JP2888529B2 - アドヘゾン変異体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本出願は、抗ウイルスまたは免疫モジュレーター治療
のための組成物に関する。特に、ヒト免疫欠損ウイルス
（HIV）感染の治療に有用な組成物に関する。
のための組成物に関する。特に、ヒト免疫欠損ウイルス
（HIV）感染の治療に有用な組成物に関する。
HIV感染に起因する第一の免疫学的な異常は、CD4細胞
表面糖タンパク質を発現するＴリンパ球の進行性の減少
および機能的な障害である［H.Lane et al.,Ann.Rev.Im
munol. ３:477（1985）］。CD4は、免疫グロブリン遺
伝子スーパーファミリーに相同性を有する非−多形性の
糖タンパク質である［P.Maddon et al.,Cell 42:93（1
985）］。CD8表面抗原と共に、CD4は成熟末梢Ｔ細胞の
２種類の別サブセットを定義するが［E.Reinherz et a
l.,Cell 19:821（1980）］、これらは、それぞれクラ
スＩおよびクラスII主組織適合性コンプレックス（MH
C）抗原に関連して名目上の抗原標的と相互作用するそ
れらの能力によって区別される［S.Swain,Proc.Natl.Ac
ad.Sci. 78:7101（1981）;E.Engleman et al.,J.Immun
ol. 127:2124（1981）;H.Spitz et al.,J.Immunol. 1
29:1563（1982）;W.Biddison et al.,J.Exp,Med. 156:
1065（1982）；およびD.Wilde et al.,J.Immunol. 13
1:2178（1983）］。CD4 T細胞の大部分は、ヘルパー／
インデューサーＴ細胞の表現型を示すが（E.Reinherz;
上記）、細胞毒性／サプレッサーＴ細胞として特徴づけ
られるCD4 T細胞も同定されている［Y.Thomas et al.,
J.Exp.Med. 154:459（1981）;S.Meuer et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 79:4395（1982）；およびA.Krensky
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2365（1982）］。
CD4ヘルパー／インデューサーＴ細胞の機能の損失は、
おそらく、後天性免疫不全症候群（AIDS）に特有の日和
見感染および悪性腫瘍に導く細胞性および体液性免疫の
重篤な欠陥の原因となる（H.Lane;上記）。
表面糖タンパク質を発現するＴリンパ球の進行性の減少
および機能的な障害である［H.Lane et al.,Ann.Rev.Im
munol. ３:477（1985）］。CD4は、免疫グロブリン遺
伝子スーパーファミリーに相同性を有する非−多形性の
糖タンパク質である［P.Maddon et al.,Cell 42:93（1
985）］。CD8表面抗原と共に、CD4は成熟末梢Ｔ細胞の
２種類の別サブセットを定義するが［E.Reinherz et a
l.,Cell 19:821（1980）］、これらは、それぞれクラ
スＩおよびクラスII主組織適合性コンプレックス（MH
C）抗原に関連して名目上の抗原標的と相互作用するそ
れらの能力によって区別される［S.Swain,Proc.Natl.Ac
ad.Sci. 78:7101（1981）;E.Engleman et al.,J.Immun
ol. 127:2124（1981）;H.Spitz et al.,J.Immunol. 1
29:1563（1982）;W.Biddison et al.,J.Exp,Med. 156:
1065（1982）；およびD.Wilde et al.,J.Immunol. 13
1:2178（1983）］。CD4 T細胞の大部分は、ヘルパー／
インデューサーＴ細胞の表現型を示すが（E.Reinherz;
上記）、細胞毒性／サプレッサーＴ細胞として特徴づけ
られるCD4 T細胞も同定されている［Y.Thomas et al.,
J.Exp.Med. 154:459（1981）;S.Meuer et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 79:4395（1982）；およびA.Krensky
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:2365（1982）］。
CD4ヘルパー／インデューサーＴ細胞の機能の損失は、
おそらく、後天性免疫不全症候群（AIDS）に特有の日和
見感染および悪性腫瘍に導く細胞性および体液性免疫の
重篤な欠陥の原因となる（H.Lane;上記）。
正常なドナーおよびAIDS患者からの分画されたCD4お
よびCD8 T細胞のHIV-I感染の研究は、CD4 T細胞の減少
が、このＴリンパ球サブセットに選択的に感染し、その
中で複製し、そして最終的にこれを破壊するHIV-Iの能
力に起因していることを明らかにした［D.Klatzmann et
al.,Science 225:59（1984）］。CD4自体がHIV-Iのた
めの細胞受容体の本質的成分であるという可能性は、CD
4に指向性のモノクローナル抗体がHIV-I感染およびシン
シチウム誘導をブロックするという観察によって最初に
示された［A.Dalgleish et al.,Nature(London) 312:7
67（1984）;J.McDougal et al.,J.Immunol. 135:3151
（1985）］。この仮説は、分子コンプレックスがCD4お
よびgp120（HIV-Iの主エンベロープ糖タンパク質）の間
で生じるということの証明［J.McDougal et al.,Scienc
e 231:382（1986）］、およびHIV-IトロピズムがCD4 c
DNAの安定な発現に続いて通常は非許容性のヒト細胞に
付与され得るという発見［P.Maddon et al.,Cell 47:3
33（1986）］によって確認された。さらに、HIV-I感染
の個体における中枢神経系機能障害の高い発生率によっ
て示されるHIV-Iの神経親和性の性質［W.Snider et a
l.,Ann.Neurol. 14:403（1983）］、およびAIDS患者の
脳組織および脳脊髄液においてHIV-Iを検出する能力
［G.Shaw et al.,Science 227:177（1985）;L.Epstei
n,AIDS Res. １:447（1985）;S.Koenig,Science 233:
1089（1986）;D.Ho et al.,N.Engl.J.Med. 313:1498
（1985）;J.Levy et al.,Lancet II:586（1985）］
は、ニューロンの、グリアの、そして単球／マクロファ
ージ起源の細胞におけるCD4の発現を説明するものであ
るようである［P.Maddon,Cell 47:444（1986）;I.Funk
e et al.,J.Exp.Med. 165:1230（1986）;B.Tourvieill
e et al.,Science 234:610（1986）］。
よびCD8 T細胞のHIV-I感染の研究は、CD4 T細胞の減少
が、このＴリンパ球サブセットに選択的に感染し、その
中で複製し、そして最終的にこれを破壊するHIV-Iの能
力に起因していることを明らかにした［D.Klatzmann et
al.,Science 225:59（1984）］。CD4自体がHIV-Iのた
めの細胞受容体の本質的成分であるという可能性は、CD
4に指向性のモノクローナル抗体がHIV-I感染およびシン
シチウム誘導をブロックするという観察によって最初に
示された［A.Dalgleish et al.,Nature(London) 312:7
67（1984）;J.McDougal et al.,J.Immunol. 135:3151
（1985）］。この仮説は、分子コンプレックスがCD4お
よびgp120（HIV-Iの主エンベロープ糖タンパク質）の間
で生じるということの証明［J.McDougal et al.,Scienc
e 231:382（1986）］、およびHIV-IトロピズムがCD4 c
DNAの安定な発現に続いて通常は非許容性のヒト細胞に
付与され得るという発見［P.Maddon et al.,Cell 47:3
33（1986）］によって確認された。さらに、HIV-I感染
の個体における中枢神経系機能障害の高い発生率によっ
て示されるHIV-Iの神経親和性の性質［W.Snider et a
l.,Ann.Neurol. 14:403（1983）］、およびAIDS患者の
脳組織および脳脊髄液においてHIV-Iを検出する能力
［G.Shaw et al.,Science 227:177（1985）;L.Epstei
n,AIDS Res. １:447（1985）;S.Koenig,Science 233:
1089（1986）;D.Ho et al.,N.Engl.J.Med. 313:1498
（1985）;J.Levy et al.,Lancet II:586（1985）］
は、ニューロンの、グリアの、そして単球／マクロファ
ージ起源の細胞におけるCD4の発現を説明するものであ
るようである［P.Maddon,Cell 47:444（1986）;I.Funk
e et al.,J.Exp.Med. 165:1230（1986）;B.Tourvieill
e et al.,Science 234:610（1986）］。
HIV-I感染に対する感受性を決定することに加えて、
感染宿主細胞における細胞変性効果の出現にCD4が関与
しているようである。CD4に対する抗体は、インビトロ
でHIV-I感染細胞と未感染CD4 T細胞の融合を抑制するこ
とがわかった；さらに、この現象によって生成した巨大
な多核化細胞は生成後の短時間で死に至り、CD4細胞数
が減少する結果になる［J.Lifson et al.,Science 23
2:1123（1986）］。また、シンシチウムの形成はgp120
発現を必要とし、そして他のウイルス性の構造または調
節タンパク質の非存在下でCD4−ポジティブなセルライ
ンをHIV-I env遺伝子を発現するセルラインと同時培養
することによって誘導することができる［J.Sodroski e
t al.,Nature 322:470（1986）;J.Lifson et al.,Natu
re 323:725（1986）］。このように、HIV-Iによる最初
の感染ならびに最終的な細胞死の両方を媒介する際に
は、gp120とCD4の間の相互作用が、治療学的介入を加え
易いウイルスのライフサイクルにおけるいくつかの重要
な入口の１つを構成する［H.Mitsuya et al.,Nature 3
25:773（1987）］。
感染宿主細胞における細胞変性効果の出現にCD4が関与
しているようである。CD4に対する抗体は、インビトロ
でHIV-I感染細胞と未感染CD4 T細胞の融合を抑制するこ
とがわかった；さらに、この現象によって生成した巨大
な多核化細胞は生成後の短時間で死に至り、CD4細胞数
が減少する結果になる［J.Lifson et al.,Science 23
2:1123（1986）］。また、シンシチウムの形成はgp120
発現を必要とし、そして他のウイルス性の構造または調
節タンパク質の非存在下でCD4−ポジティブなセルライ
ンをHIV-I env遺伝子を発現するセルラインと同時培養
することによって誘導することができる［J.Sodroski e
t al.,Nature 322:470（1986）;J.Lifson et al.,Natu
re 323:725（1986）］。このように、HIV-Iによる最初
の感染ならびに最終的な細胞死の両方を媒介する際に
は、gp120とCD4の間の相互作用が、治療学的介入を加え
易いウイルスのライフサイクルにおけるいくつかの重要
な入口の１つを構成する［H.Mitsuya et al.,Nature 3
25:773（1987）］。
CD4前駆体の既知の配列は、疎水性のシグナルペプチ
ド、約370アミノ酸の細胞外領域、クラスII MHCベータ
鎖の膜−スパニングドメインにかなりの一致を有する疎
水性の高い部分、および高く荷電した40残基の細胞内配
列を予測させる［P.Madden,Cell 42:93（1985）］。CD
4の細胞外ドメインは４つの隣接領域からなり、そのそ
れぞれは、免疫グロブリン軽鎖の可変および結合（Ｖ−
Ｊ）ドメインならびに免疫グロブリン遺伝子スーパーフ
ァミリーの他のメンバーの関連領域にアミノ酸および構
造上の類似を有する（本明細書ではそのサブクラスを新
規な用語「アドヘゾン」と定義する）。CD4のこれら構
造的に類似する領域は、V1、V2、V3およびV4ドメインと
呼ぶ（第３図において１−４を付した）。
ド、約370アミノ酸の細胞外領域、クラスII MHCベータ
鎖の膜−スパニングドメインにかなりの一致を有する疎
水性の高い部分、および高く荷電した40残基の細胞内配
列を予測させる［P.Madden,Cell 42:93（1985）］。CD
4の細胞外ドメインは４つの隣接領域からなり、そのそ
れぞれは、免疫グロブリン軽鎖の可変および結合（Ｖ−
Ｊ）ドメインならびに免疫グロブリン遺伝子スーパーフ
ァミリーの他のメンバーの関連領域にアミノ酸および構
造上の類似を有する（本明細書ではそのサブクラスを新
規な用語「アドヘゾン」と定義する）。CD4のこれら構
造的に類似する領域は、V1、V2、V3およびV4ドメインと
呼ぶ（第３図において１−４を付した）。
多数の受容体媒介の異常の治療のための薬物の開発に
おける成功した方法は、天然のリガンドの結合をブロッ
クするアンタゴニストの同定であった。通常、CD4アド
ヘゾンはHIVエンベロープの認識部位に結合するので、
これらのHIV部位を治療学的に隔離し、それによってウ
イルスの感染力をブロックするための候補になると考え
られる。しかし、完全長のCD4および他のアドヘゾンは
細胞の脂質２重層にアンカーされる細胞膜タンパク質で
ある。膜成分の存在は、製造および精製の観点から望ま
しくないであろう。さらに、通常アドヘゾンは細胞表面
上にのみ存在するので、循環系において一層安定な形態
のアドヘゾンを製造するのが望ましいであろう。また、
切除が為された可溶性のCD4アドヘゾン（一般に、CD4T
と呼ぶ）であっても治療薬として最高に有効ではないこ
ともあるが、これは、それが比較的短い生物学的半減期
を有し、細胞表面CD4と同程度にHIVに結合し、そして胎
盤または他の生物学的障壁を通過しないこともあるため
であり、また、それが感染細胞死滅またはウイルス死滅
機能をそれ自体は持たずにHIV認識部位を単に隔離する
ためである。
おける成功した方法は、天然のリガンドの結合をブロッ
クするアンタゴニストの同定であった。通常、CD4アド
ヘゾンはHIVエンベロープの認識部位に結合するので、
これらのHIV部位を治療学的に隔離し、それによってウ
イルスの感染力をブロックするための候補になると考え
られる。しかし、完全長のCD4および他のアドヘゾンは
細胞の脂質２重層にアンカーされる細胞膜タンパク質で
ある。膜成分の存在は、製造および精製の観点から望ま
しくないであろう。さらに、通常アドヘゾンは細胞表面
上にのみ存在するので、循環系において一層安定な形態
のアドヘゾンを製造するのが望ましいであろう。また、
切除が為された可溶性のCD4アドヘゾン（一般に、CD4T
と呼ぶ）であっても治療薬として最高に有効ではないこ
ともあるが、これは、それが比較的短い生物学的半減期
を有し、細胞表面CD4と同程度にHIVに結合し、そして胎
盤または他の生物学的障壁を通過しないこともあるため
であり、また、それが感染細胞死滅またはウイルス死滅
機能をそれ自体は持たずにHIV認識部位を単に隔離する
ためである。
従って、本発明の目的は可溶性の分泌型のアドヘゾン
を製造することである。他の目的は、様々なHIV-I単離
体およびそれらのそれぞれのenvポリペプチドの間で観
察される極めて大きい遺伝的変化［J.Coffin,Cell 46:
1（1986）］に本質的に影響されることなく、AIDSおよ
び関連の異常を治療する際に有用なCD4誘導体を製造す
ることである。さらに別の目的は、治療学的使用のため
に上に示したような新規な機能を有する分子を得るため
に、またはアドヘゾンもしくはそれらのリガンドのイン
ビトロでの検定のための診断試薬を得るために、他のポ
リペプチドに融合させたアドヘゾンを製造することであ
る。特に、毒素またはエフェクター分子（例えば、免疫
グロブリンのFcドメイン）をアドヘゾンの受容体（例え
ば、CD4の場合はHIV gp120）を有する細胞に指向させる
ための分子、およびアドヘゾンの精製を容易にする際に
使用するための分子を製造することが本発明の目的であ
る。さらに、本発明の目的は安定な精製度の高いアドヘ
ゾン調製物を提供することである。
を製造することである。他の目的は、様々なHIV-I単離
体およびそれらのそれぞれのenvポリペプチドの間で観
察される極めて大きい遺伝的変化［J.Coffin,Cell 46:
1（1986）］に本質的に影響されることなく、AIDSおよ
び関連の異常を治療する際に有用なCD4誘導体を製造す
ることである。さらに別の目的は、治療学的使用のため
に上に示したような新規な機能を有する分子を得るため
に、またはアドヘゾンもしくはそれらのリガンドのイン
ビトロでの検定のための診断試薬を得るために、他のポ
リペプチドに融合させたアドヘゾンを製造することであ
る。特に、毒素またはエフェクター分子（例えば、免疫
グロブリンのFcドメイン）をアドヘゾンの受容体（例え
ば、CD4の場合はHIV gp120）を有する細胞に指向させる
ための分子、およびアドヘゾンの精製を容易にする際に
使用するための分子を製造することが本発明の目的であ
る。さらに、本発明の目的は安定な精製度の高いアドヘ
ゾン調製物を提供することである。
要約 本発明の目的は、アドヘゾンのアミノ酸配列変異体、
特にトランスメンブランドメインが修飾され、従っても
はや細胞膜に存在することができない変異体をコードし
ている核酸を提供することによって達成される。CD4の
場合、そのような変異体は可溶性CD4と呼ばれる。
特にトランスメンブランドメインが修飾され、従っても
はや細胞膜に存在することができない変異体をコードし
ている核酸を提供することによって達成される。CD4の
場合、そのような変異体は可溶性CD4と呼ばれる。
変異アドヘゾンは、 （ａ）宿主細胞をアドヘゾンのアミノ酸配列変異体をコ
ードしている核酸で形質転換し、 （ｂ）この宿主細胞を培養し、そして （ｃ）宿主細胞培養培地から、または宿主細胞の溶菌液
から変異アドヘゾンを回収する、 ことからなる方法によって製造される。
ードしている核酸で形質転換し、 （ｂ）この宿主細胞を培養し、そして （ｃ）宿主細胞培養培地から、または宿主細胞の溶菌液
から変異アドヘゾンを回収する、 ことからなる方法によって製造される。
特定の態様においては、本発明の目的は、 （ａ）不活性化されたトランスメンブランドメインを有
するアドヘゾンのアミノ酸配列変異体、および （ｂ）アドヘゾンの細胞外ドメインをアドヘゾンとは異
なるポリペプチドの配列に融合させてなるポリペプチ
ド、この後者は、例えば免疫グロブリン不変ドメインの
ような長い血漿半減期を有するタンパク質、免疫原、ま
たは細胞毒から選択される、 からなる群から選択されるアドヘゾン変異体を提供す
ることによって達成される。
するアドヘゾンのアミノ酸配列変異体、および （ｂ）アドヘゾンの細胞外ドメインをアドヘゾンとは異
なるポリペプチドの配列に融合させてなるポリペプチ
ド、この後者は、例えば免疫グロブリン不変ドメインの
ような長い血漿半減期を有するタンパク質、免疫原、ま
たは細胞毒から選択される、 からなる群から選択されるアドヘゾン変異体を提供す
ることによって達成される。
好ましい態様においては、CD4アドヘゾンのgp120結合
ドメインを含むポリペプチドが、免疫グロブリン不変ド
メインにそのＣ−末端で融合されるか、またはリシンの
ような細胞毒性ポリペプチドに連結される。
ドメインを含むポリペプチドが、免疫グロブリン不変ド
メインにそのＣ−末端で融合されるか、またはリシンの
ような細胞毒性ポリペプチドに連結される。
本発明で提供されるCD4アドヘゾン変異体は、精製さ
れ、そして抗ウイルス、神経モジュレーター、または免
疫モジュレーター治療を必要としている患者、特にHIV
感染した患者に投与するため、および細胞付着の調節に
おいて使用するために、薬理学的に許容しうる担体中に
配合される。
れ、そして抗ウイルス、神経モジュレーター、または免
疫モジュレーター治療を必要としている患者、特にHIV
感染した患者に投与するため、および細胞付着の調節に
おいて使用するために、薬理学的に許容しうる担体中に
配合される。
図面の簡単な説明 第1a-1c図は、分泌型のCD4アドヘゾンのアミノ酸およ
びヌクレオチド配列を示すものである。シグナルプロセ
ッシング部位は矢印で示した。
びヌクレオチド配列を示すものである。シグナルプロセ
ッシング部位は矢印で示した。
第2a-2c図は、ヘルペスgDリーダーおよびCD4Tの推定
成熟Ｎ−末端のＮ−末端側の27残基の融合体のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示すものである。
成熟Ｎ−末端のＮ−末端側の27残基の融合体のアミノ酸
およびヌクレオチド配列を示すものである。
第３図は、天然および可溶性のCD4アドヘゾン、天然
ヒトIgG1（γ１）重鎖、および２つの代表的な重鎖−CD
4キメラの構造上の要素を示すものである。
ヒトIgG1（γ１）重鎖、および２つの代表的な重鎖−CD
4キメラの構造上の要素を示すものである。
第4a-4b図は、CD4融合体の調製において用いられるリ
ンカー処理されたヒトIgG1（γ１）鎖フラグメントの地
図である。挿入部位はγ１およびFcと命名する。
ンカー処理されたヒトIgG1（γ１）鎖フラグメントの地
図である。挿入部位はγ１およびFcと命名する。
第５図は、ＶκＪκ（軽可変および結合）およびＣκ
（軽不変）の側面にある矢印のところでCD4融合にとっ
て有用なヒトκ軽鎖フラグメントの地図である。
（軽不変）の側面にある矢印のところでCD4融合にとっ
て有用なヒトκ軽鎖フラグメントの地図である。
詳細な説明 アドヘゾンは、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミ
リーのメンバーにホモローガスな細胞外ドメインを有す
る細胞表面ポリペプチドである。しかし、クラスＩおよ
びクラスII主組織適合性抗原、免疫グロブリンおよびＴ
細胞受容体α、β、γおよびδ鎖からなる群から選ばれ
るこのスーパーファミリーの多形性の高いメンバーは除
外される。アドヘゾンの例には、CD1、CD2、CD4、CD8、
CD28、CD3のγ、δおよびε鎖、OX-2、Thy-1、細胞間ま
たは神経細胞付着分子（I-CAMまたはN-CAM）、リンパ球
機能関連抗原−３（LFA-3）、神経細胞プラズマ（neuro
cytoplasmic）タンパク質（NCP-3）、ポリ−Ig受容体、
ミエリン−関連の糖タンパク質（KAG）、高親和性のIgE
受容体、末梢ミエリンの主糖タンパク質（Po）、血小板
由来の成長因子受容体、コロニー刺激因子−１受容体、
マクロファージFc受容体、Fcガンマ受容体、および癌胚
（carcinoembryonic）抗原が含まれる。本明細書中で用
いられるホモローガスとは、免疫グロブリン遺伝子スー
パーファミリーのメンバーの配列を有するか、または上
に挙げた具体例が免疫グロブリン可変または不変ドメイ
ンの配列に有しているようなこのスーパーファミリーの
既知のメンバーに実質的に同じかまたはそれより大きい
アミノ酸配列相同性を有する配列をその中に有している
ことを意味する。好ましいアドヘゾンは、CD4、CD8、お
よび高親和性のIgE Fc受容体である。
リーのメンバーにホモローガスな細胞外ドメインを有す
る細胞表面ポリペプチドである。しかし、クラスＩおよ
びクラスII主組織適合性抗原、免疫グロブリンおよびＴ
細胞受容体α、β、γおよびδ鎖からなる群から選ばれ
るこのスーパーファミリーの多形性の高いメンバーは除
外される。アドヘゾンの例には、CD1、CD2、CD4、CD8、
CD28、CD3のγ、δおよびε鎖、OX-2、Thy-1、細胞間ま
たは神経細胞付着分子（I-CAMまたはN-CAM）、リンパ球
機能関連抗原−３（LFA-3）、神経細胞プラズマ（neuro
cytoplasmic）タンパク質（NCP-3）、ポリ−Ig受容体、
ミエリン−関連の糖タンパク質（KAG）、高親和性のIgE
受容体、末梢ミエリンの主糖タンパク質（Po）、血小板
由来の成長因子受容体、コロニー刺激因子−１受容体、
マクロファージFc受容体、Fcガンマ受容体、および癌胚
（carcinoembryonic）抗原が含まれる。本明細書中で用
いられるホモローガスとは、免疫グロブリン遺伝子スー
パーファミリーのメンバーの配列を有するか、または上
に挙げた具体例が免疫グロブリン可変または不変ドメイ
ンの配列に有しているようなこのスーパーファミリーの
既知のメンバーに実質的に同じかまたはそれより大きい
アミノ酸配列相同性を有する配列をその中に有している
ことを意味する。好ましいアドヘゾンは、CD4、CD8、お
よび高親和性のIgE Fc受容体である。
本発明は、特にアドヘゾンのアミノ酸配列変異体に関
する。アドヘゾンのアミノ酸配列変異体は考慮される種
々の目的によって調製されるが、これらにはアドヘゾン
とその結合相手との親和性を増大すること、アドヘゾン
の安定性、精製および製造を容易にすること、その血漿
半減期を増大すること、背景において既述したような治
療学的有効性を改善すること、追加の機能を導入するこ
と、およびアドヘゾンの治療学的使用の間の副作用の激
烈さまたは発生を少なくすることが含まれる。アドヘゾ
ンのアミノ酸配列変異体は、挿入、置換、または削除変
異体の１つまたはそれらの組合せからなる。
する。アドヘゾンのアミノ酸配列変異体は考慮される種
々の目的によって調製されるが、これらにはアドヘゾン
とその結合相手との親和性を増大すること、アドヘゾン
の安定性、精製および製造を容易にすること、その血漿
半減期を増大すること、背景において既述したような治
療学的有効性を改善すること、追加の機能を導入するこ
と、およびアドヘゾンの治療学的使用の間の副作用の激
烈さまたは発生を少なくすることが含まれる。アドヘゾ
ンのアミノ酸配列変異体は、挿入、置換、または削除変
異体の１つまたはそれらの組合せからなる。
挿入アミノ酸配列変異体は、アドヘゾンに対して異質
の１またはそれ以上のアミノ酸残基がＣまたはＮ末端を
含むアドヘゾン中の予め決定された部位に導入されるも
のである。そのような変異体はアドヘゾンと別種ポリペ
プチドの融合体と呼ばれる。そのような他のポリペプチ
ドには、アドヘゾン中の挿入部位において通常見い出さ
れる配列以外の配列が含まれる。いくつかの群の融合体
が本発明で意図されている。免疫学的に活性なアドヘゾ
ン融合体は、アドヘゾンと非−アドヘゾンエピトープを
含むポリペプチドからなる。非−アドヘゾンエピトープ
はあらゆる免疫学的にコンピテントなポリペプチドであ
る；即ち、融合体が投与される動物において免疫応答を
誘導することが可能であるか、または非−アドヘゾンポ
リペプチドに対して生成させた抗体によって結合され得
るあらゆるポリペプチドである。代表的な非−アドヘゾ
ンエピトープは、融合体を受け取る対象中に先在してい
る抗体によって認識されるアレルゲン、自己免疫エピト
ープ、または他の強力な免疫原もしくは抗原、例えば、
細菌性ポリペプチド（trpLEなど）、β−ガラクトシダ
ーゼ、ウイルス性ポリペプチド（ヘルペスgDタンパク質
など）等から生成するものである。免疫原性の融合体
は、インビトロでの架橋によって、または免疫原性ポリ
ペプチドをコードしているDNAで形質転換された組換え
細胞の培養によって調製される。免疫原性融合体は、免
疫原性配列がペプチド結合（群）によってアドヘゾン抗
原またはそのフラグメントに結合されるか、またはその
中に挿入されたものであるのが望ましい。従って、これ
らの生成物は、アドヘゾンエピトープとアドヘゾンに対
して外来の少なくとも１つのエピトープを含有する直線
状のポリペプチド鎖からなる。エピトープをアドヘゾン
分子またはそのフラグメント中のどこに導入しても本発
明の範囲内にあるということは理解されよう。そのよう
な融合体は、組換え宿主細胞において、または２官能性
の架橋剤の使用によって行うのが好都合である。アドヘ
ゾンを免疫原性ポリペプチドに融合させるために架橋剤
を使用することは直線状の融合ほど望ましくないが、こ
れは架橋生成物を構造的に均質な形態で合成するのが容
易ではないためである。
の１またはそれ以上のアミノ酸残基がＣまたはＮ末端を
含むアドヘゾン中の予め決定された部位に導入されるも
のである。そのような変異体はアドヘゾンと別種ポリペ
プチドの融合体と呼ばれる。そのような他のポリペプチ
ドには、アドヘゾン中の挿入部位において通常見い出さ
れる配列以外の配列が含まれる。いくつかの群の融合体
が本発明で意図されている。免疫学的に活性なアドヘゾ
ン融合体は、アドヘゾンと非−アドヘゾンエピトープを
含むポリペプチドからなる。非−アドヘゾンエピトープ
はあらゆる免疫学的にコンピテントなポリペプチドであ
る；即ち、融合体が投与される動物において免疫応答を
誘導することが可能であるか、または非−アドヘゾンポ
リペプチドに対して生成させた抗体によって結合され得
るあらゆるポリペプチドである。代表的な非−アドヘゾ
ンエピトープは、融合体を受け取る対象中に先在してい
る抗体によって認識されるアレルゲン、自己免疫エピト
ープ、または他の強力な免疫原もしくは抗原、例えば、
細菌性ポリペプチド（trpLEなど）、β−ガラクトシダ
ーゼ、ウイルス性ポリペプチド（ヘルペスgDタンパク質
など）等から生成するものである。免疫原性の融合体
は、インビトロでの架橋によって、または免疫原性ポリ
ペプチドをコードしているDNAで形質転換された組換え
細胞の培養によって調製される。免疫原性融合体は、免
疫原性配列がペプチド結合（群）によってアドヘゾン抗
原またはそのフラグメントに結合されるか、またはその
中に挿入されたものであるのが望ましい。従って、これ
らの生成物は、アドヘゾンエピトープとアドヘゾンに対
して外来の少なくとも１つのエピトープを含有する直線
状のポリペプチド鎖からなる。エピトープをアドヘゾン
分子またはそのフラグメント中のどこに導入しても本発
明の範囲内にあるということは理解されよう。そのよう
な融合体は、組換え宿主細胞において、または２官能性
の架橋剤の使用によって行うのが好都合である。アドヘ
ゾンを免疫原性ポリペプチドに融合させるために架橋剤
を使用することは直線状の融合ほど望ましくないが、こ
れは架橋生成物を構造的に均質な形態で合成するのが容
易ではないためである。
これらの免疫原挿入体は、薬理学的に許容しうる担体
中に配合され、そしてアドヘゾンに対する抗体を生成さ
せるために対象に投与されるときに特に有用である；こ
の抗体は、次いで自体既知の免疫アフィニティー法によ
るアドヘゾンの精製において、および診断において有用
となる。別法では、アドヘゾンの精製において、融合し
た非−アドヘゾンポリペプチドのための結合相手、例え
ば抗体、受容体またはリガンドを用いて不純な混合物か
ら融合体を吸着させ、次いで融合体を溶離し、そして所
望ならアドヘゾンを融合体から例えば酵素切断によって
回収する。
中に配合され、そしてアドヘゾンに対する抗体を生成さ
せるために対象に投与されるときに特に有用である；こ
の抗体は、次いで自体既知の免疫アフィニティー法によ
るアドヘゾンの精製において、および診断において有用
となる。別法では、アドヘゾンの精製において、融合し
た非−アドヘゾンポリペプチドのための結合相手、例え
ば抗体、受容体またはリガンドを用いて不純な混合物か
ら融合体を吸着させ、次いで融合体を溶離し、そして所
望ならアドヘゾンを融合体から例えば酵素切断によって
回収する。
免疫学的に活性であることもあるし、また活性でない
こともあるその他の融合体には、アドヘゾンに対してヘ
テロローガスなシグナル配列とアドヘゾン配列の融合
体、例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントな
どの増強された血漿半減期（通常、＞約20時間）を有す
るポリペプチドへのトランスメンブラン修飾したCD4ア
ドヘゾンの融合体、および細胞毒性機能との融合体が含
まれる。シグナル配列融合体は、アドヘゾンの分泌を一
層迅速にするために用いられる。ヘテロローガスなシグ
ナルが天然のアドヘゾンシグナルに置換され、そして、
得られた融合体が認識されると、即ち、宿主細胞によっ
てプロセッシングされ、そして切断されると、アドヘゾ
ンが分泌される。シグナルは意図した宿主細胞に基づい
て選択され、細菌性酵母、哺乳動物およびウイルスの配
列を含むこともある。ヘルペスgD糖タンパク質シグナル
が哺乳動物発現系で用いるのに適している。
こともあるその他の融合体には、アドヘゾンに対してヘ
テロローガスなシグナル配列とアドヘゾン配列の融合
体、例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントな
どの増強された血漿半減期（通常、＞約20時間）を有す
るポリペプチドへのトランスメンブラン修飾したCD4ア
ドヘゾンの融合体、および細胞毒性機能との融合体が含
まれる。シグナル配列融合体は、アドヘゾンの分泌を一
層迅速にするために用いられる。ヘテロローガスなシグ
ナルが天然のアドヘゾンシグナルに置換され、そして、
得られた融合体が認識されると、即ち、宿主細胞によっ
てプロセッシングされ、そして切断されると、アドヘゾ
ンが分泌される。シグナルは意図した宿主細胞に基づい
て選択され、細菌性酵母、哺乳動物およびウイルスの配
列を含むこともある。ヘルペスgD糖タンパク質シグナル
が哺乳動物発現系で用いるのに適している。
トランスメンブラン修飾したCD4のそれより長い増強
された血漿半減期を有する血漿タンパク質には、血清ア
ルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、およ
びトランスフェリンが含まれる。アドヘゾン−血漿タン
パク質融合体は、それが用いられる動物において有意に
免疫原性ではなく、そして血漿タンパク質は、その正常
な生物学的活性の故に患者において望ましくない副作用
を引き起こさないものであるのが好ましい。
された血漿半減期を有する血漿タンパク質には、血清ア
ルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、およ
びトランスフェリンが含まれる。アドヘゾン−血漿タン
パク質融合体は、それが用いられる動物において有意に
免疫原性ではなく、そして血漿タンパク質は、その正常
な生物学的活性の故に患者において望ましくない副作用
を引き起こさないものであるのが好ましい。
特定の態様において、不変または可変領域ドメインの
いずれかにホモローガスであることもあるアドヘゾンの
免疫グロブリン様のドメインを、免疫グロブリン不変領
域配列とコンジュゲートする。得られた生成物は、本明
細書中では免疫アドヘゾンと呼ばれる。免疫グロブリン
およびある種のその変異体は既知であり、その多数が組
換え細胞培養において調製されている。例えば、米国特
許4,745,055;EP 256,654;Faulkner et al.,Nature 29
8:286（1982）;EP 120,694;EP 125,023;Morrison,J.Imm
un. 123:793（1979）;Khler et al.,P.N.A.S.USA 7
7:2197（1980）;Raso et al.,Cancer Res. 41:2073（1
981）;Morrison et al.,Ann.Rev.Immunol. ２:239（19
84）;Morrison,Science 229:1202（1985）;Morrison e
t al.,P.N.A.S.USA 81:6851（1984）;EP 255,694;EP 2
66,663;およびWO 88/03559を参照。また、再分類した免
疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許4,44
4,878;WO 88/03565;およびEP 68,763およびその中で引
用されている文献を参照。
いずれかにホモローガスであることもあるアドヘゾンの
免疫グロブリン様のドメインを、免疫グロブリン不変領
域配列とコンジュゲートする。得られた生成物は、本明
細書中では免疫アドヘゾンと呼ばれる。免疫グロブリン
およびある種のその変異体は既知であり、その多数が組
換え細胞培養において調製されている。例えば、米国特
許4,745,055;EP 256,654;Faulkner et al.,Nature 29
8:286（1982）;EP 120,694;EP 125,023;Morrison,J.Imm
un. 123:793（1979）;Khler et al.,P.N.A.S.USA 7
7:2197（1980）;Raso et al.,Cancer Res. 41:2073（1
981）;Morrison et al.,Ann.Rev.Immunol. ２:239（19
84）;Morrison,Science 229:1202（1985）;Morrison e
t al.,P.N.A.S.USA 81:6851（1984）;EP 255,694;EP 2
66,663;およびWO 88/03559を参照。また、再分類した免
疫グロブリン鎖も知られている。例えば、米国特許4,44
4,878;WO 88/03565;およびEP 68,763およびその中で引
用されている文献を参照。
通常、免疫グロブリンにホモローガスであり、そして
それらの天然の環境において細胞外であるアドヘゾンの
ドメインは、可変領域（群）の代わりに免疫グロブリン
の不変領域のＮ−末端にＣ−末端で融合され、免疫グロ
ブリン重鎖の不変領域の少なくとも機能的に活性なヒン
ジ、CH2およびCH3ドメインは保持される。これは、通
常、適切なDNA配列を構築し、そして組換え細胞培養中
でそれを発現させることによって達成される。増強され
た血漿半減期を有する免疫グロブリンおよびその他のポ
リペプチドは、同じ方法で他のアドヘゾンの細胞外また
はリガンド結合ドメインに融合される。
それらの天然の環境において細胞外であるアドヘゾンの
ドメインは、可変領域（群）の代わりに免疫グロブリン
の不変領域のＮ−末端にＣ−末端で融合され、免疫グロ
ブリン重鎖の不変領域の少なくとも機能的に活性なヒン
ジ、CH2およびCH3ドメインは保持される。これは、通
常、適切なDNA配列を構築し、そして組換え細胞培養中
でそれを発現させることによって達成される。増強され
た血漿半減期を有する免疫グロブリンおよびその他のポ
リペプチドは、同じ方法で他のアドヘゾンの細胞外また
はリガンド結合ドメインに融合される。
CD4 V−様の領域（V1-V4）のための境界ドメインは、
それぞれ約100-109、約175-184、約289-298、および約3
60-369である（開始metが−25である前駆体CD4アミノ酸
配列に基づいて；第1a図）。CD4 Vドメインのいずれか
を含むCD4配列を、免疫グロブリン配列に融合する。V1V
2またはV1V2V3V4が免疫グロブリン不変領域にそれらの
Ｃ−末端で融合されるのが望ましい。融合が行われる正
確な部位は重要ではない；本明細書中で言及された境界
ドメインは、例示のためだけのものであり、Ｖ領域内
の、またはそれに隣接する他の部位がCD4の分泌または
結合特性を最適化するために選択されてもよい。最適部
位は通常の実験によって決定されるであろう。通常、融
合体は細胞内で発現されるが、組換え宿主からの融合体
の分泌の程度において極めて多くの変化が存在すること
がわかった。例えば、次の表は、本発明の方法によって
得られた種々の免疫グロブリン融合体を示すものであ
る。CD4免疫アドヘゾンのすべての例において、CD4シグ
ナルを293細胞からの分泌のために用いた。小文字のｍ
はネズミ起源を表し、一方、小文字のｈはヒト起源を表
す。ＶおよびＣは、それぞれ免疫グロブリン可変および
不変ドメインの省略形である。数値添字は、示したマル
チマーにおいて見い出される括弧内の単位の数を示す。
マルチマーの鎖が天然の免疫グロブリンと同じ方法で結
合したジスルフィドであると考えられるということは理
解されるであろう。CD4免疫アドヘゾンは、通常、CD4の
最初のＮ−末端366残基（CD44）またはCD4の最初のＮ−
末端180残基（CD42）のいずれかを含有しており、これ
らはそのＣ−末端でκ（軽）鎖またはIgG1重鎖不変領域
（γ１）に結合している。
それぞれ約100-109、約175-184、約289-298、および約3
60-369である（開始metが−25である前駆体CD4アミノ酸
配列に基づいて；第1a図）。CD4 Vドメインのいずれか
を含むCD4配列を、免疫グロブリン配列に融合する。V1V
2またはV1V2V3V4が免疫グロブリン不変領域にそれらの
Ｃ−末端で融合されるのが望ましい。融合が行われる正
確な部位は重要ではない；本明細書中で言及された境界
ドメインは、例示のためだけのものであり、Ｖ領域内
の、またはそれに隣接する他の部位がCD4の分泌または
結合特性を最適化するために選択されてもよい。最適部
位は通常の実験によって決定されるであろう。通常、融
合体は細胞内で発現されるが、組換え宿主からの融合体
の分泌の程度において極めて多くの変化が存在すること
がわかった。例えば、次の表は、本発明の方法によって
得られた種々の免疫グロブリン融合体を示すものであ
る。CD4免疫アドヘゾンのすべての例において、CD4シグ
ナルを293細胞からの分泌のために用いた。小文字のｍ
はネズミ起源を表し、一方、小文字のｈはヒト起源を表
す。ＶおよびＣは、それぞれ免疫グロブリン可変および
不変ドメインの省略形である。数値添字は、示したマル
チマーにおいて見い出される括弧内の単位の数を示す。
マルチマーの鎖が天然の免疫グロブリンと同じ方法で結
合したジスルフィドであると考えられるということは理
解されるであろう。CD4免疫アドヘゾンは、通常、CD4の
最初のＮ−末端366残基（CD44）またはCD4の最初のＮ−
末端180残基（CD42）のいずれかを含有しており、これ
らはそのＣ−末端でκ（軽）鎖またはIgG1重鎖不変領域
（γ１）に結合している。
CD4−ヒト重鎖免疫アドヘゾンは二量体として分泌さ
れたが、類似のネズミ構築物は検出されなかった（これ
は、タンパク質の細胞内の蓄積を排除するものではない
が）ことをこの表から観察するのは興味深い。以前の研
究は、宿主が重鎖および軽鎖の両鎖をコードしている核
酸で同時形質転換されない限り、免疫グロブリン重鎖は
分泌されないことを示唆していたので［Valle et al.,N
ature 241:338（1981）］、重鎖二量体を産生するhCD4
-hCγｌ形質転換体の能力は予想外であった。本発明に
よればCD4-IgG免疫アドヘゾンキメラが容易に分泌さ
れ、ここでCD4エピトープは重鎖二量体、軽鎖単量体ま
たは二量体、および重および軽鎖ヘテロ四量体中に存在
し、CD4エピトープは１またはそれ以上の軽または重鎖
に融合して存在し、可変領域類似体の４つまでおよび４
つすべてがCD4から導かれるヘテロ四量体を含む。軽−
重鎖 非−CD4可変ドメインが存在するところでは、ヘ
テロ機能性の抗体がこのように提供される。
れたが、類似のネズミ構築物は検出されなかった（これ
は、タンパク質の細胞内の蓄積を排除するものではない
が）ことをこの表から観察するのは興味深い。以前の研
究は、宿主が重鎖および軽鎖の両鎖をコードしている核
酸で同時形質転換されない限り、免疫グロブリン重鎖は
分泌されないことを示唆していたので［Valle et al.,N
ature 241:338（1981）］、重鎖二量体を産生するhCD4
-hCγｌ形質転換体の能力は予想外であった。本発明に
よればCD4-IgG免疫アドヘゾンキメラが容易に分泌さ
れ、ここでCD4エピトープは重鎖二量体、軽鎖単量体ま
たは二量体、および重および軽鎖ヘテロ四量体中に存在
し、CD4エピトープは１またはそれ以上の軽または重鎖
に融合して存在し、可変領域類似体の４つまでおよび４
つすべてがCD4から導かれるヘテロ四量体を含む。軽−
重鎖 非−CD4可変ドメインが存在するところでは、ヘ
テロ機能性の抗体がこのように提供される。
本発明に従って製造される種々の代表的なヘテロおよ
びキメラ免疫アドヘゾン抗体を以下に略して示す。
「Ａ」は、リガンド結合部位を含むアドヘゾンの細胞外
ドメインの少なくとも一部を意味する；VL、VH、CL、お
よびCHは、免疫グロブリンの軽または重鎖の可変または
不変ドメインを表す;nは整数である；そして、Ｙは共有
架橋部分を示す。
びキメラ免疫アドヘゾン抗体を以下に略して示す。
「Ａ」は、リガンド結合部位を含むアドヘゾンの細胞外
ドメインの少なくとも一部を意味する；VL、VH、CL、お
よびCHは、免疫グロブリンの軽または重鎖の可変または
不変ドメインを表す;nは整数である；そして、Ｙは共有
架橋部分を示す。
（ａ）ACL； （ｂ）ACL-ACL； （ｃ）ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-ACH、ま
たはVLCL-VHCH］； （ｄ）ACL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｅ）ACL-VHCH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｆ）VLCL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］；または （ｇ）［Ａ−Ｙ］ｎ−［VLCL-VHCH］２。
たはVLCL-VHCH］； （ｄ）ACL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｅ）ACL-VHCH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｆ）VLCL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］；または （ｇ）［Ａ−Ｙ］ｎ−［VLCL-VHCH］２。
この表に挙げた構造は重要な特徴だけを示すものであ
り、例えば、これらは免疫グロブリンの結合（Ｊ）また
は他のドメインを示しておらず、また、ジスルフィド結
合も示されていない。これらは簡単にするために省略し
た。しかし、そのようなドメインが結合活性のために必
要とされるところでは、それらは、場合に応じてそれら
がアドヘゾン、免疫アドヘゾンまたは免疫グロブリン分
子中に占める通常の位置に存在しているものとする。こ
れらは２価の抗体の代表例である；もっと複雑な構造が
他のクラス、例えばIgM由来の免疫グロブリン重鎖配列
を用いることによって得られるであろう。コンパニオン
免疫グロブリンとも呼ばれる免疫グロブリンVLVH抗体結
合部位は、予め決定された抗原に結合することができる
ものであるのが好ましい。
り、例えば、これらは免疫グロブリンの結合（Ｊ）また
は他のドメインを示しておらず、また、ジスルフィド結
合も示されていない。これらは簡単にするために省略し
た。しかし、そのようなドメインが結合活性のために必
要とされるところでは、それらは、場合に応じてそれら
がアドヘゾン、免疫アドヘゾンまたは免疫グロブリン分
子中に占める通常の位置に存在しているものとする。こ
れらは２価の抗体の代表例である；もっと複雑な構造が
他のクラス、例えばIgM由来の免疫グロブリン重鎖配列
を用いることによって得られるであろう。コンパニオン
免疫グロブリンとも呼ばれる免疫グロブリンVLVH抗体結
合部位は、予め決定された抗原に結合することができる
ものであるのが好ましい。
適当なコンパニオン免疫グロブリン結合部位および融
合相手は、IgG-1、−２、−３、または、−４サブタイ
プ、IgA、IgE、IgD、またはIgMから得られるが、IgG-1
が好ましい。
合相手は、IgG-1、−２、−３、または、−４サブタイ
プ、IgA、IgE、IgD、またはIgMから得られるが、IgG-1
が好ましい。
好ましい態様は、HIVのgp120エンベロープタンパク質
の結合部位を含むCD4のＮ−末端部分の、免疫グロブリ
ンG1のエフェクター機能を含んでいる抗体のＣ−末端Fc
部分への融合である。この分類には２つの好ましい態様
が存在する；その１つにおいては、完全な重鎖不変領域
はCD4の一部に融合され；もう一方においては、IgG Fc
を化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒン
ジ領域において始まる配列［残基216、重鎖不変領域の
最初の残基を114にとる（Kobat et al.,"Sequences of
Proteins of Immunological Interest"第４版,1987）、
または他の免疫グロブリンの類似の部位］をCD4の一部
に融合させる。これらの態様は実施例において説明す
る。
の結合部位を含むCD4のＮ−末端部分の、免疫グロブリ
ンG1のエフェクター機能を含んでいる抗体のＣ−末端Fc
部分への融合である。この分類には２つの好ましい態様
が存在する；その１つにおいては、完全な重鎖不変領域
はCD4の一部に融合され；もう一方においては、IgG Fc
を化学的に定義するパパイン切断部位のすぐ上流のヒン
ジ領域において始まる配列［残基216、重鎖不変領域の
最初の残基を114にとる（Kobat et al.,"Sequences of
Proteins of Immunological Interest"第４版,1987）、
または他の免疫グロブリンの類似の部位］をCD4の一部
に融合させる。これらの態様は実施例において説明す
る。
さらに詳しくは、アドヘゾンの１またはそれ以上の免
疫グロブリン様のドメインが免疫グロブリン鎖の可変領
域の代わりに置換されているこれらの変異体は、改良さ
れたインビボでの血漿半減期を示すものと考えられる。
これらのキメラは、１つの種の抗体からの可変ドメイン
が他の種の可変ドメインの代わりに置換されているキメ
ラ抗体と同様の方法で構築される。例えば、EP 0 125 0
23;Munro,Nature 312：（1984年12月13日）;Neuberger
et al.,Nature 312：（1984年12月13日）;Sharon et
al.,Nature 309：（1984年５月24日）;Morrison et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855（1984）;Mo
rrison et al.,Science 229:1202-1207（1985）；およ
びBoulianne et al.,Nature 312:643-646（1984年12月
13日）を参照。アドヘゾンの免疫グロブリン様のドメイ
ン（群）をコードしているDNAは、制限酵素によって、
免疫グロブリン様のドメイン（群）をコードしているDN
Aの３′末端（または、その近位）で、および成熟アド
ヘゾンポリペプチドのＮ−末端をコードしているDNAの
位置（または、その近く）で（異なるリーダーの使用が
意図されるとき）、またはアドヘゾンのＮ−末端暗号領
域（または、その近位）で（天然のアドヘゾンシグナル
が用いられるとき）、切断される。このDNAフラグメン
トは、次いで免疫グロブリン軽または重鎖不変領域をコ
ードしているDNAに容易に挿入され、そして必要なら、
削除突然変異誘発によって加工される。変異体がヒトの
インビボ治療のためのものであるときにはヒト免疫グロ
ブリンであるのが好ましい。免疫グロブリン軽または重
鎖不変領域をコードしているDNAは既知であるか、また
はcDNAライブラリーから容易に入手可能であるか、また
は合成される。例えば、Adams et al.,Biochemistry 1
9:2711-2719（1980）;Gough et al.,Biochemistry 19:
2702-2710（1980）;Dolby et al.,P.N.A.S.USA 77:602
7-6031（1980）;Rice et al.,P.N.A.S.USA 79:7862-78
65（1982）;Falkner et al.,Nature 298:286-288（198
2）；およびMorrison et al.,Ann.Rev.Immunol. ２:23
9-256（1984）を参照。
疫グロブリン様のドメインが免疫グロブリン鎖の可変領
域の代わりに置換されているこれらの変異体は、改良さ
れたインビボでの血漿半減期を示すものと考えられる。
これらのキメラは、１つの種の抗体からの可変ドメイン
が他の種の可変ドメインの代わりに置換されているキメ
ラ抗体と同様の方法で構築される。例えば、EP 0 125 0
23;Munro,Nature 312：（1984年12月13日）;Neuberger
et al.,Nature 312：（1984年12月13日）;Sharon et
al.,Nature 309：（1984年５月24日）;Morrison et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855（1984）;Mo
rrison et al.,Science 229:1202-1207（1985）；およ
びBoulianne et al.,Nature 312:643-646（1984年12月
13日）を参照。アドヘゾンの免疫グロブリン様のドメイ
ン（群）をコードしているDNAは、制限酵素によって、
免疫グロブリン様のドメイン（群）をコードしているDN
Aの３′末端（または、その近位）で、および成熟アド
ヘゾンポリペプチドのＮ−末端をコードしているDNAの
位置（または、その近く）で（異なるリーダーの使用が
意図されるとき）、またはアドヘゾンのＮ−末端暗号領
域（または、その近位）で（天然のアドヘゾンシグナル
が用いられるとき）、切断される。このDNAフラグメン
トは、次いで免疫グロブリン軽または重鎖不変領域をコ
ードしているDNAに容易に挿入され、そして必要なら、
削除突然変異誘発によって加工される。変異体がヒトの
インビボ治療のためのものであるときにはヒト免疫グロ
ブリンであるのが好ましい。免疫グロブリン軽または重
鎖不変領域をコードしているDNAは既知であるか、また
はcDNAライブラリーから容易に入手可能であるか、また
は合成される。例えば、Adams et al.,Biochemistry 1
9:2711-2719（1980）;Gough et al.,Biochemistry 19:
2702-2710（1980）;Dolby et al.,P.N.A.S.USA 77:602
7-6031（1980）;Rice et al.,P.N.A.S.USA 79:7862-78
65（1982）;Falkner et al.,Nature 298:286-288（198
2）；およびMorrison et al.,Ann.Rev.Immunol. ２:23
9-256（1984）を参照。
免疫グロブリンまたは免疫アドヘゾンキメラ鎖（群）
をコードしているDNAを、発現用の宿主細胞にトランス
フェクションする。宿主細胞がトランスフェクション前
に免疫グロブリンを産生しているときには、ヘテロ抗体
を産生させるために軽または重鎖に融合させたアドヘゾ
ンでトランスフェクションすることが必要になるだけで
ある。アドヘゾンドメインを有する１またはそれ以上の
アーム、およびコンパニオン可変領域を有する１または
それ以上のアームを有する前述の免疫グロブリンは、ア
ドヘゾンリガンドのための、および抗原のための二重の
特異性の結果になる。これらは、上記の組換え法によっ
て、またはインビトロでの方法によって製造される。後
者の場合には、例えば、免疫グロブリンとアドヘゾン融
合体のＦ（ab′）２フラグメントを調製し、このＦ（a
b′）２フラグメントを穏やかな還元条件下での還元に
よってFab′フラグメントに変換し、次いで自体既知の
方法に従って酸性条件下、互いの存在下で再酸化する。
米国特許4,444,878をも参照。
をコードしているDNAを、発現用の宿主細胞にトランス
フェクションする。宿主細胞がトランスフェクション前
に免疫グロブリンを産生しているときには、ヘテロ抗体
を産生させるために軽または重鎖に融合させたアドヘゾ
ンでトランスフェクションすることが必要になるだけで
ある。アドヘゾンドメインを有する１またはそれ以上の
アーム、およびコンパニオン可変領域を有する１または
それ以上のアームを有する前述の免疫グロブリンは、ア
ドヘゾンリガンドのための、および抗原のための二重の
特異性の結果になる。これらは、上記の組換え法によっ
て、またはインビトロでの方法によって製造される。後
者の場合には、例えば、免疫グロブリンとアドヘゾン融
合体のＦ（ab′）２フラグメントを調製し、このＦ（a
b′）２フラグメントを穏やかな還元条件下での還元に
よってFab′フラグメントに変換し、次いで自体既知の
方法に従って酸性条件下、互いの存在下で再酸化する。
米国特許4,444,878をも参照。
さらに、異なる特異性を有する免疫グロブリンから無
傷のヘテロ抗体を製造するための方法が知られている。
これらの方法は、以前に用いられていた免疫グロブリン
の１つの代わりに免疫アドヘゾン鎖を単に置換すること
によって、ヘテロキメラ抗体のインビトロでの製造のた
めに採用される。
傷のヘテロ抗体を製造するための方法が知られている。
これらの方法は、以前に用いられていた免疫グロブリン
の１つの代わりに免疫アドヘゾン鎖を単に置換すること
によって、ヘテロキメラ抗体のインビトロでの製造のた
めに採用される。
ヘテロ機能性抗体を製造するための別法においては、
アドヘゾン−免疫グロブリン融合体を産生する宿主細
胞、例えばトランスフェクションされた骨髄腫細胞が、
抗原に対する所望のコンパニオン特異性を有する抗体を
分泌するＢ細胞またはハイブリドーマと融合される。ヘ
テロ２官能性の抗体は、そのようなハイブリドーマの培
養培地から回収され、従って、通常のインビトロ依存法
（EP 68,763）よりも若干好都合に製造されることもあ
る。
アドヘゾン−免疫グロブリン融合体を産生する宿主細
胞、例えばトランスフェクションされた骨髄腫細胞が、
抗原に対する所望のコンパニオン特異性を有する抗体を
分泌するＢ細胞またはハイブリドーマと融合される。ヘ
テロ２官能性の抗体は、そのようなハイブリドーマの培
養培地から回収され、従って、通常のインビトロ依存法
（EP 68,763）よりも若干好都合に製造されることもあ
る。
他の群の融合体は、アドヘゾンが毒性物質、例えば、
リシン（脱グリコシル化されたリシンＡ鎖を含む）、ジ
フテリア毒素Ａ、または非−ペプチジル細胞毒のような
ポリペプチドとコンジュゲートされたものである。毒素
がポリペプチドであるときには、通常のインビトロでの
タンパク質架橋剤によって［リシンＡ鎖または脱グリコ
シル化されたＡ鎖をCD4に結合させるに適した方法につ
いては、例えば、Duncan et al.,Analy.Biochem. 132:
68-73（1983）;Thorpe et al.,Cancer Res. 47:5924
（1987）；およびGhotie et al.,Cancer Res. 48:2610
（1988）を参照］、または融合体としての組換え合成に
よって（例えば、米国特許4,765,382を参照）、ポリペ
プチドをアドヘゾンまたはそのトランスメンブラン−削
除した変異体に架橋させるのが好都合である。これとは
異なり、コンパニオン抗体が抗−リシン抗体免疫グロブ
リン可変ドメインであるときには、そのような免疫グロ
ブリンヘテロ抗体を用い、Raso et al.,Cancer Researc
h 41:2073（1981）の一般的な方法に従ってリシンをHI
V感染細胞に放出させる。
リシン（脱グリコシル化されたリシンＡ鎖を含む）、ジ
フテリア毒素Ａ、または非−ペプチジル細胞毒のような
ポリペプチドとコンジュゲートされたものである。毒素
がポリペプチドであるときには、通常のインビトロでの
タンパク質架橋剤によって［リシンＡ鎖または脱グリコ
シル化されたＡ鎖をCD4に結合させるに適した方法につ
いては、例えば、Duncan et al.,Analy.Biochem. 132:
68-73（1983）;Thorpe et al.,Cancer Res. 47:5924
（1987）；およびGhotie et al.,Cancer Res. 48:2610
（1988）を参照］、または融合体としての組換え合成に
よって（例えば、米国特許4,765,382を参照）、ポリペ
プチドをアドヘゾンまたはそのトランスメンブラン−削
除した変異体に架橋させるのが好都合である。これとは
異なり、コンパニオン抗体が抗−リシン抗体免疫グロブ
リン可変ドメインであるときには、そのような免疫グロ
ブリンヘテロ抗体を用い、Raso et al.,Cancer Researc
h 41:2073（1981）の一般的な方法に従ってリシンをHI
V感染細胞に放出させる。
他の群のアドヘゾン変異体は削除変異体である。削除
は、アドヘゾン配列からの１またはそれ以上のアミノ酸
残基の除去によって特徴づけられる。代表的には、アド
ヘゾンのトランスメンブランおよび細胞質ドメインが削
除される。CD4の場合、少なくとも残基368〜395（トラ
ンスメンブラン領域）、および普通には、同様の396〜4
33（細胞質ドメイン）を削除することによって、このア
ドヘゾンの分泌型が得られるであろう。付け加えると、
アミノ酸残基は、例えば第1a〜1c図において示したよう
に、成熟CD4に与えられた数に従う。即ち、CD4T分子
は、通常はおよその残基366−368の周辺において、また
はそれらに対してＮ−末端の、CD4変異体のgp120−結合
能力を保存する他のあらゆる適当な部位で終わるであろ
う。
は、アドヘゾン配列からの１またはそれ以上のアミノ酸
残基の除去によって特徴づけられる。代表的には、アド
ヘゾンのトランスメンブランおよび細胞質ドメインが削
除される。CD4の場合、少なくとも残基368〜395（トラ
ンスメンブラン領域）、および普通には、同様の396〜4
33（細胞質ドメイン）を削除することによって、このア
ドヘゾンの分泌型が得られるであろう。付け加えると、
アミノ酸残基は、例えば第1a〜1c図において示したよう
に、成熟CD4に与えられた数に従う。即ち、CD4T分子
は、通常はおよその残基366−368の周辺において、また
はそれらに対してＮ−末端の、CD4変異体のgp120−結合
能力を保存する他のあらゆる適当な部位で終わるであろ
う。
置換変異体は、アドヘゾン配列中の少なくとも１つの
残基が除去され、そしてその位置に別の残基が挿入され
たものである。成熟CD4の天然のＮ−末端残基は、リジ
ンであることが現在知られている。従って、Ｎ−末端ア
スパラギンを有する第１図に示した配列は、天然の成熟
CD4のアミノ酸配列変異体である。以下の第２表は、通
常CD抗原の性質を微妙に調節することになるであろう置
換を示すものである。
残基が除去され、そしてその位置に別の残基が挿入され
たものである。成熟CD4の天然のＮ−末端残基は、リジ
ンであることが現在知られている。従って、Ｎ−末端ア
スパラギンを有する第１図に示した配列は、天然の成熟
CD4のアミノ酸配列変異体である。以下の第２表は、通
常CD抗原の性質を微妙に調節することになるであろう置
換を示すものである。
第２表のものより保存性が少ない置換を選択すること
によって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド
骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、
（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また
は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、アドヘゾンの性質に最大の変化をもたらすと予想さ
れる置換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまた
はトレオニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、
イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ
ル）に代えて（または、によって）置換されているも
の；（ｂ）システイニルまたはプロリルが他のいずれか
の残基に代えて（または、によって）置換されているも
の；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジ
ル、アルギニルまたはヒスチジル）が、電気陰性の残基
（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）に代えて
（または、によって）置換されているもの；または
（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラ
ニル）が、そのような側鎖を有さない残基（例えば、グ
リシル）に代えて（または、によって）置換されている
ものであろう。
によって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド
骨格の構造、例えばシートまたは螺旋の立体配座、
（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、また
は（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用がもっと有
意に異なっている残基を選択することによって、機能ま
たは免疫学的な独自性の実質的な変換が行われる。通
常、アドヘゾンの性質に最大の変化をもたらすと予想さ
れる置換は、（ａ）親水性の残基（例えば、セリルまた
はトレオニル）が、疎水性の残基（例えば、ロイシル、
イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ
ル）に代えて（または、によって）置換されているも
の；（ｂ）システイニルまたはプロリルが他のいずれか
の残基に代えて（または、によって）置換されているも
の；（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジ
ル、アルギニルまたはヒスチジル）が、電気陰性の残基
（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）に代えて
（または、によって）置換されているもの；または
（ｄ）大きな側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラ
ニル）が、そのような側鎖を有さない残基（例えば、グ
リシル）に代えて（または、によって）置換されている
ものであろう。
置換または削除変異体の好ましい群は、アドヘゾンの
トランスメンブラン領域が関係しているものである。こ
のアドヘゾンのトランスメンブラン領域は、細胞膜の脂
質２重層をまたぐに適切な大きさの疎水性または親油性
の高いドメインである。これは、細胞膜においてアドヘ
ゾンをアンカーさせるものと考えられている。
トランスメンブラン領域が関係しているものである。こ
のアドヘゾンのトランスメンブラン領域は、細胞膜の脂
質２重層をまたぐに適切な大きさの疎水性または親油性
の高いドメインである。これは、細胞膜においてアドヘ
ゾンをアンカーさせるものと考えられている。
トランスメンブラン領域の削除または置換は、アドヘ
ゾンの細胞または膜脂質親和性を減少させ、その水溶解
性を改善することによって、可溶型のアドヘゾンを与
え、その回収を容易にするであろう。トランスメンブラ
ンおよび細胞質ドメインが削除されるときには、他の点
では細胞内性であるポリペプチド（身体により外来と認
識されることもある）の暴露による、または異種のポリ
ペプチド（潜在的に免疫原性である）の挿入のいずれか
による、潜在的な免疫原エピトープの導入を避ける。ト
ランスメンブラン削除されたアドヘゾンの主な利点は、
それが組換え宿主の培養培地中に分泌されるということ
である。この変異体は水溶性であり、細胞膜脂質に対し
て親和性をそれほど有していないので、組換え細胞培養
物からの回収をかなり簡単なものにする。
ゾンの細胞または膜脂質親和性を減少させ、その水溶解
性を改善することによって、可溶型のアドヘゾンを与
え、その回収を容易にするであろう。トランスメンブラ
ンおよび細胞質ドメインが削除されるときには、他の点
では細胞内性であるポリペプチド（身体により外来と認
識されることもある）の暴露による、または異種のポリ
ペプチド（潜在的に免疫原性である）の挿入のいずれか
による、潜在的な免疫原エピトープの導入を避ける。ト
ランスメンブラン削除されたアドヘゾンの主な利点は、
それが組換え宿主の培養培地中に分泌されるということ
である。この変異体は水溶性であり、細胞膜脂質に対し
て親和性をそれほど有していないので、組換え細胞培養
物からの回収をかなり簡単なものにする。
置換、削除、挿入、またはそれらのあらゆる組合せを
導入することによって最終の構築物に到達することは上
記から明らかであろう。一般的に記述すると、すべての
変異体は機能的なトランスメンブランドメインを有して
おらず、また、好ましくは機能的な細胞質配列を有して
いないであろう。通常、これは関連ドメインの削除によ
って行われるが、適切な挿入または置換突然変異もこの
目的に有効である。例えば、トランスメンブランドメイ
ンをいずれかのアミノ酸配列（例えば、全体として親水
性のハイドロパシーの性質を示す、約５〜50のセリン、
トレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパ
ラギン酸および同様の親水性残基からなるランダムな、
またはホモポリヌクレイック配列）で置換することによ
って、それを組換え宿主の培養培地中に分泌させる。こ
の変異体もアドヘゾン変異体とみなされるべきである。
導入することによって最終の構築物に到達することは上
記から明らかであろう。一般的に記述すると、すべての
変異体は機能的なトランスメンブランドメインを有して
おらず、また、好ましくは機能的な細胞質配列を有して
いないであろう。通常、これは関連ドメインの削除によ
って行われるが、適切な挿入または置換突然変異もこの
目的に有効である。例えば、トランスメンブランドメイ
ンをいずれかのアミノ酸配列（例えば、全体として親水
性のハイドロパシーの性質を示す、約５〜50のセリン、
トレオニン、リジン、アルギニン、グルタミン、アスパ
ラギン酸および同様の親水性残基からなるランダムな、
またはホモポリヌクレイック配列）で置換することによ
って、それを組換え宿主の培養培地中に分泌させる。こ
の変異体もアドヘゾン変異体とみなされるべきである。
通常、これらの変異体はアドヘゾンをコードしている
DNA中のヌクレオチドの部位特異的な突然変異誘発によ
って調製され、これによって変異体をコードしているDN
Aを得、次いで組換え細胞培養においてDNAを発現させ
る。しかし、変異アドヘゾンはインビトロでの合成によ
っても調製される。変異アドヘゾンをコードしているDN
A中で為された変異はこの配列をリーディング・フレー
ム（読み枠）の外に置くものであってはならないのは明
らかであり、好ましくは、発現に対して有害なmRNAの２
次構造を生成することもある相補領域を創製しないもの
であろう（EP 75,444A）。上記のようにCD4アドヘゾン
の性質を変えるするために変異体が選択されるが、通
常、CD4変異体は天然の原型が示すgp120結合活性と同一
の活性を示す。
DNA中のヌクレオチドの部位特異的な突然変異誘発によ
って調製され、これによって変異体をコードしているDN
Aを得、次いで組換え細胞培養においてDNAを発現させ
る。しかし、変異アドヘゾンはインビトロでの合成によ
っても調製される。変異アドヘゾンをコードしているDN
A中で為された変異はこの配列をリーディング・フレー
ム（読み枠）の外に置くものであってはならないのは明
らかであり、好ましくは、発現に対して有害なmRNAの２
次構造を生成することもある相補領域を創製しないもの
であろう（EP 75,444A）。上記のようにCD4アドヘゾン
の性質を変えるするために変異体が選択されるが、通
常、CD4変異体は天然の原型が示すgp120結合活性と同一
の活性を示す。
アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定さ
れるが、突然変異それ自体は予め決定する必要がない。
例えば、ある部位での突然変異の実施を最適にするた
め、標的コドンまたは領域においてランダム突然変異誘
発を行い、発現されたアドヘゾン変異体を最も望ましい
活性の組合せについてスクリーニングすることができ
る。既知の配列を有するDNA中の予め決定した部位にお
いて置換突然変異を行う方法は周知であり、例えばM13
プライマー突然変異誘発である。
れるが、突然変異それ自体は予め決定する必要がない。
例えば、ある部位での突然変異の実施を最適にするた
め、標的コドンまたは領域においてランダム突然変異誘
発を行い、発現されたアドヘゾン変異体を最も望ましい
活性の組合せについてスクリーニングすることができ
る。既知の配列を有するDNA中の予め決定した部位にお
いて置換突然変異を行う方法は周知であり、例えばM13
プライマー突然変異誘発である。
HIV gp120を結合することができないアドヘゾン変異
体は、それでも、少なくとも１つのアドヘゾンエピトー
プが活性のままである限り、アドヘゾンに対する抗体を
生成させるための免疫原として、または免疫検定キット
の成分（gp120検定の競合試薬のときはラベルされ、ア
ドヘゾン検定の標準のときはラベルされない）として有
用である。
体は、それでも、少なくとも１つのアドヘゾンエピトー
プが活性のままである限り、アドヘゾンに対する抗体を
生成させるための免疫原として、または免疫検定キット
の成分（gp120検定の競合試薬のときはラベルされ、ア
ドヘゾン検定の標準のときはラベルされない）として有
用である。
アドヘゾンをコードしているDNAは既知の方法によっ
て得られる［Williams,Immunol.Today ８:298-303（19
87）およびその引例を参照］。通常、CD4の変異DNA配列
のクローニングのためには原核生物が用いられる。例え
ば、大腸菌株SR101［m13ファージを増殖させるための、
JM101のλ−耐性株;Messing et al.,Nucl.Acids.Res.
９（２）:309-321（1981）］、および大腸菌K12株294
（ATCC No.31446）が特に有用である。使用することが
できる他の微生物株には、大腸菌Ｂ、UM101および大腸
菌χ1776（ATCC No.31537）が含まれる。ここに挙げた
例は限定のためのものではなく例示である。
て得られる［Williams,Immunol.Today ８:298-303（19
87）およびその引例を参照］。通常、CD4の変異DNA配列
のクローニングのためには原核生物が用いられる。例え
ば、大腸菌株SR101［m13ファージを増殖させるための、
JM101のλ−耐性株;Messing et al.,Nucl.Acids.Res.
９（２）:309-321（1981）］、および大腸菌K12株294
（ATCC No.31446）が特に有用である。使用することが
できる他の微生物株には、大腸菌Ｂ、UM101および大腸
菌χ1776（ATCC No.31537）が含まれる。ここに挙げた
例は限定のためのものではなく例示である。
変異アドヘゾンをコードしているDNAは、発現のため
に、意図している宿主細胞に適合しうる種から得られる
プロモーターおよびコントロール配列を含有しているベ
クター中に挿入される。このベクターは、必ずしもそう
とは限らないが、複製部位ならびに形質転換細胞での表
現型選択を可能にする１またはそれ以上のマーカー配列
を担持しているのが普通である。例えば、通常、大腸菌
は大腸菌種から導かれるプラスミドであるpBR322の誘導
体を用いて形質転換される［Bolivar,et al.,Gene ２:
95（1977）］。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性のための遺伝子を含有しており、従って形質
転換細胞を同定するための容易な手段を与える。また、
pBR322プラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、
組換えDNA構築の際に通常用いられるプロモーターおよ
びその他のコントロール要素を含んでいるか、または含
むように修飾されなければならない。
に、意図している宿主細胞に適合しうる種から得られる
プロモーターおよびコントロール配列を含有しているベ
クター中に挿入される。このベクターは、必ずしもそう
とは限らないが、複製部位ならびに形質転換細胞での表
現型選択を可能にする１またはそれ以上のマーカー配列
を担持しているのが普通である。例えば、通常、大腸菌
は大腸菌種から導かれるプラスミドであるpBR322の誘導
体を用いて形質転換される［Bolivar,et al.,Gene ２:
95（1977）］。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性のための遺伝子を含有しており、従って形質
転換細胞を同定するための容易な手段を与える。また、
pBR322プラスミドまたはその他の微生物プラスミドは、
組換えDNA構築の際に通常用いられるプロモーターおよ
びその他のコントロール要素を含んでいるか、または含
むように修飾されなければならない。
原核性宿主で用いるのに適したプロモーターを例示す
ると、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター
系［Chang et al.,Nature 275:615（1978）；およびGo
eddel et al.,Nature 281:544（1979）］、アルカリホ
スファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系
［Goeddel,Nucleic Acids Res. ８:4057（1980）およ
びEPO出願公開No.36,776］、およびtacプロモーターな
どのハイブリッドプロモーター［H.de Boar et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25（1983）］が含まれ
る。しかし、その他の機能的な細菌性プロモーターも適
している。これらのヌクレオチド配列は広く知られてお
り、従って当業者はこれらを、あらゆる必要な制限部位
を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて、
アドヘゾン変異体をコードしているDNAに機能的に連結
することができる［Siebenlist et al.,Cell 20:269
（1980）］。また、細菌性の系で用いるためのプロモー
ターは、抗原をコードしているDNAに機能的に結合させ
たシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を含有している。
ると、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター
系［Chang et al.,Nature 275:615（1978）；およびGo
eddel et al.,Nature 281:544（1979）］、アルカリホ
スファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系
［Goeddel,Nucleic Acids Res. ８:4057（1980）およ
びEPO出願公開No.36,776］、およびtacプロモーターな
どのハイブリッドプロモーター［H.de Boar et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25（1983）］が含まれ
る。しかし、その他の機能的な細菌性プロモーターも適
している。これらのヌクレオチド配列は広く知られてお
り、従って当業者はこれらを、あらゆる必要な制限部位
を供給するためのリンカーまたはアダプターを用いて、
アドヘゾン変異体をコードしているDNAに機能的に連結
することができる［Siebenlist et al.,Cell 20:269
（1980）］。また、細菌性の系で用いるためのプロモー
ターは、抗原をコードしているDNAに機能的に結合させ
たシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列を含有している。
原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物もク
ローニングまたは発現宿主として有用である。サッカロ
マイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）
または普通のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生
物であるが、多数のその他の株も普通に用いることがで
きる。サッカロマイセス属中での発現のためには、例え
ば、プラスミドYRp7［Stinchcomb et al.,Nature 282:
39（1979）;Kingsman et al.,Gene ７:141（1979）;Ts
chemper et al.,Gene 10:157（1980）］が一般に用い
られる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖す
る能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC No.44076
またはPEP4-1［Jones,Genetics 85:12（1977）］のた
めの選択マーカーを与えるtrp1遺伝子を既に含有してい
る。酵母宿主細胞ゲノムの性質としてtrp1欠損が存在す
ると、トリプトファンの非存在下での増殖による効率的
な選択手段が与えられる。
ローニングまたは発現宿主として有用である。サッカロ
マイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）
または普通のパン酵母が最も普通に用いられる真核微生
物であるが、多数のその他の株も普通に用いることがで
きる。サッカロマイセス属中での発現のためには、例え
ば、プラスミドYRp7［Stinchcomb et al.,Nature 282:
39（1979）;Kingsman et al.,Gene ７:141（1979）;Ts
chemper et al.,Gene 10:157（1980）］が一般に用い
られる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖す
る能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC No.44076
またはPEP4-1［Jones,Genetics 85:12（1977）］のた
めの選択マーカーを与えるtrp1遺伝子を既に含有してい
る。酵母宿主細胞ゲノムの性質としてtrp1欠損が存在す
ると、トリプトファンの非存在下での増殖による効率的
な選択手段が与えられる。
酵母宿主で用いるのに適した促進配列には、３−ホス
ホグリセレート キナーゼ［Hitzeman et al.,J.Biol.C
hem. 255:2073（1980）］、またはその他のグルコース
分解酵素［Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg. ７:149（1
968）；およびHolland,Biochemistry 17:4900（197
8）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピ
ルベート デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、３
−ホスホグリセレート ムターゼ、ピルベート キナー
ゼ、トリオセホスフェート イソメラーゼ、ホスホグル
コース イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプ
ロモーターが含まれる。
ホグリセレート キナーゼ［Hitzeman et al.,J.Biol.C
hem. 255:2073（1980）］、またはその他のグルコース
分解酵素［Hess et al.,J.Adv.Enzyme Reg. ７:149（1
968）；およびHolland,Biochemistry 17:4900（197
8）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピ
ルベート デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェート イソメラーゼ、３
−ホスホグリセレート ムターゼ、ピルベート キナー
ゼ、トリオセホスフェート イソメラーゼ、ホスホグル
コース イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのプ
ロモーターが含まれる。
増殖条件によってコントロールされる転写の別の利点
を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する
分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
およびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモータ
ー領域である。酵母発現において用いるのに適したベク
ターおよびプロモーターはR.Hitzeman et al.（欧州特
許公開No.73,657A）がさらに開示している。また、酵母
エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのが好
都合である。
を有している誘導性プロモーターであるその他の酵母プ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
トクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する
分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース
およびガラクトース利用に関与する酵素群のプロモータ
ー領域である。酵母発現において用いるのに適したベク
ターおよびプロモーターはR.Hitzeman et al.（欧州特
許公開No.73,657A）がさらに開示している。また、酵母
エンハンサーを酵母プロモーターとともに用いるのが好
都合である。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写をコントロ
ールするためのプロモーターは、種々の供給源、例えば
ポリオーマ、サルウイルス40（SV40）、アデノウイル
ス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ま
しくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムか
ら、または、例えばβアクチンプロモーターなどの異種
の哺乳動物プロモーターから得ることができる。SV40ウ
イルスの初期および後期プロモーターは、SV40のウイル
ス性複製起源をも含有するSV40の制限フラグメントとし
て好都合に得られる［Fiers et al.,Nature 273:113
（1978）］。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモ
ーターはHindIII E制限フラグメントとして都合よく得
られる［Greenaway,P.J. et al.,Gene 18:355-360（19
82）］。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモ
ーターが本発明において有用であるのは勿論である。
ールするためのプロモーターは、種々の供給源、例えば
ポリオーマ、サルウイルス40（SV40）、アデノウイル
ス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ま
しくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムか
ら、または、例えばβアクチンプロモーターなどの異種
の哺乳動物プロモーターから得ることができる。SV40ウ
イルスの初期および後期プロモーターは、SV40のウイル
ス性複製起源をも含有するSV40の制限フラグメントとし
て好都合に得られる［Fiers et al.,Nature 273:113
（1978）］。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモ
ーターはHindIII E制限フラグメントとして都合よく得
られる［Greenaway,P.J. et al.,Gene 18:355-360（19
82）］。また、宿主細胞またはその関連種由来のプロモ
ーターが本発明において有用であるのは勿論である。
高等真核生物中でのDNAの転写は、ベクター中にエン
ハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハ
ンサーは、プロモーターの転写開始能力を増強するよう
に作用する、通常は約10〜300bpのシス作用性のDNA要素
である。エンハンサーは、比較的その配向および位置に
は依存せず、転写単位の５′［Laimins,L. et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci. 78:993（1981）］および３′［Lusk
y,M.L. et al.,Mol.Cell Bio. ３:1108（1983）］に、
イントロン中［Banerji,J.L. et al.,Cell 33:729（19
83）］に、ならびに暗号配列それ自体の中［Osborne,T.
F. et al.,Mol.Cell Bio. ４:1293（1984）］に見い出
されている。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動
物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−
フェトプロテインおよびインスリン）から既知となって
いる。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを
用いるのが普通である。その例には、SV40の複製起源の
後期側のエンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマの
複製起源の後期側のエンハンサー、およびアデノウイル
スのエンハンサーが含まれる。
ハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハ
ンサーは、プロモーターの転写開始能力を増強するよう
に作用する、通常は約10〜300bpのシス作用性のDNA要素
である。エンハンサーは、比較的その配向および位置に
は依存せず、転写単位の５′［Laimins,L. et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci. 78:993（1981）］および３′［Lusk
y,M.L. et al.,Mol.Cell Bio. ３:1108（1983）］に、
イントロン中［Banerji,J.L. et al.,Cell 33:729（19
83）］に、ならびに暗号配列それ自体の中［Osborne,T.
F. et al.,Mol.Cell Bio. ４:1293（1984）］に見い出
されている。現在では多数のエンハンサー配列が哺乳動
物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−
フェトプロテインおよびインスリン）から既知となって
いる。しかし、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを
用いるのが普通である。その例には、SV40の複製起源の
後期側のエンハンサー（bp100〜270）、サイトメガロウ
イルスの初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマの
複製起源の後期側のエンハンサー、およびアデノウイル
スのエンハンサーが含まれる。
また、真核宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動
物、ヒト、または有核細胞）で用いる発現ベクターは、
mRNAの発現に影響を及ぼす転写の終止に必要な配列をも
含んでいるであろう。これらの領域は、アドヘゾンをコ
ードしているmRNAの非翻訳化部分中のポリアデニル化さ
れたセグメントとして転写される。
物、ヒト、または有核細胞）で用いる発現ベクターは、
mRNAの発現に影響を及ぼす転写の終止に必要な配列をも
含んでいるであろう。これらの領域は、アドヘゾンをコ
ードしているmRNAの非翻訳化部分中のポリアデニル化さ
れたセグメントとして転写される。
通常、発現ベクター系は、選択マーカーとも呼ばれる
選択遺伝子を含んでいるであろう。哺乳動物細胞に適し
た選択マーカーの例はジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、
チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このよう
な選択マーカーが成功裏に哺乳動物宿主細胞中に移され
ると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置
かれたときに生存することができる。２種類の広く用い
られている別カテゴリーの選択方法が存在する。第１の
カテゴリーは細胞の代謝に基づくものであり、追加培地
とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異セルラインを
用いるものである。例を２つ挙げると、CHO DHFR-細胞
とマウスLTK-細胞である。これらの細胞は、チミジンま
たはヒポキサンチンなどの栄養素の追加なしで増殖する
能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド
合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので、こ
の欠けたヌクレオチドが追加培地中に与えられなければ
生存することができない。この培地を補足するための別
法は、無傷のDHFRまたはTK遺伝子を欠いている細胞にそ
れぞれの遺伝子を導入し、こうしてこれらの成長必要条
件を変えることである。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換
されていない個々の細胞は未追加の培地で生存すること
ができないであろう。
選択遺伝子を含んでいるであろう。哺乳動物細胞に適し
た選択マーカーの例はジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、
チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。このよう
な選択マーカーが成功裏に哺乳動物宿主細胞中に移され
ると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置
かれたときに生存することができる。２種類の広く用い
られている別カテゴリーの選択方法が存在する。第１の
カテゴリーは細胞の代謝に基づくものであり、追加培地
とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異セルラインを
用いるものである。例を２つ挙げると、CHO DHFR-細胞
とマウスLTK-細胞である。これらの細胞は、チミジンま
たはヒポキサンチンなどの栄養素の追加なしで増殖する
能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド
合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので、こ
の欠けたヌクレオチドが追加培地中に与えられなければ
生存することができない。この培地を補足するための別
法は、無傷のDHFRまたはTK遺伝子を欠いている細胞にそ
れぞれの遺伝子を導入し、こうしてこれらの成長必要条
件を変えることである。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換
されていない個々の細胞は未追加の培地で生存すること
ができないであろう。
第２のカテゴリーは、あらゆる種類の細胞で用いられ
る選択方法である優性選択法であり、突然変異セルライ
ンの使用を必要としない。通常、これらの方法は宿主細
胞の増殖を阻害する薬物を用いる。新規遺伝子を有する
これらの細胞は薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、
選択に耐えるであろう。このような優性選択の例は、薬
物ネオマイシン［Southern P.およびBerg P.,J.Molec.A
ppl.Genet. １:327（1982）］、ミコフェノール酸［Mu
lligan,R.C.およびBerg P.,Science 209:1422（198
0）］、またはハイグロマイシン［Sugden,B. et al.,Mo
l.Cell.Biol. ５:410-413（1985）］を用いるものであ
る。ここに挙げた３つの例は、真核性コントロールのも
とで細菌性遺伝子を用いて、適切な薬物G418もしくはネ
オマイシン（ジェネチシン;geneticin）、xgpt（ミコフ
ェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を
それぞれ付与する。
る選択方法である優性選択法であり、突然変異セルライ
ンの使用を必要としない。通常、これらの方法は宿主細
胞の増殖を阻害する薬物を用いる。新規遺伝子を有する
これらの細胞は薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、
選択に耐えるであろう。このような優性選択の例は、薬
物ネオマイシン［Southern P.およびBerg P.,J.Molec.A
ppl.Genet. １:327（1982）］、ミコフェノール酸［Mu
lligan,R.C.およびBerg P.,Science 209:1422（198
0）］、またはハイグロマイシン［Sugden,B. et al.,Mo
l.Cell.Biol. ５:410-413（1985）］を用いるものであ
る。ここに挙げた３つの例は、真核性コントロールのも
とで細菌性遺伝子を用いて、適切な薬物G418もしくはネ
オマイシン（ジェネチシン;geneticin）、xgpt（ミコフ
ェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を
それぞれ付与する。
「増幅」とは、細胞の染色体DNA中の隔離領域の増加
または複製を意味する。増幅は、DHFRを不活化する例え
ばメトトレキセート（MTX）などの選択薬物を用いて行
う。増幅すなわちDHFR遺伝子の連続コピーの調製は、MT
X量が増加したときに、産生されるDHFR量が増加する結
果になる。内生DHFRの存在にもかかわらず、もっと多量
のMTXを培地に加えることによって増幅圧がかけられ
る。所望のタンパク質をコードしているDNAおよび同時
組込みが可能なDHFRまたは増幅遺伝子を有するプラスミ
ドで、哺乳動物宿主細胞を同時トランスフェクションす
ることによって、所望の遺伝子の増幅を行うことができ
る。さらに高濃度のMTXの存在下で増殖することができ
る細胞だけを選択することによって、細胞がなお一層の
DHFRを要求するのを確実なものにする（この要求は選択
遺伝子の複製によって満たされる）。所望の異種タンパ
ク質をコードしている遺伝子が選択遺伝子と同時組込み
される限り、この遺伝子の複製は、所望のタンパク質を
コードしている遺伝子の複製を生じる。この結果、所望
の異種タンパク質をコードしている遺伝子のコピーの増
加、即ち遺伝子の増幅によって、さらに多量の所望の異
種タンパク質が発現されることになる。
または複製を意味する。増幅は、DHFRを不活化する例え
ばメトトレキセート（MTX）などの選択薬物を用いて行
う。増幅すなわちDHFR遺伝子の連続コピーの調製は、MT
X量が増加したときに、産生されるDHFR量が増加する結
果になる。内生DHFRの存在にもかかわらず、もっと多量
のMTXを培地に加えることによって増幅圧がかけられ
る。所望のタンパク質をコードしているDNAおよび同時
組込みが可能なDHFRまたは増幅遺伝子を有するプラスミ
ドで、哺乳動物宿主細胞を同時トランスフェクションす
ることによって、所望の遺伝子の増幅を行うことができ
る。さらに高濃度のMTXの存在下で増殖することができ
る細胞だけを選択することによって、細胞がなお一層の
DHFRを要求するのを確実なものにする（この要求は選択
遺伝子の複製によって満たされる）。所望の異種タンパ
ク質をコードしている遺伝子が選択遺伝子と同時組込み
される限り、この遺伝子の複製は、所望のタンパク質を
コードしている遺伝子の複製を生じる。この結果、所望
の異種タンパク質をコードしている遺伝子のコピーの増
加、即ち遺伝子の増幅によって、さらに多量の所望の異
種タンパク質が発現されることになる。
本発明のCD抗原変異体を発現させるために好ましい宿
主細胞は哺乳動物セルラインであり、その例には次のも
のが含まれる:SV40で形質転換されたサル腎CV1ライン
［COS-7、ATCC CRL 1651］；ヒト胚腎ライン［293、Gra
ham,F.L.et al.,J.Gen Virol. 36:59（1977）、および
293S細胞（一層良好な懸濁増殖に対して選択した293サ
ブクローン）］；新生ハムスター腎細胞［BHK、ATCC CC
L 10］；チャイニーズハムスター卵巣細胞−DHFR［CH
O、UrlaubおよびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4
216（1980）］；マウス セルトーリ細胞［TM4、Mathe
r,J.P.,Biol.Reprod. 23:243-251（1980）］；サル腎
細胞［CV1、ATCC CCL 70］；アフリカミドリザル腎細胞
［VERO-76、ATCC CRL-1587］；ヒト子宮頸癌細胞［HEL
A、ATCC CCL 2］；イヌ腎細胞［MDCK、ATCC CCL 34］；
バッファロラット肝細胞［BRL 3A、ATCC CRL 1442］；
ヒト肺細胞［W138、ATCC CCL 75］；ヒト肝細胞［HepG
2、HB 8065］；マウス乳腫瘍［MMT 060562、ATCC CCL51
細胞］；およびTRI細胞［Mather,J.P.et al.,Annals N.
Y.Acad.Sci. 383:44-68（1982）］。
主細胞は哺乳動物セルラインであり、その例には次のも
のが含まれる:SV40で形質転換されたサル腎CV1ライン
［COS-7、ATCC CRL 1651］；ヒト胚腎ライン［293、Gra
ham,F.L.et al.,J.Gen Virol. 36:59（1977）、および
293S細胞（一層良好な懸濁増殖に対して選択した293サ
ブクローン）］；新生ハムスター腎細胞［BHK、ATCC CC
L 10］；チャイニーズハムスター卵巣細胞−DHFR［CH
O、UrlaubおよびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4
216（1980）］；マウス セルトーリ細胞［TM4、Mathe
r,J.P.,Biol.Reprod. 23:243-251（1980）］；サル腎
細胞［CV1、ATCC CCL 70］；アフリカミドリザル腎細胞
［VERO-76、ATCC CRL-1587］；ヒト子宮頸癌細胞［HEL
A、ATCC CCL 2］；イヌ腎細胞［MDCK、ATCC CCL 34］；
バッファロラット肝細胞［BRL 3A、ATCC CRL 1442］；
ヒト肺細胞［W138、ATCC CCL 75］；ヒト肝細胞［HepG
2、HB 8065］；マウス乳腫瘍［MMT 060562、ATCC CCL51
細胞］；およびTRI細胞［Mather,J.P.et al.,Annals N.
Y.Acad.Sci. 383:44-68（1982）］。
「形質転換」とは、染色体外要素として、または染色
体組込みのいずれかによって、DNAが複製可能なように
生物中にDNAを導入することを意味する。宿主細胞の形
質転換に適した方法の１つは、Graham,F.およびvan der
Eb,A.,Virology 52:456-457（1973）の方法である。
しかし、細胞中にDNAを導入するための他の方法、例え
ば核注射による方法またはプロトプラスト融合による方
法なども用いることができる。原核細胞または強固な細
胞壁を有する細胞を宿主として用いるときには、好まし
いトランスフェクション方法は、Cohen,F.N.et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110（1972）が記載している
塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。
体組込みのいずれかによって、DNAが複製可能なように
生物中にDNAを導入することを意味する。宿主細胞の形
質転換に適した方法の１つは、Graham,F.およびvan der
Eb,A.,Virology 52:456-457（1973）の方法である。
しかし、細胞中にDNAを導入するための他の方法、例え
ば核注射による方法またはプロトプラスト融合による方
法なども用いることができる。原核細胞または強固な細
胞壁を有する細胞を宿主として用いるときには、好まし
いトランスフェクション方法は、Cohen,F.N.et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110（1972）が記載している
塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。
所望の暗号およびコントロール配列を含有している適
切なベクターの構築には、通常の操作のライゲート法を
用いる。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを
切断し、加工し、そして望ましい形態に再ライゲートし
て必要なプラスミドを得る。適当な方法は、本明細書中
で説明する構築に対して周知である［例えば、Maniati
s,T.et al.,Molecular Cloning, 133-134 Cold Spring
Harbor（1982）；“Current Protocols in Molecular B
iology",Ausubel et al.編（1987）,Greene Publishing
Associates ＆ Wiley−Interscience版を参照］。
切なベクターの構築には、通常の操作のライゲート法を
用いる。単離したプラスミドまたはDNAフラグメントを
切断し、加工し、そして望ましい形態に再ライゲートし
て必要なプラスミドを得る。適当な方法は、本明細書中
で説明する構築に対して周知である［例えば、Maniati
s,T.et al.,Molecular Cloning, 133-134 Cold Spring
Harbor（1982）；“Current Protocols in Molecular B
iology",Ausubel et al.編（1987）,Greene Publishing
Associates ＆ Wiley−Interscience版を参照］。
ライゲート混合物を用いて大腸菌K12株294（ATCC 314
46）を形質転換し、適当なところで成功裏の形質転換体
をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選
択し、形質転換体からプラスミドを調製し、次いで制限
酵素消化によって分析し、そして／またはMessing et a
l.,Nucleic Acids Res. ９:309（1981）の方法またはM
axam et al.,Methods in Enzymology 65:499（1980）
の方法によって配列決定することにより、正しいプラス
ミド配列を確認する。
46）を形質転換し、適当なところで成功裏の形質転換体
をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選
択し、形質転換体からプラスミドを調製し、次いで制限
酵素消化によって分析し、そして／またはMessing et a
l.,Nucleic Acids Res. ９:309（1981）の方法またはM
axam et al.,Methods in Enzymology 65:499（1980）
の方法によって配列決定することにより、正しいプラス
ミド配列を確認する。
宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換する。次
いで、これを、例えばプロモーターの誘導、形質転換体
の選択、または遺伝子の増幅のための物質を含む適当な
培養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、発現
のために選択した宿主細胞でこれまで用いられている条
件であり、当業者には明らかであろう。
いで、これを、例えばプロモーターの誘導、形質転換体
の選択、または遺伝子の増幅のための物質を含む適当な
培養培地で培養する。温度、pHなどの培養条件は、発現
のために選択した宿主細胞でこれまで用いられている条
件であり、当業者には明らかであろう。
分泌されたアドヘゾン変異体は、組換え宿主の培養上
清または溶菌液から回収し、精製する。通常、この上清
は、限外濾過によって濃縮し、リガンドアフィニティー
または免疫アフィニティーマトリックスと接触させてア
ドヘゾン変異体を吸着させ、そしてマトリックスから溶
離する。所望により、アドヘゾンをイオン交換クロマト
グラフィーによって精製する。
清または溶菌液から回収し、精製する。通常、この上清
は、限外濾過によって濃縮し、リガンドアフィニティー
または免疫アフィニティーマトリックスと接触させてア
ドヘゾン変異体を吸着させ、そしてマトリックスから溶
離する。所望により、アドヘゾンをイオン交換クロマト
グラフィーによって精製する。
驚くべきことに、培養培地からの可溶性CD4アドヘゾ
ンの精製は予想外に困難であった。抗原の疎水性トラン
スメンブラン領域が削除されているにもかかわらず、こ
の抗原は、1000xgでの遠心によって懸濁液から容易に除
去することができ、かつ限外濾過メンブランなどの表面
を強く被覆する集合体を形成する強い傾向を示した。こ
れは、アルブミンまたはその他の血清タンパク質（通
常、粗製の調製物中に存在する）の濃度が、特定のレベ
ル（そのレベル以下では切り取りが行われた抗原はもは
や可溶性ではない）まで減少したことによるようであ
る。この現象は、CD4アドヘゾンを低いpH（＜約pH4）に
することによって増強されるようである。このため、分
離操作（特に、免疫アフィニティーなどの酸溶離を用い
るものなど）には、溶離がほぼ中性に維持されるよう
に、または直ちにほぼ中性に戻されるように修飾が加え
られるべきである。さらに、界面活性剤、例えばTween
80などのデタージェントを、分離工程中、抗原とともに
含有させるべきである。最終の精製産物は、アルブミン
などの予め決めたタンパク質および／またはデタージェ
ントで安定化される。
ンの精製は予想外に困難であった。抗原の疎水性トラン
スメンブラン領域が削除されているにもかかわらず、こ
の抗原は、1000xgでの遠心によって懸濁液から容易に除
去することができ、かつ限外濾過メンブランなどの表面
を強く被覆する集合体を形成する強い傾向を示した。こ
れは、アルブミンまたはその他の血清タンパク質（通
常、粗製の調製物中に存在する）の濃度が、特定のレベ
ル（そのレベル以下では切り取りが行われた抗原はもは
や可溶性ではない）まで減少したことによるようであ
る。この現象は、CD4アドヘゾンを低いpH（＜約pH4）に
することによって増強されるようである。このため、分
離操作（特に、免疫アフィニティーなどの酸溶離を用い
るものなど）には、溶離がほぼ中性に維持されるよう
に、または直ちにほぼ中性に戻されるように修飾が加え
られるべきである。さらに、界面活性剤、例えばTween
80などのデタージェントを、分離工程中、抗原とともに
含有させるべきである。最終の精製産物は、アルブミン
などの予め決めたタンパク質および／またはデタージェ
ントで安定化される。
精製されたアドヘゾンは通常の薬理学的に許容しうる
賦形剤中に製剤化される。
賦形剤中に製剤化される。
約100ng可溶性CD4アドヘゾン/ml血漿を越える濃度を
維持することができる用量で、HIV感染の患者に投与す
る。分子量の異なるCD4アドヘゾン変異体のためには、
天然（膜結合）および可溶性受容体との化学量論的な等
価性を得るため、血漿1mlあたり約2pモルの可溶性受容
体が、最初は臨床的に選ばれるであろう。可溶性CD4の
用量は、通常、100μg/kg患者体重／日である。
維持することができる用量で、HIV感染の患者に投与す
る。分子量の異なるCD4アドヘゾン変異体のためには、
天然（膜結合）および可溶性受容体との化学量論的な等
価性を得るため、血漿1mlあたり約2pモルの可溶性受容
体が、最初は臨床的に選ばれるであろう。可溶性CD4の
用量は、通常、100μg/kg患者体重／日である。
治療用のCD4変異体は、AZT、中和抗体および免疫サイ
トトキシン、gp120フラグメントおよびワクチンを含
む、AIDSを治療するための他の薬物および治療法ととも
に用いられる。
トトキシン、gp120フラグメントおよびワクチンを含
む、AIDSを治療するための他の薬物および治療法ととも
に用いられる。
後記実施例の理解を容易にするため、いくつかの頻繁
に出てくる方法および／または用語を説明する。
に出てくる方法および／または用語を説明する。
「プラスミド」は、小文字ｐ、それに先立つおよび／
またはそれに続く大文字、および／または数字で表す。
本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能である
か、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、また
は入手可能なプラスミドから公知の方法に従って構築す
ることができる。さらに、記載されたプラスミドと等価
なプラスミドが当分野で知られているが、これらは当業
者には明らかであろう。
またはそれに続く大文字、および／または数字で表す。
本発明の出発プラスミドは、市販品から入手可能である
か、制限のない状態でだれでも入手可能であるか、また
は入手可能なプラスミドから公知の方法に従って構築す
ることができる。さらに、記載されたプラスミドと等価
なプラスミドが当分野で知られているが、これらは当業
者には明らかであろう。
DNAの「消化」とは、DNA中のある配列でのみ作用する
制限酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。本発明で
用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能であ
り、それらの反応条件、補助因子、およびその他の必要
条件は当業者には既知のものを用いた。分析用には、通
常、１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメントを約20
μｌの緩衝液中、約２単位の酵素とともに用いる。プラ
スミド構築のためのDNAフラグメントを単離するために
は、通常、５〜50μｇのDNAをもっと大きな容量中、20
〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のための
適切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されて
いる。通常は37℃で約１時間のインキュベート時間を用
いたが、供給元の指示に従って変えてもよい。消化の
後、反応液を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて所望のフラグメントを単離する。
制限酵素によるDNAの触媒的切断を意味する。本発明で
用いられる多種の制限酵素は市販品から入手可能であ
り、それらの反応条件、補助因子、およびその他の必要
条件は当業者には既知のものを用いた。分析用には、通
常、１μｇのプラスミドまたはDNAフラグメントを約20
μｌの緩衝液中、約２単位の酵素とともに用いる。プラ
スミド構築のためのDNAフラグメントを単離するために
は、通常、５〜50μｇのDNAをもっと大きな容量中、20
〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のための
適切な緩衝液および基質量は製造元によって指定されて
いる。通常は37℃で約１時間のインキュベート時間を用
いたが、供給元の指示に従って変えてもよい。消化の
後、反応液を直接ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて所望のフラグメントを単離する。
制限消化物からのあるDNAフラグメントの「回収」ま
たは「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド
またはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と
既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較
による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを
含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのDN
Aの分離を意味する。この方法は広く知られている［Law
n,R.et al.,Nucleic Acids Res. ９:6103-6114（198
1）、およびGoeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.
８:4057（1980）］。
たは「単離」とは、電気泳動によるポリアクリルアミド
またはアガロースゲルでの消化物の分離、その移動度と
既知分子量のマーカーDNAフラグメントの移動度の比較
による目的フラグメントの同定、目的のフラグメントを
含有しているゲル切片の取り出し、およびゲルからのDN
Aの分離を意味する。この方法は広く知られている［Law
n,R.et al.,Nucleic Acids Res. ９:6103-6114（198
1）、およびGoeddel,D.et al.,Nucleic Acids Res.
８:4057（1980）］。
「脱ホスホリル化」とは、細菌性アルカリホスファタ
ーゼ（BAP）による処理によって末端５′ホスフェート
を除去することを意味する。この操作は、DNAフラグメ
ントの２つの制限切断末端が「環状化」または閉じた環
を形成すること（別のDNAフラグメントのこの制限部位
への挿入を妨げる）を防止する。脱ホスホリル化および
その他の組換え操作の方法および試薬は通常のものであ
る。BAPを用いる反応は、酵素調製物中に存在している
こともあるあらゆるエキソヌクレアーゼの活性を抑制す
るために、50mMトリス中、68℃で行う。反応は１時間行
う。反応の後、DNAフラグメントをゲル精製する。
ーゼ（BAP）による処理によって末端５′ホスフェート
を除去することを意味する。この操作は、DNAフラグメ
ントの２つの制限切断末端が「環状化」または閉じた環
を形成すること（別のDNAフラグメントのこの制限部位
への挿入を妨げる）を防止する。脱ホスホリル化および
その他の組換え操作の方法および試薬は通常のものであ
る。BAPを用いる反応は、酵素調製物中に存在している
こともあるあらゆるエキソヌクレアーゼの活性を抑制す
るために、50mMトリス中、68℃で行う。反応は１時間行
う。反応の後、DNAフラグメントをゲル精製する。
「ライゲート（連結）」とは、２つの２本鎖核酸フラ
グメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程
を指す（Maniatis,T.et al.,p.146;同上）。特に記さな
ければライゲートは、ライゲートしようとするほぼ等し
い量のDNAフラグメント（0.5μｇ）に対してT4 DNAリガ
ーゼ（「リガーゼ」）（10単位）を用い、既知の緩衝液
および条件を用いて行う。
グメントの間でホスホジエステル結合を形成させる過程
を指す（Maniatis,T.et al.,p.146;同上）。特に記さな
ければライゲートは、ライゲートしようとするほぼ等し
い量のDNAフラグメント（0.5μｇ）に対してT4 DNAリガ
ーゼ（「リガーゼ」）（10単位）を用い、既知の緩衝液
および条件を用いて行う。
「充填」または「平滑化」は、制限酵素切断した核酸
の付着末端の１本鎖末端が２本鎖に変換される過程を意
味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端が形
成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の
制限酵素によって創製される末端に付着するかもしれな
い制限切断末端を、いずれかの平滑切断する制限エンド
ヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適
合する末端に変換するための多用途の方法である。通
常、平滑化は、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、5
0mM NaCl、10mMトリス（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウ・フラグメント（８単位）および４種
のデオキシヌクレオシド三リン酸（それぞれ250μＭ）
の存在下、約37℃で標的DNA（２〜15μｇ）をインキュ
ベートすることによって行う。通常、このインキュベー
トはフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエタノ
ール沈澱によって30分後に停止させる。
の付着末端の１本鎖末端が２本鎖に変換される過程を意
味する。これにより付着末端が削除され、平滑末端が形
成される。この方法は、１つだけまたはいくつかの別の
制限酵素によって創製される末端に付着するかもしれな
い制限切断末端を、いずれかの平滑切断する制限エンド
ヌクレアーゼの末端または他の充填された付着末端と適
合する末端に変換するための多用途の方法である。通
常、平滑化は、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、5
0mM NaCl、10mMトリス（pH7.5）緩衝液中、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノウ・フラグメント（８単位）および４種
のデオキシヌクレオシド三リン酸（それぞれ250μＭ）
の存在下、約37℃で標的DNA（２〜15μｇ）をインキュ
ベートすることによって行う。通常、このインキュベー
トはフェノールおよびクロロホルム抽出ならびにエタノ
ール沈澱によって30分後に停止させる。
以下に挙げる実施例は、本発明を実施する際に今のと
ころ最良である態様を単に説明するためのものであり、
本発明を限定するものではない。
ころ最良である態様を単に説明するためのものであり、
本発明を限定するものではない。
実施例１ 天然のCD4および分泌型誘導体の発現のため
のベクターの構築 セクション１ ヒトCD4の組換え合成に用いたプラスミドはpSVeCD4DH
FRであった。このプラスミドは次のように構築した。
のベクターの構築 セクション１ ヒトCD4の組換え合成に用いたプラスミドはpSVeCD4DH
FRであった。このプラスミドは次のように構築した。
ヒトCD4の暗号配列の大部分を含むλCD4P1（公表され
た配列「Maddon et al.1985］に基づくオリゴヌクレオ
チドプローブを用いてヒト胎盤のcDNAライブラリーから
得た）をEcoRIで消化してcDNA挿入体を得た。このフラ
グメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回
収した（フラグメント１）。
た配列「Maddon et al.1985］に基づくオリゴヌクレオ
チドプローブを用いてヒト胎盤のcDNAライブラリーから
得た）をEcoRIで消化してcDNA挿入体を得た。このフラ
グメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回
収した（フラグメント１）。
pUC18をEcoRIで消化し、単一のフラグメントをポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって回収した（フラグメ
ント２）。フラグメント１をフラグメント２に連結し、
ライゲーション混合物を大腸菌株294中に導入した。形
質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐
性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体か
ら調製し、正しいDNAフラグメントの存在について制限
分析によりチェックした。このプラスミドをpUCCD4と命
名する。
クリルアミドゲル電気泳動によって回収した（フラグメ
ント２）。フラグメント１をフラグメント２に連結し、
ライゲーション混合物を大腸菌株294中に導入した。形
質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐
性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体か
ら調製し、正しいDNAフラグメントの存在について制限
分析によりチェックした。このプラスミドをpUCCD4と命
名する。
pSVeE′DHFR［Muesing et al.,Cell 48:691-701（19
87）］をKpnIおよびBamHIで消化し、大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）および４種類のdNTPで
平滑化した。pML-Ampr領域、SV40初期プロモーター、HI
V LTRおよびマウスDHFR遺伝子を含むフラグメント３を
ゲル電気泳動によって回収し、連結し、そしてライゲー
ション混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培
養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして耐性
コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から
調製し、BemHI制限部位の存在およびKpnI制限部位の非
存在について制限分析によりチェックした。このプラス
ミドをpSVeΔBKDHFRと命名する。このプラスミドは、適
切なセルラインへのトランスフェクションに続いて、Ec
oRI-BamHIフラグメントがSV40初期プロモーターの後に
挿入され、そしてそのコントロール下に転写されること
を可能にする。
87）］をKpnIおよびBamHIで消化し、大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ（クレノウフラグメント）および４種類のdNTPで
平滑化した。pML-Ampr領域、SV40初期プロモーター、HI
V LTRおよびマウスDHFR遺伝子を含むフラグメント３を
ゲル電気泳動によって回収し、連結し、そしてライゲー
ション混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培
養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして耐性
コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から
調製し、BemHI制限部位の存在およびKpnI制限部位の非
存在について制限分析によりチェックした。このプラス
ミドをpSVeΔBKDHFRと命名する。このプラスミドは、適
切なセルラインへのトランスフェクションに続いて、Ec
oRI-BamHIフラグメントがSV40初期プロモーターの後に
挿入され、そしてそのコントロール下に転写されること
を可能にする。
合成オリゴヌクレオチド（アダプター１−8;下記）を
調製し、CD4翻訳の開始コドンの５′側76bpからイニシ
エーターの３′側121bpのRsaI制限部位までを延長した
（EcoRI制限フラグメントに連結することができる末端
を得るためにセンス鎖の５′末端の配列AATTを有す
る）。これらのオリゴヌクレオチドを連結し、完全な配
列を含む204bpのフラグメントをゲル電気泳動によって
回収した（フラグメント４）。
調製し、CD4翻訳の開始コドンの５′側76bpからイニシ
エーターの３′側121bpのRsaI制限部位までを延長した
（EcoRI制限フラグメントに連結することができる末端
を得るためにセンス鎖の５′末端の配列AATTを有す
る）。これらのオリゴヌクレオチドを連結し、完全な配
列を含む204bpのフラグメントをゲル電気泳動によって
回収した（フラグメント４）。
pUCCD4をRsaIおよびSstIで消化し、CD4暗号配列の一
部を含む401bpフラグメントをゲル電気泳動によって回
収した（フラグメント５）。pUC18をEcoRIおよびSstIで
消化し、プラスミドの大部分を含むフラグメントをゲル
電気泳動によって回収した（フラグメント６）。フラグ
メント４および５をフラグメント６に連結し、ライゲー
ション混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培
養物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製
し、正しいフラグメントの存在について制限分析により
チェックした。挿入された合成DNAの配列は、いくつか
の形質転換体から605bpのEcoRI-SstIフラグメントを切
り取り、そして同じ酵素で消化しておいたM13mp19にそ
れらを連結することによってチェックした。大腸菌株JM
101への導入の後、１本鎖DNAを調製し、そして配列決定
した。正しい配列を含む１つのプラスミドを選択し、pC
D4intと命名した。
部を含む401bpフラグメントをゲル電気泳動によって回
収した（フラグメント５）。pUC18をEcoRIおよびSstIで
消化し、プラスミドの大部分を含むフラグメントをゲル
電気泳動によって回収した（フラグメント６）。フラグ
メント４および５をフラグメント６に連結し、ライゲー
ション混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培
養物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニ
ーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製
し、正しいフラグメントの存在について制限分析により
チェックした。挿入された合成DNAの配列は、いくつか
の形質転換体から605bpのEcoRI-SstIフラグメントを切
り取り、そして同じ酵素で消化しておいたM13mp19にそ
れらを連結することによってチェックした。大腸菌株JM
101への導入の後、１本鎖DNAを調製し、そして配列決定
した。正しい配列を含む１つのプラスミドを選択し、pC
D4intと命名した。
pCD4intをEcoRIおよびSstIで消化し、CD4暗号領域の
５′末端を含むフラグメント７をゲル電気泳動によって
回収した。pUCCD4をSstIおよびBamHIで消化し、CD4暗号
領域の残りを含む1139bpフラグメントをゲル電気泳動に
よって回収した（フラグメント８）。
５′末端を含むフラグメント７をゲル電気泳動によって
回収した。pUCCD4をSstIおよびBamHIで消化し、CD4暗号
領域の残りを含む1139bpフラグメントをゲル電気泳動に
よって回収した（フラグメント８）。
pSVeΔBKDHFRをEcoRIおよびBamHIで消化し、プラスミ
ドの大部分を含むフラグメント９を単離した。フラグメ
ント７、８および９を連結し、ライゲーション混合物を
大腸菌株294中に導入した。形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選択した。
プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しいフラグ
メントの存在につき制限分析によってチェックした。こ
のプラスミドをpSVeCD4DHFRと命名し、組換えの無傷のC
D4の合成のために使用した。
ドの大部分を含むフラグメント９を単離した。フラグメ
ント７、８および９を連結し、ライゲーション混合物を
大腸菌株294中に導入した。形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選択した。
プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しいフラグ
メントの存在につき制限分析によってチェックした。こ
のプラスミドをpSVeCD4DHFRと命名し、組換えの無傷のC
D4の合成のために使用した。
セクション２ 推定のトランスメンブランドメインおよび推定の細胞
質ドメインの大部分を欠くCD4誘導体を合成するために
プラスミドを構築した（Maddon et al.）。これは、こ
れらのドメインがCD4糖タンパク質を細胞膜にアンカー
させるという仮定およびこれらの削除が生成物の分泌を
導くであろうという仮定に基づき、分泌型のCD4を創製
するという目的で行った。このプラスミドをpSVeCD4ΔN
1aDHFRと命名し、次のように構築した。
質ドメインの大部分を欠くCD4誘導体を合成するために
プラスミドを構築した（Maddon et al.）。これは、こ
れらのドメインがCD4糖タンパク質を細胞膜にアンカー
させるという仮定およびこれらの削除が生成物の分泌を
導くであろうという仮定に基づき、分泌型のCD4を創製
するという目的で行った。このプラスミドをpSVeCD4ΔN
1aDHFRと命名し、次のように構築した。
pUCCD4をSstIおよびTaqIで消化し、531bpのフラグメ
ント（フラグメント10）を回収した。pUCCD4をNlaIIIお
よびTaqIで消化し、112bpのフラグメント（フラグメン
ト11）を回収した。pUCCD4をBamHIおよびNlaIIIで消化
し、301bpのフラグメント（フラグメント12）を回収し
た。pCD4intをSstIおよびBamHIで消化し、プラスミドの
大部分を含むフラグメント13を回収した。フラグメント
10、11および12をフラグメント13と連結し、ライゲーシ
ョン混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニー
を選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、
正しいフラグメントの存在につき制限分析によってチェ
ックした。いくつかの形質転換体からのプラスミドDNA
を配列決定し、195bpのNlaIIIフラグメントが削除され
ていること、および適切なリーディングフレームが回復
されていることを確認した。得られたプラスミドをpCD4
ΔNlaと命名した。
ント（フラグメント10）を回収した。pUCCD4をNlaIIIお
よびTaqIで消化し、112bpのフラグメント（フラグメン
ト11）を回収した。pUCCD4をBamHIおよびNlaIIIで消化
し、301bpのフラグメント（フラグメント12）を回収し
た。pCD4intをSstIおよびBamHIで消化し、プラスミドの
大部分を含むフラグメント13を回収した。フラグメント
10、11および12をフラグメント13と連結し、ライゲーシ
ョン混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニー
を選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、
正しいフラグメントの存在につき制限分析によってチェ
ックした。いくつかの形質転換体からのプラスミドDNA
を配列決定し、195bpのNlaIIIフラグメントが削除され
ていること、および適切なリーディングフレームが回復
されていることを確認した。得られたプラスミドをpCD4
ΔNlaと命名した。
pCD4ΔNlaをEcoRIおよびBamHIで消化し、トランスメ
ンブランおよび細胞質ドメインを欠くCD4誘導体の配列
を含んでいる1541bpのフラグメント（フラグメント14）
を回収し、フラグメント９に連結し、そしてライゲーシ
ョン混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニー
を選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、
正しいフラグメントの存在について制限分析によってチ
ェックした。このプラスミドをpSVeCD4ΔNlaDHFRと命名
した。
ンブランおよび細胞質ドメインを欠くCD4誘導体の配列
を含んでいる1541bpのフラグメント（フラグメント14）
を回収し、フラグメント９に連結し、そしてライゲーシ
ョン混合物を大腸菌株294中に導入した。形質転換培養
物をアンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニー
を選択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、
正しいフラグメントの存在について制限分析によってチ
ェックした。このプラスミドをpSVeCD4ΔNlaDHFRと命名
した。
HIV-Iポリペプチドを安定に発現するセルラインを樹
立するために用いた方法と同じ方法［Muesing,Smithお
よびCapon,Cell 48:6910701（1987）］によって、pSVe
CD4DHFRおよびpSVeCD4ΔNlaDHFRをCHO細胞中にトランス
フェクションした。これらの細胞を後記のような放射免
疫沈澱法によって産生について検定した。最初の実験に
おいては生成物が検出されなかったが、次の実験は、上
記の暗号セグメントが実にCHOおよび293細胞の両細胞に
おいて可溶性のCD4アドヘゾン変異体を合成させ得るこ
とを示した。
立するために用いた方法と同じ方法［Muesing,Smithお
よびCapon,Cell 48:6910701（1987）］によって、pSVe
CD4DHFRおよびpSVeCD4ΔNlaDHFRをCHO細胞中にトランス
フェクションした。これらの細胞を後記のような放射免
疫沈澱法によって産生について検定した。最初の実験に
おいては生成物が検出されなかったが、次の実験は、上
記の暗号セグメントが実にCHOおよび293細胞の両細胞に
おいて可溶性のCD4アドヘゾン変異体を合成させ得るこ
とを示した。
セクション３ 細胞質およびトランスメンブランドメインを完全に欠
くCDA変異体の合成および発現のために別の発現系を初
めに使用した。この系はサイトメガロウイルスプロモー
ターを使用し、そしてヒト起源の培養細胞において用い
ることができる。この系で用いるために構築した最初の
プラスミドはCD4の完全な暗号領域を含有しており、次
の研究において対照として機能するように意図されたも
のであった。これをpRKCD4と命名し、次のように構築し
た。
くCDA変異体の合成および発現のために別の発現系を初
めに使用した。この系はサイトメガロウイルスプロモー
ターを使用し、そしてヒト起源の培養細胞において用い
ることができる。この系で用いるために構築した最初の
プラスミドはCD4の完全な暗号領域を含有しており、次
の研究において対照として機能するように意図されたも
のであった。これをpRKCD4と命名し、次のように構築し
た。
pSVeCD4DHFRをEcoRIおよびBamHIで消化し、完全なCD4
暗号領域を含むフラグメント15を単離した。pRK5（U.S.
S.N.97,472;1987年９月11日出願）をEcoRIおよびBamHI
で消化し、プラスミドの大部分を含むフラグメント16を
ゲル電気泳動によって回収し、フラグメント15に連結
し、そしてライゲーション混合物を大腸菌株294中に導
入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで
培養し、耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形
質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在につき
制限分析によってチェックした。このプラスミドをpRKC
D4と命名する。
暗号領域を含むフラグメント15を単離した。pRK5（U.S.
S.N.97,472;1987年９月11日出願）をEcoRIおよびBamHI
で消化し、プラスミドの大部分を含むフラグメント16を
ゲル電気泳動によって回収し、フラグメント15に連結
し、そしてライゲーション混合物を大腸菌株294中に導
入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで
培養し、耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形
質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在につき
制限分析によってチェックした。このプラスミドをpRKC
D4と命名する。
セクション４ 構築された次のプラスミドは、上記（セクション３）
のCD4の分泌型誘導体を発現させるように設計されてい
た。CD4の暗号領域を、成熟CD4のアミノ酸残基368の後
で、翻訳終止コドンの前に９以上の残基をコードしてい
るpBR322由来の配列に融合させた。これは、推定のCD4
トランスメンブランおよび細胞質ドメイン（これらはCD
4を細胞表面にアンカーさせるものと仮定されている）
を除去するものである。このプラスミドをpRKCD4Tと命
名し（CD4Tと呼ぶタンパク質を産生する）、そして次の
ように構築した。
のCD4の分泌型誘導体を発現させるように設計されてい
た。CD4の暗号領域を、成熟CD4のアミノ酸残基368の後
で、翻訳終止コドンの前に９以上の残基をコードしてい
るpBR322由来の配列に融合させた。これは、推定のCD4
トランスメンブランおよび細胞質ドメイン（これらはCD
4を細胞表面にアンカーさせるものと仮定されている）
を除去するものである。このプラスミドをpRKCD4Tと命
名し（CD4Tと呼ぶタンパク質を産生する）、そして次の
ように構築した。
pSVeCD4DHFRをHpaIIで消化し、クレノウフラグメント
および４種のdNTPで平滑化し、そしてBstEIIで消化し
た。CD4暗号配列の一部を含む382bpのフラグメント（フ
ラグメント17）をゲル電気泳動によって回収した。pSVe
CD4DHFRをEcoRIおよびBstEIIで消化し、874bpのフラグ
メント（フラグメント18）を回収した。pBR322をHindII
Iで消化し、クレノウフラグメントおよび４種のdNTPで
平滑化し、そしてEcoRIで消化した。プラスミドの大部
分を含むフラグメント19を単離し、フラグメント17およ
び18に連結し、そしてライゲーション混合物を大腸菌株
294に導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プ
レートで培養し、耐性コロニーを選択した。プラスミド
DNAを形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存
在につき制限分析によってチェックした。このプラスミ
ドをpCD4Tintと命名する。
および４種のdNTPで平滑化し、そしてBstEIIで消化し
た。CD4暗号配列の一部を含む382bpのフラグメント（フ
ラグメント17）をゲル電気泳動によって回収した。pSVe
CD4DHFRをEcoRIおよびBstEIIで消化し、874bpのフラグ
メント（フラグメント18）を回収した。pBR322をHindII
Iで消化し、クレノウフラグメントおよび４種のdNTPで
平滑化し、そしてEcoRIで消化した。プラスミドの大部
分を含むフラグメント19を単離し、フラグメント17およ
び18に連結し、そしてライゲーション混合物を大腸菌株
294に導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プ
レートで培養し、耐性コロニーを選択した。プラスミド
DNAを形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存
在につき制限分析によってチェックした。このプラスミ
ドをpCD4Tintと命名する。
pRK5をEcoRIおよびSmaIで消化し、プラスミドの大部
分を含むフラグメント20を単離した。pCD4TintをEcoRI
およびEcoRVで消化し、開始コドンの３′側1176bpのHpa
II部位までのCD4暗号配列およびpBR322の154bp HindIII
-EcoRVフラグメントを含む1410bpのフラグメントを回収
した（フラグメント21）。フラグメント20および21を連
結し、ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入し
た。形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養
し、耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転
換体から調製し、正しいフラグメントの存在につき制限
分析によってチェックした。このプラスミドをpRKCD4T
と命名する。
分を含むフラグメント20を単離した。pCD4TintをEcoRI
およびEcoRVで消化し、開始コドンの３′側1176bpのHpa
II部位までのCD4暗号配列およびpBR322の154bp HindIII
-EcoRVフラグメントを含む1410bpのフラグメントを回収
した（フラグメント21）。フラグメント20および21を連
結し、ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入し
た。形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養
し、耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転
換体から調製し、正しいフラグメントの存在につき制限
分析によってチェックした。このプラスミドをpRKCD4T
と命名する。
セクション5a ヘルペスウイルスＩ型糖タンパク質Ｄに指向性である
抗体によって精製され得る分泌型のCD4を創製するた
め、プラスミドを構築してCD4Tの誘導体を発現させた
（ここで、成熟したプロセッシングされるCD4Tポリペプ
チドをコードしている領域は、成熟Ｉ型単純疱疹ウイル
スgD糖タンパク質の最初の27残基およびシグナルペプチ
ドをコードしている配列に融合している）。このプラス
ミドをpRKGDCD4Tと命名し、次のように構築した。
抗体によって精製され得る分泌型のCD4を創製するた
め、プラスミドを構築してCD4Tの誘導体を発現させた
（ここで、成熟したプロセッシングされるCD4Tポリペプ
チドをコードしている領域は、成熟Ｉ型単純疱疹ウイル
スgD糖タンパク質の最初の27残基およびシグナルペプチ
ドをコードしている配列に融合している）。このプラス
ミドをpRKGDCD4Tと命名し、次のように構築した。
pgDTrunc.DHFRをEcoRIおよびPvuIIで消化し、成熟HSV
-I gD糖タンパク質の最初の27残基およびシグナルペプ
チドの暗号領域を含むフラグメントを単離した（フラグ
メント22）。pRKCD4TをEcoRIおよびBstEIIで消化し、pR
K5領域およびCD4暗号配列の３′端末を含有するフラグ
メント23を単離した。
-I gD糖タンパク質の最初の27残基およびシグナルペプ
チドの暗号領域を含むフラグメントを単離した（フラグ
メント22）。pRKCD4TをEcoRIおよびBstEIIで消化し、pR
K5領域およびCD4暗号配列の３′端末を含有するフラグ
メント23を単離した。
成熟CD4のアミノ末端残基のコドンから翻訳開始の
３′側121bpのRsa部位までのCD4の暗号配列を含み、そ
してセンス鎖の５′末端の配列CTGCTCGAGを含む、合成
オリゴヌクレオチドGD（アダプター１−2;下記）を調製
した（フラグメント24）。pRKCD4をRsaIおよびBstEIIで
消化し、CD4の暗号領域の一部を含む665bpのフラグメン
ト（フラグメント25）を回収し、そしてフラグメント24
に連結した。単量体フラグメントだけが存在しているこ
とを確実にするためにBstEIIで消化した後、両配列を含
む724bpフラグメントをゲル電気泳動によって回収した
（フラグメント26）。
３′側121bpのRsa部位までのCD4の暗号配列を含み、そ
してセンス鎖の５′末端の配列CTGCTCGAGを含む、合成
オリゴヌクレオチドGD（アダプター１−2;下記）を調製
した（フラグメント24）。pRKCD4をRsaIおよびBstEIIで
消化し、CD4の暗号領域の一部を含む665bpのフラグメン
ト（フラグメント25）を回収し、そしてフラグメント24
に連結した。単量体フラグメントだけが存在しているこ
とを確実にするためにBstEIIで消化した後、両配列を含
む724bpフラグメントをゲル電気泳動によって回収した
（フラグメント26）。
フラグメント22、23および26を連結し、ライゲーショ
ン混合物を大腸菌株294に導入した。形質転換培養物を
アンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選
択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正し
いフラグメントの存在につき制限分析によってチェック
した。いくつかの形質転換体の配列を調べ、合成の挿入
が正しいこと、およびリーディングフレームが保存され
ていることを確認した。このプラスミドをpRKGDCD4Tと
命名する。
ン混合物を大腸菌株294に導入した。形質転換培養物を
アンピシリン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選
択した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正し
いフラグメントの存在につき制限分析によってチェック
した。いくつかの形質転換体の配列を調べ、合成の挿入
が正しいこと、およびリーディングフレームが保存され
ていることを確認した。このプラスミドをpRKGDCD4Tと
命名する。
これらのpRK5由来のプラスミドは、好ましくは、目的
のプラスミドに加えてネオマイシン耐性遺伝子を発現す
るプラスミドpRSVneo［Gorman et al.,Science 221:55
3-555（1985）］が同時トランスフェクションされたこ
とを除き、Muesing,et al.Cell 48:691（1987）に従
い、安定な発現のための293S細胞にトランスフェクショ
ンした。293細胞も宿主細胞として満足に使用される。
トランスフェクションの２日後に、Muesing et al.によ
って示されたメトトレキセートを含む培地に代えて、安
定なセルラインの選択のための0.5mg/ml G418（硫酸ゲ
ンチシン;Gibco）含有の標準培地（Ｌ−グルタミン、ペ
ニシリン−ストレプトマイシン、および10％FBSを追加
した1:1 F12/DME）で細胞を培養した。放射免疫沈澱法
によりCD4またはCD4類似体の産生について細胞を検定し
た。結合の研究（セクション5c）には、1:1 F12/DME培
地中のこれら細胞由来の培養上清を使用した。感染性の
検定（セクション5b）で用いた原料は、後記セクション
８に記したようにして得た。
のプラスミドに加えてネオマイシン耐性遺伝子を発現す
るプラスミドpRSVneo［Gorman et al.,Science 221:55
3-555（1985）］が同時トランスフェクションされたこ
とを除き、Muesing,et al.Cell 48:691（1987）に従
い、安定な発現のための293S細胞にトランスフェクショ
ンした。293細胞も宿主細胞として満足に使用される。
トランスフェクションの２日後に、Muesing et al.によ
って示されたメトトレキセートを含む培地に代えて、安
定なセルラインの選択のための0.5mg/ml G418（硫酸ゲ
ンチシン;Gibco）含有の標準培地（Ｌ−グルタミン、ペ
ニシリン−ストレプトマイシン、および10％FBSを追加
した1:1 F12/DME）で細胞を培養した。放射免疫沈澱法
によりCD4またはCD4類似体の産生について細胞を検定し
た。結合の研究（セクション5c）には、1:1 F12/DME培
地中のこれら細胞由来の培養上清を使用した。感染性の
検定（セクション5b）で用いた原料は、後記セクション
８に記したようにして得た。
セクション5b 以下の記載は可溶性CD4類似体によるHIV-1感染力の中
和を調べるものである。Robert-Guroff et al.,Nature
316:72（1985）の中和法に修飾を加えた。等量のイン
ヒビター上清およびウイルス（60μｌ）を４℃で１時間
インキュベートし、次いで5x106/mlのH9（Gallo et a
l.,Science 224:550,1984）を同容量加え、そして37℃
で１時間インキュベートを続けた。吸収の後、150μｌ
中の2.5x105細胞をインキュベーション培地2mlに移し
た。37℃で４日の後、新鮮な培地で培養物を1:2に分
け、さらに３日間インキュベートした。培養物を集め、
逆転写酵素活性を測定し（Groopman et al.,AIDS Resea
rch and Human Retroviruses ３:71,1987）、そしてHI
V-1ポジティブな血清との免疫蛍光反応性を記載のよう
にして測定した（Poiesz et al.,Proc,Acad,Nat.Sci.US
A 77:7415,1980）。インヒビター上清は、成長培地イ
ンキュベーション培地交換を行い、24時間後に上清を集
めることにより、293S/CDT4、293S/gDCD4T細胞またはト
ランスフェクションされていない293S細胞の全面プレー
ト培養から得た。第３表の第２欄に示したように、イン
ヒビター上清は、培養の最初の３日の間にインキュベー
ション培地の一部または全部を交換した。ウイルスのチ
ャレンジ用量は、同じ系で検定されたH9細胞において増
殖させたHIV-1株HTLV-IIIBの100TCID50（Groopman et a
l.;上記）であった。インキュベーション培地は、2mM L
−グルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlのス
トレプトマイシン、２μg/mlのポリブレン、および20％
ウシ胎児血清（M.A.Bioproducts）を含むRPMI 1640培地
からなっていた。
和を調べるものである。Robert-Guroff et al.,Nature
316:72（1985）の中和法に修飾を加えた。等量のイン
ヒビター上清およびウイルス（60μｌ）を４℃で１時間
インキュベートし、次いで5x106/mlのH9（Gallo et a
l.,Science 224:550,1984）を同容量加え、そして37℃
で１時間インキュベートを続けた。吸収の後、150μｌ
中の2.5x105細胞をインキュベーション培地2mlに移し
た。37℃で４日の後、新鮮な培地で培養物を1:2に分
け、さらに３日間インキュベートした。培養物を集め、
逆転写酵素活性を測定し（Groopman et al.,AIDS Resea
rch and Human Retroviruses ３:71,1987）、そしてHI
V-1ポジティブな血清との免疫蛍光反応性を記載のよう
にして測定した（Poiesz et al.,Proc,Acad,Nat.Sci.US
A 77:7415,1980）。インヒビター上清は、成長培地イ
ンキュベーション培地交換を行い、24時間後に上清を集
めることにより、293S/CDT4、293S/gDCD4T細胞またはト
ランスフェクションされていない293S細胞の全面プレー
ト培養から得た。第３表の第２欄に示したように、イン
ヒビター上清は、培養の最初の３日の間にインキュベー
ション培地の一部または全部を交換した。ウイルスのチ
ャレンジ用量は、同じ系で検定されたH9細胞において増
殖させたHIV-1株HTLV-IIIBの100TCID50（Groopman et a
l.;上記）であった。インキュベーション培地は、2mM L
−グルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlのス
トレプトマイシン、２μg/mlのポリブレン、および20％
ウシ胎児血清（M.A.Bioproducts）を含むRPMI 1640培地
からなっていた。
前希釈なしでウイルス感染細胞とともにインキュベー
トすると、両形態の可溶性CD4はHIV-1の増殖を実質的に
停止させた（第２表）。1:4の希釈では、可溶性CD4調製
物はウイルス増殖の阻害には部分的に有効なだけであっ
たが、それでも、蛍光−ポジティブな細胞および逆転写
酵素のレベルは擬トランスフェクションされた細胞上清
を与えられた培養物よりも有意に低かった（第２表）。
希釈および未希釈の対照上清の間のウイルス増殖に有意
差が存在せず、また、すべての上清が未感染のH9細胞の
増殖に影響を及ぼさなかった（データは示していない）
ので、これらの上清に存在する可溶性CD4タンパク質がH
9細胞のHIV-1感染の中和の原因であると結論された。
トすると、両形態の可溶性CD4はHIV-1の増殖を実質的に
停止させた（第２表）。1:4の希釈では、可溶性CD4調製
物はウイルス増殖の阻害には部分的に有効なだけであっ
たが、それでも、蛍光−ポジティブな細胞および逆転写
酵素のレベルは擬トランスフェクションされた細胞上清
を与えられた培養物よりも有意に低かった（第２表）。
希釈および未希釈の対照上清の間のウイルス増殖に有意
差が存在せず、また、すべての上清が未感染のH9細胞の
増殖に影響を及ぼさなかった（データは示していない）
ので、これらの上清に存在する可溶性CD4タンパク質がH
9細胞のHIV-1感染の中和の原因であると結論された。
セクション5c gP120およびCD4またはCD4変異体の間の相互作用の親
和定数を測定するために、ラクトペルオキシダーゼでラ
ベルした放射ヨウ素化gp120を用い、可溶性CD4（上記）
およびデタージェント可溶化した無傷のCD4［Lasky et
al.,Cell 50:975（1987）］を用いて飽和結合分析を行
った。結合反応は、無傷のCD4（Laskey et al.;上記）
を含む細胞溶解液またはセクション5aの記載のように調
製した未ラベルのCD4TまたはgDCD4Tを含む細胞上清とと
もに０℃で１時間インキュベートされる125I‐gp120
（３〜670ng;2.9nCi/ng）で構成されていた。反応液
（0.2ml）は、0.5x McDougal Lysis Buffer（McDLB;1x
のMcDLBは、0.5％ Nonidet NP-40、0.2％デオキシコー
ル酸ナトリウム、0.12M NaCl、0.02M トリス−HCl、pH
8.0を含む）の最終組成を有しており、50μｇの未ラベ
ルの精製gp120（74倍またはそれ以上の過剰量）の存在
下または非存在下で２回行った。インキュベーション後
に、結合gp120を免疫沈澱によって定量し、ガンマカウ
ンターで計数した。免疫沈澱のために、０℃で１時間、
結合反応溶液を正常なウサギ血清５μｌを用いて前吸収
させ、０℃で30分間、Pansorbin（10％ w/v、Calbioch
em）40μｌで透明にした。次いで、０℃で一晩、正常な
血清２μｌまたはOKT4モノクローナル抗体（Ortho）５
μｌ（0.25μｇ）とともに試料をインキュベートし、続
いてPansorbin10μｌを用いて免疫コンプレックスを集
めた。沈殿を1xMcDLBで２回および水で１回洗浄し、次
いで、試料緩衝液（0.12M トリス−HCl pH6.8、４％
SDS、0.7M メルカプトエタノール、20％ グリセロー
ル、および0.1％ ブロモフェノール・ブルー）中、100
℃で２分間溶離を行った。CD4分子はgp120によって飽和
的に結合し、単純な質量作用結合曲線を与えた。擬トラ
ンスフェクションされた細胞由来の上清は、可溶性CD4
を含む上清のものより１％以上少ないレベルの特異的に
結合したgp120を与えた。スカッチャード分析はそれぞ
れの分子上の単一クラスの結合部位を明らかにし、これ
らは無傷のCD4、CD4TおよびgDCD4Tに対して、それぞれ
1.3x10-9M、0.83x10-9Mおよび0.72x10-9Mの見掛けの解
離定数（Kd）を有していた。溶液中でのCD4-gp120結合
について得られた値は、全細胞上のCD4に対するgp120結
合について前に測定されていた新和性に匹敵する（Kd＝
4.0x10-9M;Lasky,Cell;上記）。
和定数を測定するために、ラクトペルオキシダーゼでラ
ベルした放射ヨウ素化gp120を用い、可溶性CD4（上記）
およびデタージェント可溶化した無傷のCD4［Lasky et
al.,Cell 50:975（1987）］を用いて飽和結合分析を行
った。結合反応は、無傷のCD4（Laskey et al.;上記）
を含む細胞溶解液またはセクション5aの記載のように調
製した未ラベルのCD4TまたはgDCD4Tを含む細胞上清とと
もに０℃で１時間インキュベートされる125I‐gp120
（３〜670ng;2.9nCi/ng）で構成されていた。反応液
（0.2ml）は、0.5x McDougal Lysis Buffer（McDLB;1x
のMcDLBは、0.5％ Nonidet NP-40、0.2％デオキシコー
ル酸ナトリウム、0.12M NaCl、0.02M トリス−HCl、pH
8.0を含む）の最終組成を有しており、50μｇの未ラベ
ルの精製gp120（74倍またはそれ以上の過剰量）の存在
下または非存在下で２回行った。インキュベーション後
に、結合gp120を免疫沈澱によって定量し、ガンマカウ
ンターで計数した。免疫沈澱のために、０℃で１時間、
結合反応溶液を正常なウサギ血清５μｌを用いて前吸収
させ、０℃で30分間、Pansorbin（10％ w/v、Calbioch
em）40μｌで透明にした。次いで、０℃で一晩、正常な
血清２μｌまたはOKT4モノクローナル抗体（Ortho）５
μｌ（0.25μｇ）とともに試料をインキュベートし、続
いてPansorbin10μｌを用いて免疫コンプレックスを集
めた。沈殿を1xMcDLBで２回および水で１回洗浄し、次
いで、試料緩衝液（0.12M トリス−HCl pH6.8、４％
SDS、0.7M メルカプトエタノール、20％ グリセロー
ル、および0.1％ ブロモフェノール・ブルー）中、100
℃で２分間溶離を行った。CD4分子はgp120によって飽和
的に結合し、単純な質量作用結合曲線を与えた。擬トラ
ンスフェクションされた細胞由来の上清は、可溶性CD4
を含む上清のものより１％以上少ないレベルの特異的に
結合したgp120を与えた。スカッチャード分析はそれぞ
れの分子上の単一クラスの結合部位を明らかにし、これ
らは無傷のCD4、CD4TおよびgDCD4Tに対して、それぞれ
1.3x10-9M、0.83x10-9Mおよび0.72x10-9Mの見掛けの解
離定数（Kd）を有していた。溶液中でのCD4-gp120結合
について得られた値は、全細胞上のCD4に対するgp120結
合について前に測定されていた新和性に匹敵する（Kd＝
4.0x10-9M;Lasky,Cell;上記）。
セクション６ 異質のアミノ酸残基を含まないCD4の分泌型誘導体を
製造するために、２つのプラスミドを293細胞中での発
現用に構築した。これらのプラスミドは、余分の残基を
追加することなく切除が為されたCD4遺伝子を含み、pRK
CD4ΔNlaおよびpRKCD4TP（これらは、CD4TPおよびCD4Δ
Nlaと呼ばれるタンパク質を産生する）と命名し、そし
て次のように構築した。
製造するために、２つのプラスミドを293細胞中での発
現用に構築した。これらのプラスミドは、余分の残基を
追加することなく切除が為されたCD4遺伝子を含み、pRK
CD4ΔNlaおよびpRKCD4TP（これらは、CD4TPおよびCD4Δ
Nlaと呼ばれるタンパク質を産生する）と命名し、そし
て次のように構築した。
削除された195bp NlaIII制限フラグメントを有するCD
4遺伝子を含むフラグメント14を、EcoRIおよびBamHIで
消化されたpRK5であるフラグメント16に連結した。この
ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入し、形質転
換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして
耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体
から調製し、正しいフラグメントの存在について制限分
析によってチェックした。得られたプラスミドをpRKCD4
ΔNlaと命名する。
4遺伝子を含むフラグメント14を、EcoRIおよびBamHIで
消化されたpRK5であるフラグメント16に連結した。この
ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入し、形質転
換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして
耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体
から調製し、正しいフラグメントの存在について制限分
析によってチェックした。得られたプラスミドをpRKCD4
ΔNlaと命名する。
合成DNA（５′CGT GAT AGA AGC TTT CTA GAG 3′）を
調製して1176bpのHpaII部位に結合させた；このように
結合させると、成熟CD4のアミノ酸残基368の後で翻訳を
終わらせるであろう（フラグメント27）。このフラグメ
ントのもう一方の末端は、BamHI制限フラグメントに連
結するように設計されていた。pUCCD4をBstEIIおよびHp
aIIで消化し、CD4遺伝子の一部を含む382bpフラグメン
トを回収した（フラグメント28）。フラグメント27およ
び28を連結し、次いでBstEIIで消化して二量化フラグメ
ントを単量体に還元し、そして得られた401bpフラグメ
ントを回収した（フラグメント29）。
調製して1176bpのHpaII部位に結合させた；このように
結合させると、成熟CD4のアミノ酸残基368の後で翻訳を
終わらせるであろう（フラグメント27）。このフラグメ
ントのもう一方の末端は、BamHI制限フラグメントに連
結するように設計されていた。pUCCD4をBstEIIおよびHp
aIIで消化し、CD4遺伝子の一部を含む382bpフラグメン
トを回収した（フラグメント28）。フラグメント27およ
び28を連結し、次いでBstEIIで消化して二量化フラグメ
ントを単量体に還元し、そして得られた401bpフラグメ
ントを回収した（フラグメント29）。
pRKCD4をBstIIおよびBamHIで消化し、プラスミドの大
部分を含むフラグメント（フラグメント30）を単離し、
そしてフラグメント29に連結した。ライゲーション混合
物を大腸菌株294に導入し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在について制限分析によってチェック
した。得られたプラスミドをpRKCD4TPと命名する。上記
のように両プラスミドを293細胞にトランスフェクショ
ンして安定な変異CD4を発現するセルラインを得る。
部分を含むフラグメント（フラグメント30）を単離し、
そしてフラグメント29に連結した。ライゲーション混合
物を大腸菌株294に導入し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在について制限分析によってチェック
した。得られたプラスミドをpRKCD4TPと命名する。上記
のように両プラスミドを293細胞にトランスフェクショ
ンして安定な変異CD4を発現するセルラインを得る。
セクション７ ２種類のプラスミドを構築して異質のアミノ酸残基を
欠く分泌型のCD4をCHO細胞中で発現させた。これらをpS
VeCD4ΔNlaSVDHFRおよびpSVeCD4TPSVDHFR（これらは、C
D4ΔNlaおよびCD4TPの１次配列を有するタンパク質をコ
ードしている）と命名し、次のように構築した。
欠く分泌型のCD4をCHO細胞中で発現させた。これらをpS
VeCD4ΔNlaSVDHFRおよびpSVeCD4TPSVDHFR（これらは、C
D4ΔNlaおよびCD4TPの１次配列を有するタンパク質をコ
ードしている）と命名し、次のように構築した。
pE348HBV.E400 D22をPvuIおよびEcoRIで消化し、SV40
初期プロモーターおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子の一部
を含むフラグメントを回収した（フラグメント31）。pE
348HBV.E400 D22をPvuIおよびBamHIで消化し、β−ラク
タマーゼ遺伝子の残りならびにSV40初期プロモータおよ
びDHFR遺伝子を含む大きいフラグメントを単離した（フ
ラグメント32）。
初期プロモーターおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子の一部
を含むフラグメントを回収した（フラグメント31）。pE
348HBV.E400 D22をPvuIおよびBamHIで消化し、β−ラク
タマーゼ遺伝子の残りならびにSV40初期プロモータおよ
びDHFR遺伝子を含む大きいフラグメントを単離した（フ
ラグメント32）。
フラグメント31および32をフラグメント14と連結し、
大腸菌株294に導入した。形質転換培養物をアンピシリ
ン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選択した。プ
ラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しいフラグメ
ントの存在につき制限分析によってチェックした。得ら
れたプラスミドをpSVECD4ΔNlaSVDHFRと命名する。この
プラスミドは、上記のプラスミドpSVeCD4ΔNlaDHFR（セ
クション２）中に見い出される可溶性CD4分子をコード
している同じDNAフラグメントを含んでいる。
大腸菌株294に導入した。形質転換培養物をアンピシリ
ン培地プレートで培養し、耐性コロニーを選択した。プ
ラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しいフラグメ
ントの存在につき制限分析によってチェックした。得ら
れたプラスミドをpSVECD4ΔNlaSVDHFRと命名する。この
プラスミドは、上記のプラスミドpSVeCD4ΔNlaDHFR（セ
クション２）中に見い出される可溶性CD4分子をコード
している同じDNAフラグメントを含んでいる。
pRKCD4TPをEcoRIおよびBamHIで消化し、切り詰められ
たCD4暗号領域を含むフラグメントを単離し、そしてフ
ラグメント31および32に連結した。ライゲーション混合
物を大腸菌株294に導入し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在について制限分析によってチェック
した。得られたプラスミドをpSVeCD4TPSVDHFRと命名す
る。これら両プラスミドをCHO細部中にトランスフェク
ションし、常法を用いてメトトレキセートにより選択し
たトランスフェクタントを増幅した。
たCD4暗号領域を含むフラグメントを単離し、そしてフ
ラグメント31および32に連結した。ライゲーション混合
物を大腸菌株294に導入し、形質転換培養物をアンピシ
リン培地プレートで培養し、そして耐性コロニーを選択
した。プラスミドDNAを形質転換体から調製し、正しい
フラグメントの存在について制限分析によってチェック
した。得られたプラスミドをpSVeCD4TPSVDHFRと命名す
る。これら両プラスミドをCHO細部中にトランスフェク
ションし、常法を用いてメトトレキセートにより選択し
たトランスフェクタントを増幅した。
実施例２ CD4遺伝子のＶ領域（免疫グロブリン遺伝子の可変領
域にホモローガスである;Maddon et al.,1985を参照）
の、ヒト免疫グロブリンκおよびγ２鎖の不変（Ｃ）領
域への融合体を次のように構築する。
域にホモローガスである;Maddon et al.,1985を参照）
の、ヒト免疫グロブリンκおよびγ２鎖の不変（Ｃ）領
域への融合体を次のように構築する。
Morin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. 82:7025-7029に
よって公表されている配列に基づき、ヒトκ鎖のＣ領域
（残基109〜214）コードするように合成DNAを調製す
る；このフラグメントがCD4の推定Ｖ−様領域の末端のB
spMI部位に連結されることを可能にする配列GGGGを、解
読鎖の５′末端に加える。暗号領域の３′末端に、翻訳
停止コドンならびにこの末端がBamHI制限フラグメント
に連結されることを可能にする配列を加える。合成DNA
は８つのフラグメントで調製する（それぞれの鎖に対し
て４つ;70〜90塩基の長さ）。次いで、これらをアニー
リングさせ、連結してポリアクリルアミドゲルで単離す
る（フラグメント33）。
よって公表されている配列に基づき、ヒトκ鎖のＣ領域
（残基109〜214）コードするように合成DNAを調製す
る；このフラグメントがCD4の推定Ｖ−様領域の末端のB
spMI部位に連結されることを可能にする配列GGGGを、解
読鎖の５′末端に加える。暗号領域の３′末端に、翻訳
停止コドンならびにこの末端がBamHI制限フラグメント
に連結されることを可能にする配列を加える。合成DNA
は８つのフラグメントで調製する（それぞれの鎖に対し
て４つ;70〜90塩基の長さ）。次いで、これらをアニー
リングさせ、連結してポリアクリルアミドゲルで単離す
る（フラグメント33）。
pRKCD4をEcoRIおよびBspMIで消化し、CD4の推定のＶ
−様ドメインをコードしている領域を含む478bpフラグ
メントを回収する（フラグメント34）。フラグメント33
および34をフラグメント16（発現ベクターpRK5由来）と
連結する。ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入
し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを
形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在につ
いて制限分析によってチェックする。得られたプラスミ
ドをpRKCD4CDkと命名する。
−様ドメインをコードしている領域を含む478bpフラグ
メントを回収する（フラグメント34）。フラグメント33
および34をフラグメント16（発現ベクターpRK5由来）と
連結する。ライゲーション混合物を大腸菌株294に導入
し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養
し、そして耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを
形質転換体から調製し、正しいフラグメントの存在につ
いて制限分析によってチェックする。得られたプラスミ
ドをpRKCD4CDkと命名する。
CD4 V−様ドメインのヒト免疫グロブリンＣγ２領域
への融合体をコードしているプラスミドを同様の方法で
構築し、pRKCD4Cγ２と命名する。これら両プラスミド
を上記のように、293細胞、骨髄腫細胞または他のコン
ピテントな細胞中にトランスフェクションして変異CD4
分子を発現するセルラインを得る。
への融合体をコードしているプラスミドを同様の方法で
構築し、pRKCD4Cγ２と命名する。これら両プラスミド
を上記のように、293細胞、骨髄腫細胞または他のコン
ピテントな細胞中にトランスフェクションして変異CD4
分子を発現するセルラインを得る。
実施例３ 実施例１の方法によって分泌させたgDCD4Tを10％FBS
（ウシ胎児血清）を含むか、あるいはFBSを含まない細
胞培養液から精製した。始めに細胞培養液を限外濾過に
よって濃縮し、次いで免疫アフィニティークロマトグラ
フィーによって精製した。この免疫アフィニティーカラ
ムは、Roy et al.,1984の方法により、ネズミモノクロ
ーナル抗体5B6（そのエピトープは、gDCD4T分子のHSV-1
gD部分にある）をグリセリル被覆のコントロールされ
た多孔ガラスに結合させることによって得た。濃縮細胞
培養液をこのカラムに直接適用し、汚染タンパク質を中
性pH緩衝液によって洗い落とす。次いで、このカラム
を、塩化テトラエチルアンモニウムを含む中性緩衝液、
続いてTween 80を含む中性緩衝液で洗浄する。結合gDCD
4Tを、Tween 80（0.1％ w/v）を含むpH3の緩衝液でカラ
ムから溶離し、溶離後、直ちに中和する。溶離され中和
されたgDCD4Tを、次いで限外濾過によって濃縮し、透析
／透濾過（diafilter）を行って緩衝液を約0.1％ w/v
のTween 80を含む生理学的塩溶液と交換する。
（ウシ胎児血清）を含むか、あるいはFBSを含まない細
胞培養液から精製した。始めに細胞培養液を限外濾過に
よって濃縮し、次いで免疫アフィニティークロマトグラ
フィーによって精製した。この免疫アフィニティーカラ
ムは、Roy et al.,1984の方法により、ネズミモノクロ
ーナル抗体5B6（そのエピトープは、gDCD4T分子のHSV-1
gD部分にある）をグリセリル被覆のコントロールされ
た多孔ガラスに結合させることによって得た。濃縮細胞
培養液をこのカラムに直接適用し、汚染タンパク質を中
性pH緩衝液によって洗い落とす。次いで、このカラム
を、塩化テトラエチルアンモニウムを含む中性緩衝液、
続いてTween 80を含む中性緩衝液で洗浄する。結合gDCD
4Tを、Tween 80（0.1％ w/v）を含むpH3の緩衝液でカラ
ムから溶離し、溶離後、直ちに中和する。溶離され中和
されたgDCD4Tを、次いで限外濾過によって濃縮し、透析
／透濾過（diafilter）を行って緩衝液を約0.1％ w/v
のTween 80を含む生理学的塩溶液と交換する。
デタージェントが存在しないときには、約10,000Xgで
２分間の遠心によって溶液からgDCD4Tが除去されること
から明らかなように、gDCD4Tは集合体を形成する。候補
安定剤としてのBSA、Tween 80またはグリセロールとと
もに、0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaClおよび0.25M ト
リス（pH7）中、４℃でgDCD4Tをインキュベートする
と、安定剤が存在しないときには、gDCD4Tは約60〜70％
のタンパク質だけが可溶性である点まで、12日間にわた
って徐々に凝集することがわかった。しかし、0.1％ w
/v Tween 80または0.5mg/ml BSAを使用すると、それぞ
れ約100％または80％のgDCD4Tがこの期間にわたって可
溶性のままであることを確実にした。驚くべきことに、
グリセロールは安定剤として効果がなく、対照にさえ劣
る結果を与えた；グリセロールの存在下で保存したと
き、８日目に約80％のgDCD4Tが凝集した。
２分間の遠心によって溶液からgDCD4Tが除去されること
から明らかなように、gDCD4Tは集合体を形成する。候補
安定剤としてのBSA、Tween 80またはグリセロールとと
もに、0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaClおよび0.25M ト
リス（pH7）中、４℃でgDCD4Tをインキュベートする
と、安定剤が存在しないときには、gDCD4Tは約60〜70％
のタンパク質だけが可溶性である点まで、12日間にわた
って徐々に凝集することがわかった。しかし、0.1％ w
/v Tween 80または0.5mg/ml BSAを使用すると、それぞ
れ約100％または80％のgDCD4Tがこの期間にわたって可
溶性のままであることを確実にした。驚くべきことに、
グリセロールは安定剤として効果がなく、対照にさえ劣
る結果を与えた；グリセロールの存在下で保存したと
き、８日目に約80％のgDCD4Tが凝集した。
実施例４ ヒト免疫グロブリンγ１の不変領域に融合させた長さ
の異なるCD4のアミノ末端細胞外ドメインを含むタンパ
ク質を発現させるためにプラスミドを構築した。これら
のプラスミドをpRKCD42 γ１、pRKCD4e4 γ１、pRKCD42
γ１、pRKCD4e2 γ１、pRKCD41 γ１、およびpRKCD4e1
γ１と命名する。
の異なるCD4のアミノ末端細胞外ドメインを含むタンパ
ク質を発現させるためにプラスミドを構築した。これら
のプラスミドをpRKCD42 γ１、pRKCD4e4 γ１、pRKCD42
γ１、pRKCD4e2 γ１、pRKCD41 γ１、およびpRKCD4e1
γ１と命名する。
プラスミドpRKCD44 γ１は、開始コドンから成熟CD4ポ
リペプチドのセリン残基366のコドン後の融合部位まで
のCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グ
ロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒト免
疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列を含
有している（Kabat et al.）。
リペプチドのセリン残基366のコドン後の融合部位まで
のCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グ
ロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒト免
疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列を含
有している（Kabat et al.）。
プラスミドpRKCD4e4 γ１は、開始コドンから成熟CD4
ポリペプチドのリジン残基360のコドン後の融合部位ま
でのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫
グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒト
免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列を
含有している（Kabat et al.）。
ポリペプチドのリジン残基360のコドン後の融合部位ま
でのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫
グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒト
免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列を
含有している（Kabat et al.）。
プラスミドpRKCD42 γ１は、開始コドンから成熟CD4ポ
リペプチドのグルタミン残基180のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
リペプチドのグルタミン残基180のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
プラスミドpRKCD4e2 γ１は、開始コドンから成熟CD4
ポリペプチドのロイシン残基177のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
ポリペプチドのロイシン残基177のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
プラスミドpRKCD41 γ１は、開始コドンから成熟CD4ポ
リペプチドのアスパラギン酸残基105のコドン後の融合
部位までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒ
ト免疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始ま
るヒト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている
配列を含有している（Kabat et al.）。
リペプチドのアスパラギン酸残基105のコドン後の融合
部位までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒ
ト免疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始ま
るヒト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている
配列を含有している（Kabat et al.）。
プラスミドpRKCD4e1 γ１は、開始コドンから成熟CD4
ポリペプチドのロイシン残基100のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
ポリペプチドのロイシン残基100のコドン後の融合部位
までのCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免
疫グロブリンγ１のセリン残基114のコドンで始まるヒ
ト免疫グロブリンγ１の不変領域をコードしている配列
を含有している（Kabat et al.）。
これらプラスミドの構築は、プラスミドpRKCD4TP/γ
１の前構築を必要とした。これは次のように構築した。
１の前構築を必要とした。これは次のように構築した。
ヒト免疫グロブリンγ１をコードしているcDNAクロー
ンは、公表されている配列［Ellison et al.,Nucl.Acid
s Res. 10:4071-4079（1982）］に基づくオリゴヌクレ
オチドを使用してヒト脾臓cDNAライブラリー（Clontech
Laboratories,Inc.）から得、可変領域の一部および不
変領域の全部を含むEcoRI-EagIフラグメント（このEcoR
I部位はリンカーによって与えられた；第4a、4b図を参
照）を得た。このフラグメントをクレノウフラグメント
で平滑化し、ゲル電気泳動によって回収した（フラグメ
ント al）。
ンは、公表されている配列［Ellison et al.,Nucl.Acid
s Res. 10:4071-4079（1982）］に基づくオリゴヌクレ
オチドを使用してヒト脾臓cDNAライブラリー（Clontech
Laboratories,Inc.）から得、可変領域の一部および不
変領域の全部を含むEcoRI-EagIフラグメント（このEcoR
I部位はリンカーによって与えられた；第4a、4b図を参
照）を得た。このフラグメントをクレノウフラグメント
で平滑化し、ゲル電気泳動によって回収した（フラグメ
ント al）。
成熟ポリペプチドの位置１にアスパラギンの代わりに
リジン残基を含む可溶性のCD4（残基１〜368）の置換変
異体をコードしているプラスミドpRKCD4TP-kkを、部位
指向性の突然変異誘発によってプラスミドpRKCD4TPから
構築した。合成オリゴヌクレオチドを、所望の暗号配列
を得るための突然変異誘発反応のプライマーとして調製
した。これは、置換突然変異に加えて天然配列からの２
つのサイレント突然変異を含み、突然変異コドンのそれ
ぞれの側に21塩基を含む51merとして合成した： プラスミドpRKCD4TPを大腸菌株SR101に導入し、形質
転換コロニーをアンピシリン培地プレートで培養した。
耐性コロニーを、m13K07ヘルパーバクテリオファージの
存在下で選択し、そして増殖させ,pRKCD4TPの分泌され
包膜された１本鎖の鋳型を得た。この１本鎖プラスミド
DNAを単離し、プライマーとして上記したような合成オ
リゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応の鋳型として用
いた。突然変異誘発反応液を大腸菌株SR101に導入し、
形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し
た。形質転換体は、プローブとして次の16merを用い、
適切な配列の存在についてコロニーハイブリダイゼーシ
ョン（Grunstein-Hognessを参照）によってスクリーニ
ングした： 選択したハイブリダイゼーション条件は、プローブが
正しい融合産物だけを検出するに十分厳しいものであっ
た。ポジティブと同定されたコロニーを選択し、プラス
ミドDNAを単離し、大腸菌株SR101に導入した。形質転換
培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして耐
性コロニーを、m13K07バクテリオファージの存在下で選
択し、増殖させた。鋳型を上記を同様に調製し、配列決
定によってスクリーニングした。
リジン残基を含む可溶性のCD4（残基１〜368）の置換変
異体をコードしているプラスミドpRKCD4TP-kkを、部位
指向性の突然変異誘発によってプラスミドpRKCD4TPから
構築した。合成オリゴヌクレオチドを、所望の暗号配列
を得るための突然変異誘発反応のプライマーとして調製
した。これは、置換突然変異に加えて天然配列からの２
つのサイレント突然変異を含み、突然変異コドンのそれ
ぞれの側に21塩基を含む51merとして合成した： プラスミドpRKCD4TPを大腸菌株SR101に導入し、形質
転換コロニーをアンピシリン培地プレートで培養した。
耐性コロニーを、m13K07ヘルパーバクテリオファージの
存在下で選択し、そして増殖させ,pRKCD4TPの分泌され
包膜された１本鎖の鋳型を得た。この１本鎖プラスミド
DNAを単離し、プライマーとして上記したような合成オ
リゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応の鋳型として用
いた。突然変異誘発反応液を大腸菌株SR101に導入し、
形質転換培養物をアンピシリン培地プレートで培養し
た。形質転換体は、プローブとして次の16merを用い、
適切な配列の存在についてコロニーハイブリダイゼーシ
ョン（Grunstein-Hognessを参照）によってスクリーニ
ングした： 選択したハイブリダイゼーション条件は、プローブが
正しい融合産物だけを検出するに十分厳しいものであっ
た。ポジティブと同定されたコロニーを選択し、プラス
ミドDNAを単離し、大腸菌株SR101に導入した。形質転換
培養物をアンピシリン培地プレートで培養し、そして耐
性コロニーを、m13K07バクテリオファージの存在下で選
択し、増殖させた。鋳型を上記を同様に調製し、配列決
定によってスクリーニングした。
プラスミドpRKCD4TP-kkをXbalで消化し、クレノウ酵
素で処理し、直線化されたプラスミドを含むフラグメン
トa2をゲル電気泳動によって回収し、そしてフラグメン
トa1と連結した。ライゲーション混合物を大腸菌株294
に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミド
DNAを形質転換体から調製し、正しい配向の正しいフラ
グメントの存在（即ち、CD4暗号領域と同じ配向であ
り、CD4暗号領域の３′末端にある免疫グロブリン暗号
領域）について制限分析によってチェックした。このプ
ラスミドをpRKCD4TP/γ１と命名する。
素で処理し、直線化されたプラスミドを含むフラグメン
トa2をゲル電気泳動によって回収し、そしてフラグメン
トa1と連結した。ライゲーション混合物を大腸菌株294
に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミド
DNAを形質転換体から調製し、正しい配向の正しいフラ
グメントの存在（即ち、CD4暗号領域と同じ配向であ
り、CD4暗号領域の３′末端にある免疫グロブリン暗号
領域）について制限分析によってチェックした。このプ
ラスミドをpRKCD4TP/γ１と命名する。
上記のように、合成オリゴヌクレオチドを削除突然変
異誘発反応のためのプライマーとして調製し、IgG1およ
びCD4の適切な暗号配列を融合させた。これらは、所望
の融合部位のそれぞれの側に24ヌクレオチド（即ち、所
望のCD4部分のCOOH−末端８残基、および所望の免疫グ
ロブリン部分のNH2−末端８残基に対応する）を含む48m
erとして合成した。プラスミドpRKCD4TP/γ１を大腸菌
株SR101に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地
プレートで培養した。耐性コロニーをm13K07ヘルパーバ
クテリオファージの存在下で選択し、増殖させ、pRKCD4
TP/γ１の分泌され包膜された１本鎖の鋳型を得た。こ
の１本鎖プラスミドDNAを単離し、プライマーとして上
記した合成オリゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応の
鋳型として用いた。突然変異誘発反応液を大腸菌SR101
に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養した。形質転換体を、プローブとして16merを用
い、適切な融合部位の存在についてコロニーハイブリダ
イゼーション（Grunstein-Hognessを参照）によってス
クリーニングした。これらの16merは融合部位の両側に
８塩基を含み、選択したハイブリダイゼーション条件
は、プローブが正しい融合産物だけを検出するに十分厳
しいものであった。ポジティブと同定されたコロニーを
選択し、プラスミドDNAを単離し、そして大腸菌株SR101
に導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレー
トで培養し、耐性コロニーをm13K07バクテリオファージ
の存在下で選択し、そして増殖させた。上記のように鋳
型を調製し、配列決定によってスクリーニングした。
異誘発反応のためのプライマーとして調製し、IgG1およ
びCD4の適切な暗号配列を融合させた。これらは、所望
の融合部位のそれぞれの側に24ヌクレオチド（即ち、所
望のCD4部分のCOOH−末端８残基、および所望の免疫グ
ロブリン部分のNH2−末端８残基に対応する）を含む48m
erとして合成した。プラスミドpRKCD4TP/γ１を大腸菌
株SR101に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地
プレートで培養した。耐性コロニーをm13K07ヘルパーバ
クテリオファージの存在下で選択し、増殖させ、pRKCD4
TP/γ１の分泌され包膜された１本鎖の鋳型を得た。こ
の１本鎖プラスミドDNAを単離し、プライマーとして上
記した合成オリゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応の
鋳型として用いた。突然変異誘発反応液を大腸菌SR101
に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養した。形質転換体を、プローブとして16merを用
い、適切な融合部位の存在についてコロニーハイブリダ
イゼーション（Grunstein-Hognessを参照）によってス
クリーニングした。これらの16merは融合部位の両側に
８塩基を含み、選択したハイブリダイゼーション条件
は、プローブが正しい融合産物だけを検出するに十分厳
しいものであった。ポジティブと同定されたコロニーを
選択し、プラスミドDNAを単離し、そして大腸菌株SR101
に導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレー
トで培養し、耐性コロニーをm13K07バクテリオファージ
の存在下で選択し、そして増殖させた。上記のように鋳
型を調製し、配列決定によってスクリーニングした。
常法を用いてプラスミドを293細胞にトランスフェク
ションし、上記のようにして発現および産生について検
定した。
ションし、上記のようにして発現および産生について検
定した。
また、ヒンジ領域および不変ドメインCH2およびCH3だ
けを含有する、ヒト免疫グロブリンγ１の不変領域の切
り詰められた部分に融合された長さの異なるCD4のアミ
ノ末端の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質を発
現させるために、プラスミドを構築した。
けを含有する、ヒト免疫グロブリンγ１の不変領域の切
り詰められた部分に融合された長さの異なるCD4のアミ
ノ末端の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質を発
現させるために、プラスミドを構築した。
Ser114からCys215までの免疫グロブリン配列を削除す
るための突然変異誘発反応のプライマーとして合成オリ
ゴヌクレオチドを調製した（Kabat et al.）。これら
を、所望の融合部位のそれぞれの側に24ヌクレオチド
（即ち、所望のCD4部分のCOOH−末端８残基、および所
望の免疫グロブリン部分のNH2−末端８残基に対応す
る）を含む48merとして合成した。プラスミドpRKCD44
γ１、pRKCD42 γ１およびpRKCD41 γ１を大腸菌株SR101
に別々に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プ
レートで培養した。耐性コロニーをm13K07ヘルパーバク
テリオファージの存在下で選択し、増殖させ、これらの
プラスミドの分泌され包膜された１本鎖の鋳型を得た。
この１本鎖プラスミドDNAを単離し、プライマーとして
上記した合成オリゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応
の鋳型として用いた。突然変異誘発反応液を大腸菌SR10
1に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレー
トで培養した。形質転換体を、プローブとして16merを
用い、適切な配列の存在についてコロニーハイブリダイ
ゼーション（Grunstein-Hogness）によってスクリーニ
ングした。これらの16merは、融合部位の両側に８塩基
を含み、選択したハイブリダイゼーション条件は、プロ
ーブだけが正しく融合した産物を検出するに十分厳しい
ものであった。ポジティブと同定されたコロニーを選択
し、プラスミドDNAを単離し、そして大腸菌株SR101中に
導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養し、耐性コロニーをm13K07バクテリオファージの
存在下で選択し、増殖させた。上記のようにして鋳型を
調製し、配列決定によってスクリーニングした。
るための突然変異誘発反応のプライマーとして合成オリ
ゴヌクレオチドを調製した（Kabat et al.）。これら
を、所望の融合部位のそれぞれの側に24ヌクレオチド
（即ち、所望のCD4部分のCOOH−末端８残基、および所
望の免疫グロブリン部分のNH2−末端８残基に対応す
る）を含む48merとして合成した。プラスミドpRKCD44
γ１、pRKCD42 γ１およびpRKCD41 γ１を大腸菌株SR101
に別々に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プ
レートで培養した。耐性コロニーをm13K07ヘルパーバク
テリオファージの存在下で選択し、増殖させ、これらの
プラスミドの分泌され包膜された１本鎖の鋳型を得た。
この１本鎖プラスミドDNAを単離し、プライマーとして
上記した合成オリゴヌクレオチドとの突然変異誘発反応
の鋳型として用いた。突然変異誘発反応液を大腸菌SR10
1に導入し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレー
トで培養した。形質転換体を、プローブとして16merを
用い、適切な配列の存在についてコロニーハイブリダイ
ゼーション（Grunstein-Hogness）によってスクリーニ
ングした。これらの16merは、融合部位の両側に８塩基
を含み、選択したハイブリダイゼーション条件は、プロ
ーブだけが正しく融合した産物を検出するに十分厳しい
ものであった。ポジティブと同定されたコロニーを選択
し、プラスミドDNAを単離し、そして大腸菌株SR101中に
導入した。形質転換培養物をアンピシリン培地プレート
で培養し、耐性コロニーをm13K07バクテリオファージの
存在下で選択し、増殖させた。上記のようにして鋳型を
調製し、配列決定によってスクリーニングした。
プラスミドpRKCD44 γ１から得られたプラスミドをpRK
CD44Fc1と命名し、プラスミドpRKCD42 γ１から得られた
それをpRKCD42Fc1と命名し、そしてプラスミドpRKCD41
γ１から得られたそれをpRKCD41Fc1と命名する。
CD44Fc1と命名し、プラスミドpRKCD42 γ１から得られた
それをpRKCD42Fc1と命名し、そしてプラスミドpRKCD41
γ１から得られたそれをpRKCD41Fc1と命名する。
pRKCD42Fc1、pRKCD41Fc1およびpRKCD44Fc1を上記と同
じ方法で培養し、CH1−削除したCD4免疫アドヘゾンを本
明細書の他の箇所に記載したようにして回収した。
じ方法で培養し、CH1−削除したCD4免疫アドヘゾンを本
明細書の他の箇所に記載したようにして回収した。
軽鎖融合体 ヒト免疫グロブリンκの不変領域に融合させた長さの
異なるCD4のアミノ末端の細胞外ドメインを含むタンパ
ク質を発現させるためにプラスミドを構築した。これら
のプラスミドをpRKCD44 κおよびpRKCD4e4 κと命名す
る。
異なるCD4のアミノ末端の細胞外ドメインを含むタンパ
ク質を発現させるためにプラスミドを構築した。これら
のプラスミドをpRKCD44 κおよびpRKCD4e4 κと命名す
る。
プラスミドpRKCD44 κは、開始コドンから成熟CD4ポリ
ペプチドのセリン残基366のコドン後の融合部位までのC
D4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グロブ
リンκのトレオニン残基109のコドンで始まるヒト免疫
グロブリンκの不変領域の配列を含んでいる（Kabat et
al.）。
ペプチドのセリン残基366のコドン後の融合部位までのC
D4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グロブ
リンκのトレオニン残基109のコドンで始まるヒト免疫
グロブリンκの不変領域の配列を含んでいる（Kabat et
al.）。
プラスミドpRKCD4e4 κは、開始コドンから成熟CD4ポ
リペプチドのリジン残基360のコドン後の融合部位まで
のCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グ
ロブリンκのトレオニン残基109のコドンで始まるヒト
免疫グロブリンκの不変領域の配列を含んでいる（Kaba
t et al.）。
リペプチドのリジン残基360のコドン後の融合部位まで
のCD4遺伝子の一部、これにすぐ続く、成熟ヒト免疫グ
ロブリンκのトレオニン残基109のコドンで始まるヒト
免疫グロブリンκの不変領域の配列を含んでいる（Kaba
t et al.）。
これらのプラスミドは、下記を除き、上記のプラスミ
ドpRKCD44 γ１およびpRKCD4e4 γ１に類似する方法で構
築した。
ドpRKCD44 γ１およびpRKCD4e4 γ１に類似する方法で構
築した。
ヒト免疫グロブリンκ暗号配列（第５図）を、公表さ
れている配列［Hieter,P.A.et al.,Cell 22:197-207
（1980）］に基づくオリゴヌクレオチドを用い、ヒト脾
臓cDNAライブラリー（Clontech Laboratories,Inc.）か
ら得、可変領域の一部および不変領域を含むEcoRI-EspM
Iフラグメントを得た（第５図を参照）。このフラグメ
ントをクレノウフラグメントおよび４種類のdNTPで平滑
化した。このフラグメントをフラグメントa1の代りに用
い、プラスミドpRKCD4TP/hκを構築した。
れている配列［Hieter,P.A.et al.,Cell 22:197-207
（1980）］に基づくオリゴヌクレオチドを用い、ヒト脾
臓cDNAライブラリー（Clontech Laboratories,Inc.）か
ら得、可変領域の一部および不変領域を含むEcoRI-EspM
Iフラグメントを得た（第５図を参照）。このフラグメ
ントをクレノウフラグメントおよび４種類のdNTPで平滑
化した。このフラグメントをフラグメントa1の代りに用
い、プラスミドpRKCD4TP/hκを構築した。
CHO細胞における発現 CHO細胞中で上記の免疫アドヘゾンを発現させるため
に、プラスミドを構築した。これらを、pSVeCD44 γ１SV
DHFR、pSVeCD42 γ１SVDHFR、pSVeCD41 γ１SVDHFR、pSVe
CD4e4 γ１SVDHFR、pSVeCD4e2 γ１SVDHFR、pSVeCD4e1
γ１SVDHFR、pSVeCD44Fc1SVDHFR、pSVeCD42Fc1SVDHFR、
pSVeCD41Fc1SVDHFR、pSVeCD44 κSVDHFR、およびpSVeCD4
2 κSVDHFRと命名する。
に、プラスミドを構築した。これらを、pSVeCD44 γ１SV
DHFR、pSVeCD42 γ１SVDHFR、pSVeCD41 γ１SVDHFR、pSVe
CD4e4 γ１SVDHFR、pSVeCD4e2 γ１SVDHFR、pSVeCD4e1
γ１SVDHFR、pSVeCD44Fc1SVDHFR、pSVeCD42Fc1SVDHFR、
pSVeCD41Fc1SVDHFR、pSVeCD44 κSVDHFR、およびpSVeCD4
2 κSVDHFRと命名する。
フラグメント31は上記のようにして調製した。プラス
ミドpE348HBV.E400 D22をBamHIで消化し、クレノウフラ
グメントおよび４種のdNTPによって平滑化し、次いでPv
uIで消化し、そしてβ−ラクタマーゼ遺伝子の残りおよ
びSV40初期プロモーターおよびDHFR遺伝子を含む大きい
フラグメントを単離することによってフラグメント32a
を調製した。プラスミドpRKCD44 γ１、pRKCD42 γ１、pR
KCD41 γ１、pRKCD4e4 γ１、pRKCD4e2 γ１、pRKCD4e1
γ１、pRKCD44Fc1、pRKCD42Fc1、pRKCD41Fc1、pRKCD44
κおよびpRKCD42 κをHindIIIで別々に消化し、クレノウ
フラグメントおよび４種のdNTPで平滑化し、次いでEcoR
Iで消化し、そしてCD4-Ig融合タンパク質をコードして
いるフラグメントを単離した。得られたDNAフラグメン
トをフラグメント31および32aと連結し、大腸菌株294に
導入した。上記のようにコロニーを選択し、正しいプラ
スミドの存在についてチェックし、次いで常法を用いて
CHO細胞にトランスフェクションし、そしてメトトレキ
セート選択によって増幅した。
ミドpE348HBV.E400 D22をBamHIで消化し、クレノウフラ
グメントおよび４種のdNTPによって平滑化し、次いでPv
uIで消化し、そしてβ−ラクタマーゼ遺伝子の残りおよ
びSV40初期プロモーターおよびDHFR遺伝子を含む大きい
フラグメントを単離することによってフラグメント32a
を調製した。プラスミドpRKCD44 γ１、pRKCD42 γ１、pR
KCD41 γ１、pRKCD4e4 γ１、pRKCD4e2 γ１、pRKCD4e1
γ１、pRKCD44Fc1、pRKCD42Fc1、pRKCD41Fc1、pRKCD44
κおよびpRKCD42 κをHindIIIで別々に消化し、クレノウ
フラグメントおよび４種のdNTPで平滑化し、次いでEcoR
Iで消化し、そしてCD4-Ig融合タンパク質をコードして
いるフラグメントを単離した。得られたDNAフラグメン
トをフラグメント31および32aと連結し、大腸菌株294に
導入した。上記のようにコロニーを選択し、正しいプラ
スミドの存在についてチェックし、次いで常法を用いて
CHO細胞にトランスフェクションし、そしてメトトレキ
セート選択によって増幅した。
実施例5 CD4変異体の培養、精製および製剤 可溶性のCD4アドヘゾン（CD4T、CD4TPまたは可溶性の
CD4免疫アドヘゾンなど）をコードしているプラスミド
を、CHO-DP7［CHOから導かれるプロインスリン−形質転
換したオートクリン（autocrine）宿主細胞;U.S.S.N.9
7,472］にリン酸カルシウムトランスフェクションし、
形質転換体を選択培地（１〜10％の透濾過または透析し
たウシ血清を含む1:1 HAM F12/DMEM GHT-）で増殖させ
た。他の適当な宿主細胞はCHO細胞または293Sヒト胚腎
細胞である。この形質転換体を同じ培地（しかし、500n
Mメトトレキセートを含む）でのメトトレキセート選択
によって増幅した。CD4TP、CD4tp 500bを分泌すること
ができるサブクローンを選択した。CD4TPが培養中に蓄
積するまで、CD4tp 500bを約37℃においてDMEM/HAMF12
培地で培養し、その後、遠心によって培地を細胞および
不溶性物質から分離する。
CD4免疫アドヘゾンなど）をコードしているプラスミド
を、CHO-DP7［CHOから導かれるプロインスリン−形質転
換したオートクリン（autocrine）宿主細胞;U.S.S.N.9
7,472］にリン酸カルシウムトランスフェクションし、
形質転換体を選択培地（１〜10％の透濾過または透析し
たウシ血清を含む1:1 HAM F12/DMEM GHT-）で増殖させ
た。他の適当な宿主細胞はCHO細胞または293Sヒト胚腎
細胞である。この形質転換体を同じ培地（しかし、500n
Mメトトレキセートを含む）でのメトトレキセート選択
によって増幅した。CD4TP、CD4tp 500bを分泌すること
ができるサブクローンを選択した。CD4TPが培養中に蓄
積するまで、CD4tp 500bを約37℃においてDMEM/HAMF12
培地で培養し、その後、遠心によって培地を細胞および
不溶性物質から分離する。
CD4TP形質転換体からの培養液を濃縮し、透濾過して
イオン強度を低下させた。この濃縮物を、培養液から不
純物を吸着するために、大量のＱ−セファロースアニオ
ン交換樹脂（予め25mM NaCl、pH8.5で平衡化する）に通
した。CD4TPの等電点は約9.5であり、従って、それぞれ
カチオン交換樹脂（カルボキシメチルまたはスルホニル
セファロースなど）およびアニオン交換樹脂（４級アン
モニウムセファロースなど）での交互の吸着によって、
切除された形態のCD4とほとんどの不純物を分けること
ができる。さらに、電気陽性度が高いドメインがCD4の
細胞外のセグメントに存在するので、あらゆるCD4含有
変異体はCD4TPと同じ方法で精製される。アニオン交換
樹脂工程からの未吸着の培養液を、次いでカチオン交換
樹脂（予め、pH8.5の25mM NaClで平衡化する）に通し、
これによってCD4TPを樹脂に吸着させた。CD4TPをNaCl勾
配液（pH8.5）で溶離すると、このCD4変異体は約0.2M N
aClで溶離する。硫酸アンモニウムを1.7Mの濃度になる
まで溶離液に加え、この溶液を疎水性相互作用クロマト
グラフィー樹脂（フェニルまたはブチルセファロース）
のカラムに通した。硫酸アンモニウム勾配液を用いてCD
4TPを疎水性相互作用カラムから溶離すると、約0.7M硫
酸アンモニウムでCD4TPが溶離した。この溶離液を濃縮
し、0.02％（w/v）Tween 20またはTween 80を含むリン
酸緩衝食塩水を用い、G-25カラムで緩衝液を交換した。
CD4TPはこの溶液において可溶性かつ安定であり、これ
を滅菌濾過し、そして水性製剤としてバイアルに詰め
た。他のポリマー性のノニオン系界面活性剤がCD4製剤
で用いるのに適しているが、これらにはプルロニックブ
ロックコポリマーまたはポリエチレングリコールが含ま
れる。
イオン強度を低下させた。この濃縮物を、培養液から不
純物を吸着するために、大量のＱ−セファロースアニオ
ン交換樹脂（予め25mM NaCl、pH8.5で平衡化する）に通
した。CD4TPの等電点は約9.5であり、従って、それぞれ
カチオン交換樹脂（カルボキシメチルまたはスルホニル
セファロースなど）およびアニオン交換樹脂（４級アン
モニウムセファロースなど）での交互の吸着によって、
切除された形態のCD4とほとんどの不純物を分けること
ができる。さらに、電気陽性度が高いドメインがCD4の
細胞外のセグメントに存在するので、あらゆるCD4含有
変異体はCD4TPと同じ方法で精製される。アニオン交換
樹脂工程からの未吸着の培養液を、次いでカチオン交換
樹脂（予め、pH8.5の25mM NaClで平衡化する）に通し、
これによってCD4TPを樹脂に吸着させた。CD4TPをNaCl勾
配液（pH8.5）で溶離すると、このCD4変異体は約0.2M N
aClで溶離する。硫酸アンモニウムを1.7Mの濃度になる
まで溶離液に加え、この溶液を疎水性相互作用クロマト
グラフィー樹脂（フェニルまたはブチルセファロース）
のカラムに通した。硫酸アンモニウム勾配液を用いてCD
4TPを疎水性相互作用カラムから溶離すると、約0.7M硫
酸アンモニウムでCD4TPが溶離した。この溶離液を濃縮
し、0.02％（w/v）Tween 20またはTween 80を含むリン
酸緩衝食塩水を用い、G-25カラムで緩衝液を交換した。
CD4TPはこの溶液において可溶性かつ安定であり、これ
を滅菌濾過し、そして水性製剤としてバイアルに詰め
た。他のポリマー性のノニオン系界面活性剤がCD4製剤
で用いるのに適しているが、これらにはプルロニックブ
ロックコポリマーまたはポリエチレングリコールが含ま
れる。
また、可溶性CD4の免疫アフィニティー精製を用いる
ことも可能であるが、これではCD4はCD4に対する固定化
抗体に吸着される。この方法は、酸性条件下での可溶性
CD4の溶離によって、比較的高レベルの界面活性剤のと
きにだけ完全に改善されるタンパク質凝集が導かれると
いう欠点を有している。前述の方法はもっと低い界面活
性剤量、約0.01〜0.10％（w/v）界面活性剤の使用を可
能にする。
ことも可能であるが、これではCD4はCD4に対する固定化
抗体に吸着される。この方法は、酸性条件下での可溶性
CD4の溶離によって、比較的高レベルの界面活性剤のと
きにだけ完全に改善されるタンパク質凝集が導かれると
いう欠点を有している。前述の方法はもっと低い界面活
性剤量、約0.01〜0.10％（w/v）界面活性剤の使用を可
能にする。
免疫グロブリン重鎖とのCD4融合体の精製のために行
われる方法は、限外濾過によって組換え上清を濃縮する
こと、続いて樹脂固定化したブドウ球菌のプロテインＡ
に融合体を吸着させることであった。この融合体を塩ま
たはデタージェントを含まない0.1Mクエン酸緩衝液pH3
によって溶離し、この調製物をpH7.5のトリス緩衝液中
で緩衝化する。CD4 V1-V4との免疫グロブリン融合体
は、所望により、未融合のCD4変異体について上記した
方法によってさらに精製する。また、CD4 V1-V2とのCD4
免疫グロブリン融合体は、この群の分子の等電点がCD4
の４つのＶ領域のすべてを含有している種のものと同じ
ほどアルカリ性であるとは予測されないことを除き、上
記の方法によって精製してもよい。
われる方法は、限外濾過によって組換え上清を濃縮する
こと、続いて樹脂固定化したブドウ球菌のプロテインＡ
に融合体を吸着させることであった。この融合体を塩ま
たはデタージェントを含まない0.1Mクエン酸緩衝液pH3
によって溶離し、この調製物をpH7.5のトリス緩衝液中
で緩衝化する。CD4 V1-V4との免疫グロブリン融合体
は、所望により、未融合のCD4変異体について上記した
方法によってさらに精製する。また、CD4 V1-V2とのCD4
免疫グロブリン融合体は、この群の分子の等電点がCD4
の４つのＶ領域のすべてを含有している種のものと同じ
ほどアルカリ性であるとは予測されないことを除き、上
記の方法によって精製してもよい。
実施例６ いくつかのアドヘゾン変異体の特徴を調べた。第４表
に示したように免疫アドヘゾンCD44 γ１およびCD42 γ１
はウサギにおいて改良した血漿半減期を示し、高親和性
のgp120結合およびFcγ受容体に対する親和性（U937細
胞を用いて測定）（大きいヒトIgG1のそれに匹敵する）
を伴っている。
に示したように免疫アドヘゾンCD44 γ１およびCD42 γ１
はウサギにおいて改良した血漿半減期を示し、高親和性
のgp120結合およびFcγ受容体に対する親和性（U937細
胞を用いて測定）（大きいヒトIgG1のそれに匹敵する）
を伴っている。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．84（1987) ｐ．1649−1653 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．231（1986) ｐ．382−385 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/13 C12P 21/08 C07K 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (25)
- 【請求項１】免疫グロブリンの不変領域のＮ末端に、Ｃ
末端で融合した、クラスＩまたはクラスII主要組織適合
抗原、免疫グロブリンまたはＴ細胞抗原受容体α、β、
γ鎖を除く免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの
細胞表面メンバーの細胞外ドメイン配列を含んでなるポ
リペプチド。 - 【請求項２】ポリペプチドが、 （ａ）ACL； （ｂ）ACL-ACL； （ｃ）ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-ACH、ま
たはVLCL-VHCH］； （ｄ）ACL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｅ）ACL-VHCH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］； （ｆ）VLCL-ACH−［ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-A
CH、またはVLCL-VHCH］；または （ｇ）［Ａ−Ｙ］ｎ−［VLCL-VHCH］２ （ここで、Ａはスーパーファミリーメンバーの可変領域
様ドメインであり；VL、VH、CLおよびCHは免疫グロブリ
ンの軽または重鎖の可変または定常ドメインを表し;nは
整数であり；そして、Ｙは共有架橋剤の残基を表す） よりなる群から選択される請求項１に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項３】VLおよびVHドメインが、予め決めた抗原を
結合することができるものである請求項２に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項４】免疫グロブリン配列が、IgG1、IgG2、IgG
3、IgG4、IgA、IgE、IgD、またはIgMから得られる請求
項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項５】スーパーファミリーのメンバーが、CD1、C
D2、CD3、CD4、CD8、CD28、DX-2、Thy-1、細胞間または
神経細胞付着分子、ポリ−Ig受容体、ミエリン関連グリ
コプロテイン、高親和性IgE受容体、血小板由来成長因
子受容体、コロニー刺激因子−１受容体、Fcガンマ受容
体および癌胚性抗原よりなる群から選択される請求項１
〜４のいずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項６】スーパーファミリーのメンバーがCD2、CD
4、CD8、CD28、CD3のγ、δまたはε鎖、および高親和
性IgE受容体よりなる群から選択される請求項５に記載
のポリペプチド。 - 【請求項７】スーパーファミリーのメンバーがCD4であ
る請求項６に記載のポリペプチド。 - 【請求項８】スーパーファミリーの可変領域様ドメイン
が、そのＣ末端で免疫グロブリンの定常領域のＮ−末端
に融合している請求項１〜７のいずれかに記載のポリペ
プチド。 - 【請求項９】CD4のV1V2またはV1V2V3V4ドメインが、そ
のＣ末端で免疫グロブリンの定常領域に融合している請
求項８に記載のポリペプチド。 - 【請求項１０】免疫グロブリン定常領域が免疫グロブリ
ン重鎖の定常領域である請求項８または９に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項１１】免疫グロブリン定常領域が免疫グロブリ
ン軽鎖の定常領域である請求項８または９に記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項１２】ヒトCD4抗原可変（Ｖ）領域を含んでな
るポリペプチドが、そのＣ末端で、所定の抗原に結合で
きるVLVH抗体結合部位を有するコンパニオン免疫グロブ
リン重鎖−軽鎖ペアと共有結合的に関連する免疫グロブ
リン鎖の定常領域を含んでなるポリペプチドのＮ−末端
に融合している、融合タンパク質を含んでなるCD4ポリ
ペプチド変異体。 - 【請求項１３】ACH-(VLCL-VHCH)、(ACL-ACH)-(VLCL-VHC
H)、(ACL-VHCH)-(VLCL-VHCH)または(VLCL-ACH）−（VLC
L-VHCH)、 （ここで、ＡはヒトCD4抗原Ｖ領域であり、VLおよびVH
はそれぞれ免疫グロブリン軽および重鎖の可変ドメイン
であり、CLおよびCHはそれぞれ免疫グロブリンの軽およ
び重鎖の定常領域である。） である請求項12に記載のCD4ポリペプチド変異体。 - 【請求項１４】融合タンパク質がヒトCD4抗原のＶ−Ｊ
ドメインを含んでなる請求項12または13に記載のポリペ
プチド - 【請求項１５】ヒトCD4抗原が配列Asn-Lys-Val-Val-Leu
-Gly-Lys-Lysを含んでなる請求項12または13に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項１６】免疫グロブリン配列がIgG1、IgG2、IgG
3、IgG4、IgA、IgE、IgDまたはIgMからのものでる請求
項12〜15のいずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項１７】免疫グロブリン配列がIgG-1またはIgG-3
からのものである請求項16に記載のポリペプチド。 - 【請求項１８】免疫グロブリン配列がIgAまたはIgMから
のものである請求項16に記載のポリペプチド。 - 【請求項１９】請求項１〜11のいずれかに記載のポリペ
プチドをコードする核酸。 - 【請求項２０】請求項19に記載の核酸を含んでなる複製
可能なベクター。 - 【請求項２１】請求項19に記載の核酸または請求項20に
記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主細胞。 - 【請求項２２】請求項21に記載の組換え宿主細胞の培養
物からポリペプチドを回収することを含んでなる請求項
１〜11に記載のポリペプチドを製造する方法。 - 【請求項２３】請求項12〜18のいずれかに記載のCD4ポ
リペプチド変異体をコードする核酸。 - 【請求項２４】所定の抗原に対する可変領域を有する免
疫グロブリンをコードする核酸を発現する宿主細胞に、
ヒトCD4抗原可変（Ｖ）領域を含むポリペプチドが、そ
のＣ末端で免疫グロブリン鎖の定常領域を含むポリペプ
チドのＮ末端に融合している融合タンパク質をコードし
ている核酸をトランスフェクトすることを含んでなるCD
4ポリペプチド変異体の製造方法。 - 【請求項２５】CD4ポリペプチド変異体を宿主細胞培養
物から回収する請求項24に記載の方法。
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