DK175930B1 - Nucleinsyrer, som koder for et fusionsprotein, rekombinant værtscelle indeholdende nucleinsyrerne, polypeptider indkodet af nucleinsyrerne, en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne polypeptider samt replicerbare vektorer indeholdende nucleinsyrerne - Google Patents

Description

DK 175930 B1

Baggrund for opfindelsen

Den foreliggende opfindelse angår nucleinsyrer, som koder for et fusionsprotein, hvori et immunoglobulinlignende do-5 mæne af et ikke-højpolymroft medlem af immunoglobulingen-superfamilien er fusioneret med et polypeptid, en rekombi-nant værtscelle indeholdende nucleinsyrerne, polypeptider indkodet af nucleinsyrerne, en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved udvinding af polypeptidet fra 10 kulturen af en værtscelle transficeret med nucleinsyrerne samt replicerbare udtrykkelsesvektorer indeholdende nucleinsyrerne. Polypeptiderne kan anvendes i præparater til antiviral behandling eller til immunomodulerende terapi. Opfindelsen angår nærmere bestemt præparater, der kan bruges 15 til behandling af infektioner med Human Immundefekt Virus (HIV).

Den primære, immunologiske abnormalitet, som fremkommer ved infektion med HIV, er den fremadskridende udtømning og 20 funktionelle svækkelse af T-lymfocyter, som udtrykker CD4-celleoverfladeglycoproteinet (H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol., 3:477 (1985)). CD4 er et ikke-polymorft glycopro tein, som har homologi med immunoglobulingen-superfamilien (P. Maddon et al., Cell, 42:93 (1985)). Sammen med CD8- 25 overfladeantigenet definerer CD4 to forskellige subsæt af modne, perifere T-celler (E. Reinherz et al., Cell, 19:821 (1980)), der kan skelnes ved deres evne til at vekselvirke med nominelle antigenmål i forbindelse med klasse I henholdsvis klasse II af de vigtigste histokompatibili-30 tetskompleksantigener (MHC-antigener) (S. Swain, Proc.

Natl. Acad. Sci., 78:7101 (1981), E. Engleman et al., J.

Immunol., 127:2124 (1981), H. Spitz et al., J. Immunol., 129:1563 (1982), W. Biddison et al., J. Exp. Med., 156:1065 (1982) og D. Wilde et al., J. Immonol., 131:2178 (1983)).

35 For det meste udviser CD4 T-celler hjælper/inducer T- 2 DK 175930 B1 cellefænotypen (E. Reinherz, se ovenfor) omend CD4 T-celler karakteriseret som cytotoxiske/suppresser T-celler også er blevet identificeret (Y. Thomas et al., J. Exp. Med., 154:459 (1981), S. Meuer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

5 USA, 79:4395 (1982) og A. Krensky et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 79:2365 (1982)). Tabet af CD4 hjælper/inducer T-cellefunktionen ligger sandsynligvis til grund for de dybtgående defekter i cellulær og humoral immunitet, der fører til opportunistiske infektioner og de ondartede karakteri-10 stika for det erhvervede immundefektsyndrom (AIDS) (H. Lane, se ovenfor).

Undersøgelser af HIV-I-infektion af fraktionerede CD4 og CD8 T-celler fra normale donorer og AIDS-patienter har af-15 sløret, at udtømning af CD4 T-celler hidrører fra HIV-I's evne til selektivt at inficere, replikere og endelig ødelægge dette T-lymfocytsubsæt (D. Klatzmann et al., Science, 225:59 (1984)). Den mulighed, at CD4 i sig selv var en vigtig komponent af den cellulære receptor for HIV-I, blev 20 først indikeret ved den observation, at monoklonale antistoffer rettet mod CD4 blokerer HIV-I-infektion og syncy-tiainduktion (A. Dalgleish et al., Nature (London), 312:767 (1984), J. McDougal et al., J. Immunol., 135:3151 (1985)).

Denne hypotese er blevet bekræftet ved påvisning af, at der 25 dannes et molekylekompleks mellem CD4 og gpl20, det vigtigste hylsterglycoprotein fra HIV-I (J. McDougal et al., Science, 231:381 (1986), og den iagttagelse, at HIV-I-tropisme kan tilvejebringes i almindelige, ikke-permissive humane celler efter den stabile ekspression af et CD4-cDNA (P.

30 Maddon et al., Cell, 47:333 (1986)). Endvidere synes de neurotropiske egenskaber af HIV-I, der afspejles ved en høj forekomst af fejlfunktion i det centrale nervesystem hos HIV-I-inficerede individer (W. Snider et al., Ann. Neurol., 14:403 (1983)), og muligheden for at påvise HIV-I i hjerne- i 35 væv og cerebrospinalvæske hos AIDS-patienter (G. Shaw et i 3 DK 175930 B1 al., Science, 227:177 (1985), L. Epstein, AIDS Res., 1:447 (1985), S. Koenig, Science, 233:1089 (1986), D. Ho et al., N. Engl. J. Med., 313:1498 (1985), J. Levy et al., Lancet, 11:586 (1985)) at kunne forklares i ekspressionen af CD4 i 5 celler af neuronal, glial og monocyt/makrofag oprindelse (P. Maddon, Cell, 47:444 (1986), I. Funke et al., J. Exp.

Med., 165:1230 (1986), B. Tourvieille et al., Science, 234:610 (1986)).

10 Udover at fastlægge følsomhed over for Hiv-l-infektion synes manifesteringen af cytopatiske effekter i den inficerede værtscelle at involvere CD4. Antistof mod CD4 fandtes at hæmme fusionen af ikke-inficerede CD4 T-celler og HIV-I-inficerede celler in vitro; endvidere dør de store multi-15 kerneholdige celler, som produceres ved denne begivenhed, kort tid efter de er blevet dannet, hvilket resulterer i udtømning af populationen af CD4-celler (J. Lifson et al., Science, 232:1123 (1986)). Dannelsen af syncytia kræver også gpl20-ekspression og kan fremkaldes ved samdyrkning af 20 CD4-positive cellelinjer og cellelinjer, som udtrykker HIV-I-env-genet i fravær af andre virale, strukturelle eller regulatoriske proteiner (J. Sodroski et al., Nature, 322:470 (1986), J. Lifson et al., Nature, 232:725 (1986)).

Ved mediering af både den initielle infektion med HIV-I så-25 vel som den sidste celledød udgør vekselvirkningen mellem gpl20 og CD4 én af adskillige kritiske punkter i den virale livscyklus, hvor man kan gribe ind terapeutisk (H. Mitsuya et al., Nature, 325:773 (1987)).

30 Den kendte sekvens for CD4-forstadiet forudsiger et hydrofobt signalpeptid, et ekstracellulært område på ca. 370 aminosyrer, en meget hydrofob strækning med signifikant identitet med det membranstrækkende domæne af klasse II MHC beta-kæden og en stærkt ladet intracellulær sekvens på 40 35 aminosyrer (P. Madden, Cell, 42:93 (1985)). Det ekstracel- DK 175930 B1 4 lulære domæne af CD4 består af 4 sammenhængende områder, som hver har aminosyrelighed og strukturel lighed med de variable og forbindende områder (V-J) af de lette kæder af immunoglobulin såvel som med relaterede områder i andre 5 medlemmer af immunoglobulingen-superfamilien (et subsæt heraf er her defineret ved det nydannede udtryk "adheso-ner"). Disse strukturelt lignende områder af CD4 kaldes Vi-, V2-, V3- og V4-domænerne (benævnt 1-4 i figur 3) .

10 En vellykket strategi ved udvikling af lægemidler til behandling af mange receptormedierede abnormaliteter har været identifikation af antagonister, som blokerer binding af den naturlige ligand. Eftersom CD4-adhesonen almindeligvis bindes til genkendelsesstederne for HIV-hylsteret, synes 15 adhesonen at ville være en kandidat til at lægge beslag på disse HIV-steder, hvorved viral infektivitet blokeres. Men CD4 i fuld længde og andre adhesoner er cellemembranpro- i teiner, som er forankret i cellernes lipiddobbeltlag. Tilstedeværelsen af membrankomponenter ville være uønskelige 20 set ud fra fremstilling og oprensning. Eftersom adhesoner normalt endvidere kun er til stede på celleoverflader, ville det være ønskeligt at frembringe adhesoner i en form, som er mere stabil under cirkulering. Endvidere er trunke-ret, opløseligt CD4-adheson (almindeligvis kaldt CD4T) må-25 ske ikke optimalt effektiv som terapeutisk middel, eftersom den har en forholdsvis kort biologisk halveringstid, ikke bindes bedre til HIV end til celleoverflade CD4, måske ikke krydser den placentale barriere eller andre biologiske barrierer; og eftersom den blot lægger beslag på HIV-genken-30 delsesstederne uden i sig selv at bære en dræberfunktion over for inficerede celler eller virus.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at producere opløselige, secernerede adhesoner. Et andet for-35 mål er at producere CD4-derivater, der kan bruges til be- 5 DK 175930 B1 ' handling af AIDS og beslægtede tilstande, på en måde, som stort set er upåvirket af den ekstreme grad af genetisk variation, som observeres blandt forskellige HIV-I-isolater, og deres respektive env-polypeptider (J. Coffin, Cell, 46:1 5 (1986)). Et andet formål er at fremstille adhesoner, som er fusioneret med andre polypeptider til tilvejebringelse af molekyler med nye funktioner, såsom de ovenfor beskrevne til terapeutisk brug eller diagnostiske reagenser til in vitro analyse af adhesoner eller deres ligander. Det er 10 navnlig et formål at fremstille molekyler til at dirigere toksiner eller effektormolekyler (f.eks. Fc-domænet af immunoglobulin) til celler, som bærer receptorer for adheso-nerne, f.eks. HIV gpl20 i tilfælde med CD4, og til brug ved at lette oprensningen af adhesoner. Det er endvidere et 15 formål at tilvejebringe stabile, meget rene adhesonpræpara-ter.

Oversigt over den foreliggende opfindelse 20 Formålene med den foreliggende opfindelse opnås ved at tilvejebringe nucleinsyre, som koder for et fusionsprotein, hvori et immunoglobulinlignende domæne af et ikke-højpolymorft medlem af immunoglobulingen-superfamilien er fusioneret med et polypeptid omfattende en immunoglobulin-25 konstant område-sekvens. Sådanne fusionsproteiner er en aminosyresekvensvariant af en adheson, navnlig en variant, i hvilken det transmembrane domæne er modificeret således, at det ikke længere er i stand til at sætte sig i cellemembranen. I tilfælde med CD4 kaldes sådanne varianter opløse-30 lig CD4.

Adhesionsvarianter fremstilles ved en fremgangsmåde, som omfatter (a) at en værtscelle transformeres med nucleinsyre, der koder for en aminosyresekvensvariant af en adhe- J

35 son, (b) at værtscellen dyrkes, og (c) at adhesonsvarianten j 6 DK 175930 B1 indvindes fra værtscelledyrkningsmediet eller fra lysater af værtscellen.

Ved specifikke udførelsesformer opnås formålet med den fo-5 religgende opfindelse ved tilvejebringelse af en adhesion-variant udvalgt blandt gruppen bestående af (a) en adhe-sonaminosyresekvensvariant med et inaktiveret transmembran-j domæne og (b) et polypeptid, som omfatter et ekstracellu- ! lært adhesondomæne fusioneret til sekvensen af et polypep- | 10 tid, som er forskellig fra adhesonen, hvor sidstnævnte f.eks. er udvalgt blandt et cytotoxin, et immunogen eller et protein med en lang plasmahalveringstid, såsom et konstant immunoglobulindomæne.

15 I en foretrukken udførelsesform er et polypeptid, som omfatter et gpl20-bindingsdomæne af CD4-adhesonen, i dets C-terminale ende fusioneret til et konstant immunoglobulindomæne eller koblet sammen med et cytotoxisk polypeptid, såsom ricin.

20

De her tilvejebragte CD4-adhesonsvarianter kan oprenses og formuleres i pharmacologisk acceptable vehikler til indgivelse i patienter, som har behov for antiviral, neuromodu-lerende eller immunomodulerende terapi, navnlig i patienter 25 inficeret med HIV, og til brug ved modulering af celleadhæsion.

Kort beskrivelse af tegningerne 30 Figurerne la-lc viser aminosyresekvensen og nucleotidse-kvension for en secerneret form af CD4-adhesonen. Sig-nalprocesseringsstedet er angivet med en pil.

Figurerne 2a-2c viser aminosyresekvensen og nucleotidse-35 kvensen for en fusion mellem herpes gD-lederen og de N- 7 DK 175930 B1 terminale 27 aminosyrerester og den formodede, modne N-; terminale ende af CD4T.

Figur 3 viser strukturelementerne af den native og den op-5 løselige CD4-adheson, den native, humane IgGi (yl) tung kæde og to eksempler på chimærer mellem tung kæde og CD4.

Figurerne 4a-4b er et kort over det koblede human IgGi (yl) kædefragment anvendt ved fremstilling af CD4-fusioner. Ind-10 føjelsessteder er betegnet 1 og Fc.

Figur 5 er et kort over det humane κ letkædefragment, der kan anvendes ved CD4-fusioner, ved pilen flankeret af VKJK (let variabel og forbindende) og CK (let konstant).

! 15

Detaljeret beskrivelse

Adhesoner er celleoverfladepolypeptider, som har et ekstra-cellulært domæne, der er homolog med et medlem af immu-20 noglobulingen-superfamilien, men udelukker dog meget poly-morfe medlemmer af denne superfamilie udvalgt fra gruppen klasse I og klasse II af de vigtigste histokompatibilitetsgener, immunoglobuliner og T-cellereceptor α-, β-, y- og δ-kæder. Eksempler på adhesoner omfatter CD1, CD2, CD4, CD8, 25 CD28, γ-, δ- og ε-kæderne af CD3, OX-2, Thy-1, de intracel- lulære eller neurale celleadhæsionsmolekyler (I-CAM eller N-CAM), lymfocytfunktionassocieret antigen-3 (LFA-3), neu-rocytoplasmisk protein (NCP-3), poly-Ig receptor, myelin-associeret glycoprotein (MAG), IgE-receptor med høj affini-30 tet, det vigtigste glycoprotein i perifer myelin (Po), blodpladeafledt vækstfaktorreceptor, kolonistimulerende faktor-l-receptor, macrofag Fc-receptor, Fc-gamma-receptorer og carcinoembryonisk antigen. Homolog betyder her, at de har den samme sekvens som et medlem af immunog lubo lin- DK 175930 B1 I 8 i gen-superfamilien eller indeholder en sekvens, som stort set er den samme som {eller en større del deraf) en amino-syresekvens, der er homolog med et kendt medlem af superfamilien, sådan som de ovenfor givne specifikke eksempler har 5 til sekvensen af et variabelt eller konstant immunoglobu-lindomæne. Eksempler på adhesoner er CD4, CD8 og IgE Fc-receptoren med høj affinitet. Den foreliggende opfindelse angår navnlig animosyresekvensvarianter af adhesoner. Ami-nosyresekvensvarianter af adhesoner fremstilles med henblik 10 på forskellige formål, herunder forøgelse af adliesonens affinitet for dens bindingspartner, at forøge stabiliteten, at lette oprensningen og fremstillingen af adhesonen, at forøge dens plasmahalveringstid, at forbedre dens terapeutiske virkningsfuldhed som ovenfor beskrevet i forbindelse 15 med den kendte teknik, at indføre yderligere funktionalite-ter og mildne alvorligheden eller forekomsten af bivirkninger under terapeutisk anvendelse af adhesonen. Aminosyrese-kvensvarianter af adhesoner falder inden for én eller en kombination af følgende klasser: varianter fremkommet ved 20 indføjelse, substitution eller deletion.

Aminosyresekvensvarianter fremkommet ved indføjelse er de varianter, i hvilke én eller flere aminosyrerester, som ikke findes i adhesonen, indføres i et forudbestemt sted i 25 adhesonen, inklusive den C- eller N-terminale ende. Sådanne varianter kaldes fusioner mellem adhesonen og et forskelligt polypeptid. Sådanne andre polypeptider indeholder andre sekvenser, end de, der normalt findes i adhesonen ved indføjelsespositionen. Der tænkes på adskillige grupper af 30 fusioner. Immunologisk aktive adhesonsfusioner omfatter en adheson og et polypeptid, som indeholder en ikke-adhesonepitop. Ikke-adhesonepitopen er et hvilket som helst immunologisk kompetent polypeptid, f.eks. et hvilket som helst polypeptid, som er i stand til at rejse et immunsvar 35 i det dyr, i hvilket fusionen indgives, eller som er i 9 DK 175930 B1 stand til at blive bundet af et antistof rejst mod ikke-adhesonpolypeptidet. Typiske ikke-adhesonepitoper vil være de epitoper, som bæres af allergener, autoimmune epitoper eller andre potente immunogener eller antigener, der gen- 1 5 kendes af eksisterende antistoffer i fusionsmodtageren, herunder bakterielle polypeptider, såsom trpLE, beta-galactosidase, virale polypeptider, såsom herpes gD-protein og lignende. Immunogene fusioner fremstilles ved tværbinding in vitro eller med rekombinerede cellekulturer trans-10 formeret med DNA, som koder for et immunogent polypeptid.

Det foretrækkes, at den immunogene fusion er én, i hvilken den immunogene sekvens er bundet til eller indsat i adhe-sonantigenet eller et fragment deraf ved hjælp af en peptidbinding (peptidbindinger). Disse produkter består derfor 15 af en lineær polypeptidkæde, som indeholder adhesonepitoper og mindst én epitop, der er fremmed for adhesonen. Det skal forstås, at det ligger inden for den foreliggende opfindelses rækkevidde at indføre epitoperne hvor som helst i adhe-sonmolekylet eller et fragment deraf. Sådanne fusioner 20 frembringes bekvemt ved hjælp af rekombinerede værtsceller eller ved at anvende bifunktionelle tværbindingsmidler. Anvendelsen af et tværbindingsmiddel til at fusionere adhesonen til det immunogene polypeptid er ikke så ønskelig som en lineær fusion, fordi de tværbundne produkter ikke så let 25 syntetiseres i strukturel homogen form.

Disse immunogene indføjelsesvarianter er navnlig anvendelige, når de formuleres i et pharmacologisk acceptabelt bæremateriale og indgives i en person for at rejse antistoffer 30 mod adhesonen, hvilke antistoffer igen er nyttige til diagnostisering eller ved oprensning af adheson ved immu-noaffinitetsmetoder, der i sig selv er kendte. Ved oprensning af adhesoner anvendes alternativt bindingspartnere for det fusionerede ikke-adhesonpolypeptid, f.eks. antistoffer, 35 receptorer eller ligander, til at adsorbere fusionen fra

^ I

i i i I

10 DK 175930 B1 urene blandinger, hvorefter fusionen elueres, og om ønsket indvindes adhesonen fra fusionen, f.eks. ved enzymatisk spaltning.

5 Andre fusioner, som også kan være eller ikke er immunologisk aktive, omfatter fusioner mellem adhesonsekvensen og en signalsekvens, der er heterolog til adhesonen, f.eks. fusioner mellem transmembranmodificerede CD4-adhesoner og polypeptider, der har en forøget plasmahalveringstid (al-] 10 mindeligvis >ca. 20 timer), såsom immunoglobulinkæder eller fragmenter deraf, og fusioner med cytotoxiske funktionali-teter. Signalsekvensfusioner anvendes for hurtigere at dirigere secerneringen af adhesonen. Det heterologe signal erstatter det native adhesonssignal, og når den fremkomne 15 fusion genkendes, det vil sige processeres og spaltes af værtscellen, secerneres adhesonen. Signaler udvælges på basis af den påtænkte værtscelle og kan omfatte bakterie-, gær-, pattedyr-, og virussekvenser. Herpes gD-glycoprotein-signalet er egnet til brug i pattedyrekspressionssystemer.

20

Plasmaproteiner, som har en forøget plasmahalveringstid, der er længere end for transmembranmodificeret CD4, omfatter serumalbumin, immunoglobuliner, apolipoproteiner og transferrin. Fortrinsvis er adheson-plasmaproteinfusionen 25 ikke væsentlig immunogen i det dyr, i hvilket det anvendes, og plasmaproteinet fremkalder ikke uønskede bivirkninger i patienter på grund af dets normale biologiske aktivitet.

I en specifik udførelsesform konjugeres det adhesonimmu-30 noglobulinlignende domæne, der kan -være homolog med enten det konstante domæne eller det variable domæne, med en sekvens fra det konstante område af et immunoglobulin. De fremkomne produkter kaldes her immunoadhesoner. Immunoglobuliner og visse varianter deraf er kendte, og mange er 35 blevet fremstillet ved rekombination i cellekultur. Se 11 DK 175930 B1 f.eks. U.S. patent nr. 4.745.055, EP nr. 256.654, Faulkner et al., Nature, 298:286 (1982), EP nr. 120.694, EP nr.

125.023, Morrison, J. Immun., 123:793 (1979), Kohier et al., PNAS USA, 77:2197 (1980), Raso et al., Cancer Res., 5 41:2073 (1981), Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2:239 (1984), Morrison, Science, 229:1202 (1985), Morrison et al., PNAS USA, 81:6851 (1984), EP nr. 255.694, EP nr.

266.663 og WO 88/03559. Reassorterede immunoglobulinkæder kendes også. Se f.eks. U.S. patent nr. 4.444.878, WO i 10 88/03565 og EP nr. 68.763 og heri omtalte referencer.

Adhesondomæner, som er homologe til immunoglobuliner og ekstracellulære i deres native miljø, fusioneres almindeligvis C-terminalt til den N-terminale ende af det konstan-15 te område af immunoglobuliner i stedet for det (de) variable område(r) deraf, under bevarelse af mindst funktionelt aktive hængsel-, CH2- og CH3-domæner af det konstante område af en tung immunoglobulinkæde. Dette opnås almindeligvis ved at konstruere den passende DNA-sekvens og udtrykke den 20 i en rekombineret cellekultur. Immunoglobuliner og andre ! polypeptider med forøget plasmahalveringstid fusioneres til det ekstracellulære domæne eller ligandbindingsdomæne i andre adhesoner på samme måde.

25 Grænsedomænerne for de CD4 V-lignende områder (V1-V4) er ca. 100-109, ca. 175-184, ca. 289-298 henholdsvis ca. 360-369 (baseret på forstadiet til CD4-aminosyresekvensen, hvor den initierende met er -25; figur la) . CD4-sekvenser, som indeholder et hvilket som helst af CD4 V-domænerne, fusio-30 neres til immunoglobulinsekvensen. Det foretrækkes, at V1V2 eller V1V2V3V4 fusioneres i deres C-terminale ende til det konstante immunoglobulinområde. Det præcise sted, ved hvilken fusionen finder sted, er ikke kritisk; grænsedomænerne angivet her er kun til vejledning, og andre steder i nærhe-35 den og inden for V-områderne kan udvælges for at optimere 12 DK 175930 B1 secerneringen eller bindingsegenskaberne for CD4. Det opti- I male sted vil blive bestemt ved rutineforsøg. Det har gene- ! ' relt vist sig, at fusionerne udtrykkes intracellulært, men der findes en stor variation med hensyn til secernerings-5 graden af fusionerne fra rekombinerede værter. Den efterfølgende tabel viser f.eks. de forskellige monoglobulinfu-sioner, som er blevet opnået ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. I alle eksempler med CD4-immunoadhesoner, blev CD4-signalet anvendt til at styre se-10 cernering fra 293-celler. Et lille m angiver oprindelse fra mus, medens et lille h angiver human oprindelse. V og C er forkortelser for det variable henholdsvis det konstante domæne af immunoglobulin. Talindeksene angiver antallet af enheder i parentesen fundet i den pågældende multimer. Det 15 skal forstås, at kæderne i multimererne formodes at være disulfidbundne på samme måde som native immunoglobuliner. CD4-immunoadhesonerne indeholdt typisk enten de første N-terminale 366 aminosyrerester af CD4 (CD44) eller de første 180 N-terminale aminosyrerester af CD4 (CD42) bundet i de-20 res C-terminale ende til κ-kæden (let) eller det konstante område af den tunge kæde af IgGl (γΐ).

i 25 30 ! 13 DK 175930 B1

Tabel I

Transficeret gen Secerneret produkt mVKCK m^K^K og/eller (mVKCK)2

mV7^C7i ND

mV^C* + mV7lC7l (mVK:Cw)2(æV7lC7l)2 + mVKCK og/eller (mVKCK)2 hCD4-mCK hCDA*mCK og/eiier (hCD4-mCK)2

hCD4-mC7l ND

+ hCD4-mC7i (hCD4-mClc) 2 (hCD4-mC7i)2 + Μ04-ηι0Λ og/eller (hCD4-mC^)2 Η0ϋ4-ΜΛ hCD4-hCK og/eller (hCD4-hCK)2 hCD4-hC7l (hCD4-hC7l)2 hCD4-hC* + hCD4-hC7i (hCD4 -hC*) 2 (hCD4 -hC7i) 2 + hCD4-hCK og/eller (hCD4-hC*)2 m$KCK + hCD4-hC7i (inV/cCic)2(tiCD4-hC7^)2 + mVKCic °B/eller *ND — ikke påvist 14 DK 175930 B1 På baggrund af denne tabel er det interessant at observere, at immunoadhesonen mellem CD4 og den humane tunge kæde blev secerneret som en dimer, medens den analoge musekonstruktion ikke blev påvist (dette udelukker imidlertid ikke den 5 intracellulære akkumulering af proteinet). hCD4-hC yl-transformanternes evne til at producere tungkæde dimer var uventet, eftersom tidligere arbejde lod formode, at tunge immunoglobulinkæder ikke blev secerneret med mindre værterne blev co-transformeret med nucleinsyre, som koder for bå-! 10 de den tunge kæde og den lette kæde (Valle et al., Nature, 241:338 (1981)). Ifølge den foreliggende opfindelse secerneres CD4-IgG-immunoadhesonchimærer let, i hvilke CD4-epitopen er til stede i tungkæde dimerer, letkæde monomerer eller -dimerer og heterotetramerer af tung kæde og let kæ-15 de, hvori CD4-epitopen er til stede fusioneret til én eller flere lette eller tunge kæder, herunder heterotetramerer, hvorhos op til og inklusiv alle fire analoger med variabelt område er afledt fra CD4. Hvor et lettungkæde, ikke-CD4, variablet domæne er til stede, er der tilvejebragt et hete-20 rofunktionelt antistof.

Forskellige eksempler på heteroimmunoadhesonantistoffer og chimære immunoådhesonantistoffer produceret i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er vist skematisk ne-25 denfor. "A" betyder mindst en del af det ekstracellulære domæne af en adheson indeholdende dens ligandbindingssted, VL, VH, Cl og CH repræsenterer variable og konstante domæner af den lette eller den tunge kæde af et immunoglobulin.

30 (a) ACh- [VlCl-V„Ch] ; (b) [ACl-AC„] - [VLCL-V„C„] ; (c) [ACl-VhCh]-[VlCl-VhCh] ; eller (d) [VlCl-AChI-IVlCl—V„CH] .

15 DK 175930 B1

De i denne tabel viste strukturer viser kun nøgletræk, f.eks. viser de ikke forbindelsesdomæner (J) eller andre domæner af immunoglobulinerne, og disulfidbindinger er ej heller vist. Disse er udeladt for korthedens skyld. Men 5 hvor sådanne domæner er nødvendige for bindingsaktivitet skal de betragtes som værende til stede på de sædvanlige steder, som de optager i adhesonen, immunoadhesonen eller i immunoglobulinmolekylerne, som det nu er tilfældet. Disse eksempler er repræsentative for divalente antistoffer; mere 10 komplekse strukturer ville fremkomme ved at anvende sekven- j ser for den tunge immunoglobulinkæde fra andre klasser, f.eks. IgM. Immunoglobulin VLVH-antistofkombineringsstedet også betegnet det ledsagende immunoglobulin er fortrinsvis i stand til at bindes til et forudbestemt antigen.

15

Egnede ledsagerimmunoglobulinkombineringssteder og fusionspartnere opnås fra IgG-1, -2, -3 eller -4 subtyperne, IgA,

IgE, IgD eller IgM, men fortrinsvis IgG-1.

20 En foretrukken udførelsesform er en fusion af en N-terminal del af CD4, som indeholder bindingsstedet for gpl20-hylsterproteinet fra HIV, og den C-terminale Fc-del af et antistof, som indeholder effektorfunktionerne for immunoglobulin Gi. Der er to foretrukne udførelsesformer af den 25 slags; i én er hele det konstante område af den tunge kæde fusioneret til en del af CD4; i en anden er en sekvens, som begynder med hængselområdet netop opstrøms papainspalt-ningsstedet, der definerer IgG Fc kemisk (amminosyrerest 216, hvor den første aminosyrerest af det konstante område 30 af den tunge kæde er 114 (Kobat et al., "Sequences of Protein of Immunological Interest" 4. udg., 1987) eller analoge steder af andre immunoglobuliner) er fusioneret til en del af CD4. Disse udførelsesformer er beskrevet i eksemplerne .

35 16 DK 175930 B1 Nærmere bestemt formodes de varianter, i hvilke ét eller flere immunoglobulinlignende domæner af en adheson er indsat i stedet for det variable område af en immunoglobulin-i kæde, at udvise forbedret in vivo plasmahalveringstid. Dis- 5 se chimærer konstrueres på en lignende måde som chimære antistoffer, i hvilke et variabelt domæne fra ét antistof fra én art indsættes i stedet for det variable område fra en anden art. Se f.eks. EP nr. 0.125.023, Munro, Nature, 312: (13. december 1984), Neuberger et al., Nature, 312: (13.

^ 10 december 1984), Sharon et al., Nature, 309: (24. maj 1984),

Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984), Morrison et al., Science, 229:1202-1207 (1985) og

Boulianne et al., Nature 312:643-646 (13. december 1984).

Det DNA, som koder for det (de) immunoglobulinlignende 15 adhesondomæne(r), spaltes med et restriktionsenzym ved eller proksimalt 3'-enden af det DNA, som koder for det (de) immunoglobulinlignende domæne(r), og ved et punkt ved eller nær det DNA, som koder for den N-terminale ende af det modne adhesonpolypeptid (hvor man tænker på at anvende en an- 20 den leder) eller ved eller proksimalt det område, der koder for den N-terminale ende af adhesonen (hvor det native adhesonsignal anvendes). Dette DNA-fragment indsættes derefter let i det DNA, som koder for et konstant område af en let eller tung immunoglobulinkæde, og tilpasses om nødven-25 digt ved deletionsmutagenisering. Dette er fortrinsvis et humant immunoglobulin, når varianten påtænkes til in vivo terapi i mennesker. DNA, som koder for de konstante områder af den lette eller tunge immunoglobulinkæde, er kendt eller kan let fås fra cDNA-biblioteker eller kan syntetiseres. Se 30 f.eks. Adams et al., Biochemistry, 19:2711-2719 (1980),

Gough et al-, Biochemistry, 19:2702-2710 (1980), Dolby et al., PNAS USA, 77:6027-6031 (1980), Rice et al., PNAS USA, 79:7862-7865 (1982), Falkner et al., Nature, 298:286-288 (1982) og Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2:239:256 35 (1984).

DK 175930 B1 17 DNA, som koder for den (de) chimære immunoglobulin- eller immunoadhesonkæde(r), overføres ved transfektion i en værtscelle til ekspression. Hvis værtscellen producerer et 5 immunoglobulin forud for transfektion, behøver man kun at transficere med adhesonen fusioneret til en let kæde eller en tung kæde til frembringelse af et heteroantistof. De ovenfor nævnte immunoglobuliner, som har én eller flere arme, der bærer adhesondomænet, og én eller flere arme, der '10 bærer de variable ledsagerområder, resulterer i dobbelt specificitet for adhesonligand og for antigen. Disse fremstilles ved de ovenfor beskrevne rekombinantmetoder eller ved in vitro procedurer. I sidstnævnte tilfælde fremstilles f.eks. F(ab')2~fragmenter af adhesonfusionen og et immu-15 noglobulin, F(ab')2~fragmenterne omdannes til Fab'-fragmenter ved reduktion under milde reduktionsbetingelser og reoxideres derefter i hinandens tilstedeværelse under sure betingelser i overensstemmelse med kendte metoder. Se også U.S. patent nr. 4.444.878.

20

Der kendes yderligere procedurer til fremstilling af intakte heteroantistoffer ud fra immunoglobuliner med forskellige specificiteter. Disse procedurer tilpasses til in vitro produktion af heterochimære antistoffer ved simpelthen at 25 indsætte immunoadhesonkæderne i stedet for en af de tidligere anvendte immunoglobuliner.

Ved en alternativ metode til fremstilling af et heterofunk-tionelt antistof fusioneres værtsceller, som producerer en 30 adheson-immunoglobulinfusion, f.eks. transficerede myelo-maer, også med B-celler eller hybridomaer, som secernerer antistof, der har den ønskede ledsagerspecificitet for et antigen. Heterobifunktionelt antistof indvindes fra dyrkningsmediet fra sådanne hybridomaer, og kan således frem- 18 DK 175930 B1 stilles noget mere bekvemt end ved traditionelle in vitro i resorteringsmetoder (EP nr. 68.763).

i j En anden gruppe af fusioner er de fusioner, i hvilke en ! 5 adheson er konjugeret med en toxisk substans, f.eks. et po- lypeptid, såsom ricin (inkluderende deglycosyleret ricin A-kæde), diptheria toxin A eller et ikke-peptidylcytotoxin.

Når toxinet er et polypeptid, er det bekvemt at tværbinde polypeptidet til adhesonen eller dens transmembrandeletere-10 de variant ved hjælp af traditionelle in vitro proteintværbindingsmidler (for egnede metoder til kobling af ricin A-kæde eller deglycosyleret A-kæde til CD4, se f.eks. Duncan : et al., Analy. Biochem., 132:68-73 (1983), Thorpe et al.,

Cancer Res., 47:5924 (1987) og Ghotie et al., Cancer Res., 15 48:2610 (1988)) eller ved rekombinant syntese som en fusion (se f.eks. U.S. patent nr. 4.765.382). Når ledsagerantistofferne alternativt er variable immunoglobulindomæner af antistoffet mod ricin, anvendes sådanne immunoglobulinhete-roantistoffer til at levere ricin til HIV-inficerede celler 20 efter den generelle procedure ifølge Raso et al., Cancer Research, 41:2073 (1981).

En anden klasse af adhesonvarianter er deletionsvarianter. Deletioner er karakteriseret ved fjernelsen af én eller 25 flere animosyrerester fra en adhesonsekvens. Typisk er transmembrandomænet eller det cytoplasmiske domæne af adhe-soner fjernet. I tilfælde med CD4 vil mindst aminosyrere-sterne 368-395 (det transmembrane område) og sædvanligvis også 396-433 (det cytoplasmiske domæne) være fjernet til 30 opnåelse af secernerede former af denne adheson. I parentes bemærket følger aminosyreresterne den nummerering, der anvendes for moden CD4 som f.eks. bemærket i figurerne la-lc. CD4T-molekylerne vil således generelt afslutte i nærheden af ca aminosyreresterne 366-368 eller ved et hvilket som 19 DK 175930 B1 helst andet egnet sted N-terminalt herfor, hvilket bevarer CD4-variantens evne til at binde gpl20.

Odskiftningsvarianter er de varianter, i hvilke mindst én i 5 aminosyrerest i adhesonsekvensen er blevet fjernet, og en anden aminosyrerest indsat i dens sted. Den native N-terminale aminosyrerest for moden CD4 vides at være lysin.

Den sekvens, som vises i figur 1 med en N-terminal aspara-gin, er således en aminosyresekvensvariant af nativ, moden 10 CD4. I tabel 2 nedenfor anføres substitutioner, der almindeligvis vil resultere i en finmodulering af CD-antigenets egenskaber.

i i | 20 DK 175930 B1

Tabel 2

Oprindelig rest Eksempler på substitutioner i ^ Ala sar j Arg lys | Asn gin; his

Asp glu

Cys ser; ala 20 Gin asn

Glu asp

Gly pro

His asn; gin

Ile leu; val 25 Leu ile; val

Lys arg; gin; glu

Met leu; ile

Phe met; leu; tyr

Ser thr 20 ^ ser

Trp tyr

Tyr trp; phe

Val ile; leu 25 Væsentlige ændringer i funktion eller immunologisk i-dentitet frembringes ved at udvælge substitutioner, som er mindre konservative end de, der er vist i tabel 2, det vil sige ved at udvælge aminosyrerester, som adskiller sig mere væsentligt med hensyn til deres effekt 30 på at bevare (a) strukturen af polypeptidskelettet i substitutionsområdet, f.eks. som en foldebladkonforma-tion eller en spir alkonf ormat ion, (b) molekylets ladning eller hydrofobicitet ved målstedet eller (c) sidekædens fylde. De substitutioner, som almindeligvis 35 forventes at frembringe de største ændringer i adheson-egenskaber, vil være de substitutioner, i hvilke (a) en 21 DK 175930 B1 hydrofil aminosyrerest, f.eks. seryl eller threonyl, indsættes i stedet for (eller erstattes med) en hydrofob rest, f.eks. leucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl eller analyl, (b) en cysteinyl eller prolyl indsættes i 5 stedet for (eller erstattes med) en anden aminosyrerest, (c) en aminosyrerest, som har en elektropositiv sidekæde, f. eks. lysyl, arginyl eller histidyl, indsættes i stedet for (eller erstattes med) en elektrone-gativ rest, f.eks. glutamyl eller aspartyl eller (d) en 10 aminosyrerest med en fyldig sidekæde, f.eks. phenyla-nyl, indsættes i stedet for (eller erstattes med) en aminosyre, som ikke har en sidekæde, f.eks. glycyl.

I En foretrukken klasse af substitutionsvarianter eller 15 deletionsvarianter er de varianter, som involverer det transmembrane område af adhesonen. Det transmembrane område af adhsonen er et meget hydrofobt eller lipofilt domæne, som har den korrekte størrelse til at strække sig over cellemembranens lipiddobbeltlag. Det formodes 20 at forankre adhesonen i cellemembranen.

Deletion eller substitution af transmembrandomænet vil lette indvinding og tilvejebringe en opløselig form af adhesonen ved at reducere dens celle- eller membranli-25 pidaffinitet og ved at forbedre dens vandopløselighed.

Hvis det transmembrane domæne og det cytoplasmiske domæne fjernes, undgår man at indføre potentielt immunogene epitoper enten ved eksponering af ellers intracel-lulære polypeptider, som kunne genkendes af kroppen som 30 værende fremmede, eller ved indføjelse af heterologe polypeptider, som er potentielt immunogene. En hovedfordel ved den transmembrandeleterede adheson er, at den secerneres i dyrkningsmediet for de rekombinerede værter. Denne variant er vandopløselig og har ikke en 35 tydelig affinitet for cellemembranlipider, hvorfor det er betydeligt nemmere at indvinde den fra den rekombi- 22 DK 175930 B1 nerede cellekultur.

Det vil tydeligt fremgå af ovennævnte diskussion, at substitutioner, deletioner, indføjelser eller en hvil-5 ken som helst kombination deraf indføres for at nå til en slutkonstruktion. Som et generelt princip har alle varianter ikke et funktionelt transmembrant domæne og har fortrinsvis ikke en funktionel cytoplasmisk sekvens. Dette opnås almindeligvis ved at fjerne det re-10 levante domæne, omend passende indføjelsesmutagener eller substitionsmutagener også kan være effektive til dette formål. F.eks kan det transmembrane domæne udskiftes med en hvilken som helst aminosyresekvens, f. eks. en tilfældig eller en homopolyaminosyresekvens på 15 fra ca 5 til 50 serin-, threonin-, lysin-, arginin-, glutamin- og asparaginsyrerester samt lignende hydrofile aminosyrerester, som alle udviser en hydrofil hydro-patiprofil, således at den secerneres i dyrkningsmediet for rekombinerede værter. Denne variant skal også be-20 tragtes som værende en adhesonvariant.

Disse varianter fremstilles almindeligvis ved stedsspecifik mutagenisering af nucleotider i det DNA, som koder for adhesonen, hvorved der frembringes DNA, som ko-25 der for varianten, og hvorefter DNA'et udtrykkes i en rekombineret cellekultur. Adhesonvarianter kan imidlertid også fremstilles ved in vitro syntese. Det er klart, at variationer i det DNA, som koder for adhesonvarianter, ikke må anbringe sekvensen ude af læseramme 30 og vil fortrinsvis ikke frembringe komplementære områder, som kunne producere sekundære mRNA-strukturer, som skader ekspression (EP nr. 75.444A). CD4-varianterne udviser typisk den samme gpl20-bindingsaktivitet som den naturligt forekommende prototype, omend der også 35 udvælges varianter for at modificere CD4-adhesonens e-genskaber som ovenfor indikeret.

23 DK 175930 B1

Omend stedet for indføring af en aminosyresekvensvaria-tion er forudbestemt, behøver mutationen i sig selv ikke at være forudbestemt. For at optimere effekten af en mutation på et bestemt sted kan tilfældig mutageni-5 sering udføres ved målkodonen eller målområdet, og de udtrykte adhesonvarianter kan screenes for den optimale kombination af ønskede aktiviteter. Metoder til frembringelse af substitutionsmutationer på forudbestemte steder i DNA med en kendt sekvens er velkendte, f.eks.

10 M13-primermutagenisering.

Adhesonvarianter, som ikke er i stand til at binde HIV gpl20, er ikke desto mindre anvendelige som immunogener til at rejse antistoffer for adhesonen eller som immu-15 noanalysekomponenter (mærket som et konkurrerende rea gens for gpl20-analyse eller umærket som en standard for en adhesonanalyse), når blot én adhesonepitop forbliver aktiv.

20 Det DNA, som koder for adhesoner, opnås ved kendte procedurer. Se Williams, Immunol. Today, 8:298-303 (1987) og referencer deri. Generelt anvendes prokaryoter til at klone CD4 variant-DNA-sekvenser. F.eks. er E. coli-stamme SR101 (til propagering af ml3-fag, en λ-resi-25 stent stamme af JM 101; Messing et al., Nucl. Acids.

Res., 9(2):309-321 (1981)), og E. coli K12-stamme 294 (ATCC nr. 31446) specielt nyttige. Andre mikrobielle stammer, som kan anvendes, omfatter E. coli B UM101 og E. coli% 1776 (ATCC nr. 31537). Disse eksempler er il-30 lustrative frem for begrænsende.

DNA, som koder for adhesonvarianterne, indsættes til ekspression i vektorer, som indeholder promotorer og styringssekvenser, der er afledt fra arter, som er koro-35 patible med den påtænkte værtscelle. Vektoren bærer almindeligvis, men ikke nødvendigvis, et replikations- 24 DK 175930 B1 ! sted såvel som én eller flere markørsekvenser, der er i stand til at tilvejebringe en fænotypisk selektion i ' transformerede celler. F.eks. transformeres E. coli typisk med et derivat af pBR322, hvilket er et plasmid 5 afledt fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclinresistens og tilvejebringer således en let måde til at identificere transformerede celler. pBR322-plasmidet eller et andet mikrobielt plasmid må også in-10 deholde eller være modificeret til at indeholde promotorer og andre styringselementer, der almindeligvis anvendes i rekombinerede DNA-konstruktioner.

Promotorer, der egner sig til brug med prokaryote vær-15 ter, omfatter illustrativt B-lactamase og lactosepromo-torsystemerne (Chang et al., Nature, 275:615 (1978) og Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), alkalisk phosphatase, tryptofan (trp) promotorsystemet (Goeddel,

Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) og EPO-ansøgning pu-20 blikation nr. 36.776) samt hybridpromotorer, såsom tac-promotoren (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 80:21-25 (1983)). Andre funktionelle bakterielle promotorer er imidlertid egnede. Deres nucleotidse-kvenser er almindeligvis kendte, hvorved en fagmand er 25 i stand til på funktionsdygtig måde at ligere dem til det DNA, som koder for adhesonvarianten, under anvendelse af linkere eller adaptorer til tilvejebringelse af et hvilket som helst restriktionssted (Siebenlist et al.. Cell, 20:269 (1980)). Promotorer til brug i bak-30 terielle systemer vil også indeholde en Shine-Dalgarno-sekvens (S.D.-sekvens), der på funktionsdygtig måde er koblet til det DNA, som koder for antigenet.

Ud over prokaryoter er eukaryote mikrober, såsom gær-35 kulturer, også brugbare som klonings- eller ekspressionsværter. Saccharomyces cerevisiae eller almindelig 25 DK 175930 B1 bagegær er den mest almindelige anvendte eukaryote mikroorganisme, omend en række andre stammer er alminde-j ligt tilgængelige. Til ekspression i Saccharomyces an vendes f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Na-5 ture, 282:39 (1979), Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979), Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, som mangler evnen til at gro i tryptofan, f.eks. ATCC 10 nr. 44076, eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en karakteristik for gærværtscellegenomet tilvejebringer derefter en effektiv måde til at selektere ved vækst i fravær af tryptofan.

15

Egnede promotorsekvenser til brug i gærværter omfatter promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) eller for andre glycolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 20 7:149 (1968) og Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), såsom enolase, glycer aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, phosphoglucose-25 isomerase og glucokinase.

Andre gærpromotorer, som er inducerbare promotorer med den yderligere fordel at transcriptionen er styret af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehy-30 drogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer i forbindelse med nitrogenmetabolisme, metallothionein, glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase og enzymer ansvarlige for udnyttelse af maltose og galactose. Egnede· vektorer og promotorer til brug ved 35 gærekspression er yderligere beskrevet af R. Hitzeman et al., Europæisk Patentpublikation nr. 73.657A. Gær- 26 DK 175930 B1 enhancere kan også med fordel anvendes sammen med gærpromotorer.

Promotorer til styring af transcription fra vektorer i 5 pattedyrværtsceller kan fås fra forskellige kilder, f. eks. genomerne fra vira, såsom polyomavirus, abevirus 40 (SV40), adenovirus, retrovira, hepatitis-B-virus og mest fortrinsvis cytomegalovirus, eller fra heterologe pattedyrpromotorer, f.eks. beta-actinpromotoren. De 10 tidlige og sene promotorer fra SV40-viruset opnås bekvemt som et SV40-restriktionsfragment, der også indeholder det virale SV40-replikationsstartsted. Fiers et al., Nature, 273:113 (1978). Den umiddelbart tidlige promotor fra det humane cytomegalovirus opnås bekvemt 15 som et Hindlll E-restriktionsfragment. Greenaway, P.J. et al., Gene, 18:355-360 (1982). Selvfølgelig kan promotorer fra værtscellen eller beslægtede arter også anvendes her.

20 DNA-transcriptionen i højere eukaryoter forøges ved at indføje en enhancersekvens i vektoren. Enhancere er cis-virkende DNA-elementer, sædvanligvis fra ca 10 til 300 bp, -som forøger en promotors transcriptionsinitie-ringsevne. Enhancere er forholdsvis orienterings- og 25 positionsuafhængige, idet de er blevet fundet 5' (Lai-mins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Scie., 78:993 (1981)) og 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108 (1983)) for transcriptionsenheden, inden i en in-tron (Banerji, J.L. et al., Cell, 33:729 (1983)) såvel 30 som inden i selve den kodende sekvens (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)). Der kendes nu mange enhancersekvenser fra pattedyrgener (globin, ela-stase, albumin, α-fetoprotein og insulin). Man vil i-midlertid typisk anvende en enhancer fra et virus i en 35 eukaryot celle. Eksempler omfatter SV40-enhanceren på den sene side af replikationsstartstedet (bp 100-270), 27 DK 175930 B1 den tidlige cytomegaloviruspromotorenhancer, polyomaen-hanceren på den sene side af replikationsstartstedet og adenovirusenhancere.

5 Ekspressionsvektorer, som anvendes i eukaryote værts celler (celler fra gær, svampe, insekter, planter, dyr, mennesker eller kerneholdige celler) kan også indeholde sekvenser, som er nødvendige for terminering af transcription, hvilket kan påvirke mRNA-ekspression. Disse 10 områder transcriberes som polyadenylerede segmenter i den ikke-translaterede del af det mRNA, som koder for adhesonen.

I Ekspressionsvektorsystemer vil almindeligvis indeholde 15 et selektionsgen, også kaldet en selekterbar markør.

Eksempler på egende selekterbare markører fra pattedyrceller er dihydrofolatreductase (DHFR), thymidinkinase eller neomycin. Når sådanne selekterbare markører på-vellykket måde overføres i en pattedyrværtscelle, kan 20 den transformerede pattedyrværtscelle overleve, hvis den anbringes under et selektivt tryk. Der er to meget anvendte forskellige kategorier af selektive programmer. Den første kategori er baseret på en celles metabolisme og anvendelsen af en mutantcellelinie, som 25 mangler evnen til at vokse uafhængigt af et suppleret medium. To eksempler er: CHO DHFR“-celler og LTK--mu seceller . Disse celler mangler evnen til at gro uden tilsætning af sådanne næringsstoffer som thymidin eller hypoxanthin. Fordi disse celler mangler visse gener, 30 som er nødvendige for en fuldstændig nucleotid syntesevej , kan de ikke overleve med mindre de manglende nu-cleotider tilføres i et suppleret medium. Et alternativ til at supplere mediet er at indføre et intakt DHFR- eller TK-gen i celler, som mangler de respektive 35 gener, hvorved deres vækstkrav ændres. Individuelle celler, som ikke blev transformeret med DHFR- eller TK- 28 DK 175930 B1 genet, vil ikke være i stand til at overleve i ikke-supplerede medier.

Den anden kategori er dominant selektion, som refererer 5 til et selektionsskema, der kan anvendes i en hvilken som helst celletype og ikke kræver anvendelsen af en mutantcellelinie. Disse programmer anvendes typisk i et medikament til at standse væksten af en værtscelle.

De celler, som har et nyt gen, vil udtrykke et protein, 10 som giver medikamentresistens, og de vil overleve selektionen. Eksempler på sådan dominant selektion udnytter medikamenterne neomycin, Southern, P. og Berg, P., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982), mycophenol- syre, Mulligan, R.C. og Berg, P. Science, 209:1422 15 (1980) eller hygromycin, Sugden, B. et al.. Mol. Cell.

Biol., 5:410-413 (1985). De tre ovenfor nævnte eksempler udnytter bakterielle gener under eukaryot kontrol til tilvejebringelse af resistens over for det passende medikament G418 eller neomycin (geneticin), xgpt (myco-20 phenolsyre) henholdsvis hygromycin.

"Amplification" refererer til forøgelsen af replikatio-nen af et isoleret område i en celles kromosomale DNA. Amplification opnås ved at anvende et selektionsmiddel, 25 f.eks. methotrexat (MTX), som inaktiverer DHFR. Amplification eller fremstillingen af efterfølgende kopier af DHFR-genet resulterer i, at større mængder af DHFR bliver produceret over for større mængder MTX. Ampli-ficationstryk påføres uanset tilstedeværelsen af endo-30 gent DHFR ved at tilsætte stadig stigende mængder MTX til medierne. Amplification af et ønsket gen kan opnås ved at cotransficere en pattedyrværtscelle med et plas-! mid med et DNA, som koder for et ønsket protein, og DHFR- eller amplificationsgenet, hvilket tillader coin-35 tegration. Man sikrer sig, at cellen kræver mere DHFR, hvilket krav opfyldes ved replikation af selektionsge- 29 DK 175930 B1 net, ved kun at selektere for celler, som kan vokse i nærværelse af en stadig større MTX-koncentration. Så , længe det gen, som koder for et ønsket, heterologt pro tein, er cointegreret sammen med selektionsgenet, giver 5 replikation af dette gen ophav til replikation af det gen, som koder for det ønskede protein. Resultatet er, at det forøgede antal kopier af genet, det vil sige et amplificeret gen, som koder for det ønskede, heterologe protein, udtrykker mere af det ønskede, heterologe pro-, 10 tein.

Foretrukne værtsceller til ekspression af CD-antigenva-rianter ifølge den foreliggende opfindelse er pattedyrcellelinier, eksempler omfatter: abenyre CVl-linien 15 transformeret med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonisk nyrelinie (293, Graham, F.L. et al., J. Gen.

Virol., 36:59 (1977) og 293S-celler (293-subkloner se lekteret for bedre suspensionsvækst)), babyhamsternyreceller (BHK, ATCC CCL 10), kinesiske hamsterovariecel-20 ler-DHFR (CHO, Urlaub og Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA), 77:4216 (1980)), musesertoliceller (TM4, Mather, j.P., Biol. Reprod., 23:243-251 (1989)), abenyreceller (CVl ATCC CCL 70), nyreceller fra afrikansk, grøn marekat (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane cervicale carcino-25 maceller (HELA, ATCC CCL 2), hundenyreceller (MDCK, ATCC CCL 34), bøf f e lr otte leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), musebrysttumorceller (MMT 060562, ATCC CCL51-celler) og TRI-celler (Mather, 30 J. P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)).

"Transformation" betyder indføring af DNA i en organisme, således at DNA1et repliceres, enten som et ekstra-35 kromosomalt element eller ved kromosomal integration.

En egnet metode til transformation af værtscellerne er 30 DK 175930 B1 metoden ifølge Graham, F. og van der Eb, A. , Virology, 52:456-457 (1973). Men andre metoder til indføring af DNA i celler, såsom kerneinjektion eller ved proto-plastfusion, kan også anvendes. Hvis prokaryote celler 5 eller celler, som indeholder væsentlige cellevægge, anvendes som værter, er den foretrukne transfektionsmeto-de calciumbehandling under anvendelse af calciumchlorid som beskrevet af Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA), 69:2110 (1972).

10

Konstruktion af egnede vektorer, som indeholder de ønskede kodende sekvenser og styringssekvenser, udnytter standardmetoder og manipulerende ligeringsmetoder. I-solerede plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, til-15 passes og genligeres i den form, som ønskes til frembringelse af de ønskede plasmider. Egnede procedurer til den her beskrevne konstruktion er velkendte. Se f. eks. (Maniatis, T. et al.. Molecular Cloning, 133-134,

Cold Spring Harbor, (1982) , "Current Protocols in Mo-20 lecular Biology", redigeret af Ausubel et al., (1987), publiceret af Greene Publishing Associates & Wiley-In-terscience).

Korrekte plasmidsekvenser bekræftes ved at transformere 25 E. coli K12 stamme 294 (ATTC 31446) med ligeringsblandinger, vellykkede transformanter udvælges ved ampicil-lin- eller tetracyclinresistens, hvor det passer sig, plasmider fra transformanterne fremstilles derefter ved restriktionsenzymfordøjelse og/eller sekventeres ved 30 metoden ifølge Messing et al., . Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved metoden ifølge Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

Værtsceller transformeres med ekspressionsvektorerne i-35 følge den foreliggende opfindelse. Derefter dyrkes de i passende dyrkningsmedier, f.eks. indeholdende sub- 31 DK 175930 B1 stanser til induktion af promotorer, selektion af transformanter eller amplificering af gener. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH og lignende, er de betingelser, der tidligere er anvendt med den 5 værtscelle, som er udvalgt for ekspression, og vil være indlysende for en fagmand.

De secernerede adhesonvarianter indvindes og oprenses fra kultursupernatanterne eller lysater af de rekombi-10 nerede værter. Supernatanterne koncentreres typisk ved ultrafiltrering, kontaktes med en ligandaffinitetsma-triks eller en immunoaffinitetsmatriks til adsorption af adhesonvarianten og elueres fra matriksen. Adheso-nen oprenses eventuelt ved ionbytningskromatografi.

15

Det var overraskende, at oprensning af opløselig CD4-adheson fra dyrkningsmediet var uventet vanskelig. U-anset at det hydrofobe transmembranområde af antigenet var blevet fjernet, udviste antigenet en stærk tendens 20 til at danne aggregater, som let kunne fjernes fra suspensionen ved centrifugering ved 1000 x g, og som var tilbøjelig til at dække overflader, såsom ultrafiltre-ringsmembraner. Dette synes at hidrøre fra nedsættelse af koncentration af albumin eller andre serumproteiner 25 (der almindeligvis er til stede i den rå præparation) til et bestemt niveau, under hvilket det trunkerede antigen ikke længere forbliver opløseligt. Dette fænomen synes at blive værre ved at udsætte CD4-adhesonen for lav pH (< ca pH 4). Som følge deraf skal separations-30 procedure (navnlig de procedurer, som anvender sur elu-ering, såsom immunoaffinitet) modificeres således, at eluatet holdes ved eller straks føres tilbage til neutralitet. Endvidere bør et overfladeaktivt middel, f. eks. et detergent, såsom Tween 80, tilsættes til anti-35 genet under separationsproceduren. Det færdigt opren-sede produkt vil blive stabiliseret med et forudbestemt 32 DK 175930 B1 protein, såsom albumin, og/eller et detergent.

Den oprensede adheson formuleres i traditionelle phar-macologisk acceptable excipienser.

5

Den indgives i patienter med HIV-infektion i en dosis, som er i stand til at holde en koncentration som er større end ca 100 ng af opløselig CD4-adheson/ml plasma. For CD4-adhesonvarianter, som har en anden moleky-10 levægt, vil ca 2 picomol opløselig receptor per ml plasma blive vurderet klinisk i begyndelsen for at eta-1 blere en støkiometrisk ækvivalens med nativ (membran- bundet) og opløselig receptor. Den almindelige dosis af opløselig CD4 er 100 ug/kg patientvægt/dag.

15

De terapeutiske CD4-varianter anvendes sammen med andre terapier og midler til behandling af AIDS, herunder A2T, neutraliserende antistoffer og immunocytotoxiner, gpl20-fragmenter og vacciner.

20

For at lette forståelsen af de efterfølgende eksempler vil visse hyppigt forekommende metoder og/eller udtryk blive beskrevet.

25 "Plasmider" er betegnet med et lille p, hvor der foran og/eller efter står store bogstaver og/eller tal. Ud-gangsplasmiderne her kan enten fås koirmercielt, eller er offentligt tilgængelige på en ikke-begrænset måde eller kan konstrueres ud fra tilgængelige plasmider i 30 overensstemmelse med publicerede procudurer. Endvidere er ækvivalente plasmider til de her beskrevne kendte og vil være indlysende for en fagmand.

"Fordøjelse" af DNA refererer til katalytisk spaltning 35 af DNA'et med et restriktionsenzym, som kun virker ved visse sekvenser i DNA'et. De forskellige her anvendte 33 DK 175930 B1 restriktionsenzymer kan fås kommercielt, og deres reaktionsbetingelser, cofaktorer og andre krav blev anvendt som det vil være en fagmand bekendt. Til analytiske formål blev typisk 1 ug plasmid eller DNA-fragment an-5 vendt med ca 2 enheder enzym i ca 20 μΐ pufferopløsning. Til isolering af DNA-fragmenter til plasmidkon-struktion blev typisk fra 5 til 50 ug DNA fordøjet med fra 20 til 250 enheder enzym i et større volumen. Passende puffere og substratmængder til specielle restrik-10 tionsenzymer er specificeret af producenten. Der anvendes almindeligvis inkuberingstider på ca 1 time ved 37“C, men kan variere i overensstemmelse med leverandørens instruktioner. Efter fordøjelse blev reaktions- i

blandingen underkastet elektroforese direkte på en po- J

15 lyacrylamidgel til isolering af det ønskede fragment.

i "Indvinding" eller "isolering" af et bestemt DNA-fragment fra en restriktionsfordøjelsesblanding betyder separation af f ordøj elsesblandingen på en polyacrylamid-20 gel eller agarosegel ved elektroforese, identifikation af det fragment, som har interesse, ved at sammenligne dets mobilitet med markør-fragmenter med kendt molekylevægt, fjernelse af det gelsegment, som indeholder det ønskede fragment, og separation af gelen fra DNA. Den-25 ne procedure er almindelig kendt (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 (1981) og Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)).

"Dephosphorylering" refererer til fjernelse af de ter-30 minale 51-phosphater ved behandling med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP). Denne procedure forhindrer, at 2 restriktionsspaltede ender af DNA-fragment "cirkulerer" eller danner en lukket sløjfe, hvilket ville udelukke indføjelse af et andet DNA-fragment ved restrik-35 tionsstedet. Procedure og reagenser til dephosphylering og andre rekombinante manipuleringer er traditio- 34 DK 175930 B1 nelle. Reaktioner med BAP udføres i 50 mM Tris ved 68° C for at undertrykke aktiviteten af enhver exonuclease, der kan være til stede i enzympræparationerne. Reaktionerne fik lov til at forløbe i 1 time. Efter reaktio-5 nen blev DNA-fragmentet geloprenset.

"Ligering" refererer til dannelsen af phosphordiester-bindinger mellem 2 dobbeltstrengede nucleinsyrefragmenter (Maniatis, T. et al., Id. side 146). Med mindre 10 andet er anført, kan ligering udføres med kendte puffere og betingelser med 10 enheder T4-DNA-ligase ("liga-se”) per 0,5 ug af omtrent ækvimolære mængder af DNA-fragmenter, som skal ligeres.

i I 15 "Udfyldning” eller "frembringelse af stumpe ender" re fererer til de procedurer, ved hvilke den enkeltstrengede ende i de klæbrige ender af en restriktionsenzymspaltet nucleinsyre omdannes til en dobbeltstreng.

Dette eliminerer de klæbrige ender og danner en stump 20 ende. Denne process er et alsidigt værktøj til at omdanne en restriktionsskæringsende, som kun passer sammen med enderne skabt af kun ét eller nogle få andre restriktionsenzymer, til en ende, som er kompatibel med en hvilken som helst stumpendeskærende restriktionsen-25 donuclease eller andre fyldte klæbrig e ender. Frembringelse af stumpe ender udføres typisk ved at inkubere 2-15 ug af mål-DNA'et i 10 mM MgCl2» 1 mM dithio-threitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-puffer (pH 7,5) ved ca 37°C i nærværelse af 8 enheder Klenow-fragment af DNA-30 polymerase I og 250 uM af hver af de 4 deoxynucleosid-triphosphater. Inkuberingen afsluttet almindeligvis efter 30 minutter med phenol- og chloroformekstraktion og ethanol præcipitering.

35 De efterfølgende eksempler illustrerer alene de på nuværende tidspunkt bedste udførelsesformer for udøvelse 35 DK 175930 B1 af opfindelsen, men skal ikke betragtes som en begrænsning af opfindelsen.

Eksempel 1 5 Konstruktion af vektorer til ekspression af nativ CD4 og secernerede derivater

Sektion 1 10 Det plasmid, som blev anvendt til rekombinant syntese af human CD4, var pSVeCD4DHFR. Plasmidet blev konstrueret på følgende måde: ACD4P1 indeholdende det meste af den kodende sekvens 15 for human CD4 (opnået fra et humant placentalt cDNA-bi-bliotek under anvendelse af oligonucleotidprober baseret på den publicerede sekvens (Maddon et al., 1985)) blev fordøjet med EcoRI til frembringelse af cDNA-ind-føjeisen. Dette fragment blev indvundet ved polyacryl-20 amidgelelektroforese (fragment 1).

pUC18 blev fordøjet med EcoRI, og det enkelte fragment blev indvundet ved polyacrylamidelektroforese (fragment 2). Fragment 1 blev ligeret til fragment 2, og lige-25 ringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpla-det på ampicillinholdige medieplader, og resistente kolonier blev udvalgte. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne og undersøgt ved restriktionsana-30 lyse for tilstedeværelse af de korrekte DNA-fragmenter.

Dette plasmid kaldes pUCCD4.

pSVeE'DHFR (Muesing et al.. Cell, 48:691-701 (1987)) blev fordøjet med Kpnl og BamHI, og der blev frembragt 35 stumpe ender med E. coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og de 4 dNTP'er. Fragment 3, som indeholder pML- j 36 DK 175930 B1

Ampr-området, den tidlige SV40-promotor, HIV-LTR og mu-se-DHFR-genet blev indvundet ved gelelektroforese, blev ligeret, og ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kul-5 tur blev udpladet på ampicillinmedieplader og resistente kolonier blev udvalgte. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne og undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af BamHI-restriktionsstedet og fravær af KpnI-restriktionsstedet. Dette 10 plasmid kaldes pSVeÆBKDHFR og tillader, at EcoRI-BamHI-fragmenter indsættes efter den tidlige SV40-promotor og transcriberes under dens kontrol, efter transfection i en passende cellelinie.

15 Der blev fremstillet syntetiske oligonucleotider (adap-torerne 1-8 nedenfor), som strakte sig fra 76 bp 5' for initieringscodonen af CD4-translation til Rsal-restriktionsstedet ved 121 bp 3' for initiatoren, med sekvensen AATT ved 5’-enden af sensestrengen til frembringel-20 se af en ende, som kan ligere til et EcoRI-restriktionsfragment. Disse oligonucleotider blev ligeret, og det 204 bp lange fragment, som indeholder hele sekvensen, blev indvundet ved gelelektroforese (fragment 4).

25 CD4 adaptor 1: AATTCAAGCCCAGAGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCT

CD4 adaptor 2: pACTGCTCAGCCCCTTCCTCCCTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTC CD4 adaptor 3: pCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGC CD4 adaptor 4:

pAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGT 30 CD4 adaptor 5: pACAGGTCAGTTCCACTGTATCCCCTTTTTTGCCCAGCACCACTTTGTTTCC

CD4 adaptor 6: pCTGAGTGGCTGCTGGGAGGAGCGCCAGTTGCAGCACCÅGAAGCAAGT CD4 adaptor 7: pGCCTAAAAGGGACTCCCCGGTTCATTGTGGCCTTGCCGAGGGAGGAAGGG CD4 adaptor 8: GCTGAGCAGTAGGGACCTGAGCCCACAGAAATGGCAGGGCTCTGGGCTTG

35 pUCCD4 blev fordøjet med Rsal og SstI og det 401 bp lange fragment, som indeholder en del af den CD4-koden- 37 DK 175930 B1 de sekvens blev indvundet ved gelelektroforese (fragment 5). pUC18 blev fordøjet med EcoRI og SstI, og det fragment, som indeholdt hovedparten af plasmidet blev indvundet ved gelelektroforese (fragment 6). Fragmen-5 terne 4 og 5 blev ligeret til fragment 6, og ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev udvalgt. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transfor-10 manter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Sekvensen af det indsatte syntetiske . DNA blev undersøgt ved at udskære de 605 bp lange EcoRI-Ssti-fragmenter fra adskillige transformanter og ligere dem med M13mpl9, som var 15 blevet fordøjet med de samme enzymer. Efter transformation i E. coli stamme JM101 blev der fremstillet og sekventeret enkeltstrenget DNA. Ét plasmid, som indeholdt den korrekte sekvens, blev udvalgt og kaldes pCD4int.

20 pCD4int blev fordøjet med EcoRI og SstI og fragment 7, som indeholder 5'-enden af det CD4-kodende område, blev indvundet ved gelelektroforese. pUCCD4 blev fordøjet med SstI og BamHI, og det 1139 bp lange fragment, som 25 indeholder resten af det CD4-kodende område (fragment 8), blev indvundet ved gelelektroforese.

pSVeABKDHFR blev fordøjet med EcoRI og BamHI, og fragment 9, som omfatter hovedparten af plasmidet, blev i-30 . soleret. Fragmenterne 7, 8 og 9 blev ligeret, og lige ringsblandingen blev transformeret i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampi-cillinholdige medieplader, og de resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra 35 transformanterne og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment.

i 38 DK 175930 B1

Dette plasmid blev kaldt pSVeCD4DHFR og blev anvendt til at dirigere syntesen af rekombinant intakt CD4.

Sektion 2 5

Der blev konstrueret et plasmid til at styre syntesen af et CD4-derivat, som manglede det formodede transmem-brane domæne og det meste af det formodede cytoplasmi-ske domæne (Maddon et al.). Dette blev gjort med hen- 10 blik på at frembringe en secerneret form af CD4 baseret på den antagelse, at disse domæner forankrer CD4-glyco-proteinet til cellemembranen, og at deres fjernelse ville resultere i secernering af produktet. Dette plasmid kaldes pSVeCD4ANlaDHFR og blev konstrueret på føl-15 gende måde: pUCCD4 blev fordøjet med SstI og Taql, og det 531 bp lange fragment (fragment 10) blev indvundet. pUCCD4 blev fordøjet med Nlalll og Tagl, og det 112 bp lange 20 fragment (fragment 11) blev indvundet. pUCCD4 blev fordøjet med BamHI og Nlalll, og det 301 bp lange fragment (fragment 12) blev indvundet. pCD4int blev fordøjet med SstI og BamHI, og fragment 13, som omfatter hovedparten af plasmidet, blev indvundet. Fragmenterne 25 10, 11 og 12 blev ligeret sammen med fragment 13, og ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev ud-pladet på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra 30 transformanterne og undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Plasmid-DNA fra adskillige transformanter blev sekventeret for at sikre, at det 195 bp lange Nlalll-fragment var blevet fjernet, og at den korrekte læseramme var genopret-35 tet. Det fremkomne plasmid blev kaldt pCD4ANla.

39 DK 175930 B1 pCD4åNla blev fordøjet med EcoRI og BamHI og det 1542 bp lange fragment, som indeholder sekvensen af et CD4-derivat, der mangler transmembrandomænet og det cyto-plasmiske domæne, blev indvundet (fragment 14) og lige-5 ret til fragment 9, og ligeringsblandingen blev transformeret i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og blev undersøgt ved re-10 striktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Dette fragment blev kaldt pSVeCD4dNlaDHFR.

Både pSVeCD4DHFR og pSVeCD4dNlaDHFR blev ved transfection overført i CHO-celler ved den samme metode, som 15 blev anvendt til at etablere cellelinier, som stabilt udtrykker HIV-I polypeptider (Muesing, Smith og Capon,

Cell, 48:6910701 (1987)). Disse celler blev analyseret for produktion ved radioiramunopræcipitering som nedenfor beskrevet. Selv om der ikke var påvist produkt i 20 indledende forsøg, viste efterfølgende forsøg, at den ovenfor beskrevne kodende sekvens faktisk kunne dirigere syntesen af en opløselig CD4-adhesonvariant i både CHO- og 293-celler.

25 Sektion 3

Der blev i begyndelsen anvendt et andet ekspressionssystem for syntesen og ekspressionen af en CD4-variant, ' som fuldstændig manglede de cytoplasmiske og transmem-30 brane domæner. Dette system udnytter cytomegalovirus-promotoren og kan anvendes i dyrkede celler af human oprindelse. Det første plasmid, der blev konstrueret til brug i dette system, indeholdt det kodende område for CD4 og var beregnet til at fungere som en kontrol i 35 de efterfølgende undersøgelser. Det blev kaldt pRKCD4 j og blev konstrueret på følgende måde: 40 DK 175930 B1 pSVeCD4DHFR blev fordøjet med EcoRI og BamHI, og fragment 15, som indeholdt hele det CD4-kodende område, blev isoleret. pRK5 (U.S. patentansøgning nr. 97.472, indleveret 11. september 1987) blev fordøjet med EcoRI 5 og BamHI, og fragment 16, som omfattede hovedparten af plasmidet, blev indvundet ved elektroforese, blev ligeret til fragment 15, og ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedie-10 plader, og resistente kolonier blev selekteret. Plas-mid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelsen af det korrekte fragment. Dette plasmid blev kaldt pRKCD4.

15 Sektion 4

Det næste plasmid, der blev konstrueret, blev udformet til at styre ekspressionen af det ovennævnte (sektion 3) secernerede derivat af CD4. Det kodende område af 20 CD4 blev fusioneret efter amino syrer est 368 fra moden CD4 til en sekvens fra pBR322, som koder for endnu 9 aminosyrerester før en translationstermineringscodon.

Dette fjerner de formodede CD4-transmembrane og cyto-plasmiske domæner, som formodes at forankre CD4 til i 25 celleoverfladen. Plasmidet blev kaldt pRKCD4T (og pro ducerer et protein, som blev kaldt CD4T) og blev konstrueret på følgende måde: pSVeCD4DHFR blev fordøjet med Hpall, blev forsynet med 30 stumpe ender med Klenow-fragment og de 4 dNTP’er og blev fordøjet med BstEII. Det 382 bp lange fragment (fragment 17), som indeholdt en del af den CD4-kodende sekvens, blev indvundet ved gelelektroforese. pSVeCD4-DHFR blev fordøjet med EcoRI og BstEII, og det 874 bp 35 lange fragment (fragment 18) blev indvundet. pBR322 blev fordøjet med Hindlll, blev forsynet med stumpe en- i

S

; 41 DK 175930 B1 der med Klenow-fragment og de 4 dNTP'er og blev fordøjet med EcoRI. Fragment 19, som omfattede hovedparten af plasmidet, blev isoleret og ligeret til fragmenterne 17 og 18, og ligeringsblandingen blev ved transformati-5 .on overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader, og re-stistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte 10 fragment. Dette plasmid blev kaldt pCD4Tint.

pRK5 blev fordøjet med EcoRI og Smal, og fragment 20, ! som omfattede hovedparten af plasmidet, blev isoleret.

! pCD4Tint blev fordøjet med EcoRI og EcoRV, og det 1410 15 bp lange fragment, som indeholder den CD4-kodende sekvens til Hpall-stedet ved 1176 bp 3' for initierings-codonen og det 154 bp lange HindIII-EcoRV-fragment fra pBR322, blev indvundet (fragment 21). Fragmenterne 20 og 21 blev ligeret, og ligeringsblandingen blev ved 20 transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transf ormanter og undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af 25 det korrekte fragment. Dette plasmid blev kaldt pRK- j CD4T.

Sektion 5a 30 For at frembringe en secerneret form af CD4, der kunne ; oprenses med et antistof rettet mod herpes virus type I glycoprotein D, blev der konstrueret et plasmid til at udtrykke et derivat af CD4T, i hvilket plasmid det område, som koder for det modne, processerede CD4T-poly-35 peptid, var fusioneret til en sekvens, som koder for ; signalpeptidet og de første 27 aminosyrerester i det 42 DK 175930 B1 modne type I Herpes Simplex virus gD glycoprotein. Dette plasmid blev kaldt pRKGDCD4T og blev konstrueret på følgende måde: 5 pgDTrunc.DHFR blev fordøjet med EcoRI og PvuII, og det fragment, som indeholdt det kodende område for signal-peptidet og de første 27 aminosyrerester af det modne HSV I gD glycoprotein blev isoleret (fragment 22).

PRKCD4T blev fordøjet med EcoRI og BstEII, og fragment 10 23, scan indeholdt 3’-enden af den CD4-kodende sekvens og pRK5-området, blev isoleret.

Syntetiske oligonucleotider GD (adaptorerne 1-2 nedenfor), som indeholdt den kodende sekvens for CD4 fra 15 codonen for den aminoterminale rest af moden CD4 til Rsa-stedet ved 121 bp 3' for translationinitieringen, og som indeholdt sekvensen CTGCTCGAG ved 5'-enden af sensestrengen, blev fremstillet {fragment 24). pRKCD4 blev fordøjet med Rsal og BstEII, og det 665 pb lange 20 fragment, som indeholder en del af det kodende område for CD4, blev indvundet (fragment 25) og blev ligeret til fragment 24. Efter fordøjelse med BstEII for at sikre, at kun et monomert fragment var til stede, blev det 724 bp lange fragment, som indeholder begge sekven-25 ser, indvundet ved gelelektroforese (fragment 26).

Fragmenterne 22, 23 og 26 blev ligeret, og ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294. Den transformerede kultur blev udpladet på 30 araipicillinmedieplader, og resistente kolonier blev. selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra trans-formanter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Sekvensen af adskillige transformanter blev undersøgt for at sikre, 35 at den syntetiske indføjelse var korrekt, og at læserammen var bevaret. Dette plasmid blev kaldt pRKGDCD4T.

43 DK 175930 B1

Disse pRK5-afledte plasmider blev fortrinsvis ved transfektion overført i 293S-celler til stabil ekspression i overensstemmelse med Muesing et al., Cell, 48; 691 (1987) med den undtagelse, at ud over det plasmid, 5 som har interesse, blev et plasmid, som udtrykker neo-mycinresistensgenet pRSV neo (Gorman et al., Science, 221:553-555 (1985)) cotransficeret. 293-celler kan også anvendes som værtsceller på tilfredsstillende måde.

2 dage efter transfektion blev cellerne overført i 10 standardmedium (1:1 F12/DME suppleret med L-glutamin, penicillin-streptomycin og 10% FBS) med 0,5 mg/ml G418 (Genticinsulfat, Gibco) til selection af stabile cellelinier frem for i medier, som indeholder methotrexat som vist af Muesing et al. Cellerne blev analyseret 15 for produktion af CD4 eller CD4-analoger ved radioimmu-nopræcipitering. Ved bindingsstudier (sektion 5c) anvendtes konditionerede supernatanter fra disse celler i 1:1 F12/DME-mediet. Materialer anvendt i infectivi-tetsanalyser (sektion 5b) blev opnået som beskrevet i 20 sektion 8 nedenfor.

gDCD4 adaptor 1: CTGCTCGAGCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGAC gDCDA adaptor 2: 2¾ pACAGGTCAGTTCCACTGTATCCCCTTTTTTGCCCAGCACCACTTTGTTTCCCTGCTCGA Sektion 5b

Det efterfølgende udgør en undersøgelse af neutralise-30 ringen af HIV-I-infektivitet med opløselige CD4-analo- ger. En modifikation af neutraliseringsproceduren i-følge Robert-Guroff et al., Nature, 316:72 (1985) blev fulgt. Lige store voluminer inhibitorsupernatant og virus (60 ul) blev inkuberet ved 4eC i 1 time, hvoref-35 ter det samme volumen H9 (Gallo et al., Science, 224: 500, 1984) ved 5xl06/ml blev tilsat, og inkuberingen 44 DK 175930 B1 blev fortsat i 1 time ved 37°C. Efter absorption blev 2,5xl0^-celler i 150 ul overført til 2 ml inkuberings-medium. Efter 4 dage ved 37 °C blev kulturerne opdelt ; 1:2 med frisk medie og inkuberet i yderligere 3 dage.

5 Kulturer blev høstet, aktivitet af revers transcriptase blev målt (Groopman et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 3:71, 1987), og immunofluorescensreaktivi- tet med HIV-I-positivt serum blev bestemt som beskrevet (Poiesz et al., Proc. Acad. Nat. Sci. USA, 77:7415, 10 1980). Inhibitorsupernatanter blev opnået fra sammen flydende pladekulturer af 293S/CDT4-, 293S/gDCD4T-cel-ler eller ikke-transficerede 293-celler ved at erstatte vækstmediet med inkuberingsmedium og høste supernatan-terne 24 timer senere. Inhibitorsupernatant erstattede 15 en del eller alt inkuberingsmedium under de første 3 dyrkningsdage som anført i den anden spalte i tabel 3. Provokationsdosis af virus var 100 TCID^q (Groopman et al., se ovenfor) af HIV-I stamme HTLV-IIIB dyrket i H9-celler analyseret i det samme system. Inkuberingsmedie 20 bestod af RPMI 1640-medier indeholdende 2 mM L-gluta-min, 100 enheder/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 2 ug/ml polybren og 20% føtal kalveserum (M.A. Biopro-ducts).

25 30 35 45 DK 175930 B1

Tabel 3

Fortynding af Indirekte Revers Inhibitor- inhibitor- iirununof luo- transcrip- 5 supernatant supernatant rescens *) tase +) Transfektion- efterligning ufort.; 1:4 65,3 65,5 21,8 23,9

Transfektion- 10 efterligning ufort.; 1:4 61,2 61,1 18,5 28,1 CD4T ufort.; 1:4 0,4 18,0 0,11 5,94 I CD4T ufort.; 1:4 0,8 16,1 0,15 3,72 ! gDCD4T ufort.; 1:4 0,4 26,8 0,14 9,92 I 15 gDCD4T ufort.; 1:4 1,4 36,1 0,23 11,3 *) % positive celler + ) cpm/ml x 105 20

Begge former af opløselig CD4 ødelagde praktisk taget væksten af HIV-I, når de blev inkuberet med virusinficerede celler uden forudgående fortynding (tabel 3).

25 Ved en fortynding på 1:4 var de opløselige CD4-præpara-tioner kun delvis effektive til at hæmme virusvækst, men niveauet af fluorescens-positive celler og revers transcriptase var stadig væsentligt lavere end kulturer der modtog cellesupernatanter efter transfektionefter-30 ligning (tabel 3). Eftersom der ikke var nogen væsentlig forskel i virusvækst mellem fortyndede og ufortyn-dede kontrolsupernatanter, eller nogen af supernatan-terne påvirkede væksten af uinficerede H9-celler (resultatet er ikke vist) blev det konkluderet, at opløse-35 lige CD4-proteiner til stede i disse supernatanter var ansvarlige for neutraliseringen af HIV-I-infektion af 46 DK 175930 B1 H9-celler.

Sektion 5c 5 For at bestemme affinitetskonstanten for vekselvirkninger mellem gpl20 og CD4 eller CD4-varianter blev mætningsbindingsanalyser udført med opløselig CD4 (se o-venfor) og detergentopløseliggjort intakt CD4 (Lasky et al.. Cell, 50:975 (1987)) under anvendelse af radioio-10 deret gpl20 mærket med lactoperoxidase. Bindingsreaktionsblandinger omfattede ^^I-gpl20 (fra 3 ng til 670 ng, 2,9 nCi/ng) inkuberet .i l time ved 0°C med cellely-sater indeholdende intakt CD4 (Lasky et al., ovenfor citeret) eller cellesupernatanter indeholdende umærket 15 CD4T eller gDCD4T fremstillet som beskrevet i sektion 5a. Reaktionsblandinger (0,2 ml) havde en slutsammen-sætning på 0,5 x McDougal lyseringspuffer (McDLB) (1 x McDLB indeholder 0,5% Nonidet NP-40, 0,2% Na-deoxycho-lat, 0,12 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 8,0) og blev ud-20 ført i dobbeltprøver både i nærværelse eller fravær af 50 ug umærket, oprenset gpl20 (74 ganges overskud eller et større overskud). Efter inkubering blev bundet gpl20 kvantificeret ved immunopræcipitering og talt i en gammatæller. Til immunopræcipitering blev bindings-25 reaktionsopløsninger præabsorberet med 5 μΐ normalt kaninserum i 1 time ved 0°C og blev klaret med 40 μΐ Pan-sorbin (10% vægt/volumen, Calbiochem) i 30 minutter ved 0°C. Prøver blev derefter inkuberet natten over ved 0° C med 2 μΐ normalt serum eller 5 μΐ (0,25 ug) OKT4 mo-30 noklonalt antistof (Ortho) efterfulgt af opsamling af immunkomplekser med 10 μΐ Pansorbin. Præcipitater blev vasket 2 gange i 1 x McDLB og 1 gang i vand, blev derefter elueret ved 100eC i 2 minutter i prøvepuffer (0,12 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,7 M mercaptoetha- 35 nol, 20% glycerol og 0,1% bromphenolblå). CD4-molekyler blev bundet på mætbar måde af gpl20 og gav en 47 DK 175930 B1 simpel massevirkningskurve. Supernatanter fra celler transficeret på efterligende måde gav et niveau af specifikt bundet gpl20 på mindre end 1% af det, der blev fundet for supernatanter indeholdende opløseligt CD4.

5 Scatchard-analyse afslørede en enkelt klasse af bindingssteder på hvert molekyle med tilsyneladende dissocieringskonstanter (Kd) på 1,3 x 10~9 M, 0,83 x 10"9 M og 0,72 x 10-9 M for intakt CD4, CD4T henholdsvis gDCD4T. Værdierne opnået for CD4-gpl20-binding i 10 opløsning er sammenlignelig med affiniteten tidligere målt for gpl20-binding til CD4 på hele celler (Kd=4,0 x 10-9 M, Lasky, Cell, se ovenfor).

Sektion 6 15

For at producere secernerede derivater af CD4, som er fri for fremmede aminosyrerester, blev der konstrueret 2 plasmider til ekspression i 293-celller. Plasmiderne indeholdt CD4-gener, som var blevet trunkeret uden til-20 føjelse af ekstra aminosyrerester, og kaldes pRKCD44Nla og pRKCD4TP (og som producerer proteinter kaldet CD4TP og CD4ANla) og blev konstrueret på følgende måde:

Fragment 14, som indeholdt CD4-genet med en deletion af 25 det 195 bp lange Nlalll-restriktionsfragment, blev ligeret til fragment 16, der er pRK5 fordøjet med EcoRI og BamHI. Ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294, den transformerede kultur blev udpladet på amipicillinmedieplader, og resi-30 stente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Det fremkomne plasmid blev kaldt pRKCD4ANla.

35 Syntetisk DNA (5'CGT GAT AGA AGC TTT CTA GAG 3') blev fremstillet for at fastgøre det til Hpall-stedet ved DK 175930 B1 48 1176 bp, og som, når det var således bundet, ville ter-minere translation efter aminosyreresten 368 i rooden CD4 (fragment 27). Den anden ende af dette fragment blev udformet til at ligere til BamHI-restrikstions-5 fragmenter. pUCCD4 blev fordøjet med BstEII og Hpall, og det 382 bp lange fragment, som indeholdt en del af CD4-genet, blev indvundet (fragment 28). Fragmenterne 27 og 28 blev ligeret og blev derefter fordøjet med BstEII for at reducere dimeriserede fragmenter til mo-10 nomerer, og det fremkomne 401 bp lange fragment blev indvundet (fragment 29).

pRKCD4 blev fordøjet med Bstll og BamHI, og det fragment, som omfattede hovedparten af plasmidet (fragment 15 30), blev isoleret og ligeret til fragment 29. Lige ringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294, den transformerede kultur blev udpla-det på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra 20 transformanter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Det fremkomne plasmid blev kaldt pRKCD4TP. Begge plasmider blev ved transfektion overført i 293-celler til frembringelse af stabile cellelinier, som udtrykker variant 25 CD4 som beskrevet ovenfor.

Sektion 7

Der blev konstrueret 2 plasmider til at styre ekspres- i 30 sionen af secerneret CD4, som mangler fremmede aminosy-rerester, i CHO-celler. Disse kaldes pSVeCD4ANlaSVDHFR og pSVeCD4TRSVDHFR (og koder for proteiner, der har den primære sekvens for CD4ANla og CD4TP), og de blev konstrueret på følgende måde: pE348HBV.E400D22 blev fordøjet med Pvul og EcoRI, og 35 i 49 DK 175930 B1 det fragment, som indeholdt den tidlige SV40-promotor og en del af β-lactamasegenet, blev indvundet (fragment 31). pE348HBV.E400D22 blev fordøjet med Pvul og BamHI, og det store fragment, som indeholdt resten af B-lacta-5 masegenet såvel som den tidlige SV40-promotor samt DHFR-genet, blev isoleret (fragment 32).

Fragmenterne 31 og 32 blev ligeret sammen med fragment 14 og blev ved transformation overført i E. coli stamme 10 294. Den transformerede kultur blev udpladet på ampi- cillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transforman-ter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Det fremkomne : 15 plasmid blev kaldt pSVECD4ANlaSVDHFR. Dette plasmid indeholder det samme DNA-fragment, som koder for det opløselige CD4-molekyle, som findes i det ovennævnte plasmid pSVeCD44NlaDHFR (sektion 2).

20 pRKCD4TP blev fordøjet med EcoRI og BamHI, og det fragment, som indeholdt det trunkerede CD4-kodende område, blev isoleret og ligeret til fragmenterne 31 og 32. Ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294, den transformerede kultur blev udpla-25 det på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Det fremkomne . plasmid blev kaldt pSVeCD4TPSVDHFR. Begge 30 disse plasmider blev transfektion overført i CHO-cel-ler, og amplificerede transfeetanter blev udvalgt ved hjælp af methotrexat under anvendelse af traditionelle procedurer.

35 i 50 DK 175930 B1

Eksempel 2

Fusioner af V-området af CD4-genet, hvilket område er homologt med det variable område af immunoglobulingener 5 (ref. Maddon et al., 1985), til det konstante område (C) af de humane immunoglobulinkæder H og r2 blev konstrueret på følgende måde:

Der blev frembragt syntetisk DNA, som koder for C-områ-10 det af den humane -'f-kæde (resterne 109-214) baseret på den sekvens, som er publiceret af Morin et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., 82:7025-7029, med tilføjelsen ved 5'-enden af den kodende streng af sekvensen GGGG, hvilket muliggør, at dette fragment ligeres til BspMI-stedet 15 ved enden af det formodede v-lignende område af CD4.

Ved 3’-enden af det kodende område blev der tilføjet en translationsstopkodon, såvel som en sekvens, som tillader at denne ende ligeres til BamHI-restriktionsfrag-menter. Det syntetiske DNA blev fremstillet i 8 frag-20 menter, 4 for hver streng, 70-90 baser lange. Disse fik derefter lov til at annelere og ligere forud for . isolering på en polyacrylamidgel (fragment 33).

pRKCD4 blev fordøjet med EcoRI og BspMI, og det 478 bp 25 lange fragment, som indeholdt det område, der koder for det formodede V-lignende domæne af CD4, blev indvundet (fragment 34). Fragmenterne 33 og 34 blev ligeret med fragment 16 (fra ekspressionsvektoren pRK5). Ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E.

30 coli stamme 294, den transformerede.kultur blev udpla-det på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanter og blev undersøgt ved restriktionsanalyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment. Det 35 resulterende plasmid blev kaldt pRKCD4Ck.

51 DK 175930 B1

Et plasmid, som koder for en fusion af det V-lignende domæne af CD4 til det humane immunoglobulinområde CT2, blev konstrueret på lignende måde og blev kaldt pRKCD4-CT2. Begge disse plasmider blev ved transfektion over-5 ført i 293-celler, myelomaceller eller andre kompetente i celler til opnåelse af cellelinier, som udtrykte CD4-molekylevarianter som ovenfor beskrevet.

Eksempel 3 1 10 gDC4T secerneret ved metoden fra eksempel 1 blev oprenset fra cellekulturvæske indeholdende enten 10% FBS (føtal bovinserum) eller intet FBS. Den konditionerede cellekulturvæske blev først koncentreret ved ultrafil-15 trering og blev derefter oprenset ved immunoaffinitets-kromatografi. Immunoaffinitetssøjlen blev fremstillet ved at koble det monoklonale museantistof 5B6 (hvis e-pitop er på HSV-1 gD-delen af gDC4T-molekylet) til gly-cerylbelagt glas med kontrolleret porestørrelse ved me-20 toden ifølge Roy et al., 1984. Den koncentrerede cellekulturvæske blev sat direkte på søjlen, og de konta-minerende proteiner blev vasket væk med puffer med neutral pH-værdi. Søjlen blev derefter vasket med neutral puffer indeholdende tetramethylammoniumchlorid efter-25 fulgt af neutral puffer indeholdende Tween 80. Det bundne gDCD4T blev elueret fra søjlen med puffer med pH 3 indeholdende Tween 80 (0,1% vægt/volumen) og blev neutraliseret straks efter, det var elueret. Det elue-rede, neutraliserede gDCD4T blev derefter koncentreret 30 ved ultrafiltrering og blev „dialyseret/diaf iltreret for at udskifte pufferen til en opløsning med et fysiologisk salt indeholdende Tween 80 ved ca 0,1% vægt/volumen .

35 Hvis detergentet ikke er til stede, danner gDCD4T aggregater, hvilket fremgår af, at det ved centrifugering 52 DK 175930 B1 ved ca 10,000 x g i 2 minutter er muligt at fjerne gDCD4T fra opløsningen. I nkube ring af gDCD4T ved 4°C i 0,1 M natriumacetat, 0,5 M NaCl og 0,25 M tris ved pH 7 sammen med BSA, Tween 80 eller glycerol som kandidat-5 stabilisatorer viste, at i nærværelse af et stabiliseringsmiddel aggregerede gDCD4T gradvis over 12 dages forløb til det punkt, hvor kun ca 60-70% af proteinet var opløseligt. Men anvendelse af 0,1% vægt/volumen Tween 80 eller 0,5 mg/ml BSA sikrede, at ca 100% hen-10 holdsvis 80% af gDCD4T forblev opløselig over denne tidsperiode. Glycerol var overraskende ineffektiv som et stabiliseringsmiddel og frembragte resultater, der var dårligere end kontrollen - efter 8 dage var ca 80% af gDCD4T aggregeret, når det blev opbevaret i nærvæ-15 relse af glycerol.

Eksempel 4

Der blev konstrueret plasmider til styring af ekspres-20 sionen af proteiner, hvilke plasmider indeholder forskellige længder af det aminoterminale, ekstracellulære domæne af·CD4 fusioneret til det konstante område af human immunoglobulin 1. Disse plasmider kaldes pRK.-CD42ΥΊ / pRKCD4g^y^, pRKCD42^j/ pRKCD4g2/ pRKCD4^y^ og 25 pRKCD4elrl.

Plasmid pRKCD44r^ indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for serinrest 366 i det modne CD4-polypeptid, umiddelbart 30 efterfulgt af den sekvens, der koder for det konstante område af human immunoglobulin Y1, startende ved kodonen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobulin Ti (Kabat et al. ).

35 Plasmid pRKCD4e4rl indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for : j 53 DK 175930 B1 lysinrest 360 i det modne CD4-polypeptid, umiddelbart efterfulgt af den sekvens, som koder for det konstante område af human immunoglobulin Y1, startende ved kodonen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobu-5 lin Y1 (Rabat et al.).

Plasmid pRRCD42yi indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for glutaminrest 180 i det modne CD4-polypeptid, umiddel-10 bart efterfulgt af den sekvens, som koder for det konstante område af human immunoglobulin TI, startende ved kodonen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobulin TI (Rabat et al.).

15 Plasmid pRRCD4e2y^ indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for leucinrest 177 i det modne CD4-polypeptid, umiddelbart efterfulgt af den sekvens, som koder for det konstante område af human immunoglobulin Y1, startende ved kodo-20 nen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobulin Γ1 (Rabat et al.).

Plasmid pRRCD41Tr1 indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for 25 asparginsyrerest 105 i det modne CD4-polypept id, umiddelbart efterfulgt af den sekvens, som koder for det konstante område af human immunoglobulin Yl, startende ved kodonen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobulin Yl (Rabat et al.).

30

Plasmid pRKCD4elrl indeholder den del af CD4-genet fra initieringskodonen til fusionsstedet efter kodonen for leucinrest 100 i det modne CD4-polypeptid, umiddelbart efterfulgt af den sekvens, som koder for det konstante 35 område af human immunoglobulin Yl, startende ved kodonen for serinrest 114 i det modne, humane immunoglobu- 54 DK 175930 B1 lin TI (Kabat et al. ).

Konstruktion af disse plasmider forudsætter den tidligere konstruktion af plasmid pRKCD4TP/Tl. Det blev 5 konstrueret på følgende måde:

En cDNA-klon, som koder for human immunoglobulin 1, blev opnået fra et human, milt-cDNA-bibliotek (Clontech Laboratories, Inc.) under anvendelse af oligonucleoti-10 der baseret på den publicerede sekvens (Ellison et al.,

Nucl. Acids Res., 10:4071-4079 (1982)) og et EcoRI-

Eagl-fragment (EcoRI-stedet blev tilvejebragt ved en linker, se figur 4a,b) indeholdende en del af det variable og alt af det konstante område, blev opnået. Det-15 te fragment blev forsynet med stumpe ender med Klenow-fragment og blev indvundet ved gelelektroforese (fragment al).

Plasmid pRKCD4TP-kk, som koder for en substitutionsva-20 riant af opløselig CD4 (resterne 1-368) indeholdende en lysinrest i stedet for asparagin ved position 1 i det modne polypeptid, blev konstrueret ud fra plasmid pRK-CD4TP ved stedstyret mutagenisering. Der blev fremstillet et syntetisk oligonucleotid som en primer for 25 en mutageniseringsreaktion til frembringelse af den ønskede kodende sekvens. Dette blev syntetiseret som en 51-mer, der indeholdt 2 tavse mutationer i forhold til den naturlige sekvens ud over mutationssubstitutionen og 21 baser på hver side af de muterede kodoner: 30 5'- CCC TTT TTT GCC CAG CAC CAC CTT CTT GCC CGT AGT-GGC TGC TGG GAG GAG -3’

Plasmid pRKCD4TP blev ved transformation overført i E.

35 coli stamme SR101, og de transformerede kolonier blev udpladet på ampicillinmedieplader. Resistente kolonier i i i i 55 DK 175930 B1 blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07 hjæl-perbakteriofager til frembringelse af secernerede, indkapslede, enkeltstrengede templater af pRKCD4TP. Det enkeltstrengede plasmid-DNA blev isoleret og anvendt 5 som template for mutageniseringsreaktioner med de syntetiske oligonucleotider, der er beskrevet ovenfor, som primere. Reaktionsblandingen efter mutagenisering blev overført ved tranformation i E. coli SR101, og den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedie-10 plader. Transformanter blev screenet ved kolonihybri-disering (ref. Grunstein-Hogness) for tilstedeværelse af den passende sekvens under anvendelse af den følgende 16-mer som probe.

15 5'- C CAC CTT CTT GCC CTG -3'

De valgte hybridiseringsbetingelser var tilstrækkeligt, stringente til, at proben kun påviste det korrekt fusionerede produkt. Kolonier identificeret som positive 20 blev selekteret, og plasmid-DNA blev isoleret og anvendt til at transformere E. coli stamme SR101. De transformerede kulturer blev udpladet på ampicillinme-dieplader, og resistente kolonier blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07 bakteriofag. Templater 25 blev fremstillet som ovenfor beskrevet og blev screenet ved sekventering.

Plasmid pRKCD4TP-kk blev fordøjet med Xbal og blev behandlet med Klenow-énzym, og fragment a2, som indehol-30 der det liniariserede plasmid blev . indvundet ved gel-elektroforese og blev ligeret til fragment al. Ligeringsblandingen blev ved transformation overført i E. coli stamme 294, den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader, og resistente kolonier 35 blev selekteret. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne og blev undersøgt ved restriktionsana- 56 DK 175930 B1 lyse for tilstedeværelse af det korrekte fragment i den korrekte orientering (det vil sige det immunoglobulin-kodende område i samme orientering som det CD4-kodende område og ved 3'-enden af det CD4-kodende område). Det-5 te plasmid blev kaldt pRKCD4TP/Yl.

Der blev fremstillet syntetiske oligonucleotider som primere for deletionsmutageniseringsreaktioner til at fusionere de passende kodende sekvenser for IgGl og CD4 10 som ovenfor beskrevet. Disse blev syntetiseret som 48-merer omfattende 24 nucleotider på hver side af det ønskede fusionssted (det vil sige svarende til de COOH-terminale 8 aminosyrerester af den ønskede CD4-enhed og de NH2_terminale 8 aminosyrerester af den ønskede immu-15 noglobulinenhed). Plasmid pRKCD4TP/ri blev ved transformation overført i E. coli stamme SR101, og de transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmediepla-der. Resistente kolonier blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07 hjælperbakteriofager til frembrin-20 gelse af secernerede, indkapslede, enkeltstrengede tem-plater af pRKCD4TP/T 1. Det enkeltstrengede plasmid-DNA blev isoleret og anvendt som template for mutagenise-ringsreaktioner med de ovenfor beskrevne syntetiske oligonucleotider som primere. Blandingen efter mutage-25 niseringsreaktionen blev overført ved tranformation i E. coli SR101, og den transformerede kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader. Transformanter blev screenet ved kolonihybridisering (ref. Grunstein-Hog-ness) for tilstedeværelse af det passende fusionssted 30 under anvendelse af 16-merer som prober. Disse .16-?me-rer omfattede 8 baser på hver side af fusionsstedet, og hybridiseringsbetingelserne blev valgt tilstrækkeligt stringente til, at proberne kun påviste det korrekt fusionerede produkt. Kolonier identificeret som positive 35 blev selekteret, og plasmid-DNA blev isoleret og ved transformation overført i E. coli stamme SR101. De 57 DK 175930 B1 transformerede kulturer blev udpladet på ampicillinme-dieplader, og restistente kolonier blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07-bakteriofager. Templater blev fremstillet som ovenfor beskrevet og blev screenet 5 ved sekventering.

Plasmiderne blev ved transfektion overført i 293-celler under anvendelse af standardprocedurer og blev analyseret for ekspression og produktion som ovenfor beskre- 10 vet.

Udtrykt Secerneret pRKCD4m + pRKCD 4 g 2 y t t 15 pRKCD42rl + + pRKCD4e4n + + pRKCD44il + +

Der blev også konstrueret plasmider til at styre eks-20 pressionen af fusionsproteiner indeholdende forskellige længder af det aminoterminale, ekstracellulære domæne af CD4 fusioneret til den trunkerede del af det konstante område af human immunoglobulin Ύ1 omfattende kun hængselororådet og de konstante domæner CH2 og CH3.

25

Der blev fremstillet syntetiske oligonucleotider som primere for mutageniseringsreaktioner for at fjerne im-munoglobulinsekvensen fra Serll4 til og med Cys215 (Rabat et al.). Disse blev syntetiseret som 48-merer om-30 fattende 24 nucleotider på hver side af det ønskede fusionssted (det vil sige svarende til de COOH-termina le 8 aminosyrer af den ønskede CD4-enhed og de NH2-terminale 8 aminosyrerester af den ønskede iiranunoglobulinen-hed). Plasmiderne pRKCD44r^, pRKCD42rl og pRKCD41y1 35 blev hver for sig ved transformation overført i E. coli stamme SR101, og den transformerede kultur blev udpla- 58 DK 175930 B1 det på ampicillinmedieplader. Resistente kolonier blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07-hjælpebak-teriofager til opnåelse af secernerede, indkapslede, enkeltstrengede templater af disse plasmider. Det en-5 keltstrengede plasmid-DNA blev isoleret og anvendt som template for mutageniseringsreaktioner med de ovenfor beskrevne syntetiske oligonucleotider som primere. Mu-tageniseringsreaktionsblandingerne blev ved transformation overført i E. coli SR101, og den transformerede 10 kultur blev udpladet på ampicillinmedieplader. Trans-formanter blev screenet ved kolonihybridisering (ref. Grunstein-Hogness) for tilstedeværelse af det passende fusionssted under anvendelse af 16-merer som prober.

Disse 16-merer omfattede 8 baser på hver side af fusi-15 onsstedet, og de valgte hybridiseringsbetingelser var tilstrækkeligt stringente til, at proberne kun påviste det korrekt fusionerede produkt. Kolonier identificeret som positive blev selekteret, og plasmid-DNA blev isoleret og ved transformation overført i E. coli stam- j 20 me SR101. De transformerede kulturer blev udpladet på ampicillinmedieplader, og de restistente kolonier blev selekteret og dyrket i nærværelse af ml3K07-bakteriofa-ger. Templater blev fresmtillet som ovenfor beskrevet og blev screenet ved sekventering.

25

Plasmidet afledt fra plasmid pRKCD44T^ er kaldt pRKCD-^4Fcl/ Plasmidet afledt fra plasmid pRKCD42yi er kaldt pRKCD42FCj, og plasmidet afledt fra plasmid pRKCD4^y-^ er kaldt pRKCD4^Fc^. i 30 pRKCD42pci, pRKCD4]_Fc^ og pRKCD44Fc^ blev dyrket på samme måde som ovenfor beskrevet, og CHl-deleterede CD4-immunoadhesoner blev indvundet som beskrevet andet steds.

35 i i -------- — ---- DK 175930 B1 59

Fusioner med let kæde

Der blev konstrueret plasmider til at styre ekspressionen af proteiner indeholdende forskellige længder af 5 det aminoterminale, ekstracellulære domæne af CD4 fusioneret til det konstante område af human immunoglobulin J(. Disse plasmider blev kaldt pRKCD44jc og pRKCD4e^yc..

Plasmid pRKCD44* indeholder den del af CD4-genet, som * 10 går fra initieringskodonen til fustionsstedet efter ko donen for serinrest 366 i det modne CD4-polypeptid, u-middelbart efterfulgt af sekvensen for det konstante område af human immunoglobulin K startende ved kodonen for threoninrest 109 i det modne, humane immunoglobulin 15 H (Rabat et al.).

Plasmid pRKCD4e4>< indeholder den del af CD4-genet, som går fra initieringskodonen til fustionsstedet efter ko- donen for lysinrest 360 i det modne CD4-polypeptid, u- 20 middelbart efterfulgt af sekvensen for det konstante område af human immunoglobulin H startende ved kodonen for threoninrest 109 i det modne, humane immunoglobulin K(Rabat et al.).

25 Disse plasmider blev konstrueret på en lignende måde som plasmiderne pRKCD44y^ og pRKCD4e4y^ beskrevet ovenfor med følgende undtagelse:

Den sekvens, der koder for human immunoglobulin-fc (fi-30 gur 5), blev opnået fra et human, milt-cDNA-bibliotek (Clontech Laboratories, Inc.) under anvendelse af oli-gonucleotider baseret på den publicerede sekvens (Hieter, P.A. et al., Cell, 22:197-207 (1980)), og der blev opnået et EcoRI-BspMl-fragment indeholdende en del af 35 det variable område og hele det konstante område (se figur 5). Dette fragment blev forsynet med stumpe en- 60 DK 175930 B1 der med Klenow-fragment og de 4 dNTP'er. Dette fragment blev anvendt i stedet for fragment al og blev anvendt til at konstruere plasmid pRKCD4TP/h*.

5 Ekspression i CHO-celler

Plasmider blev konstrueret eller konstrueres til at styre ekspressionen af de ovenfor beskrevne immunoadhe-soner i CHO-celler. Disse plasmider kaldes: 10 pSVeCD44TlSVDHFR, pSVeCD42rlSVDHFR, pSVeCD41TlSVDHFR, pSVeCD4e4nSVDHFR, pSVeCD4e2TlSVDHFR, pSVeCD4elTXSVDH-FR, pSVeCD44FclSVDHFR, pSVeCD42FclSVDHFR, pSVeCD41Fcl-SVDHFR, pSVeCD44AlSVDHFR og pSVeCD42^SVDHFR.

15 Fragment 31 blev fremstillet som ovenfor beskrevet.

Fragment 32a blev fremstillet ved at fordøje plasmid PE348HBV.E400D22 med BamHI, frembringe stumpe ender med Klenow-fragment og de 4 dNTP'er, derefter fordøje med Pvul og isolere det store fragment, som indeholdt re-20 sten af β-lactamasegenet og den tidlige SV40-promotor samt DHFR-genet. Plasmiderne pRKCD44r^, pRKCD42yi# pRKCD41T1, pRKCD4e4rl, pRKCD4e2ri, pRKCD4elYl, pRK-CD44Fci, pRK.CD42Fcl· pRKCD42j>Qj_» pRKCD44y^ og pRKCD42^ blev separat fordøjet med Hindlll, blev forsynet med 25 stumpe ender med Klenow-fragment og de 4 dNTP'er, blev derefter fordøjet med EcoRI, og de fragmenter, som koder for CD4-Ig-fusionsproteinet, blev isoleret. De fremkomne DNA-fragmenter blev ligeret sammen med fragmenterne 31 og 32a og blev ved transformation overført 30 i E. coli stamme 294. Kolonier blev selekteret og undersøgt for tilstedeværelse af det korrekte plasmid som j ovenfor nævnt, blev derefter ved transfektion overført i CHO-celler og blev amplificeret ved methotrexatselektion under anvendelse af traditionelle procedurer.

35 ......................... 1 DK 175930 B1 61

Eksempel 5

Dyrkning, oprensning og formulering af CD4-varianter

Plasmider, som koder for opløselige CD4-adhesoner, så-5 som CD4T, CD4TP eller opløselig CD4-immunoadhesoner, blev ved calciumphosphattransfektion overført i CH0-DP7 (en proinsulintransformeret, autocrin værtscelle afledt fra CHO; U.S. patentansøgning nr. 97.472), og trans-formanterne blev dyrket i selektivt medium (1:1 HAM F12 10 /DMEM GHT- indeholdende 1-10% diafiltreret eller dialyseret bovinserum). Andre egnede værtsceller er CHO-celler eller humane 293S-embryonnyreceller. Transformanterne blev amplificeret ved methotrexatselektion i det samme medium, men indeholdende 500 nM methotrexat.

15 En subklon, som er i stand til at secernere CD4TP, CD4tp 500 b, blev selekteret. CD4tp 500 b blev dyrket i DMEM/HAM F12-medium ved ca 37°C, indtil CD4TP akkumulerede i kulturen, hvorefter mediet blev adskilt fra cellerne, og uopløseligt materiale blev fjernet ved 20 centrifugering.

Kulturvæske fra CD4TP-transformanter blev koncentreret og diafiltreret for at sænke ionstyrken. Koncentratet blev ført igennem et stort volumen Q-Sepharose anion-25 bytningsresin (tidligere ækvilibreret med 25 mM NaCl, pH 8,5) for at adsorbere kontaminerende materiale fra kulturvæsken. Det isoelektriske punkt for CD4TP er ca 9,5, hvorved det er muligt at skelne mellem trunkerede former af CD4 og de fleste kontaminerende materialer 30 ved alternerende adsorption henholdsvis på en kation- bytteresin, såsom carboxymethyl eller sulfonyl Sepharo-se, og en anionbytteresin, såsom kvartenær ammonium Se-pharose. Eftersom meget elektropositive domæner er til stede i det ekstracellulære segment af CD4, kan enhver 35 CD4-holdig variant endvidere oprenses på samme måde som CD4TP. Den ikke-adsorberede kulturvæske fra anionbyt- t ~ DK 175930 B1 62

teresintrinnet blev derefter ført gennem en kationbyt-teresin (tidligere ækvilibreret med 25 mM NaCl ved pH

8,5), hvorved CD4TP blev adsorberet til resinen. CD4TP blev elueret med en NaCl-gradient ved pH 8,5, hvor den-5 ne CD4-variant eluerede ved ca 0,2 M NaCl. Ammoniumsulfat blev tilsat til eluatet til en koncentration på 1,7 M, og opløsningen blev ført gennem en søjle af kro-matografiresin til hydrofob vekselvirkning (phenyl- eller butyl-Sepharose). CD4TP blev elueret fra søjlen 10 til hydrofob vekselvirkning med en gradient af ammoniumsulfat, hvor CD4TP kom frem ved ca 0,7 M ammoniumsulfat. Eluatet blev koncentreret og pufferen blev skiftet på en G-25-søjle under anvendelse af phosphatpufret sa-lin indeholdende 0,02% (vægt/volumen) Tween 20 eller 15 Tween 80. CD4TP var opløselig og stabil i denne opløsning, der blev sterilt filtreret og fyldt i hætteglas som en vandig formulation. Der kan anvendes andre polymere, ikke-ioniske overfladeaktive midler sammen med CD4-formulationerne, herunder Pluronic blokcopolymerer 20 eller polyethylenglycol.

Det er også muligt at anvende immunoaffinitetsoprens-ning af opløseligt CD4, hvorved CD4 adsorberes på et immobiliseret antistof mod CD4. Denne metode har den 25 ulempe, at eluering af det opløselige CD4 under sure betingelser fører til proteinaggregering, som kun kan forbedres meget ved forholdsvis høje niveauer af overfladeaktivt middel. Den tidligere nævnte procedure tillader anvendelse af meget lavere mængder af overfla-30 deaktivt middel, fra ca 0,01 til 0,1% (vægt/volumen) o-verfladeaktivt middel.

Den procedure, som fulgte efter oprensningen af CD4-fvisioner med den tunge immunoglobulinkæde, var at koncen-35 trere rekombinerede supernatanter ved ultracentrifugering og derefter adsorbere fusionen på resin-immobili- ---— ---1 DK 175930 B1 63 seret Staphylococcus protein A. Fusionen blev elueret I med 0,1 M citratpuffer pH 3 uden salt eller detergent.

I Denne præparation blev puf ret i Tris-puffer ved pH 7,5.

Immunoglobulinfusionerne med CD4 V1-V4 oprenses eventu-5 elt yderligere ved den procedure, som er beskrevet o-venfor for ikke-fusionerede CD4-varianter. CD4-immuno-globulin-fusioner med CD4 VI-V2 kan også oprenses ved proceduren ovenfor med undtagelse af, at det ikke er forventet, at det isoelektriske punkt af denne klasse 10 af molekyler vil være så alkalisk som det isoelektriske punkt for de former, som indeholder alle 4 V-områder af CD4.

Eksempel 6 15

Adskillige adhesonvarianters egenskaber blev bestemt.

Som vist i tabel 4 udviser immunoadhesonerne CD4^r^ og CD42ri forbedret plasmahalveringstid i kaniner sammen med højaffinitet-gpl20-binding og en affinitet for Fcy-20 receptoren (bestemt med U93 7-celler), som er sammenlignelig med værdien for bulk human IgGl.

25 30 35

V

DK 175930 B1 64

Tabel 4

Plasmahalveringstid11 i gp!20 KP (nM)^ FcrR KP (nM)+ kaniner (timer) CD4TS 2,3 + 0,4 ikke påvist 0,25 CD44ri 1,2 + 0,1 2,83 ± 0,25 6,4 CD42rl 1,4 ± 0,1 3,01 + 0,68 40,6 itic it

Human IgGl ND 3,52+0,5 21 dage * bestemt i mennesker.

+ KD blev bestemt ved metoden ifølge Anderson et al., J. Immunol., 125:2735-2741 {1980).

# bestemt ved metoden ifølge Smith et al., Science, 238: 1704-07 (1987).

§ kun resterne 1-368.

a adhesonvarianten blev injiceret intravenøst i kaniner, og blodprøver blev opsamlet periodisk og analyseret for tilstedeværelsen af adhesonvarianten.

** ikke udført.

Claims (28)

65 DK 175930 B1

1. Nucleinsyre, som koder for et fusionsprotein, hvori et immunoglobulinlignende domæne af et ikke-højpolymorft medlem af immunoglobulingen-superfamilien er fusioneret med et polypeptid omfattende en immunoglobulin-konstant område-sekvens. 10

2. Nucleinsyre ifølge krav 1, hvori immunoglobulingen-superfamilie-medlemmet er et andet end et CD4-polypeptid.

3. Nucleinsyre ifølge krav 2, hvori immunoglobulingen-su- 15 perfamilie-medlemmet er valgt blandt høj-affinitets-IgE- receptoren, I-CAM og N-CAM.

4. Nucleinsyre ifølge krav 1, hvori immunoglobulingen-su-perfamilie-medlemmet er et CD4-polypept'id. 20

5. Nucleinsyre ifølge krav 4, som koder for et fusions-protein, hvori et humant CD4-antigen-V-område er fusioneret ved dets C-terminus til N-terminus af et polypeptid omfattende et konstant område af en immunoglobulin-tung 25 kæde.

6. Nucleinsyre ifølge krav 5, hvori det humane CD4-anti-gen-V-område består hovedsageligt af VI-V4 eller VI-V2 områderne. 30

7. Nucleinsyre ifølge ethvert af kravene 1-4, hvori fusionsproteinet omfatter immunoglobulin-CHl-, -hængsel-, -CH2- og -CH3-områder.

8. Nucleinsyre ifølge ethvert af kravene 1-4, hvori fu sionsproteinet omfatter immunoglobulin-hængsel-, -CH2- og -CH3-områder. 66 DK 175930 B1

9. Nucleinsyre ifølge krav 7 eller 8, hvori immunoglobu-linsekvenserne er fra IgG-1, IgG-2, IgG-3, lgG-4-subty-per, IgA, igE, IgD eller IgM.

10. Nucleinsyre ifølge krav 9, hvori immunoglobulinse- kvenserne er fra IgG-1 eller IgG-3.

11. Nucleinsyre ifølge krav 5, som koder for et hetero-funktionelt immunoadhæson omfattende et fusionsprotein, 10 hvori et polypeptid omfattende et humant CD4-antigen-V-område er fusioneret ved dets C-terminus til N-terminus af et polypeptid omfattende et konstant område af en im-munoglobulinkæde kovalent forbundet med et ledsage-immu-noglobulin-tung kæde-let kæde-par bærende et VLVH-anti-15 stof-kombinerende sted, som er i stand til at binde til et forud fastsat antigen.

12. Nucleinsyre ifølge krav 11, hvori fusionsproteinet omfatter V-J domænet af det humane CD4-antigen. 20

13. Nucleinsyre ifølge krav 11, hvori det humane CD4-an-tigen omfatter sekvensen Asn-Lys-Val-Val-Leu-Gly-Lys-Lys.

14. Nucleinsyre ifølge krav 11, hvori V-området omfatter 25 aminosyresekvensen, der strækker sig omkring resterne 24- 117 af forstadiet til humant CD4, hvori den indledende Met-rest er nr. 1.

15. Nucleinsyre ifølge krav 11, som koder for et hetero-30 funktionelt immunoadhæson valgt blandt ACH~ ( VLCL~VHCH ), (acl-ach)-(vlcl-vhch). (ΑοΙ_-νΗεΗ)-(νΛ-νΗοΗ) og (vL-cL- ACh)-(VjCk-VjjCy), hvori A er et humant CD4-antigen-V-om- råde, VL og VH er de variable domæner af henholdsvis en immunoglobulin-let og -tung kæde, og C_ og C„ er de kon- L· H 35 stante domæner af henholdsvis en immunoglobulin-let og -tung kæde.

67 DK 175930 B1

16. Nucleinsyre ifølge krav 15, hvori det VTV„-antistof- Li H kombinerende sted er fra et anti-ricin-antistof.

17. Nucleinsyre ifølge krav 15, hvori immunoglobulinse-5 kvenserne er fra IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4-subtyper, IgA, IgE, IgD eller IgM.

18. Nucleinsyre ifølge krav 17, hvori immunoglobulinse-kvenserne er fra IgG-1 eller IgG-3. LO

19. Nucleinsyre ifølge krav 17, hvori immunoglobulinse-kvenserne er fra IgA eller IgM.

20. Rekombinant værtscelle omfattende nucleinsyren ifølge L5 ethvert af kravene 1-19.

21. Celle ifølge krav 20, som er en pattedyrcelle.

22. Celle ifølge krav 20, hvori værtscellen udtrykker 20 DNA, som koder for et immunoglobulin med variabelt område rettet mod et forud fastsat antigen.

23. Polypeptid indkodet af en nucleinsyre ifølge krav 1 eller 2. 25

24. Polypeptid indkodet af en nucleinsyre ifølge ethvert af kravene 3-19.

25. Polypeptid ifølge krav 24 omfattende en immunoglobu- 30 lin-let kæde.

26. Polypeptid ifølge krav 25, som er i form af en dimer.

27. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, 35 hvilken fremgangsmåde omfatter udvinding af polypeptidet fra kulturén af en værtscelle transficeret med nucleinsyre ifølge ethvert af kravene 1-19. 68 DK 175930 B1

28. Replicerbar udtrykkelsesvektor omfattende nucleinsyre ifølge ethvert af kravene 1-19. 5 10 15 20 25 •30 35 !