейропротекторною дією на периферичні нейрони, свідчачи про активність при нейродегенеративних захворюваннях, подібних, наприклад, хворобі Альцгеймера, хвороби Паркінсона або БАС (бічному аміотрофічному склерозу). б5 Тепер, після повного опису винаходу, фахівцям в даній області буде зрозуміло, що те ж саме можна виконувати в широких межах еквівалентних параметрів, концентрацій і умов, не відходячи від суті і не виходячи за рамки винаходу і без надмірного експериментування.

ПОСИЛАННЯ

АргатеКу, О, апа Омадіа, Н. (1997) ЕРгопіШгтв іп Мийіріе Зсіеговів, сіїпісаЇ гезеагсй апа (Негару. Мапіп

Оп рибіїзпег, І опдоп.

Аптей 5.А.. бода!Ї, К.М, 9г., ММаївпи, (1994) А пем/ гаріа апа вітріе поп-гадіоасіме аззау топіюг апа деіегтіпе (пе ргоїїегайоп ої ММтрпосуїев: ап аМегпайме о |НІШутіаїпе іпсогрогайоп, У. ої Іттипої. Меййовдв 170, 211-224.

Апдегзоп, 0.9. (1997) СейшШаг апа тоїіесшіаг Біоїоду ої пецга! сгеві сеї! ІПпеаде дейегтіпайоп. Тгепав 70. Зепеї. 13, 276-280.

Ванг, Гопд-їегт Пірросатра! віїсев: а тоде! зувіет ог іпмевіїдайпод зупаріїс теспапізтвз апа раїйоіодіс ргосеззев. .) Мейгозсі Кев, 42, 294-305.

Вепоїопо, С., Війе, К., Огоппе, 9.Р. апа Ваїїоні, Кк. (1996) Кедшайоп ої (угозіпазе депе ехргезвіоп ру сАМР іп В16 теіапота іпумоїмез мо САТОТО тоїйїв звигоипаїпд (пе ТАТА бох: ітріїсайоп ої (пе тісгорпіаІтіа 75 Ддепе ргодисі. у). СеїІ.Віо!І. 134,747-755.

Воппі А, З!ип У, МадаІ-Місеп М, Впакф А, Егапк ЮА, КогоузКу І, ебФанпі М, Мапсорошовз СО, Огсепрегд МЕ (1997) Кедшайоп ої діодепевів іп (Ше сепігаї пегуоив зузіет Бу (Ше ЗАК-5ТАТ взідпаїйпуд раїпйжау. Зсіепсе 278, 477-483.

СаппеМйа, В., Норат, Су. Сбао, М. еї а (1998) Те пешгедшііп, діа! дгоулий Тасіог 2, дітіпізпез 2го ашоіїттипе детуеїйпайоп апа еппапсез гетуеїїпайоп іп а спгопіс геіарвіпд тоде! їтог Миїбріе зсесіеговів.

Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА, 95, 10100-10105.

Спераф. .)., Рівспег, О., Китаг, А., Оп, МУ, КоПеї О., Іарідої Т.. Різспег, М., Козе-допп, 5.,

Мадіег, А., ЗіІаміп, 5. апа Кемеі), М. (1997) Іпіепеицкіп-б гесеріог- ІпіегіеиКіп-б6 Тивіоп о ргоїеіпв У еппапсеа Іпіепеийкіп-6 (уре ріеіоїгоріс асіїміев. Еиг. СуїоКкіпе Мей. 8, 359-365. Га

Спеп, Г.Е., іш, К. беарег, А.М., Каїгададаа, 5., Кік, С апа Ограпіак, УК. (1998) КесотрБбіпапі питап діа! дгомлйи Тасіог 2 (Орг 2) ітргомевз їипсіопа! гесомегу ої сгизпей регірпегаІ пегуле (а аоибіе-ріїпа і9) зіцау) Мешигоспет. Іпі., 33, 341-351.

Егазег, 5. Е. апа Вгоппег-Егазег, М. (1991). Мідгайпу пецга! сгеві сейв іп (Ше ігпК ої (Ше аміап етьгуо аге тийіроїепі. Оемеіортенпі 112, 913-920. ю

Садіепі, МК.А. апа ОНЧеп, ЦШ.Н. (1997) Іпіепеціп-б (1-6) - А тоІесше м/йй Броїй Бепеїїсіа!ї апа девігисіїме роїепііаІв. Ргод. Меийгобіо!., 52, 379-390. іа

Нагшипо, Н.Р., мап дег Меспе, Р.О, РоїІага, 9.0, (1998) СийІаіп-Вате зупаготе, СІОР апа оїфетг спгопіс «о іттипе-теадіаєей пеигораї(піев. Сигт. Оріп. Меиго!., 11,497-513.

Нігоїа, Н., Кіуата, Н., Ківпітого, Т. апа Тада, Т. (1996) АссеЇегаїеуй пегуе гедепегайоп іп тісе Бу о Пргедшіагей ехргезвіоп ої Іпіег) ешикіп (11) 6 апа ІІ--6 гесеріог апег (гашта, У. Ехр. Меа., 183, 2627-2634. -

Но, Р.К., Соап, О.М., Спепо, Е.Т., МіеіЇ, С., Тагп, О.М., Зпоц, Н., Зіета, О, апа Тегїтів, Ю.). (1998)

Кераїг м/йй соПадеп (Шрціез ІпКкей м/йй о Бгаїп-дегімей пеийгоїгорпіс Тасіог апа сійагу пешйгоїгорпіс Тасіог іп а гаї зсіайіс пегме іпіигу тодеї. Агсп. Сіоіагупдоі!. Неай Меск Зига., 124, 761-766. «

Ір ММ, Муе ЗН, Вошіоп ТО, Оаміз 5, Тада Т, Її М, Вітеп 5), Мазикажа К, Ківпітоїю Т, Апдегзоп 0, еї аї (1992) СМТЕ апа ІБ асі оп пейгопа! сеїйв міа впагей зідпайпо райм/ауз Ша іпуоїме (Ше 1/-6б відпаї -й с ігапзашйсіпд гесеріог сотропепі др130. Сеї! 69:1121-32. ц Уеззеп, К. К. апа МігеКу, К. (1991). Зспулапп сеї! ргесигзогв апа (Неїг аемеортепі. Сііа 4,185-194. и"? Уцпо, М., Кгатег, Е., Оглепкому5Ко, М, ВіаКкетоге, МУ. Адизглі, А., Кпалаїш, К., СпПіісніа, К., моп

ВіапКепієїд, О., Кецйептапп, ап ТгоМйег, У. (1995). Ііпев ої Мигіпе ОІїдодепагодіаі Ргесигвог СеїЇв

Іттогпаїїгей Бу ап Асіїмаїей пеи Тугозіпе Кіпазе Зпом/ Оівіпсі ЮОедгеев ої Іпіегасіоп м/йй Ахопвз Іп Мйго апа -І Іп Мімо. Ечшг. У, ої Меийигозсіепсе 7, 1245-1265.

Капп, М.А. апа Ое Меїйв, 9, (1994) Кедшайоп ої ап оїЇїдодепагосуїе ргодепіог сей ІПпе бу (Ше б іпєепеикіп-6 Тату ої суїоКіпевз. Са. 12, 87-98.

Ге) КоПеї О., Амігат, К., Спера(й, 9., Беп-Ниг, Н., Мадіег, А., Зп!ййУ, |, Кемеї, М, апа Іарідої, Т, (1999) со 50 Те воїшбіе ІІ -6 гесерсог/1І -6 Тивіоп ргоїєіп еппапсев таїіпіепапсе апа ргоїїегайоп ої питап СО34"СО38779/8С1О героршаїййпд сеїЇв (ЗКС) іп міїго. Віосад, іп ргезв. сл Кіоизві, С апа Огизгв, Р. (1996) МакКіпд а Зспугапп. Тгтепаз Сепеї!., 12, 84-86.

Їее, О.А. йигамжеї, К.Н. апа МуУіпдерапкК, Ау, (1995) Сіагу Меийгоїгорпіс Тасіог ехргевзвіоп іп Зспжмапп сеї із іпдисей Бу ахопаї! сопіасі. 0. Меигоспет. 65, 564-568.

ІЇетКке, б. апа Спао, М. (1988), Ахопз гедшіайге Зспмжапп сеї! ехргеввіоп ої (Ше та|ог туеїйп апа МОГ гесеріог депез. Оемеортепі 102, 499.

ІФ) М. Ко, (1998) Сийиге теїйподв їТог зеїесіме дгоули ої погтаІ! гаї апа питап Зспулапп сеїїв, Мей, Сеї. іме) Віої., 57, 167-186.

МПріоп, 5, А., апа Козепрегд, Р А. (1994). Ехсйагу атіпо асідв аз а Ріпаї соттоп раїймжау ог 6о пешйгоіодіс аізогдегв. М Епаї У Мед, 330, 613-22.

ЇиребКі, С, Оетегепз, С, Апдіаде, Р. МіМПагтоуа, Н., ЕРгапкішгйпег. А, ее. М. М.-М., апа 7аїс, В. (1993) ЄЕмеп іп сикиге, оїїдодепагосуїез туеїїпай(е зоЇеізу ахопз. РМАЗ 90, 6820-6824.

Мауег, М., Впакоо, К. апа МобБіе, М. (1994) Сійагу Меийгоїгорпіс Тасіог апа ІеиКетіа Іппіріогу Тасіог рготоїе (пе депегайоп, тайшгайоп апа взигмімаї! ої оіїдодепагосуфез іп міго. Оемеіортенпі, 120, 143-153. 65 Меропаїа, 9У.М/, Аппотвгопв, 5.Р., Нугс. К, Ї., Спої. О. МУ., апа Соідрего, Оіідодепагосуїев їтот Тогебгаїп аге підпіу миІпегаріе юю АМРА/Каїпаїе гесеріог-теадіаєеай ехсйоїохісігу. Маї Меа, 4, 291-7.

Меапвпитгві, А.О., Натзоп, дБсАМР, Кеадй, 5.3., СатррбреїІ. С.А., Коббріпз, М.). апа Раподаіоз, М.М. (2000) Тпе цве ої ТадМап. КТ-РСК аззауз їТог зетідцапійайме апаїузів ої депе ехргезвіоп іп СМ (іззцуез апа аізеазе тоае!в. У, Мейгозсі. Мейїподз 15, 9-20.

Мепавеї, І., Каїг, А., Когаїс, М., Веп-Мип. А. апа Кемеї, М. (1998) ІпіепеиКіп-б6 Яипсіопе іп ашоіттипе епсерпа|отуеїйів; а віцау іп депе-іагдеєей тісе. Еиг. У. Іттипої, 28, 1727-1737.

Мозтапп, ТТ. (1983). Карій соогітейіс аззау їог сейшШаг одгоулиИ апа зигміма!: Арріїсайоп ою ргоїїтегайоп апа суюйохісйу аззаув. 9). Іттипої, Ме(подз 65, 55-63.

МигаКкаті, М., Нірі, М., Макадамжа, М., Мадакажа. Т., МазиКамжша, К., Матапівзпі, К., Тада, Т. апа Ківпітою, 70... (1993) 1-6 іпдисед потодаітегігайоп ої ор130 апа аззвосіа(ей асіїманйоп ої а (уговіпе Кіпазе. Зсіепсе 260, 1808-1810.

Моміск, О., Зпцітап, Г.М., Спеп, Ї, апіа Кемеї, М. (1992) Еппапсетепі ої іпіегіеиКіп-б суфовіаййс епПесі оп питап Бгеаві сагсіпота сеїв ру звоЇшШріеє ІЇ/-б гесеріог їгот игіпе апа гемегвіоп Бу топосіопа! апііродіев.

Суфокіпе, 4, 6-11.

Рапіопі, Ї., Сагсіа, 9. Н., апіа Сшегте, 9.А. Сегерга! м/пйе тайцег із Підніу миіпегаріе (о ізспетіа.

БігоКе, 27,1641-6.

Ріггі М., РаїЇЇїасага, С, Атідні. М., Мето, М., апа брапо, Р.Р., (1993) АКепиайоп ої ехсіаюгу атіпо асій (охісйу ру тегйароїгоріс дішатайе гесеріог адопізів апа апігасебат іп ргітагу сийигев ої сегереїЙЇаг дгапшіе сеїІв. У Мешгоспет, 61,683-9.

Ропіачу, 0О., АКаз, О., Ерріеп, С. Напипо, Н.Р., Нойтапп, М. апа Рглипіек, Н. (1998) Рготоїіпа гетуеїїпайоп аз а їшиге (пегареціїс ргіпсіріе іп Микіріе 5сіеговів. Мегмепаггі, 69, 841-850.

ЗапепкК, 2., Зепагазеуоп, .)., ап4а Мепаеїї, УК. (1994) СМТ роїепііа(ез регірпега! пегме гедепегайоп.

Вгаїп Кез, 655, 246-50.

ЗіосКег, К.М, ЗПпегтап, Ї., Кее, 5. апа Сітепі, б. (1991) Вазіс ЕСЕ апа Тог-рейа! іпїцепсе соттійтепі сч об теїаподепевів іп печга! сгеві-дегімей сеїІз ої аміап етргуов. Оемеіортепі, 111, 635-645.

Тада, Т., Ніріп М., Нігайа, М.. МатазакКі, К., Мазикамжа, К., Маївида, Т., Нігапо, Т. апа Ківпітої, Т. (8) (1989) ІпіегіецкКіп-6 Ггіддеге (пе аззосіайоп ої її гесеріог мйй а розвіріе відпа! (гапздисег др130. Сеїї, 58, 573-581.

Торіїко, Р., Мигрпу. Р, апа Спагпау, Р. (1996) Етргуопіс демеюртепі ої Зспулапп сеїїв: Мийіріе гоЇїев ог

Меишгедиіїпз аіопд (пе раїпу/ау, Мої. СеїЇ. Мешйговс, 8, 71-75, ю зо Тоцітопа, 5., Міде, Х., Раде, О., апа Вепамідев5, 4. (1992), оса! іптивіоп ої іпіегіеиКіп-б6 аКепиа(ев

Ше пешгоїохіс еПесів ої ММО А оп гаї вігіайа!| споїїпегдіс пейгопв. Меиговсі І ей, 144, 49-52. Ме)

Тгарр. В, О., Нацег, Р, апа Гетке, 5. (1988), Ахопа! геошіайоп ої туеїїп ргоїеіпй тМА Іемеїз іп асімеу («о туеїїпайпд Зспмапп сеїІв. У. Меишговсі. 8.3515.

Тгодарога МУ (1998) Асще апа спгопіс пеигораїйіев: пем/ азресів ої СицШаїп-Вате взупдготе апа спгопіс ісе) ішШаттацйогу детуеїїпайпо роїу пеигораїйу, ап омегліем апа ап ираайе. ЕІесігоепсерпаіодг Сіїп Меигорпузіої, ї- 107, 303-316.

УУайапаре, А., ТаКеда, К., Ріоріз В. апа Таспірапа, М. (1998) Ерівіайіс геіайопепір рейуееп УУаагаеприга зупдготе депез МІТЕ апа РахЗ3, Майте Сепеї., 18, 283-286.

Матада, М. апа Наїйапака, Н. (1994). Іпфепеикіп-б ргоїесів сийигей гаї пірросатра! пешгопз адаїпві « дішатаїгйе-іпдисеай сеї! деаій. Вгаїп Кев. 643, 173-80. з с з»

Claims (3)

Формула винаходу

1. Застосування химери ІІ 6КІІ Є для виробництва лікарського засобу для лікування травматичної дегенерації -І нервів, демієлінізуючих захворювань ЦНС або ПНО і/або нейродегенеративних захворювань.

2. Застосування за п.1, де демієлінізуючим захворюванням є розсіяний склероз (РОС). Ме,

3. Застосування за п. 1, де нейродегенеративне захворювання вибране з хвороби Альцгеймера, хвороби ФО Паркінсона і аміотрофічного бічного склерозу (БАС). о 50 сл Ф) іме) 60 б5