PT2383297E

PT2383297E - Anticorpos otimizados que visam cd

Info

Publication number: PT2383297E
Application number: PT111733366T
Authority: PT
Inventors: Matthew J Bernett; Seung Yup Chu; John R Desjarlais; Sher Bahadur Karki; Gregory Alan Lazar; Erik Weiking Pong; John O Richards; Eugene Alexander Zhukovsky
Original assignee: Xencor Inc
Priority date: 2006-08-14
Filing date: 2007-08-14
Publication date: 2013-04-15
Also published as: ME01786B; ES2402591T9; NL301163I2; HUS2200007I1; JP2010500882A; ES2457072T3; US20100272723A1; DK2383297T5; AU2007285976B2; CA2658557C; WO2008022152A2; WO2008022152A3; US20200317804A1; EP2383297B9; HRP20140331T1; HRP20130314T2; JP2011182798A; US10626182B2; DK2383297T3; JP5825756B2

Description

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DESCRIÇÃO "ANTICORPOS OTIMIZADOS QUE VISAM CD 19"

ANTECEDENTES

Células B

As células B são linfócitos que desempenham um papel importante na resposta imune humoral. São produzidas na medula óssea da maioria dos mamíferos, e representam 5-15% do conjunto de circulação linfóide. A principal função das células B é produzir anticorpos contra vários antigénios, e são um componente essencial do sistema imune adaptativo. 0 corpo humano produz milhões de tipos diferentes de células B por dia que circulam no sangue e linfa desempenhando um papel de vigilância imunológica. As células B, também referidas como linfócitos B, não produzem anticorpos até que se tornem plenamente ativadas. Cada célula B tem uma única proteína recetora (referida como a recetora das células B (RCB)) na sua superfície que se irá ligar a um antigénio particular. 0 RCB é uma imunoglobulina ligada a membrana, e é esta molécula que permite a distinção das células B dos outros tipos de linfócitos, assim como é o principal recetor envolvido na ativação das células B. Um vez que as células B encontram o seu antigénio cognato e recebe um sinal adicional da célula T auxiliar, pode diferenciar-se ainda mais nos vários tipos de células B listados a seguir. As células B podem tornar-se ou um desses tipos de células diretamente ou pode sofrer um passo de diferenciação intermédio, a reação de centro germinativo, em que as células B irá hípermutar a região 2 variável do seu gene de imunoglobulina e possivelmente submetidos a mudança de classe. 0 desenvolvimento das células B ocorre através de várias fases, cada fase representando uma mudança no conteúdo genómico nos loci de anticorpos. As fases de

desenvolvimento das células B incluem células B

Progenitoras, Pró-células B Precoces, Pro-células B Tardias, Pré-células B Grande, Pré-células B Pequenas, células B Imaturas, e células B Maduras.

As células B maduras podem ser divididas em quatro tipos principais:

As células B-l expressam CD5, um marcador usualmente encontrado nas células T. As células B-l também expressam IgM em quantidades maiores que IgG. Segregam anticorpos polireativos naturais de baixa afinidade encontrados no soro e frequentemente têm especificidades direcionadas para os próprios antigénios, e polissacáridos bacterianos comuns. As células B-l estão presentes em baixo número nos nódulos linfáticos e no baço e, em vez disso, são encontrados predominantemente nas cavidades peritoniais e pleurais. As células B-2 são as células B convencionais às quais muitos textos se referem. Residem na medula óssea, baço, e nódulos linfáticos. São de curta duração; e quando desencadeadas por antigénios podem diferenciar-se em células B de memória produtoras de IgG. No decurso destas respostas de anticorpo a IgG pode sofrer uma substancial maturação de afinidade.

As células B plasmáticas (também conhecidas como células plasmáticas) são células B grandes que foram expostas a 3 antigénio e produzem e segregam grandes quantidades de anticorpos, que auxiliam na destruição de micróbios ao ligarem e facilitarem o direcionamento pelos fagócitos, assim como a ativação do sistema de complemento. As células plasmáticas são por vezes referidas como fábricas de anticorpos.

As células B de memória são formadas a partir de células B ativadas que são específicas para o antigénio encontrado durante a resposta imune primária. Estas células vivem durante muito tempo, e podem responder rapidamente a seguir a uma segunda exposição ao mesmo antigénio.

Quando as células B falham em qualquer passo do processo de maturação, estas morrerão através de um mecanismo chamado de apoptose. Se reconhecem o seu próprio antigénio durante o processo de maturação, as células B ficarão suprimidas (conhecido como anergia) ou sofrem apoptose. As células B são produzidas continuamente na medula óssea, mas somente uma pequena porção de células B recentemente formadas sobrevive para participar no conjunto de células B periféricas de vida longa.

Nos anos recentes, surgiram dados sugerindo que os linfócitos B desempenham um papel mais vasto nas respostas imunes e não são meramente os recetores passivos de sinais que resultam em diferenciação das células plasmáticas produtoras de anticorpo. Juntamente com os seus papéis tradicionais como células que apresentam antigénios e precursoras de células plasmáticas produtoras de anticorpo, foi também observado que as células B mostraram regular também as funções das células que apresentam antigénio (CAAs) e das célula T, produzir citocinas, e expressar pares recetor/ligando que previamente se tinha pensado serem limitados a outros tipos de células. 4

Distúrbios das células B

Devido ao seu papel critico na regulação do sistema imune, a desregulação das células B está associada a uma diversidade de distúrbios. Os distúrbios das células B, também aqui referidos como doenças relacionadas com as células B, dividem-se em proliferação excessiva ou descontrolada (linfomas, leucemias), e defeitos de desenvolvimento das células B/produção de imunoglobulina (imunodeficiências). A maioria (80%) dos casos de linfoma tem origem nas células B. Estes incluem linfoma não-Hodgkin (LNH.), leucemia linfoblástica aguda (LLA), e doenças autoimunes relacionadas. O LNH é uma malignidade heterogénea com origem nos linfócitos. Nos Estados Unidos (U.S.), a incidência é estimada em 65.000/ano com mortalidade de aproximadamente 20.000 (American Câncer Society, 2006; e SEER Câncer Statistics Review). A doença pode ocorrer em todas as idades, o surgimento habitual começa em adultos acima dos 4 0 anos, com a incidência a aumentar com a idade. O LNH é caracterizado por uma proliferação clonal de linfócitos que se acumulam nos nódulos linfáticos, sangue, medula óssea e baço, embora qualquer órgão importante possa estar envolvido. O diagnóstico e caracterização histológica do LNH são feitos usando uma combinação de critérios morfológicos e de imunofenotipos. O sistema de classificação corrente usado pelos patologistas e clinicos é a Classificação de Tumores da Organização Mundial de Saúde (OMS), o qual organiza o LNH em célula B precursora e madura ou neoplasias das células T. O PD correntemente divide o LNH em indolente ou agressivo para entrada em ensaios clinicos. Para consistência do presente documento será também usada uma 5 divisão similar. 0 grupo de LNH indolente é composto primariamente por subtipos foliculares, linfoma linfocitico de pequenas células, MALT, e zona marginal; o indolente engloba aproximadamente 50% de doentes de LNH de célula B diagnosticados de novo. O LNH agressivo inclui doentes com diagnóstico histológico de células B grandes primariamente difusas (40% de todos os doentes diagnosticados de novo têm células grandes difusas), de Burkitt, e células do manto. O percurso clinico do LNH é altamente variável. Um dos determinantes principais é o subtipo histológico. Os tipos de LNH mais indolentes são considerados como sendo doença incurável. Os doentes respondem inicialmente quer à quimioterapia quer à terapia por anticorpo mas a maioria irá recidivar. Os estudos até à data não demonstraram uma melhoria na sobrevivência coma intervenção precoce. Em doentes assintomáticos, é aceitável "observar e esperar" até que o doente se torne sintomático ou a ritmo doença parecer estar a acelerar. Ao longo do tempo, a doença pode transformar-se numa histologia mais agressiva. A média de sobrevivência é 8 até 10 anos, e os doentes indolentes frequentemente recebem 3 ou mais tratamentos durante a fase de tratamento da sua doença. O tratamento inicial de um doente de LNH indolente sintomático historicamente tem sido a combinação de quimioterapia. Os agentes mais comummente usados incluem: ciclofosfamida, vincristina e prednisona (CVP); ciclofosfamida, adriamicina, vincristina, prednisona (CHOP); ou o análogo da purina, fludarabina. Aproximadamente 70% a 80% dos doentes irá responder à sua quimioterapia inicial, e duração das remissões últimas na ordem de 2-3 anos. Em última análise, a maioria dos doentes recidiva. A descoberta e o uso clinico do anticorpo anti-CD20, rituximab, proporcionou melhorias significativas na resposta e na taxa de sobrevivência. O padrão de tratamento atual para a maioria dos doentes é rituximab + CHOP (R- 6 CHOP) ou rituximab + CVP (R-CVP). 0 interferão está aprovado para tratamento inicial do LNH em combinação com agentes de alquilação, mas tem uso limitado nos U.S. A terapia com rituximab tem mostrado ser eficaz em vários tipos de LNH, e está atualmente aprovada como um tratamento de primeira linha tanto para LNH indolente (linfoma folicular) como agressivo (linfoma das células B grande difuso). Porém, há limitações significativas do anticorpo monoclonal anti-CD20 (mAb), incluindo resistência primária (50% de resposta em doentes indolentes com recidiva), resistência adquirida (50% de taxa de resposta após retratamento), resposta completa rara (2% de taxa de resposta completa em população com recidiva), e um padrão continuado de recidiva. Finalmente, muitas células B não expressam CD20, e assim muitas doenças das células B não são tratáveis usando a terapia de anticorpo anti-CD20. Anticorpos contra antigénios, outros para além do CD20, podem ter efeitos antilinfoma que podem ultrapassar a resistência anti-CD20 ou aumentar a atividade da terapia anti-CD2 0.

Para além do LNH existem vários tipos de leucemias que resultam da desregulação das células B. A leucemia linfocitica crónica (também conhecida como "leucemia linfóide crónica" ou "da célula"), é um tipo de leucemia de adulto causada por uma acumulação anormal de linfócitos B. Em LLC, os linfócitos malignos podem parecer normais e maduros, mas não são capazes de lidar de forma eficaz com a infeção. A LLC é a forma mais comum de leucemia em adultos. Os homens são duas vezes mais propensos a desenvolver LLC que as mulheres. No entanto, o fator de risco chave é a idade. Mais de 75% dos novos casos são diagnosticados em doentes com idade acima dos 50. Mais de 10.000 casos são diagnosticados todos os anos e a mortalidade é praticamente 7 5.000 por ano (American Câncer Society, 2006; e SEER Câncer Statistics Review). A LLC é uma doença incurável mas que progride lentamente na maioria dos casos. Muitas pessoas com LLC levam uma vida normal e ativa durante muitos anos. Devido ao seu inicio lento, as fases iniciais de LLC não são geralmente tratados uma vez que se acredita que a intervenção precoce de LLC não aumenta o tempo de sobrevida ou a qualidade de vida. Em vez disso, a condição é monitorizada ao longo do tempo. Os tratamentos iniciais de LLC variam dependendo no diagnóstico exato e da progressão da doença. Existem dezenas de agentes usados para a terapia de LLC. Embora o análogo da purina fludarabina mostra dar taxas de resposta superiores ao clorambucilo como terapia primária, não há evidência que o uso precoce da fludarabina aumenta a sobrevida global. A combinação dos regimes de quimioterapia tais como fludarabina com ciclofosfamida, FCR (fludarabina, ciclofosfamida e rituximab) e CHOP são eficazes tanto em novos diagnosticados ou em LLC recidivados. O transplante da medula óssea alogénica (células estaminais) é raramente usado como um tratamento de primeira linha para LLC devido ao seu risco. A LLC "refratária" é uma doença que já não responde favoravelmente ao tratamento. Neste caso são consideradas as terapias mais agressivas, incluindo o transplante de medula óssea (células estaminais). 0 anticorpo monoclonal alemtuzumab, direcionado contra CD52, pode ser usado em doentes com doença refratária baseada na medula óssea.

Um outro tipo de leucemia é a leucemia linfoblástica aguda (LLA), também conhecida como leucemia linfocitica aguda. A LLA é caracterizada pela sobreprodução e multiplicação continua de glóbulos brancos imaturos e malignos (também conhecidos como linfoblastos) na medula óssea. 'Aguda' refere-se a estado imaturo, indiferenciado, de linfócitos em circulação ("blastos"), e em que a doença progride rapidamente com expetativa de vida de semanas a meses, se não tratada. A LLA é a mais comum na infância com um pico de incidência aos 4-5 anos de idade. As crianças de 12-16 anos de idade morrem mais facilmente desta do que as outras. Atualmente, pelo menos 80% de crianças com LLA são consideradas curáveis. Menos de 4.000 casos são diagnosticados todos os anos e a mortalidade é quase 1.500 por ano (American Câncer Society, 2006; e SEER Câncer Statistics Review). A autoimunidade resulta de uma rutura da autotolerância envolvendo mecanismos imunes humorais e/ou mediados por célula. Entre as consequências da falha na tolerância central e/ou periférica, são a sobrevivência e a ativação das células B e células T auto reativas. Exemplos de doenças autoimunes incluem, por exemplo, artrite reumatóide (RA) , sistema de lúpus eritematoso (SLE ou lúpus), esclerose múltipla, Sindrome de Sjogren, e púrpura trombocitopénia idiopática (PTI) . A patogénese da maioria das doenças autoimunes está ligada à produção de auto-anticorpos contra antigénios próprios, conduzindo a uma diversidade de patologias associadas. Os autoanticorpos são produzidos por células plasmáticas terminalmente diferenciadas que são derivadas de células B naives ou de memória. Além disso, as células B podem ter outros efeitos na patologia autoimune, como células apresentando antigénio (CAAs) que pode interagir com e estimular as células T auxiliares, estimulando adicionalmente o ciclo da resposta imune anti-própria. A depleção das células B pode ter impacto direto na produção de autoanticorpos. De facto, o tratamento da RA e SLE com as terapias de deplexão das células B tais como Rituxan foi demonstrado ter beneficio 9 clínico para as duas classes de doença (Edwards & Cambridge, Nat. Rev. Immunol. 2006; Dass et al., Future Rheumatol. 2006; Martin & Chan, Annu. Rev. Immunol. 2066).

Infelizmente, não se sabe a priori quais os mecanismos de ação que podem ser ótimos para um dado antigénio alvo. Além disso, não são conhecidos quais os anticorpos que podem ser capazes de mediar um dado mecanismo de ação contra uma célula alvo. Em alguns casos uma falta de atividade de anticorpo, tanto mediado por Fv como mediado por Fc, pode ser devido ao direcionamento de um epitopo no antigénio alvo que é fraco para mediar essa atividade. Noutros casos, o epitopo alvo pode ser propício a uma desejada atividade mediada por Fv ou mediada por Fc, mas a afinidade (afinidade da região Fv para antigénio ou afinidade da região Fc para os recetores Fc) pode ser insuficiente. No sentido de resolver este problema, a presente invenção descreve modificações para anticorpos anti-CD19 que forneça atividades otimizadas mediadas por Fv e Fc. Uma vasta gama de aplicações destes anticorpos otimizados é contemplada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É aqui descrito um anticorpo que se liga a CD19, em que o referido anticorpo compreende pelo menos uma modificação na região constante em relação ao anticorpo parente. O anticorpo descrito acima liga-se com afinidade alterada a um recetor Fc ou altera a função efetora em comparação com o anticorpo parente. É também divulgado um anticorpo que se liga a CD19, incluindo pelo menos uma modificação na região constante em relação a um anticorpo anti-CD 19 parente, em que o 10 anticorpo se liga com afinidade aumentada ao Recetor de FcYRIIIa em comparação com o anticorpo parente.

Em certos aspetos, a modificação é um aminoácido. A modificação pode ser numa posição selecionada a partir do grupe ' que con siste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278; 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332 , 333 , 334 , 335, 336, e 337, em que a numeração é i de ac :ordo com o i ndice EU. A modifi cação aminoácido pode ser uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste de 221 K, 221 Y, 222E, 222 Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 2351, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 23 6N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 23 9E, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 2401, 240M, 24 0T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 2 60D, 2 60E, 2 60H, 2 60Y, 2 62A, 2 62E, 2 62F, 11

2621, 2 62Τ, 2 63A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 64A, 2 64D, 2 64E, 2 64F 2 64G, 2 64Η, 2641, 2 64K, 2 64L, 2 64M, 264N, 2 64P, 2 64Q, 2 64R 264S, 2 64Τ, 2 64W, 2 64Y, 2 65F, 2 65G, 2 65H, 2651, 2 65K, 2 65L 2 65Μ, 2 65Ν, 2 65P, 2 65Q, 2 65R, 2 65S, 2 65T, 2 65V, 2 65W, 2 65Y 2 6 6Α, 2661, 2 6 6M, 2 66T, 2 67D, 2 67E, 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67K 2 67L, 2 67Μ, 2 67N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R, 2 67T, 2 67V, 2 67W, 2 67Y 2 68D, 2 68Ε, 2 68F, 2 68G, 2681, 2 68K, 2 68L, 2 68M, 2 68P, 2 68Q 2 68R, 2 68Τ, 2 68V, 2 68W, 2 69F, 2 69G, 2 69H, 2691, 269K, 269L 2 69Μ, 2 69Ν, 2 69P, 2 69R, 269S, 2 69T, 2 69V, 2 69W, 2 69Y, 27 0F 27 0G, 2 7 OH, 2701, 27 0L, 2 7 OM, 27 0P, 27 0Q, 27 0R, 2 7 0 S, 27 0T 27 0W, 27 0Y, 271 A, 271D, 271E, 271F, 271G, 2 71H, 2711 271Κ, 271L, 271M, 271N , 271Q , 271 R, 271 S, 271T, 271V 271W, 271Y, 272D, 272F, 2 72G, 272H, 2721, 272K, 272L, 272M 272Ρ, 2 72R, 2 72 S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 2731, 274D, 274E 274F, 21 AG, 274H, 2741, 27 4L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H 2761, 276L, 27 6M, 276P, 276R, 2765, 276T, 276V, 276W, 276Y 27 8D, 278E, 278G, 27 8H, 2781, 27 8K, 278L, 27 8M, 278N, 278P 27 8Q, 278R, 278S, 27 8T, 27 8V, 278W, 280G, 280K, 2 8 OL, 280P 280W, 2 81D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G 2 82Κ, 282P, 2 8 2 Y; 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y 284D, 2 84E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K 285Q, 285W, 285Y, 2 8 6E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y 2 90D, 2 90H, 2 90L, 2 90N, 2 90W, 2 91D, 2 91E, 2 91G, 2 91H, 2911 2 91Q, 2 91T, 2 92D, 2 92E, 2 92T, 2 92 Y, 2 93F, 2 93G, 2 93H, 2931 2 93L, 2 93M, 2 93N, 2 93P, 2 93R, 2 93S, 2 93T, 2 93V, 2 93V, 2 93Y 2 94F, 2 94G, 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 2 94M, 2 94P, 2 94R, 294S 2 94Τ, 2 94V, 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 9SE, 2 95F, 2 95G, 2 95H, 2951 2 95Μ, 2 95N, 2 95P, 2 95R, 2 95S, 2 95T, 2 95V, 2 95W, 2 95Y, 2 9 6A 2 96D, 296E, 2 96G, 2 96H, 2961, 2 96K, 2 96L, 2 96M, 296N, 2 9 6Q 2 96R, 296S, 2 96T, 2 96V, 2 97D, 2 97E, 2 97F, 2 97G, 2 97H, 2971 2 97Κ, 2 97L, 2 97M, 2 97P, 2 97Q, 2 97R, 2 97S, 2 97T, 2 97V, 2 97W 2 97Υ, 2 98A, 2 98D, 2 98E, 2 98F, 2 98H, 2981, 2 98K, 2 98M, 2 98N 2 98Q, 2 98R, 2 98T, 2 98W, 2 98Y, 2 99A, 2 99D, 2 99E, 2 99F, 2 99G 2 99Η, 2991, 299K, 2 99L, 2 99M, 2 99N, 2 99P, 2 99Q, 2 99R, 2 99S 12 2 99V, 2 99W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 32 0F, 320G, 32 OH, 3201, 320L, 32 0N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 3221, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322 Y, 3231, 324D, 324F, 324G, 324H, 3241, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 3261, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328T, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329L, 32 9M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 3341, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 3351, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, e 33' 7N, em que a numeração é de acordo com o índice EU.

Em aspetos adicionais, a modificação de aminoácido pode ser numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 245, 246, 247, 249 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 2 66, 267, 268, 269, 270 271, 272, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 324 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 13 e 337. Em aspetos adicionais, a substituição pode ser

selecionada a partir do grupe i que consiste de 221K, 222 Y 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V 233W, 233Y, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 235D, 235F 235G, 235H, 2351, 235K, 235M, 235N, 235Q, 235R, 235S, 235T 235V, 235W, 235Y, 236D, 236E, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y 237D, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 2391 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 2 3 9W 239Y, 2 4 OM, 240T, 241D, 2 41E, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 245A, 246D, 246H, 246Y, 247G 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 2 60D 2 60E, 2 60H, 260Y, 262A, 2 62E, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631 2 63M, 2 63T, 2 64D, 2 64E, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64L 2 64M, 2 64N, 2 64P, 264Q, 2 64R, 264S, 2 64T, 2 64W, 2 64Y, 2 65F 2 65G, 2 65H, 2651, 2 65K, 2 65L, 2 65M, 2 65P, 2 65Q, 2 65R, 2 65S 2 65T, 2 65V, 2 65W, 2 65Y, 2 6 6A, 2661, 2 66M, 2 66T, 2 67D, 2 67E 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67K, 267L, 2 67M, 2 67N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R 2 67V, 267W, 267Y, 2 68F, 2 68G, 2681, 2 68M, 2 68P, 2 68T, 2 68V 268W, 2 69F, 2 69G, 269H, 2691, 2 69L, 2 69M, 2 69N, 2 69P, 2 69R 269S, 2 69T, 2 69V, 2 69W, 2 69Y, 27 0F, 27 0G, 270H, 2701, 270L 27 0M, 27 0P, 27 0Q, 27 0R, 270S, 27 0T, 270W, 27 0Y, 271A, 271D 271E, 271F, 271G, 271H, 2711, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 2721 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 2741, 274L, 274M, 274P, 274R 274T, 274V, 274W, 274Y, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 2Z6H 2761, 276L, 27 6M, 276P, 276R, 27 6S, 276T, 276V, 276W, 27 8D 14

2 7 8Ε, 278G, 278H, 2781, 278K, 27 8L, 278M, 278N, 278P, 278Q 2 7 8R, 2 7 8 S, 27 8T, 278V, 278W, 2 8 OG, 280P, 2 8 OW, 2 81E, 2 81K 2 8 IN, 281P, 2 81Y, 2 82G, 282P, 2 82Y, 283G, 283H, 283K, 283L 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285K, 285Q 2 8 5W, 285Y, 286G, 286P, 286Y, 288Y, 2 90H, 2 90L, 2 90W, 2 91D 291E, 2 91G, 2 91H, 2911, 2 91Q, 2 91T, 2 92D, 2 92E, 2 92T, 292Y 2 93F, 2 93G, 2 93H, 2931, 2 93L, 2 93M, 2 93N, 2 93P, 2 93R, 293S 2 93T, 2 93W, 2 93Y, 2 94F, 2 94G, 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 294M 2 94P, 2 94R, 294S, 2 94T, 2 94V, 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 95F, 295G 2 95H, 2951, 2 95M, 2 95N, 2 95P, 2 95R, 2 95S, 2 95T, 2 95V, 295W 2 95Y, 2 9 6A, 2 96D, 296E, 2 96G, 2961, 296K, 2 96L, 296M, 296N 2 96Q, 2 96R, 296S, 2 96T, 2 96V, 2 97D, 2 97E, 2 97F, 2 97G, 297H 2971, 2 97K, 2 97L, 2 97M, 2 97P, 2 97R, 2 97 S, 2 97T, 2 97V, 297W 2 97Y, 298E, , 2 98F , 2 98H, 2981, 2981L, 2 98M, 2 98Q, 298R 2 98W, 2 98Y, 2 99A, 2 99D, 2 99E, 2 99F, 2 99G, 2 99H, 2991, 299K 2 99L, 299M, 299N, 2 99P, 2 99Q, 2 99R, 299S, 299V, 299W, 299Y 3 0 OA, 300D, 3 0 OE, 300G, 3 0 OH, 300K, 3 0 OM, 3 0 ΟΝ, 300P, 300Q 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 3021, 303D 303E, 303Y, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 32 OD, 32 OF, 320G 32 OH, 3201, 32 OL, 32 ON, 320P, 320S, 320T, 32 OV, 32 OW, 32 OY 322D, 322F, 322G, 322H, 3221, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W 322Y, 324D, 324F, 324G, 324H, 3241, 324L, 324M, 324P, 324R 324T, 324V, 324W, 324Y, 32 5A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H 3251, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V 325W, 325Y, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 32 7 F, 327H, 3271 327K, 327L, 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D 328E, 328F, 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H 3291, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V 329W, 329Y, 330E, 330F, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331Q, 33IQ, 331R 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L, 332M, 332N 332P, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 3331 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 335D, 335F 15 15 335G, 335Η, 335Υ, 336Ε, 3351, 335L, 335Μ, 336Κ, 336Υ, 337Η, 335Ρ, 335R, 335S, e 337N. 335V, 335W,

Num aspeto adicional, a modificação é numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 325, 328, 332, 336, em que numeração de posicionamento é de acordo com o indice EU. Em aspetos adicionais, a modifi .cação é selecionada a partir do grupo que consiste de 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 2 31G, 231K, 231P, 231Y, 2 32E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 2401, 240M, 240T, 244H, 245A, 247G, 247V, 2 62A, 2 62E, 2 62F, 2621, 2 62T, -263A , 2631, 2 63M, 263T, 266A, 2 661, 2 6 6M, 2 66T, 2 7 IA, 271D, 271E, 271F, 2 71G, 2 71H, r 27H, 2 71K, 271L, 2 71M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 27 1T, 271V, 271W, 271Y, 2731, 27 5L, 275W, 2 81D, 281E, 2 81K, 2 8 IN, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 2 8 4Q, 284T, 284Y, 2 91D, 2 91E, 2 91G, 2 91H, 2911, 2 91Q, 2 91T, 2 9 9A, 2 99D, 2 99E, 2 99F, 2 99G, 2 99H, 2991, 2 99K, 2 99L, 2 99M, 2 99N, 2 99P, 2 99Q, 2 99R, 299S, 2 99V, 299W, 2 99Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 3231, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332 Y, 336E, 336K, e 336Y. 0 anticorpo pode incluir adicionalmente uma segunda modificação de aminoácido numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228 230 , 231, 232 , 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 243 , 244, 245 , 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264 265 , 266, 267 , 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276 16 278, 280, 281, 282 :, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 290 i, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303 , 304, 305, 313, 317, 318 !, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327 , 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 , 335 , 336, e 337, em que a numeração é de acordo coir L O indice EU. A segunda modificação aminoácido pode : ser uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste de 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 2 31E, 2 31G, 2 31K, 231P, 231Y, 2 32E, 2 32G, 2 32K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 2 3 5 G, 235H, 2351, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 2 3 6A, 236D, 236E, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 2 37 S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239L, 2 3 9M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 2 4 0A, 2401, 2 4 0M, 240T, 241D, 2 41E, 241L, 2 4 IR, 2 41S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 2 4 9Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 2585, 258Y, 2 60D, 2 60E, 2 60H, 2 60Y, 2 62A, 2 62E, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 64A, 2 64D, 2 64E, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64L, 2 64M, 2 64N, 2 64P, 2 64Q, 2 64R, 2 64 S, 2 64T, 2 64W, 2 64Y, 2 65F, 2 65G, 2 65H, 2651, 2 65K, 2 65L, 2 65M, 2 65N, 2 65P, 2 65Q, 2 65R, 2 65S, 2 65T, 2 65V, 2 65W, 2 66Y, 2 6 6A, 2661, 2 6 6M, 2 66T, 2 67D, 2 67E, 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67K, 267L, 2 67M, 2 67N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R, 2 67T, 2 67V, 2 67W, 2 67Y, 2 68D, 2 68E, 2 68F, 2 68G, 2681, 2 68K, 2 68L, 2 68M, 2 68P, 2 68Q, 2 68R, 2 68T, 2 68V, 2 68W, 2 69F, 2 69G, 2 69H, 2691, 269K, 2 69L, 269M, 269N, 2 69P, 2 69R, 269S, 269T, 269V, 17

2 69W, 2 69Υ, 27 0F, 270G, 2 7 ΟΗ, 2701, 27 0L, 2 7 ΟΜ, 27 0Ρ, 27 0Q 27 0R, 270S, 27 0Τ, 2 7 0W, 27 0Υ, 2 7 ΙΑ, 271D, 2 7 ΙΕ, 271F, 271G 271Η, 2711, 271Κ, 271L, 271Μ, 271Ν, 271Q, 271R, 271S, 271Τ 271V, 271W, 271Υ, 272D, 272F, 272G, 272Η, 2721, 272Κ, 272L 272Μ, 272Ρ, 272R, 2725, 272Τ, 272V, 272W, 272Υ, 2731, 274D 274Ε, 274F, 274G, 274Η, 2741, 274L, 274Μ, 274Ν, 274Ρ, 274R 274Τ, 274V, 274W, 274Υ, 275L, 275W, 276D, 276Ε, 276F, 276G 27 6Η, 2761, 276L, 27 6Μ, 276Ρ, 276R, 27 6S, 276Τ, 276V, 2 7 6W 27 6Υ, 278D, 278Ε, 278G, 27 8Η, 2781, 278Κ, 27 8L, 27 8Μ, 278Ν 27 8Ρ, 27 8Q, 278R, 278S, 278Τ, 278V, 278W, 280G, 2 8 ΟΚ, 280L 280Ρ, 280W, 281D, 281Ε, 281Κ, 281Ν, 281Ρ, 281Q, 281Υ, 2 82Ε 2 82G, 2 82Κ, 282Ρ, 2 82Υ, 283G, 283Η, 283Κ, 283L, 283Ρ, 283R 283Υ, 284D, 284Ε, 284L, 284Ν, 284Q, 284Τ, 284Υ, 285D, 285Ε 2 8 5Κ, 285Q, 285W, 285Υ, 286Ε, 286G, 286Ρ, 286Υ, 288D, 288Ε 2 8 8Υ, 2 90D, 2 90Η, 2 90L, 2 90Ν, 290W, 2 91D, 2 91Ε, 2 91G, 2 91Η 2911, 2 91Q, 2 91Τ, 2 92D, 2 92Ε, 2 92Τ, 2 92Υ, 2 93F, 2 93G, 2 93Η 2931, 2 93L, 2 93Μ, 2 93Ν, 2 93Ρ, 2 93R, 2 93S, 2 93Τ, 2 93V, 293W 2 93Υ, 2 94F, 2 94G, 2 94Η, 2941, 2 94Κ, 2 94L, 2 94Μ, 2 94Ρ, 2 94R 2 94 S, 2 94Τ, 2 94V, 2 94W, 2 94 Υ, 2 95D, 2 95Ε, 2 95F, 2 95G, 2 95Η 2951, 2 95Μ, 2 95Ν, 2 95Ρ, 2 95R, 295S, 2 95Τ, 2 95V, 2 95W, 2 95Υ 2 9 6Α, 2 9 6D, 2 96Ε, 2 96G, 2 96Η, 2961, 236Κ, 2 96L, 2 96Μ, 2 96Ν 2 96Q, 2 96R, 296S, 2 96Τ, 2 96V, 2 97D, 2 97Ε, 2 97F, 2 97G, 2 97Η 2971, 2 97Κ, 2 97L, 2 97Μ, 2 97Ρ, 2 97Q, 2 97R, 2 97S, 2 97Τ, 2 97V 2 97W, 2 97 Υ, 2 98Α, 2 98D, 2 98Ε, 2 98F, 2 98Η, 2981, 2 98Κ, 2 98Μ 2 98Ν, 2 98Q, 2 98R, 2 98Τ, 2 98W, 2 98Υ, 2 99Α, 2 99D, 2 99Ε, 2 99F 2 99G, 299Η, 2991, 2 99Κ, 2 99L, 2 99Μ, 2 99Ν, 2 99Ρ, 2 99Q, 299R 299S, 299V, 299W, 2 99Υ, 300Α, 300D, 300Ε, 300G, 300Η, 300Κ 300Μ, 300Ν, 300Ρ, 300Q, 300R, 300S, 300Τ, 300V, 300W, 301D 301Ε, 301Η, 301Υ, 3021, 303D, 303Ε, 303Υ, 304D, 304Η, 304L 304Ν, 304Τ, 305Ε, 305Τ, 305Υ, 313F, 317Ε, 317Q, 318Η, 318L 318Q, 318R, 318Υ, 320D, 320F, 320G, 32 ΟΗ, 3201, 320L, 32 ΟΝ 320Ρ, 32 0 S, 320Τ, 32 0V, 320W, 32 ΟΥ, 322D, 322F, 322G, 322Η 3221, 322Ρ, 322S, 322Τ, 322V, 322W, 322Υ, 3231, 324D, 324F 324G, 324Η, 3241, 324L, 324Μ, 324Ρ, 324R, 324Τ, 324V, 324W 324Υ, 325Α, 325D, 325Ε, 325F, 325G, 325Η, 3251, 325Κ, 325L 18 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 3261, 326L, 326P, 32 6T, 327D, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 3341, 334L, 334P, 334T, 335D, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 336Y, 337E, 337H, e 337N, em com o indice : EU.

325T, 325V, 325W, 325Y, 326E 327E, 327F, 327H, 3271, 327K 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y 328H, 3281, 328K, 328M, 328N 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E 329L, 32 9M, 329N, 329Q, 329R 330E, 330F, 330G, 330H, 3301 3305, 330T, 330V, 330W, 330Y 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V 332F, 332H, 332K, 332L, 332M 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F 335F, 335G, 335H, 3351, 335L 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K que a numeração é de acordo

Em aspetos adicionais, a modificação aminoácido é 332E. A segunda modificação aminoácido pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de: 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y, e 330L. Em certos aspetos, a segunda modificação aminoácido é 239D.

Noutros aspetos, a modificação é uma modificação glicoforma que reduz o nivel de fucose em relação ao anticorpo parente. Ainda noutros aspetos, a invenção é dirigida para uma composição incluindo pluralidade de anticorpos glicosilados como definido nas reivindicações, em que cerca de 80-100% dos anticorpos glicosilados na composição compreende uma estrutura de núcleo de hidrato de carbono madura que não possui fucose.

Numa forma de realização adicional, o anticorpo reduz a ligação a FcYRIIb em comparação com o anticorpo anti-CD19 parente. 19 A invenção é dirigida para um anticorpo que se liga a CD19 e compreende uma cadeia pesada variável com a SEQ ID NO:40 e uma cadeia leve variável com a SEQ ID NO: 58. A cadeia pesada tem uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 132, uma CDR2 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:116. A cadeia leve tem uma CDRl compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs:129, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:130.

Um anticorpo aqui descrito pode ter uma sequência variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 13-16, 20-23, e 27-39 e 41-44, e/ou uma sequência variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 17-19, 24-26, e 45-57 e 59-79.

Ainda noutras variações, o anticorpo inclui uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 86 e 88 até 95, e/ou uma sequência de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 96 até 105 e 107 até 110. O anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve SEQ ID NO:106 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID NO:87.

Em vários aspetos adicionais, a invenção é dirigida para uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo como definido nas reivindicações. A presente invenção relaciona-se com um anticorpo como definido nas reivindicações ou uma composição como definida nas reivindicações para uso no tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de linfomas não 20

Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda das células B/linfoma (B-LLA), e linfoma de células do manto (LCM).

Em aspetos adicionais, a invenção é dirigida para uma composição compreendendo um anticorpo ou composição como definida nas reivindicações e um transportador aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos seguintes ilustram adicionalmente aspetos da invenção, e não são entendidos para limitar a invenção para qualquer aplicação particular ou teoria da operação.

Figura 1: Sequência de aminoácidos de CD 19 homo sapiens, como obtido a partir de cDNA clone MGC:12802, IMAGEM:4054919, Número de acesso GenBank:BC006338.

Figura 2. Sequências de regiões constantes naturais de anticorpo, incluindo a cadeia leve de constante kappa de cadeia leve, e a cadeia pesada de constante gama para IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. É também fornecida a sequência de um cadeia constante IgG Híbrida, e uma cadeia constante IgG Híbrida compreendendo as substituições 239D e I332E.

Figura 3. Alinhamento das sequências de aminoácidos das imunoglobulinas IgG humanas IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. A Figura 3a fornece as sequências dos domínios CHI (CyI) e de articulação, e a Figura 3b fornece as sequências de domínios CH2 (Cy2) e CH3 (Cy3) . As posições são numeradas de acordo com o índice EU da sequência de IgGl, e diferenças entre IgGl e as outras imunoglobulinas IgG2, IgG3, e IgG4 são mostradas a cinzento. Existe polimorfismo alotípico num número de posições, e assim podem existir pequenas diferenças entre as sequências apresentadas e as 21 sequências da técnica anterior. Os inícios possíveis da região Fc são marcados, aqui definidos como posição EU 226 ou 230.

Figura 4. Os haplotipos comuns da cadeia gama da IgGl humana (Figura 4a) e IgG2 (Figura 4b) mostram as posições e as substituições relevantes de aminoácidos.

Figura 5. Formas de realização preferidas dos perfis de ligação ao recetor que incluem aumentos de, reduções de, ou sem efeito na ligação a vários recetores, onde essas mudanças podem ser benéficas em certos contextos.

Figura 6. Sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do 4G7 original e anticorpos HD37 (HO e LO) . A Figura 6a fornece as sequências dos domínios VH e VL, e a Figura 6b fornece as sequências das CDRs. Os limites de CDR são determinados de acordo com a convenção de Kabat (VH CDRl: 31-35b, VH CDR2: 50-65, VH CDR3: 95-102, VL CDRl: 24-34, VL CDR2: 50-56, e VL CDR3: 89-97) .

Figura 7. Afinidades de ligação relativas de Híbrido 4G7 S239D/I332E e anticorpo 4G7 IgG 1 a um painel de recetores Fc.

Figura 8. CMCA de Híbrido 4G7 S239D/I332E, híbrido HD37 S239D/I332E, 4G7 IgGl, HD37 IgGl, e um anticorpo de controlo negativo na linha de células Daudi (Figura 8a) e CMCA de Híbrido 4G7 S239D/I332E, 4G7 IgGl, rituximab, e um anticorpo de controlo negativo nas linhas de células SUP-B15 e Raji (Figura 8b).

Figura 9. Um ensaio de ligação de superfície celular de Híbrido 4G7 S239D/1332E às células Raji. 22

Figura 10. A Figura 10a mostra ensaios CMCA de Hibrido 4G7 S239D/I332E, 4G7 IgGl, e rituximab num painel de 14 linhas de células representando vários linfomas e leucemias. Ambos os parâmetros de potência (EC50) e eficácia (% CMCA) são normalizados para o rituximab (anti-CD20). A Figura 10b lista os linfomas testados e as linhas de células de leucemia.

Figura 11. Sequências da região variável de cadeia pesada com reduzida imunogenicidade para anticorpo 4G7 anti-CD19.

Figura 12. Sequências da região variável de cadeia leve com reduzida imunogenicidade para anticorpo 4G7 anti-CD19.

Figura 13. Sequências da região variável de cadeia pesada reduzida imunogenicidade para anticorpo HD37 anti-CD19.

Figura 14. Sequências da região variável de cadeia leve de reduzida imunogenicidade para anticorpo HD37 anti-CD19.

Figura 15. Resultados de um ensaio de ligação de superfície celular de variantes 4G7 de imunogenicidade reduzida a células Raji (Figura 15a) e CMCA de HD37_H2L1 Híbrido S239D/I332E e 4G7_H1L3 Híbrido S239D/I332E em células MEC-1 (Figura 15b).

Figura 16. Afinidade de ligação celular em células RS4; 11 de afinidade amadurecida 4G7 em relação a H1L1 mAb.

Figura 17. Dados de afinidade de ligação celular a células RS4;11 de variantes 4G7 incubadas durante 5 dias a 37°C, pH 9,0 em 200 mM de Tris-LCP mostrando a estabilidade melhorada obtida. 23

Figura 18. Sequências para variantes de cadeia pesada de anti-CD19 que aumentam a afinidade e/ou a estabilidade.

Figura 19. Sequências para variantes de cadeia leve de anti-CD19 que aumentam a afinidade e/ou a estabilidade.

Figura 20. Propriedades antiproliferativas do Hibrido 4G7 S239D/I332E em células Raji.

Figura 21. Propriedades antiproliferativas do Hibrido S239D/I332E 4G7 de estabilidade e afinidade melhoradas em células SU-DHL-6 com e sem ligação cruzada.

Figura 22. Fagocitose de células Raji e RS4;11 com Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas de 4G7.

Figura 23. CMCA Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas de 4G7 contra linhas de células de linfoma múltiplo usando células assassinas naturais (NK) purificadas.

Figura 24. Hibrido S239D/1332E de estabilidade e afinidade melhoradas 4G7 que se liga a células 293T transfetadas com CD19 humanas.

Figura 25. Reatividade cruzada de estabilidade de 4G7 e afinidade melhorada do Hibrido S239D/1332E para os CD19 de conimolgos e rhésus.

Figura 26. CMCA em células RS4;11 e MEC-1 usando um anticorpo anti-CD19 de função efetora melhorada (Híbrido S239D/I332E 4G7 H1L1) com baixo conteúdo em fucose proporcionada pela expressão no sistema Lecl3. 24

Figura 27. Substituições únicas feitas para maior estabilidade e/ou afinidade. A numeração da região variável é de acordo com Kabat. Um conjunto expandido de posições está incluido nas CDRs. Os limites da CDR canónica definidos por Kabat, como listado na Figura 6, são realçados a cinza.

Figura 28. Variantes da região variável anti-CD19 construídas para otimizar a afinidade e estabilidade.

Figura 29. Variantes preferidas e aumento relativo na afinidade de ligação versus o parente H1L1 mAb.

Figura 30. Ensaio de proliferação das células B, mostrando a capacidade de variantes de anticorpos anti-CD19 para inibir a viabilidade de células B primárias. A Figura 30a mostra a dependência da dose do anticorpo anti-mu na proliferação de células B. A Figura 30b mostra a proliferação de células B na presença de anti-mu fixado (2 mg/mL) mais concentrações variadas de anticorpos controlo da variante WT e Fc de anti-CD19, e variante Fc anti-CD30. Anti-Anti-CDl9_IgGl_WT = 4G7_H3_L1 IgGl_WT, Anti- CD19_Hybrid_S239D/I332E = 4G7_H3_Ll_Hybrid_239D/332E, e

Anti-CD30_S239D/I332E, aqui usado como um controlo negativo, = AC10 H3.69V2 L3.71 Híbrido_239D/332E (como divulgado na US 2007/0166309, Lazar G.A. et al., arquivado em 15 de Março, 2007) .

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A divulgação é direcionada para anticorpos anti-CD19 modificados e métodos para uso dos mesmos. Em vários aspetos, os anticorpos podem ter um tendo uma região Fc modificada, sequências CDR específicas, sequências de região variável, e/ou modificações da região constante. Os 25 anticorpos podem ser humanizados. A presente invenção é além disso direcionada para anticorpos e composições como definido nas reivindicações para uso no tratamento de indicações de doença, como linfoma não-Hodgkin (LNH), leucemia linfoblástica aguda das células B (LLA) e outras doenças como definido nas reivindicações. A fim de que a invenção possa ser mais completamente compreendida, várias definições são apresentadas abaixo. Essas definições são entendidas para incluir equivalentes gramaticais.

Por "CMCA" ou "citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo" como aqui usado entende-se a reação mediada por células em que células citotóxicas não especificas que expressam FcyRs reconhecem anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causa a lise das células alvo. Em vários aspetos, a função efetora CMCA aumentada pode significar potência melhorada e eficácia melhorada. Por "potência" como usado no contexto experimental entende-se a concentração do anticorpo quando é observado um efeito terapêutico particular EC50 (metade da concentração máxima eficaz). Por "eficácia" como usado no contexto experimental entende-se a função efetora máxima possivel a niveis de saturação de anticorpo.

Por "FCDA" ou fagocitose mediada por células dependente de anticorpo como aqui usado é considerada a reação mediada por célula em que células citotóxicas não especificas que expressam FcyRs reconhecem o anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causa fagocitose da célula alvo.

Por "aminoácido" e "identidade de aminoácido" como aqui usado significa um dos 20 aminoácidos que correm naturalmente ou qualquer dos análogos não naturais que 26 devem estar presentes numa posição definida, especifica. Assim "aminoácido" como aqui usado significa quer os aminoácidos que ocorrem naturalmente quer os sintéticos. Por exemplo, a homofenilalanina, citrulina e noreleucina são considerados aminoácidos para os fins da invenção. "Aminoácido" inclui também resíduos de iminoácidos tais como prolina e hidroxiprolina. A cadeia lateral pode ser tanto na configuração (R) como na (S). Na forma de realização preferida, os aminoácidos estão na configuração (S) ou L. Se são usadas cadeias laterais de ocorrência não natural, podem ser usados substituintes não aminoácido, por exemplo para evitar ou retardar a degradação in vivo.

Por "célula B" ou "linfócito B" como aqui usado significa um tipo de linfócitos desenvolvido na medula óssea que circula no sangue e linfa, e fornece imunidade humoral. As células B reconhecem moléculas sem antigénio e diferenciam-se ou maturam nas células plasmáticas que segregam imunoglobulina (anticorpos) que inativam os antigénios. São também geradas células de memória que fazem a imunoglobulina específica (anticorpo) em encontros posteriores com tal antígeno. As células B são também conhecidas como "células Beta" no ilhéu de Langerhans.

Por "célula B antigénio" ou "célula B marcadora" como aqui usado entende-se qualquer proteína que é expressa nas células B.

Por "CD19" como aqui usado entende-se a proteína da SEQ ID N0:1 (representada na Figura 1) . CD19 é também conhecida como antigénio B4 da superfície das células B, antigénio CD19 das células B, antigénio CD19, e Leu-12. CD19 humana é designado GeneID:930 por Gene de Entrez, e HGNC:1633 por HGNC. A CD19 pode ser codificada pelo gene chamado CD19. 0 uso de "CD19" aqui pretende englobar todos os alelos 27 conhecidos ou ainda desconhecidos e formas polimorfas de CD19.

Por "CDC" ou "citotoxicidade dependente de complemento" como aqui usado entende-se a reação em que um ou mais componentes do complemento de proteína reconhece o anticorpo liqado numa célula alvo e subsequentemente causa a lise da célula alvo.

Por "região constante" como aqui usado entende-se o polipéptido que inclui pelo menos uma porção das primeiras três regiões constantes de um anticorpo, com pelo menos uma função efetora. Assim a região constante refere-se portanto aos três últimos domínios da região constante de imunoglobulina de IgA, IgD, e IgG, e os últimos quatro domínios de imunoglobulina das regiões constantes de IgE e IgM, e a articulação flexível N-terminal para estes domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, a região constante inclui os domínios de imunoglobulina Cgamal, Cgama2 e Cgama3 (Ογΐ, 0γ2 e 0γ3) e a articulação entre Cgamal (Ογΐ) e Cgama2 (Cy2). Embora os limites da região constante possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para compreender resíduos do seu terminal carboxilo, em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. A cadeia leve constante compreende tipicamente um único domínio, e como aqui definido refere-se às posições 108-214 de Ck ou CÀ, em que a numeração é de acordo com o índice EU. Para anticorpos IgG de comprimento total, a cadeia pesada constante, como aqui definido, refere-se ao N terminal do domínio CHI para o C terminal do domínio CH3, ou posições 118-447, em que a numeração é de acordo com o índice EU. "Região constante" pode referir-se a esta região isolada, ou um truncamento ou fusão incluem anticorpos, fusões Fc, Fcs isolados, e fragmentos Fc. Em várias formas 28 de realização, a região constante pode ser a região do anticorpo que é codificado por um dos genes da região constante das cadeias leves ou pesadas de imunoglobulina, i.e. a região de um anticorpo codificado pelas cadeias leves kappa (Ck) ou lambda (CÀ) . Em várias formas de realização, a cadeia pesada constante ou a região constante de cadeia pesada pode ser a região de um anticorpo codificado por genes mu, delta, gama, alfa, ou epsilon para definir o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, ou IgE, respetivamente.

Por "função efetora" como aqui usada entende-se um evento bioquímico que resulta da interação de uma região Fc de anticorpo com um recetor Fc ou ligando. As funções efetoras incluem funções efetoras mediadas por FcyR tais como CMCA e FCDA, e funções efetoras mediadas por complemento tais como CDC. Por "célula efetora" como aqui usado entende-se uma célula do sistema imunitário que expressa um ou mais recetores Fc e medeia uma ou mais funções efetoras. Células efetoras incluem mas não são limitados a monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, grandes linfócitos granulares, células de Langerhans, células assassinas (NK) naturais, e células T γδ, e podem ser de qualquer organismo incluindo mas não limitado a humanos, ratinhos, ratazanas, coelhos, e macacos.

Por "Fab" ou "região Fab" como aqui usado significa os polipéptidos que compreendem os domínios de imunoglobulina VH, CHI, VH, e CL. Fab pode referir-se a esta região isoladamente, ou a esta região no contexto de um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo.

Por "Fc" ou "região Fc", como aqui usado entende-se o polipéptido compreendendo a região constante de um 29 anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante. Assim Fc refere-se aos últimos domínios de imunoglobulina de duas regiões constantes do IgA, IgD, e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina da região constante de IgE e IgM, e a articulação flexível N-terminal a esses domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cgama2 e Cgama3 (0γ2 e 0γ3) e a articulação entre Cgamal (Ογΐ) e Cgama2 (Cy2). Embora os limites da região Fc possam variar, uma região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida para compreender os resíduos C226 ou P230 na sua terminação carboxilo, em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. Fc pode referir-se a esta região isoladamente, ou a esta região no contexto de um polipéptido Fc, por exemplo um anticorpo. Por "polipéptido Fc" como aqui usado entende-se um polipéptido que compreende toda ou parte de uma região Fc. Os polipéptido Fcs incluem anticorpos, fusões Fc, Fcs isolados, e fragmentos de Fc.

Por "recetor Fc gama" ou "FcyR" como aqui usado entende-se qualquer membro da família das proteínas que ligam região Fc do anticorpo IgG. Em várias formas de realização, os FcyR são substancialmente codificados pelos genes FcyR. Em humanos esta família inclui mas não é limitada a FcyRI (CD64), incluindo as isoformas FcyRIa, FcyRIb, e FcyRIc; FcyRII (CD32), incluindo as isoformas FcYRIIa (incluindo os alotipos H131 e R131), FcYRIIb (incluindo FcYRIIb-1 e FcYRIIb-2), e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16), incluindo as isoformas FcYRIIIa (incluindo os alotipos V158 e F158) e FcYRIIIb (incluindo os alotipos Fc-YRIIIb-NAl e FcyRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), assim como quaisquer isoformas FcyRs ou FcyR ou alotipos humanos desconhecidos. Os FcyRs de ratinho incluem mas não são limitados a FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32), FcyRIII (CD 16), e 30

FcyRIII-2 (CD16-2), assim como qualquer isoformas FcyRs ou FcyR ou alotipos de ratinho desconhecido. Um FcyR pode ser desde qualquer organismo, incluindo mas não limitado a humanos, ratinhos, ratazanas, coelhos, e macacos.

Por "ligando Fc" ou "recetor Fc" como aqui usado entende-se uma molécula, preferencialmente um polipéptido, a partir de qualquer organismo que se liga à região Fc de um anticorpo para formar um complexo Fc-ligando. Os ligandos Fc incluem mas não são limitados a FcyRs, FcRn, Clq, C3, lectina de ligação a manano, recetor de manose, proteina estafilocócica A, proteina estreptocócica G, e FcyR virai. Os ligandos Fc também incluem homólogos de recetor Fc (FcRH), que são uma familia de recetores Fc que são homólogos para FcyRs (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Os ligandos Fc podem incluir moléculas não descobertas que ligam Fc.

Por "IgG" como aqui usado entende-se um polipéptido pertencente à classe dos anticorpos que são substancialmente codificados por um gene de gama imunoglobulina reconhecido. Em humanos esta classe compreende IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. Em ratinhos esta classe compreende IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3. Por "imunoglobulina (Ig)" aqui entende-se uma proteina consistindo de um ou mais polipéptidos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. As imunoglobulinas incluem mas não são limitadas a anticorpos. As imunoglobulinas podem ter várias formas estruturais, incluindo mas não limitadas a anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpo, e domínios de imunoglobulina individual. Por "domínio de imunoglobulina (Ig)" aqui entende-se uma região de uma imunoglobulina (Ig) que existe como uma entidade estrutural distinta como verificado, por um especialista na técnica de estrutura de 31 proteínas. Os domínios Ig tipicamente têm uma topologia de dobragem em sanduíche β característica. Os domínios Ig conhecidos na classe IgG de anticorpos são VH, Ογΐ, 0γ2, 0γ3, VL, e CL.

Por "modificação" aqui entende-se uma alteração nas propriedades físicas, químicas, ou sequência de uma proteína, polipéptido, anticorpo, ou imunoglobulina. Modificações preferidas da invenção são modificações de aminoácido e modificações de glicoforma.

Por "modificação de aminoácido" aqui entende-se uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácido numa sequência de polipéptido. Por "substituição de aminoácido" ou "substituição" aqui entende-se a substituição de um aminoácido numa posição particular numa sequência de polipéptido parente por outro aminoácido. Por exemplo, a substituição I332E refere-se a um polipéptido variante, neste caso uma variante constante de cadeia pesada, na qual a isoleucina na posição 332 é substituída por ácido glutâmico. 0 resíduo WT pode ou não ser designada. No exemplo anterior, 332E indica a substituição da posição 332 com um ácido glutâmico. Para os fins presentes, múltiplas substituições são tipicamente separadas por uma barra. Por exemplo, 239D/332E refere-se a uma variante dupla compreendendo as substituições 239D e 332E. Por "inserção de aminoácido" ou "inserção" como aqui usado entende-se a adição de um aminoácido na posição particular numa sequência de polipéptido parente. Por exemplo, inserir -236 designa uma inserção de glicina na posição 236. Por "deleção de aminoácido" ou "deleção" como aqui usado entende-se a remoção de um aminoácido na posição particular numa sequência de polipéptidos parente. Por exemplo, G236-designa a deleção da glicina na posição 236. 32

Por "modificação de glicoforma" ou "glicoforma modificada" ou "glicoforma modificada geneticamente" como aqui usado entende-se uma composição hidrato de carbono que está ligada covalentemente a uma proteina, por exemplo um anticorpo, em que a referida composição hidrato de carbono difere quimicamente da de uma proteina parente. Glicoforma modificada tipicamente refere-se a diferentes hidrato de carbono ou oligossacáridos; assim por exemplo um anticorpo pode compreender uma glicoforma modificada. Em alternativa, a glicoforma modificada pode referir-se ao anticorpo que compreende o hidrato de carbono ou oligossacárido diferente.

Por "polipéptido parente", "proteína parente", "polipéptido precursor", ou "proteína precursora" como aqui usados entende-se um polipéptido não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. 0 referido polipéptido parente pode ser um polipéptido que ocorre naturalmente, ou uma variante ou versão geneticamente modificada de um polipéptido que ocorre naturalmente. Polipéptido parente pode referir-se ao próprio polipéptido, as composições que compreendem o polipéptido parente, ou a sequência de aminoácidos que o codifica. Consequentemente, por "anticorpo parente" ou "imunoglobulina parente" como aqui usado entende-se um anticorpo ou imunoglobulina que é modificada para gerar uma variante. Por "anticorpo anti-CD19 parente" ou "imunoglobulina anti~CD19 parente" como aqui usado entende-se um anticorpo ou imunoglobulina que liga CD19 e é modificada para gerar uma variante.

Por "proteína" ou "polipéptido" como aqui usado entende-se pelo menos dois aminoácidos ligados covalentemente, que incluem proteínas, polipéptidos, oligopéptidos e péptidos. A proteína pode ser efetuada de aminoácidos que ocorrem 33 naturalmente e ligações peptídicas, ou estruturas peptidomiméticas sintéticas, i.e. "análogos", tais como peptóides.

Por "posição" como aqui usado entende-se a localização na sequência de uma proteína. As posições podem ser numeradas sequencialmente, ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo o índice EU como em Kabat. Posições correspondentes são determinadas como aqui realçado, geralmente através de alinhamento com outras sequências parentes.

Por "resíduo" como aqui usado entende-se a posição numa proteína e a sua identidade de aminoácido associada. Por exemplo, a Asparagina 297 (também referida como Asn297 e N297) é um resíduo na posição 297 no anticorpo IgGl humano.

Por "antigénio alvo" ou "alvo" ou "antigénio" como aqui usado entende-se a molécula que está ligada especificamente pela região variável de um dado anticorpo. Um antigénio alvo pode ser uma proteína, hidrato de carbono, lípido, ou outro composto químico. Por "célula alvo" como aqui usado entende-se uma célula que expressa um antigénio alvo.

Por "região variável" entende-se a região variável de uma cadeia pesada ou da cadeia leve de anticorpo. A região variável de cadeia pesada (VH), como aqui definido, refere-se a terminação N à terminação C do domínio VH, definida pelos resíduos 1-113 de acordo com a convenção de numeração de Kabat. A região variável de cadeia leve (VL), como aqui definido, refere-se à terminação N terminal da terminação C do domínio VL, definida pelos resíduos 1-107 de acordo com a convenção de numeração de Kabat. Os especialistas na técnica reconhecerão que a convenção da numeração da região variável de Kabat emprega letras para contar o comprimento 34 variável de CDRs. Assim uma VH é definida pelos residuos 1-113 de Kabat, e que uma VL é definida por 1-107 de Kabat, não significa necessariamente que o dominio VH contenha exatamente 113 residuos, nem que VL contenha exatamente 107 residuos. Em vez disso, os residuos 1-113 de VH e 1-107 de VL de acordo com Kabat destinam-se a englobar os dominios estruturais que foram determinados pelos alinhamentos da sequência de um largo conjunto de regiões variáveis de anticorpo de comprimento variável (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Em certas formas de realização, a região variável pode compreender um ou mais dominios Ig codificados substancialmente por qualquer dos genes VK, VX, e/ou VH que constituem os locais genéticos de imunoglobulina kapa, lambda, e de cadeia pesada, respetivamente.

Por "proteína variante", "variante de proteína", "polipéptido variante", ou "variante de polipéptido" como aqui usado entende-se uma sequência de polipéptido que difere da de uma sequência do polipéptido parente devido a pelo menos uma modificação de aminoácido. Polipéptido variante pode referir-se ao próprio polipéptido, uma composição compreendendo o polipéptido, ou a sequência amino que o codifica. Preferencialmente, o polipéptido variante tem pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com o polipéptido parente, por exemplo desde cerca de uma até cerca de dez modificações de aminoácido, e preferencialmente desde cerca de uma até cerca de cinco modificações de aminoácido em comparação com o parente. A sequência de polipéptido variante aqui preferencialmente possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia com uma sequência de polipéptido parente, e o mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de homologia, 35 mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia. Consequentemente, por "anticorpo variante" ou "variante de anticorpo" como aqui usado entende-se uma sequência de anticorpo que difere da sequência de anticorpo parente devido a pelo menos uma modificação de aminoácido. Variante de anticorpo pode referir-se ao próprio anticorpo polipéptido, composições compreendendo o anticorpo polipéptido variante, ou a sequência de aminoácidos que a codifica. Consequentemente, por "variante de anticorpo" ou "variante de anticorpo" como aqui usado entende-se um anticorpo, conforme definido acima, que difere na sequência da sequência do anticorpo parente devido a pelo menos uma modificação de aminoácido. Anticorpo variante pode referir-se à própria proteína, as composições compreendendo a proteína, ou a sequência de aminoácidos que a codifica. Consequentemente, por "variante constante de cadeia pesada" ou "variante constante de cadeia leve" ou "Variante Fc" como aqui usado entende-se a constante de cadeia pesada, constante cadeia leve, ou polipéptido ou sequência da região Fc, respetivamente, que difere na sequência da de uma sequência parente devido a pelo menos uma modificação de aminoácido.

Por "tipo selvagem ou WT" aqui entende-se uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleótidos que é encontrada na natureza, incluindo as variações alélicas. A proteína WT, polipéptido, anticorpo, imunoglobulina, IgG, etc., têm uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleótidos que não foi intensionalmente modificada.

Para todas as posições da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina discutidas na presente invenção, a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, 36

National Institutes of Health, Bethesda). 0 "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduo do anticorpo IgGl EU humano, como descrito em Edelman et al., 1969, Biochemistry 63:78-85.

Anticorpos

Como aqui usado, o termo "anticorpo" refere-se a uma proteína monomérica ou multimérica compreendendo uma ou mais cadeias de polipéptidos. Um anticorpo liga-se especificamente a um antigénio (por exemplo CD 19) e pode ser capaz de modular a atividade biológica do antigénio. Como aqui usado, o termo "anticorpo" pode incluir "anticorpo de comprimento total" e "polipéptido Fc."

Por "anticorpo de comprimento total" aqui entende-se a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo as regiões variável e constante. Por exemplo, na maioria dos mamíferos, incluindo humanos e ratinhos, o anticorpo de comprimento total da classe IgG é um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos de duas cadeias de imunoglobulina, cada par com uma cadeia leve e uma pesada, cada cadeia leve compreendendo domínios de imunoglobulina VL e CL, e cada cadeia pesada compreendendo os domínios de imunoglobulina VH, CHI (CyI) , CH2 {Cy2) , e CH3 (Cy3). Em alguns mamíferos, por exemplo em camelos e lamas, os anticorpos IgG podem consistir somente de duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio variável ligado à região Fc. 0 termo "anticorpo" inclui também fragmentos de anticorpo. Os fragmentos específicos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI, (iii) o fragmento Fv que consiste nos 37 domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546) o qual consiste de uma única variável, (v) regiões CDR isoladas, (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv) , em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante peptídico o qual permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação a antigénio (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) dímeros Fv de cadeia única biespecífica (PCT WO 1993/011161) e (ix) "diacorpos" ou "triacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6444-6448). Em certas formas de realização, os anticorpos são produzidos por técnicas de DNA recombinante. Outros exemplos de formatos e arquiteturas de anticorpo são descritos em Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, e Cárter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 e referências aqui citadas. Em formas de realização adicionais, os anticorpos são produzidos por clivagem enzimática ou química dos anticorpos que ocorrem naturalmente.

Unidades estruturais de anticorpo natural tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada tetrâmero é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par com uma cadeia "leve" (tipicamente com um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (tipicamente com um peso molecular de cerca de 50-70 kDa) . Cada uma das cadeias leves e pesadas são constituídas por duas regiões distintas, referidas como regiões variável e constante. Para a classe IgG de imunoglobulinas, a cadeia pesada é composta por quatro domínios de imunoglobulina 38 ligados da terminação N- à C- pela ordem VH-CH1-CH2-CH3, em relação ao domínio variável de cadeia pesada, domínio constante 1 de cadeia pesada, domínio constante 2 de cadeia pesada, e domínio constante 3 de cadeia pesada respetivamente (também referido como VH-Cy1-Cy2-Cy3, em relação ao domínio variável de cadeia pesada, domínio constante gama 1, domínio constante gama 2, e domínio constante gama 3 respetivamente) . A Cadeia leve de IgG é composta por dois domínios de imunoglobulina ligados da terminação N- para a C pela ordem VL-CL, em relação ao domínio variável de cadeia leve e o domínio constante de cadeia leve respetivamente. As regiões constantes mostram menor diversidade de sequência, e são responsáveis pela ligação de algumas das proteínas naturais para eliciar eventos bioquímicos importantes. A região variável de um anticorpo contém os determinantes de ligação a antigénio de uma molécula, e assim determina a especificidade de um anticorpo para o seu antigénio alvo. A região variável é assim chamada porque é a mais distinta na sequência dos outros anticorpos dentro da mesma classe. Na região variável, estão reunidas três ansas para cada um dos domínios V de cadeia pesada e cadeia leve para formar um sítio de ligação a antigénio. Cada uma das ansas é referida como uma região de determinação de complementaridade (de aqui em diante referida como uma "CDR"), na qual a variação na sequência de aminoácidos é a mais significativa. Há um total de 6 CDRs, três para cada cadeia pesada e leve, designadas VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3. A região variável fora das CDRs é referida como a região estrutural (FR). Embora não seja tão diversa como as CDRs, a variabilidade de sequência ocorre na região FR entre diferentes anticorpos. Acima de tudo, esta arquitetura característica dos anticorpos fornece uma base estável (a região FR) na qual substancial diversidade de 39 ligação a antigénio (as CDRs) pode ser explorada pelo sistema imunitário para obter especificidade para uma ampla gama de antigénios. Um certo número de estruturas de alta resolução estão disponíveis para uma diversidade de fragmentos de região variável de diferentes organismos, alguns não ligados e alguns complexados com o antigénio. As caracteristicas estruturais e de sequência das regiões variáveis de anticorpo são divulgadas, por exemplo, em Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, e as caracteristicas conservadas dos anticorpos são divulgadas, por exemplo, em Maynard et al., 2000, Annu Ver Biomed Eng 2:339-376.

Os anticorpos são agrupados em classes, também referidas como isotipos, como determinado geneticamente pela região constante. As cadeias leves constantes humanas são classificadas como cadeias leves kappa (Ck) e lambda (CX) . As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respetivamente. A classe IgG é a mais comummente usada para fins terapêuticos. Em humanos esta classe compreende as subclasses IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. Em ratinhos esta classe compreende as subclasses IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3. A IgM tem subclasses, incluindo, mas não limitadas a, IgMl e IgM2. A IgA tem várias subclasses, incluindo mas não limitada a IgAl e IgA2. Assim, "isotipo" como aqui usado significa qualquer das classes ou subclasses de imunoglobulinas definidas pelas caracteristicas químicas e antigénicas das suas regiões constantes. Os isotipos de imunoglobulina humana conhecidos são IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgMl, IgM2, IgD, e IgE. A Figura 2 fornece as sequências da cadeia leve humana kappa e das cadeias constantes de cadeia pesada gama. A Figura 3 mostra um alinhamento de cadeias pesadas constantes da IgG humana. 40

Podem também ser úteis as IgGs que são composições hibridas de isotipos de IgG naturais humanos. Funções efetoras tais como CMCA, FCDA, CDC, e meia vida sérica diferem significativamente entre as diferentes classes de anticorpos, incluindo por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgG, e IgM humanas (Michaelsen et al., 1992, Molecular Immunology, 29(3): 319-326). Uma série de estudos têm explorado as variantes IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4 a fim de investigar os determinantes das diferenças da função efetora entre elas. Ver por exemplo Canfield & Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; Chappel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88(20): 9036-9040; Chappel et al., 1993, Journal of Biological Chemistry 268:25124-25131; Tao et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1025-1028; Tao et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 661-667; Redpath et al., 1998, Human Immunology, 59, 720-727.

Como descrito na US 2006/0134105, registada em outubro 21, 2005, intitulada "IgG Immunoglobulin Variants with Optimized Effector Function", é possível manipular modificações de aminoácido num anticorpo que compreende as regiões constantes de outras classes de imunoglobulina, por exemplo como as ilustradas nos alinhamentos na Figura 3. Essas composições de IgG híbridas manipuladas podem fornecer propriedades de função efetora melhoradas, incluindo CMCA, fagocitose, CDC, e meia vida sérica melhorados. Por exemplo, como ilustrado pela Figura 3, uma variante híbrida IgGl/IgG3 pode ser construída por substituição das posições IgGl nas regiões CH2 e CH3 com os aminoácidos da IgG3 em posições onde os dois isotipos diferem. Portanto um anticorpo variante híbrido IgG pode ser construído para compreender uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste em: 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, e 41 436F, em que a numeração é de acordo com o índice EU. Essas variantes podem fornecer propriedades de função efetora alternativas e/ou melhoradas.

Como outro exemplo, a função efetora relativamente pobre da IgG2 pode ser melhorada substituindo os resíduos chave de ligação a FcyR com os correspondentes aminoácidos numa IgG com melhor função efetora. Por exemplo, as diferenças entre os resíduos chave entre IgG2 e IgGl em relação a ligação FcyR podem incluir P233, V234, A235, -236 (referente à deleção em IgG2 em relação a IgGl), e G327. Portanto uma ou mais modificações de aminoácido na IgG2 parente em que um ou mais desses resíduos é substituído com os correspondentes aminoácidos IgGl, P233E, V234L, A235L, 236G (referente a uma inserção de uma glicina na posição 236), e G327A, pode fornecer função efetora aumentada. A sequência de uma tal IgG, compreendendo um híbrido de resíduos de IgGl e IgG2, aqui referida como "Híbrida" nos Exemplos e Figuras, é fornecida na Figura 2.

Tal como é conhecido na técnica, o polimorfismo da imunoglobulina existe na população humana. 0 polimorfismo da Gm é determinado pelos genes IGHG1, IGHG2 e IGHG3 os quais têm alelos que codificam determinantes antigénicos alotípicos referido como alotipos Glm, G2m, eG3m para marcadores das moléculas IgGl, IgG2 e IgG3 humano (nenhuns alotipos Gm foram encontrados na cadeia 4 gama). Os marcadores podem ser classificados em 'alotipos' e 'isoalotipos'. Estes são identificados em diferentes bases sorológicas dependentes de uma forte homologias de sequências entre isotipos. Os alotipos são determinantes antigénicos especificados por formas alélicas dos genes Ig. Os alotipos representam pequenas diferenças nas sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de diferentes indivíduos. Mesmo uma única diferença de aminoácido pode 42 dar origem a um determinante alelotipico, embora em muitos casos sejam várias as substituições de aminoácidos que ocorrem. Os alotipos são diferenças de sequência entre alelos de uma subclasse pelo que os anti-soros reconhecem apenas as diferenças alélicas. Um isoalotipo é um alelo num isotipo que produz um epitopo que é partilhado com uma região homóloga não polimórfica de um ou mais de outros isotipos e devido a isto o antisoro irá reagir com alotipos relevantes e com os isotipos homólogos relevantes (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88-110; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66).

As formas alélicas de imunoglobulinas humanas foram bem caracterizadas (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51). Adicionalmente, outros polimorfismos foram caracterizados (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9) . Atualmente, são

conhecidos 18 alotipos Gm: Glm (1, 2, 3, 17 ) ou Glm (a, x, f, z), G2m (23) ou G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) ou G3m (bl, c3, b5, bO, b3, b4, s, t, gl, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Os alotipos que são herdados em combinações fixadas são chamados haplotipos Gm. A Figura 4 mostra haplotipos comuns da cadeia gama de IgGl humano (Figura 4a) e IgG2 (Figura 4b) mostrando as posições e as substituições de aminoácidos relevantes. As sequências de aminoácidos destas versões alotipicas de IgG 1 e IgG2 são fornecidas como SEQ IDs: 80-85. Os anticorpos da presente invenção podem ser substancialmente codificados 43 por qualquer alotipo, isoalotipo, ou haplotipo de qualquer qene de imunoqlobulina.

Formas alélicas de imunoglobulinas humanas foram bem caracterizadas (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of imunoglobulinas humanas. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51).

Adicionalmente, outros polimorfismos foram caracterizados (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9). Presentemente, são conhecidos 18 alotipos Gm: Glm (1,2 , 3, 17) ou Glm (a, X, f, z) , G2m (23) ou G2m (n) , G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) i ou G3m (bl, c3, b5, bO, b3, b4, s, t, gl, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al. , 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Alotipos que são herdados em combinações fixas são chamados haplotipos Gm. A Figura 4 mostra haplotipos comuns da cadeia gama de IgGl humana (Figura 4a) e IgG2 (Figura 4b) mostrando as posições e as substituições de aminoácidos relevantes. Os anticorpos da presente invenção podem ser substancialmente codificados por qualquer teletipo, isoalotipo, ou haplotipo de qualquer gene de imoglobulina. Os anticorpos da presente invenção podem ser substancialmente codificados por genes de qualquer organismo, preferencialmente mamíferos, incluindo mas não limitado a humanos, roedores incluindo mas não limitado a ratinhos e ratos, lagomorfos incluindo mas não limitado a coelhos e lebres, camelídeos incluindo mas não limitado a camelos, lamas, e dromedários, e primatas não humanos, incluindo mas não limitado a Prossímios, Platyrrhini (macacos do Novo Mundo), Cercopithecoidea (macacos do Velho Mundo) , e Hominoidea incluindo os Gibões 44 e Macacos Menores e Grandes. Numa forma de realização mais preferida, os anticorpos da presente invenção são substancialmente humanos. Os anticorpos da presente invenção podem ser substancialmente codificados por genes de imunoglobulina pertencentes a qualquer das classes de anticorpo. Numa forma de realização mais preferida, os anticorpos da presente invenção compreendem sequências pertencentes à classe de anticorpos IgG, incluindo subclasses de IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4 humanas. Numa forma de realização alternativa, os anticorpos da presente invenção compreendem sequências pertencentes às classes de anticorpos IgA (incluindo subclasses IgAl e IgA2 humanas), IgD, IgE, IgG, ou IgM. Os anticorpos da presente invenção podem compreender mais do que uma cadeia de proteína. Ou seja, a presente invenção pode encontrar uso num anticorpo que é um monómero ou um oligómero, incluindo um homo- ou hetero-oligómero.

Na forma de realização mais preferida, os anticorpos da invenção baseiam-se em sequências de IgG humanas, e assim as sequências de IgG humanas são usadas como sequências "base" em relação às quais outras sequências são comparadas, incluindo mas não limitado a sequências de outros organismos, por exemplo sequências de roedores e primatas, assim como sequências de outras classes de imunoglobulina tais como IgA, IgE, IgGD, IgGM, e as afins. É também contemplado que, embora os anticorpos da presente invenção sejam manipulados no contexto de um anticorpo parente, as variantes podem ser manipulados em ou "transferidos" para o contexto de outro, segundo anticorpo parente. Isto é realizado determinando os resíduos e substituições "equivalentes" ou "correspondentes" entre o primeiro e segundo anticorpo, tipicamente com base na homologia de sequência ou estrutural entre as sequências dos dois anticorpos. Com vista a estabelecer a homologia, a 45 sequência de aminoácidos de um primeiro anticorpo aqui evidenciado é diretamente comparado com a sequência de um sequndo anticorpo. Após o alinhamento das sequências, usando um ou mais dos programas de alinhamento de homologia conhecidos na técnica (por exemplo usando resíduos conservados como entre espécies), permitindo as necessárias inserções e deleções com vista a manter o alinhamento (i.e., evitando a eliminação de resíduos conservados através de deleção e inserção arbitrária), são definidos os resíduos equivalentes de aminoácidos específicos na sequência primária do primeiro anticorpo. 0 alinhamento de resíduos conservados preferencialmente deve conservar 100% desses resíduos. No entanto, um alinhamento superior a 75% ou tão baixo como 50% dos resíduos conservados é também adequado para definir os resíduos equivalentes. Os resíduos equivalentes podem também ser definidos determinando a homologia estrutural entre um primeiro e um segundo anticorpo ou seja ao nível da estrutura terciária para anticorpos cujas estruturas foram determinadas. Neste caso, os resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais as coordenadas atómicas de dois ou mais dos principais átomos da cadeia de um resíduo de aminoácido particular do parente ou precursor (N em N, CA em CA, C em C e O em O) estão dentro de 0,13 nm e preferencialmente 0,1 nm após alinhamento. O alinhamento é atingido após o melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a sobreposição máxima de coordenadas atómicas de átomos de proteína não hidrogénio das proteínas. Independentemente de como os resíduos equivalentes ou correspondentes são determinados, e independentemente da identidade do anticorpo parente em que os anticorpos são feitos, o que se pretende transmitir é que os anticorpos divulgados pela presente invenção podem ser manipulados em qualquer segundo anticorpo parente que tenha homologia de sequência ou estrutural significativa com o referido anticorpo. Portanto 46 por exemplo, se é gerado um anticorpo variante em que o anticorpo parente é IgGl humano, usando os métodos descritos acima ou outros métodos para determinar os resíduos equivalentes, o referido anticorpo variante pode ser manipulado num anticorpo progenitor de IgG2 humano, num anticorpo parente IgA humano, num anticorpo parente IgG2a ou IgG2b de rato, e afins. Novamente, como descrito acima, o contexto do anticorpo parente não afeta a capacidade para transferir os anticorpos da presente invenção para outros anticorpos parentes. Por exemplo, as variantes de anticorpo que são manipuladas num anticorpo IgGl humano que tem como alvo um epítopo do antigénio pode ser transferido para um anticorpo IgG2 humano que visa um epítopo do antigénio diferente, e assim por diante.

Na classe IgG das imunoglobulinas, existem vários domínios de imunoglobulinas na cadeia pesada. Por "domínio de imunoglobulina (Ig)" é aqui pretendida uma região de uma imunoglobulina (Ig) com uma estrutura terciária distinta. Com interesse para a presente invenção são os domínios de cadeia pesada constante, (incluindo, uns domínios de pesada constante (CH) e a articulação. No contexto dos anticorpos IgG, cada um dos isotipos IgG tem três regiões CH: "CHI" refere-se às posições 118-220, "CH2" refere-se às posições 237-340, e "CH3"' refere-se às posições 341-447 de acordo com o índice EU como em Kabat. Por "articulação" ou "região de articulação" ou "região de articulação de anticorpo." ou "região de articulação de imunoglobulina" aqui entende-se o polipéptido flexível compreendendo os aminoácidos entre os primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo. Estruturalmente, a extremidade do domínio IgG CHI na posição 220 de EU, e o domínio IgG CH2 começa na posição 237 de EU do resíduo. Assim, para a IgG a articulação é aqui definida para incluir as posições 221 (D221 em IgGl) até 236 (G236 em IgGl), em que a numeração é de acordo com 47 o índice EU como em Kabat. Em algumas formas de realização, por exemplo no contexto de uma região Fc, a articulação mais baixa está incluída, com a "articulação inferior" geralmente referente às posições 226 ou 230. A cadeia pesada constante, como aqui definida, refere-se ao N terminal do domínio CHI ao C terminal do domínio CH3, compreendendo, assim, as posições 118-447, em que a numeração é de acordo com o índice EU. A cadeia leve constante compreende um único domínio, e como aqui definido refere-se às posições 108-214 de Ck ou CX, em que a numeração é de acordo com o índice EU.

Os anticorpos da invenção podem incluir anticorpos multiespecíficos, notavelmente anticorpos biespecíficos, também por vezes referidos como "diacorpos". Estes são anticorpos que se ligam a dois (ou mais) antigénios diferentes. Os diacorpos podem ser fabricados por uma diversidade de modos conhecidos na técnica, por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos. Numa forma de realização, o anticorpo é um minicorpo. Os minicorpos são proteínas do tipo anticorpo minimizado compreendendo um scFv ligado a um domínio CH3. Em alguns casos, o scFv pode estar ligado à região Fc, e pode incluir algum ou todos os da região de articulação. Para uma descrição de anticorpos multiespecíficos ver Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 e referências aqui citadas. O anticorpo aqui descrito pode ser um fragmento de anticorpo. De especial interesse são os anticorpos que compreendem regiões Fc, fusões Fc, e a região constante da cadeia pesada (CHl-articulação-CH2-CH3). Os referidos anticorpos podem compreender fragmentos Fc. Um fragmento Fc da presente invenção pode compreender desde 1 - 90% da região Fc, com 10 - 90% sendo preferido, e 30 - 90% sendo o 48 mais preferido. Assim, por exemplo, um fragmento Fc pode compreender um dominio IgGl 0γ2, um dominio IgGl Cy2 e a região de articulação, um dominio IgGl 0γ3, e assim por diante. Numa forma de realização, um fragmento Fc adicionalmente compreende um parceiro de fusão, tornando-o efetivamente uma fusão de fragmento Fc. Os fragmentos Fc podem ou não conter uma sequência de polipéptido extra.

Anticorpos quiméricos, humanizados, e completamente humanos A imunogenicidade é o resultado de uma série de respostas complexas a uma substância que é reconhecida como estranha, e pode incluir a produção de anticorpos neutralizantes e não neutralizantes, a formação de complexos imunológicos, a ativação de complemento, ativação de mastócitos, inflamação, respostas de hipersensibilidade, e anafilaxia. Vários fatores podem contribuir para a imunogenicidade da proteina, incluindo mas não limitado a sequência de proteina, via e frequência de administração, e população doente. A imunogenicidade pode limitar a eficácia e a segurança da proteina terapêutica de múltiplos modos. A eficácia pode ser reduzida diretamente pela formação de anticorpos neutralizantes. A eficácia pode ser também reduzida indiretamente, por ligação ou a anticorpos neutralizantes ou a não neutralizantes tipicamente conduz a eliminação rápida do soro. Podem ocorrer efeitos secundários graves e mesmo morte quando aparece uma reação imunológica. Assim, a manipulação de proteínas pode ser usada para reduzir a imunogenicidade dos anticorpos da presente invenção.

Em algumas formas de realização, os componentes da estrutura podem ser uma mistura de espécies diferentes. Esse anticorpo pode um anticorpo quimérico e/ou um 49 anticorpo humanizado. Em geral, tanto os "anticorpos quiméricos" como os "anticorpos humanizados" referem-se a anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Os "Anticorpos quiméricos" tradicionalmente compreendem região(ões) variável(eis) de um ratinho (ou rato, em alguns casos) e a(s) região(ões) constante (s) de um humano (Morrison et al., 1984, Proc Natl Acad Sei USA 81: 6851-6855).

Por anticorpo "humanizado" como aqui usado entende-se um anticorpo compreendendo uma região estrutural humana (FR) e uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR's) de um anticorpo não humano (usualmente ratinho ou rato). 0 anticorpo não humano EP fornecendo as CDR's é chamado o "dador" e a imunoglobulina humana que fornece a estrutura é chamada o "aceitador". Em certas formas de realização, a humanização assenta principalmente sobre a inserção de enxertos de CDRs dadoras nas estruturas VL e VH do aceitador (humano) (Winter US 5225539). Esta estratégia é referida como "enxerto de CDR". A "Retromutação" dos resíduos da estrutura do aceitador selecionado nos correspondentes resíduos dadores é muitas vezes necessária para recuperar a afinidade que é perdida na construção do enxerto inicial (US 5693762). 0 anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Ig), tipicamente a da imunoglobulina humana, e portanto, tipicamente, irá compreender uma região Fc humana. Uma multiplicidade de técnicas e métodos para humanizar e reformular anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (Ver Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), e as referências aqui citadas). A humanização ou outros métodos de redução da imunogenicidade de regiões variáveis de anticorpo não humano pode incluir métodos de 50 recapeamento, como descrito por exemplo em Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:969-973. Os métodos baseados na seleção podem ser empregues em regiões variáveis de anticorpo humanizado e/ou de afinidade madura, quer dizer, para aumentar a afinidade da região variável para o seu antigénio alvo. Outros métodos de humanização podem envolver o enxerto somente de partes das CDRs, incluindo mas não limitado a métodos descritos na US 2002/0034765; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084. Podem ser empregues métodos com base na estrutura para maturação da humanização-e afinidade, por exemplo como descrito na US 2002/0177170 e pedidos relacionados.

Em certas variações, a imunogenicidade do anticorpo é reduzida usando um método descrito na US 2006/0008883, intitulada "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof", registada em 3 de dezembro, 2004.

As modificações para reduzir a imunogenicidade podem incluir modificações que reduzem a ligação do péptido processado derivado da sequência parente às proteínas MHC. Por exemplo, as modificações de aminoácido devem ser manipuladas de modo a que não sejam ou que só um número mínimo dos epítopos imunológicos seja previsto ligar-se, com alta afinidade, a quaisquer alelos MHC prevalentes. Vários métodos de identificação de epitopos ligados a MHC nas sequências de proteína são conhecidos na técnica e podem ser usados para medir os epitopos num anticorpo da presente invenção. Ver por exemplo US 2002/0119492, US 2004/0230380, US 2006/0148009, e referências aí citadas.

Numa forma de realização alternativa, os anticorpos da presente invenção podem ser totalmente humanos, ou seja as 51 sequências dos anticorpos são completamente ou substancialmente humanas. "Anticorpo totalmente humano" ou "anticorpo completamente humano" refere-se a um anticorpo humano com a sequência de gene de um anticorpo derivado de um cromossoma humano com as modificações aqui sublinhadas. São conhecidos na técnica vários métodos para gerar anticorpos totalmente humanos, incluindo o uso de ratinhos transgénicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458,) ou bibliotecas de anticorpos humanos ligadas a métodos de seleção (Griffiths et al., 1998, Curr Opin

Biotechnol 9:102-108).

Anticorpos que visam CD19

Os anticorpos da presente invenção como definido nas reivindicações ligam-se a CD19. As regiões variáveis de quaisquer anticorpos anti-CD19 conhecidos ou desconhecidos podem encontrar utilização. Os anticorpos aqui divulgados podem apresentar seletividade para CD 19 versus alvos alternativos, ou seletividade para uma forma especifica do alvo versus formas alternativas. Exemplos incluem comprimento total versus variantes de emenda, formas superfície celular versus formas solúveis, seletividade para várias variantes polimórficas, ou seletividade para formas conformacionais especificas de um alvo. Um anticorpo aqui divulgado pode ligar qualquer epitopo ou região no CD19, e pode ser especifico para fragmentos, formas mutantes, formas de emenda, ou formas aberrantes dos referidos antigénios. Foi encontrado um certo número de anticorpos úteis que visam CD19 que podem encontrar aplicação. Anticorpos ou imunoadesinas adequados incluem os anticorpos CD19 ou imunoadesinas em MT-103 (um anticorpo de cadeia simples bispecifico CD19/CD3; Hoffman, P. et al. 2005. Int. J. Câncer. 115: 98-104; Schlereth, B. et al. 2006. Câncer Immunol. Immunother. 55: 503-514), um diacorpo 52 CD19/CD16 (Schlenzka, J. et al. 2004. Anti-cancer Drugs. 15: 915-919; Kipriyanov, S.M- et al. 2002. J. Immunol. 169: 137-144), BU12-saporin (Flavell, D.J. et al. 1995. Br. J. Câncer. 72: 1373-1379), e anti-CDl9-idarubicina (Rowland, A.J. et al. 1993. Câncer Immunol. Immunother. 55: 503-514); Olson, US Pub. No. 2004/0136908A1, registada em 4 de março, 2004; US 5,686,072; Olson, WO 02/080987A1, registada em 29 de março, 2002; Tedder, WO 06/133450A1, registada em 8 de junho, 2006 ; Tedder, WO 06/121852A2, registada em 5 de abril, 2006 ; Tedder, WO 06/089133A2, registada em 15 de fev., 2006; Tedderm US Pub . No. 2006/280738A1, registada em 8 de jun., 2006; US 7 ,109,304; Hansen, US Pub • No. 2005/070693A1, registada em 2 de agosto., 2004; Hansen, US Pub. No. 2006/257398A1, registada em 1 de jun., 2006; Hansen, WO 05/012493A2, registada em 2 de agosto., 2004; Rao-Naik, WO 07/002223A2, registada em 20 de jun., 2006; Page, US Pub. 2002/182208A1, registada em 16 de maio, 2002; US 5, 686, 072; Page, EP00481790B1, registada em 17 de out., 1991; Hariharan, US Pub. No. 2003/103971A1, registada em 12 de set., 2002; Goldenberg, US Pub. No. 2003/133930A1, registada em 24 de jan., 2003; Goldenberg, US Pub. No. 2004/219156A1, registada em 30 dez., 2002; Hahharan, US Pub. No. 2007/0009519A1, registada em 21 de jul., 2006; Curd, WO 00/067796A1, registada em 4 de maio, 2000; Kipriyanov, WO 03/088998A1, registada em 15 de abr., 2003; US 7,112,324, US 7,129,330, Olson, US Pub. No. 2004/013690A1, registada em 4 de mar., 2004; Darken, US Pub. No. 2006/0193852A1, registada em 5 de maio, 2006; Amphlett, US Pub. No. 2007/0009541A1, registada em 14 de set., 2006; Kersey, WO 96/36360A1, registada em 15 de maio, 199E; Kufer, WO 04/106381A1, registada em 26 de maio, 2004; Little, US Pub. No. 2007/031436A1, registada em 10 de out., 2006; Kufer, US Pub. No. 2007/123479A1, registada em 26 de maio, 2004; Baeuerle, WO 07/068354A1, registada em 29 de nov., 2006; Le Gall, EP 01314741B1, registada 14 de nov., 53 2001; Pesando, WO 91/13974A1, registada em 12 de mar., 1991; /Alien et al, Clin. Câncer. Res 2005; 11(9) 1 de maio, 2005; Barbins et al, J. Immunother, Vol. 29, No.2, março/abril 2006; Bruenke et al, Brit. J. Haem, 130, 218- 2228 (2005); Callard, J. Immunol. Vol. 148, 2983-2987, No. 10, 15 de maio, 1992; Cárter et al, Immunol. Res. 2002; 26/1-3:45-54; Cárter & Barrington, Cuir. Dir. Autoimmun. Basel, Karger, 2004, vol 7, pp 4-32; WWWK Cheng et al, Biochim. Biophys. Acta 1768 (2007) 21-29; Cochlovius, Câncer Res. 60, 4336-4341, 15 de agosto., 2000; LJN Cooper et al, Blood Cells, Molecules & Diseases, 33 (2004) 83-89; LJN Cooper et al, Blood, 15 de fev. 2005, Vol. 105, No. 4, pp 1622-1631; Culton et al, J. Clin. Immunol., Vol. 27, No. 1, j an. 2 0 07; Daniel et al, Blood, Vol. 92, No. 12 (15 dez.), 1998: pp 4750-4757; Doody et al, Curr. Opin. Immun., 1996, pp 378-382; Dreier et al, Int. J. Câncer, 100, 690- 697 (2002); Dreier et al, J. Immunol., 2003, pp. 4397-4402;

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Os anticorpos da presente invenção podem encontrar aplicação numa vasta gama de produtos. Numa forma de 55 realização os anticorpos da invenção são um terapêutico, um diagnóstico, ou um reagente de pesquisa, preferencialmente um terapêutico. Um anticorpo da presente invenção pode encontrar aplicação numa composição de anticorpo que é monoclonal. Os anticorpos da presente invenção podem ser antagonistas, neutralizantes ou inibidores. Numa forma de realização preferida, os anticorpos da presente invenção são usados para matar células alvo que suportam o antigénio alvo, por exemplo células cancerígenas. Numa forma de realização alternativa, os anticorpos da presente invenção são usados para bloquear ou antagonizar o antigénio alvo. Numa forma de realização preferida alternativa, os anticorpos da presente invenção são usados para bloquear ou antagonizar o antigénio alvo e matar as células alvo que suportam o antigénio alvo.

Anticorpos anti-CD 19 como terapêuticas para tratar distúrbios das células B

Os anticorpos são uma classe de proteínas terapêuticas que podem ser usados para tratar distúrbios das células B. Um certo número das propriedades favoráveis de anticorpos, incluindo mas não limitado a especificidade para o alvo, capacidade para mediar mecanismos efetores imunitários, e longa vida no soro, torna os anticorpos terapêuticas poderosas. A presente invenção descreve anticorpos como definido nas reivindicações contra as células B de antigénio CD 19.

As células B de antigénio CD19 (CD19, também conhecido como antigénio B4 da superfície das células B, Leu-12) é um marcador de superfície de pan-célula B humana que é expressa a partir de estádios precoces de desenvolvimento da pré-célula B através de diferenciação do terminal nas células plasmáticas. 0 CD19 promove a proliferação e 56 sobrevivência de células B maduras. Associa-se num complexo com CD21 na superfície celular. Também se associa com CD81 e Leu-13 e potência a sinalização das células B recetora (RCB) . Em conjunto com RCB, o CD 19 modula a sinalização intrinseca e a induzida por recetor antigénio limite critico para a expansão clonal de células B e imunidade humoral. Em colaboração com CD21 liga o sistema imunitário inato e adaptativo. Após a ativação, a cauda citoplasmática do CD19 torna-se fosforilada o que leva a ligação pela familia das Src quinases e recrutamento da PI-3 quinase. É um alvo de imunoterapia atraente para cancros de origem linfóide uma vez que é também expresso na vasta maioria das células LNH assim como algumas leucemias.

Um certo número de anticorpos ou conjugados de anticorpos que visam CD19 foram avaliados em estudos pré-clinicos ou em ensaios clinicos para o tratamento de cancros. Estes anticorpos anti-CD 19 ou conjugados de anticorpo incluem mas não são limitados a MT-103 (um anticorpo CD19/CD3 biespecifico de cadeia simples; Hoffman et al, 2005 Int J Câncer 115:98-104; Schlereth et al, 2006 Câncer Immunol Immunother 55:503-514), um diacorpo CD19/CD16 (Schlenzka et al, 2004 Anti-cancer Drugs 15:915-919; Kipriyanov et al, 2002 J Immunol 169:137-144), BU12-saporin (Flavell et al, 1995 Br J Câncer 72:1373-1379), e anti-CDl9-idarubicina (Rowland et al, 1993 Câncer Immunol Immunother 55:503-514).

Otimização Fc de anticorpos anti-CD19 Há um certo número de mecanismos caracterizados através dos quais os anticorpos medeiam efeitos celulares, incluindo antiproliferação via bloqueio de vias de crescimento necessários, de sinalização intracelular conduzindo à apoptose, regulação negativa reforçada e/ou renovação dos recetores, citotoxicidade dependente do complemento (CDC), 57 citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (CMCA), fagocitose mediada por células dependente anticorpo (FCDA) e promoção de uma resposta imune adaptiva (Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410). A eficácia de anticorpo pode ser devido a uma combinação destes mecanismos, e sua importância relativa na terapia clinica para a oncologia parece ser dependente de cancro. A importância de funções efetoras mediadas por FcyR para a atividade de alguns anticorpos foi demonstrada em ratinhos (Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sei U SA 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446), e através de correlações observadas entre eficácia clinica em humanos e o seu alotipo de formas de alta (V158) ou baixa (F158) afinidade polimórfica de FcyRIIIa (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng & Levy, 2003, Journal of Clinicai Oncology, 21:3940-3947). Juntamente estes dados sugerem que um anticorpo que é otimizado para ligar a certos FcyRs podem mediar melhor as funções efetoras, e deste modo destruir as células alvo mais efetivamente em doentes. Assim, um meio promissor para melhorar a potência antitumoral de anticorpos é através do aumento da sua capacidade para mediar funções efetoras citotóxicas tais como CMCA, FCDA, e CDC. Adicionalmente, os anticorpos podem mediar mecanismos anti-tumorais através da inibição de crescimento ou sinalização apoptótica que pode ocorrer quando um anticorpo se liga ao seu alvo nas células tumorais. Essa sinalização pode ser potenciada quando os anticorpos são apresentados para as células do tumor ligados a células imunitárias via FcyR. Portanto o aumento da afinidade dos anticorpos para FcyRs pode resultar melhorias nos efeitos anti-proliferativos. 58 A manipulação do anticorpo para opimizar a função efetora foi alcançada usando modificações de aminoácidos (ver por exemplo a US 2004/0132101 e US 2006/0024298 e referências ai citadas) , e as glicoformas manipuladas (ver por exemplo Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473, Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621).

Modificações para otimização da função efetora São divulgados anticorpos compreendendo modificações, em que as referidas modificações alteram a afinidade para um ou mais recetores Fc, e/ou alterar a capacidade do anticorpo para mediar uma ou mais funções efetoras. As modificações incluem modificações de aminoácido e modificações de glicoforma.

Modificações de aminoácido

Como descrito na US 2006/0024298, registada em 5 de maio, 2005, intitulada "Optimized Fc Variants", modificações de aminoácido em posições da cadeia pesada da região constante 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 266, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 , 336, e 337, permi te a modificação das propriedades de ligação a FcyR, função efetora, e propriedades potencialmente clinicas de anticorpos.

Em particular, variantes que alteram a ligação a um ou mais recetores humanos Fc podem compreender um aminoácido 222E, 59

222Υ, 223Ε, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G 227Κ, 221Υ, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 2 3 OE, 230G, 230Y 231Ε, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F 234G, 2 34Η, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S 234Τ, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H 2351, 235Κ, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V 235W, 235Υ, 2 3 6A, 236D, 236E, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L 236Μ, 236Ν, 236P, 23 6Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y 237D, 237Ε, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F 238G, 238Η, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S 238Τ, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 2391 239Κ, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 23 9W 239Υ, 240Α, 2401, 2 4 OM, 240T, 241D, 2 41E, 241L, 241R, 241S 241 W, 241 Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y 244Η, 245Α, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q 249Υ, 255Ε, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 2 60D, 2 60E, 2 60H, 260Y 2 62Α, 2 62Ε, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 64A 2 64D, 2 64Ε, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64L, 2 64M, 2 64N 2 64Ρ, 2 64Q, 2 64R, 264S, 2 64T, 264W, 2 64Y, 2 65F, 2 65G, 2 65H 2651, 265Κ, 2 65L, 2 65M, 2 65N, 265P, 265Q, 2 65R, 2 65S, 2 65T 265V, 265W, 2 65Y, 2 66A, 2661, 2 66M, 2 66T, 2 67D, 2 67E, 2 67F 2 67Η, 2671, 2 67K, 2 67L, 2 67M, 2 67N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R, 2 67T 2 67V, 2 67W, 2 67Y, 2 68D, 2 68E, 2 68F, 2 68G, 2681, 2 68K, 2 68L 2 68Μ, 2 68Ρ, 2 68Q, 2 68R, 2 68T, 2 68V, 2 68W, 2 69F, 2 69G, 2 69H 2691, 2 69Κ, 2 69L, 269M, 2 69N, 2 69P, 2 69R, 269S, 2 69T, 2 69V 2 69W, 2 69Υ, 27 0F, 27 0G, 27 0H, 2701, 270L, 27 0M, 27 0P, 2 7 OQ 2 7 OR, 2 7 0 S, 27 0T, 27 0W, 27 0Y, 2 7 IA, 271D, 271E, 271F, 2 71G 271H, 2711, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T 2 7IV, 2 71W, 2 71Y , 272C ), 272F, 272G, 272H, 2721, 27214 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 2731 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 2741, 274L, 274M, 274N, 274P 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F 60

276G, 27 6H, 2761, 27 6L, 27 6M, 276P, 276R, 27 6S, 276T, 276V 27 6W, 27 6Y, 27 8D, 27 8E, 27 8G, 27 8H, 2781, 27 8K, 27 8L, 27 8M 278N, 27 8P, 27 8Q, 278R, 278S, 27 8T, 278V, 278W, 280G, 280K 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 2 81K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 2 82G, 282K, 282P, 2 82 Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288P 288E, 2 8 8Y, 2 90D, 2 90H, 2 90L, 2 90N, 2 90W, 2 91D, 291E, 2 91G 2 91H, 2911, 2 91Q, 2 91T, 2 92D, 2 92E, 2 92T, 2 92Y, 2 93F, 2 93G 2 93H, 2931, 2 93L, 2 93M, 2 93N, 2 93P, 2 93R, 2 93S, 2 93T, 2 93V 2 93W, 2 93Y, 2 94F, 2 94G, 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 2 94M, 2 94P 2 94R, 294S, 2 94T, 2 94V, 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 95E, 2 95F, 2 95G 2 95H, 2951, 2 95M, 2 95N, 2 95P, 2 95R, 2 95S, 2 95T, 2 95V, 2 95W 2 95Y, 2 96A, 2 96D, 2 96E, 2 96G, 2 96H, 2961, 296K, 2 96L, 2 9 6M 2 96N, 2 96Q, 2 96R, 296S, 2 96T, 2 96V, 2 97D, 2 97E, 2 97F, 2 97G 2 97H, 2971, 2 97K, 2 97L, 2 97M, 2 97P, 2 97Q, 2 97R, 2 97S, 2 97T 2 97V, 2 97W, 2 97Y, 2 98A, 2 98D, 2 98E, 2 98F, 2 98H, 2981, 2 98K 2 98M, 298N, 2 98Q, 2 98R, 2 98T, 2 98W, 2 98Y, 2 99A, 2 99D, 2 99E 2 99F, 2 99G, 2 99H, 2991, 2 99K, 2 99L, 2 99M, 2 99N, 2 99P, 2 99Q 2 99R, 299S, 2 99V, 2 99W, 2 99Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W 301D, 301E, 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 32 0F, 320G, 32 OH, 3201, 320L 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G 322H, 3221, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322 Y, 3231, 324D 324F, 324G, 324H, 3241, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 32 5G, 325H, 3251, 325K 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y 32 6E, 3261, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271 327K, 327L, 327M, 327N, 327F, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328M 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D 32 9E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329L, 32 9M, 329N, 329Q 32 9R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H 61 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 3341, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 3351, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, e 337N, em que a numeração é de acordo com o índice EU.

Como descrito na US 2005/0244403, registada em 24 de Março, 2005, intitulada "Immunoglobulin variants outside the Fc region", modificações de aminoácido em posições da cadeia pesada da região constante 1 18, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, e 236, permite a modificação de propriedades de ligação a FcyR, a função efetora, e propriedades potencialmente clínicas de anticorpos.

Como descrito na US 2005/0244403, registada em 24 de março, 2005, intitulada "Immunoglobulin variants outside the Fc region", as modificações de aminoácido nas posições da região constante de cadeia leve 108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 62 213, permite a modificação de propriedades de ligação a FcyR, a função efetora, e as propriedades potencialmente clinicas de anticorpos.

Em particular, as variantes que alteram a ligação a um ou mais recetores humanos Fc pode compreender uma modificação de aminoácido na região constante de cadeia pesada, como aqui descrito, selecionado a partir do grupo que consiste de 118K, 118E, 118Y, 119R, : 119E, 119Y, 120R, 120E, 1201, 121 E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 1351, 135E, 135K, 136E, 136K, 1361, 137E, 138S, 138R, 138D, 1391, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L, 150K, 150E, 151A, 151D, 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 1551, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 1 62K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 165D, 165R, 165Y, 166D, 1 67A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y, 17 8D, 179K, 179Y, 179E, 18 OK, 18 OL, 180E, 183T, 1871, 187K, 187E, 1881, 189D, 189G, 1901, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 1 92N, 1 92R, 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 195R, 195D, 195Y, 1 96K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197 Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 2 01E, 2 01K, 2 01L, 203D, 203L, 203K, 205D, 2 05L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 21OL, 21OE, 21OY, 21 IR, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 21 9Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 2191, 2I9Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 22 IN, 221Q, 221K, 221S, 221T, 221H, 221 A, 22IV, 221L, 2211, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222 S, 222T, 222H, 222V, 222L, 2221, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 2231, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 63 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 2241, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225A, 225V, 225L, 225L, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 2271, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 22 8Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 2281, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 2301, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 2311, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 2321, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 2331, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 2361, 236F, 236M, 236Y, 236W, e 236P, em que a numeração é de acordo com o índice EU.

Em particular, as variantes que alteram a ligação a um ou mais recetores humanos Fc podem compreender uma modificação de aminoácido na região constante de cadeia leve, como aqui descrito, selecionados a partir do grupo que consiste de

108D, 1081, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 1101, 110K, 111E 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 1141, 114K, 116T, 121D 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 125E, 125K, 126D, 126L 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 1291, 129K, 131T, 137K 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E 147K, 149D, 149Y, 150A, 1511, 151K, 152L, 152R, 152S, 153D 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E, 1551, 155K, 156A, 156D 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y 64 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 1701, 170N, 17 0R, 17 IA, 171N, 171V, 172E, 1721, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 18 0K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183E, 184E, 184K, 184Y, 1851, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 1951, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 2 02D, 202R, 2 02Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 2 0 6E, 2061, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R, em que numeração é de acordo com o índice ! EU.

Substituições adicionais que podem ser usadas incluem outras substituições que modulam a afinidade ao recetor Fc, a função efetora mediada por FcyR, e/ou a função efetora mediada por complemento, incluem mas não são limitados a 2 98A, 2 98T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334L, e 334A (US 6,737,056; Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604,- US 6, 528, 624; Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572), 247L, 255L, 270E, 392T, 396L, e 421K (US 2005/0037000; US 2005/0064514), e 280H, 280Q, e 280Y (US 2004/0002587).

Numa outra forma de realização, os anticorpos aqui descritos podem ser combinados com variantes constantes de cadeia pesada que alteram a ligação FcRn. Estes incluem modificações que modificam a afinidade FcRn de um modo específico de pH. Em particular, as variantes que aumentam a ligação Fc incluem FcRn mas não são limitados a: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356, US 2005/0276799, PCT WO 2004/035752, PCT WO 2004/092219, US 2005/0014934, US 2005/0032114, PCT WO 2005/037867, US 2005/0226864), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 65

434Α (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604, US 2005/0118174, USA6737056, US 2006/0194291, US 2006/0194957, PCT WO 2006/031370, US 2006/0067930), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H,

308T/309P/311S (Dali Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, US7083784, PCT WO 1997/034631, PCT WO 2002/060919, US 2006/0198840), 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, inserção de Ser a seguir a 281,

283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y 311 V, 385H, 385N, (PCT WO 2006/053301, US 2006/0173170, US 2007/0135620) 204D, 284E, 285E, 286D, e 290E (PCT WO 2005/047327).

Os anticorpos podem compreender modificações isotipicas, que são modificações numa IgG parente com o tipo de aminoácido numa IgG alternativa. Por exemplo como ilustrado na Figura 3, uma variante IgGl/IgG3 híbrida pode ser construída por substituição das posições de IgGl na região CH2 e/ou CH3 com os aminoácidos da IgG3 nas posições em que dois isotipos diferem. Assim pode ser construída uma variante de anticorpo IgG híbrida que compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir do grupo que consiste de: 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R, e 436F. Uma variante híbrida

IgGl/IgG2 pode ser construída pela substituição das posições IgG2 na região CH2 e/ou CH3 com aminoácidos de IgGl nas posições onde os dois isotipos diferem. Assim pode ser construída uma variante de anticorpo IgG híbrido que compreende uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste de 233E, 234L, 235L, -236G (referente a uma inserção de uma glicina na posição 236) , e 327A.

Modificações de glicoforma 66

Muitos polipéptidos, incluindo anticorpos, são submetidos a uma diversidade de modificações pós translacionais envolvendo as porções hidrato de carbono, tais como a glicosilação com oligossacáridos. Existem vários fatores que podem influenciar a glicosilação. As espécies, tipos de tecidos e células têm, todos, mostrado ser importantes do mesmo modo a que glicosilação ocorre. Além disso, o envolvimento extracelular, através de condições de cultura alteradas tais como concentração de soro, pode ter um efeito direto na glicosilação. (Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822).

Todos os anticorpos contêm hidrato de carbono em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada. Cada isotipo de anticorpo tem uma variedade de distintas estruturas hidrato de carbono ligado a N. Para além do hidrato de carbono ligado à cadeia pesada, até 30% de IgGs humanas têm uma região Fab glicosilada. A IgG tem um único hidrato de carbono biantena ligado a N no Asn297 do dominio CH2. Para IgG a partir de soro ou produzida ex vivo em hibridomas ou células manipuladas, as IgG são heterogéneos em relação ao hidrato de carbono ligado a Asn297 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32). Para IgG humana, o núcleo oligossacárido normalmente consiste em GlcNAc2Man3GlcNAc, com números diferindo de residuos externos.

As porções hidrato de carbono dos anticorpos da presente invenção serão descritas relativamente à nomenclatura comummente usada para a descrição de oligossacáridos. Uma revisão da química do hidrato de carbono que usa esta nomenclatura é encontrada em Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Esta nomenclatura inclui, por exemplo, Man, que representa manose; GlcNAc, que representa manose 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa manose galactose; 67

Fuc para fucose; e Glc, que representa manose glucose. Os ácidos siálicos são descritos pela notação abreviada NeuNAc, para o ácido 5-N-acetilneurâminico, e NeuNGc para 5-glicolilneuramínico. 0 termo "glicosilação" significa a ligação de oligossacáridos (hidratos de carbono contendo dois ou mais açúcares simples ligandos conjuntamente por exemplo desde dois até cerca de doze açúcares simples unidos conjuntamente) a uma glicoproteina. As cadeias laterais do oligossacárido estão tipicamente lingadas à estrutura da glicoproteina através de ligações N ou 0. Os oligossacáridos dos anticorpos da presente invenção que ocorrem geralmente estão ligados a um domínio CH2 de uma região Fc como oligossacáridos ligados a N. A "glicosilação ligada a N" refere-se à ligação da porção hidrato de carbono a um resíduo de asparagina numa cadeia de glicoproteina. 0 especialista na técnica reconhecerá que, por exemplo, cada um dos domínios CH2 das IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 de murino assim como das IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgD humanas tem um único sítio para a glicosilação ligada a N no resíduo de aminoácido 297 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991).

Para os presentes fins, uma "estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro" refere-se a uma estrutura de hidrato de carbono de núcleo processado ligado a uma região Fc a qual geralmente consiste da seguinte estrutura de hidrato de carbono GlcNAc(Fucose)-Glc-NAc-Man-(Man-GlcNAc)2 típica dos oligossacáridos biantena. A estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro é ligada à região Fc da glicoproteina, geralmente através de ligação N a Asn297 de um domínio CH2 da região Fc. Um "GlcNAc de biseção" é um resíduo GlcNAc ligado à β1,4 manose da estrutura de hidrato 68 de carbono de núcleo maduro, o GlcNAc de biseção pode estar ligado enzimaticamente à estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro por uma enzima β(1,4)-Ν-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII). As células OHC normalmente não expressam GnTIII (Stanley et al., 1984, J. Biol. Chem. 261: 13370-13378), mas podem ser modificadas nesse sentido (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180) . A presente invenção contempla anticorpos como definido nas reivindicações que compreendem glicoformas modificadas ou glicoformas manipuladas. Por "glicoforma modificada" ou "glicoforma manipulada" como aqui usado entende-se uma composição hidrato de carbono que está ligada covalentemente a uma proteína, por exemplo um anticorpo, em que a referida composição hidrato de carbono difere quimicamente daquela da proteína parente. As glicoformas manipuladas podem ser úteis para vários fins, incluindo mas não limitado a aumentar ou reduzir a função efetora medidada por FcyR. Os anticorpos da presente invenção podem ser modificados para controlar o nível de oligossacáridos fucosilados e/ou de biseção que estão ligados covalentemente à região Fc.

Historicamente, os anticorpos produzidos em Células de Ovário de Hamster Chinês (OHC), um dos hospedeiros industriais mais usados, contêm cerca de 2 até 6% da população que é não fucosilada. A linha de células YB2/0 (mieloma de rato) e Lee 13 (uma lectina mutante da linha OHC que tem uma GDP-manose 4,6 desidratase deficiente conduzindo à deficiência da GDPfucose ou intermediários açúcar GDP que são o substrato da al,6-fucosiltransferase (Ripka et al., 1986), no entanto, pode produzir anticorpos células com 78% até 98% espécies não fucosiladas. Infelizmente, a produção de anticorpo a partir destas células é 69 extremamente pobre e portanto estas linhas de células não são úteis para fazer comercialmente produtos de anticorpos terapêuticos. 0 gene FUT8 codifica a enzima al,6-fucosiltransferase que catalisa a tranferência de um resíduo fucosil da GDP-fucose para a posição 6 de GlcNac ligado a Asn (ligado a N) de uma N-glicana (Yanagidani et ai., 1997, J Biochem 121:626-632). Sabe-se que a al,6 fucosiltransferase é a única enzima responsável pela adição da fucose ao hidrato de carbono biantena ligado a N na Asn297 no domínio CH2 do anticorpo IgG. São conhecidos vários métodos na técnica para gerar glicoformas modificadas (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem. 278:3466-3473); (US 6,602,684; US 2003/0157108; US 2003/0003097; PCT WO 00/ 617 3 9A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87 (5) :614-621; (Potelligent™ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ] ; GlycoMAb™ glicosilation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland]). Estas técnicas controlam o nível de oligossacáridos fucosilados e/ou de biseção que estão ligados covalentemente à região Fc, por exemplo por expressão de uma IgG em vários organismos ou linhas de células, por manipulação ou de outro modo (por exemplo células Lec-13 OHC ou células de hibridoma rato YB2/0), por regulação enzimática envolvida no passo de glicosilação (por exemplo FUT8 [al,6-fucosiltranserase] e/ou βΙ-4-Ν-acetilglucosaminiltransferase III [GnTIII]), ou por modificação do(s) hidrato de carbono(s) após a IgG ter sido expressa. 70

Outros métodos para modificar as glicoformas dos anticorpos da invenção incluem o uso de estirpes de leveduras glicomanipuladas (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), musgo (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8), e plantas (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7). Métodos para modificar glicoformas incluem mas não são limitados ao uso de uma estirpe glicomanipulada da levedura Pichia pastoris (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), uma estirpe glicomanipulada do musgo Physcomitrella patens em que as enzimas β1,2-xylosiltransferase e/ou al,3-fucosiltransferase são eliminadas (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8), e o uso de interferência de RNA para inibir alfa-1,3-fucosiltransferase e/ou beta-1,2 xilosiltransferase endógenas na planta aquática Lemna minor (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7).

Glicoforma modificada ou manipulada tipicamente refere-se ao hidrato de carbono ou oligossacárido diferente; assim por exemplo um anticorpo pode compreender uma glicoforma manipulada. Em alternativa, a glicoforma manipulada pode referir-se ao anticorpo que compreende o hidrato de carbono ou oligossacárido diferente. Para os fins das glicoformas modificadas aqui descritas, um "anticorpo parente" é um anticorpo glicosilado com a mesma sequência de aminoácidos e estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro como uma glicoforma manipulada da presente invenção, exceto que a fucose está ligada à estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro do anticorpo parente. Por exemplo, numa composição compreendendo a parente glicoproteina cerca de 50-100% ou cerca de 70-100% da glicoproteina parente compreendem a estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro com a fucose a ele ligada. 71 A presente invenção fornece uma composição compreendendo vários dos anticorpos glicosilados como definido nas reivindicações em que cerca de 80-100% do anticorpo na composição compreende a estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro que não possui fucose e o mais preferencialmente, cerca de 90-99% do anticorpo na composição não tem fucose ligada à estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro. O anticorpo aqui descrito na composição pode compreende tanto uma estrutura de núcleo de hidrato de carbono madura que não possui fucose como adicionalmente compreende pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc. A combinação da glicoforma manipulada e modificação de aminoácido fornece ótimas propriedades de ligação do recetor Fc ao anticorpo.

Propriedades otimizadas de anticorpos São aqui divulgadas variantes de anticorpo que são otimizadas para um número de propriedades terapeuticamente relevantes. Um anticorpo variante compreende uma ou mais modificações de aminoácido em relação a um anticorpo parente, em que a referida modificação de aminoácido(s) fornece uma ou mais propriedades otimizadas. Portanto os anticorpos podem ser anticorpos variantes. Um anticorpo aqui descrito difere na sequência de aminoácidos do seu anticorpo parente devido a pelo menos uma modificação de aminoácido. Assim os anticorpos variantes têm pelo menos uma modificação de aminoácido comparada com o parente. Em alternativa, os anticorpos variantes podem ter mais que uma modificação de aminoácido em comparação com o parente, por exemplo desde cerca de uma até cinquenta modificações de aminoácido, preferencialmente desde cerca de uma até dez modificações de aminoácido, e mais preferencialmente desde cerca de uma até cerca de cinco modificações de aminoácido em comparação com o parente. Assim as sequências dos 72 anticorpos variantes e as dos anticorpos parentes são substancialmente homólogos. Por exemplo, as sequências de anticorpo variante aqui possuirão cerca de 80% de homologia com a sequência de anticorpo parente, preferencialmente pelo menos cerca de 90% de homologia, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de homologia.

Os anticorpos podem compreender modificações de aminoácido que fornecem propriedades de função efetora otimizadas em relação ao parente. Substituições mais preferidas e propriedades de função efetora otimizadas são descritas nas US 2004/0132101, PCT WO 2004/029207, e US 2005/0054832.

Propriedades que podem ser otimizadas incluem mas não são limitadas a afinidade aumentada ou reduzida para um FcyR. Os anticorpos são otimizados para possuir afinidade aumentada para um ativador FcyR humano, preferencialmente FcyRI, FcYRIIa, FcyRIIc, FcYRIIIa, e FcYRIIIb, o mais preferencialmente FcYRIIIa. Os anticorpos são otimizados para possuir reduzida afinidade para o recetor inibitório FcyRIIó humano. Estas formas de realização preferidas são antecipadas para fornecer anticorpos com propriedades terapêuticas melhoradas em humanos, por exemplo função efetora melhorada e maior potência anti-tumor. Os anticorpos são otimizados para terem afinidade reduzida ou ablacionada para um FcyR humano, incluindo mas não limitado a FcyRI, FcyRIIa, FcYRIIb, FcyRIIc, FcYRIIIa, e FcYRIIIb. Estas formas de realização são antecipadas para fornecer anticorpos com propriedades terapêuticas melhoradas em humanos, por exemplo reduzida função efetora e reduzida toxicidade. Os anticorpos fornecem afinidade aumentada para uma ou mais FcyRs, afinidade ainda reduzida para um ou mais de outros FcyRs. Por exemplo, um anticorpo pode ter ligação melhorada a FcYRIIIa, ainda uma ligação reduzida FcYRIIb. Como alternativa, um anticorpo pode ter ligação melhorada a 73

FcYRIIa e FcyRI, embora uma ligação reduzida a FcYRIIb. Ainda numa outra forma de realização, um anticorpo pode ter afinidade aumentada para FcyRIIb, embora uma afinidade reduzida a um ou mais ativadores FcyRs. A modificação preferencialmente aumenta a afinidade de ligação para um ou mais FcyRs. Por "maior afinidade" ou "afinidade melhorada" ou "afinidade aumentada" ou "melhor afinidade" que uma imunoglobulina parente, como aqui usado entende-se que uma variante Fc se liga a um recetor Fc com uma constante de equilíbrio de associação (KA) significativamente mais elevada ou uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) mais baixa que o polipéptido parente quando as quantidades do polipéptido variante e parente no ensaio de ligação são essencialmente a mesma. Por exemplo, a variante Fc com afinidade de ligação FcyR melhorada pode apresentar desde cerca de 5 vezes até cerca de 1000 vezes, por exemplo desde cerca de 10 vezes até cerca de 500 vezes de melhoria de afinidade de ligação ao recetor Fc em comparação com o polipéptido parente, onde a afinidade de ligação do recetor Fc é determinada, por exemplo, como divulgado aqui nos Exemplos. Consequentemente, por "afinidade reduzida" em comparação com um polipéptido Fc parente como aqui usado entende-se que uma variante Fc liga um recetor Fc com KA significativamente mais baixa ou KD mais alta que o polipéptido parente.

Os dados no presente estudo indicam que WT IgGl humano se liga a V158 FcYRIIIa humano com uma afinidade de aproximadamente 240 nM (Exemplo 1). Isto é consistente com a literatura que indica que esta ligação é de aproximadamente 200-500 nM, como determinado por Biacore (210 nM como mostrado em Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49; 250 nM como mostrado em Lazar et al, Proc Natl 74

Acad Sei USA 1,03(11):4005-4010) e calorimetria (530 nM, Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49). No entanto uma afinidade tão baixa como 750 nM foi medida num estudo (Ferrara et al., 2006, J Biol Chem 281 (8):5032-5036). Apesar de a ligação a F158 FcYRIIIa ser mais baixa do que o ponto de corte 5 μΜ aplicado no presente estudo, a literatura indica que WT IgGl humana se liga a F158 FcYRIIIa humano com uma afinidade de aproximadamente 3-5μΜ, como indicado por calorimetria (2,7 μΜ, em Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49) e Biacore (5,0 μΜ, Ferrara et al., 2006, J Biol Chem 281(8):5032-5036).

Os anticorpos podem compreender a otimização de ligação Fc a um FcyR humano, no entanto em alternativa os anticorpos podem possuir afinidade aumentada ou reduzida para FcyRs de organismos não humanos, incluindo mas não limitado a roedores e primatas não humanos. Os anticorpos que são otimizados para ligação a um FcyR não humano podem encontrar utilização em experiências. Por exemplo, estão disponíveis modelos de ratinho para uma diversidade de doenças que permitem testar propriedades como a eficácia, toxicidade, e farmacocinética de um dado fármaco candidato. Como é conhecido na técnica, as células cancerígenas podem ser enxertadas ou injetadas em ratinhos mimetizando um cancro humano, um processo referido como xeno enxertos. Testes de anticorpos que compreendem anticorpos que são otimizados para um ou mais FcyRs de ratinho, podem fornecer informação valiosa com vista à eficácia da proteína, o seu mecanismo de ação, e afins. Os anticorpos pode também ser otimizados para aumentar a funcionalidade e/ou propriedade de solução na forma aglicosilada. Os anticorpos glicosilados ligam um ligando Fc com maior afinidade que a forma aglicosilada do anticorpo parente. Os referidos ligandos Fc incluem mas não são limitados a FcyRs, Clq, 75

FcRn, e proteínas A e G, e pode ser a partir de qualquer fonte incluindo mas não limitado a humanos, ratinhos, ratos, coelhos, ou macacos, preferencialmente humanos. Os anticorpos podem ser otimizados para serem mais estáveis e/ou mais solúveis que a forma aglicosilada do anticorpo parente.

Os anticorpos podem compreender modificações que modulam a interação com outros ligandos Fc que não os FcyRs, incluindo mas não limitado a proteínas de complemento, FcRn, e homólogos de recetor Fc (FcRHs) . FcRHs incluem mas não são limitados a FcRHl, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5, e FcRH6 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).

Preferencialmente, a especificidade do anticorpo para o ligando Fc irá determinar a sua utilidade terapêutica. A utilidade de um dado anticorpo para fins terapêuticos irá depender do epitopo ou forma do antigénio alvo e a doença ou indicação a ser tratrada. Para alguns alvos e indicações, funções efetoras aumentadas mediadas por FcyR podem ser preferidas. Isto pode ser particularmente favorável para anticorpos anticancro. Assim podem ser usados anticorpos que compreende anticorpos que fornecem afinidade aumentada para ativar FcyRs e/ou afinidade para reduzir FcyRs inibidor. Para alguns alvos e indicações, pode ser também benéfico utilizar anticorpos que fornecem seletividade diferencial para diferentes ativadores FcyRs; por exemplo, em alguns casos pode ser desejada ligação aumentada a FcYRIIa e FcYRIIIa, mas não a FcyRI, enquanto noutros casos, a ligação aumentada somente para FcYRIIa pode ser preferida. Para certos alvos e indicações, pode ser preferível utilizar anticorpos que aumentam tanto as funções efetoras mediadas por FcyR e mediadas por complemento, enquanto para outros casos pode ser vantajoso utilizar anticorpos que aumentam as funções efetoras 76 mediadas por FcyR ou mediada por complemento. Para alguns alvos ou indicações de cancro, pode ser vantajoso para reduzir ou eliminar a uma ou mais funções efetoras, por exemplo eliminando a ligação a Clq, um ou mais FcyR's, FcRn, ou um ou mais outros ligandos Fc. Para outros alvos e indicações, pode ser preferível utilizar anticorpos que fornecem ligação aumentada a FcYRIIb inibitório, ainda nível WT, reduzido, ou eliminando a ligação a ativadores FcyRs. Isto pode ser particularmente útil, por exemplo, quando o objetivo de um anticorpo é inibir a inflamação ou doença auto-imune, ou modulam o sistema imunitário em alguns modos.

Claramente um importante parâmetro que determina a seletividade mais benéfica de um dado anticorpo para tratar uma dada doença é o contexto do anticorpo, em que o tipo de anticorpo está a ser usado. Portanto a seletividade ou especificidade do ligando Fc de um dado anticorpo irá proporcionar propriedades diferentes dependendo de se compõe um anticorpo ou anticorpos com uma fusão acoplada ou parceiro conjugado. Por exemplo, toxina, radionucleótido, ou outros conjugados podem ser menos tóxicos para células normais se o anticorpo que os compreende tem ligação reduzida ou eliminada de um ou mais ligandos Fc. Como outro exemplo, a fim de inibir a inflamação ou doença auto-imune, pode ser preferível utilizar um anticorpo com afinidade aumentada para ativar FcyRs, tais como para ligar estes FcyRs e prevenir a sua ativação. Por outro lado, um anticorpo que compreende duas ou mais regiões Fcs com afinidade FcYRIIb aumentada pode coenvolver este recetor na superfície das células imunitárias, inibindo deste modo a proliferação destas células. Se em alguns casos um anticorpo pode envolver o seu antigénio alvo num tipo de célula no entanto envolver FcyRs em células separadas do antigénio alvo, noutros casos pode ser vantajoso envolver 77

FcyRs na superfície das mesmas células como o antigénio alvo. Por exemplo, se os anticorpos alvo um antigénio numa célula que também expressa um ou mais FcyRs, pode ser benéfico utilizar um anticorpo que aumenta ou reduz a ligação a FcyRs na superfície dessa célula. Isto pode ser o caso, por exemplo quando o anticorpo está a ser utilizado como um agente anti-cancro, e coenvolvimento do antigénio alvo e FcyR na superfície da mesma célula promove eventos de sinalização dentro da célula que resulta na inibição do crescimento, apoptose, ou outro efeito anti-proliferativo. Em alternativa, o coenvolvimento do antigénio e do FcyR na mesma célula pode ser vantajoso quando o anticorpo está a ser usado para modular o sistema imunitário de vários modos, em que o coenvolvimento do antigénio alvo e FcyR fornece algum efeito proliferativo ou anti-proliferativo. Do mesmo modo, os anticorpos que compreende duas ou mais regiões Fc pode beneficiar dos anticorpos que modulam a seletividade ou especificidade FcyR para envolver FcyRs na superfície da mesma célula. A especificidade do ligando Fc dos anticorpos aqui descritos pode ser modulada para criar diferentes perfis de função efetora que podem ser adequados para epitopos de antigénios específicos, indicações ou populações de doentes. A Figura 5 descreve várias formas de realização preferidas dos perfis de ligação ao recetor que incluem melhorias de, reduções de ou sem efeito para a ligação a vários recetores, onde tais alterações podem ser benéficas em determinados contextos. Os perfis de ligação ao recetor na Figura 5 podem variar no grau de aumento ou diminuição dos recetores específicos. Adicionalmente, as alterações de ligação podem ser especificadas no contexto de alterações adicionais de ligação a outros recetores tais como Clq ou FcRn, por exemplo através da combinação com a eliminação de ligação a Clq para desligar a ativação do complemento, ou 78 através da combinação de ligação aumentada Clq para aumentar a ativação do complemento. São possíveis outras formas de realização com outro perfil de ligação a recetor, os perfis de ligação a recetores enumerados são exemplificativos. A presença de diferentes formas polimorfas de FcyRs fornece no entanto outro parâmetro que afeta a utilidade terapêutica dos anticorpos aqui descritos. Considerando que a especificidade e seletividade de um dado anticorpo para as diferentes classes de FcyRs afeta significativamente a capacidade de um anticorpo para atingir o antigénio para o tratamento de uma dada doença, a especificidade ou seletividade de um anticorpo para diferentes formas polimorfas destes recetores pode em parte determinar qual a investigação ou experiências pré-clinicas que podem ser apropriados para testar, e em última análise, quais as populações de doentes que podem ou não responder ao tratamento. Assim a especificidade ou seletividade de anticorpos para polimorfismo de ligando Fc, incluindo mas não limitado a polimorfismos FcyR, Clq, FcRn, e FcRH, pode ser usado para guiar a seleção de investigação válida e experiências pré-clinicas, definição de ensaios clinicos, seleção de doentes, dependência de dosagem, e/ou outros aspetos relativos aos ensaios clinicos.

Outras modificações

Os anticorpos aqui descritos podem compreender uma ou mais modificações que fornecem propriedades otimizadas que não são especificamente relacionadas com a função efetora per se. As referidas modificações podem ser modificações de aminoácido, ou podem ser modificações que são feitas enzimaticamente ou quimicamente. Tal modificação(ões) fornecem igualmente alguma melhoria no anticorpo, por 79 exemplo um aumento na sua estabilidade, solubilidade, função, ou uso clínico. São admissíveis várias melhorias que podem ser ligadas aos anticorpos aqui descritos, com modificações adicionais. A região variável de um anticorpo pode ser afinidade amadurecida, isto é dizer que as modificações de aminoácido têm sido feitas nos domínios VH e/ou VL do anticorpo para aumentar a ligação do anticorpo ao seu antigénio alvo. Esses tipos de modificações podem melhorar as cinéticas de associação e/ou de dissociação de ligação ao antigénio alvo. Outras modificações incluem as que melhoram a seletividade para o antigénio alvo vs. alvos alternativos. Estas incluem modificações que melhoram a seletividade para antigénio expressas no alvo vs. células não alvo. Outras melhorias para as propriedades de reconhecimento do alvo podem ser fornecidas por modificações adicionais. Tais propriedades podem incluir, mas não são limitados a, propriedades cinéticas específicas (i.e. cinéticas de associação e dissociação) , seletivamente para o alvo específico em relação alvos alternativos, e seletividade para uma forma específica de alvo em relação a formas alternativas. Exemplos incluem variantes de comprimento total versus junção, da superfície celular versus formas solúveis, seletividade para diferentes variantes polimórficas, ou seletividade para formas específicas conformacionais do antigénio alvo.

Os anticorpos aqui descritos podem compreender uma ou mais modificações que fornecem internalização reduzida ou aumentada, de um anticorpo. Os anticorpos podem ser utilizados ou combinados com modificações adicionais com vista a reduzir a internalização celular de um anticorpo que ocorre através da interação com um ou mais ligandos Fc. Deve ser esperado que esta propriedade aumente a função 80 efetora, e, potencialmente reduza a imunogenicidade dos anticorpos da presente invenção. Em alternativa, os anticorpos podem ser utilizados diretamente ou em combinação com modificações adicionais com vista a aumentar a internalização celular de um anticorpo que ocorre através da interação com um ou mais ligandos Fc. Por exemplo, é usado um anticorpo que fornece ligação aumentada a FcyRI, que é expresso nas células dendríticas e precocemente ativo na resposta imunológica. Esta estratégia pode ser melhorada adicionalmente por combinação com modificações adicionais, tanto dentro do anticorpo ou numa ligação de fusão ou parceiro conjugado, que promove o reconhecimento e apresentação de fragmentos de péptidos Fc por moléculas MHC. Espera-se que essas estratégias devem melhorar o processamento do antigénio alvo e, assim, melhorar a antigenicidade do antigénio alvo (Bonnerot and Amigorena, 1999, Immunol Rev. 172:279-84), promover uma resposta imune adaptativa e maior mortalidade da célula alvo pelo sistema imunitário humano. Estas estratégias podem ser particularmente vantajosas quando o antigénio alvo é libertado da superfície celular. Uma aplicação adicional destes conceitos surge com imunoterapias de vacina idiotipo, nas quais os anticorpos específicos para clone produzidos pelas células do linfoma dos doentes são usados para vacinar o doente.

As modificações são feitas para melhorar as propriedades biofísicas dos anticorpos, incluindo mas não limitado a estabilidade, solubilidade, e estado oligomérico. As modificações podem incluir, por exemplo, substituições que fornecem mais interações intramoleculares favoráveis no anticorpo tais como para fornecer maior estabilidade, ou substituição de aminoácidos não polares expostos com aminoácidos polares de maior solubilidade. Um certo número de objetivos e métodos de otimização são descritos na US 81 2004/0110226, que podem encontrar uso para aplicar modificações adicionais para otimizar adicionalmente os anticorpos. Os anticorpos podem também ser combinados com modificações adicionais que reduzem o estado oligomérico ou tamanho, de modo a que a penetração no tumor seja aumentado, ou As taxas de depuração in vivo são aumentadas como desejado.

Outras modificações dos anticorpos incluem aqueles que permitem a formação especifica ou moléculas homodiméricas ou homomultiméricas. Essas modificações incluem mas não são limitadas uns dissulfetos manipulados, assim como modificações quimicas ou métodos de agregação que podem proporcionar um mecanismo para gerar homodimérico ou homomultimeros covalentes. Por exemplo, métodos de manipulação e composições dessas moléculas são descritos em Kan et al., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al., 2002, Recent Results Câncer Res. 159: 104-12; US 5, 681,566; Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195, e Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918-22. Modificações adicionais às variantes incluem aquelas que permitem a formação especifica ou heterodimérica, heteromultimérica, bifuncional, e/ou moléculas multifuncionais. Essas modificações incluem, mas não são limitados a, uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio CH3, no qual as substituições reduzem a formação de homodímero e aumentam a formação de heterodímero. Por exemplo, métodos de manipulação e composições dessas moléculas são descritos em Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270(1): 26-35, e Cárter et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:7-15. Modificações adicionais incluem modificações na articulação e domínios CH3, nos quais as modificações reduzem a tendência para formar dímeros. 82

Os anticorpos aqui descritos podem compreender modificações que removem sitios de degradação proteolitica. Estes podem incluir, por exemplo, sitios de protease que reduzem o rendimento de produção, assim como sitios de protease que degradam a proteina administrada in vivo. São feitas modificações adicionais para remover sitios de degradação covalentes tais como sitios de desaminação (i.e. desaminação de residuos de glutaminilo e asparaginilo nos correspondentes residuos de glutamilo e aspartilo), oxidação, e degradação proteolitica. Os sitios de desaminação que são particularmente úteis remover são aqueles que têm maior propensão para a desaminação, incluindo, mas não limitado a residuos de asparaginilo e glutamilo seguidos por glicinas (motivos NG e QG, respetivamente). Nesses casos, a substituição de qualquer residuo pode reduzir significativamente a tendência para a desaminação. Sitios comuns de oxidação incluem residuos de metionina e cisteina. Outras modificações covalentes, que podem ser tanto introduzidas como removidas, incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de residuos de serilo ou treonilo, metilação de "-grupos amina de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal. Modificações adicionais podem também incluir mas não são limitadas a modificações pós-translacionais tais como glicosilação e fosforilação ligada a N ou ligada a 0.

As modificações podem incluir aquelas que melhoram a expressão e/ou os rendimentos de purificação a partir de hospedeiros ou células hospedeiras comummente usadas na produção de produtos biológicos. Estas incluem, mas não são limitadas a várias linhas de células de mamiferos (por 83 exemplo OHC), linhas de células de leveduras, linhas de células bacterianas, e plantas. As modificações adicionais incluem modificações que removem ou reduzem a capacidade das cadeias pesadas formarem ligações dissulfeto intercadeia. As modificações adicionais incluem modificações que removem ou reduzem a capacidade das cadeias pesadas para formar ligações dissulfeto intracadeia.

Os anticorpos podem compreender modificações que incluem o uso de aminoácidos não naturais incorporados usando, por exemplo, as tecnologias desenvolvidas por Schultz e colegas, incluindo mas não limitado aos métodos descritos por Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, e Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7. Estas modificações permitem a manipulação de várias propriedades funcionais, biofisicas, imunológicas, ou as propriedades de produção discutidas acima. Estas modificações permitem modificações quimicas adicionais para outros fins. Outras modificações são aqui contempladas. Por exemplo, o anticorpo da invenção pode ser ligado a uma diversidade de polímeros não proteico, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolimeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. Modificações de aminoácidos adicionais podem ser feitas para permitir modificação química postranslacional especifica ou não especifica ou dos anticorpos. Tais modificações, incluem, mas não são limitadas a PEGilação e glicosilação. Substituições específicas que podem ser utilizadas para permitir a PEGilação incluem, mas não são limitadas a, introdução de novos resíduos de cisteína ou aminoácidos não naturais de modo a que químicas de acoplamento eficientes e específicas possam ser usadas para ligar um PEG ou de outra 84 forma uma porção polimérica. A introdução de sítios de glicosilação específicos pode ser obtida por introdução de novas sequências N-X-T/S nos anticorpos.

Modificações covalentes de anticorpos da presente invenção podem ser feitas postranslacionalmente. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos numa molécula reagindo o resíduo de aminoácidos específico do anticorpo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C-terminais. A modificação covalente dos anticorpos da invenção pode compreender a adição de um ou mais marcadores. 0 termo "grupo marcador" significa qualquer marcador detetável. 0 grupo marcador pode ser ligado ao anticorpo por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir impedimento estérico potencial. São conhecidos na técnica vários métodos para proteínas de marcação e podem ser usados na realização da presente invenção. Em geral, os marcadores caem uma variedade de classes, dependendo do ensaio no qual são para ser detectados: a) marcadores isotópicos, que podem ser radioativos ou isótopos pesados; b) marcadores magnéticos (por exemplo, partículas magnéticas); c) porções ativas redox; d) corantes óticos; grupos enzimáticos (por exemplo peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados; e f) epitopos de polipéptidos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências pares zipper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metais, marcadores de epitopo, etc.). 0 grupo marcador pode ser ligado ao anticorpo por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcação de proteínas são conhecidos na 85 técnica e podem ser usados na realização da presente invenção. Marcadores especificos incluem corantes óticos, incluindo, mas não limitado a, cromóforos, fósforos e fluoróforos, sendo os últimos especificos em muitos casos. Os fluoróforos podem ser ou "pequena molécula" flúores, ou flúores proteicos. Por "marcador fluorescente" entende-se qualquer molécula que pode ser detetada através das suas inerentes propriedades fluorescentes.

Conjugados e fusões de anticorpo

Os anticorpos da invenção podem ser "proteínas de fusão" de anticorpo, algumas vezes referidas aqui como "conjugados de anticorpo". 0 parceiro de fusão ou parceiro conjugado pode ser proteico ou não proteico; o último sendo geralmente gerado usando grupos funcionais no anticorpo e no parceiro conjugado. Os parceiros de fusão e conjugados podem ser qualquer molécula, incluindo compostos químicos de moléculas pequenas e polipéptidos. Por exemplo, vários conjugados de anticorpo e métodos são descritos em Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588. Possíveis parceiros conjugados incluem mas não são limitados a citocinas, agentes citotóxicos, toxinas, radioisótopos, agente quimioterapêutico, agentes antiangiogénicos, inibidores da tirosina quinase, e outros agentes terapeuticamente ativos. Os parceiros conjugados podem ser pensados mais como cargas úteis, quer dizer que o objetivo de um conjugado é direcionado a entrega do parceiro conjugado à célula alvo, por exemplo uma célula de cancro ou célula imune, pelo anticorpo. Assim, por exemplo, a conjugação de uma toxina a um anticorpo visa a aplicação da referida toxina a células expressando o antigénio alvo. Como será apreciado por um especialista na técnica, na realidade os conceitos e definições de fusão e conjugado são sobreposição. A designação de um anticorpo como uma 86 fusão ou conjugado não é para o limitar a qualquer forma de realização particular da presente invenção. Pelo contrário, estes termos são usados vagamente para transmitir o conceito amplo de que qualquer anticorpo da presente invenção pode estar geneticamente, quimicamente, ou de outro modo ligado, a um ou mais polipéptidos ou moléculas para dar alguma propriedade desejada.

Conjugados adequados incluem, mas não são limitados a, marcadores como descrito a seguir, fármacos e agentes citotóxicos incluindo, mas não limitado a, fármacos citotóxicos (por exemplo, agentes quimioterapêuticos) ou toxinas ou fragmentos ativos dessas toxinas. Toxinas adequadas e os seus correspondentes fragmentos incluem cadeia A difteria, cadeia A exotoxina, cadeia A ricino, cadeia A abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina e semelhantes. Os agentes citotóxicos incluem também radioquimicos obtidos por conjugação de radioisótopos aos anticorpos, ou ligação de um radionuclideo a um agente quelante que tenha sido ligado covalentemente ao anticorpo. Formas de realização adicionais utilizam caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina, maitansina, e duocarmicinas e análogos; para estes últimos, ver U.S. 2003/0050331.

Os anticorpos da presente invenção podem ser fundidos ou conjugados a uma citocina. Por "citocina" como aqui usado entende-se um termo genérico para proteínas libertado por uma população de células que atuam noutra célula como mediadores intercelulares. Por exemplo, como descrito em Penichet et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-101, as citocinas podem ser ligadas ao anticorpo para fornecer uma matriz de propriedades desejáveis. Exemplos dessas citocinas são linfoquinas, monoquinas, e hormonas polipéptidos tradicionais. Incluídas entre as citocinas estão hormonas de crescimento tais como hormonas de 87 crescimento humanas, hormona de crescimento humana N-metionilo, e hormona de crescimento bovino; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteinas tais como hormona estimulante de foliculo (HEF), hormona estimulante da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (HL); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogénio placentário; fator alfa e beta de necrose tumural; substância inibidora mulleriana; péptido associado a gonadotropina de rato; inibitina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoletina (TPO); fator de crescimento neural tais como FEC-beta; fator de crescimento plaquetário; fator de crescimento transformador (FCTs) tais como FCT-alfa e FCT-beta; fator I e II de crescimento tipo insulina; eritropoletina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão alfa, beta, e gama; fatores de estimulação de colónia (FEC) tais como macrófago-CSF (M- CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-β, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, um fator de necrose tumoral tal como TNF-alfa ou TNF-beta; C5a; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e kit ligando (KL). Como aqui usado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes, os equivalentes biologicamente ativos das citoquinas de sequências nativas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser ligados, conjugados, ou operacionalmente ligados a uma toxina, incluindo mas não limitado a toxinas de pequenas moléculas e toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas. Por exemplo, várias imunotoxinas e métodos de imunotoxina são descritos em Thrush et al., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14:49-71. Toxinas de pequenas moléculas incluem mas não são limitadas a caliqueamicina, maitansina (US 5,208,020), tricoteno, e CC1065. O anticorpo da invenção pode ser conjugado para uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo cerca de 1 até cerca de 10 moléculas de maitansina por moléculas de anticorpo) . A maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me a qual pode ser reduzida a May-SH3 e reagida com anticorpo modificado (Chari et al., 1992, Câncer Research 52: 127-131) para gerar um conjugado maitansinóide-anticorpo. Outro conjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina são capazes de produzir quebras de DNA de cadeia dupla a concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usadas incluem mas não são limitados a yi1, (¾1, oí3, N-acetil-yi1, PSAG, e Θ1!, (Hinman et al., 1993, Câncer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Câncer Research 58:2925-2928) (US 5,714,586; US 5,712,374; US 5,264,586; US 5,773,001). 10 análogos de dolastatina tais como auristatina E (AE) e monometilauristatina E (MMAE) podem ser usados como conjugados para os anticorpos da presente invenção (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21 (7) : 778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). Toxinas úteis enzimaticamente ativas incluem mas não são limitadas a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxinas de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de rícino, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, PCT WO 93/21232. Pode também ser contemplado um conjugado entre um anticorpo da 89 presente invenção e um composto com atividade nucleolitica, por exemplo uma ribonuclease ou DNA endonuclease tal como uma deoxiribonuclease (Dnase).

Um anticorpo da presente invenção pode ser ligado, conjugado, ou operacionalmente ligado a um radioisótopo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem, mas não são limitados a, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, BÍ212, P32, e isótopos radioativos de Lu.

Um anticorpo da presente invenção pode ser conjugado a um "recetor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento a tumor em que o conjugado anticorpo-recetor é administrado ao doente, seguido por remoção do conjugado não ligado da circulação usando um agente de aclaramento e depois administração de um "ligando" (por exemplo avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo a radionucleótido). 0 anticorpo pode ser conjugado ou operacionalmente ligado a uma enzima com vista a empregar a Terapia Pró-fármaco Mediada por Enzima Dependente de Anticorpo (ADEPT). A ADEPT pode ser usada através de conjugação ou ligação operacional a anticorpo para uma enzima ativadora de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (por exemplo um agente quimioterapêutico peptidilo, ver PCT WO 81/01145) num fármaco anti-cancro ativo. Ver, por exemplo, PCT WO 88/07378 e US 4,975,278. 0 componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar num pró-fármaco de modo a cobrir a sua forma citotóxica mais ativa. Enzimas que são úteis no método incluem mas não são limitados a fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos contendo fosfato em fármacos livres; arilsulfatase útil para converter pró-fármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina 90 deaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica num fármaco anti cancro, 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo péptido em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácido; enzimas de clivagem de hidrato de carbono tais como beta-galactosidase e neuramimidase útil para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; beta-lactamase úteis para converter fármacos derivatizados com .alfa.- lactâmicos em fármacos livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter fármacos derivatizados na sua azotos de amina com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respetivamente, em fármacos livres. Em alternativa, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser usados para converter os pró-fármacos em fármacos ativos livres (ver, por exemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados para libertação da abzima para uma população de células tumorais. Vários conjugados adicionais podem ser contemplados para os anticorpos da presente invenção. Vários agentes quimioterapêuticos, agentes antiangiogénicos, inibidores de quinase de tirosina, e outros agentes terapêuticos são descritos abaixo, os quais podem encontrar uso como conjugados de anticorpo.

Também contemplados como conjugados de fusão e parceiros são os polipéptidos Fc. Assim um anticorpo pode ser um polipéptido multimérico Fc, compreendendo duas ou mais regiões Fc. A vantagem de uma tal molécula é que ele fornece múltiplos sitios de ligação para os recetores Fc com uma única molécula de proteina. As regiões Fc podem ser 91 ligadas usando uma abordagem de manipulação química. Por exemplo, os Fab's e Fc' s podem ser ligados por ligações tioéter originando os resíduos de cisteína nas articulações, gerando moléculas tais como FabFc2. As regiões Fc podem ser ligadas usando manipulação disulfeto e/ou ligação química cruzada. As regiões Fc podem ser ligadas geneticamente. As regiões Fc num anticorpo são ligadas geneticamente às regiões Fc geradas ligadas em tandem como descrito na US 2005/0249723, registada em 12/21/2004, intitulada "Fc polipeptides with novel Fc ligand binding sites,". Os polipéptidos Fc ligados em tandem podem compreender duas ou mais regiões Fc, preferencialmente uma até três, mais preferencialmente duas regiões Fc. Pode ser vantajoso explorar um certo número de construções manipuladas com vista a obter anticorpos ligados como homo- ou heterotandem com as propriedades estruturais e funcionais mais favoráveis. Os anticorpos ligados em tandem podem ser anticorpos ligados em homo-tandem, ou seja um anticorpo de um isotipo é fundido geneticamente a outro anticorpo do mesmo isotipo. É antecipado que porque existem sítios múltiplos de ligação FchR, Clq, e/ou FcRn nos polipéptidos Fc ligado sem tandem, as funções efetoras e/ou farmacocinéticas pode ser aumentada. Numa forma de realização alternativa, os anticorpos de diferentes isotipos podem ser ligados em tandem, referidos como anticorpos ligados em heterotandem. Por exemplo, devido à capacidade de visar os recetores FcyR e FcaRI, um anticorpo que se liga a ambos FcyRs e FcaRI pode fornecer uma significativa melhoria clínica.

Para além dos anticorpos, uma proteína tipo anticorpo que encontra um papel em expansão na investigação e terapia é uma fusão de Fc (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195- 92 200). "Fusão Fc" é aqui entendido para ser sinónimo dos termos "imunodesina", "fusão Ig", "quimera Ig", e "recetor de globulina" (por vezes com hifens) como usado na técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Uma fusão de Fc é uma proteína em que um ou mais polipéptidos está operacionalmente ligado a Fc. Uma fusão de Fc combina a região Fc de um anticorpo, e assim as suas funções efetoras e farmacocinéticas favoráveis, com a região de ligação ao alvo de um recetor, ligando, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína. O papel da última é mediar o reconhecimento do alvo, e assim a sua funcionalidade análoga à região variável de anticorpo. Devido à sobreposição estrutural e funcional das fusões de Fc com os anticorpos, a discussão nos anticorpos da presente invenção estende-se também a Fc.

Virtualmente qualquer proteína ou pequena molécula pode ser ligada a Fc para gerar uma fusão de Fc. Os parceiros da proteína de fusão podem incluir, mas não são limitados à região variável de qualquer anticorpo, a região de ligação a alvo de um recetor, uma molécula adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quemocina, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína. Os parceiros das pequenas moléculas de fusão podem incluir qualquer agente terapêutico que dirijam a fusão de Fc para um alvo terapêutico. Tais alvos podem ser qualquer molécula, preferencialmente um recetor extracelular, que esteja implicado na doença.

Os parceiros de fusão e conjugados podem ser ligados a qualquer região de um anticorpo da presente invenção, incluindo nos terminais N ou C, ou no mesmo resíduo entre os terminais. Um parceiro de fusão ou conjugado pode ser ligado ao terminal Nor C do anticorpo, o mais 93 preferencialmente ao terminal N. Vários ligantes podem encontrar uso na presente invenção para anticorpos ligados covalentemente a um parceiro de fusão ou conjugado. Por "ligante", "sequência ligante", "espaçador", "sequência de amarração" ou equivalentes gramaticais destes, aqui entende-se uma molécula ou grupo de moléculas (tais como um monómero ou polímero) que coneta duas moléculas e serve frequentemente para colocar as duas moléculas numa configuração preferida. Os ligantes são conhecidos na técnica; por exemplo, ligantes homo- ou hetero-bifuncionais como são bem conhecidos (ver, 1994 Pierce Chemical Company Catalog, secção técnica em agentes de reticulação, páginas 155-200). Podem ser usadas várias estratégias para ligar covalentemente as moléculas conjuntamente. Estas incluem, mas não são limitadas a ligações polipéptido entre terminais N e C de proteínas ou domínio de proteínas, ligação através de ligações dissulfureto, e ligação através de reagentes de reticulação química. Num aspeto destas formas de realização, o ligante é uma ligação péptidica, gerada por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. O ligante pode conter resíduos de aminoácidos que fornecem flexibilidade. Assim, o péptido ligante pode incluir predominantemente os seguintes resíduos de aminoácidos: Gly, Ser, Ala, ou Thr. O péptide ligante deve ter um comprimento que é adequado para ligar duas moléculas de tal modo que assumam a conformação relativa correta a uma outra de modo que conservem a desejada atividade. Comprimentos adequados para este fim incluem pelo menos um e não mais de 50 resíduos de aminoácidos. Preferencialmente, o ligando é desde cerca de 1 até 30 aminoácidos de comprimento, com os ligantes de 1 até 20 aminoácidos de comprimento sendo os mais preferidos. Ligantes úteis incluem polímeros de glicina-serina (incluindo, por exemplo, (GS)n, (GSGGS)n (GGGGS)n e (GGGS)n, em que n é um número inteiro de pelo menos um) , polímeros glicina-alanina, polímeros alanina- 94 serina, e outros ligantes flexíveis, como será apreciado pelos da técnica. Em alternativa, uma variedade de polímeros não proteicos, incluindo mas não limitado a polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol, podem encontrar utilização como ligantes, que podem encontrar utilização para ligar os anticorpos da presente invenção a um parceiro de fusão ou conjugado, ou para ligar os anticorpos da presente invenção a um conjugado.

Produção de anticorpos São aqui descritos métodos para produzir e testar anticorpos experimentalmente. Os métodos fornecidos são entendidos para ilustrar geralmente que um ou mais anticorpos podem ser produzidos e testados experimentalmente para obter anticorpos variantes. Métodos gerais para biologia molecular de anticorpo, expressão, purificação, e triagem são descritos em Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

Podem ser criados ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da presente invenção, e que podem depois ser clonados nas células hospedeiras, expressas e ensaiadas, se desejado. Assim, os ácidos nucleicos, e particularmente DNA, podem ser feitos de modo a codificar cada sequência de proteína. Estas práticas são realizadas usando procedimentos bem conhecidos. Por exemplo, vários métodos que podem ser úteis são descritos em Molecular Cloning - A 95

Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Como será apreciado pelos especialistas na técnica, a geração de sequências exatas para uma biblioteca compreendendo um grande número de sequências é potencialmente cara e demorada. Por "biblioteca" aqui entende-se um conjunto de variantes em qualquer forma, incluindo mas não limitado a uma lista de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos, uma lista de ácidos nucleicos ou substituições de aminoácidos nas posições variáveis, uma biblioteca fisica compreendendo ácidos nucleicos que codificam as sequências de biblioteca, ou uma biblioteca fisica compreendendo as proteínas variantes, na forma purificada ou não purificada. Consequentemente, há uma diversidade de técnicas que podem ser usadas para gerar bibliotecas eficientemente. Esses métodos que podem encontrar uso são descritos ou referenciados nas US 6,403,312; US 2002/0048772; US 2002/0090648; US 2003/0130827; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. Tais métodos incluem mas não são limitados a métodos de montagem de genes, métodos com base em PCR e métodos que usam variações de PCR, métodos baseados em reação em cadeia da ligase, métodos de oligos agrupados tais como os usados em embaralhamento sintético, métodos de amplificação propensos a erros e métodos que usam oligos com mutações aleatórias, métodos clássicos de mutagénese dirigida a sítio, mutagénese de cassete, e outra amplificação e métodos de síntese de genes. Como é conhecido na técnica, há uma variedade de kits disponíveis comercialmente e métodos para montagem de genes, mutagénese, subclonagem de vetor, e afins, e esses produtos comerciais encontram utilidade na presente invenção para gerar ácidos nucleicos que codificam anticorpos. 96

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por cultura de células hospedeiras transformadas com ácido nucleico, preferencialmente um vetor de expressão, contendo ácido nucleico que codifica os anticorpos, sob condições apropriadas para induzir ou causar a expressão da proteina. As condições apropriadas para a expressão irão variar com a escolha do vetor de expressão e a célula hospedeira, e serão facilmente verificadas por um especialista na técnica através de experiências de rotina. Uma grande variedade de células hospedeiras apropriadas pode ser usada, incluindo mas não limitadas a células de mamifero, bactérias, células de inseto, e leveduras. Por exemplo, várias linhas de células que podem ser úteis na presente invenção são descritas no catálogo de linhas de células ATCC®, disponíveis na American Type Culture Collection.

Os anticorpos podem ser expressos em sistemas de expressão em mamíferos, incluindo sistemas nos quais as construções de expressão são introduzidas nas células de mamífero usando vírus tais como retrovírus ou adenovírus. Podem ser usadas quaisquer células de mamífero, com as células humanas, de ratinho, rato, hamster, e de primata sendo particularmente preferidas. As células adequadas incluem também células de investigação conhecidas, incluindo mas não limitado a células T Jurkat, NIH3T3, OHC, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, células NSO e variantes destas. As bibliotecas de proteínas podem ser expressas nas células bacterianas. Os sistemas de expressão bacterianos são conhecidos na técnica, e incluem Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris, e Streptococcus lividans. Os anticorpos podem ser produzidos em células de inseto (por exemplo Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5bl-4) ou células de levedura (por exemplo S. cerevisiae, Pichia, etc). Os anticorpos podem ser expressos in vitro usando sistemas de translação isentos de células. 97

Os sistemas de translação in vitro derivados tanto de células procarióticas (por exemplo E. coli) como de células eucarióticas (por exemplo gérmen de trigo, reticulócitos de coelho) estão disponíveis e podem ser escolhidas com base nos niveis de expressão e propriedades funcionais da proteina de interesse. Por exemplo, como apreciado pelos especialistas na técnica, a translação in vitro é requerida para algumas tecnologias de exibição, por exemplo exibição em ribossomas. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos por métodos de sintese quimica. Também os sistemas de expressão transgénicos tanto animais (por exemplo vacas, ovelhas ou leite de cabra, ovos de galinha embrionados, larvas completas de inseto, etc.) e vegetal (por exemplo milho, tabaco, lentilha, etc.)

Os ácidos nucleicos que codificam a sequência de cadeia pesada e a sequência de cadeia leve dos anticorpos da presente invenção, como definido nas reivindicações, podem ser incorporados no vetor de expressão com vista a expressar a proteina. Uma diversidade de vetores de expressão podem ser utilizados para a expressão de proteina. Os vetores de expressão podem compreender vetores extra cromossomais auto replicantes ou vetores que se integram num genoma hospedeiro. Os vetores de expressão são construídos para serem compatíveis com o tipo de célula hospedeira. Assim, os vetores de expressão que encontram uso na presente invenção incluem mas não são limitados aos que viabilizam a expressão de proteína em células de mamífero, bactérias, células de inseto, leveduras, e em sistemas in vitro. Tal como é conhecido na técnica, uma diversidade de vetores de expressão estão disponíveis, comercialmente ou de outro modo, os quais podem encontrar uso na presente invenção para expressarem anticorpos. 98

Os vetores de expressão tipicamente compreendem uma proteina operacionalmente ligada com sequências de controlo ou reguladoras, marcadores selecionáveis, quaisquer parceiros de fusão, e/ou elementos adicionais. Por "operacionalmente ligado" aqui entende-se que o ácido nucleico é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Geralmente, estes vetores de expressão incluem ácido nucleico regulador transcricional e translacional operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica o anticorpo, e são tipicamente apropriados para a célula hospedeira usada para expressar a proteina. Em geral, as sequências reguladoras transcricionais e translacionais podem incluir sequências promotoras, sitios de ligação ribossomais, sequências transcricionais de inicio e paragem, sequências translacionais de inicio e paragem, e sequências melhoradoras ou ativadoras. Tal como é conhecido na técnica, os vetores de expressão tipicamente contêm um gene de seleção ou marcador para permitir a seleção das células hospedeiras transformadas contendo o vetor de expressão. Os genes de seleção são bem conhecidos na técnica e irão variar com a célula hospedeira usada.

Os anticorpos podem ser operacionalmente ligados a um parceiro de fusão para poderem atingir a proteina expressa, purificação, triagem, exibição, e afins. Os parceiros de fusão podem estar ligados à sequência de anticorpo através de sequências de ligantes. A sequência ligante compreende geralmente um pequeno número de aminoácidos, tipicamente menos que dez, embora ligantes mais longos possam ser usados. Tipicamente, as sequências ligantes são selecionadas para serem flexíveis e resistentes à degradação. Tal como será avaliado pelos especialistas na técnica, qualquer de uma vasta variedade de sequências pode ser usada como ligante. Por exemplo, uma sequência ligante comum compreende a sequência de aminoácidos GGGGS. Um 99 parceiro de fusão pode ser uma sequência alvo ou de sinalização que direciona o anticorpo e quaisquer parceiros de fusão associados para a desejada localização celular ou para meios extracelulares. Como é conhecido na técnica, certas sequências de sinalização podem visar uma proteina a ser secretadas para o meio de crescimento, ou para o espaço periplasmático, localizado entre a membrana interna e a externa da célula. Um parceiro de fusão pode ser também uma sequência que codifica um péptido ou proteina que viabiliza a purificação e/ou triagem. Tais parceiros de fusão incluem mas não são limitados a etiquetas de polihistidina (His-etiquetas) (por exemplo H6 e H10 ou outras etiquetas para uso com sistemas Cromatografia de Afinidade a Metal Imobilizado (CAMI) (por exemplo colunas de afinidade Ni+2) ) , fusões GST, fusões MBP, Strep-tag, a sequência alvo de biotinilação BSP da enzima bacteriana BirA, e etiquetas epitopo que são visadas por anticorpos (por exemplo etiquetas c-myc, etiquetas bandeira, e afins). Tal como será avaliado pelos especialistas na técnica, essas etiquetas podem ser úteis para purificação, para triagem, ou ambas. Por exemplo, um anticorpo pode ser purificado usando uma etiqueta His imobilizando-o numa coluna de afinidade Ni+2, e depois após purificação a mesma etiqueta His pode ser usada para imobilizar o anticorpo numa placa revestida a Ni+2 para realizar um ELISA ou outro ensaio de ligação (como descrito abaixo). Um parceiro de fusão pode viabilizar o uso de um método de seleção para testar anticorpos (ver abaixo). Os parceiros de fusão que viabilizam uma diversidade de métodos de seleção são bem conhecidos na técnica, e todos estes encontram uso na presente invenção. Por exemplo, fundindo os membros de uma biblioteca de anticorpo ao gene da proteina III, a apresentação de fagos pode ser utilizada (Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, 100

Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:13315-1317). Os parceiros de fusão podem viabilizar anticorpos a serem marcados. Em alternativa, um parceiro de fusão pode ligar-se a uma sequência especifica no vetor de expressão, permitindo que o parceiro de fusão e anticorpo associado seja ligado covalentemente ou não covalentemente com o ácido nucleico que os codifica.

Os métodos de introdução de ácido nucleico exógeno nas células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, e vão variar com a célula hospedeira usada. As técnicas incluem mas não são limitadas a transfeção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, tratamento de cloreto de cálcio, transfeção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, infeção virai ou de fago, encapsulação dos polinucleótido(s) em liposomas, e microinjeção direta de DNA nos núcleos. No caso de células de mamifero, a transfeção pode ser transiente ou estável. Os anticorpos podem ser purificados ou isolados após expressão. As proteínas podem ser isoladas ou purificadas numa diversidade de vias conhecidas dos especialistas na técnica. Métodos de purificação padrão incluem técnicas cromatográficas, incluindo troca iónica, interação hidrofóbica, afinidade, calibração ou filtração em gel, e fase reversa, realizados à pressão atmosférica ou a alta pressão usando sistemas tais como FPLC e HPLC. Os métodos de purificação incluem também técnicas eletroforéticas, imunológicas, de precipitação, de diálise, e cromatofocusação. Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunção com concentração de proteína, são também úteis. Como é bem conhecido na técnica, uma diversidade de proteínas naturais liga Fc e anticorpos, e estas proteínas podem encontrar utilização na presente invenção para purificação de anticorpos. Por exemplo, as proteínas bacterianas A e G ligam-se à região Fc. Do mesmo 101 modo, a proteína bacteriana L liga-se à região Fab de alguns anticorpos, como evidentemente faz o antigénio alvo do anticorpo. A purificação pode, muitas vezes, ser viabilizada por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados usando resina de glutationa se for empregue fusão GST, cromatografia de afinidade Ni+2 se é empregue uma etiqueta His, ou se é usado anticorpo anti-bandeira imobilizado. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, ver, por exemplo Protein Purification: Principies and Practice, 3a Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. O grau de purificação necessário variará dependendo da triagem ou da utilização dos anticorpos. Em alguns casos não é necessária purificação. Por exemplo numa forma de realização, se os anticorpos são secretados, a triagem pode ser feita diretamente a partir dos meios. Como é bem conhecido na técnica, alguns métodos de seleção não envolvem a purificação das proteínas. Assim, por exemplo, se uma biblioteca de anticorpos é feita numa biblioteca de apresentação de fagos, a purificação da proteína pode não ser realizada.

Experimentação in vitro

Os anticorpos podem ser triados usando uma diversidade de métodos, incluindo mas não limitado aos que usam ensaios in vitro, ensaios in vivo à base de células, e seleção de tecnologias. Automação e tecnologias de rastreio de alto rendimento podem ser utilizadas nos procedimentos de triagem. A triagem pode empregar o uso de um parceiro de fusão ou marcador. 0 uso de parceiros de fusão foi discutido acima. Por "marcado" aqui entende-se que os anticorpos da invenção pode ter um ou mais elementos, isótopos, ou compostos químicos anexados para permitir a deteção de uma triagem. Em geral, os marcadores inserem-se 102 em três classes: a) marcadores imunológicos, os quais podem ser um epitopo incorporado como um parceiro de fusão que é reconhecido por um anticorpo, b) marcadores isotópicos, os quais podem ser radioativos ou isótopos pesados, e c) pequenas moléculas marcadoras, as quais podem incluir corantes fluorescentes e colorimétricos, ou moléculas tais como biotina que permite outros métodos de marcação. Os marcadores podem ser incorporados no composto em qualquer posição e podem ser incorporados in vitro ou in vivo durante a expressão de proteina.

As propriedades funcionais e/ou biofísicas de anticorpos são triados num ensaio in vitro. Os ensaios in vitro podem permitir uma ampla gama dinâmica para propriedades de triagem de interesse. As propriedades dos anticorpos que podem ser triados incluem mas não são limitados a estabilidade, solubilidade, e afinidade para os ligandos Fc, por exemplo FcyRs. Podem ser tríadas múltiplas propriedades simultaneamente ou individualmente. As proteínas poem ser purificadas ou não purificadas, dependendo dos requisitos do ensaio. A triagem é um ensaio de ligação qualitativo ou quantitativo para ligar anticorpos a uma proteína ou molécula não proteína que se conhece ou se pensa ligar o anticorpo. A triagem é um ensaio de ligação para medir a ligação ao antigénio alvo. A triagem é um ensaio para ligação dos anticorpos a um ligando Fc, incluindo mas não limitados à família dos FcyRs, o recetor FcRn neonatal, a proteína complemento Clq, e as proteínas bacterianas A e G. Os referidos ligandos Fc podem ser de qualquer organismo, com os humanos, de ratinho, ratos, coelho, e macacos sendo preferidos. Podem ser realizados ensaios usando uma diversidade de métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não limitado a ensaios com base em FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) e BRET (Transferência de Energia de 103

Ressonância de Bioluminescência) , AlphaScreen™ (Ensaio de Proximidade Luminescente homogénea amplificada) , Ensaio de Proximidade de Cintilação, ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima), SPR (Ressonância plasmónica de superfície, também conhecida como Biacore™), calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria diferencial exploratória, eletroforese em gel, e cromatografia incluindo filtração em gel. Estes e outros métodos podem assumir a vantagem de algum parceiro de fusão ou marcador do anticorpo. Ensaios podem empregar uma diversidade de métodos de deteção incluindo mas não limitado a cromogénicos, fluorescentes, luminescentes, ou marcadores isotópicos.

As propriedades biofísicas de anticorpos, por exemplo estabilidade e solubilidade, podem ser tríadas usando uma diversidade de métodos conhecidos na técnica. A estabilidade de proteína pode ser determinada medindo o equilíbrio termodinâmico entre estados dobrados e não dobrados. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser não dobrados usando desnaturante químico, calor, ou pH, e esta transição pode ser monitorizada usando métodos incluindo mas não limitado a espetroscopia de dicroísmo circular, espetroscopia de fluorescência, espetroscopia de absorção, espetroscopia de NMR, calorimetria, e proteólise. Tal como será avaliado pelos especialistas na técnica, os parâmetros cinéticos das transições de dobragem e não dobragem podem também ser monitorizados usando estas e outras técnicas. A solubilidade e integridade estrutural global de um anticorpo podem ser determinadas quantitativamente ou qualitativamente usando um vasta gama de métodos que são conhecidos na técnica. Métodos que podem encontrar uso na presente invenção para caracterizar as propriedades biofísicas de anticorpos incluem eletroforese em gel, 104 focagem isoelétrica, eletroforese capilar, cromatografia tal como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iónica, e cromatografia liquida de alta resolução de fase reversa, mapeamento peptídico, mapeamento de oligossacárido, espetrometria de massa, espetroscopia de absorção ultravioleta, espetroscopia de fluorescência, espetroscopia de dicroismo circular, calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria diferencial exploratória, ultra-centrifugação analítica, dispersão de luz dinâmica, proteólise, e ligação cruzada, medição de turbidez, ensaios de retardamento de filtro, ensaios imunológicos, ensaios de ligação de corantes fluorescentes, ensaios de coloração de proteína, microscopia, e deteção de agregados via ELISA ou outro ensaio de ligação. As análises estruturais empregam técnicas de cristalografia de raio X e espetroscopia de NMR pode também encontrar utilização. A estabilidade e/ou a solubilidade podem ser medida determinando a quantidade de solução de proteína após algum período de tempo definido. Neste ensaio, a proteína pode ser ou não ser exposta a algumas condições extremas, por exemplo temperatura elevada, pH baixo, ou presença de desnaturante. Porque a função tipicamente requere uma proteína estável, solúvel, e/ou bem dobrada/estruturada, os ensaios funcionais e de ligação acima mencionados fornecem também modos para realizar uma tal medida. Por exemplo, uma solução compreendendo um anticorpo pode ser ensaiada quanto à sua capacidade para ligar o antigénio alvo, depois exposta a elevada temperatura por um ou mais períodos de tempo definidos, depois ensaiada novamente quanto à ligação antigénio. Porque a proteína agregada e não dobrada não é esperado que seja capaz de ligar antigénio, a quantidade de atividade restante fornece uma medida da estabilidade e solubilidade do anticorpo. 105 A biblioteca é tríada usando um ou mais ensaios com base celular ou in vitro. Para esses ensaios, anticorpos, purificados ou não purificados, são tipicamente adicionados exogenamente de modo a que as células sejam expostas a variantes individuais ou grupos de variantes pertencendo à biblioteca. Estes ensaios são tipicamente, mas não sempre, com base na biologia da capacidade do anticorpo para ligar a antigénio e mediar algum evento bioquímico, por exemplo funções efetoras como lise celular, fagocitose, inibição de ligação ligando/recetor, inibição do crescimento e/ou proliferação, apoptose e afins. Esses ensaios frequentemente envolvem a monitorização da resposta das células ao anticorpo, por exemplo sobrevivência celular, morte celular, fagocitose celular, lise celular, alteração na morfologia celular, ou ativação transcricional tal como expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, esses ensaios poem medir a capacidade dos anticorpos para eliciar CMCA, FCDA, ou CDC, Para alguns ensaios células adicionais ou componentes, ou seja para além das células alvo, pode ter que ser adicionadas, por exemplo complemento sérico, ou células efetoras tais como monócitos do sangue periférico (CMSPs), células NK, macrófagos, e afins. Essas células adicionais podem ser de qualquer organismo, preferencialmente humanos, ratinhos, ratos, coelhos, e macaco. Anticorpos reticulados ou monoméricos podem causar apoptose de certas linhas de células expressando o antigénio alvo do anticorpo, ou podem mediar o ataque nas células alvo por células imunitárias as quais foram adicionadas ao ensaio. Métodos para monitorizar a morte celular ou a viabilidade são conhecidos na técnica, e incluem o uso de corantes, fluoróforos, imunoquímicos, citoquímicos, e reagentes radioativos. Por exemplo, ensaios de caspase ou flouroconjugados anexina podem viabilizar a apoptose a ser medida, e absorção ou liberação de substratos radioativos (por exemplo ensaio de libertação 106

Crómio-51) ou a redução metabólica de corantes fluorescentes tais como azul alamar pode permitir o crescimento celular, ativação da proliferação ou ativação a ser monitorizada. É usado o ensaio de citotoxicidade com base em EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA) . Em alternativa, células alvo mortas ou danificadas podem ser monitorizadas medindo a libertação de uma ou mais proteínas intracelulares naturais, por exemplo lactato desidrogenase. A ativação transcricional pode também servir como um método para ensaiar a função em ensaios com base celular. Neste caso, a resposta pode ser monitorizada ensaiando os genes ou proteínas naturais que podem ser regulados para cima ou regulados para baixo, por exemplo a libertação de certas interleucinas pode ser medida, ou em alternativa a leitura pode ser através de luciferase ou construção de repórter GFP. Ensaios à base de células podem também envolver as mudanças de mudanças morfológicas de células como resposta à presença de um anticorpo. Tipos de células para tais ensaios podem ser procarióticas ou eucarióticas, e pode ser empregue uma diversidade de linhas de células que são conhecidas na técnica. Em alternativa, triagens com base celular são realizadas usando células que foram transformadas ou transfetadas com ácidos nucleicos que codificam os anticorpos.

Os ensaios in vitro incluem mas não são limitados a ensaios de ligação, CMCA, CDC, fagocitose, citotoxicidade, proliferação, apoptose, necrose, paragem do ciclo celular, libertação peróxido/ozono, quimiotaxia de células efetoras, inibição desses ensaios por redução da função efetora dos anticorpos; intervalos de atividades como >100x melhoramento ou >100x redução, misturas de ativação do recetor e os resultados do ensaio que são esperados desses perfis de recetor. 107

Experimentação in vivo

As propriedades biológicas dos anticorpos da presente invenção podem ser caracterizadas na célula, tecido, e experiência de organismo completo. Como é conhecido na técnica, os fármacos são muitas vezes testados em animais, incluindo mas não limitado a ratinho, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos, e macacos, com vista a medir a eficácia do fármaco para tratamento contra uma doença ou modelo de doença, ou medir as farmacocinéticas, toxicidade, e outras propriedades do fármaco. Os referidos animais podem ser referidos como modelos de doença. Em relação aos anticorpos da presente invenção, surge um desafio particular quando se usam modelos animais para avaliar o potencial para eficácia em humano de polipéptidos candidatos- isto é devido, pelo menos em parte, ao facto dos anticorpos que tem um efeito especifico sobre a afinidade para um recetor humano Fc podem não ter um efeito de afinidade semelhante ao recetor de animais ortólogos. Estes problemas podem ser agravados pelas ambiguidades inevitáveis associadas com a atribuição correta de ortólogos verdadeiros (Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468), e o facto que alguns ortólogos simplesmente não existem no animal (por exemplo os humanos possuem um FcYRIIa enquanto que o ratinho não) . As terapêuticas são frequentemente testadas em ratinho, incluindo mas não limitado a ratinho nú, ratinho SCID, ratinho xeno enxertado, e ratinho transgénico (incluindo noquins e nocautes). Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que se destina a uma terapêutica antineoplásica, pode ser testada num modelo de cancro e ratinho, por exemplo um ratinho xeno enxertado. Neste método, um tumor ou linha de células tumoral é enxertado em ou injetado num ratinho, e subsequentemente o ratinho é tratado com a terapêutica para determinar a capacidade do anticorpo para reduzir ou inibir o crescimento tumoral e as metástases. 108

Uma abordagem alternativa é o uso de um modelo de murino SCID no qual os ratinhos imunodeficientes são injetados com Linfócitos do Sangue Periférico (PBLs) humanos, conferindo um sistema imunitário semifuncional e humano - com uma matriz apropriada de FcRs humanos - ao ratinho que foi subsequentemente injetado com anticorpos ou polipéptidos Fc que visa as células tumorais humanas injetadas. Num tal modelo, os polipéptidos Fc que visam o desejado antigénio (tal como her2/neu em células cancerígenas de ovário SkOV3) interagem com PBLs humanos dentro do ratinho para envolver funções efetoras tumoricidas. Tal experimentação pode fornecer dados significativos para determinação do potencial do referido anticorpo a ser usado como uma terapêutica. Quaisquer organismos, preferencialmente mamíferos, podem ser usados para teste. Por exemplo devido à sua semelhança genética com os humanos, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados, e portanto podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinéticas, ou outras propriedades dos anticorpos da presente invenção. Os testes de anticorpos da presente invenção em humanos são, em última análise, necessários para aprovação dos medicamentos, e, assim, obviamente estas experiências estão contempladas. Portanto os anticorpos da presente invenção podem ser testados em humanos para determinar a sua eficácia terapêutica, toxicidade, farmacocinéticas, e/ou outras propriedades clinicas.

Os anticorpos da presente invenção podem conferir desempenho superior nas terapêuticas contendo Fc em modelos animais ou em humanos. Os perfis de ligação ao recetor desses anticorpos, como descrito nesta especificação, podem, por exemplo, ser selecionados para aumentar a potência de fármacos citotóxicos ou para visar funções efetoras ou células efetoras especificas para melhorar a seletividade da ação dos fármacos. Mais ainda, perfis de 109 ligação a recetor podem ser selecionados que podem reduzir algumas ou todas as funções efetoras reduzindo assim os efeitos secundários ou a toxicidade do tal fármaco contendo Fc. Por exemplo, um anticorpo com ligação reduzida a FcYRIIIa, FcyRI e FcYRIIa pode ser selecionado para eliminar a maioria da função efetora mediada por célula, ou um anticorpo com reduzida ligação a Clq pode ser selecionado para limitar as funções efetoras mediadas por complemento. Em alguns contextos, tais funções efetoras são conhecidas terem potenciais efeitos tóxicos, portanto eliminando-os pode aumentar a segurança do fármaco carregando Fc e essa segurança aumentada pode ser caracterizada em modelos animais. Em certos contextos, essas funções efetoras são conhecidas por mediarem a desejada atividade terapêutica, assim aumentando-a podem aumentar a atividade ou a potência do fármaco carregando Fc e essa atividade ou potência melhorada pode ser caracterizada em modelos animais.

Os anticorpos otimizados podem ser testados numa diversidade de modelos tumorais ortotópicos. Estes modelos animais clinicamente relevantes são importantes no estudo de patofisiologia e terapia de cancros agressivos como o cancro pancreático, da próstata e da mama. Ratinhos privados de imunidade incluindo, mas não limitado a ratinhos nús atimicos ou SCID são frequentemente usados na classificação de disseminação do tumor local e sistémica do local de injeção intraórgão (por exemplo pâncreas, próstata ou glândula mamária) de células tumorais humanas ou fragmentos de doentes dadores.

Os anticorpos da presente invenção podem ser avaliados quanto à eficácia em modelos animais clinicamente relevantes de várias doenças humanas. Em muitos casos, 110 modelos relevantes incluem vários animais transgénicos para antigénios específicos de tumores.

Modelos transgénicos relevantes tais como aqueles que expressam recetores Fc humanos (por exemplo, CD16 incluindo a cadeia gama, FcyRI, Rlla/b, e outros) devem ser usados para avaliar os anticorpos de teste e fusões Fc quanto à sua eficácia. A avaliação dos anticorpos por introdução de genes humanos que medeiam a função efetora direta ou indiretamente em ratinho ou outros roedores que podem viabilizar estudos fisiológicos de eficácia na toxicidade tumoral ou outras doenças tais como distúrbios auto-imunes e RA. Os recetores Fc humanos tais como FcYRIIIa podem possuir polimorfismos como os da posição 158 V ou F que podem viabilizar ainda mais a introdução de específicos e combinações polimorfismos humanos nos roedores. Os vários estudos envolvendo FcRs específicos de polimorfismo não são, no entanto, limitados a esta secção e englobam todas as discussões e aplicações de FcRs em geral como especificado ao longo destes anticorpos de aplicação da presente invenção pode conferir atividade superior em fármacos contendo Fc nesses modelos transgénicos, em variantes específicas com perfis de ligação otimizado para atividade mediada por FcYRIIIa humana pode mostrar atividade superior em ratinhos CD 16 transgénicos. Melhorias similares da eficácia, em ratinhos transgénicos para os outros recetores Fc humanos, por exemplo FcYRIIa, FcyRI, etc., podem ser observadas para os anticorpos com os perfis de ligação otimizados para os recetores respetivos. Ratinhos transgénicos para múltiplos recetores humanos deveriam mostrar atividade melhorada para anticorpos com perfis de ligação otimizados para os correspondentes recetores múltiplos, por exemplo como mostrado na Figura 5. 111

Devido às dificuldades e ambiguidades associadas com o uso de modelos animais para caracterizar a eficácia potencial dos anticorpos terapêuticos candidatos num doente humano, alguns polipéptidos variantes da presente invenção podem encontrar utilidade como procuradores para avaliar a eficácia potencial em humanos. Tais moléculas procuradoras devem preferencialmente mimetizar - no sistema animal - a biologia FcR e/ou de complemento do correspondente anticorpo humano candidato. Este mimetismo é mais provável que seja manifestado pelas afinidades de associação relativas entra anticorpos e animais específicos vs. recetores humanos. Por exemplo, se se está a usar um modelo de ratinho para avaliar a potencial eficácia em humanos de um anticorpo que tem afinidade aumentada para FcYRIIIa humano, uma variante de procuração apropriada deverá ter afinidade aumentada para FcyRIII-2 de ratinho (CD16-2 de ratinho) . Em alternativa se se está a usar um modelo de ratinho para avaliar a potencial eficácia em humano de um anticorpo que tem afinidade reduzida para o FcYRIIb inibitório humano, uma variante de procuração apropriada deverão ter afinidade reduzida para FcyRII de ratinho. Também deve ser notado que os anticorpos procuradores podem ser criados no contexto de um anticorpo humano, um anticorpo animal, ou ambos.

Os testes de anticorpos podem incluir estudos de eficácia em primatas (por exemplo modelo de macaco cinomólogo) parar facilitar a avaliação da depleção de células alvo específicas abrigando o antigénio alvo. Outros modelos de primatas incluem mas não são limitados aos de macacos rhésus e polipéptidos Fc em estudos terapêuticos de auto-imune, transplante e cancro. São realizados estudos de toxicidade para determinar os efeitos relacionados de anticorpo ou fusão Fc que não podem 112 ser avaliados em perfis de farmacologia padrão ou ocorrem somente após administração repetida do agente. A maioria dos testes de toxicidade são realizados em duas espécies -um roedor e um não roedor - para assegurar que quaisquer efeitos adversos não esperados não são desprezados antes que novas entidades terapêuticas sejam introduzidas no homem. Em geral, estes modelos podem medir uma diversidade de toxicidades incluindo genotoxicidade, toxicidade crónica, imunogenicidade, toxicidade reprodutiva/de desenvolvimento e carcinogenicidade. Incluidos nos parâmetros acima mencionados estão medidas padrão de consumo de alimentos, peso corporal, formação de anticorpo, quimica clinica, e exame macro e microscópico de órgãos/tecidos padrão (por exemplo cardiotoxicidade). Outros parâmetros de medição são o traumatismo no local de injeção e a medição dos anticorpos neutralizantes, se algum. Tradicionalmente, as terapêuticas de anticorpo monoclonais, nuas ou conjugadas são avaliadas quanto à reatividade cruzada com os tecidos normais, produção de imunogenicidade/anticorpo, toxicidade de conjugado ou ligante e toxicidade "bystander" de espécies radiomarcadas. No entanto, tais estudos podem ter de ser individualizados para responder às preocupações específicas e seguindo o conjunto de orientações por ICH S6 (Estudos de segurança para produtos biotecnológicos, também mencionado anteriormente). Como tal, os princípios gerais dos produtos são suficientemente bem caracterizados e relativamente aos quais impurezas/contaminantes foram removidos, que o material de teste é comparável ao longo do desenvolvimento, e cumprimento das GLP.

As farmacocinéticas (PK) dos anticorpos da invenção podem ser estudadas numa diversidade de sistemas animais, com o mais relevante sendo o de primatas não humanos tais como os cinomolgos, macacos rhésus. Administrações i.v./s.c. únicas 113 ou repetidas de mais de uma gama de dosagem de 6000-vezes (0,05-300 mg/kg) podem ser avaliadas sobre a meia vida (dias a semanas) usando concentração plasmática e depuração assim como pode ser medido o volume de distribuição a um estado de equilíbrio e nível de absorbância sistémica. Exemplos desses parâmetros de medida incluem geralmente a concentração plasmática máxima observada (Cmax), o tempo para atingir Cmax (Tmax), e a área sob a curva de concentração plasmática-tempo de tempo de 0 até ao infinito [AUC(0-inf] e eliminação da semivida aparente (Tl/2). Outros parâmetros medidos pode incluir análise comportamental dos dados de concentração-tempo obtidos a seguir à administração e biodisponibilidade de i.v.. Exemplos de estudos farmacológicos/toxicológicos usando cinomologos foram estabelecidos para Rituxan e Zevalina em que os anticorpos monoclonais para CD20 são de reação cruzada. A biodistribuição, dosimetria (para anticorpos radiomarcados) , e estudos de PK podem também ser feitos em modelos de roedores. Esses estudos de avaliação da tolerância em todas as doses administradas, toxicidade para os tecidos localizados, localização preferencial para modelos animais de roedores xenoenxertados, depleção de células alvo (por exemplo células CD20 positivas).

Os anticorpos da presente invenção podem conferir farmacocinéticas superiores nas terapêuticas contendo Fc em sistemas animais ou em humanos. Por exemplo, a ligação aumentada a FcRn pode aumentar a meia vida e a exposição ao fármaco contendo Fc. Em alternativa, a ligação diminuída a FcRn pode diminuir a meia vida e a exposição ao fármaco contendo Fc nos casos em que a exposição reduzida é favorável tal como quando esse fármaco tem efeitos secundários. 114 É conhecido na técnica que o conjunto de recetores Fc é expresso diferencialmente em vários tipos de células imunitárias, assim como em diferentes tecidos. Distribuição diferencial nos tecidos de recetores Fc pode em última análise ter um impacto nas propriedades farmacodinâmicas (PD) e farmacocinéticas (PK) de anticorpos da presente invenção. Porque os anticorpos da apresentação têm afinidades variáveis com o conjunto de recetores Fc, um rastreio suplementar dos polipéptidos quanto às propriedades de PD e/ou PK pode ser extremamente útil para definir o equilíbrio ótimo de PD, PK, e a eficácia terapêutica conferida por cada polipéptido candidate.

Estudos de farmacodinâmica podem incluir, mas não são limitados a, visar células tumorais específicas ou bloquear os mecanismos de sinalização, medir a depleção do antigénio alvo expressando células ou sinais, etc. Os anticorpos da presente invenção podem visar populações de células efetoras especificas e deste modo direcionar fármacos contendo Fc para recrutar certas atividades para melhorar a potência ou para aumentar a penetração num compartimento fisiológico particularmente favorável. Por exemplo, a atividade de neutrófilos e localização podem ser visados por um anticorpo que preferencialmente visa FcYRIIIb. Tais efeitos farmacodinâmicos podem ser demonstrados em modelos animais ou em humanos.

Uso clínico

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para vários fins terapêuticos como definido nas reivindicações. Tal como será apreciado por aqueles na técnica, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para quaisquer fins terapêuticos que usem anticorpos e os afins. Numa forma de realização preferida, os anticorpos podem ser 115 administrados a um doente para tratar doenças incluindo mas não limitadas a cancro, doenças autoimunes e inflamatórias, e doenças infeciosas.

Um "doente" para os fins da presente invenção inclui tanto humanos como outros animais, preferencialmente mamíferos e mais preferencialmente humanos. Portanto os anticorpos da presente invenção têm aplicações nas terapias humanas e veterinária. 0 termo "tratamento," ou "tratar" no contexto da presente invenção entende-se para incluir o tratamento terapêutico, assim como profilático, ou medidas de supressão de uma doença ou distúrbio. Assim, por exemplo, a administração bem sucedida de um anticorpo antes do início da doença resulta no tratamento da doença. Como outro exemplo, a administração bem sucedida de um anticorpo otimizado após manifestação clínica da doença para combater os sintomas da doença compreende o tratamento da doença. "Tratamento" e "tratar" incluem também a administração de um anticorpo otimizado após o aparecimento da doença com vista a erradicar a doença. A administração bem sucedida de um agente após o início e após os sintomas clínicos serem desenvolvidos, com possível redução dos sintomas clínicos e talvez a melhoria da doença, compreende o tratamento da doença. Aqueles "com necessidade de tratamento" incluem mamíferos já com a doença ou distúrbio, assim como aqueles com tendência para ter a doença ou distúrbio, incluindo aqueles em que a doença ou distúrbio é para ser prevenido.

Um anticorpo da presente invenção pode ser administrado a um doente com uma doença envolvendo expressão inapropriada de uma proteína ou outra molécula. Isto significa a inclusão de doenças e distúrbios caracterizados por proteínas aberrantes, devido por exemplo a alterações na quantidade da proteína presente, da localização da proteína, da modificação postranslacional, do estado 116 conformacional, a da presença de um mutante ou proteína do patogénio, etc. De modo semelhante, a doença ou distúrbio pode ser caracterizado pelas moléculas de alterações incluindo mas não limitado a polissacáridos e gangliósidos. Uma superabundância pode ser devida a qualquer causa, incluindo mas não limitado a sobre expressão a nível molecular, aparecimento prolongado ou acumulado no sítio de ação, ou atividade aumentada da proteína em relação ao normal. Incluídos nesta definição estão doenças e distúrbios caracterizados por uma redução da proteína. Esta redução pode ser devida a qualquer causa, incluindo mas não limitado a expressão reduzida a nível molecular, aparecimento encurtado ou reduzido no sítio de ação, formas mutantes da proteína, ou atividade reduzida da proteína em relação ao normal. Uma tal superabundância ou redução da proteína pode ser medida em relação à expressão normal, aparecimento, ou atividade da proteína, e a medida referida pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e/ou testagem clínica dos anticorpos da presente invenção.

Por "cancro" e "canceroso" aqui refere-se a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não são limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo liposarcoma), tumores neuroendócrinos, mesotelioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma, e leucemia ou malignidades linfóides.

Exemplos mais específicos de tais cancros incluem malignidades hematológicas, tais como linfomas não Hodgkin (LNH) . Os cancros LNH incluem mas não são limitados a Linfoma de Burkitt (LB) , linfoma linfocítico de pequenas células/leucemia linfocítica crónica (SLL/LLC), linfoma de células do manto (LCM), linfoma folicular (LF), linfoma da 117 células B grande difusa (LCGD), linfoma de zona marginal (LZM), leucemia células pilosas (LCP) e leucemia linfocitica (LPL), linfoma das células B da zona marginal extranodal do tecido linfóide associado a mucosa (MALT) , linfoma das células B da zona marginal nodal, linfoma de células grandes do mediastino, linfoma de células grande intravascular, linfoma de efusão primária, leucemia/linforna linfoblástica de B precursoras, linfoma das células T e NK precursoras (linfoma linfoblástico de T precursora, linfoma blástico das células NK), tumores das células T e NK maduras, incluindo linfoma e leucemia da célula T periférica (PTL), leucemia da célula T adulta/ linfomas das célula T e leucemia linfocitica granular grande, leucemia linfocitica crónica da célula T/leucemia prolinfocitica, leucemia linfocitica granular da célula T grande, leucemia agressiva da célula NK, linfoma extranodal de células T-/NK, linfoma da célula T tipo enteropatia, linfoma hepatosplénico da célula T, linfoma anaplástico da célula grande (ALCL), linfoma angiocétrico e angioimunoblástico da célula T, micose fungóide/síndroma de Sézary, e linfoma cutâneo da célula T (CTCL). Outros cancros que podem ser tratados pelos anticorpos da invenção incluem mas não são limitados a Linfoma de Hodgkin, tumores de células percursoras de linfócitos, incluindo leucemia/linforna linfoblástico aguda das células B (B-LLA), e leucemia/linforna linfoblástica aguda da célula T (T-LLA), timoma, histocitose celular de Langerhans, mieloma múltiplo, neoplasias mielóides tais como leucemias mielogénica aguda (AML), incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia promielocitica aguda, leucemia mielomonocitica aguda, e leucemias monociticas agudas, síndromas mielodisplásticos, e doenças mieloproliferativa crónicas (MDS), incluindo leucemia mielogénica crónica (LMC). Outros cancros que podem ser tratáveis pelos anticorpos da invenção incluem mas não são limitados a 118 tumores do sistema nervoso central tais como glioma, glioblastoma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma, e retinoblastoma; tumores sólidos da cabeça e pescoço (por exemplo cancro nasofaringeo, carcinoma das glândulas salivares, e cancro esofágico), pulmão (por exemplo cancro das pequenas células do pulmão, cancro não das pequenas células pulmão, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), sistema digestivo (por exemplo cancro do estômago ou gástrico incluindo cancro gastrointestinal, cancro do duto biliar ou do trato biliar, cancro do colon, cancro retal, cancro coloretal, e carcinoma anal) , sistema reprodutivo (por exemplo cancro testicular, penis, ou próstata, uterino, vaginal, vulvar, cervical, ovárico, e do endométrio), pele (por exemplo melanoma, carcinoma das células basal, cancro das células escamosas, queratose actinica), figado (por exemplo cancro do figado, carcinoma hepático, cancro hepatocelular, e hepatoma), ósseos (por exemplo osteoclastoma, e cancros ósseos osteoliticos), tecidos e órgãos adicionais (por exemplo cancro pancreático, cancro da bexiga, cancro do rim ou renal, cancro da tiróide, cancro da mama, cancro do peritoneu, e sarcoma de Kaposi), e tumores do sistema vascular (por exemplo angiosarcoma e hemagiopericitoma).

Indicações oncológicas preferidas que podem ser tratados pelos anticorpos anti-CD19 da invenção incluem mas não são limitadas a todos os linfomas não Hodgkin (LNH), especialmente LNH refratária/resistente, leucemia linfocitica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda das células B/linfoma (B-LLA), e linfoma de células do manto (LCM).

Resultados da autoimunidade de uma quebra da auto-tolerância envolvendo mecanismos imunitários humorais e/ou mediados por células. Entre as consequências da falha na 119 tolerância central e/ou periférica, são a sobrevivência e ativação de células B e células T auto reativas. Várias doenças autoimunes são definidas por ativação excessiva dos linfócitos B e/ou T. A ativação destas células requerem em cooperação, o acoplamento de antigénio e sinais co-estimuladores dos linfócitos de interação, depleção mediada por anticorpo, inibição, anti-proliferação, e/ou bloqueamento das células B são abordagens terapêuticas para o tratamento de doença autoimune.

Por "doenças autoimunes" aqui incluem rejeição do enxerto alogénico em ilhota, alopecia areata, espondilite anquilosante, sindrome antifosfolipidico, doença autoimune de Addison, autoanticorpos antineutrófilos citoplasmáticos (ANCA), doenças autoimunes da glândula adrenal, anemia hemolitica autoimune, hepatite autoimmune, miocardite autoimune, neutropenia autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune, urticária auto-imune, doença de Behcet, penfigóide bolhoso, cardiomiopatias, Síndroma de Castleman, spruce-dermatite celíaca, síndroma disfunção imunológica de fadiga crónica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndroma de Churg-Strauss, penfigóide cicatricial, síndroma de CREST, doença aglutinina fria, doença de Crohn, dermatomiosite, lúpus discóide, crioglobulinemia mista essencial, deficiência de fator VIII, fibroialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Grave, Guillain-Barre, síndroma de Goodpasture, doença de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), tiroidite de Hashimoto, hemofilia A, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénia idiopática (PTI), neuropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenia imunomediada, artrite juvenil, doença de Kawasaki, líquen plantus, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla (MS), diabetes mellitus tipo 1, miastenia grave, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, 120 poliarterite nodosa, policrondrite, síndromas poliglandular, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamaglobinulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenómeno de Reynauld, síndrome de Reiter, artrite reumatóide (RA) , sarcoidose, escleroderma, síndrome de Sjogren, rejeição de transplante de órgão sólido, síndroma de pessoa rígida, sistema de lúpus eritematóide (SLE), arterite de Takayasu, arterite temporal/ arterite de células gigantes, púrpura trombocitopenia trombótica, colite ulcerosa, uveíte, vasculites tais como vasculite dermatite herpetiforme, vitiligo, e granulomatose de Wegener.

Indicações autoimunes que podem ser tratadas pelos anticorpos anti-CD19 da invenção incluem mas não são limitados a artrite reumatóide (RA), sistema de lúpus eritematóide (SLE ou lúpus), esclerose múltipla, Síndrome de Sjogren, e púrpura trombocitopénia idiopática (PTI).

Por "distúrbios inflamatórios" aqui incluem-se síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), artrite sética aguda, artrite adjuvante, artrite ideopática juvenil, encefalomielite alérgica, rinite alérgica, vasculite alérgica, alergia, asma, aterosclerose, inflamação crónica devida a infeções crónicas virais ou bacterianas, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), doença da artéria coronária, encefalite, doença inflamatória intestinal, osteólise inflamatória, inflamação associada a reações de hipersensibilidade aguda e retardada, inflamação associada com tumores, lesão do nervo periférico ou doenças desmielinizantes, inflamação associada com trauma tecidual tais como queimaduras e isquemia, inflamação devida a meningite, síndrome de lesão de órgãos múltiplos, fibrose pulmonar, sepse e choque sético, síndroma de Stevens- 121

Johnson, artropia indiferenciada, e espondiloartropatia indiferenciada.

Por "doenças infeciosas" aqui incluem-se doenças causadas por patogénios tais como virus, bactérias, fungos, protozoários, e parasitas. As doenças infeciosas podem ser causadas por virus incluindo adenovirus, citomegalovirus, dengue, Epstein-Barr, hanta, hepatite A, hepatite B, hepatite C, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, virus da imnodeficiência humano, (HIV), papiloma virus humano (HPV), gripe, sarampo, papeira, papova virus, polio, virus sincicial respiratório, peste bovina, rinovirus, rotavirus, rubéola, virus SARS, variola, meningite virica, e afins. As doenças infeciosas podem também ser causadas por bactérias incluindo Bacillus antracis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Diptheria, E. coli, Legionella, Helicobacter pylori, Mycobacterium rickettsia, Mycoplasma neisseria, Pertussis, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumonia, Streptococcus, Staphylococcus, Vibria cholerae, Yersinia pestis, e afins. As doenças infeciosas poem também ser causadas por fungos tais como Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei, e afins. As doenças infeciosas podem também ser causadas por protozoários e parasitas tais como clamidia, kokzidioa, leishmania, malaria, rickettsia, tripanosomas, e afins.

Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para prevenir ou tratar condições adicionais incluindo mas não limitado a condições cardíacas tais como insuficiência cardiaca congestiva (CHF), miocardite e outras condições de miocardio; doenças da pele tais como rosácea, acne, e eczema; condições ósseas e dentárias tais 122 como perda de osso, osteoporose, doença de Paget, histiocitose de células de Langerhans, doença periodontal, osteopénia por desuso, osteomalacia, displasia fibrosa monostótica, displasia fibrosa poliostótica, metástase óssea, tratamento da dor óssea, hipercalcemia maligna humoral, reconstrução periodontal, lesão da medula espinhal, e fraturas ósseas; condições metabólicas tais como doença de Gaucher; condições endocrinas tais como síndroma de Cushing; e condições neurológicas.

Um certo número de recetores que podem interagir com os anticorpos da presente invenção, são polimórficos na população humana. Para um dado doente ou população de doentes, a eficácia dos anticorpos da presente invenção pode ser afetada pela presença ou ausência de polimorfismo especifico nas proteínas. Por exemplo, FcyRIIIA é polimórfico na posição 158, o qual é comummente ou V (alta afinidade) ou F (baixa afinidade). Foi observado que os doentes com o genotipo V/V homozigótico têm uma melhor resposta clínica ao tratamento com o anticorpo anti-CD20 Rituxan® (rituximabe), provavelmente porque estes doentes fazem uma resposta NK mais forte (DallOzzo et al. (2004) Câncer Res. 64:4664-9). Polimorfismos adicionais incluem mas não são limitados a FcyRIIA R131 ou H131, e esses polimorfismos são conhecidos por aumentarem ou diminuírem a ligação Fc e subsequente a atividade biológica, dependendo do polimorfismo dos anticorpos da presente invenção podem ligar preferencialmente a uma forma polimórfica particular de um recetor, por exemplo FcyRIIIA 158 V, ou ligam-se com uma afinidade equivalente a todos os polimorfismos na posição particular no recetor, por exemplo ambos os polimorfismos 158V e 158F de FcyRIIIA. Numa forma de realização preferida, os anticorpos da presente invenção que podem ter ligação equivalente a polimorfismos podem ser usados num anticorpo para eliminar a eficácia diferencial 123 observada nos doentes com diferentes polimorfismos. Uma tal propriedade pode dar uma maior coerência na resposta terapêutica e reduzir as populações de pacientes que não respondem. Essa variante Fc com idêntica ligação a polimorfismos recetores pode ter atividade biológica aumentada, tais como CMCA, CDC ou meia vida de circulação, ou em alternativa atividade diminuída, através da modulação da ligação aos recetores Fc relevantes. Os anticorpos da presente invenção podem ligar-se com maior ou menor afinidade a um dos polimorfismos de um recetor, ou acentuando a diferença existente ligando ou invertendo a diferença. Uma tal propriedade pode permitir a criação de terapêuticas especialmente adaptadas para a eficácia com uma população doente possuindo tal polimorfismo. Por exemplo, uma população doente possuindo um polimorfismo com um maior afinidade para um recetor inibitório tal como FcyRIIB pode receber um fármaco contendo um anticorpo com ligação reduzida para tal forma polimórfica do recetor, criando um fármaco com maior eficácia.

Os doentes podem ser triados para um ou mais polimorfismos com vista a predizer a eficácia dos anticorpos da presente invenção. Esta informação pode ser usada, por exemplo, para selecionar doentes para incluir ou excluir de ensaios clínicos ou, pós-aprovação, para fornecer orientações aos médicos e doentes visando dosagens apropriadas e opções de tratamento. Por exemplo, em doentes que são homozigóticos ou heterozigóticos para fármacos de anticorpo FcyRIIIA 158F tal como o anti-CD20 mAb, Rituximabe são minimamente eficazes (Carton 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21: 3940-3947); tais doentes podem mostrar uma melhor resposta clínica aos anticorpos da presente invenção. Os doentes podem ser selecionados para inclusão em ensaios clínicos para um anticorpo da presente invenção se o seu genótipo indica que eles são susceptíveis de 124 responder significativamente melhor a um anticorpo da presente invenção, em comparação com um ou mais terapêuticas de anticorpos atualmente utilizados. Dosagens apropriadas e regimes de tratamento são determinados usando essa informação do genótipo. Os doentes são selecionados para inclusão num ensaio clinico ou para a recepção de terapia pós-aprovação com base no seu genotipo de polimorfismo, onde tal terapia contém um anticorpo manipulado para ser especificamente eficaz para essa população, ou em alternativa onde tal terapia contém um anticorpo que não mostra atividade diferencial para as formas diferentes do polimorfismo. São aqui divulgados testes de diagnóstico para identificar doentes que são igualmente para mostrar uma resposta clinica favorável para um anticorpo da presente invenção, ou que são igualmente para exibir uma resposta significativamente melhor quando tratados com um anticorpo da presente invenção versus uma ou mais terapêuticas de anticorpo correntemente usadas. Qualquer um de uma série de métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar os polimorfismos de FcyR em humanos.

Além disso, os testes de prognóstico podem ser realizados em amostras clinicas tais como sangue e amostras de tecido. Esses testes podem ser ensaiados para a atividade da função efetora, incluindo mas não limitado a CMCA, CDC, fagocitose, e opsonização, ou para matar, independentemente do mecanismo, de células cancerosas ou patogénicas de outro modo.

Os ensaios CMCA, tal como os descritos previamente, podem ser usados para prever, para um doente especifico, a eficácia de um dado anticorpo da presente invenção. Essa informação pode ser usada para identificar doentes para 125 inclusão ou exclusão nos ensaios clínicos, ou para consubstanciar decisões sobre dosagens apropriadas e regimes de tratamento. Essa informação pode também ser usada para selecionar um fármaco que contém um anticorpo particular que mostra superior atividade nesse ensaio.

Formulação São comtempladas composições farmacêuticas em que são formulados um anticorpo da presente invenção como definido nas reivindicações e um transportador farmaceuticamente aceitável. As formulações dos anticorpos da presente invenção podem ser preparadas para armazenamento por mistura do referido anticorpo com o desejado grau de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para recipientes nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, acetato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilo amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool orbenzil butílico; alquil parabenos tais como as metil ou propil parabenos; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como 126 EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; adoçantes e outros agentes aromatizantes; enchimentos tais como celulose microcristalina, lactose, milho e outros amidos; agentes ligantes; aditivos; agentes de coloração; formadores de sais contraiões tais como sódio; complexos de metal (por exemplo complexos de Zn-proteina); e/ou tensoativos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica que compreende o anticorpo da presente invenção pode estar numa forma solúvel em água, tal como estar presente como sais farmaceuticamente aceitáveis, os quais se entende incluam tanto sais de adição de ácidos e bases. "Sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis" referem-se aos sais que retêm a eficiência biológica de bases livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e afins, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanesulfónico, ácido etanesulfónico, ácido p-toluenesulfónico, ácido salicílico e afins. "Sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis" incluem os derivados de bases inorgânicas tais como sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e afins. Particularmente preferidos são os sais de amónio, potássio, sódio, cálcio, e magnésio. Sais derivados de bases orgânicas não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias, e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iónica, tais 127 como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, e etanolamina. As formulações a usar para administração in vivo são preferencialmente estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos.

Os anticorpos aqui divulgados podem também ser formulados como imunoliposomas. Um liposoma é uma vesicula pequena compreendendo vários tipos de lipidos, fosfolipidos e/ou tensoativos que são úteis na aplicação de um agente terapêutico a um mamifero. Os liposomas que contêm o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descrito em Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sei USA, 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sei USA, 77:4030; US 4,485,045; US 4,544,545; e PCT WO 97/38731. Os liposomas com tempo de circulação melhorado são divulgados na US 5,013,556. Os componentes do liposoma são comummente dispostos numa formação em bicamada, similar à disposição das membranas biológicas. Liposomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição lipidica compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina PEG-derivatizada (PEG-PE). Os liposomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir liposomas com o diâmetro desejado. Um agente quimioterapêutico ou outro agente terapeuticamente ativo está opcionalmente contido no liposoma (Gabizon et al., 1989, J National Câncer Inst 81:1484) . O anticorpo e outros agentes terapeuticamente ativos podem também ser acondicionados em microcápsulas preparadas por métodos incluindo mas não limitados a técnicas de coacervação, polimerização interfacial (por exemplo usando 128 hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina, ou microcápsulas de poli-(metilmetacilato)), sistemas de administração de fármaco coloidal (por exemplo, liposomas, microsferas de albumina, microemulsões, nano-particulas e nanocápsulas), e macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed., 1980. Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polimero sólido hidrofóbico, as quais matrizes são na forma de artigos moldados, por exemplo filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) , ou poli(vinilálcool)), polilactidos (US 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato, não degradável etileno acetato de vinilo, copolimeros de ácido láctico degradável-ácido glicólico tais como o Lupron Depot® (os quais são microsferas injetáveis compostas de copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico, e

ProLease® (disponível comercialmente da Alkermes), o qual é um sistema de aplicação à base de microsferas composto da desejada molécula bioativa incorporada numa matriz de poli-DL-láctido-co-glicolido (PLG).

Administração

intraEP A administração de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da presente invenção, pode ser feita numa diversidade de modos, incluindo, mas não limitado a oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraoticamente, transdermicamente, topicamente (por exemplo, géis, pomadas, loções, cremes, etc.), peritonealmente intraEP, intramuscularmente, 129 intrapulmonar, vaginalmente, parentericamente, retalmente, ou intraocularmente. Em alguns casos, por exemplo para o tratamento de feridas, inflamação, etc., o anticorpo pode ser diretamente aplicado como uma solução ou spray. Como é conhecido na técnica, a composição farmacêutica pode ser formulada em conformidade, dependendo da forma de introdução. A administração subcutânea pode ser preferível em algumas circunstâncias porque o doente pode auto administrar a composição farmacêutica. Muitas terapêuticas de proteína não são suficientemente potentes para permitir a formulação de uma dose terapeuticamente eficaz no volume máximo aceitável para administração subcutânea. Este problema pode ser tratado em parte pelo uso de formulações proteicas compreendendo arginina-LCP, histidina, e polisorbato (ver WO 04091658). Os anticorpos da presente invenção podem ser mais adequados para administração subcutânea devido a, por exemplo, potência aumentada, meia vida sérica melhorada, ou solubilidade aumentada.

Como é conhecido na técnica, as terapêuticas de proteína são muitas vezes administradas por infusão IV ou bólus. Os anticorpos da presente invenção podem também ser aplicados usando esse método. Por exemplo, a administração venosa pode ser por infusão intravenosa com 0,9% de cloreto de sódio como veículo de infusão. A administração pulmonar pode ser conseguida utilizando um inalador ou nebulizador e a formulação compreendendo um agente de formação de aerossóis. Por exemplo, pode ser usada tecnologia para inalação AERx® comercialmente disponível da Aradigm, ou sistema de administração pulmonar Inhance™ comercialmente disponível da Nektar Therapeutics. Os anticorpos da presente invenção podem ser mais adaptados 130 a administração intrapulmonar. O FcRn está presente no pulmão, e pode promover o transporte do pulmão para a corrente sanguínea (por exemplo Syntonix WO 04004798, Bitonti et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sei. 101:9763-8). Consequentemente, os anticorpos que ligam FcRn mais eficientemente no pulmão ou que são libertados mais eficientemente na circulação sanguínea podem ter biodisponibilidade melhorada a seguir à administração intrapulmonar. Os anticorpos da presente invenção podem também ser mais favoráveis para administração intrapulmonar devido a, por exemplo, solubilidade melhorada ou ponto isoelétrico alterado.

Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser mais favoráveis para aplicação oral devido a, por exemplo, estabilidade melhorada a pH gástrico e resistência à proteólise aumentada. Além disso, FcRn parece ser expresso no epitélio intestinal de adultos (Dickinson et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:903-11), portanto anticorpos com perfis de interação FcRn melhorados podem mostrar biodisponibilidade aumentada a seguir a administração oral. O transporte mediado por FcRn de anticorpos pode também ocorrer noutras membranas mucosas tais como as dos tratos gastrointestinal, respiratório, e genital (Yoshida et al. (2004) Immunity 20:769-83).

Além disso, uma quantidade de sistemas de administração são conhecidos na técnica e podem ser usados para administrar os anticorpos da presente invenção. Exemplos incluem, mas não são limitados a, encapsulação em liposomas, micropartículas, microesferas (por exemplo microesferas PLA/PGA), e afins. Em alternativa, pode ser usado um implante de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas ou fibras. Sistemas de libertação sustentada podem compreender um material ou matriz 131 polimérico tal como poliésteres, hidrogéis, poli(álcool vinílico), polilactidos, copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etilenovinilo, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tais como os da Lupron Depot®, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. É também possível administrar um ácido nucleico que codifica o anticorpo da corrente invenção, por exemplo por infeção retroviral, injeção direta, ou revestimento com lípidos, recetores de células de superfície, ou outros agentes de transfeção. Em todos os casos, sistemas de libertação controlada podem ser usados para libertar o anticorpo no ou perto do local de ação desejado.

Dosagem

As quantidades de dosagem e frequências de administração são selecionadas para serem terapeuticamente ou profilaticamente eficazes. Como é conhecido na técnica, os ajustes à degradação da proteína, libertação sistémica versus libertação localizada, e taxa da síntese de nova protéase, assim como a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, interação fármaco e a gravidade da condição pode ser necessária, e será determinável com a experimentação de rotina pelos especialistas na técnica. A concentração do anticorpo terapeuticamente ativo na formulação pode variar desde cerca de 0,1 até 100 % em peso. Numa forma de realização preferida, a concentração do anticorpo é numa gama de 0, 003 to 1,0 molar. Com vista a tratar o doente, pode ser administrada uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo da presente invenção. Por "dose terapeuticamente eficaz" aqui entende-se uma dose que produz os efeitos para os quais é administrado. A dose exata irá depender do objetivo do tratamento, e será 132 ajustável por um especialista na técnica usando técnicas conhecidas. As dosagens podem variar desde 0,0001 até 100 mg/kg de peso corporal ou maior, por exemplo 0,1, 1, 10, ou 50 mg/kg de peso corporal, com 1 até lOmg/kg sendo preferido.

Pode ser usada apenas uma única dose do anticorpo. Podem ser administradas doses múltiplas do anticorpo. O tempo decorrido entre administrações pode ser menos que 1 hora, cerca de 1 hora, cerca de 1-2 horas, cerca de 2-3 horas, cerca de 3-4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, cerca de 2-4 dias, cerca de 4-6 dias, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, ou mais que 2 semanas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados em regimes de dose metronómica, quer por infusão continua ou administração frequente em periodos de repouso prolongado. Tal administração metronómica pode envolver dosagem a intervalos constantes sem periodos de repouso. Tipicamente esses regimes englobar dose baixa crónica ou infusão continua por um periodo de tempo prolongado, por exemplo 1-2 dias, 1-2 semanas, 1-2 meses, ou até 6 meses ou mais. O uso de doses menores pode minimizar efeitos secundários e a necessidade de periodos de repouso.

[0203] O anticorpo da presente invenção e um ou mais de outros agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados ciclicamente ao doente. O ciclo terapêutico envolve a administração de um primeiro agente de uma só vez, um segundo agente a uma segundo tempo, opcionalmente agentes adicionais a tempos adicionais, opcionalmente um periodo de descanso, e depois repetir esta sequência de administração de um ou mais tempos. O número de ciclos é tipicamente desde 2 - 10. O ciclo terapêutico pode reduzir 133 o desenvolvimento de resistência a um ou mais agentes, pode minimizar os efeitos secundários, ou pode melhorar a eficácia de tratamento.

Terapias de combinação

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados concomitantemente com um ou mais de outros regimes ou agentes terapêuticos. Regimes ou agentes terapêuticos adicionais podem ser usados para melhorar a eficácia ou a segurança do anticorpo. Também, os regimes ou agentes terapêuticos adicionais podem ser usados para tratar a mesma doença ou uma comorbidade em vez de alterar a ação do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção pode ser administrado ao doente juntamente com quimioterapia, terapia de radiação, ou a quimioterapia e a terapia de radiação. 0 anticorpo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos, incluindo mas não limitado a agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, citocinas, agentes inibidores de crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes antiangiogénicos, cardioprotetores, agentes imunoestimulantes, agentes imunosupressores, agentes que promovem a proliferação de células hematológicas, inibidores da angiogénese, inibidores da proteína tirosina quinase (PTK), anticorpos adicionais, FcYRIIb ou outros inibidores de recetor Fc, ou outros agentes terapêuticos.

Os termos "em combinação com" e "co-administração" não são limitados à administração dos agentes profiláticos ou terapêuticos exatamente ao mesmo tempo. Em vez disso, entende-se que o anticorpo da presente invenção e o outro agente ou agentes podem ser administrados numa sequência e no tempo do intervalo de modo que eles podem atuar em 134 conjunto para fornecer um benefício que é aumentado versus tratamento com apenas um ou outro anticorpo da presente invenção ou o outro agente ou agentes. É preferível que o anticorpo e o outro agente ou agentes atuam aditivamente, e é especialmente preferido que atuem sinergicamente. Essas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido. 0 prático clínico especialista pode determinar empiricamente, ou considerando as farmacocinéticas e modos de ação dos agentes, a dose ou doses apropriadas de cada agente terapêutico, assim como os timings e métodos de administração apropriados.

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados com uma ou mais moléculas adicionais compreendendo anticorpos ou Fc. Os anticorpos da presente invenção podem ser coadministrados com um ou mais outros anticorpos que têm eficácia no tratamento da mesma doença ou numa comorbilidade adicional; por exemplo podem ser administrados dois anticorpos que reconhecem dois antigénios que são sobreexpressados num dado tipo de cancro, ou dois antigénios que medeiam a patogénese de uma doença autoimune ou infeciosa.

Exemplos de anticorpos anti-cancro que podem ser coadministrados incluem, mas não são limitados a, anticorpos antígenos de superfície de células anti-17-ΙΑ tais como Panorex™ (edrecolomab); anticorpos anti-4-ΙΒΒ; anticorpos anti-4Dc; anticorpos anti-A33 tais como A33 e CDP-833; anticorpos anti-cx4pi integrina tais como natalizumab; anticorpos anti-a4p7 integrina tais como LDP-02; anticorpos anti-οΛ/βΙ integrina tais como F-200, M-200, e SJ-749; anticorpos anti-avp3 integrina tais como abciximab, CNTO-95, Mab-17E6, e Vitaxin™; anticorpos fator 5 (C5) anti-complemento tais como 5G1.1; anticorpos anti- 135 CA125 tais como OvaRex® (oregovomab); anticorpos anti-CD3 tais como Nuvion® (visilizumab) e Rexomab; anticorpos anti-CD4 tais como IDEC-151, MDX-CD4, 0KT4A; anticorpos anti-CD6 tais como Oncolisina B e Oncolisina CD6; anticorpos anti-CD7 tais como HB2; anticorpos anti-CD19 tais como B43, MT-103, e Oncolisina B; anticorpos anti-CD20 tais como 2H7, 2H7.vl6, 2H7.vll4, 2H7.vll5, Bexxar® (tositumomab, 1-131 marcado anti-CD20), Rituxan® (rituximab), e Zevalin®) (Ibritumomab tiuxetan, Y-90 marcado anti-CD20); anticorpos anti-CD22 tais como Lymphocide™ (epratuzumab, Y-90 marcado anti-CD22); anticorpos anti-CD23 tais como IDEC-152; anticorpos anti-CD25 tais como basiliximab e Zenapax® (daclizumab); anticorpos anti-CD30 tais como AC10, MDX-060, e SGN-30; anticorpos anti-CD33 tais como Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicm), Oncolisina M, e Smart M195; anticorpos anti-CD38; anticorpos anti-CD40 tais como SGN-40 e toralizumab; anticorpos anti-CD40L tais como 5c8, Antova™, e IDEC-131; anticorpos anti-CD44 tais como bivatuzumab; anticorpos anti-CD46; anticorpos anti-CD52 tais como Campath® (alemtuzumab); anticorpos anti-CD55 tais como SC-1; anticorpos anti-CD56 tais como huN901-DMl; anticorpos anti-CD64 tais como MDX-33; anticorpos anti-CD66e tal como XR-303; anticorpos anti-CD74 tais como IMMU-110; anticorpos anti-CD80 tais como galiximab e IDEC-114; anticorpos anti-CD89 tais como MDX-214; anticorpos anti-CD123; anticorpos anti-CD138 tais como B-B4-DM1; anticorpos anti-CD 146 tais como AA-98; anticorpos anti-CD148; anticorpos anti-CEA tais como CT84.66, labetuzumab, e Pentacea™; anticorpos anti-CTLA-4 tais como MDX-101; anticorpos anti-CXCR4; anticorpos anti-EGFR tais como ABX-EGF, Erbitux® (cetuximab), IMC-C225, e Merck Mab 425; anticorpos anti-EpCAM tais como anti-EpCAM de Crucell, ING-1, e IS-IL-2; anticorpos anti-efrina B2/EphB4; anticorpos anti-Her2 tais como Herceptin®, MDX-210; anticorpos anti-FAP (proteina de ativação de fibroblastos) tais como 136 sibrotuzumab; anticorpos anti-ferritina tais como NXT-211; anticorpos anti-FGF-1; anticorpos anti-FGF-3; anticorpos anti-FGF-8; anticorpos anti-FGFR, anticorpos anti-fibrina; anticorpos anti-G250 tais como WX-G250 e Rencarex®; anticorpos gangliósido anti-GD2 tais como EMD-273063 e TriGem; anticorpos anti-GD3 gangliósido tais como BEC2, KW-2871, e mitumomab; anticorpos anti-gpIIb/IIIa tais como ReoPro; anticorpos antiheparinase; anticorpos anti-Her2/ErbB2 tais como Herceptin® (trastuzumab), MDX-210, e pertuzumab; anticorpos anti-HLA tais como Oncolyn®, Smart 1D10; anticorpos anti-HM1.24; anticorpos anti-ICAM tais como ICM3; anticorpos recetores anti-IgA; anticorpos anti-IGr-1 tais como CP-751871 e EM-164; anticorpos anti-IGF-lR tais como IMC-A12; anticorpos anti-IL-6 tais como CNTO-328 e elsilimomab; anticorpos anti-IL-15 tais como HuMax™-IL15; anticorpos anti-KDR; anticorpos anti-laminina 5; anticorpos de antigénio anti-Lewis Y tais como Hu3S193 e IGN-311; anticorpos anti-MCAM; anticorpos anti-Mucl tais como BravaRex e TriAb; anticorpos anti-NCAM tais como ERJC-1 e ICRT; anticorpos antigénio anti-PEM tais como Theragyn e Therex; anticorpos anti-PSA; anticorpos anti-PSCA tais como IG8; anticorpos anti-Ptk; anticorpos anti-PTN; anticorpos anti-RANKL tais como AMG-162; anticorpos anti-RLIP76; anticorpos antigénio anti-SK-1 tais como Monopharm C; anticorpos anti-STEAP; anticorpos anti-TAG72 tais como CC49-SCA e MDX-220; anticorpos anti-FCT-β tais como CAT-152; anticorpos anti-TNF-α tais como CDP571, CDP870, D2E7, Humira® (adalimumab), e Remicade® (infliximab); anticorpos anti-TRAIL-Rl e TRAIL-R2; anticorpos anti-VE-cadherin-2; e anticorpos anti-VLA-4 tais como Antegren™. Para além disso, anticorpos anti-idiotipo incluindo mas não limitados a epitopo GD3 de anticorpo BEC2 e o epitopo gp72 de anticorpo 105AD7, podem ser usados. Além disso, anticorpos biespecificos incluindo mas não limitados ao anticorpo Bi20 anti-GD3/CD20 podem ser usados. 137

Exemplos de anticorpos que podem ser co-administrados para tratar doenças autoimune ou inflamatória, rejeição de transplante, GVHD, e afins incluem, mas não são limitados a, anticorpos integrina 3η0ί-α4β7 tais como LDP-02, anticorpos integrina anti-beta2 tais como LDP-01, anticorpos anti-complemento (C5) tais como 5G1.1, anticorpos anti-CD2 tais como BTI-322, MEDI-507, anticorpos anti-CD3 tais como 0KT3, SMART anti-CD3, anticorpos anti-CD4 tais como IDEC-151, MDX-CD4, 0KT4A, anticorpos anti-CDlla, anticorpos anti-CD14 tais como IC14, anticorpos anti-CD18, anticorpos anti-CD23 tais como IDEC 152, anticorpos anti-CD25 tais como Zenapax, anticorpos anti-CD40L tais como 5c8, Antova, IDEC-131, anticorpos anti-CD64 tais como MDX-33, anticorpos anti-CD80 tais como IDEC-114, anticorpos anti-CD147 tais como ABX-CBL, anticorpos anti-E-seletina tais como CDP850, anticorpos anti-gpIIb/IIIa tais como ReoPro/Abcixima, anticorpos anti-ICAM-3 tais como ICM3, anticorpos anti-ICE tais como VX-740, anticorpos anti-FcYRl tais como MDX-33, anticorpos anti-IgE tais como rhuMab-E25, anticorpos anti-IL-4 tais como SB-240683, anticorpos anti-IL-5 tais como SB-240563, SCH55700, anticorpos anti-IL-8 tais como ABX-IL8, anticorpos anti-interferão gama, e anticorpos anti-TNFa tais como CDP571, CDP870, D2E7, Infliximab, MAK-195F, anticorpos anti-VLA-4 tais como Antegren. Exemplos de outras moléculas contendo Fc que podem ser co-administrados para tratar doença autoimune ou inflamatória, rejeição de transplante, GVHD, e afins incluem, mas não são limitados a, recetor p75 TNF /fusão de Fc Enbrel® (etanercept) e armadilha IL-1 da Regeneron.

Exemplos de anticorpos que podem ser co-administrados para tratar doenças infeciosas incluem, mas não são limitados a, anticorpos anti-antrax tais como ABthrax, anticorpos anti- 138 CMV tais como CytoGam e sevirumab, anticorpos anti-criptosporídio tais como CryptoGAM, Sporidin-G, anticorpos anti-helicobacter tais como Pyloran, anticorpos anti-hepatite B tais como HepeX-B, Nabi-HB, anticorpos anti-HIV tais como HRG-214, anticorpos anti-RSV tais como felvizumab, HNK-20, palivizumab, RespiGam, e anticorpos anti-staphylococcus tais como Aurexis, Aurograb, BSYX-A110, e SE-Mab.

Em alternativa, os anticorpos da presente invenção podem ser co-administrados ou com uma ou mais outra moléculas que compete para a ligação a um ou mais recetores Fc. Por exemplo, co-administrar inibidores do FcyRIIb recetor inibidor pode resultar na função efetora aumentada. De modo semelhante, a co-administração de inibidores dos recetores de ativação tais como FcyRIIIa podem minimizar a função efetora não desejada. Os inibidores de recetor Fc incluem, mas não são limitados a, moléculas Fc que são manipuladas para atuar como inibidores competitivos para ligar a FcyRIIb FcyRIIIa, ou outros recetores Fc, assim como outras imunoglobulinas e especificamente o tratamento chamado IVIg (imunoglobulina intravenosa). 0 inibidor pode ser administrado e permitir atuar antes do anticorpo ser administrado. Uma via alternativa para atingir o efeito de doseamento sequencial deve ser fornecer uma forma de dosagem de libertação imediata do inibidor recetor Fc e depois uma formulação de libertação sustentada do anticorpo da invenção. As formulações de libertação imediata e de libertação controlada podem ser administrados separadamente ou ser combinados numa forma de unidade de dosagem. A administração de um inibidor FcyRIIb pode também ser usado para limitar respostas imunes não desejadas, por exemplo resposta a anticorpo anti-Fator VIII a seguir a administração do Fator VIII a hemofílicos. 139

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados com um agente quimioterapêutico. Por "agente quimioterapêutico" como aqui usado entende-se um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem mas não são limitados a agentes de alquilação tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tais como busulfano, improsulfano e piposulfano; androgénios tais como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles de inibição de aromatase, 4-hifroxitamoxifeno, trioxifeno, quetoxifeno oxifeno, LY 117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosfaoramida e trimetilolomelamina; repositores de ácido fólico tais como ácido frolínico; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, 140 colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mustarda uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; proteínas tais como arginina deiminase e asparaginase; análogos da purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; taxanos, por exemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e docetaxel (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); RFS 2000 inibidor de topoisomerase; inibidor da timidilato sintase (tais como Tomudex); quimioterapêuticos adicionais incluindo aceglatona; glicósido aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; difluorometilornitina (DMFO); elformitina; acetato de eliptinio; etoglucida; nitrato de gálio; hifroxiureia; lentinana; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CT-11; ácido retinóico; esperamicinas; 141 capecitabina. Sais, ácidos ou derivados, farmaceuticamente aceitáveis, de qualquer dos acima podem também ser usados.

Um quimioterapêutico ou outro agente citotóxico podem ser administrados como pró-fármaco. Por "pró-fármaco" como aqui usado entende-se um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa ou seja menos citotoxicidade para células tumorais em comparação com o fármaco parente e é capaz de ser ativado enzimaticamente ou convertido numa forma parente mais ativa. Ver, por exemplo Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615° Meeting Belfast, 14:375-382; Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery; e Borchardt et al., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985. Os pró-fármacos podem ser pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptido, pró-fármacos modificados com D-aminoácido, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo beta-lactâmicos, pró-fármacos contendo opcionalmente fenoxiacetamida substituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco citotóxico mais ativo isento de citoxicidade. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados numa forma de pró-fármaco para uso com os anticorpos da presente invenção incluem mas não são limitados a qualquer dos agentes quimioterapêuticos acima mencionados.

Uma diversidade de outros agentes terapêuticos podem encontrar utilização para administração com os anticorpos da presente invenção. 0 anticorpo pode ser administrado com um agente anti-angiogénico. Por "agente anti-angiogénico" como aqui usado entende-se um composto que bloqueia, ou interfere em algum grau, no desenvolvimento dos vasos 142 sanguíneos. 0 fator anti-angiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou uma proteína, por exemplo um anticorpo, fusão Fc, ou citocina, que liga a um fator de crescimento ou recetor de fator de crescimento envolvido na promoção da angiogénese. 0 fator anti-angiogénico preferido aqui é um anticorpo que se liga ao Fator de Crescimento Vascular Endotelial (FCVE). Outros agentes que inibem a sinalização através de FCVE podem também ser usados, por exemplo terapêuticos à base de RNA que reduzem os níveis de FCVE ou a expressão de FCVE-R, fusões da toxina FCVE, ratoeira de FCVE Regeneron, e anticorpos que ligam FCVE-R. Numa forma de realização alternativa, o anticorpo é administrado com um agente terapêutico que induz ou aumenta a resposta adaptativa imunológica, por exemplo um anticorpo que visa CTLA-4. Agentes anti-angiogénese adicionais incluem, mas não são limitados a, angiostatina (fragmento de plasminogénio), antitrombina III, angiozima, ABT-627, Bay 12-9566, benefina, bevacizumab, bisfosfonatos, BMS-275291, inibidor derivado de cartilagem (CDI), CAI, CD59 fragmento de complemento, CEP-7055, Col 3, combretastatina A-4, endostatina (fragmento colagénio XVIII), inibidores da farnesil transferase, fragmento de fibronetina, gro-beta, halofuginona, heparinases, fragmento de exassacáridos heparina, HMV833, gonadotropina coriónica humana (hCG), IM-862, interferão alfa, interferão beta, interferão gama, proteína indutível por interferão 10 (IP-10), interleucina-12, kringle 5 (fragmento de plasminogénio), marimastato, inibidores da metaloproteinase (por exemplo TIMPs), 2-metodiestradiol, MMI 270 (CGS 27023A), inibidor de ativiator de plasminogénio (PAI), fator-4 plaquetário (PF4), prinomastato, fragmento de prolactina 16kDa, proteína relacionada com proliferina (PRP), PTK 787/ZK 222594, retinoides, solimastato, esqualamina, SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, tetrahidrocortisol-S, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina-1 (TSP-1), 143 TNP-470, transformação do fator de crescimento beta (FCT-(3) , vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticulina), ZS6126,e ZD6474. 0 anticorpo pode ser administrado com um inibidor da tirosina quinase. Por "inibidor da tirosina quinase" como aqui usado entende-se uma molécula que inibe em alguma extensão a atividade da tirosina quinase de uma tirosina quinase. Exemplos desses inibidores incluem mas não são limitados a quinazolinas, tais como PD 153035, 4-(3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo(2,3-d) pirimidinas; curcumina (metano diferuloilo, 4,5-bis (4 — fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas contendo porções nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antisentido (por exemplo as que se ligam a ácido nucleico codificando ErbB); quinoxalinas (US 5,804,396); trifostinas (US 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G) ; inibidores de pan-ErbB tais como Cl-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Mesilato de imatiniba (STI571,Gleevec®; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); Cl-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou como descrito em qualquer dos seguintes pedidos de patente: US 5,804,396; PCT WO 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanamid); PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert); PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc) ; PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT W096/3397 (AstraZeneca); PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib (IRESSA™, ZD1839, AstraZeneca), e OSI-774 (Tarceva™, OSI Pharmaceuticals/Genentech). 144 0 anticorpo pode ser administrado com um ou mais agentes imunomoduladores. Tais agentes podem aumentar ou diminuir a produção de uma ou mais citocinas, apresentação auto-antigénio regulado para cima ou para baixo, antigénios máscara de MHC, ou promove a proliferação, diferenciação, migração, ou estado de ativação de uma ou mais tipos de células imunitárias. Agentes imunomoduladores incluem mas não limitados a: fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs) tais como aspirina, ibuprofed, celecoxib, diclofenac, etodolac, fenoprofeno, indometacina, cetoralaco, oxaprozina, nabumentona, sulindaco, tolmentina, rofecoxib, naproxeno, cetoprofeno, e nabumetona; esteróides (por exemplo glucocorticóides, dexametasona, cortisona, hifroxicortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, trimcinolona, azulfidineicosanoides tais como prostaglandinas, tromboxanos, e leucotrienos; assim como esteróides tópicos tais como antralina, calcipotrieno, clobetasol, e tazaroteno); citocinas tais como TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10; citocina, quemocina, ou antagonistas de recetor incluindo anticorpos, recetores solúveis, e fusões recetor Fc contra BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD2 0, CD23, CD2 8, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, fatores de complemento (C5, D) CTLA4, eotaxina, Fas, ICAM, ICOS, IFNa, IFN£, IFNy, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, integrinas, LFA-1, LFA-3, MHC, seletinas, TGFP, TNFa, TNFP, TNF-R1, recetor da célula T, incluindo Enbrel® (etanercept), Humira® (adalimumab), e Remicade® (infliximab); heterólogos globulina anti-limfocito; outras moléculas imunomoduladoras tais como pirimidinas substituidas 2-amino-6-aril-5, anticorpos anti-idiotipicos para péptidos ligado a MHC e fragmentos MHC, azatioprina, brequinar, bromocriptina, ciclofosfamida, ciclosporina A, D-penicilamina, 145 deoxispergualina, FK506, glutaraldeído, ouro, hifroxicloroquina, leflunomida, malononitriloamidas (por exemplo leflunomida), metotrexato, monocíclica, mizoribina, micofenolato de mofetilo, rapamicina, e sulfasasazina.

Anticorpos da presente invenção podem ser administrados com uma citocina. Por "citocina" como aqui usado entende-se um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de células que atuam noutra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfoquinas, monoquinas, e hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluído entre as citocinas estão hormonas de crescimento tais como hormonas de crescimento humanas, hormonas N-metionilo de crescimento humanas, e hormona de crescimento de bovino; hormona paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormona glicoproteína tais como hormona de estimulação de folículo (HEF), hormona estimulante da tiróide (TSH), e hormona luteinizante (HL) ; fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogénio placentário; fator alfa e beta de necrose tumoral; substância inibidora mulleriana; péptido associado a gonadotropina de rato; inibitina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoletina (TPO); fator de crescimento neural tal como FEC-beta; fator de crescimento plaquetário; fator de crescimento transformador (TGFs) tais como FCT-alfa e FCT-beta; fator I e II de crescimento tipo insulina; eritropoletina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão-alfa, beta, e gama; fatores de estimulação de colónia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocitemacrófago-CSF (GM-CSF); e granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, um fator de necrose tumoral tais como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos incluindo 146 LIF e kit ligando (KL) . Como aqui usado, o termo citocina inclui proteinas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes, e biologicamente ativos equivalentes das citocinas da sequência nativa.

Citocinas ou outros agentes que estimulam células do sistema imunitário pode ser co-administrado com o anticorpo da presente invenção. Um tal modo de tratamento pode aumentar a função efetora desejada. Por exemplo, agentes que estimulam as células NK, incluindo mas não limitado a IL-2 podem ser co-administradas. Numa outra forma de realização, podem ser co-administrado os agentes que estimulam macrófagos, incluindo mas não limitado a C5a, péptidos formilo tais como N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (Beigier-Bompadre et al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8). Também podem ser administrados, agentes que estimulam os neutrófilos, incluindo mas não limitados a G-CSF, GM-CSF, e afins. Além disso, podem ser usados agentes que promovem a migração dessas citocinas imunoestimuladoras. Também agentes adicionais incluindo mas não limitados a interferão gama, IL-3 e IL-7 podem promover uma ou mais funções efetoras.

Citocinas ou outros agentes que inibem a função efetora da célula podem ser co-administradas com o anticorpo da presente invenção. Um tal modo de tratamento pode limitar a função efetora não desejada. O anticorpo pode ser administrado com um ou mais antibióticos, incluindo mas não limitado a: antibióticos aminoglicósido (por exemplo apramicina, arbecacina, bambermicinas, butirosina, dibecacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectrinomicina), aminociclitois (por exemplo esprectinomicina), antibióticos 147 anfenicol (por exemplo azidamfenicol, eloranfenicol, florfenicol, e tianfenicol), antibióticos ansamicina (por exemplo rifamida e rifampina), carbapenemas (por exemplo imipenema, meropenema, panipenema); cefalosporina (por exemplo cefaclor, cefadroxil, cefamandole, cefatrizina, cefazedona, cefozoprano, cefpimizole, cefpiramida, cefpiroma, cefprozil, cefuroxina, cefixima, cefalexina, cefradina), cefamicinas (cefbuperazona, cefoxitina, cefminox, cefmetazole, e cefotetano); lincosamidas (por exemplo clindamicina, lincomicina) ; macrolida (por exemplo azitromicina, brefeldina A, claritromicina, eritromicina, roxitromicina, tobramicina), monobactâmicos (por exemplo aztreoname, carumoname, e tigemoname); mupirocina; oxacefemas (por exemplo flomoxef, latamoxef, e moxalactame); penicilinas (por exemplo amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bexzilpenicilinico, benzilpenicilina de sódio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamecilina, penetamato iodidrato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, benzoato de penicilina V, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina, e fencihicilina de potássio); polipéptidos (por exemplo bacitracina, colistina, polimixina B, teicoplanina, vancomicina) ; quinolonas (amifloxacina, cinoxacina, ciprofloxacina, enoxacina, enrofloxacina, feroxacina, flumequina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, ácido nalidixico, norfloxacina, ofloxacina, ácido oxolinico, pefloxacina, ácido pipemídico, rosoxacina, rufloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, tosufloxacina, trovafloxacina); rifampina; estreptograminas (por exemplo quinupristina, dalfopristina); sulfonamidas (sulfanilamida, sulfametoxazole); tetraciclenos (clortetraciclina, hidrocloreto de demeclociclina, demetilclortetraciclina, doxiciclina, duramicina, minociclina, neomicina, 148 oxitetraciclina, estreptomicina, tetraciclina, vancomicina).

Agentes antifúngicos tais como anfotericina B, ciclopirox, clotrimazole, econazole, fluconazole, flucitosina, itraconazole, cetoconazole, niconazole, nistatina, terbinafina, terconazole, e tioconazole podem também ser usados.

Agentes antivirais incluindo inibidores da protease, inibidores da transcriptase reversa, e outros, incluindo interferões tipo I, inibidores de fusão virai, e inibidores de neuramidase, podem também ser usados. Exemplos de agentes antivirais incluem, mas não são limitados a, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, clevadina, enfuvirtida, entecavir, foscarnet, gangciclovir, idoxuridina, indinavir, lopinavir, pleconarilo, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, trifluridina, vidarabina, e zidovudina, podem ser usados.

Os anticorpos da presente invenção podem ser combinados com outros regimes terapêuticos. Por exemplo, o doente a ser tratado com um anticorpo da presente invenção pode também receber terapia de radiação. A terapia de radiação pode ser administrada de acordo com protocolos comummente empregues na técnica e conhecidos dos especialistas na técnica. Tal terapia inclui mas não é limitada a radiação de césio, iridio, iodo, ou cobalto. A terapia de radiação pode ser irradiação no corpo inteiro, ou pode ser dirigida localmente para um sitio especifico ou tecido em ou sobre o corpo, tais como pulmão, bexiga, ou próstata. Tipicamente, a terapia de radiação é administrado em pulsos ao longo de um período de tempo desde cerca de 1 até 2 semanas. A terapia de radiação pode, no entanto, ser administrada durante períodos de tempo mais longos. Por exemplo, a 149 terapia de radiação pode ser administrada a doentes com cancro da cabeça e pescoço durante cerca de 6 até cerca de 7 semanas. Opcionalmente, a terapia de radiação pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas, sequenciais. 0 médico especialista pode determinar empiricamente a dose ou doses apropriadas de terapia de radiação útil aqui. 0 anticorpo da presente invenção e uma ou mais outras terapias anti-cancro, podem ser empregues para tratar células cancerígenas ex vivo. É contemplado que esse tratamento ex vivo pode ser útil no transplante na medula óssea e particularmente, transplantes autólogos de medula óssea. Por exemplo, o tratamento de células e tecido(s) contendo células cancerígenas com anticorpo e uma ou mais outras terapias anti-cancro, tais como descrito acima, pode ser empregue para destruírem ou destruírem praticamente as células cancerígenas antes do transplante num doente recetor.

Está evidentemente contemplado que os anticorpos da invenção podem empregar em combinação ainda com outras técnicas terapêuticas tais como cirurgia ou fototerapia.

EXEMPLOS

Exemplos são fornecidos abaixo para ilustrar a presente invenção. Estes exemplos não se destinam a limitar a presente invenção a qualquer aplicação ou teoria particular de operação.

Como referência às regiões variáveis de imunoglobulina, as posições são numeradas de acordo com o esquema de numeração de Kabat. Como referência às regiões constantes de imunoglobulina, as posições são numeradas de acordo com p índice EU como em Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States 150

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda).

Exemplo 1. Anticorpos anti-CD19 com modificações de aminoácido que aumentam a função efetora

Os anticorpos anti-CD19 da invenção destinam-se a candidatos clínicos para terapêutica anti-cancro. Para investigar a possibilidade de melhorar a função efetora de um anticorpo que visa CD19, versões variantes de anticorpos anti-CD19 foram manipuladas. A Figura 6 fornece algumas sequências da região variável da cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-CD19 4G7 (Meeker, T.C. et al. 1984. Hybridoma. 3: 305-320) e HD37 (Pezzuto, A. et al. 1987. J. Immunol. 138: 2793-2799) usados no presente estudo. As cadeias pesada e leve do parente quimérico de ratinho são marcadas com HO 4G7, HO HD37, LO 4G7, e LO HD37 respetivamente. As variantes da presente invenção podem ser feitas no contexto do anticorpo B43 anti-CD19 (Uckun, F.M. et al. 1998. Blood. 71: 13-29) as quais têm propriedades similares a HD37 e partilham idênticas CDRs e uma identidade de sequência total de 97% em relação às sequências HD37 HO e LO mostrada na Figura 6. Os genes para WT 4G7 e HD37 VH e VL de murino, designados HO e LO respetivamente, foram construídos usando técnicas de síntese genéticas e subclonagem no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1Zeo (Invitrogen) compreendendo as regiões constantes de IgGl de cadeia pesada e leve kapa (Ck) de comprimento total. A variante S239D/I332E (função efetora anti-GD19 aumentada) foi construída na região Fc de um anticorpo híbrido IgGl/IgG2 (referido como "Híbrido", Figura 2) no vetor pcDNA3.1Zeo usando técnicas de mutagénese QuikChange (Stratagene). Todas as sequências foram sequenciadas para confirmar a fidelidade da 151 sequência. Os plasmideos contendo gene de cadeia pesada (VH-CH1-CH2-CH3) (tipo selvagem ou variantes) foram co-transfetados com plasmídeo contendo gene de cadeia leve (VL-CLk) para as células 293T. Os meios foram colhidas 5 dias após transfeção, e os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante usando cromatografia de afinidade de proteína A (Pierce, Catalog # 20334)

As afinidades de ligação relativas do Híbrido 4G7 S239D/I332E e do anticorpo 4G7 IgGl foram calculadas através da determinação dos parâmetros de ligação num Biacore™ usando um painel de recetores Fc (Figura 7). Resumidamente, a proteína A/G foi acoplada a um fluxo de células dum chip CM5. A IgG foi primeiro diluída até 25 nM e imobilizada a proteína A / G de canal ~ 1000 RUs. O FcyR-His foi seriadamente diluído e injetado a 30 mL/min durante 2 min seguido por dissociação durante 3 min. Para determinar KD os sensogramas resultantes são "ajustados ao grupo" usando o modelo de interação 1:1 disponível no software de avaliação BIA. Os valores de KD que eram mais altos que 5 3 10~6 M são marcados como ND (não determinados) na Figura 7. Os dados indicam que o anticorpo WT IgGl se liga a V158 FcYRIIIa com uma afinidade de aproximadamente 240 nM, consistentes com a literatura (Okazaki et al, 2004, J Mol Biol 336:1239-49; Lazar et al, Proc Natl Acad Sei USA 103(11):4005-4010). A versão variante Fc liga-se a V158 FcYRIIIa com uma afinidade de cerca de 4,7 nM, indicando um aumento de afinidade de cerca de 50 vezes em relação a WT. A ligação da variante anti-CD19 a F158 FcYRIIIa é cerca de 16,7 nM.

Para medir a capacidade das variantes de anticorpo para mediarem a função efetora contra as células expressando CD19, a função efetora aumentada do anti-CD19 foi testada num ensaio CMCA de base celular. 152

Monócitos do sangue periférico humano (CMSPs) foram isolados dos leukopaks e usados como células efetoras, e foram usadas células cancerígenas CD19 positivas como células alvo. As células alvo foram semeadas em placas de 96 poços com 10,000 (Raji e MEC-1) e 20,000 (SUP-B15) células/poço e tratadas com os anticorpos específicos em triplicado. Os CMSPs isolados usando um gradiente Ficoll foram adicionados em excesso às células alvo e cocultivadas durante 4 h antes de processamento quanto à atividade LDH usando o Kit de Deteção de Citotoxicidade de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 8a mostra os resultados do ensaio CMCA de comparação dos anticorpos 4G7 IgGl e 4G7 Híbrido S239D/I332E, e HD37 IgGl e HD37 Híbrido S239D/I332E na linha de células Daudi (LB) . A Figura 8b mostra os resultados do ensaio CMCA de comparação de anticorpos 4G7 IgGl e 4G7 Hibrido S239D/I332E, e anti-CD20 rituximab nas linhas de células SUP-B15 (LLA) e Raji (Linfoma de Burkitt). Os gráficos mostram que os anticorpos diferem não somente no seu EC50, refletindo a sua potência relativa, mas também o nível máximo de CMCA esperado pelos anticorpos a concentrações de saturação, refletindo a sua eficácia relativa. Melhorias consideráveis na potência e eficácia são observadas para as variantes de anticorpo Fc em comparação com o anticorpo com a região Fc WT. O anticorpo IgGl quimérico tem muito pouca eficácia ou potência. A EC50 da curva de dose response tal como o da Figura 8 representa a concentração de um composto em que é observado 50% do seu efeito máximo. Num contexto clinico, a potência reflete a concentração do anticorpo necessária para realizar o seu efeito terapêutico. Assim os dados da Figura 8 mostram que os anticorpos anti-CD19 otimizados em Fc atuam in vivo a uma concentração ou dose menor que aquela de um anti-CD19 WT ou anticorpo anti-CD20. Na Figura 8b, 153 enquanto WT IgG21 anti-CD19 à concentração de saturação medeia aproximadamente 10% de CMCA máximo, a Variante Fc anti-CD19 lisa aproximadamente 60% das células alvo. Num contexto clinico, a eficácia reflete o beneficio terapêutico máximo do fármaco administrado.

Exemplo 2. Ligação de um anticorpo anti-CD19 de funções efetoras aumentadas para uma linha de células tumorais derivadas das células B

Mediu-se a ligação relativa do Híbrido 4G7 S239D/I332E à linha de células Raji. Foram determinadas as afinidades da função efetora melhorada das variantes anti-CD19 usando o sistema DELFIA® (PerkinElmer Life Sciences) o qual é baseado em Fluorometria Resolvida no Tempo (FRT). O anti-CD19 (H0L0) é marcado com Európio usando o kit Eu-Labeling disponível na PerkinElmer Biosciences. O tipo selvagem não marcado (WT) ou variantes (frio) são diluídos seriadamente (tipicamente partindo de 1 μΜ) em passos de log © e misturado com uma concentração fixada de anti-CD19 marcado (ou quente). A mistura de anticorpos "quente" e "frio" é depois adicionada a 100,000 Células Raji (que têm uma alta densidade de superfície expressaram o antigénio CD-19) e incubada em gelo durante 30 min. O ensaio é aplicado essencialmente como um ensaio de competição para triagem dos anticorpos anti-CD19 de afinidades diferentes. Na ausência de variantes de competição de afinidade, o Eu-anti-CD19 e CD19 de superfície interagem e produzem um sinal a 613 nm quando o Európio é excitado a 340 nm. A adição do tipo selvagem ou variante compete com a interação Eu-anti-CDl9-CD19, reduzindo quantitativamente a fluorescência para viabilizar a determinação das afinidades de ligação relativa. A Figura 9 mostra resultados de um ensaio de ligação de superfície celular de anti-CD19 de 154 função efetora melhorada a células Raji. Como pode ser observado, o valor EC50 calculado é 1,2 nM.

Exemplo 3. CMCA de um anticorpo anti-CD19 com citotoxicidade aumentada contra linhas de células de linfoma múltiplo.

Com vista a avaliar as propriedades citotóxicas do anti-CD19 de função efetora aumentada, foram realizados ensaios CMCA sobre um painel de 14 linhas de células representando vários linfomas e leucemias (Figura 10a). As linhas de células testadas eram linhas de células DoHH-2 e SCI de Linfoma Folicular (LF); linha de células Jeko-1 de Linfoma das Células do Manto (LCM); linhas de células Daudi e Raji de Linfoma de Burkitt (LB); linhas de células MEC1 e WaC3CD5 da Leucemia Linfocitica Crónica (LLC); linha de células Bonna-12 da Leucemia das Células Pilosas (LCP); linha de células BV-1.73 da Leucemia Mielogénica Crónica (LMC); e linhas de células VAL, SUP-B15, NALM-6, RS4;11, e 697 de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). Os monócitos do sangue periférico humano (CMSPs) foram isolados a partir de leukopaks e usados como células efetoras, e as células cancerígenas CD19 positivas foram usadas como células alvo. As células alvo foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com os anticorpos específicos em triplicado. As CMSPs isoladas usando um gradiente de Ficoll foram adicionadas em excesso às células alvo e cocultivadas durante 4 h antes de processadas quanto à atividade LDH usando o Kit de Deteção de Citotoxicidade de acordo com as instruções do fabricante. Ambos os parâmetros, potência (EC50) e eficácia (% CMCA) foram normalizados com os do rituximab (anti-CD20). Esta triagem demonstrou a superioridade citotóxica in vitro do anti-CD 19 de função efetora aumentada sobre uma vasta gama de linhas de células, especialmente as representando a doença 155 linfoproliferativa que se origina nos estados precoces do desenvolvimento das células B. A Figura 10b lista as linhas de células usadas e seus tipos de cancro correspondentes.

Exemplo 4. Anticorpos anti-CD19 com reduzido potencial de imunogenicidade.

Devido a um vasto uso de tecnologia de hibridoma, um número substancial de anticorpos são derivados de fontes não humanas. No entanto, as proteínas não humanas são frequentemente imunogénnicas quando administradas a humanos, reduzindo grandemente setes modo a utilidade terapêutica. A imunogenicidade é o resultado de uma série complexa de respostas a uma substância que é percebido como estranho e pode incluir a produção de anticorpos neutralizantes e não neutralizantes, formação de complexos imunes, ativação de complemento, ativação de mastócitos, inflamação, respostas de hipersensibilidade, e anafilaxia. Vários fatores poem contribuir para a imunogenicidade de proteína, incluindo mas não limitado a sequência de proteína, via e frequência de administração, e população doentes. A imunogenicidade pode limitar a eficácia e a segurança de uma proteína terapêutica por múltiplas vias. A eficácia pode ser reduzida diretamente através da formação de anticorpos neutralizadores. A eficácia pode também ser reduzida indiretamente, por ligação a anticorpos quer neutralizantes quer não neutralizantes tipicamente conduz a rápida eliminação a partir de soro. Podem ocorrer graves efeitos secundários e mesmo morte quando surge uma reação imunológica. Assim numa forma de realização preferida, a manipulação da proteína é usada para reduzir a imunogenicidade das proteínas alvo CD19 da presente invenção. 156

Com vista a reduzir o potencial de imunogenicidade das proteínas anti-CD19 da presente invenção, a imunogenicidade dos anticorpos 4G7 e HD37 anti-CD 19 foi reduzida usando um método descrito na US 2006/0008883, intitulada "Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof", registada em 6 de dezembro, 2004. Os métodos reduzem o potencial de imunogenicidade através do aumento do conteúdo humano de sequência do anticorpo por meio de mutações. As cadeias pesada e leve com reduzido potencial para a imunogenicidade são chamadas Hl, H2, H3, H4, etc e Ll, L2, L3, etc. e são mostradas nas Figuras 11 até 14. As cadeias pesada e leve dos anticorpos originais, 4G7 e HD37, são referidas como H0 e L0, respetivamente. Combinações das diferentes cadeias pesadas e leves foram expressas e os anticorpos resultantes, com nomes tais como H3L3, H3/L3 ou H3_L3, foram purificadas e examinadas. Os anticorpos anti-CD19 foram expressos pela transfeção transiente dos vetores de acordo com as cadeias pesada e leve no crescimento das células 293T em 10% de IgG ultra-baixa de soro fetal de bovino com lmM de piruvato de sódio e IX aminoácidos não essenciais (Gibco®, Invitrogen Hayward CA). Cinco dias após a transfeção, o meio de cultura foi removido e passado através de uma coluna de proteína A (Pierce Biotechnology Inc, Rockford MD). As cadeias pesadas podem ser feitas com qualquer tipo de domínio constante incluindo, em humanos, IgGl, IgG2 e híbridos compreendendo IgGl e IgG2 assim como domínios constantes de ratinho tais como IgGl e IgG2a, que podem ser referidos como mlgGl e mIgG2a. As sequências de cadeias pesadas humanas podem ser encontradas na Figura 2. Foi medida a ligação relativa de variantes anti-CDl9 com reduzida imunogenicidade para uma linha de células Raji. As afinidades de imunogenicidade reduzida das variantes anti-CD19 foram determinadas usando o sistema DELFIA® (PerkinElmer Life Sciences) que é baseado em Fluorometria 157

Resolvida no Tempo (FRT). 0 Anti-CD19 é marcado com Európio usando o kit Eu-Labeling disponível da PerkinElmer Biosciences. Tipo selvagem (WT) não marcado ou variantes (frio) são diluídos seriadamente (partindo tipicamente de 1 μΜ) em passos ^ log e misturados com uma concentração fixada de anti-CD19 marcado (ou quente). A mistura de anticorpos "quentes" e "frios" são depois adicionados a 100,000 células Raji (que têm uma alta densidade de antigénio CD-19 expresso de superfície) e incubadas em gelo durante 30 min. O ensaio é essencialmente aplicado como um ensaio de competição para triar anticorpos anti-CD19 de afinidades diferentes. Na ausência de variantes de competição de afinidade, Eu-anti-CD19 e CD19 de superfície interagem e produzem um sinal a 613 nm quando o Európio é excitado a 340 nm. A adição do tipo selvagem ou variante compete com interação Eu-anti-CD19 - CD 19, reduzindo quantitativamente a fluorescência para viabilizar a determinação de afinidades de ligação relativa. A Figura 15a mostra os resultados de um ensaio de ligação de superfície celular de variantes 4G7 de imunogenicidade reduzida a células Raji. Com base na afinidade e estabilidade de ligação, a região variável 4G7 H1L1 foi escolhida para desenvolvimento adicional. A Figura 15b mostra os resultados de um ensaio CMCA em modelos de imunogenicidade reduzida HD37_H2L1 Híbrido S239D/I332E e 4G7_H1L3 Híbrido S239D/I332E na linha de células MEC-1 (LLC) . Este ensaio CMCA foi realizado como nos ensaios anteriores. Ambos os anticorpos são ativos nesta linha de células e portanto e, portanto, podem ser tratamentos potenciais para CLL.

Exemplo 5. Aumento da afinidade e estabilidade da função efetora de anti-CD19 aumentada. 158 A maturação de afinidade 4G7 mAb H1L1 foi realizada com vista a aumentar adicionalmente a afinidade de ligação CD19 assim como a potência CMCA. A maturação de afinidade foi realizada em três estádios usando uma abordagem de manipulação computacional/proteina. Primeiro, operando sob a hipótese de que os resíduos da determinação de especificidade (SDRs) (Padlan, E.A. et al. 1995. FASEB J. 9: 133-139) nas CDRs de um anticorpo já foram otimizados pelas células B no processo de hipermutação somática in vivo, uma biblioteca de variantes 94 foi designado para determinar aqueles resíduos nas CDRs que foram críticos para a ligação a antigénio, e assim não deve ser mudado durante o processo de manipulação. Esta biblioteca consiste de uma ou duas mutações de "sondagem" mutações feitas nas posições nas CDRs com sítios escolhidos usando modelação estrutural assim como a probabilidade de que a posição é frequentemente um SDR, que foi compilado a partir da análise de estruturas complexa antigénio-anticorpo disponíveis no Protein Data Bank (PDB) (MacCallum, R.M. et al. 1996. JMB 262: 732-745; Almagro, J.C. 2004. J. Mol.

Recognit. 17:132-143).

Foram introduzidas mutações variantes usando o kit de mutagénese QuikChange no formato Fab do modelo H1L1 e continha uma etiqueta 6X-His. As variantes Fabs foram expressas em células 293T usando placas d 24 poços e foram analisadas por AlphaScreen ou citometria de fluxo usando células Raji ou RS4;11, e com a concentração de cada variante determinada usando um chip de ligação His por Biacore™. Das 50 posições, foram identificadas 17 posições que foram críticas para ligação a antigénio, permitindo-nos reduzir o tamanho da biblioteca na ronda seguinte de maturação de afinidade e dando valiosa informação estrutural sobre quais as posições que ficam junto da interface do antigénio e que fariam bons alvos para 159 encontrar variantes de afinidade aumentadas. Os 17 SDRs identificados nas nossas análises estão em excelente concordância com o número médio de SDRs presentes nos anticorpos cujos complexos antigénio-anticorpo foram resolvidos (Almagro, J.C. 2004. J. Mol. Recognit. 17:132-143). Para além da informação estrutural valiosa ganha com esta biblioteca, foram obtidas algumas variantes que tinham uma afinidade aumentada.

As restantes 33 posições CDR foram classificadas por ordem de importância com base na análise dos resultados da primeira biblioteca e através do mapeamento do SDRs do modelo estrutural do modelo H1L1. Através desta análise determinou-se que praticamente toda a interface de ligação de antigénio-anticorpo pode ser explorada com uma frequência total de 12,2 aminoácidos por posição (-9.3 novas variantes por posição) com uma segunda ronda de tamanho de biblioteca de 279 variantes. A Library Design Automation (LDA™) (US 2006/0234303, registada em 3 de março, 2006) foi usada para criar uma biblioteca de variantes otimizada que foi ajustada para adequação e cobertura com base no número de variantes desejadas. A biblioteca final da segunda ronda quando ajustada para formato de alto rendimento contendo 265 variantes a 30 posições. Esta biblioteca produziu diversas variantes mostrando afinidades de ligação aumentadas. As variantes anti-CD19 Fab foram triadas por citometria de fluxo para determinar a afinidade. A linha de células RS4;11, conhecida por expressar CD19, foi suspensa em PBS e plaqueada a 200.000 células/poço numa placa de 96 poços de fundo redondo. Uma diluição seriada de anticorpos CD19 foi adicionada a células RS4;11 a uma concentração desconhecida. As células foram incubadas sobre gelo durante 30 minutos e depois lavadas 4 vezes em PBS. Um anti-Fab PE-marcado F(ab')2 foi diluído a 1/50 em PBS, o qual foi 160 depois usado para resuspender as RS4;11 revestidas com anti-CD 19 Fab. As células foram incubadas durante 30 minutos e lavadas duas vezes. As células foram depois fixadas e os ensaios de ligação foram avaliados num citómetro de fluxo FACS Canto II. O MFI foi usado para medir a força de ligação. A partir das duas bibliotecas um e dois, foi obtido um total de 30 variantes de afinidade únicas em 11 posições. A análise dos dados de ligação das duas primeiras bibliotecas assim como a análise estrutural adicional permitiu-nos desenhar uma terceira e final biblioteca contendo combinações de 2-8 variantes únicas. Esta biblioteca consistiu de 149 variantes em 8 posições. Destas, 20 variantes mostraram um aumento significativo na afinidade e foram selecionadas para conversão para o formato de comprimento completo para medição simultânea da afinidade de ligação e CMCA. Para avaliar as propriedades da solução, foram realizados ensaios de estabilidade nestas variantes. 0 conjunto final das mutações incluidas nas 20 finais eram as variantes de cadeia pesada T57P, K58E, SlOOcT, RlOOdS, e as variantes de cadeia leve L27cQ, S27eV, A55N, F961, e F96N. Estudos de estabilidade acelerada revelaram que pelo menos uma das mutações de afinidade aumentada criou instabilidade na proteína e fez com que estas variantes perdessem toda a potência após somente 8 h a 37°C. Tendo em conta os dados de ligação e estabilidade, uma afinidade definitiva do candidato mAb amadurecido pode ser selecionada a qual apresentou um aumento de ~10 vezes de afinidade de ligação nas células RS4;11 relativamente ao H1L1 mAb (Figura 16) . As variantes delineadas para aumentarem a estabilidade a longo termo da molécula anti-CD19 foram também desenhadas e triadas. A Figura 17 mostra os dados de ligação para as variantes incubadas durante 5 dias a 37°C, pH 9,0 em 200 mM Tris-LCP, demonstrando a 161 melhoria na estabilidade obtida a partir de uma variante anti-CDl9.

Todas as substituições unitárias feitas para maior estabilidade e/ou afinidade são mostrados na Figura 27. A Figura 28 lista todas as variantes da região variável anti-CD19 construída para optimizar a afinidade e estabilidade. A Figura 29 lista as variantes preferidas e o aumento relativo na afinidade de ligação versus o H1L1 mAb parente. As sequências para as variantes de cadeia pesada de afinidade e/ou estabilidade aumentada preferidas são mostradas na Figura 18. As sequências para as variantes de cadeia leve de afinidade e/ou estabilidade aumentada preferidas são mostradas na Figura 19. Sequências de aminoácidos de variante S239D/I332E Híbrido de comprimento completo contendo as regiões variáveis de afinidade e estabilidade melhorada são fornecidas como SEQ ID NOs: 86-110. As CDR's de afinidade e estabilidade melhorada são fornecidos como SEQ ID NOs: 111-131.

Exemplo 6. Propriedades antiproliferativas de 4G7 Híbrido S239D/I332 em células Raji.

Para observar um efeito antiproliferativo in vitro, muitos anticorpos requerem ligação cruzada, usualmente conseguida com um anticorpo secundário. Foi proposto que os efeitos correspondentes in vivo destes anticorpos possam estar dependentes da ligação cruzada mediada por recetores Fc expressados na superfície das células efetoras. Nesta experiência as células Raji foram crescidas durante 3 dias na presença de 100 ng/mL 4G7 Híbrido S239D/I332E, 4G7 IgGl, ou anti-CD20 (rituximab) ou anticorpos controlo (não-CD19 ligados à região variável com variantes Fc Híbrido S239D/I332E) a várias concentrações com ΙΟχ o excesso molar de anticorpo de ligação cruzada. O crescimento celular foi 162 medido usando um ensaio de luminescência dependente de ATP. Os resultados para o ensaio de antiproliferação são mostrados na Figura 20. OS dois 4G7 Híbrido S239D/I332E e 4G7 IgGl mostram mais fortes efeitos antiproliferação que o rituximab.

Exemplo 7. Propriedades antiproliferativas de Híbrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7 em células SU-DHL-6.

Nesta experiência as células SU-DHL-6 foram ou crescidas durante 3 dias na presença de 4G7 humanizada e Híbrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas e anticorpos controlo a várias concentrações com ΙΟχ o excesso molar de anticorpo de ligação cruzada e 6000 células/poço ou foram crescidas na presença de uma concentração do anticorpo fixada a 3000 células/poço e a viabilidade a pontos específicos de tempo medida durante um total de 72 horas. Os resultados do ensaio de antiproliferação são mostrados na Figura 21. A estabilidade e afinidade melhorada para 4G7 do Híbrido S239D/I332E mostra mais forte efeito antiproliferativo que o rituximab. A estabilidade e afinidade melhoradas de 4G7 Híbrido S239D/I332E mostram também efeitos antiproliferativos mesmo na ausência de anticorpo de ligação cruzada.

Exemplo 8. Fagocitose de Raji e células RS4;11 com estabilidade e afinidade melhoradas do Híbrido S239D/I332E paara 4G7.

Ao contrário das células NK as quais expressam somente FcYRIIIa e algumas vezes FcyRIIc, os monócitos e as células efetoras derivadas de monócito expressam uma gama de FcyRs, incluindo FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, e FcYRIIIa. Assim a ativação e função das células efetoras derivadas de 163 monócitos, incluindo por exemplo macrófagos, podem ser dependentes ou envolver complexos imunológicos de anticorpo com outros recetores que não somente FcYRIIIa. Evidentemente que como descrito na PCT WO 2007/041635, Desjarlais J.R. et al., registada em 3 de outubro, 2006, a fagocitose por macrófagos é mediada em parte por envolvimento do anticorpo com FcYRIIa.

Para avaliar a capacidade de estabilidade e afinidade melhoradas do Híbrido S239D/I332E para 4G7 para mediar a fagocitose a foi realizado um ensaio de fagocitose baseada em citometria de fluxo. Monócitos CD14+ purificados foram cultivados em fator de estimulação de colónia de macrófagos (50ng/mL) durante 5 dias numa incubadora humidificada para a diferenciação de macrófagos. As células RS4;11 ou Raji foram usadas como alvo. As células alvo foram marcadas com PKH67 (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram adicionadas a uma placa de 96 poços após às quais foi adicionada uma diluição seriada de anticorpos anti-CD19 modificados em WT e Fc. Macrófagos derivados de monócitos foram depois adicionados aos poços a um efetor para visar uma proporção de 4:1. Estes ensaios foram realizados na presença de soro humano. A cocultura de células foi resumidamente centrifugada e depois incubada numa incubadora humidificada durante 4 horas. As células foram colhidas, e os macrófagos foram corados com uma segunda cor fluorescente para os distinguir dos do alvo. As células foram fixadas em PFA 1% e a fagocitose foi avaliada num Citómetro de fluxo FACS Canto II. A leitura da fagocitose foi determinada pelo número de células positivas duplas divididas pelo número total de células tumorais. Os resultados dos ensaios de fagocitose são mostrados na Figura 22. A estabilidade e afinidade melhoradas de Híbrido S239D/I332E para 4G7 mostra um nível aumentado de 164 fagocitose em ambas as linhas de células em comparação com o anticorpo IgGl anti-CD19.

Os macrófagos são fagócitos que atuam como captadores para consumir as células mortas, as substâncias estranhas, e outros detritos. Importante, os macrófagos são células profissionais apresentadoras de antigénio (CAAs), removendo os patogénios e estruturas estranhas dos tecidos periféricos, depois migrando para os órgãos linfóides secundários para iniciar respostas imunológicas adaptativas por ativação das células T naives. Portanto os resultados da experiência anterior sugerem que a modificação dos anticorpos anti-CDl9 pode permitir os mecanismos de ação que incluem ambas as funções efetoras citotóxicas inatas, assim como as funções efetoras que podem conduzir potencialmente à resposta imunológica adaptativa a longo prazo.

Exemplo 9. CMCA de estabilidade e afinidade melhoradas X 0) Híbrido S239D/I332E para 4G7 contra linhas de células de linforna múltiplo usando células assassinas naturais (NK) purificadas

Com vista a avaliar as propriedades citotóxicas de Híbrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7, foram realizados ensaios CMCA com células NK purificadas num painel de 6 linhas de células representando vários linfomas e leucemias (Figura 23) . CMCA com células NK purificadas é feita em placas microtituladoras de 96 poços. As células NK foram purificadas a partir de CMSP humano usando o kit da Miltenyi Biotec (Cat #130-091-152) e incubadas em 10% de FBS/RPMI1640 ao longo da noite com 10 ng/mL de IL-2. No dia seguinte, 10,000 (WaC3CD5, Namalwa, Bonna-12, Ramos) ou 20,000 (RS4;11, BV-173) células de cancro alvo são opsonizadas com concentrações variáveis de 165 anticorpo e 50k de células NK são usadas para cada concentração de anticorpos em triplicado. As células alvo são lavadas três vezes enquanto as células NK são lavadas duas vezes com RPMI1640 e ambas resuspendidas em 1% de FBS/RPMI1640 e adicionadas às soluções de anticorpo. Após 4 horas de incubação a 37°C numa incubadora humidificada com 5% de C02, o ensaio foi quantificado usando sistema de deteção dependente de fluorescência CytoTox-One dependente de LDH da Promeqa (#PAG7891) . 0 sinal de LDH total é determinado a partir de células alvo lisadas Triton-X100 (LDH Alvo Total) e usado para normalizar valores experimentais ajustados contra a base de LDH espontânea (Base espontânea) . Assim a % CMCA = ( (Valor Experimental -Base Espontânea)/(LDH Alvo Total - LDH Alvo))* 100. A base espontânea é o valor obtido a partir de células Alvo e NK coincubadas na ausência de anticorpo. LDH alvo é o valor das células alvo cancerígenas sozinhas libertando espontaneamente LDH durante a incubação. A Figura 23 mostra os resultados de CMCA, ensaio para 6 linhas de células usando Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7, 4G7 IgGl (com região variável afinidade/estabilidade otimizada), rituximab (anti-CD20), e um anticorpo isotipo controlo. Para todas as linhas de células testadas, Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7 tem melhor desempenho na potência e eficácia em comparação com 4G7 IgGl e rituximab.

Exemplo 10. Híbrido S239D/I332E estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7 ligando células 293T transfetadas CD19

Um clone CD19 humano foi encomendado à Origene (No. de catálogo SC127938) e transfetada para células 293T. As células foram suspensas em PBS e plaqueadas a 100 000 células/poço. Uma diluição seriada de 4G7 Híbrido S239D/I3332E de estabilidade e afinidade melhoradas foi 166 adicionada às células e depois as células foram incubadas em gelo durante 30 minutos e depois lavadas 4 vezes em PBS. Um anti-Fab PE-marcado F(ab')2 foi diluído 1/50 em PBS, o qual foi depois usado para resuspender as células 293T revestidas com anti-CD19 de Híbrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7. As células foram incubadas durante 30 minutos e lavados duas vezes. As células foram então fixadas e a ligação foi avaliada num citómetro de fluxo FACS Canto II. A Figura 24 mostra os resultados para este teste. Os resultados mostram que Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7 ligam as células 293T transfetadas com CD19 e não ligam as células controlo (células 293T normais).

Exemplo 11. 4G7 Hibrido S239D/1332E de estabilidade e afinidade melhoradas é de reação cruzada com CD19 de cinomolgos e macacos rhésus. A testagem pré-clinica de fármacos em macacos é tipicamente um importante passo na descoberta de medicamentos a fim de avaliar a toxicidade potencial. Foram obtidas amostras de sangue de cinco cinomolgos (Macaca fascicularis; género = Macaco (Latim) ou Macaco (Português); espécies = fascicularis) e cinco macacos rhésus (Macaca mulatta). Hibrido S239D/I332E de 4G7 anti-CD19 de estabilidade + afinidade melhorada, IgGl anti-CD19 (imunogenicidade reduzida, mas sem região variável afinidade/estabilidade otimizada), rituximab (anti-CD20), e controlo negativo (Fc aumentado, região variável não ligada) foram diretamente marcadas com FITC. O Rituximab foi também marcado com CAA para identificar as células da fração de células B. Todas as CMSPs humanas foram usadas como controlos positivos. As amostras de sangue e CMSPs foram pré-incubadas com 2 mg/mL de um isotipo de anticorpo controlo com Fc aumentada para bloquear qualquer potencial ligação FcyR. Em cada 167 experiência, rituximab-CAA e uma das variantes de teste foram incluidas no ensaio. A deteção é feita usando um Citómetro de fluxo FACS Canto II com frações de linfócitos de porta baseados na dispersão para a frente e lateral. Os resultados são mostrados na Figura 25. Anti-CD19 maduras não afinidade/estabilidade (assim como o seu anticorpo parente de murino) não reage cruzadamente com CD19 de conimolgos ou rhésus. As variantes que aumentam a ligação e estabilidade da molécula anti-CD19 viabilizam a reatividade cruzada de Hibrido S239D/I332E de estabilidade e afinidade melhoradas para 4G7 tanto para CD19 de conimolgos como de rhésus.

Exemplos 12. CMCA de um anticorpo anti-CD19 de função efetora melhorada com reduzido conteúdo de fucose

Os anticorpos anti-CDfl9 com função efetora melhorada (4G7 H1L1 Hibrido S239D/1332E) foram avaliados com reduzido conteúdo de fucose. A linha de células Lecl3 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 49:533-545 (1986)) foi utilizada para expressar anticorpos anti-CD19 com reduzido conteúdo de fucose. Lecl3 refere-se a linha de células mutante de Ovário de Hamster Chinês (OHC) resistentes a lectina as quais apresentam um metabolismo da fucose defeituoso e portanto têm uma capacidade diminuida para adicionar fucose ao complexo de hidratos de carbono. Aquela linha de células é descrita em Ripka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(l):51-62; e Ripka et al., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 249(2):533-545. Acredita-se que as células Lecl3 não têm a transcrição para GDPD-manose-4,6-desidratase, uma enzima chave para o metabolismo da fucose. Ohyama et al., 1988, J. Biol. Chem. 273(23): 14582-14587. A GDP-D-manose-4,6-desidratase gera GDP-mannose-4-ceto-6-D-desoximanose a partir de GDPmanose, a qual é depois convertida pela proteina FX em GDP-L-fucose. A expressão de oligossacáridos 168 fucosilados está dependente de substratos dadores de GDP-L-fucose e fucosiltransferase(s). A linha de células Lecl3 de OHC é deficiente na sua capacidade para adicionar fucose, mas fornece IgG com oligossacárido o qual é por sua vez similar aquele encontrado em linhas de células OHC normais e no soro humano (Jefferis, R. et al., 1990, Biochem. J. 268, 529-537; Raju, S. et al., 2000, Glycobiology 10, 477-486; Routier, F. H., et al., 1997, Glycoconj . J. 14, 201-207) . As células OHC e HEK293 normais adicionam fucose ao oligossacárido IgG num elevado grau, tipicamente desde 80-98%, e as IgGs dos seros são também altamente fucosiladas (Jefferis, R. et al., 1990, Biochem J. 268, 529-537; Raju, S. et al., 2000, Glycobiology 10, 477-486; Routier, F. H., et al., 1997, Glycoconj. J. 14, 201-207; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740). Está bem estabelecido que os anticorpos expressos nas células Lecl3 transfetadas produzem consistentemente cerca de 10% de hidrato de carbono fucosilado (Shields et al., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740).

Os ensaios de CMCA foram realizados em células RS4;11 e MEC-1 usando anticorpos anti-CD19 com e sem variantes com função efetora melhorada e com e sem fucosilação reduzida. A Figura 26 mostra os resultados destes ensaios CMCA. A potência e a eficácia de CMCA são similares para o anticorpo anti-CD19 com modificações de aminoácido (4G7_HlLl_Hybrid_239D/1332E + fucose) e IgGl anti-CD19 com reduzido conteúdo de fucose (4G7_HlLl_IgGl_WTfucose). A potência de CMCA é adicionalmente aumentada através da combinação da modificação de aminoácido com reduzido conteúdo de fucose (4G7_HlLl_Hybrid_239D/332E-fucose). (Figura 26) . Esta experiência ilustra portanto que podem ser usadas combinações de modificações de aminoácidos e de glicoformas modificadas para otimizar anticorpos anti-CD19 para as propriedades de função efetora. 169 0 uso da linha de células Lecl3 não se destina a limitar a presente invenção do modo particular de redução do conteúdo de fucose. Uma diversidade de outros métodos são conhecidos na técnica para controlar o nivel de oligossacáridos fucosilados e/ou de bisseção que são ligados covalentemente à região Fc, incluindo mas não limitado a expressão em vários organismos ou linhas de células, manipuladas ou de outra forma (por exemplo células Lecl3 OHC ou células YB2/0 de hibridoma de rato), regulação de enzimas envolvidas no passo de glicosilação (por exemplo FUT8 [al,6-fucosiltranserase] e/ou βΙ-4-Ν-acetilglucosaminiltransferase III [Gn'TIII]), e modificação de hidrato de carbono (s) de modificação após a IgG ter sido expressa (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176 — 180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology e Bioengineering 87(5):614-621),- (US 6,602,684; US 2003/0157108; US 2003/0003097; PCT WO 00/ 61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1). O uso de modificações especificas para aumentar a função efetora, por exemplo as substituições 239D e 332E e o reduzido nivel de fucose, não se destinam a limitar os anticorpos anti-CD 19 a estas modificações especificas. Como descrito acima na secção intitulada "Modificações para otimizar a função efetora", um grande número de modificações, incluindo modificações de aminoácido e de glicoformas modificadas, está contemplado para os anticorpos anti-CD19 para melhorar as suas propriedades da função efetora. 170

Exemplo 13. Anticorpos anti-CD19 inibem a proliferação de células B primárias - aplicações de anticorpos anti-CD19 no tratamento de doenças autoimunes A capacidade dos anticorpos anti-CD19 desta invenção para empobrecerem as células B através de função efetora CMCA é exemplificada pela sua capacidade para lisar uma diversidade de linhas de células representativas de uma gama de linhagem de célula B, como mostrado nos exemplos precedentes. Esta função é mediada por células efetoras tais como células NK e macrófagos que expressam FcyRs, desencadeamento que induz a lise das células alvo revestidas com CD19. Um mecanismo adicional de ação pode também ser mediado contra células B ativadas por antigénio. A ativação por antigénio das células B ser mimetizada pelo uso de anticorpos para recetores de células B (RCB) . Isto conduz à sua proliferação na cultura, uma medida genérica de ativação. A ligação de antigénios pode ser mimetizada in vitro por ligação cruzada da RCB (mu ou IgM) com o anticorpo anti-mu (anti-4, anti-IgM). Com vista a demonstrar esta atividade, Células Mononucleares do Sangue Periférico (CMSPs) foram preparadas a partir do Pacote de Leucoforese por gradiente de densidade Ficoll, e as células B primárias humanas foram purificadas a partir das CMSPs usando o kit de seleção magnética negativa comprada na Miltenyi Biotec. O ensaio de proliferação foi realizado em FBS a 10%/meio RPMI1640 num volume total de 100 μ]0 em placas de microtitulação de 96 poços em triplicado. A ativação das células B foi induzida usando fragmento F(ab')2 de anticorpo anti-mu de cabra (Jackson Immunoresearch, Inc.) . Em 50 μ]0 de meio, diluições seriadas do anticorpo anti-mu foram retiradas aliquotas para placas microtituladoras de 96 poços, às quais foram 171 adicionadas 83,000 células B purificadas num volume de 50 μ]1. Depois as placas microtituladoras foram incubadas a 37°C durante 3 dias após os quais, foi usado o formato de ensaio de luminescência de ATP (Cell TiterGlo Kit da Promega) para detetar as células vivas usando o luminómetro. A Figura 30a mostra que há uma dependência de dose da proliferação das células B na concentração de anticorpo anti-mu.

Com vista a avaliar a capacidade de anticorpos anti-CD19 WT (4G7_H3_L1 IgGl_WT) e variante (4G7_H3_Ll_Hybrid_239D/332E) para modular a proliferação das células B, foi realizado um ensaio para monitorizar a viabilidade das células B humanas primárias na presença de anti-CD19 e coestimular o anticorpo anti-mu. Como descrito acima, foram preparadas CMSPs a partir do Pacote de Leucoforese por gradiente de densidade Ficoll, e as células B humanas primárias foram purificadas a partir das CMSPs usando seleção magnética negativa. O ensaio de proliferação foi realizado em FBS a 10%/meio RPMI1640 num volume total de 100 μ]1 em placas microtituladoras de 96 poços em triplicados. Para induzir a ativação das células B, foi usado o fragmento F(ab')2 do anticorpo anti-mu de cabra. Em 50 μ]1 de meio, uma concentração fixa (2 mg/mL) de anti-mu com diluições seriadas cinco vezes dos anticorpos foram realizadas em placas microtituladoras de 96 poços, às quais 100,000 células B purificadas foram adicionadas num volume de 50 μ]1. Depois as placas microtituladoras foram incubadas a 37 °C durante 3 dias após os quais foi usado um formato de ensaio de luminescência de ATP para detetar as células vivas usando iluminómetro.

Os resultados, fornecidos na Figura 30b, mostram que anticorpo anti-CD 19 WT não tem efeito na proliferação das 172 células B primárias, similarmente ao controlo negativo com anticorpo anti-CD30 (CD30 não é expresso nas células B) . Pelo contrário, o anticorpo anti-CD19 compreendendo modificações Fc tem atividade inibidora significativa contra a viabilidade das células B. Especialmente, uma sinalização in vitro como resultado da ligação cruzada anti-mu anticorpo mimetiza o envolvimento de antigénio de RCB, e é um proxi para o envolvimento de RCB pelo autoantigénio numa situação clinica autoimune. A patogénese da maioria das doenças autoimunes está acoplada à produção de auto-anticorpos contra os próprios antigénios, conduzindo a uma diversidade de patologias associadas. Por exemplo, SLE é caracterizada pela produção de anticorpos auto ou próprios para duplicar a cadeia de ADN. Consequentemente, na experiência acima descrita o envolvimento de RCB in vitro por anticorpo anti-mu mimetiza a estimulação das células B em doentes de lúpus in vivo por anticorpos anti-cadeia dupla de ADN. Os autoanticorpos são produzidos por células de plasma terminalmente diferenciadas que são derivadas de células B narves ou memória. Além disso, as células B podem ter outros efeitos na patologia autoimune, como células apresentando antigénio (CAAs) que podem interagir com e estimular células T auxiliares, estimulando mais o ciclo de resposta imune anti próprio. Dada a expressão de CD19 na maioria da linhagem de células B, variando desde pré-B para células plasmáticas, os anticorpos desta invenção pode ter grande utilidade para o tratamento de doenças autoimunes. Exemplos dessas doenças autoimunes incluem, mas não são limitados a, artrite reumatóide (RA), sistema de lúpus eritematóide (SLE ou lúpus), esclerose múltipla, Sindrome de Sjogren, e púrpura trombocitopénica idiopática (PTI). 173 0 exemplo corrente demonstra que os anticorpos anti-CD19 da invenção podem inibir substancialmente a proliferação das células B num modo dependente de dose, indicando que podem inibir a ativação das células B estimuladas por antigénio. A ativação das células B pelo antigénio pode também iniciar o processo de comutação de classe e, em última análise, a diferenciação terminal em células plasmáticas secretoras de anticorpos. Os anticorpos desta invenção são portanto capazes de inibirem estes processos através de um mecanismo adicional de ação que não requer células efetoras. É esperado que esta inibição tenha impacto benéfico na doença autoimune impedindo a diferenciação terminal das populações de células B naives e de memória, prevenindo assim a diferenciação das células plasmáticas secretoras de auto-anticorpos. Também é possivel que aspetos adicionais da biologia das células B tais como apresentação de antigénio seja afetada pelos anticorpos anti-CD19. »IgGÍ Glmfss»*} aHeiype pEQ Í8 AS1XG3»SVFÍ»LÁI*SSKSTSQí:íTAAljfâa..VKDYF£>'ÊÍ*VTVSWHSOALTCGVflTF?À

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F.ESQYNSTYRVVSVLTVLH.QDWLNGjCEYKCKVSI^fKALFAFIEKTISKAKGQFSB^QVYT LFFSIG>EiyTKPQ¥SETCLYKGFYFSD3AVETOÉNCK^BFn^YKTTFFVIl>SDesiyíAfSKÍy TVIMSRWQ^MVI^CSYMeiGOlNeYTQSCSLSLSPGK: 174 > IgGI Glm(f) allotype (SEQ ID NO:82)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKJDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA

VLQSSGLYSLSSWTVPSSSIvGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP

ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMÍSRTPEVTCWVOVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRWSVLTVIJHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSREEVfTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPElNÍNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL

TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > IgGI Glm(a,f) allotype (SEQ ID NO:83)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA vlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpap

ELLGGPSVFLFPPK.PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK.GQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL ivdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk > JgG2 G2m(n+) allotype (SEQ ID NO:84)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG PSVFLFPPKPKDTLMÍSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RW QQGNVF S CS VMH E ALHNH YTQKS LSLSP GK > IgG2 G2m(n-) allotype (SEQ ID NO:85)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV

LQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG

PSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQF

NSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKT1SKTKGQPREPQVYTLPPSRE

EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK. 175 > 4G7 Hl Hybrid S239D/I332E (SEQID NO:86)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWÍGYINPY

NDGTKYNEKFQGRVT1SSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGSRVFDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPÁVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPICSCDKTHTCPP

CPAPELLGGPDWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF

LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNFIYTQKSLSLSPGK > 4G7 H1.52 Hybrid S239D/I332E (SEQ II) NO:87)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY

NDGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCA.RGTYYYGTRVFDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTvSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNIIKPSNTiCVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEYQFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVA/IIQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEVí/ESNGQPEInTSÍYKTTPPMLDSDGSFF

LY SKLTVDKSRW QQGNYFSC S VMHEA LHNIíYT QKS LSLSPGK > 4G7 111.78 Hybrid S239D/I332E (SEQ I» NO:8§)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEW1GYINPY NAGTKYNEKFQGRVTISSDKSlSTAYMELSSLRSEDTAjVTfYCARGTYYYGSRVFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPÁPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK-EYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP QVATLPPSREEMTKHQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALIiNHYTQKS LSLSPGK 176 > 4G7 Hl.191 Hybrid S239D/I332E (SEQ ID NO-.89)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEW1GYINPY NDGTEYNEKFQGRVTISSDKSÍSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVPDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WN SGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKT1SKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALI-INHYTQKSLSLSPGK > 4G7 Hl.192 Hybrid S239D/1332E (SEQ ID NO:90) EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGPKYNEKFQGRVTISSDK-SISTAYMELSSFRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQS S GLYSLSS V VT\7PS SSLGTQTYTCN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK . , > 4G7 H1.196 Hybrid S239D/I332E (SEQ ID NO:91)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY NDGPKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTSVFDYWG QGTLVTVSSASTK.GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSSLSSWTVPSSSLGTQITICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPE\TCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRW SVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APEEKTISKTKGQPREP QWTLPPSREEMTKNQYSLTCLVKGFYPSDÍAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LY SKLT VDKSR W QQGNWSCS VMHE ALHNH YT QKS LS LSPGK 177 > 4G7 Η 1.201 Hybrid S239D/I332E (SEQ Π) NO:92)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWYRQAPGKGLEWIGYINPY NSGTKYhffiKFQGRVTISSDKSÍSTÀYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLY SLSS WT V? S S SLGTQTYICNVNHKP SNTK VDKK VEPKS CDKTHT CPP CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA-VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > 4G7 01.202 Hybrid S239D/I332E (SEQ Ϊ1) NO:93)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY

NEGTKYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNIIIG^SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKTKGQPREP

QWTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTIPPMLDSDGSFF

LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > 4G7 H1.203 Hybrid S239D/I332E (SEQ ID NO:94)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY

NSGTEYNEKFQGRVnsSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWGQ

GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC

PAPELLGGPDVFLFPPKEKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK

TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKT1SKTKGQPREPQ

WTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 178 > 4G7 Η1.204 Hybrid S239D/I332E (SEQID NO:95)

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGYTFTSYVMHWVRQAPGKGLEWIGYINPY

NEGTEYNEKFQGRVTISSDKSISTAYMELSSLRSEDTAMYYCARGTYYYGTRVFDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP

CPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNA

KTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEK.TISKTKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDlAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF

LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > 4G7 LI (SEQ IB NO:96)

DÍVMTQSPATLSLSPGER/.TI.SCRSSKSLLNSNGNTYLWFQQKPGQSPQLLIYRM SNLASGVPDRFSGSGSGTEFTLTÍSSLEPEDFAVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLEIKRTVAA PSVFÍFPP SDEQLKS G'.r AS VV CLLNNFYPREAKVQWK VDNAI.QSGNSQESVTEQBSKI)S TYSI..SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 L1.26 (SEQ ID NO:97)

Dl VMT QS P ATLSLSP GERATLSCRS S KSLQNSNGNTYLYWF QQKPGQSP QLLIY R MSNLASGWDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLS STLTLSKÀDYEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC > 4G7 L1.32 (SEQ ID NQ:98)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLENVNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR MSNLASGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLEIKRTV AAPSVFÍFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTY S LS STLTLSKÀDYEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC > 4G7 L1.64 (SEQ II) NO:99)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLLNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRM SNLASGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVAA PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TY SLS STLTLSKÀDYEKHKVY ACEVTHQGLS SP VTKSFNRGEC 179 > 4G7 L1.68 (SEQID N0:100)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLLNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRM

SNLASGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPNTFGAGTKLEIKRTVA

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKYYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7.L1.96 (SEQ ID NO: 101)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLLNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYRM

SNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTÍSSLEPEDFAVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLEIKRTVAA

PSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW-KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS

TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 LI.145 (SEQ ID NO:102)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR

MSNLASGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAWYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVA APSVF1FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD ST Y SLSS TLTLSKADYEKHKVY ACE VTHQGLS SP VTKS FNRGEC > 4G7 L1.148 (SEQ ID NO:103)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPNTFGAGTKLEIKRTV

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 L1.149 (SEQ ID NO:1.04)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNSNGNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR msnlnsgvpdrfsgsgsgteftltisslepedfavyycmqhleypitfgagtkleikrtva

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD ST YS LS STLTLS KAJD Y EKHKVYACE VTHQGLS SP VTKS FNRGEC > 4G7 L1.154 (SEQ ID NO:105) divmtqspatlslspgeratlscrsskslqnvngntylywfqqkpgqspqlliyr

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEFEDFAVYYCMQHLEYPNTFGAGTKLEIKRTV

AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 180 > 4G7 L1.155 (SEQ ID N€):106)

DIVMTQSPATL-SLSPGERATLSCRSSKSLQNVNGMITLYWFQQKPGQSPQLUYR

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGIXLEIKRTVA

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 L1.160 (SEQ ID NO: 107)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNVNANTYLYWFQQKPGQSPQLUYR M SNLN 8GVPDRFS G SGS GTEFTLTIS SI EPEDF A VYY CM QHLEYPITF G AGTKLEIKRT V A APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC >4G7 hí.lM 0ÈQ m ηΟίίβ»)

MSHU^SOYPOItrSGSGSGTBFTíjr©SLBfEÍ>FAVYYCMQHLEYPlTFGAGTKLBmRTVA APSWIFI^SDBQLRSOmsVVCIXMNfYMBAKlVQWICVimAI^SGNSQESVTEQDSKD STYSI^STLTLSK ADYOOilCVY ACE VTÍiQGLS SP VTItSFNRG EC > 4G7 L1.163 (SEQ I» NO:109) DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNANSNTYLYWFQQKPGQSPQLLIYR MSNLNSGWDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPI.TFGAGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 L1.164 (SEQ ID NO:110)

DIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSKSLQNANGNTYLYWFQQK-PGQSPQLLIYR

MSNLNSGVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCMQHLEYPITFGAGTKLEIKRTVA

APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD

STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC > 4G7 VH CDR2 D55A (SEQ ID) NO:111)

YINPYNAGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 T57P (SEQ ID NO:112)

YINPYNDGPKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 K58E (SEQ ID NO:113) 181

YINPYNDGTEYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 D55S (SEQ ID NO:114)

YINPYNSGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 D55E (SEQ ID NO:115)

YINPYNEGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR3 S100T (SEQ ID NO:116)

GTYYYGTRVFDY > 4G7 VH CDR13 RlOOdS (SEQ ID NO:117)

GTYYYGSSVFDY > 4G7 VH CDR3 SlOOcT/RlOOds (SEQ ID NO:118)

GTYYYGTSVFDY > 4G7 VL CDR1 L27cQ (SEQ ID NO:119)

RSSKSLQNSNGNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV (SEQ ID NO:120)

RSSKSLQNVNGNTYLY > 4G7 VL CDR1 S27cV (SEQ ID NO:121)

RSSKSLLNVNGNTYLY > 4G7 VL CDR1G29A (SEQ ID NO: 122)

RSSKSLLNSNANTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV/G29A (SEQ ID NO:123)

RSSKSLQNVNANTYLY > 4G7 VL CDR1 S27eA (SEQ ID NO:124)

RSSKSLLNANGNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29A (SEQ ID NO:125)

RSSKSLQNANANTYLY > 4G7 VL CDR1 G29S (SEQ ID NO:126)

RSSKSLLNSNSNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29S(SEQ ID NO:127)

RSSKSLQNANSNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA (SEQ ID NO:128)

RSSKSLQNANGNTYLY > 4G7 VL CDR2 A55N (SEQ ID NO:129)

RMSNLNS 182 182 > 4G7 VL CDR3 MQHLEYPIT > 4G7 VL CDR3 MQHLEYPNT > 4G7 VH CDR1 > 4G7 VH CDR2 > 4G7 VH CDR3 > 4G7 VL CDR1 > 4G7 VL CDR2 > 4G7 VL CDR3 > HD37 VH CDR1 > HD37 VH CDR2 > HD37 VH CDR3 > HD37 VL CDR1 > HD37 VL CDR2 > HD37 VL CDR3 F96I (SEQ ID NO:130) F96N (SEQ ID NO:131)

(SEQ ID NO:132): SYVMH (SEQ ID NO:133): YINPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO :134): GTYYYGSRVFDY (SEQ ID NO:135): RSSKSLLNSNGNTYLY (SEQ ID NO:136): RMSNLAS (SEQ ID NO:137): MQHLEYPFT (SEQ ID NO:138): SYWMN (SEQ ID NO:139): QIWPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO:140): RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID NO:141): KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID NO:142): DASNLVS (SEQ ID NO:143): QQSTEDPWT

Além disso, a presente descrição relaciona-se com os seguintes itens: 1. Um anticorpo que se liga a CD19, o referido anticorpo compreendendo a cadeia pesada e/ou a cadeia leve, a referida cadeia pesada com uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NO: 132 e 138, a CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs:111-115 e a CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionadaa partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs:116-118; e a referida cadeia leve com uma CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 119-128, a CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 12 9, e a CDR3 compreendendo uma sequência de 183 aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOs:130-131. 2. Um anticorpo de acordo com o item 1, em que o referido anticorpo compreende uma sequência variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 13-16, 20-23, e 27-44, e/ou uma sequência de cadeia leve variável selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 17-19, 24-26, e 45-79. 3. Um anticorpo de acordo com o item 2, em que o referido anticorpo compreende uma sequência variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 86-95, e/ou uma sequência de cadeia leve variável selecionada a partir do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 96-110. 4. Um anticorpo de acordo com o item 1, em que o referido anticorpo se liga com afinidade aumentada ao Recetor de FcYRIIIa ou aumenta função efetora CMCA em comparação com o anticorpo parente. 5. Um anticorpo de acordo com o item 4, em que a referida modificação é um aminoácido. 6. 0 anticorpo de acordo com o item 5 , em que a referida modificação de aminoácido é numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 184 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, e 337, em que a numeração é de acordo com o índice EU. 7. Um antrcorpo de acordo com o rtem 5, em que a referrda modificação de aminoácido é uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235Y, 2 3 6A, 236D, 236E, 236F, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237R, 2 37S, 237T, 237V, 237W, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 2 4 0A, 2401, 2 4 0M, 240T, 241D, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 2 60D, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64R, 264S, 2 64T, 2 64W, 2 64Y, 2 65L, 2 65M, 2 65N, 2 65P, 2 65Q, 2 65Y, 2 6 6A, 2661, 2 6 6M, 266T, 2 67K, 2 67L, 2 67M, 2 67N, 2 67P, 2 67Y, 2 68D, 2 68E, 2 68F, 2 68G, 2 68Q, 2 68R, 2 68T, 2 68V, 2 68W, 2 69L, 2 69M, 2 69N, 2 69P, 2 69R, 27 0F, 2 7 0G, 2 7 OH, 2701, 270L, de 221 K, 221 Y, 222E, 222Y, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 2 3 0A, 2 3 0E, 2 3 0G, 230Y, 2 31E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 235E, 235F, 235G, 235H, 235L 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 2 41E, 241L, 2 4 IR, 2 41S, 241W, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 2 60E, 2 60H, 2 60Y, 2 62A, 2 62E, 2 63M, 2 63T, 2 64A, 2 64D, 2 64E, 2 64L, 2 64M, 2 64N, 2 64P, 2 64Q, 2 65F, 265G, 265H, 2651, 2 65K, 2 65R, 265S, 265T, 2 65V, 2 65W, 2 67D, 2 67E, 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67Q, 2 67R, 2 67T, 2 67V, 2 67W, 2681, 2 68K, 2 68L, 2 68M, 2 68P, 269F, 2 69G, 269H, 2691, 269K, 269S, 2 69T, 2 69V, 2 69W, 2 69Y, 2 7 0M, 270P, 270Q, 2 7 0R, 2 7 0 S, 185 27 0Τ, 270W, 27 0Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 2 71G, 2 71H, 2711 271Κ, 271L, 2 71M, 2 7 IN, 271Q, 271R, 2 71S, 271T, 2 7IV, 271W 271Υ, 272D, 272F, 272G, 272H, 2721, 272K, 272L, 272M, 272P 272R, 2 72 S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 2731, 274D, 274E, 274F 274G, 2 7 4H, 2741, 274L, 27 4M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 2761 276L, 27 6M, 27 6P, 276R, 27 6S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 27 8D 278Ε, 278G, 278H, 2781, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 27 8Q 278R, 278S, 278T, 27 8V, 278W, 2 8 OG, 2 8 OK, 2 8 OL, 280P, 2 8 OW 2 81D, 281 E, 2 81K, 2 8 IN, 281P, 281Q, 281 Y, 282E, 2 82G 2 82K, 282P, 2 82Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y 2 90D, 2 90H, 2 90L, 2 90N, 2 90W, 2 91D, 291E, 2 91G, 2 91H, 2911 291Q, 2 91T, 2 92D, 2 92E, 2 92T, 2 92Y, 2 93F, 2 93G, 2 93H, 2931 2 93L, 2 93M, 2 93N, 2 93P, 2 93R, 293S, 2 93T, 2 93V, 293W, 2 93Y 2 94F, 2 94G, 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 2 94M, 2 94P, 2 94R, 2 94S 2 94T, 2 94V, 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 95E, 2 95F, 2 95G, 2 95H, 2951 2 95M, 2 95N, 2 95P, 2 95R, 295S, 2 95T, 2 95V, 295W, 2 95Y, 2 96A 2 96D, 2 96E, 2 96G, 2 96H, 2961, 2 96K, 2 96L, 2 96M, 2 96N, 2 96Q 2 96R, 296S, 2 96T, 2 96V, 2 97D, 2 97E, 2 97F, 2 97G, 2 97H, 2971 2 97K, 2 97L, 2 97M, 2 97P, 297Q, 2 97R, 2 97S, 2 97T, 2 97V, 297W 2 97 Y, 298A, 2 98D, 2 98E, 2 98F, 2 98H, 2981, 2 98K, 2 98M, 2 98N 2 98Q, 2 98R, 2 98T, 2 98W, 2 98Y, 299A, 2 99D, 2 99E, 2 99F, 2 99G 2 99H, 2991, 2 99K, 2 99L, 2 99M, 2 99N, 2 99P, 2 99Q, 2 99K, 2 99S 2 99V, 299W, 2 99Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q 318R, 318Y, 32 0D, 320F, 32 OG, 32 OH, 3201, 320L, 32 ON, 320P 320S, 320T, 32 OV, 32 OW, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 3221 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 3231, 324D, 324F, 324G 324H, 3241, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y 325A, 325D, 325E, 325F, 32 5G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 3261 186 32 6L, 32 6P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 32 9G, 32 9H, 3291, 329K, 329L, 32 9M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 32 9T, 32 9V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 3341, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 3351, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337Ε, 337Η, e 337N, em que a numeração é de acordo com o índice EU. 8. Um anticorpo de acordo com o item 5, em que a referida modificação de aminoácido é numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234 , 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 245, 246, 247, 249 , 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 2 66, 267, 268, 269, 270 , 271, 272, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285 , 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299 , 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 324 , 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 , e 337 • 9. Um anticorpo de acordo com L O item 5, - em que a referida modificação de aminoácido é uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste de 221K, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 187 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 235D, 235F, 235G, 235H, 2351, 235K, 235M, 235N, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Υ, 236D, 236F, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236Ρ, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 2 3 9E, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239L, 239Μ, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 23 9V, 239W, 239Y, 240M, 240Τ, 241D, 2 4 ΙΕ, 2 4 IR, 241S, 2 41W, 2 41Y, 243E, 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 245A, 246D, 246H, 245Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 2 60D, 2 60E, 2 60H, 2 60Υ, 262A, 2 62E, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 64D, 2 64E, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64L, 2 64M, 2 64N, 264Ρ, 2 64Q, 2 64R, 264S, 2 64T, 2 64W, 2 64Y, 2 65F, 2 65G, 2 65H, 2651, 2 65K, 2 65L, 2 65M, 2 65P, 2 65Q, 2 65R, 2 65S, 2 65T, 2 65V, 2 65W, 2 65Y, 2 6 6A, 2661, 2 66M, 2 66T, 2 67D, 2 67E, 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67K, 2 67L, 2 67M, 267N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R, 2 67V, 2 67W, 2 67Υ, 2 68F, 2 68G, 2681; 268M, 2 68P, 2 68T, 2 68V, 2 68W, 2 69F, 2 69G, 2 69H, 2691, 2 69L, 2 69M, 2 69N, 2 69P, 2 69R, 269S, 2 69T, 2 69V, 269W, 2 69Y, 27 0F, 27 0G, 27 0H, 2701, 27 0L, 27 0M, 27 0P, 270Q, 27 0R, 270S, 27 0T, 27 0W, 27 0Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 2711, 271K, 271L, 271M :, 271N , 271Q , 271R :, 271 S, 277T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 2721, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 274D, 274E, 2 74F, 274G, 274H, 2741, 274L, 274M, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 2761, 276L, 27 6M, 276P, 276R, 27 6S, 276T, 276V, 276W, 27 8D, 278E, 27 8G, 27 8H, 2781, 27 8K, 278L, 27 8M, 27 8N, 27 8P, 27 8Q, 27 8R, 278S, 27 8T, 27 8V, 27 8W, 280G, 280P, 280W, 281E, 281K, 2 8 IN, 281P, 281Y, 282G, 282P, 2 82Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286G, 286P, 286Y, 288Y, 2 90H, 2 90L, 2 90W, 2 91D, 2 91E, 2 91G, 2 91H, 2 91T, 291Q, 2 91T, 2 92D, 2 92E, 292T, 2 92Y, 2 93F, 2 93G, 2 93H, 2931, 2 93L, 2 93M, 2 93N, 2 93P, 2 93R, 2 93S, 2 93T, 188 2 93W, 2 93Y, 2 94F, 2 94G, 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 2 94M, 2 94P 2 94R, 294S, 2 94T, 2 94V, 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 95F, 2 95G, 2 95H 2951, 2 95M, 2 95N, 2 95P, 2 95R, 295S, 2 95T, 2 95V, 2 95W, 2 95Y 2 96A, 2 96D, 2 96E, 2 96G, 2961, 2 96K, 2 96L, 2 96M, 2 96N, 2 96Q 2 96R, 296S, 2 96T, 296V, 2 97D, 2 97E, 2 97F, 2 97G, 2 97H, 2971 2 97K, 297L, 2 97M, 2 97P, 2 97R, 297S, 2 97T, 2 97V, 2 97W, 2 97Y 2 98E, 2 98F, 2 98H, 2981, 2 98K, 2 98M, 2 98Q, 2 98R, 2 98W, 2 98Y 2 99A, 2 99D, 2 99E, 2 99F, 2 99G, 2 99H, 2991, 2 99K, 2 99L, 2 99M 2 99N, 2 99P, 2 99Q, 2 99R, 299S, 2 99V, 2 99W, 2 99Y, 300A, 300D 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 32 0F, 320G, 320H, 3201 32 0L, 32 0N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F 322G, 322H, 3221, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 324D 324F, 324G, 324H, 3241, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 32 5G, 325H, 3251, 325K 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327Y, 327L 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K 329L, 32 9M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y 330E, 330F, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330W, 330Y 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H 3351, 335L, 335M, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 33 6E 336K, 336Y, 337H, e 337N. 10. O anticorpo do item 5, em que a referida modificação é numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 247, 262, 223, 224, 263, 266, 225, 228, 271, 273, 230, 231, 275, 281, 232, 240, 284, 291, 244, 245, 299, 302, 189 304, 313, 323, 325, 328, 332, 336, em que a numeração de posicionamento é de acordo com o indice EU. 11. O anticorpo do item 5, em que a referida modificação é selecionada a partir do grupo que consiste de 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 2401, 2 4 0M, 240T, 244H, 245A, 247G, 247V, 2 62A, 2 62E, 2 62F, 2621, 2 62T, 2 63A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 6 6A, 2661, 2 66M, 2 66T, 2 7 IA, 271D, 271E, 271F, 2 71G, 271H, 2711, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 2 7 IR, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 2731, 275L, 275W, 2 81D, 281E, 281K, 2 8 IN, 281P, 2 81Q, 2 81Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 2 93E, 2 91G, 2 91H, 2911, 2 91Q, 2 91T, 2 99A, 2 99D, 2 99E, 299F, 2 99G, 2 99H, 2991, 2 99K, 2 99L, 2 99M, 299N, 2 99P, 2 99Q, 2 99R, 299S, 2 99V, 299W, 2 99Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 3231, 325A, 325D, 325E, 325F, 32 5G, 325H, 3251, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, r 332V , 332W, 332Y, 336E, 336K, e 336Y. 12. Um anticorpo de acordo com o item 10, compreendendo adicionalmente uma segunda modificação de aminoácido que é numa posição selecionada a partir do grupo que consiste de 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237; 238. 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 2 62, 263, 264, 265, 266, 261, ,268, 269; 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 33! , 332, 333, 190 334, 335, 336, e 337, em que a numeração é de acordo com o índice EU. 13. Um anticorpo < de acordo com o item 10, em que a referida segunda modificação de aminoáci .do é a substituição selecionada a partir do grupe ' que consiste de 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 2 3 0A, 2 3 0E, 2 3 0G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 2 3 5 G, 235H, 2351, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 2 3 6A, 236D, 236E, 236F, 236H, 2361, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 23 6Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 2371, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 2 4 0A, 2401, 2 4 0M, 240T, 241D, 2 41E, 241L, 2 4 IR, 2 41S, 241W, 24 1Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y , 258H :, 258S, 258Y, 260D, 2 ! 601E, 2 60H, 2 60Y, 2 62A, 2 62E , 2 62F , 2621, 2 62T, 263 A, 2631, 2 63M, 2 63T, 2 64A, 2 64D, 2 64E, 2 64F, 2 64G, 2 64H, 2641, 2 64K, 2 64L, 2 64M, 2 64N, 2 64P, 2 64Q, 2 64R, 264S, 2 64T, 2 64W, 2 64Y, 2 65F, 2 65G, 2 65H, 2651, 2 65K, 2 65L, 2 65M, 2 65N, 2 65P, 2 65Q, 2 65R, 2 65S, 2 65T, 2 65V, 2 65W, 2 65Y, 2 6 6A, 2661, 2 6 6M, 266T, 2 67D, 2 67E, 2 67F, 2 67H, 2671, 2 67K, 2 67L, 2 67M, 2 67N, 2 67P, 2 67Q, 2 67R, 2 67T, 2 67V, 2 67W, 2 67Y, 2 68D, 2 68E, 2 68F, 2 68G, 2681, 2 68K, 2 68L, 2 68M, 2 68P, 2 68Q, 2 68R, 2 68T, 2 68V, 2 68W, 269F, 2 69G, 2 69H, 2691, 2 69K, 2 69L, 2 69M, 2 69N, 2 69P, 2 69R, 269S, 269T, 269V, 269W, 2 69Y, 27 0F, 2 7 0G, 2 7 OH, 2701, 270L, 2 7 0M, 191 270Ρ, 27 0Q, 27 0R, 270S, 27 0T, 271F, 271G, 271H, 2711, 271K, 271S, 271Τ, 271V, 271W, 271Y, 272Κ, 272L, 272M, 272P, 2 72R, 2731, 274D, 274E, 274F, 274G, 274Ρ, 274R, 274T, 274V, 274W, 276F, 276G, 276H, 2761, 276L, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278Μ, 278Ν, 27 8P, 278Q, 27 8R, 2 8 ΟΚ, 2 8 OL, 280P, 2 8 OW, 2 81D, 281Υ, 282E, 2 82G, 2 82K, 282P, 283Ρ, 283R, 283Y, 284D, 284E, 285D, 2 85E, 285K, 28SQ, 285W, 288D, 288E, 288Y, 2 90D, 2 90H, 2 91G, 2 91H, 2911, 291Q, 2 91T, 2 93G, 2 93H, 2931, 2 93L, 2 93M, 2 93V, 2 93W, 2 93Y, 2 94F, 2 94G, 2 94Ρ, 2 94R, 294S, 2 94T, 2 94V, 2 95G, 2 95H, 2951, 2 95M, 295N, 2 95W, 2 95Y, 2 9 6A, 2 96D, 2 96E, 296Μ, 296N, 2 9 6Q, 2 96R, 296S, 2 97G, 2 97H, 2971, 2 97K, 2 97L, 2 97Τ, 2 97V, 2 97W, 2 97 Y, 298A, 2 98Κ, 2 98M, 2 98N, 2 98Q, 2 98R, 299Ε, 299F, 2 99G, 299H, 2991, 2 99Q, 2 99R, 2995, 299V, 299W, 3 0 OH, 300K, 300M, 3 0 ON, 300P, 300W, 301D, 301 E, 30 1H, 3 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 3201, 32 OL, 32 ON, 32 OP, 320S, 322F, 322G, 322H, 3221, 322P, 3231, 324D, 324F, 324G, 324H, 324Τ, 324V, 324W, 324Y, 325A, 3251, 325K, 325L, 325M, 325P,

270W, 27 0Y, 271A, 271D, 271E, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R 272D, 272F, 272G, 272H, 2721 2 72 S, 272T, 272V, 272W, 2 72 Y 274H, 274T, 274L, 274M, 274N 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E 276M, 276P, 276R, 276S, 276T 278G, 278H, 2781, 278K, 27 8L 278S, 27 8T, 278V, 27 8W, 2 8 OG 2 81E, 2 81K, 2 8 IN, 281P, 2 81Q 2 82Y, 283G, 283H, 283K, 283L 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y 2 90L, 2 90N, 2 90W, 2 91D, 2 91E 2 92D, 2 92E, 2 92T, 2 92Y, 2 93F 2 93N, 2 93P, 2 93R, 293S, 2 93T 2 94H, 2941, 2 94K, 2 94L, 2 94M 2 94W, 2 94Y, 2 95D, 2 95E, 2 95F 2 95P, 2 95R, 295S, 2 95T, 2 95V 2 96G, 2 96H, 2961, 2 96K, 2 96L 2 96T, 2 96V, 2 97D, 2 97E, 2 97F 2 97M, 2 97P, 297Q, 2 97R, 297S 2 98D, 2 98E, 2 98F, 2 98H, 2981 2 98T, 298W, 2 98Y, 2 99A, 2 99D 2 99K, 2 99L, 2 99M, 2 99N, 2 99P 2 99Y, 300A, 300D, 300E, 300G 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V 1Y, 3021, 303D, 303E, 303Y 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E 318Y, 32 OD, 32 OF, 32 OG, 32 OH 320T, 32 OV, 32 OW, 32 OY, 322D 322S, 322T, 322 V, 322W, 322Y 3241, 324L, 324M, 324P, 324R 325D, 325E, 325F, 325G, 325H 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V 192 325W, 325Y, 326E, 3261, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 3281, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329L, 32 9M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 3311, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 3341, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 3351, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K , 336Y, 337E, 337H, e 337N, em que a numeração é de acordo com o índice EU. 14. Um anticorpo de acordo com o item 5, em que a modificação aminoácido é 332E. 15. Um anticorpo de acordo com o item 14, compreendendo adicionalmente uma segunda modificação de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de: 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y, e 330L. 16. Um anticorpo de acordo com o item 15, em que a segunda modificação aminoácido é 239D. 17. Um anticorpo de acordo com o item 4, em que a referida modificação é uma modificação de glicoforma que reduz o nível de fucose em relação ao anticorpo parente. 18. Uma composição compreendendo a pluralidade dos anticorpos glicosilados, em que cerca de 80-100% de anticorpo glicosilado na composição compreende a estrutura 193 de hidrato de carbono de núcleo maduro que não possui fucose. 19. Um anticorpo de acordo com o item 1, em que o referido anticorpo reduz adicionalmente a ligação a FcYRIIb em comparação com o referido anticorpo anti-CD 19 parente. 20. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo de um dos itens 1-17. 21. Um método para tratar uma doença relacionada com as células B, em que o referido método compreende a administração de um anticorpo de acordo com o item 1. 22. Um método do item 21, em que a referida doença é selecionada a partir do grupo que consiste de: linfornas não Hodgkin (LNH), leucemia linfocitica crónica (LLC), célula B leucemia linfoblástica aguda/linforna (B-LLA), e células de linfoma do manto (LCM). 23. Um método do item 21, em que a referida doença é uma doença autoimune. 24. O método do item 23, em que a referida doença autoimune é selecionada a partir do grupo que consiste de: artrite reumatóide (RA), sistema de lúpus eritematóide (SLE ou lúpus), esclerose múltipla, Sindrome de Sjogren, e púrpura trombocitopénia idiopática (PTI). 25. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com o item 1 e um transportador farmaceuticamente aceitável. 194 LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> XENCOR, INC. <120> ANTICORPOS OTIMIZADOS QUE VISAM CD 19 <130> T2329 EP/1 S3 <140> PCT/US2007/07 5932 <141> 2007-08-14 <150> US 60/822,362 <151> 2006-08-14 <160> 146 <170> Patentln version 3.5 <210> 1

<211> 556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 195

Met Pro N O •ti H O Arg Leu Leu Phe .Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Vai Arg I? iro Glu Glu Pro Leu. Vai Vai Lys Vai Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn. Ala Vai Leu. Gin Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gin 35 4 0 45 Gin Leu Thr Trp y fcf** 'w·. Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro pHip» JL- 1 Á Leu Lys Leu 50' 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly lie His Met Arg Pro Leu. Ala T 1 J5> ^ 65 70 Q A o U Trp Leu Phe I Xs Phe Asn Vai G gjf y w “ «L Gin Gin Met Gly Gly Phe Tyr Leu JK f» 85 90 95 Cys Gin. Pro Gly Pro Pro Ser ¢51 Lys Al a T irp Gin Pro Gly Trp pn V Á Sm 100 105 110 Vai Asn Vai Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Vai Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 196

Ser Ser Pro Ser 145 Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Vai Trp Ala 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro 165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gin Ser Leu Ser Gin Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Vai Pro Pro Asp Ser Vai Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu 210 Ser Trp Thr His Vai His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 215 220 Leu Leu Ser Leu 225 Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 230 235 240 Vai Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gin Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr 260 Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Vai Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 275 280 285

Gly Trp Lys Vai 290 Ser Ala Vai Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 295 300 Cys Ser Leu Vai 305 Gly Ile Leu His Leu Gin Arg Ala Leu Vai Leu Arg 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Vai 325 330 335 Thr Pro Pro Pro 340 Gly Ser Gly Pro Gin Asn Gin Tyr Gly Asn Vai Leu 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gin Arg Trp Ala 355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp 370 375 380

Vai Gin Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Vai Gly 197 385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu 405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gin Asp Gin Leu 420 425 430

Ser Gin Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly 435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu 450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gin Pro Vai Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser 465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly 485 490 495

Ser Gin Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gin 500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gin Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala^ 515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp 530 535 540 α

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg 545 550 555 198

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 199

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 200 145 150 155 160

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai. Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 '295 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens 201 <400>4

Ala Ser"Thr Lys 1

Glv Pro Sér Vai Phe Pro Leu Ala 5 10

Pro Cys Ser Arg 15

Ser Thr

Ser Glu 20

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 25

Leu Vai

Lys Asp Tyr 30 202

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser 35 40

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 50 55

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 65 70

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 75 80

Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys 85

Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 90 95

Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai 100

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 105 110

Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe 115 120

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 130 135

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 140

Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 145 150

Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 155 160

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 165

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 170 175

Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai 180

Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 195 200

Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 210 215

Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 220

Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 235 240

Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 245.....

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile " 250 - " 255

Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 260

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 265 270 203

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285

Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 5 <211> 377

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 204

Ala $00 Thr lyo Oly FAO lar Vai Fhá Fr o hoo Ais. Fro Cys Sor Ary •í 0 10 1$ Sor Thr SOO 11 y oiy Thr Alá Alá too Oiy Cyo LáU Vai hys AOp Tyr Fa« Frá 01 y 20 Fro Vâ! Thr Wl Sor S,y^5: Trp Asó Sor 01 y Ais 3:0 loo Thr Sor 3S 40 4S Óly Vál lio Thr fixa !» Alá ¥oi Lás Sis ÍOT sor Tly hOA Tyr sor $0 ss 00 Too Oáo Ias: Vai Vai Thr Vál Iro Sár Sor Sor Too Ol y Thr Oro Thr OS 20 os 00 Tyr Thr COO Aon OAl Aóh Eis hyó Olá Sor Thr lys Tsl Aso Lyo â$ 00 OS Scy VíA Olo hou W® Thr Fro hoy 01 y Asp Thr Thr lis Thr Oyo Fro 100 TOS 110 Alf í-v-^íí: P ro Aio Fro hys Sõr Cyn & A: S<\ •r>-A>:·· Th >: Fro Fro Fro €ys Fro Ary 115 100 12$ Oyo fro Slu ISO hyo Sor Cys Aso Thr Fro Fro fro Cys fro Aro Cyr 130 13S 140 2 ?: O OTo fro Tyo Sor €yo Ayp Thr Oro Oro fro Cys fro Ar p Oys fro

I4S ISO ISO ISO 205 205 Pro Lys 175

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 165 170

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 180 185 190

Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Lys Trp Tyr 195 200 205

Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220

Gin Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His 225 230 235 240

Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys 245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin 260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285

Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300

Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Ile 340 345 350

Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gin 355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu- Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 6 <211> 327 206

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 207

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 1 5 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 20 Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 25 30 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser 35 40 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 50 55 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 65 70 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 75 80 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys 85 Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 90 95 Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 100 Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai 115 120 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 130 135 Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 140 Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu 145 150 Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 155 _ 160 Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 165 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 195 200 Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 208 225 230 235 240

Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 245

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 250 255

Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 260

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 265 270

Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 275 280

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 285

Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg 290 295

Trp Gin Glu Gly Asn Vai Phe Ser 300

Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 305 310

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 7 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Constante híbrida de cadeia pesada(CH) <400> 7 209

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 1 5

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 20

Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser 35 40

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 50 55

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 65 ' ~ 70

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 75 80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys 85

Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 90 95 210

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 130 135 Thr Pro Glu Vai Thr Cys 140 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro 145 150 Glu Vai Gin Phe Asn Trp 155 160 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala 165 170 Lys Thr Lys Pro Arg Glu 175 Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai 180 185 Ser Vai Leu Thr Vai Vai 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 195 200 Lys Cys Lys Vai Ser Asn 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 210 215 Ile Ser Lys Thr Lys Gly 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu 225 230 Pro Pro Ser Arg Glu Glu 235 240 Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 245 250 Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 275 280 Ser Asp Gly Ser Phe Phe 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala 305 310 Leu His Asn His Tyr Thr 315 320 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 8 211

<211> 330 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Constante de cadeia pesada híbrida (CH) com substituições 239De332E <400> 8 212

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 50

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp 145 150 155 150

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai 180 185 - 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 195 200 205 213

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu 210 215

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 225 230

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 245

Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 260

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 275 280

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp 290 295

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 305 310

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 315 320

Gly Lys 330

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 214

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly 1 5

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala 20

Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys 35 40

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser 65 70 )

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser 85

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser 115 120 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 45 Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60 Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser 215

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Pro Ser Ile Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Ser Vai Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 ' '105 110 <210> 11 <211 > 124

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 216 35 40 45

Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly 50 55

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 65 70

Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser 85

Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai 100

Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 105 110

Thr Vai Ser Ser

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai 115 120 <210> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Asp Ile Leu Leu Thr Gin Thr Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15

Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Ile Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80

Pro Vai Glu Lys Vai Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys"Leu Glu Ile Lys 100 105 110 217

<210> 13 <211 > 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> Η1 4G7 <400> 13 Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr I-le Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H2 4G7 <400> 14 218

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ser Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr ..........- - 20..... 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Ser Leu 50 55 60

Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 GÍn Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H3 4G7 <400> 15 219 219 Pro Gly Arg 15

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin 15 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly.Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu. Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala A_rg Gly Thr .Tyr .Tyr . Tyr -Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Ser Ser 120

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 115

<210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H4 4G7 <400> 16 220

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly 1 5

Pro Glu Vai Lys Lys Pro Gly Thr 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Vai Trp Vai 45

Ser Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Ser Leu 60

Lys Ser Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120

<210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L1 4G7 <400> 17

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1....... 5 - 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 221

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L2 4G7 <400> 18

Ser Ala Ser Vai Gly 15

Gin Ser Pro Ser Ser Leu 10

Asp Ile Vai Met Thr 1 5

Ser Cys Arg Ser Ser Lys 25

Asp Arg Vai Thr Ile 20

Ser Leu Leu Asn Ser 30

Leu Tyr Trp Phe Gin Gin 40

Asn Gly Asn Thr Tyr 35

Lys Pro Gly Gin Ser 45

Tyr Arg Met Ser Asn Leu 55

Pro Gin Leu Leu Ile 50

Ala Ser Gly Vai Pro 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu 70 75

Asp Arg Phe Ser Gly 65

Phe Thr Leu Thr Ile 80

Ser Ser Leu Gin —Leu Glu Tyr Pro 100

Pro Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110 222

<210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L3 4G7 <400> 19

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Vai Ser Pro Gly 15 10 15

Leu Leu Asn Ser 30

Pro Gly Gin Ser 45

Ser Gly Vai Pro

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 20 25

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gin Lys 35 40

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20

<211> 124 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H1 HD37 <400> 20 223

Thr Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile - .....35 - 40 45 Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Gin Asp Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 21

<211> 124 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Η2 HD37 <400> 21 224

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Glu Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Met 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly 50 55

Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 60

Lys Ser Arg Vai Thr Ile Thr Ala 65 70

Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala" Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ala 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin G.ly Thr L.eu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 22

<211> 124 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H3 HD37 <400> 22 225 225 Gin Vai Gin Leu 1

Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 45

Gly Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly 50 55

Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Ala Leu 60

Lys Ser Arg Vai Thr Ile Thr Ala 65 70

Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Phe Cys 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai 100

Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 105 110

Thr Vai Ser Ser

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai 115 120 <210> 23

<211> 124 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> H4 HD37 <400> 23

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr ... . 20 - - 25 30

Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 226

Ala Gin Ile Trp 50 Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Vai 55 60 Lys Gly Arg Phe 65 Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu 100 Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 105 110 Tyr Trp Gly Gin 115 <210> 24 <211> 111 Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 120

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L1 HD37 <400> 24

Asp Ile Leu Leu 1 Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp 25 30 Gly Asp Ser Tyr 35 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 40 45 Lys Leu Leu Ile 50 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser Gly Ile Pro Pro 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp 100 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110 227 <210> 25

<211> 111 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L2 HD37 <400> 25

Asp Ile Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80

Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> L3 HD37 <400> 26 228

Asp Ile Leu Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp 20 25 30 . Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro -35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 Η1.109 <400> 27 229

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 ' 110

Ser

Gin Gly Thr .Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 28

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.113 <400> 28 230

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly His Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 H1.144 <400> 29

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile - 35 · — 40 - - ---- 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 231

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Ser Arg Vai Phe Asn Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 30

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.146 <400> 30

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Ser Arg Vai Phe His Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gin Gly. ..Thr. Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 210> 31 232

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H 1.147 <400> 31

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met Hís Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Glu Lys Phe

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Ser Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 233

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Ser Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.191 <400> 32

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr . _ .. - 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 234

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 33 <211> 121

<212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 H 1.192 <400 33

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210 34 <211> 121 235

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.196 <400> 34

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 35 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H 1.199 <400> 35

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 _ ......... „5. - · - 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 236

Val Met Hís Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.201 <400> 36

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met.Glu Leu Ser Ser-Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 237

<210> 37 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 Η1.202 <400> 37

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 HO

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.203 <400> 38

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly15 10 15 238 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 20 Vai Met His Trp Vai Arg Gin 35 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 50 55 Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85 Al a Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr 100 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 115 Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser 1 5 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 20 Vai Met His Trp Vai Arg Gin 35 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 50 55 Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr 100 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60 .

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser <210> 39 115 239

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H 1.204 <400> 39

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser 1 5

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 20

Vai Met His Trp Vai Arg Gin 35

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 50 55

Gin-Gly Arg Vai Thr Ile Ser 65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg 85

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr 100

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45 Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 60 Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai 115

<210> 40 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.52

Ser <400> 40 240

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly 100

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 <210> 41

<211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.60 <400> 41

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45 Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60 Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95 Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser 241

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 H1.62 <400 42

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 _ Gly Tyr, .Ile. Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 242

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.65 <400> 43

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 44 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.78 243 <400> 44

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ala 50 55

Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser 65 70

Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.11 <400> 45

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn-Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 244

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Leu Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 L1.124 <400> 46

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1.5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Trp Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.138 <400> 47 245

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.139 <400> 48

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Àsn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp .Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Giy Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 246

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.141 <400> 49

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.143 <400> 50

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1. - 5 - 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30 247

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.144 <400> 51

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 52 <211> 112 <212> PRT 248 <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.145 <400> 52

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.146 <400> 53

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser -35 --40 -- - 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60 249

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 L1.148 <400 54

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 '5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.149 <400> 55 250

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 56 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.152 <400> 56

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 ... _.. ......— 70 75 8 0

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 251

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.154 <400> 57

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.155 <400> 58 252

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 59 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.160 <400> 59 253 Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser 1 5

Ala Thr 10

Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr 35

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg 50 55

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 70

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp 85

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe — ...100 -· -

<210> 60 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.161 <400> 60

Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 25 30 Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45 Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 60 Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 75 80 Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 90 95 Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 - 110 254

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.162 <400> 61

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 255 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210 62 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 L1.163 <400 62

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30

Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.164 <400> 63 256

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30 As η Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 64 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.17 <400> 64 257

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro 1 5

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20

Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp 35 40

Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met 50 55

Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70

Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe 85

Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 90 95

Leu Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly 100

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110

<210> 65 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.19 <400> 65 258

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 66 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.26 <400> 66

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 259 259 Pro Gin Leu Leu Ile 50

Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 67 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.3 <400> 67

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Gin Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 260 <210> 68

<211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.32 <400> 68

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 69 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.46 <400> 69 261

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser His Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210 70 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.54 <400> 70 262

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Gly Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 .

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 71 <211 > 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.55 <400> 71

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 263

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 72 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.64 <400> 72 264

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly l 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro' Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 73 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.67 <400> 73 265

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Vai Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 74 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.68 <400> 74

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu-Arg-Ala T-hr Leu Ser Cys Arg Ser Ser'Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 2 66

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala 100 105

<210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.8 <400> 75

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Lys Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 76 <211> 112 <212> PRT 267 <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.80 <400> 76

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Phe Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 77 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.9 <400> 77 268

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro--Gln -Leu Leu'“Ile Tyr Arg Met Leu Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.92 <400> 78 269

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 ' 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Leu Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 79 <211> 112 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.96 <400> 79

Asp 1

Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 5 10 15 270

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 80 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Pro

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 115 120 125 271

Lys Pro Lys Asp Thr 130 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 135 140 Vai Vai Vai Asp Vai 145 Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 150 155 160 Tyr Vai Asp Gly Vai 165 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu· 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser 180 Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala 210 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro 225 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr 275 Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu 290 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 295 300 Vai Phe Ser Cys Ser 305 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 310 315 320 Gin Lys Ser Leu Ser 325 <210> 81 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens Leu Ser Pro Gly Lys 330 <400> 81 272

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 -80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95

Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 273 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 82 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95 " Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 274

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys 130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 83 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 275 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 20 25 Leu Vai Lys Asp Tyr 30 . Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 35 40 Gly Ala Leu Thr Ser 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 50 55 Ser Gly Leu Tyr Ser 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 65 70 75 Leu Gly Thr Gin Thr 80 Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn 85 90 Thr Lys Vai Asp Lys 95 Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 100 105 Thr Cys Pro Pro Cys 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 115 120 Phe Leu Phe Pro Pro 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 130 135 Pro Glu Vai Thr Cys 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 165 170 Thr Lys Pro Arg Glu 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 195 200 Cys Lys Vai Ser Asn 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 210 215 Ser Lys Ala Lys Gly 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 225 230 235 Pro Ser Arg Asp Glu 240

Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 276

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lvs Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 84 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 85 90 95

Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro - ..... 100 - ' 105 110

Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 277

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 130 135 Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 140 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 145 150 Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 155 160

Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai 180 Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 195 200 Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 210 215 Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 220 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 235 240 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 245 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 250 255

Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 275 280 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 285

Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 85 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens 315 320 <400> 85

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15 278

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 50 55 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 60 Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 65 70 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 75 80 Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys 85 Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys 90 95 Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Vai 100 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 105 110 Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe 115 120 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 130 135 Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp 140 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 145 150 Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 155 160 Met Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 165 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 170 175 Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai 180 Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 195 200 Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro 205

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Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285

Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

<210> 86 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 H1 Híbrido S239D/I332E <400 86

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 ’ 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 280

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Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asr. Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 290 , 295 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335

Glu Lys- Thr I-le- Ser-Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

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Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400''

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

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Pro Gly Lys 450

<210> 87 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.52 Híbrido S239D/I332E <400> 87

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Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 282

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120

Ser Ma Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp 145 150

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Ser Trp Asn Ser Gly Ma Leu Thr 165

Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ma 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 180

Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200

Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 210 215

Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 220

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Cys Pro Ma Pro Glu Leu Leu Gly 235 240

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Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 285

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Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 305 310

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 315 320 " Lys Glu Tyr Lys Cys Lys''Vai Ser 325

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 340

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Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

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Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255

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Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300

Arg Vai—Vai Ser Vai Leu'Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335 285

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys 450

<210> 89 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 H1.191 Híbrido S239D/I332E <400> 89

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 286

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 130 135 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp 145 150 Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 170 175 Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 210 215 Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 235 240 Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 260 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 265 270 Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn 275 280 Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 305 310

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 315 320 287 287 Lys G1 u Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 325 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 340 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 355 360 Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe 370 375 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 385 390 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 420 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 Pro Gly Lys 450

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 330 335

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 410 415

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 425 430

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<210> 90 <211> 451 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20 Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp 50 55

Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 10 15

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Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60 288

Gin Gly Arg Vai Thr 65 Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95 Ala Arg Gly Thr Tyr 100 Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai 115 Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 120 125 Vai Phe Pro Leu Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu 195 Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr 210 Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 Asp Lys Thr His Thr 225 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235 240 Gly Pro Asp Vai Phe 245 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 265 270 Glu Asp Pro Glu.Vai 275 Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 280 285

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Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys 450

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 290

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240

Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 -Ile Ser Arg Thr PrcGlu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285 291

His Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 295 300 Arg Vai Vai 305 Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350 Tyr Thr Leu 355 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 360 365 Leu Thr Cys 370 Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 375 380 Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 390 395 400 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430 His Glu Ala 435 Pro Gly Lys 450 <210 92 <211> 451 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 440 445

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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 292

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 Gly Leu Glu Trp Ile 45 Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Ser Gly Thr Lys 50 55 Tyr Asn Glu Lys Phe 60 Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser 65 70 75 Ile Ser Thr Ala Tyr 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 85 90 Ala Met Tyr Tyr Cys 95 Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai 100 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser 115 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 Glu Pro Vai Thr Vai 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai 165 170 His Thr Phe Pro Ala 175 Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 Ser Vai Vai Thr Vai 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile 195 200 Cys Asn Vai Asn His 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai 210 215 Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 Pro Glu Leu Leu Gly 240 Gly. Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai 260 265 Vai Asp Vai Ser His 270 293

Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285

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Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 370 375 380

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Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys 450

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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30 Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala 35 40 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85 Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 115 120 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp 145 150 Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 170 175 Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 195 200 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp 210 215 Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Prõ Pro 225 230 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 235 240 Gly Pro Asp Vai Phe Leu Phe Pro 245 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 250 255 295

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Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys 450

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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175

Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 180 185 190

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Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 290 295 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu 325 330 335

Glu Lys Thr Il.e Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 370 375 380

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Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445

Pro Gly Lys . 45.0 . <210> 95 <211> 451 299

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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Vai Met His Trp 35 Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Vai 65 Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr 100 Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr Trp Gly 105 110 Gin Gly Thr Leu 115 Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 120 125

Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys 145 Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Vai Leu Gin Ser 180 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 Pro 'Ser Ser Ser 195 Leu Gly~Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His 200 205 Lys Pro Ser Asn 210 Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 301

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 225 230

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 235 240

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Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe Asn 275 280

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Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai 305 310

Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 325

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 340

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 345 350

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Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser 365

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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 420

Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr —435 ----- 440

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 445

Pro Gly Lys 450 302

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

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Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 —Thr Tyr Ser Leu Ser-Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 305

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arq Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

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Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 306 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

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Glu Arg Ala Thr Leu S er Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pró Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu' Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr 145 Pro Arg Glu Ala Lys 150 Vai Gin Ser Gly Asn Ser Gin 165 Glu Ser Vai Thr Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Thr Leu Lys His Lys 195 Vai Tyr Ala Cys Glu 200 Pro Vai 210 Thr Lys Ser Phe Asn 215 Arg Gly Glu Cys

Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 155 160

Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 170 175

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Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr' Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 309 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 130 135 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai 145 150 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser 165 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys 195 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn 210 215

Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 140

Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 155 160

Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 170 175

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 185 190

Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 205

Gly Glu Cys <210> 101 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.96 <400> 101 310

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 311

<210> 102 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.145 <400> 102

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50...... _ _ 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 312 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 103 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.148 <400> 103 313

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu 15 10 Ser Leu Ser Pro Gly 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys 20 . 25 Ser Leu Gin Asn Ser 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin 35 .................. 40 Lys Pro Gly Gin Ser 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu 65 70 75 Phe Thr Leu Thr Ile 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr 85 90 Tyr Cys Met Gin His 95 Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr 100 105 Lys Leu Glu Ile Lys 110 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe 115 120 Pro Pro Ser Asp Glu 125 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys 130 135 Leu Leu Asn Asn Phe 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 180 185 Lys Ala Asp Tyr Glu 190 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 195 200 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 Gin Gly Leu Ser Ser 205

<210> 104 <211> 219 <212> PRT 314 <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.149 <400> 104

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 -Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arq Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 315

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Hís 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Ile 100 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110 Arg Thr Vai Ala Ala 115 Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala 145 Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin 165 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Vai Thr Lys Ser 210 <210> 105 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.154 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215 <400> 105 316

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tvr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 106 317

<211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.155 <400> 106

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 318 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro 35 40 45 Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser 50 55 60 Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70 75 Leu Thr Ile 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 Met Gin His 95 Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 100 105 Glu Ile Lys 110 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 145 150 155 Ala Leu Gin 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser 165 170 Lys Asp Ser 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 Asp Tyr Glu 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 107 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 319 <223> 4G7 L1.160 <400> 107

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai 20 25 30

Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 108 <211> 219 <212> PRT 320 <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.162 <400> 108

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30 Asn Ala Asn 35 Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45 Pro Gin Leu 50 Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 55 60 Asp Arg Phe 65 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 70 75 80 Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys 130 Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 135 140 Tyr Pro Arg 145 Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys 195 Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 200 205 321

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 109 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 L1.163 <400> 109 322

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30

Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 'Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lvs His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Sln Gly Leu Ser Ser 195 ' “ 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 2lõ 215 <210> 110 323

<211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220 <223> 4G7 L1.164 <400> 110

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Met Gin His 85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 324

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR2 D55A <400> 111

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ala Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR2 T57P <400> 112

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR2 K58E <400> 113 325

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 325 1 5 10 15

Gly

<210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR2 D55S <400> 114

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR2 D55E <400> 115

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly

<210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR3 S100T <400> 116

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Vai Phe Asp Tyr 1 5-------- 10 <210> 117 326

<211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR3 R100dS <400> 117

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Vai Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VH CDR3 S100cT/R100dS <400> 118

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser Vai Phe Asp Tyr 15 10

<210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ <400> 119

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV <400> 120

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 121 <211> 16 <212> PRT 327 <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 S27eV <400> 121

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Vai Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15

<210> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 G29A <400> 122

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV/G29A <400> 123

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Vai Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 124 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 S27eA <400> 124

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial 328 <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29A <400> 125

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 G29S <400> 126

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29S <400> 127

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala Asn Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15

<210> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA <400> 128

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Gin Asn Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 '10 15

<210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> 4G7 VL CDR2 A55N 329 <400> 129

Arg Met Ser Asn Leu Asn Ser 1 5

<210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR3 F96I <400> 130

Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Ile Thr 1 5

<210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> 4G7 VL CDR3 F96N <400> 131

Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Asn Thr 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132

Ser Tyr Vai Met His 1 5 <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Gly <210> 134 <211> 12 330 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 134

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Vai Phe Asp Tyr 15 10 <210> 135 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 135

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 15 10 15 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 137

Met Gin His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400 138

Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 139 331

Gin Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15 .Gly—........ - <210> 140 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140

Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10 15 <210> 141 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141

Lys Ala Ser Gin Ser Vai Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn 15 10 15 <210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 142

Asp Ala Ser Asn Leu Vai Ser 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 143

Gin Gin Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5

<210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Ligante Péptido <400> 144 332 <210> 145 <211> 5 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Ligante Péptido <400> 145 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 146 <211> 4

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Ligante Péptido <400> 146 Gly Gly Gly Ser 1

Claims

REIVINDICAÇÕES Um anticorpo que se liga a CDR19, o referido anticorpo compreendendo uma cadeia leve SEQ ID NO: 106, e uma cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 87. Uma composição compreendendo uma pluralidade de anticorpos glicosilados de acordo com a reivindicação 1, em que cerca de 80-100% do anticorpo glicosilado na composição compreende a estrutura de hidrato de carbono de núcleo maduro que não possui fucose. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou uma composição de acordo com a reivindicação 2, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Um ácido nucleico que codifica a sequência de cadeia pesada e a sequência de cadeia leve de acordo com a reivindicação 1. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 2-3 para uso no tratamento uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de linfomas não Hodgkin (LNH), leucemia linfocitica crónica (LLC), leucemia linfoblástica aguda das células B /linfoma (B-LLA), e linfoma das células do manto (LCM).