BR122021010656B1 - Anticorpo anti-tnf e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

O presente pedido se refere a uma região Fc variante compreendendo pelo menos uma modificação relativa a uma região Fc humana tipo selvagem em que a modificação é selecionada do grupo consistindo em 434S, 252Y/428L, 252Y/434S e 428L/434S, e a numeração é de acordo com o índice EU.

Description

(Dividido do PI 0821604-5, depositado em 22/12/2008)

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119(e) para USSN 61/016.793 arquivado em 26 de dezembro de 2007; USSN 61/031.353 arquivado em 25 de fevereiro de 2008; USSN 61/046.353 arquivado em 18 de abril de 2008; USSN 61/050.172, arquivado em 02 de maio de 2008; USSN 61/079, 779, arquivado em 10 de julho de 2008, e USSN 61/099.178 arquivado em 22 de setembro de 2008 e é uma continuação em parte do USSN 11/932, 151, arquivado em 31 de outubro de 2007, que é uma continuação em parte de USSN 11/436.266, arquivado em 17 de maio de 2006, que reivindicou benefício sob 35 USC § 119(e) para USSN 60/951.536 arquivado em 24 de julho de 2007 e é uma continuação em parte do USSN 11/274.065, arquivado em 14 de novembro de 2005, que reivindicou benefício sob 35 USC § 119 (e) USSN 60/627.763, arquivado em 12 de novembro de 2004; USSN, 60/642.886, arquivado em 11 de janeiro de 2005; USSN 60/649.508, arquivado em 02 de fevereiro de 2005; USSN 60/662.468, arquivado em 15 de março de 2005; USSN 60/669.311, arquivado em 06 de abril de 2005; USSN 60/681, 607, arquivado em 16 de maio de 2005; USSN 60/690, 200, arquivado em 13 de junho de 2005; USSN 60/696, 609, arquivado em 05 de julho de 2005; USSN 60/703, 018, arquivado em 27 de julho de 2005, e USSN 60/726, 453, arquivado em 12 de outubro de 2005, todos integralmente incorporados para referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] O presente pedido refere-se a variantes otimizadas de imunoglobulina IgG, métodos de engenharia para a sua geração, e sua aplicação, especialmente para fins terapêuticos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Anticorpos são proteínas imunológicas que se ligam um antígeno específico. Na maioria dos mamíferos, incluindo seres humanos e camundongos, os anticorpos são construídos a partir de cadeias polipeptídicas emparelhadas leves e pesadas. Cada cadeia é composta de domínios de imunoglobulina individual (Ig) e, assim, o termo genérico imunoglobulina é usado para essas proteínas. Cada cadeia é composta de duas regiões distintas, denominadas regiões variável e constante. As regiões variáveis de cadeia leve e pesada mostram uma significativa diversidade de seqüências entre os anticorpos, e são responsáveis pela ligação do antígeno alvo. As regiões constantes mostram menor diversidade de seqüência, e são responsáveis pela ligação de um número de proteínas naturais que provocam eventos bioquímicos importantes. Nos seres humanos há cinco classes diferentes de anticorpos, incluindo IgA (que inclui as subclasses IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que inclui subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. A característica distintiva entre estas classes de anticorpos é a sua constante regiões, embora possam existir diferenças mais sutis na região V. Os anticorpos IgG são proteínas tetraméricas compostas por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A cadeia pesada de IgG é composta por quatro domínios de imunoglobulina ligados a terminais N- a C- na ordem VH-CH1- CH2-CH3, referindo-se ao domínio variável de cadeia pesada, domínio constante de cadeia pesada 1, domínio constante de cadeia pesada 2, e domínio constante de cadeia pesada 3, respectivamente (também conhecidos como VH-CY1-CY2-CY3, referindo-se ao domínio variável de cadeia pesada, domínio 1 de gama constante, domínio 2 de gama constante, e domínio 3 de gama constante, respectivamente). A cadeia leve de IgG é composta de dois domínios de imunoglobulina ligados a terminais N- a C- na ordem VL-CL, referindo-se ao domínio variável de cadeia leve e ao domínio constante de cadeia leve, respectivamente.

[004] Em IgG, um local em Fc entre os domínios CY2 e CY3 medeia a interação com o receptor FcRn neonatal. A ligação ao FcRn recicla o anticorpo endocitosado a partir do endossomo de volta para a corrente sanguínea (Raghavan et al. 1996, Annu Cell Dev Rev Biol 12:181-220; Ghetie et al. 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766, ambos integralmente incorporados para referência). Este processo, juntamente com exclusão de filtração renal devido ao grande tamanho da molécula de grande comprimento, resulta na meia-vida favorável do soro do anticorpo variando de uma a três semanas. A ligação do Fc ao FcRn também desempenha um papel fundamental no transporte de anticorpos. O local de ligação no FC para FcRn é também o local em que as proteínas bacterianas A e G se ligam. A ligação apertada por estas proteínas é geralmente explorada como um meio para purificar os anticorpos empregando uma cromatografia de afinidade a proteína A ou proteína G durante a purificação de proteínas. Assim, a fidelidade desta região em Fc é importante tanto para as propriedades clínicas dos anticorpos como sua purificação. As estruturas disponíveis do complexo Fc/FcRn do rato (Burmeister et al. 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al. 2001, Mol Cell 7:867-877, ambos integralmente incorporados para referência), e os complexos de Fc com proteínas A e G (Deisenhofer, 1981, Bioquímica 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al. 1995, 3:265-278 Estrutura; Tashiro et al. 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471 -481, todos integralmente incorporados para referência), fornecem uma idéia da interação do Fc com estas proteínas. O receptor de FcRn também é responsável pela transferência de IgG ao intestino neonatal e ao lúmen do epitélio intestinal em adultos (Ghetie e Ward, Annu. Rev. Immunol. 2000, 18:739-766; Yoshida e cols., Immunity, 2004, 20 (6) :769-783, ambos integralmente incorporados para referência).

[005] Estudos de domínios Fc em ratos e humanos têm demonstrado a importância de alguns resíduos Fc com a ligação de FcRn. As seqüências de humanos e ratos têm cerca de 64% de identidade de seqüência nas regiões Fc (resíduos 237-443 da numeração do índice EU). Ver figuras 3, 4 e 5 para os alinhamentos humano/rato de Fc, FcRn cadeia pesada e FcRn cadeia leve (beta-2-microglobulina). Um modelo do complexo Fc/FcRn foi construído a partir da atual estrutura do complexo Fc/FcRn (Martin et al. 2001, Mol Cell 7:867-877, integralmente incorporados para referência). As sequências em humanas e ratos compartilham alguns resíduos que são importantes para a ligação de FcRn, tais como H310 e H435 (Medesan et al., 1997 J. Immunol. 158(5):221-7; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604, ambos integralmente incorporados para referência). Em muitas posições, no entanto, as proteínas humanas e de ratos com diferentes aminoácidos, fornecendo os resíduos em diferentes ambientes da sequência de humanos e, possivelmente, uma identidade diferente, do que na seqüência do rato. Esta variabilidade limita a capacidade de transferir as características de um homólogo para outros.

[006] No Fc de ratos, a mutação aleatória e a seleção de phage display nos locais, T252, T254 e T256 levam a um triplo mutante, T252L/T254S/T256F, isso tem um aumento de 3,5 vezes na afinidade FcRn e um aumento de 1,5 vezes na meia-vida sérica (Ghetie et al. 1997, Nat. Biotech. 15(7): 637-640, ambos integralmente incorporados para referência). O rompimento da interação Fc/FcRn por mutações nas posições 253, 310 e 435 também levar a diminuição na meia-vida in vivo (Medesan J. et al Immunol. 1997 158(5):2211-7, ambos integralmente incorporados para referência).

[007] Estudos mutacionais no Fcy humano são feitos em alguns dos resíduos que são importantes para a ligação ao FcRn e demonstraram um aumento da meia-vida sérica. Em FCY1 humanos, Hinton et al. alterou três resíduos individualmente para os outros 19 aminoácidos comuns. Hinton et al. descobriu que alguns pontos mutantes em um mutante duplo aumentaram a afinidade de ligação de FcRn (Hinton et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 62136216; Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, ambos integralmente incorporados para referência). Duas mutações aumentaram a meia-vida em macacos. Shields et al. Modificou resíduos, quase exclusivamente à Ala, e estudou a sua ligação ao FcRn e o FcyR (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604, ambos integralmente incorporados para referência).

[008] Dall'Acqua et al. utilizou o phage display para selecionar as mutações Fc que ligaram FcRn com elevada afinidade (Acqua Dall 'et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, ambos integralmente incorporados para referência). As seqüências de DNA foram inicialmente selecionadas para mutantes duplos e triplos. A referência expressou as proteínas codificadas por muitas de suas seqüências selecionadas e encontrou algumas que limitam a FcRn mais fortemente do que o Fc do tipo selvagem.

[009] A administração de anticorpos e proteínas de fusão de Fc como terapia que requer injeções com uma frequência prescrita relativa à limpeza e características de meia-vida da proteína. As meias-vidas in vivo permite mais injeções aleatórias ou menor dose, o que é claramente vantajoso. Embora as mutações anteriores no domínio Fc levem algumas proteínas com o aumento de afinidade de ligação de FcRn e meias-vidas in vivo, estas mutações não identificaram as mutações ideais e o aumento da meia-vida in vivo.

[010] Uma característica da região Fc é a glicosilação de N-ligados conservados que ocorre em N297. Este carboidrato ou oligossacarídeo como é chamado às vezes, desempenha um papel estrutural e funcional importante para o anticorpo, e é uma das principais razões para que os anticorpos devam ser produzidos utilizando sistemas de expressão em mamíferos. Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477; and Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989, todos integralmente incorporados para referência).

[011] Anticorpos têm sido desenvolvidos para uso terapêutico. As publicações representativas relacionadas a essas terapias incluem Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833 e Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648, todos integralmente incorporados para referência. Atualmente, a terapia anticancerígena, qualquer pequena melhoria na taxa de mortalidade define o sucesso. Algumas variantes de IgG aqui divulgadas aumentam a capacidade dos anticorpos para limitar o crescimento ou destruir, pelo menos parcialmente, as células cancerosas específicas.

[012] A potência anti-tumoral de anticorpos é através de reforço da sua capacidade de mediar funções efetoras citotóxicas como ADCC, ADCP e CDC. Exemplos incluem Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446 e Cartron et al., 2002, Blood 99:754758, ambos integralmente incorporados para referência).

[013] O IgG1 humano é o anticorpo mais utilizado para fins terapêuticos, e a maioria dos estudos de engenharia foram desenvolvidos neste contexto. Os isotipos diferentes da classe IgG, no entanto, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, tem propriedades físico, biológico e clínico únicas. Há uma necessidade na técnica para uma melhor concepção de variantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Há uma necessidade de desenvolver tais variantes para melhorar a ligação com FcRn e/ou aumento de sua meia-vida in vivo em relação aos polipeptídeos IgG nativos. Adicionalmente, há a necessidade de combinar as variantes com melhores propriedades farmacocinéticas com variantes que incluem modificações para melhorar a eficácia através da ligação de FcgammaR alterado. O presente pedido atende a estas e outras necessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] O presente pedido é dirigido as variantes de Fc de um polipeptídeo original que inclua pelo menos uma modificação na região Fc do polipeptídeo. Em várias modalidades, os polipeptídeos da variante exibem ligação alterada ao FcRn em relação a um polipeptídeo original. Em algumas variações, a modificação pode ser selecionada do grupo consistindo em: 428L, 434S e 434m, onde a numeração está de acordo com o índice EU em Kabat et al.

[015] Em outra modalidade, a variante de Fc inclui pelo menos duas modificações selecionadas do grupo consistindo em: 252Y/428L, 428L/434H 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M e 428L/434S.

[016] Em outra modalidade, a variante de Fc inclui pelo menos uma modificação selecionada do grupo consistindo em: M428L/N434S, V308F/M428L/N434S.

[017] Em outra modalidade, a variante de Fc inclui pelo menos uma modificação selecionada do grupo consistindo em: 259I/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, e 308F/319L/434S.

[018] Em outra modalidade, a variante de Fc inclui pelo menos uma modificação selecionada do grupo consistindo em:em outra modalidade, a invenção inclui um método para tratar um paciente com necessidade de tratamento compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Fc aqui descrita.

[019] Em outra modalidade, a invenção inclui um método para aumentar a meia-vida de um anticorpo ou imunoadesina modificando uma Fc de acordo com as alterações aqui descritas.

[020] Em outra variante, a invenção inclui variante de Fc com aumento da ligação de FcRn com outras variantes de Fc que modulam a função efetora.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[021] Figura 1. Alinhamento das seqüências de cadeias pesadas constantes de IgG humano. Cinza indica diferenças de IgG1 e resíduos de caixa indicam variações alotípicas comuns na população humana.

[022] Figura 2. (SEQ ID NO: 1-6) Seqüências de aminoácidos das regiões constantes usadas na invenção.

[023] Figura 3. (SEQ ID NO: 7-12) Seqüências de aminoácidos de regiões constantes de variantes do exemplo.

[024] Figura 4. (SEQ ID NO: 13-22) Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis VH e VL usadas na invenção.

[025] Figura 5. (SEQ ID NO: 23-29) Seqüências de aminoácidos de anticorpos da variante do exemplo.

[026] Figura 6. Ligação VEGF relativa por WT e seleção de anticorpos anti-VEGF de IgG1 da variante. O campo mostra as unidades de resposta de Biacore (RU) no final da fase de associação para a ligação do anticorpo analito ao antígeno VEGF imobilizado. Anticorpo anti-Her2 IgG1 foi utilizado como controle negativo.

[027] Figura 7. Sensogramas da Biacore de WT e anticorpos de IgG1 da variante para FcRn humano imobilizado em baixo pH (6,0) e pH alto(7,4).

[028] Figura 8. Afinidades de ligação de FcRn do WT e seleção de anticorpos de IgG1 da variante para FcRn humano em pH 6,0, conforme determinado pela Biacore. O gráfico mostra um gráfico da constante de pseudo-afinidade (Ka*), em uma escala logarítmica.

[029] Figura 9. Afinidades de ligação de anticorpos anti-VEGF de IgG1 da variante para FcRn humano como determinado pela Biacore. A tabela mostra a dobra do Ka* relativa de cada variante relativa ao IgG1 WT humano (nativo). O n indica o número de tempo que cada variante foi testado e o meio e SD indicam a média e desvio padrão, respectivamente, para cada variante em relação aos experimentos de ligação n. A dobra de FcRn foi calculada para todas as variantes em relação ao IgG1 de WT dentro de cada experimento de ligação. NB indica que nenhuma ligação foi detectada. ND indica que a ligação não foi determinada para a variante particular. NF indica que nenhum ajuste foi possível a partir dos dados de ligação.

[030] Figura 10. Ligação relativa de anticorpos anti-VEGF de IgG2 e IgG1/2 da variante para FcRn humano como determinado pela Biacore. A tabela é descrita na Figura 9.

[031] Figura 11. Análise de combinações de substituição de aditivos e sinérgicos. Figura 11 mostra um gráfico da ligação de dobra determinada experimentalmente para FcRn humano por cada variante versus a ligação prevista d FcRn por dobra, conforme determinado pelo produto das variantes individuais. Os pontos de dados da variante são rotulados, e a linha representa aditividade perfeita. Figura 11b mostra a diferença entre a dobra experimental e prevista para cada variante de combinação. Figura 11c mostra a sinergia de cada combinação de variante. A porcentagem de sinergia é calculada como 100x[(dobra experimental/dobra prevista) - 1)].

[032] Figura 12. Ligação relativa de variantes de anticorpos anti-TNF, - CD25, -EGFR e de IgE para FcRn humano como determinado pela Biacore. A tabela é descrita na Figura 9.

[033] Figura 13. Farmacocinética in vivo do WT e anticorpos da variante em mFcRn-/- hFcRn+ de camundongos. Os gráficos mostram a concentração sérica de anticorpos contra o tempo após uma única dose intravenosa. Figura 13a mostra os dados de um dos quatro estudos realizados com anticorpos IgG1 (Estudo 3), e Figura 13b mostra dados de um estudo realizado com anticorpos IgG2 (Estudo 5).

[034] Figura 14. Parâmetros PK ajustados de todos os estudos PK in vivo realizados em mFcRn-/- hFcRn+ de camundongos com anticorpos da variante e WT. O n representa o número de camundongos por grupo, com meio e dados de desvio padrão (SD) fornecidos para os parâmetros PK. A meia-vida representa a fase beta que caracteriza a eliminação de anticorpos do soro. Cmax é a concentração sérica máxima observada, a AUC é a área sob a curva de tempo de concentração e remoção é a remoção de anticorpos do soro. A meia-vida da dobra é calculada como a meia-vida de anticorpos da variante em relação a do IgG1 WT ou IgG2 original em cada estudo.

[035] Figura 15. Correlação entre a meia-vida de IgG1 (Figura 15a) e IgG2 (Figura 15b) de anticorpos da variante em mFcRn-/- hFcRn+ de camundongos e a ligação por dobra de FcRn relativa ao IgG1 WT. Os dados sobre o eixo y são da Figura 14, e dados sobre o eixo-x são das figuras 9 e 10. As variantes selecionadas são rotuladas e os dados da variante de experimentos repetidos estão circulados. Figura 15c mostra ambos dados de correlação de IgG1 e IgG2 com as linhas em preto e cinza representam ajustes dos dados IgG1 e IgG2, respectivamente.

[036] Figura 16. (SEQ ID NO: 30-35) Seqüências de aminoácidos da variante e imunoadesinas anti-TNF Fc original utilizadas na invenção.

[037] Figura 17. Ligação do imunoadesinas anti-TNF para antígeno TNF, conforme determinado pela Biacore.

[038] Figura 18. Ligação relativa de imunoadesinas Fc da variante para FcRn humano como determinado pela Biacore. A tabela mostra a dobra do Ka* relativa de cada variante relativa ao IgG1 WT humano (nativo). O n indica o número de tempo que cada variante foi testado e o meio e SD indicam a média e desvio padrão, respectivamente, para cada variante em relação aos experimentos de ligação n. A dobra de FcRn foi calculada para todas as variantes em relação ao IgG original dentro de cada experimento de ligação.

[039] Figura 19. Farmacocinética in vivo de imunoadesinas Fc da variante e original em mFcRn-/- hFcRn+ de camundongos. Os gráficos mostram a concentração sérica da fusão de Fc contra o tempo após uma única dose intravenosa.

[040] Figura 20. Parâmetros PK ajustados da fusão de Fc em estudo PK in vivo em mFcRn-/- hFcRn+ de camundongos. Os parâmetros são os descritos na Figura 14. A porcentagem de aumento na meia-vida é calculada em 100 vezes a meia-vida da fusão de Fc em relação a essa variante do IgG1 WT ou IgG2 original.

[041] Figura 21. Ligação relativa de anticorpos anti-VEGF de IgG1 da variante para FcRn humano e macacos como determinado pela Biacore. Figura 21 mostra os dados em formato tabular. A descrição da figura é como na Figura 9, e os dados para a ligação com FcRn humanos são retirados a partir da Figura 9. Figura 21b mostra um gráfico dos dados.

[042] Figura 22. Farmacocinética in vivo do WT e anticorpos da variante em macacos. Os gráficos mostram a concentração sérica de anticorpos contra o tempo após uma única dose intravenosa.

[043] Figura 23. Parâmetros PK ajustados a partir do em estudo Pk in vivo em macacos com anticorpos da variante e WT. Os parâmetros são conforme descrito na Figura 14.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[044] A presente invenção divulga a geração de novas variantes de domínios Fc, incluindo aquelas descobertas em anticorpos, fusões DE Fc, e imuno-adesões, o que têm uma ligação aumentada ao receptor FcRn. Como visto aqui, as ligações ao FcRn resultam em retenção mais longa do soro in vivo.

[045] A fim de aumentar a retenção das proteínas de Fc in vivo, o aumento da afinidade de ligação deve ser de cerca de pH 6 enquanto mantém afinidade mais baixa de cerca de pH 7.4. Embora ainda em exame, as regiões de Fc são tidas como tendo meias-vidas mais longas in vivo, por causa das ligações ao FcRn em pH 6 em um sequestrador endossomal de Fc (Ghetie e Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, integralmente incorporado para referência). O compartimento endossomal então recicla o Fc na superfície celular. Uma vez que o compartimento se abre para o espaço extracelular, o pH mais alto, ~7.4, induz a liberação de Fc de volta no sangue. Em camundongos, Dall’ Acqua et al. mostraram que Mutantes de Fc com a ligação FcRn aumentada em pH 6 e pH 7.4 de fato tiveram concentrações de soro reduzidas e a mesma meia-vida como Fc de tipo selvagem (Dall’ Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, ambos integralmente incorporados para referência). A afinidade aumentada de Fc por FcRn em pH 7.4 é entendida por proibir a liberação do Fc de volta no sangue. Portanto, as mutações de Fc que aumentarão a meia-vida de Fc in vivo aumentarão de forma ideal a ligação de FcRn em pH mais baixo embora ainda permitam liberar o Fc em pH mais alto. O aminoácido histidina muda seu estado de carga na faixa de pH de 6.0 a 7.4. Portanto, não é surpreendente encontrar suas regiões em posições importantes no complexo Fc/FcRn (Figura 6.)

[046] Um aspecto adicional da invenção é o aumento na ligação FcRn sobre o tipo selvagem especificamente em pH mais baixo, cerca de pH 6.0, para facilitar a ligação Fc/FcRn no endossoma. Também são divulgadas variantes de Fc com a ligação de FcRn alterada e ligações alteradas a outra classe de receptores Fc, o FcyR’s (algumas vezes escrito FcgamaR) como ligações diferenciais ao FcyRs, particularmente ligações aumentadas ao FcyRIIIb e ligações diminuídas ao FcyRIIb, mostraram resultar em eficácia aumentada.

Definições

[047] De modo a que o pedido possa ser melhor entendido, várias definições são estabelecidas abaixo. Tais definições devem abranger equivalentes gramaticais.

[048] Por “ADCC” ou “citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” como usado aqui entende-se a reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem ligação de anticorpo na célula-alvo e consequentemente causam lise da célula-alvo.

[049] Por “ADCP” ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo como usado aqui entende-se a reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem ligação de anticorpo na célula-alvo e consequentemente causam fagocitose da célula- alvo.

[050] Por “modificação” entende-se aqui uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos, ou uma alteração em uma fração quimicamente ligada à proteína. Por exemplo, a modificação pode ser um carboidrato alterado ou estrutura PEG presa na proteína. Por “modificação de aminoácido” entende-se aqui uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos.

[051] Por “substituição de aminoácido” ou “substituição” entende-se aqui a substituição de um aminoácido em uma posição específica de uma sequência de polipeptídeos original por outro aminoácido. Por exemplo, a substituição E272Y se refere a um polipeptídeos da variante, nesse caso uma variante de Fc, na qual o ácido glutâmico na posição 272 é substituído por tirosina.

[052] Por “inserção de aminoácido” ou “inserção” como usado aqui entende-se a adição de uma sequência de aminoácidos em uma posição específica em uma sequência de polipeptídeos original. Por exemplo, -233E ou A233E designa uma inserção de ácido glutâmico após a posição 233 e antes da posição 234. Além disso, -233ADE ou A233ADE designa uma inserção de AlaAspGlu após a posição 233 e antes da posição 234.

[053] Por “deleção de aminoácido” ou “deleção” como usado aqui entende-se a remoção de uma sequência de aminoácidos em uma posição específica em uma sequência de polipeptídeos original. Por exemplo, E233- ou E233# designa uma deleção de ácido glutâmico na posição 233. Além disso, EDA233- ou EDA233# designa uma deleção da sequência GluAspAla que começa na posição 233

[054] Por “proteína variante” ou “variante de proteína”, ou “variante” como usado aqui entende-se a proteína que difere daquela de uma proteína original por meio de pelo menos uma modificação de aminoácido. A proteína variante pode se referir à própria proteína, à composição compreendendo a proteína, ou à sequência de aminoácidos que a codifica. De preferência, a proteína variante tem pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com a proteína original; por exemplo, de cerca de um a cerca de dez modificações de aminoácido, e de preferência, de cerca de um a cerca de cinco modificações de aminoácido em comparação com o original. A sequência de proteína variante aqui, de preferência, terá pelo menos cerca de 80% de homologia com uma sequência de proteína original, e mais de preferência pelo menos cerca de 90% de homologia, mais de preferência pelo menos cerca de 95% de homologia. A proteína variante pode se referir à própria proteína da variante, à composição compreendendo a variante da proteína, ou à sequência de DNA que a codifica. Assim, por “variante de anticorpo” ou “anticorpo de variante” como usado aqui entende-se um anticorpo que difere de um anticorpo original por meio de pelo menos uma modificação de aminoácido, “variante de IgG” ou “IgG de variante” como usado aqui entende-se um anticorpo que difere de um IgG original por meio de pelo menos uma modificação de aminoácido, e “imunoglobulina variante” ou “variante de imunoglobulina” como usado aqui entende-se uma sequência de imunoglobulinas que difere daquela de uma sequência de imunoglobulinas original por meio de pelo menos uma modificação de aminoácido. “Fc variante” ou “variante de Fc” como usado aqui entende-se a proteína compreendendo a modificação em um domínio Fc. As variantes Fc da presente invenção são definidas de acordo com as modificações de aminoácido que as compõe. Assim, por exemplo, N434S ou 434S é uma variante de Fc com a substituição de serina na posição 434 relativa ao polipeptídeo Fc original, em que a numeração está de acordo com o índice de EU. Da mesma forma, M428L/N434S define uma variante de Fc com as substituições M428L e N434S. Uma relativa ao polipeptídeo de Fc original. A identidade do aminoácido WT pode ser inespecífica, no caso da variante acima mencionada ser referida como 428L/434S. Nota-se que a ordem em que substituições são fornecidas é arbitrária, o que significa dizer que, por exemplo, 428L/434S é a mesma variante de Fc que M428L/N434S, e assim por diante. Para todas as posições discutidas na presente invenção, a numeração é de acordo com o índice UE. O índice EU ou o índice EU como em Kabat ou o esquema de numeração EU se refere à numeração dos anticorpos EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85, integralmente incorporado aqui por referência.) A modificação pode ser uma adição, deleção ou substituição. Substituições podem incluir aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos de ocorrência não natural. Variantes podem compreender aminoácidos não naturais. Exemplos incluem US 6.586.207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2, J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; e, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10, ambos integralmente incorporados para referência.

[055] Como utilizado aqui, “proteína" é entendida como pelo menos dois aminoácidos covalentemente presos, o que inclui proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos e peptídeos. O grupo polipeptidila pode compreender aminoácidos de ocorrência natural e ligações de peptídeo, ou estruturas peptídeoomiméticas sintéticas, ou seja, "análogas", tais como peptóides (ver Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992), integralmente incorporado para referência). Os aminoácidos podem ser de ocorrência natural ou ocorrência não natural; como será apreciado por aqueles versados na técnica. Por exemplo, homo-fenilalanina, citrulina, e noreleucina são considerados aminoácidos para os propósitos da invenção, e os aminoácidos configurados D- e L- (R ou S) podem ser utilizados. As variantes da presente invenção podem compreender modificações que incluem o uso de aminoácidos não naturais incorporados usando, por exemplo, as tecnologias desenvolvidas por Schultz e colegas, incluindo entre outros métodos descritos por Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, e erson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3, and Chin et al., 2003, Science 301(5635):964-7, todos integralmente incorporados para referência. Em adição, polipeptídeos podem incluir derivatização sintética de uma ou mais cadeias laterais ou terminais, glicosilação, PEGuilação, permutação circular, ciclização, ligações com outras moléculas, fusão com proteínas ou domínios de proteínas, e adição de etiquetas ou rótulos de peptídeo.

[056] Por “resíduo” como usado aqui entende-se a posição na proteína e sua identidade de aminoácido associada. Por exemplo, Asparagina 297 (também referida como Asn297 ou N297) é um resíduo no anticorpo IgG1 humano.

[057] Por “Fab” ou “região Fab” como usado aqui entende-se o polipeptídeo que compreende os domínios de imunoglobulina VH, CH1, VL, e CL. Fab pode se referir a essa região isolada, ou essa região no contexto de um anticorpo de comprimento total, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão Fab. Por "Fv" ou "fragmento Fv" ou "região Fv", usado aqui significa um polipeptídeo que compreende os domínios VH e VL de um anticorpo único.

[058] Por “Modificação de subclasse IgG” como usado aqui entende-se uma modificação de aminoácido que converte um aminoácido de um Isotipo de IgG no aminoácido correspondente em um isotipo de IgG diferente alinhado. Por exemplo, devido a uma IgG1 compreender a tirosina e IgG2 uma fenilalanina na posição EU 296, uma substituição F296Y em IgG2 é considerada uma modificação de subclasse IgG.

[059] Por “modificação de ocorrência não natural” como usado aqui entende-se uma modificação de aminoácido que não é isotípica. Por exemplo, já que nenhuma das IgGs compreendem uma serina na posição 434, a substituição 434S em IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 é considerada uma modificação de ocorrência não natural.

[060] Por “aminoácido” e “identidade de aminoácido” como usado aqui entende-se um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural ou qualquer análogo não natural que pode estar presente em uma posição específica definida.

[061] Por “função efetora” como usado aqui entende-se um evento bioquímico que resulta da interação de uma região Fc de anticorpo com um receptor Fc ou ligando. Funções efetoras incluem entre outras ADCC, ADCP, e CDC.

[062] Por “ligando Fc de IgG” como usado aqui entende-se uma molécula, de preferência um polipeptídeo, de qualquer organismo que se liga à região Fc de um anticorpo IgG para formar um complexo ligando Fc/Fc. Os ligandos de Fc incluem entre outros FcyRs, FcyRs, FcyRs, FcRn, C1q, C3, lectina de ligando manana, receptor de manose, proteína A staphylococcal, proteína G streptococcal, e FcyR viral. Os ligandos de Fc também incluem receptores Fc homólogos (FcRH), que são uma família de receptores Fc homólogos aos Fc/Rs (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136, integralmente incorporados para referência). Os ligandos Fc podem incluir moléculas não descobertas que se ligam ao Fc. Ligandos Fc de IgG particulares são os receptores gama de FcRn e Fc. Por “ligando Fc” como usado aqui entende-se uma molécula, de preferência um polipeptídeo, de qualquer organismo que se liga à região Fc de um anticorpo para formar um complexo ligando Fc/Fc.

[063] Por “receptor Fc gama”, “Fc.'R” ou “FcgammaR” como usado aqui entende-se qualquer membro da família de proteínas que se ligam à região Fc do anticorpo IgG e é codificada por um gene Fc/R. Em humanos, esta família inclui, entre outros, a Fc/RI (CD64), incluindo as isoformas Fc/RIa, Fc/RIb, e Fc/RIc; Fc/RII (CD32), incluindo as isoformas Fc/RIIA (incluindo alótipos H131 e R131), Fc/RIIb (incluindo Fc/RIIb-1 e Fc/RIIb-2) e FC/RIIC; e Fc/RIII (CD16), incluindo as isoformas Fc/RIIIa incluindo alótipos V158 e F158) e Fc/RIIIb (incluindo alótipos Fc/RIIIb-NA1 e Fc/RIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, integralmente incorporado para referência), bem como qualquer isoforma Fc/Rs ou Fc/R ou alótipo humano não descoberto. Um Fc/R pode ser qualquer organismo, incluindo entre outros humanos, camundongos, ratos, coelhos, e macacos. Fc/Rs de camundongos incluem, entre outros, Fc/RI (CD64), Fc/RII (CD32), Fc/RIII (CD16), e Fc/RIII-2 (CD16-2), assim como qualquer isoforma ou alótipo de Fc/Rs ou Fc/R de camundongo não descoberto.

[064] Por “FcRn” ou “receptor Fc neonatal” como usado aqui entende- se a proteína que se liga à região Fc do anticorpo IgG e é codificada pelo menos em parte por um gene FcRn. O FcRn pode ser de qualquer organismo, incluindo entre outros humanos, camundongos, ratos, coelhos, e macacos. Como é sabido na técnica, a proteína FcRn funcional compreende dois polipeptídeos, geralmente denominados como cadeia pesada e cadeia leve. A cadeia leve é beta-2-microglobulina e a cadeia pesada é codificada pelo gene FcRn. Salvo disposição em contrário, uma proteína FcRn ou FcRn se refere ao complexo de FcRn de cadeia pesada com beta-2-microglobulina. Sequências de particular interesse de FcRn são mostradas nas Figuras, particularmente a espécie humana.

[065] Por “polipeptídeo original” como usado aqui entende-se um polipeptídeo não modificado que é consequentemente modificado para gerar uma variante. O polipeptídeo original pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural, ou uma variante ou versão modificada de um polipeptídeo de ocorrência natural. O polipeptídeo original pode se referir ao próprio polipeptídeo, composições que compreendem o polipeptídeo original, ou a sequência de aminoácidos que o codificam. Assim, por “imunoglobulina original” como usado aqui entende-se um polipeptídeo de imunoglobulina não modificado que é modificado para gerar uma variante, e por “anticorpo original” como usado aqui entende-se um anticorpo não modificado que é modificado para gerar um anticorpo da variante. Deve-se notar que “anticorpo original” inclui anticorpos conhecidos produzidos comercialmente de forma recombinante como destacado abaixo.

[066] Por “posição” como usado aqui entende-se um local na sequência da proteína. As posições podem ser numeradas sequencialmente, ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo o índice EU como em Kabat.

[067] Por “antígeno-alvo” como usado aqui entende-se a molécula que é ligada especificamente pela região variável de um dado anticorpo. Um antígeno-alvo pode ser uma proteína, um carboidrato, lipídio, ou outro composto químico.

[068] Por “célula-alvo” como usado aqui entende-se uma célula que expressa um antígeno-alvo.

[069] Por “região variável“ como usado aqui entende-se a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios Ig substancialmente codificados por qualquer dos genes VK, VA, e/ou VH que compõem os locais genéticos kappa, lambda, e da imunoglobulina de cadeia pesada, respectivamente.

[070] Por “tipo selvagem ou WT” entende-se aqui uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que é encontrada na natureza, incluindo variações de alelos. A proteína WT tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não foi modificada intencionalmente.

[071] A presente invenção é direcionada a anticorpos que exibem ligações moduladas ao FcRn relativas ao anticorpo do tipo selvagem. Por exemplo, em alguns exemplos, a ligação aumentada resulta em reciclagem celular do anticorpo e assim aumenta a meia-vida. Em adição, anticorpos que exibem ligações aumentadas ao FcRn e ligações alteradas a outros receptores Fc, por exemplo FCYRS, são úteis na presente invenção.

Anticorpos

[072] O presente pedido é direcionado a anticorpos que incluem modificações de aminoácido que modulam ligações ao FcRn. De particular interesse são os anticorpos que minimamente compreendem uma região Fc, ou sua variante funcional, que mostra afinidade de ligação aumentada ao FcRn em pH mais baixo, e não exibem ligação substancialmente alterada em pH mais alto.

[073] Unidades estruturais de anticorpos tradicionais geralmente compreendem um tetrâmero. Cada tetrâmero é geralmente composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, cada par com uma cadeia "leve" (tipicamente com peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (tipicamente com peso molecular de cerca de 50-70 kDa). Cadeias leves em humanos são classificadas como cadeias leves de kappa e lambda Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou epsilon, e define o isotipo de anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tem várias subclasses, incluindo, entre outros, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tem subclasses, incluindo, entre outros, IgM1 e IgM2. Assim, “isotipo" como usado aqui significa qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas por características químicas e antigênicas das regiões constantes. Os isotipos de imunoglobulina humana comuns são IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, e IgE.

[074] A porção amino-terminal de cada cadeia inclui a região variável, de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, primariamente responsável pelo reconhecimento de antígenos. Na região variável, três ciclos são agrupados para cada um dos domínios V de cadeia pesada e cadeia leve para formar um local de ligação de antígeno. Cada um dos ciclos é denominado como uma região de determinação de complementariedade (aqui denominado "CDR"), em que a variação na sequência de aminoácido é mais significante.

[075] A porção com terminal carboxila de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Kabat et al. coletou numerosas sequências primárias de regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve. Com base no grau de conservação das sequências, eles classificaram sequências individuais primárias no CDR e na estrutura e fizeram uma lista (ver SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., integralmente incorporado para referência).

[076] Na subclasse IgG de imunoglobulinas, há vários domínios de imunoglobulina na cadeia pesada. Por “domínio de imunoglobulina (Ig)“ entende-se aqui a região de uma imunoglobulina com uma estrutura terciária distinta. De interesse na presente invenção são os domínios de cadeia pesada, incluindo os domínios pesados constantes (CH) e os domínios de dobradiças. No contexto de anticorpos IgGs, cada isotipo de IgGs têm três regiões CH. Assim, domínios “CH” no contexto de IgG são como segue: “CH1” se refere a posições 118-220 de acordo com o índice EU como em Kabat. “CH2” se refere as posições 237-340 de acordo com o índice EU como em Kabat, e “CH3” se refere as posições 341-447 de acordo com o índice EU como em Kabat.

[077] Outro tipo de domínio Ig de cadeia pesada é a região de dobradiça. Por “dobradiça” ou “região de dobradiça” ou “região de dobradiça de anticorpo” ou “região de dobradiça de imunoglobulina” entende-se aqui o polipeptídeo flexível compreendendo os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios de um anticorpo. Estruturalmente, o domínio IgG CH1 termina na posição EU 220 , e o domínio CH2 IgG começa no resíduo da posição EU 237. Assim, para IgG, a clivagem do anticorpo é aqui definida para incluir as posições 221 (D221 em IgG1) a 236 (G236 em IgG1), onde a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat. Em algumas modalidades, por exemplo, no contexto de uma região Fc, a dobradiça inferior está incluída, com a “dobradiça inferior” geralmente se referindo às posições 226 ou 230.

[078] De particular interesse na presente invenção são as regiões Fc. Por “Fc” ou “região Fc”, como usado aqui entende-se o polipeptídeo compreendendo a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante e em alguns casos, parte da dobradiça. Assim, Fc se refere pelo menos a dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD, e IgG, aos três últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e à dobradiça flexível do terminal N para esses domínios. Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, como ilustrado na Figura 1, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cgama2 e Cgama3 (Cg2 e Cg3) e a região da dobradiça inferior entre Cgama1 (Cg1) e Cagama2 (Cg2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para incluir regiões C226 ou P230 em seus terminais carboxila, em que a numeração é de acordo com o índice EU como em Kabat. Fc pode se referir a essa região em isolamento, ou essa região no contexto de um polipeptídeo Fc, como descrito abaixo. Por “polipeptídeo Fc” como usado aqui entende-se um polipeptídeo que compreende toda ou parte de uma região Fc. Polipeptídeos Fc incluem anticorpos, fusões de Fc, Fcs isolados, e fragmentos de Fc.

[079] Em algumas modalidades, os anticorpos são cadeias completas. Por “anticorpo de cadeia completa” entende-se aqui a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constantes, incluindo uma ou mais modificações como definido aqui.

[080] Alternativamente, os anticorpos podem ser uma variedade de estruturas, incluindo, entre outras, fragmentos de anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes referidos aqui como “mimetismo de anticorpo”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpos (algumas vezes referidas como “conjugados de anticorpos”), e fragmentos de cada, respectivamente.

Fragmentos de anticorpos

[081] Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. De particular interesse estão os anticorpos que compreendem regiões de Fc, fusões de Fc, e a região constante da cadeia pesada (CH1-dobradiça-CH2- CH3), novamente também incluindo fusões de região pesada constante.

[082] Fragmentos de anticorpos específicos incluem, entre outros, (i) o fragmento Fab consistindo de domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) o fragmento Fd composto pelos domínios VH e CH1, (iii) o fragmento Fv constituído em domínios VH e VL de um único anticorpo; (iv) o fragmento de dAB (Ward et al. 1989, Nature 341:544-546, integralmente incorporado para referência), que consiste de uma única variável, (v) regiões CDR isoladas, (vi) Fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos ligados a Fab (vii) as moléculas Fv de cadeia única (scFv), onde um domínio VH e um domínio de VL estão ligados por um ligando de peptídeo que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação do antígeno (Bird et al. 1988, Science 242:423-426, Huston et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, integralmente incorporado para referência), (viii) Fv de cadeia única biespecífica (WO 03/11161, aqui incorporado para referência) e (ix) "dicorpos" ou “tricorpos”, multivalentes ou multifragmentos específicos construídos por fusão de genes (Tomlinson et. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, todos integralmente incorporados para referência). O fragmento de anticorpos pode ser modificado. Por exemplo, as moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfito ligando os domínios VH e VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, integralmente incorporados para referência).

Anticorpos quiméricos e humanizados

[083] Em algumas modalidades, os componentes scaffold podem ser uma mistura de espécies diferentes. Como tal, se uma proteína é um anticorpo, tal anticorpo pode ser um anticorpo quimérico e/ou um anticorpo humanizado. Em geral, ambos “anticorpos quiméricos” e “anticorpos humanizados” se referem a anticorpos que combinam regiões de mais de uma espécie. Por exemplo, “anticorpos quiméricos” tradicionalmente compreendem região(ões) variável(is) de um camundongo (ou rato, em alguns casos) e a região constante de um humano. “Anticorpos humanizados” geralmente se referem a anticorpos não humanos que tiveram regiões da estrutura do domínio variável trocadas por sequências descobertas em anticorpos humanos. Geralmente, em um anticorpo humanizado, todo o anticorpo, exceto os CDRs, é codificado por um polinucleotídeo de origem humana ou é idêntico a tal anticorpo, exceto em seus CDRs. Os CDRs, alguns ou todos os que são codificados por ácidos nucléicos originados em um organismo não humano, são enxertados na estrutura de folha beta de uma região variável de anticorpo humano para criar um anticorpo, a especificidade do que é determinado pelos CDRs. A criação de tais anticorpos é descrita em, por exemplo, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, todos incorporados para referência. “Mutação de volta” de regiões de estrutura receptora selecionada dos resíduos doadores correspondentes é geralmente requerida para reagir à afinidade que é perdida no constructo inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, todos integralmente incorporados para referência). Os anticorpos humanizados idealmente também compreenderão pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina, tipicamente a imunoglobulina humana, e assim, tipicamente compreenderão uma região Fc humana. Anticorpos humanizados podem também ser gerados usando camundongos com um sistema imune geneticamente modificado. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, integralmente incorporado para referência. Uma variedade de técnicas e métodos para humanizar e remodelar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (ver Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanização de Anticorpos monoclonais, Molecular Biology de Células B, 533-545, Elsevier Science (USA), e referências neles citadas, todos integralmente incorporados para referência). Os métodos de humanização, incluem, entre outros, métodos descritos no Jones et al. 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al. 1988, Science, 239: 1534-1536; Queen et al. 1989, Proc Natl Acad Sci, E.U.A. 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:42859, Presta et al., 1997, câncer Res.57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O’Connor et al., 1998, proteína Eng 11:321-8, todos incorporados para referência. Humanização ou outros métodos de reduzir a imunogeneticidade de regiões variáveis de anticorpos humanos podem incluir métodos de resuperfície, como descrito por exemplo em Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, integralmente incorporados para referência. Em uma modalidade, o anticorpo original teve afinidade maturada, como é sabido na técnica. Os métodos com base na estrutura podem ser empregados para a humanização e maturação de afinidade, por exemplo, como descrito no USSN 11/004, 590. Os métodos com base na seleção podem ser utilizados para humanizar e/ou regiões variáveis de anticorpo maduro para afinidade, incluindo, entre outros, métodos descritos em Wu et al. 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 2261122618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, proteína Engineering 16(10):753-759, todos integralmente incorporados para referência. Outros métodos de humanização podem envolver apenas partes dos CDRs, incluindo entre outros métodos descritos em USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, todos integralmente incorporados para referência.

Anticorpos biespecíficos

[084] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção multiespecificam anticorpos, e notadamente um anticorpo bioespecífico, também algumas vezes referido como “dicorpos”. Esses são os anticorpos que se ligam a dois (ou mais) antígenos diferentes. Diacorpos podem ser manufaturados em uma variedade de modos conhecidos na técnica (Holliger e Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, integralmente incorporado para referência), por exemplo, preparados quimicamente ou hibridomas híbridos.

Minicorpos

[085] Em uma modalidade, o anticorpo é um minicorpo. Minicorpos são proteínas do tipo anticorpo minimizadas compreendendo um scFv unido a um domínio CH3. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061, integralmente incorporado para referência. Em alguns casos, o scFv pode ser unido à região Fc, e pode incluir algumas ou toda a região de dobradiça.

Fusões de anticorpos

[086] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção são proteínas de fusão de anticorpo (algumas vezes referidas aqui como um “conjugado de anticorpos”). Um tipo de fusão de anticorpo compreende as fusões de Fc, que ligam a região Fc com um parceiro conjugado. Por “fusão de Fc” como usado aqui entende-se a proteína em que um ou mais polipeptídeos é operacionalmente ligado a uma região de Fc. A fusão de Fc é aqui entendida como sendo sinônimo dos termos “imunoadesina”, “fusão de Ig”, “quimera de Ig”, e “receptor de globulina” (algumas vezes com traços) como usaram na técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, ambos integralmente incorporados para referência). Uma fusão de Fc combina a região de Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, o que em geral pode ser qualquer proteína ou molécula pequena. Virtualmente, qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada ao Fc para gerar uma fusão Fc. Uma parceiro de proteína de fusão pode incluir, entre outras, a região variável de qualquer anticorpo, a região de ligação-alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, ou algumas outras proteínas ou domínio de proteína. Os parceiros de fusão de moléculas pequenas podem incluir qualquer agente terapêutico que direcione a fusão de Fc a um alvo terapêutico. Tais alvos podem ser qualquer molécula, de preferência, um receptor extracelular, o que implica em doença. Assim, as variantes de IgG podem ser ligadas a um ou mais parceiros de fusão. Em uma modalidade alternativa, a variante de IgG é conjugada ou operacionalmente ligada a outro composto terapêutico. O composto terapêutico pode ser um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, uma toxina, um radioisótopo, uma citocina, ou outro agente terapeuticamente ativo. O IgG pode ser ligado a uma de uma variedade de polímeros não protéicos, como polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol.

[087] Além das fusões de Fc, as fusões de anticorpos incluem a fusão de uma região constante de uma cadeia pesada com um ou mais parceiros de fusão (novamente incluindo a região variável de qualquer anticorpo), enquanto outras fusões de anticorpos são substancialmente ou completamente anticorpos de cadeias completas com parceiros de fusão. Em uma modalidade, o papel de um parceiro de fusão é mediar a ligação alvo, e assim, é funcionalmente análogo às regiões variáveis de um anticorpo (e de fato pode ser). Virtualmente qualquer proteína ou molécula pequena pode ser ligada ao Fc para gerar uma fusão Fc (ou fusão de anticorpos). Um parceiro de proteínas de fusão pode incluir, entre outros, a região de ligação-alvo de um receptor, uma molécula de adesão, um ligando, uma enzima, uma citocina, uma quimiocina, ou algumas outras proteínas ou domínios de proteína. Os parceiros de fusão de moléculas pequenas podem incluir qualquer agente terapêutico que direcione a fusão de Fc a um alvo terapêutico. Tais alvos podem ser qualquer molécula, de preferência, um receptor extracelular, o que implica em doença.

[088] O parceiro conjugado pode ser proteináceo ou não proteináceo; o último geralmente sendo gerado usando grupos funcionais no anticorpo e no parceiro conjugado. Por exemplo ligandos são conhecidos na técnica; por exemplo, ligandos homo- ou hetero-bifuncionais como são bem conhecidos (ver, 1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section no cross-linkes, pages 155-200, incorporados aqui para referência).

[089] Conjugados adequados incluem, entre outros, marcadores como descritos abaixo, drogas e agentes citotóxicos incluindo, entre outros, drogas citotóxicas (como agentes quimioterapêuticos) ou toxinas ou fragmentos ativos de tais toxinas. Toxinas adequadas e seus fragmentos correspondentes incluem cadeia de difteria A, cadeia de exotoxina A, cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, curcina, crotina, fenomicina, enomicina e similares. Agentes citotóxicos também incluem radioquímicos feitos pela conjugação de radioisótopos aos anticorpos, ou pela ligação de um radionucleotídeo a um agente quelante que foi covalentemente preso ao anticorpo. As modalidades adicionais utilizam caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina, podetansina, duocarmicinas e análogos; para o último, ver U.S. 2003/0050331A1, integralmente incorporado para referência.

Modificações covalentes de Anticorpos

[090] Modificações covalentes de anticorpos são incluídas no escopo desta invenção, e são geralmente, mas não sempre, feitas pós- translacionalmente. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula por regiões de aminoácido de reação específica do anticorpo com um agente de derivatização orgânica que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou as regiões de terminais N ou C.

[091] Os resíduos de cisteinila reagem mais comumente com α- haloacetatas (e aminas correspondentes), tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para produzir derivados carboximetila ou carboxiamidometila. Os resíduos de cisteinila podem também ser derivatizados por reação com bromotrifluoroacetona, a-bromo-e-(5-imidozoil)ácido propiônicofosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil dissulfato, metil 2-piridil dissulfato, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, ou cloro-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazola e semelhantes.

[092] Os resíduos de histidila são derivatizados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5.5-7.0 devido a este agente ser relativamente específico para a cadeia lateral de histidila. O brometo de para-bromofenacila também é útil; a reação é de preferência realizada em 0.1M de cacodilato de sódio em pH 6.0.

[093] Os resíduos de terminal lisinila e amino reagem com ácido succínico ou outros anidros de ácido carboxílico. A derivatização com esses agentes tem o efeito de reverter a carga das regiões de lisinila. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos que contém alfa-amino incluem imidoésteres tais como metil picolinimidato; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroboroidrato; ácido trinitrobenzenosulfônico; O-metilisouréia; 2,4- pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxiilato.

[094] Os resíduos de arginila são modificados pela reação com um ou vários reagentes convencionais, dentre eles fenilglioxal, 2-3-butanodiona, 1-2- ciclohexanodiona e ninhidrina. A derivatização de regiões de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas devido a um pKa alto do grupo guanidina funcional. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina, assim como o grupo arginina epsilon-amino.

[095] As modificações específicas de resíduos de tirosila podem ser feitas, com interesse particular na introdução de marcadores espectrais nos resíduos de tirosila por reação com compostos aromáticos diazônio ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizola e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosila são ionizados usando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para uso em radioimunoensaio, o método cloramina T descrito acima sendo adequado.

[096] Grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R'—N=C=N--R'), onde R e R' são grupos alquila opcionalmente diferentes, tais como 1- ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4- dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos aspartila e glutamila são convertidos em regiões asparaginila e glutaminila pela reação com íons de amônio.

[097] A derivatização com agentes bifuncionais é útil para anticorpos de reticulação a uma superfície ou matriz de suporte insolúvel em água para uso em uma variedade de métodos, além de métodos descritos abaixo. Os agentes de reticulação comumente utilizados incluem, por exemplo, 1-1-bis (diazoacetil)-2 feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres de ácido 4-azidosalicílico, Imidoésteres homobifunctional, incluindo ésteres de disuccinimidila como 3,3'-ditio(succinimidilpropionato), e maleimidas bifuncionais, como bis-N maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes, tais como metil-3-[(p azidofenila) ditio] propioimidato produzem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar ligações cruzadas na presença de luz. Alternativamente, matrizes reativas insolúveis em água, tais como carboidratos ativados com brometo de cianogênio e substratos reativos descritos nas patentes US. Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537, 4.330.440 e, todos integralmente incorporados para referência, são utilizados para a imobilização de proteínas.

[098] Os resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desamidados para resíduos de aspartila e glutamila correspondentes, respectivamente. Em alternativa, estes resíduos são desamidados sob condições levemente ácidas. De qualquer forma estes resíduos se inserem no âmbito da presente invenção.

[099] Outras modificações incluem a hidroxilação da prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilas de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos α-amino da lisina, arginina e cadeias laterais de histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], integralmente incorporados para referência), acetilação da amina de terminal N, e amidação de qualquer grupo carboxila com terminal C.

Glicosilação

[0100] Outro tipo de modificação covalente é a glicosilação. Em outra modalidade, as variantes de IgG aqui divulgadas podem ser modificadas para incluir uma ou mais gliicoformas modificadas. Por "glicoformas modificadas" tal como aqui utilizado significa uma composição de carboidratos que é covalentemente ligada a um IgG, em que tal composição de carboidratos difere de tal IgG original. As glicoformas modificadas podem ser úteis para uma variedade de finalidades, incluindo, entre outros, aumentar ou reduzir a função efetora. As glicoformas modificadas podem ser geradas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:34663473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1, todos integralmente incorporados para referência; (Potelligent® technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zürich, Switzerland]). Muitas dessas técnicas baseiam-se em controlar o nível de oligossacarídeos fucosilados e/ou divididos que são covalentemente ligados a região de Fc, por exemplo, expressando um IgG em vários organismos ou linhagens celulares, modificadas ou de outro modo (por exemplo, células CHO Lec-13 ou células YB2/0 de hibridoma de rato), pela regulagem de enzimas envolvidas na via de glicosilação (por exemplo FUT8 [α1-6 fucosiltranserase] e/ou β1-4-N- acetilglucosaminiltransferase III[GnTIII]), ou através da modificação de carboidratos(s) após IgG ter sido expresso. A glicoforma modificada normalmente se refere à diferentes carboidratos ou oligossacarídeos, desse modo, uma variante de IgG, por exemplo, um anticorpo ou fusão de Fc, pode incluir uma glicoforma modificada. Alternativamente, a glicoforma modificada pode referir-se a variante de IgG que compreende os diferentes carboidratos ou oligossacarídeos. Como é conhecido na técnica, os padrões de glicosilação podem depender da sequência da proteína (por exemplo, a presença ou ausência de determinados resíduos de aminoácidos de glicosilação, discutido abaixo), ou a célula hospedeira ou organismo em que a proteína é produzida. Sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo.

[0101] A glicosilação de polipeptídeos costuma ser ligada a N ou O. A ligação a N refere-se à fixação de fração de carboidratos na cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo de asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a fixação enzimática de fração de carboidrato para a cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer dessas sequências de tri-peptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação em potencial. A glicosilação ligada a O refere-se à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.

[0102] A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada, alterando a sequência de aminoácidos tal que a mesma contenha uma ou mais das sequências de tri-peptídeo acima descritas (para locais de glicosilação tipo N-ligada). A alteração também pode ser feita através da adição ou da substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina para a sequência de partida (para locais de glicosilação ligadas a O). Para facilitar, a sequência de aminoácidos do anticorpo é preferencialmente alterada por mudanças no nível do DNA, particularmente através da mutação do DNA que codifica o polipeptídio alvo em bases pré-selecionadas, tais como os códons que são gerados, que se traduzirão nos aminoácidos desejados.

[0103] Outros meios de aumentar o número de frações de carboidratos sobre o anticorpo é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos à proteína. Estes processos são vantajosos na medida em que não exigem a produção de proteínas em uma célula hospedeira que tenha capacidades para glicosilação ligadas a N e O. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(res) pode(m) estar associado(s) a: (a), arginina e histidina, (b) carboxilas livres, (c) grupos sulfidrila livres, como as cisteínas, (d) grupos hidroxilas livres como os da serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como os da fenilalanina, tirosina e triptofano, ou (f) grupo amida da glutamina. Estes métodos são descritos no WO 87/05330 e Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, ambos integralmente incorporados para referência.

[0104] A remoção de frações de carboidratos presentes no anticorpo de partida pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química exige a exposição da proteína ao composto de ácido trifluormetanosulfônico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando intacto o polipeptídeo. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131, ambos integralmente incorporados por referência. A clivagem enzimática de frações de carboidratos em polipeptídeos pode ser alcançada através da utilização de uma variedade de endo e exo-glicosidases, como descrito por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350, integralmente incorporados por referência. A glicosilação em locais de glicosilação potencial pode ser evitada com o uso do composto tunicamicina, como descrito por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105, integralmente incorporados por referência. A Tunicamicina bloqueia a formação de ligações de proteína N- glicosídeo.

[0105] Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a vários polímeros não proteináceos incluindo, entre outros, vários polióis, tais como polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, na forma estabelecida em, por exemplo, catálogo de PEG 2005-2006 Nektar Therapeutics (disponível no site do Nektar) Patentes U.S. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337, integralmente incorporados para referência. Além disso, como é conhecido na técnica, substituições de aminoácidos podem ser feitas em várias posições dentro do anticorpo para facilitar a adição de polímeros, tais como PEG. Ver, por exemplo, Publicação US no. 2005/0114037A1, integralmente incorporados para referência.

Anticorpos Marcados

[0106] Em algumas modalidades, a modificação covalente de anticorpos da invenção compreende a adição de um ou mais marcadores. Em alguns casos, estes são considerados fusões de anticorpos. O termo "grupo de marcação" significa qualquer marcador detectável. Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado ao anticorpo via braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para proteínas de marcação são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para a realização da presente invenção.

[0107] Em geral, os marcadores englobam uma variedade de classes, dependendo do ensaio em que estão a ser detectado: a) marcação isotópica, que pode ser radioativa ou de isótopos pesados; b) marcação magnética (por exemplo, partículas magnéticas); c) frações de redução ativa; d) tintas ópticas, grupos enzimáticos (por exemplo, peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), e) grupos biotinilados e f) epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíperes da leucina, sítios de ligação para os anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, indicador de epítopo, etc.) Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado ao anticorpo via braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para proteínas de marcação são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para a realização da presente invenção.

[0108] Marcadores específicos compreendem corantes ópticos incluindo, entre outros, cromóforos, fósforos e fluoróforos, com o específico sendo este último, em muitos casos. Fluoróforos podem ser fluoros de molécula "pequena" ou fluoros proteináceos.

[0109] Por "marcador fluorescente" entende-se qualquer molécula que pode ser detectada através de suas propriedades fluorescentes inerentes. Marcadores fluorescentes apropriados incluem, entre outros, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malacito, estilbeno, amarelo lucifer, azul Cascade vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, Red LC 640, 5 Cy, Cy 5.5, Red LC 705, verde Oregon, as tinturas-Alexa Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascata Azul, Amarelo e Cascade R- ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina e Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Os corantes adequados ópticos, incluindo fluoróforos, estão descritos no Manual de sondas Moleculares por Richard P. Haugland, integralmente incorporados para referência.

[0110] Marcadores fluorescentes proteináceos adequados também incluem, entre outros, proteína fluorescente verde, incluindo uma Renilla, Ptilosarcus, ou uma espécie Aequorea de GFP (Chalfie et al. 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc ., Genbank Accession Number U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, 24:462-471 Biotechniques; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178182), proteína fluorescente amarela reforçada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408 - 5417), β- galactosidase (Nolan et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277,WO99/49019, Patente US nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Todas as referências acima citadas neste parágrafo sendo expressamente incorporadas aqui por referência.

Variantes IgG

[0111] Em uma modalidade, a invenção fornece proteínas IgG variante. No mínimo, as variantes IgG compreendem um fragmento de anticorpo que compreende a a região CH2-CH3 de cadeia pesada. Além disso, as variantes IgG adequadas incluem domínios Fc (por exemplo, incluindo a região de dobradiça inferior), bem como variantes de IgG que constituem a região constante da cadeia pesada (CH1-dobradiça-CH2-CH3), também sendo útil na presente invenção, todas as que podem ser fundidas aos parceiros da fusão.

[0112] Uma variante IgG inclui uma ou mais modificações de aminoácidos em relação a um polipeptídeo IgG original, em alguns casos, em relação à IgG do tipo selvagem. A variante de IgG pode ter uma ou mais propriedades otimizadas. Uma variante IgG difere na sequência de aminoácidos de sua IgG original em virtude de, pelo menos, uma alteração de aminoácidos. Assim variantes IgG tem, pelo menos, uma alteração de aminoácidos em relação ao original. Alternativamente, as variantes de IgG podem ter mais de uma modificação de aminoácidos, em comparação com a original, por exemplo, de cerca de uma a cinquenta modificações de aminoácidos, de preferência de cerca de uma a dez modificações de aminoácidos e, mais preferencialmente, de cerca de uma a cinco modificações de aminoácidos em relação ao original.

[0113] Assim, as sequências das variantes de IgG e aquelas do polipeptídeo de Fc original são substancialmente homólogas. Por exemplo, as sequências de variantes de IgG variante aqui terá cerca de 80% de homologia com a sequência de variante IgG original, de preferência, pelo menos cerca de 90% de homologia, e mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95% de homologia. Modificações podem ser feitas geneticamente usando a biologia molecular, ou podem ser feitas por via enzimática ou química.

Antígenos-alvos para anticorpos

[0114] Praticamente qualquer antígeno pode ser orientado pelas variantes IgG, incluindo, entre outros, proteínas, subunidades, domínios, motivos e/ou epítopos pertencentes a seguinte lista de antígenos-alvo, que inclui fatores solúveis, tais como citocinas e fatores ligados a membrana, incluindo os receptores de transmembrana: 17-IA, 4-1BB, 4dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor A1 de Adenosina, A33, ECA, ECA-2, ativina, ativina A, ativina AB, Ativina B, Ativina C, Ativina RIA, ativina RIA ALK-2, Ativina RIIA, Ativina RIB ALK-4, Ativina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS , ADAMTS4, ADAMTS5, adressinas, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, alfa-V/beta- 1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRiL, AR, ARC, ART, Artemina, anti-Id, ASPÁRTICO, fator natriurético atrial, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, estimulador de linfócitos B (BLyS), BACE , BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, Bak, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b- ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM , BLK, BMP, BMP-2 BMP-2, BMP-3 osteogenina, BMP-4-2b BMP, BMP-5, BMP-6 VGR-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP- 8a, OP-2), BMPR, IA BMPR (ALK-3), IB BMPR (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMPs, b NGF, BOK, bombesina, fator neurotrófico derivado do osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator complementar 3 (C3), C3a, C4, C5, C5, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno associado ao carcinoma, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina S, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, ICC, CCK2 , CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCl4, CCL5, CCL6 , CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8 , CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22 CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34 , CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Clostridium botulinum, toxinas Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG - 2, o CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15 , CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno citoqueratina associado ao tumor, DAN, DCC DcR3, DC-SIGN, fator de decaimento de aceleração, des(1-3), IGF- I (IGF-1 cérebro), Dhh digoxina, DNAM-1, DNAse, DPP, DPPIV/CD26, DTK, ECAD, a EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA , receptores de endotelina, Encefalinase, Enos, EOT, eotaxin1, EpCAM, B2 Efrina/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, Fator II, fator VII, fator VIIIc, Fator IX, proteína de ativação de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio estimulante de folículo, fractalcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (VGR-2 ), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF- 9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, alfa2-TFG, TFG-alfa3, GITR, glucagon, Glut 4, glicoproteína IIb / IIIa (GP IIb / IIIa) , GM-CSF, gp130, gp72, GRO, fator de liberação do hormônio de crescimento, Hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, envelope de glicoproteína HCMV glicoproteína do envelope gB, HCMV)gH , HCMV UL, fator de crescimento hematopoético (HGF), Hepatite B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3), HER4 (ErbB-4), glicoproteína do vírus do herpes simples (HSV) gB, gD HSV glicoproteína HGFA, antígeno associado ao melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA), HIV gp120, HIV gp IIIB 120 ciclo V3, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, HRK, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor IgA, IgE, IGF, proteínas de ligação IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF- gama, Inibina, iNOS, insulina cadeia A, insulina cadeia B, fator de crescimento semelhante à insulina 1, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfaV), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina Alfa6, integrina beta1, integrina beta2, gama interferon, IP-10, I-TAC, JE, Calicreína 2, Calicreína 5, 6 Calicreína, Calicreína 11, Calicreína 12, Calicreína 14, 15 Calicreína, Calicreína L1, Calicreína L2, Calicreína L3, Calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de queratinócitos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, Lefti, antígeno Lewis-Y, antígeno relacionado Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, L- selectina, LT-a, LT- b, LTB4, LTBP-1, surfactante pulmonar, hormônio luteinizante, receptor beta linfotoxina, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, metaloproteases, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1 alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP- 2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, MPO, MSK, MSP, mucina (MUC1), MUC18, substância mueleriana-inibitina, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-caderina, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou - 6, Neurturina, fator de crescimento neuronal (NGF), NGFR, NGF-beta , nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio da paratireóide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP), PlGF, PLP, PP14, proinsulina, Prorelaxina, Proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específica da próstata (PSMA), PTEN, PTHrP, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, Relaxina de cadeia A, relaxina de cadeia B, renina, vírus sincicial respiratório (RSV F), RSV Fgp, Ret, fatores reumatóides, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, serina, albumina, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína-72 associada ao tumor), TARC, TCA-3, receptores de células T (por exemplo, receptor alfa/beta de células T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina testicular semelhante a PLAP, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan específica, TGF-beta RI (ALK -5), TGF-beta RII, TGF- beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF- beta5, trombina, Thimus Ck-1, hormônio estimulante da tireóide, Tie, TIMP, TeQ, fator tecidual, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (R ODF RANK, TRANCE R) TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF-RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL TNFRH2 R2), TNFRST23 (DcTRAIL TNFRH1 R1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (Ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (Ligando TRANCE/RANK ODF, Ligando OPG), TNFSF12 (Ligando TWEAK Apo-3, Ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BLyS BAFF, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligando HVEM LIGHT, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (Ligando GITR Ligando AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-A Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (Ligando OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (Ligando CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Ligando Fas Ligando Apo-1, Ligando APT1), TNFSF7 (Ligando CD27 CD70), TNFSF8 (Ligando CD153 CD30), TNFSF9 (Ligando 4-1BB CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, R2- TRAIL, TRANCE, receptor de transferência, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno CA 125 associado ao tumor, antígeno associado ao tumor que expressa Lewis Y relacionados a carboidratos, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Uroquinase, VCAM, VCAM-1, VeCAD, VE-Caderina, VE-caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), Vegi, VIM, antígenos virais, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, fator von Willebrand, PD-1, Wnt1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, Wnt5a, WNT5B, WNT6, Wnt7a, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1 , XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD e receptores para hormônios e fatores de crescimento.

[0115] Uma pessoa versada na técnica considerará que a referida lista de alvos não se refere apenas às proteínas específicas e biomoléculas, mas o caminho bioquímico ou caminhos que os compõem. Por exemplo, a referência a CTLA-4 como um antígeno alvo implica que os ligandos e receptores que compõem a via de co-estimulação de células T, incluindo CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28, e quaisquer outros ligandos desconhecidos ou receptores que se ligam estas proteínas, também sejam alvos. Desse modo, o alvo, como aqui usado, não se refere apenas a uma biomolécula específica, mas ao conjunto de proteínas que interagem com tal alvo e os elementos do caminho bioquímico para o qual o alvo pertence. Uma pessoa versada na técnica ainda considerará que qualquer um dos antígenos-alvo acima mencionados, ligandos ou receptores que as ligam, ou outros membros do seu caminho bioquímico correspondente, podem ser operacionalmente ligados às variantes de Fc da presente invenção, a fim de gerar uma fusão de Fc. Assim, por exemplo, uma fusão de Fc que tem como alvo EGFR pode ser construída por ligação de forma operacional uma variante de Fc a EGF, TGF-b, ou qualquer outro ligando, descoberto ou não-descoberto, que se liga ao EGFR. Assim, uma variante de Fc da presente invenção pode ser operativamente ligada a EGFR, a fim de gerar uma fusão de Fc que liga EGF, TGF-b, ou qualquer outro ligando, descoberto ou não-descoberto, que se liga ao EGFR. Assim, praticamente qualquer polipeptídeo, seja o domínio de um ligando, receptor, ou alguma outra proteína ou domínio de proteína incluindo, entre outros, os alvos acima referidos e as proteínas que compõem os seus caminhos bioquímicos correspondentes, podem ser operacionalmente ligados as variantes de Fc da presente invenção para desenvolver uma fusão de Fc.

[0116] A escolha do antígeno apropriado depende da aplicação desejada. Para o tratamento anticâncer é desejável ter um alvo cuja expressão é restrita às células cancerosas. Alguns alvos que comprovaram ser principalmente adequados à terapia de anticorpos são aqueles com funções de sinalização. Outros anticorpos terapêuticos exercem seus efeitos através do bloqueio da sinalização do receptor, inibindo a ligação entre o receptor e seu ligando cognato. Outro mecanismo de ação dos anticorpos terapêuticos deve causar a sub-regulação de receptor. Outros anticorpos não funcionam por sinalização através de seu antígeno alvo. Em alguns casos, os anticorpos direcionados aos agentes de doenças infecciosas são usados.

[0117] Em uma modalidade, as variantes de Fc da presente invenção são incorporadas a um anticorpo contra uma citocina. Alternativamente, as variantes de Fc são fundidas ou conjugadas a uma citocina. Por "citocina", usado aqui significa um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que age sobre outra célula como mediadores intercelulares. Por exemplo, conforme descrito no Penichet et al. 2001, J Immunol Methods 248:91-101, expressamente incorporado para referência, as citocinas podem ser fundidas à anticorpos para fornecer um conjunto de propriedades desejáveis. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, hormônios polipeptídeos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão os hormônios do crescimento, tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionila e hormônio de crescimento bovino, hormônio da paratireóide, tiroxina, insulina; pró-insulina, relaxina; pró- relaxina; hormônio de glicoproteína, tal como hormônio estimulante de folículo (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático, fator de crescimento de fibroblastos, prolactina, lactogênio placentário, fator de necrose tumoral alfa e beta; substância inibidora de muleriana; peptídeo associado a gonadotrofina de camundongo; inibina, ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo, tal como NGF-beta, fator de crescimento plaquetário; fatores de crescimento de transformação (TGFs), tais como TGF-alfa e TGF-beta, fator-I e II de crescimento semelhante a insulina; eritropoietina (EPO), fatores osteoindutores; interferons, tais como o interferon-alfa, beta e gama; fatores estimuladores de colônias (QCA), tais como macrófagos-CSF (M-CSF), granulócitos e macrófagos-CSF (GM-CSF ) e de granulócitos-CSF (G-CSF), interleucinas (ILs), tais como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, fator de necrose tumoral, como o TNF-alfa e TNF-beta; C5a, e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e kit ligando ( KL). Como usado aqui, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes, equivalentes biologicamente ativos de citocinas de sequência nativa.

[0118] Citocinas e alvos solúveis, como membros da superfamília de TNF, são alvos preferenciais para o uso com as variantes da presente invenção. Por exemplo, anti-VEGF, anti-CTLA-4, e anticorpos anti-TNF, ou fragmentos dos mesmos, são particularmente bons anticorpos para a utilização de variantes de Fc que aumentam a ligação FcRn. Produtos terapêuticos contra esses alvos são frequentemente envolvidos no tratamento de doenças autoimunes e exigem injeções múltiplas durante longos períodos de tempo. Portanto, maior meia-vida sérica e tratamentos menos frequentes trazidos pelas variantes da presente invenção, são particularmente preferidos.

[0119] Vários anticorpos e fusões de Fc que são aprovados para uso, em ensaios clínicos, ou em desenvolvimento podem se beneficiar das variantes de Fc da presente invenção. Estes anticorpos e fusões de Fc são aqui referidos como "produtos clínicos e candidatos". Assim, em uma modalidade preferida, os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem encontrar uso em uma gama de produtos clínicos e candidatos. Por exemplo, vários anticorpos que tomam como alvo CD20 podem se beneficiar dos polipeptídeos de Fc da presente invenção. Por exemplo, os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem encontrar uso de um anticorpo que é substancialmente semelhante ao rituximabe (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (ver, por exemplo, U.S. 5.736.137), um anticorpo anti-CD20 quimérico aprovado para o tratamento de linfoma não-Hodgkin; Humax-CD20, anti-CD20 atualmente a ser desenvolvido por Genmab, um anticorpo anti-CD20 descrito no U.S. 5.500.362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (intracelular), e PRO70769 (PCT/US2003/040426, intitulado "variantes de imunoglobulina e seus usos"). Vários anticorpos que atacam elementos alvos da família de receptores de fator de crescimento epidérmico, incluindo o EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3), HER4 (ErbB-4), podem se beneficiar dos polipeptídeos de Fc da presente invenção. Por exemplo, os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem encontrar uso de um anticorpo que é substancialmente semelhante ao trastuzumab (Herceptin®, Genentech) (ver, por exemplo, U.S. 5.677.171), um anticorpo humanizado anti- Her2/neu aprovado para tratar o câncer de mama; pertuzumabe (rhuMab-2C4, Omnitarg™), atualmente sendo desenvolvido pela Genentech, um anticorpo anti-Her2 descrito no U.S 4.753.894; cetuximabe (Erbitux®, Imclone) (U.S. 4.943.533; PCT WO 96/40210), um anticorpo anti-EGFR quimérico em ensaios clínicos para uma variedade de cânceres; ABX-EGF (E.U. 6.235.883), atualmente sendo desenvolvido pela Abgenix-Immunex-Amgen; Humax-EGFR (USSN 10/172, 317), actualmente a ser desenvolvido pela Genmab, 425, EMD55900, EMD62000 e EMD72000 (Merck KGaA) (U.S. 5.558.864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (US 5,891,996; US 6, 506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); e SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138). Em outra modalidade preferida, os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem encontrar uso em alemtuzumabe (Campath®, Millennium), um anticorpo monoclonal humanizado atualmente aprovado para o tratamento de células B da leucemia linfocítica crônica. Os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem encontrar uso em uma variedade de anticorpos ou fusões de Fc que são substancialmente similares aos de outros produtos clínicos e candidatos, incluindo, entre outros, muromonab-CD3 (OKT3 ortoclone®), um anticorpo anti-CD3 desenvolvido pela Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetano (Zevalin ®), um anticorpo anti-CD20 desenvolvido pelo IDEC/Schering AG, ozogamicina gemtuzumab (Mylotarg ®), um anticorpo anti-CD33 (proteína p67), desenvolvido por Celltech / Wyeth, alefacept (Amevive®), um anti-LFA-3 de fusão de Fc desenvolvido pela Biogen) abciximab (ReoPro®), desenvolvido por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desenvolvido pela Novartis, palivizumab (Synagis®), desenvolvido pela MedImmune, infliximab (Remicade ®), um anticorpo anti-TNFalfa desenvolvido por Centocor, adalimumab (Humira®), um anticorpo anti-TNFalfa desenvolvido pela Abbott, Humicade™, um anticorpo anti-TNFalfa desenvolvido pela Celltech, etanercept (Enbrel®), um anti-TNFalfa de fusão de Fc desenvolvido pela Immunex/Amgen, ABX-CBL, um anticorpo anti-CD147 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-IL8 , um anticorpo anti-IL8 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo anti-MUC18 sendo desenvolvido pela Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), um anti- MUC1 em desenvolvimento pela Antisoma, Therex (R1550), um anti- anticorpo MUC1 sendo desenvolvido pela Antisoma, AngioMab (AS1405), a ser desenvolvido pela Antisoma, HuBC-1, a ser desenvolvido pela Antisoma, Tioplatina (AS1407) a ser desenvolvido pela Antisoma, Antegren® (natalizumab), um anti-alfa-4 beta -1 (VLA-4) e anticorpo alfa-4 beta-7 sendo desenvolvido pela Biogen, VLA-1 mAb, um anticorpo anti-integrina VLA-1 sendo desenvolvido pela Biogen, LTBR mAb, um anticorpo do receptor beta anti linfotoxina (LTBR) sendo desenvolvido pela Biogen, CAT-152, um anticorpo anti-TGF-β2 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology, J695, um anticorpo anti-IL-12 a ser desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Abbott, CAT-192, um anticorpo anti-TGFβ1 a ser desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e a Genzyme, CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxin1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology™, LymphoStat-B um anticorpo anti-BLyS sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences Inc., TRAIL - R1mAb, um anticorpo anti-TRAIL-R1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences, Inc., bevacizumab Avastin™ (rhuMAb-VEGF), um anticorpo anti-VEGF sendo desenvolvido pela Genentech, um anticorpo da família de receptores anti-HER a ser desenvolvido pela Genentech, fator anti-tecidual (ATF), um anticorpo do fator tecidual a ser desenvolvido pela Genentech, Xolair™ (omalizumab), um anticorpo anti-IgE sendo desenvolvido pela Genentech, Raptiva™ (efalizumab), um anticorpo anti-CD11a sendo desenvolvido pela Genentech e Xoma, anticorpo MLN-02 (antes LDP-02), a ser desenvolvido pela Genentech e Millennium Pharmaceuticals, Humax CD4, um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pela Genmab, Humax-IL15, um anticorpo anti-IL15 sendo desenvolvido pela Genmab e Amgen, Humax-inflam, sendo desenvolvido por Genmab e Medarex, Humax-câncer, um anticorpo anti-heparanase I sendo desenvolvido pela Genmab e Medarex e GcoSciences Oxford, Humax-Linfoma, a ser desenvolvido pela Genmab e Amgen, Humax -TAC, a ser desenvolvido pela Genmab, IDEC-131, e o anticorpo anti-CD40L sendo desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 sendo desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, um anti-CD23 a ser desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, fator de migração anti- macrófagos (MIF) a ser desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, BEC2, um anticorpo anti-idiotípicos sendo desenvolvido pela ImClone, IMC-1C11, um anticorpo anti-KDR a ser desenvolvido pela ImClone, DC101, um anticorpo anti-flk-1 a ser desenvolvido pela ImClone, anticorpos anti-VE caderina sendo desenvolvido pela ImClone, CEA-Cide ™ (labetuzumab), um anticorpo de antígeno anti-carcinoembrionário (CEA) a ser desenvolvido pelo Immunomedics, LymphoCide ™ (epratuzumab), um anticorpo anti-CD22 a ser desenvolvido pelo Immunomedics, AFP-Cide, a ser desenvolvido pelo Immunomedics, MyelomaCide, sendo desenvolvido por Immunomedics, LkoCide, sendo desenvolvido por Immunomedics, ProstaCide, a ser desenvolvido por Immunomedics, MDX-010, um anticorpo anti-CTLA4 sendo desenvolvido pela Medarex, MDX-060, um anticorpo anti-CD30 a ser desenvolvido pela Medarex, MDX-070 a ser desenvolvido pela Medarex, MDX018 a ser desenvolvido pela Medarex, Osidem™ (IDM-1) e anticorpos anti-Her2 sendo desenvolvidos pela Medarexe and Immuno-Designed Molecules, Humax™-CD4, um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab, Humax, IL15, um anticorpo anti-IL15 sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab, CNTO 148, um anticorpo anti-TNFa sendo desenvolvido pela Medarex e Centocor/J&J, CNTO 1275, um anticorpo anti-citocina sendo desenvolvido por Centocor/J&J, MOR101 e MOR102, anti-ICAM-1 (ICAM-1 ) (CD54) anticorpos sendo desenvolvidos pela MorphoSys, MOR201, um anticorpo de receptor 3 de fator de crescimento anti- fibroblastos (FGFR-3) a ser desenvolvido pela MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), um anticorpo anti- CD3 sendo desenvolvido pela Protein Design Labs, HuZAF™, um anticorpo anti-interferon-gama a ser desenvolvido pela Protein Design Labs, Integrina Anti-α5β1, a ser desenvolvido pela Protein Design Labs, anti-IL-12, desenvolvido pela Protein Design Labs, ING-1, um anticorpo anti-Ep-CAM a ser desenvolvido pela Xoma e MLN01, um anticorpo anti-beta2 integrina sendo desenvolvido pela Xoma, todas as referências acima citadas neste parágrafo são expressamente incorporadas neste documento para referência.

[0120] Os polipeptídeos de Fc da presente invenção podem ser incorporados nos candidatos e produtos clínicos acima mencionados, ou em anticorpos e fusões de Fc que são substancialmente semelhantes a eles. O Polipeptídeos de Fc da presente invenção pode ser incorporado em versões de candidatos e produtos clínicos acima mencionadsos que são humanizados, amadurecidos por afinidade, projetados, ou modificados de alguma outra forma.

[0121] Em uma modalidade, os Polipeptídeos de Fc da presente invenção são utilizados para o tratamento das indicações autoimunes, inflamatórias, ou transplante. Os antígenos alvos e produtos clínicos e os candidatos que são relevantes para essas doenças incluem, entre outros, anticorpos integrina anti-α4β7, como LDP-02, anticorpos integrina anti-beta2, como LDP-01, anti-complemento (C5), tais como anticorpos 5G1.1, anticorpos anti-CD2, tais como BTI-322, MEDI-507, anticorpos anti-CD3, como OKT3, SMART anti-CD3, anticorpos anti-CD4 como o IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A, anticorpos anti-CD11a, anticorpos anti-CD14 como o IC14, anticorpos anti- CD18, anticorpo anti-CD23, como IDEC 152, anticorpos anti-CD25, como Zenapax, anticorpos anti-CD40L como 5c8, Antova, IDEC-131, os anticorpos anti-CD64 como a MDX-33, anticorpos anti-CD80, como IDEC-114, anticorpos anti-CD147 como ABX-CBL, anti-E-selectina como anticorpos CDP850, anticorpos anti-gpIIb/IIIa como ReoPro/ Abcixima, anti- ICAM-3, como anticorpos ICM3, anticorpos anti-ICE como VX-740, anticorpos anti-FcR1 como MDX-33, anticorpos anti-IgE como rhuMab-E25, anticorpos anti-IL-4, como SB- 240683, anticorpos anti-IL-5 como SB-240563, SCH55700, anti-IL-8, tais como anticorpos ABX IL8, anticorpos anti-interferon gama, anti-TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF-alfa), tais como anticorpos CDP571 , CDP870, D2E7, Infliximab, MAK-195F e anti-VLA-4, tais como anticorpos Antegren.

[0122] Os variantes de Fc da presente invenção, tais como aqueles com maior ligação à FcRn podem ser utilizados em moléculas inibidoras de TNF para proporcionar melhores propriedades. As moléculas do inibidor de TNF úteis incluem qualquer molécula que inibe a ação do TNF-alfa em um mamífero. Exemplos adequados incluem a fusão de Fc de Enbrel® (etanercept) e os anticorpos Humira® (adalimumab) e Remicade® (infliximab). Os anticorpos monoclonais (como Remicade e Humira) modificados usando as variantes de Fc da presente invenção para aumentar a ligação FcFn, podem traduzir em uma melhor eficácia através de um aumento da meia-vida.

[0123] Em algumas modalidades, os anticorpos contra as doenças infecciosas são usados. Anticorpos contra as células eucarióticas incluem anticorpos contra células de levedura incluindo, mas não limitado a, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis e K. lactis, guillerimondii Pichia e P. pastoris., Schizosaccharomyces pombe, Plasmodium falciparium, e Yarrowia lipolytica.

[0124] Os anticorpos contra células fúngicas adicionais também são úteis, incluindo antígenos alvo associados às cepas de Candida, incluindo Candida glabrata, Candida albicans, C. krusei, C. lusitaniaeand C. maltosa, bem como as espécies de Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides, Blastomyces e Penicillium, entre outros.

[0125] Os anticorpos dirigidos contra antígenos alvo associados com protozoários incluem, mas não estão limitados a, os anticorpos associados com Trypanosoma, incluindo espécies de Leishmania incluindo Leishmania donovanii, Plasmodium spp., Pneumocystis carinii, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, e Cyclospora cayetanensis.

[0126] Os anticorpos direcionados contra antígenos procarióticos também são úteis, incluindo anticorpos contra bactérias adequados, tais como procariótes patogênicos e não patogênicos incluindo, entre outros, Bacillus, incluindo o Bacillus anthracis, Vibrio, por exemplo, V. cholerae; Escherichia, por exemplo, E. coli enterotoxigênica, Shigella, por exemplo, S. dysenteriae, Salmonela, por exemplo, S. typhi, por exemplo, Micobactéria, por exemplo, M. tuberculosis, M. leprae, Clostridium, por exemplo, C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C.perfringens; Cornyebacterium, por exemplo, C. diphtheriae, Streptococcus, S. pyogenes, S. pneumoniae, Staphylococcus, por exemplo, S. aureus, Haemophilus, por exemplo, H. influenzae, Neisseria, por exemplo, N. meningitidis, N. gonorrhoeae; Yersinia, por exemplo, Y. lamblia, Y. pestis, Pseudomonas, por exemplo, P. aeruginosa, P. putida, a clamídia, por exemplo, C. trachomatis; Bordetella, por exemplo, B. pertussis, Treponema, por exemplo, T. palladium, B. anthracis, Y. pestis, Brucella spp., Tularensis F., B. mallei, B. Pseudomallei, B. mallei, B.pseudomallei, Clostridium botulinum, Salmonella spp., toxina B de SEB V. cholerae, E. coli O157:H7, Listeria spp., beigelii Trichosporon, Rhodotorula espécies, Hansenula anomala, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Listeria spp., Mycoplasma sp.e semelhantes.

[0127] Em alguns aspectos, os anticorpos são dirigidos contra infecções virais; estes vírus incluem, entre outros, incluindo ortomixovirus (por exemplo, o vírus da gripe), paramixovirus (por exemplo, vírus sincicial respiratório, vírus da caxumba, vírus do sarampo), adenovírus, rinovírus, coronavírus, reovirus, togavirus (por exemplo, do vírus da rubéola), parvovírus, poxvírus (por exemplo, o vírus da varíola, o vírus vaccinia), enterovírus (poliovírus, por exemplo, coxsackievirus), vírus da hepatite (incluindo A, B e C), herpesvírus (por exemplo, vírus herpes simplex, vírus varicela zoster, citomegalovírus, vírus Epstein-Barr), rotavírus, vírus Norwalk, hantavirus, por arenavírus, Rhabdovirus (por exemplo, o vírus da raiva), os retrovírus (incluindo HIV, HTLV I e II), papovavirus (papilomavírus, por exemplo), poliomavirus e picornavírus, e assim por diante.

Propriedades Otimizadas de Variante IgG

[0128] O presente pedido também fornece variantes de IgG que são otimizadas para uma variedade de propriedades terapêuticas relevantes. Uma variante de IgG que foi projetada ou prevista para exibir uma ou mais propriedades otimizadas é aqui referida como uma “variante de IgG otimizada”. As propriedades mais preferidas que podem ser otimizadas incluem, entre outros, a afinidade aumentada ou reduzida para FcRn e meia-vida aumentada ou diminuída in vivo. As modalidades adequadas incluem os anticorpos que apresentam maior afinidade de ligação para FcRn em pH baixos, como o pH associado com endossomas, por exemplo, pH 6,0, mantendo a menor afinidade com pH mais altos, como 7,4., para permitir uma maior absorção em endossomos, mas com taxas de liberação normal Da mesma forma, esses anticorpos com ligação FcRn modulada podem opcionalmente ter outras propriedades desejáveis, tais como ligação FCYR modulada, tal como descrito no USSNs USSNs 11/174, 287, 11/124, 640, 10/822, 231, 10/672, 280, 10/379, 392, e o pedido de patente intitulado “IgG Immunoglobulin variants with optimized effector function” depositado em 21 de outubro de 2005 tendo pedido. No. 11/256.060. Ou seja, propriedades otimizadas incluem, entre outros, afinidade aumentada ou reduzida para um FcyR. Em uma modalidade opcional, as variantes IgG são otimizadas para possuir afinidade maior para um ser humano ativando FcyR, de preferência FcyRIIIa além do perfil de ligação de FcRn. Em ainda outra modalidade opcional alternativa, as variantes de IgG são otimizadas para possuir reduzida afinidade para o FcyRIIb de receptor inibidor humano. Ou seja, modalidades particulares abrangem o uso de anticorpos que apresentam maior ligação aos FcRn, e aumentam a ligação FcyRIIIa. Outras modalidades fazem uso de anticorpos que apresentam maior ligação aos FcRn e ligação FcyRIIIa aumentada. Essas modalidades devem fornecer polipeptídeos de IgG com melhores propriedades terapêuticas em seres humanos, por exemplo, função efetora intensificada e maior potência anticâncer. Em uma modalidade alternativa, as variantes de IgG são otimizadas para terem afinidade por FcRn aumentada ou reduzida e afinidade para um FcyR humano aumentada ou diminuída, incluindo mas não limitado a, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIb, FcyRIIC , FcyRIIIa e FcyRIIIb incluindo suas variações alélicas. Essas modalidades devem fornecer polipeptídeos de IgG com melhores propriedades terapêuticas em seres humanos, por exemplo, função efetora intensificada e maior potência anticâncer. Em outras modalidades, as variantes IgG proporcionam maior afinidade para FcRn e maior afinidade para um ou mais FcyRs, e ainda reduzida afinidade para um ou mais Fcy Rs. Por exemplo, uma variante IgG pode ter reforçado a ligação FcRn e FcyD RlIIa, ainda reduzido a ligação FcyRIIb. Como alternativa, uma variante IgG pode ter reduzido a ligação FcRn e FcyR's. Em outra modalidade, uma variante de IgG pode ter reduzido a afinidade para FcRn e aumentado a afinidade para FcyRIIb, ainda afinidade reduzida para um ou mais FcyRs de ativação. Em ainda outra modalidade, uma variante IgG pode ter aumentado a meia-vida sérica e reduzido a funções efetoras.

[0129] A modalidades preferidas incluem a otimização de ligação a um FcRn humanos e FcyR, porém em modalidades alternadas as variantes IgG possuem afinidade aumentada ou reduzida para FcyR e FcRn a partir de organismos não-humanos, incluindo mas não limitado aos roedores e primatas não-humanos. As variantes de IgG que são otimizadas para ligação a um FcRn não humano podem encontrar uso em experimentação. Por exemplo, os modelos de camundongo estão disponíveis para uma variedade de doenças que permitem a análise de propriedades, tais como eficácia, toxicidade e farmacocinética de um candidato a determinada droga. Como é conhecido na técnica, as células cancerosas podem ser enxertadas ou injetadas em camundongos para imitar um câncer humano, um processo conhecido como xenoenxerto. Teste de variantes de IgG, que compreendem variantes de IgG que são otimizadas para FcRn podem fornecer informações valiosas no que diz respeito às características da depuração das proteínas, o seu mecanismo de depuração, e assim por diante. As variantes de IgG também podem ser otimizadas para maior funcionalidade e/ou propriedades de solução em forma aglicosilada. Os ligandos de Fc incluem, entre outros, FcRn, FcyRs, C1q, e as proteínas A e G, e podem ser de qualquer fonte, incluindo, entre outros, humanos, camundongo, rato, coelho, ou macaco, de preferência humano. Em uma modalidade preferida alternativa, as variantes de IgG são otimizadas para serem mais estáveis e/ou mais solúveis que a forma aglicosilada da variante IgG original.

[0130] As variantes de IgG podem incluir modificações que modulam a interação com o FC ligantes diferentes de FcRn e FcyRs, incluindo, entre outros, proteínas de complemento, e homólogos de receptor Fc (FcRHs). Os FcRHs incluem mas não estão limitados a, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH5 e FcRH6 (Davis et al. 2002, Immunol. Reviews 190:123-136, integralmente incorporados para referência).

[0131] Preferencialmente, a especificidade do ligando Fc da variante de IgG determinará a sua utilidade terapêutica. A utilidade de uma determinada variante de IgG para fins terapêuticos depende da forma ou epítopo do antígeno alvo e da doença ou da indicação a ser tratada. Para a maioria dos alvos e indicações, a ligação de FcRn melhorada pode ser preferível na medida em que a ligação de FcRn aumentada pode resultar em um aumento na meia- vida. A maior meia-vida sérica permite a administração de dosagem menos frequente ou inferior da terapêutica. Isto é particularmente preferível quando o agente terapêutico é dado em resposta a uma indicação que requer a administração repetida. Para alguns alvos e indicações, a afinidade a FcRn diminuída pode ser preferível. Isso pode ser especialmente preferível quando uma variante de Fc com depuração aumentada ou meia-vida sérica diminuída é desejada, por exemplo, em polipeptídeos de Fc usados como agentes de imagem ou de rádio terapêuticos.

[0132] As variantes de IgG que podem ser usadas compõem as variantes de IgG que oferecem maior afinidade com FcRn com maior ativação FcyRs e/ou menor afinidade para FcyRs inibitória. Para alguns alvos e indicações, pode ser mais benéfico utilizar variantes de IgG que fornecem seletividade diferencial para diferentes ativações de FcyRs, por exemplo, em alguns casos, a ligação intensificada a Fc/RIIA e FcyRIIIa pode ser desejada, mas não em Fc/RI, enquanto que em outros casos, a ligação intensificada apenas a Fc/RIIA pode ser preferida. Para alguns alvos e indicações, pode ser preferível utilizar variantes de IgG que alteram a ligação de FcRn e intensficam as funções efetoras mediadas por complemento e mediadas por Fc/R, enquanto que para outros casos pode ser vantajoso utilizar variantes de IgG que melhoram a ligação de FcRn, ou meia-vida de soro, e funções efetoras mediadas por Fc/R ou mediada por complemento. Para alguns alvos ou indicações de câncer, pode ser vantajoso reduzir ou extirpar uma ou mais funções efetoras, por exemplo, pela neutralização da ligação a C1q, um ou mais Fc/R, FcRn ou um ou ligandos Fc. Para outros alvos e indicações, pode ser preferível utilizar variantes de IgG que oferecem maior ligação ao Fc/RIIb inibitória, contudo o nível WT, reduzido ou ligação removida para ativar Fc/Rs. Isto pode ser particularmente útil, por exemplo, quando o objetivo de uma variante de IgG é inibir a inflamação ou doença auto-imune, ou modular o sistema imunológico de alguma forma. Já que as doenças auto-imunes são geralmente de longa duração e o tratamento é dado em doses repetidas, seu tratamento com variantes de Fc e aumento da meia-vida de FcRn é particularmente preferido.

[0133] A modificação pode ser feita para intensificar a estabilidade, solubilidade, função ou uso clínico de IgG. Em uma modalidade preferida, as variantes de IgG podem incluir modificações para reduzir a imunogenicidade em humanos. Em uma modalidade preferida, a imunogenicidade de uma variante IgG é reduzida utilizando um método descrito em USSN 11/004.590, integralmente incorporado para referência. Em modalidades alternativas, as variantes de IgG são humanizadas (Clark, 2000, 21:397-402 Immunol Hoje, integralmente incorporadas para referência).

[0134] As variantes de IgG podem incluir alterações que reduzem a imunogenicidade. As modificações para reduzir a imunogenicidade podem incluir modificações que reduzem a ligação de peptídeos processados derivados da seqüência original para proteínas MHC. Por exemplo, alterações de aminoácidos seriam modificadas de tal forma que não existam ou exista um número mínimo de epítopos imunes que sejam previstos para se ligar com alta afinidade, a qualquer alelo MHC predominante. Diversos métodos de identificação de epitopos de ligação de MHC em seqüências de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados para pontuar epitopos em uma variante de IgG. Ver, por exemplo, WO 98/52976; WO 02/079232; WO 00/3317; USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN 10/754,296; PCT WO 01/21823; e PCT WO 02/00165; Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: 942-948; Sturniolo et al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al., 1995, J. Immunol. 154: 5927-5933; and Hammer et al., 1994, J. Exp. Med. 180:2353-2358, todos integralmente incorporados para referência. As informações baseadas na sequência podem ser usadas para determinar uma pontuação de ligação para um determinado peptídeo - interação MHC (ver, por exemplo, Mallios 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios 2001, Bioinformatics 17: p942-948; Sturniolo al. al. 1999, Nature Biotech. 17:555-561, todos integralmente incorporados para referência).

Variantes de IgG modificados

[0135] As variantes da presente invenção podem ser concebidas de diversas formas. As variantes, como aqui descritas, podem ser inserções, exclusões, substituições, outras modificações, ou combinações destas e outras mudanças. A nova modalidade da presente invenção é o projeto de inserções e deleções que melhoram ou reduzem a ligação de um polipeptídeo Fc a um ligando Fc. Conforme divulgado aqui, inserções ou exclusões podem ser feitas de forma que aumentem ou diminuam a afinidade do polipeptídeo Fc para FcRn. Inserções e deleções podem ser criadas pelas abordagens racionais ou por abordagens que incluem o uso ou componentes aleatórios, tais como a criação de biblioteca aleatória ou semi-aleatória ou triagem. Em uma modalidade alternativa, as substituições são divulgadas de forma que aumentem ou diminuam a afinidade do polipeptídeo Fc para FcRn.

Modificações da estrutura: Inserções e deleções

[0136] Os polipeptídeos de variantes Fc podem ser criados através da substituição de um aminoácido de variante no lugar do aminoácido original em uma posição no polipeptídeo Fc. Ao substituir um ou mais aminoácidos para os aminoácidos da variante no polipeptídeo Fc, as cadeias laterais com essas posições são alteradas. A maioria das substituições úteis modifica as propriedades Fc, alterando as cadeias laterais de Fc. As cadeias laterais substituídas podem interagir diretamente ou indiretamente com um parceiro de ligação de Fc que está associado com uma função de Fc ou propriedade. Pelo menos uma substituição altera a estrutura covalente de uma ou mais cadeias de um polipeptídeo de Fc originais.

[0137] Alternativamente, os polipeptídeos Fc variante podem ser criados de forma que alterem a estrutura covalente da espinha dorsal do polipeptídeo Fc original. Os átomos da espinha dorsal nas proteínas são o nitrogênio do peptídeo, o carbono alfa, a carbonila ou o carbono do peptídeo e o oxigênio da carbonila. A alteração da estrutura covalente da espinha dorsal fornece métodos adicionais de alterar as propriedades dos polipeptídeos Fc. A estrutura covalente da espinha dorsal de Fc pode ser alterada pela adição de átomos na espinha dorsal, por exemplo, inserindo um ou mais aminoácidos ou a subtraindo átomos da espinha dorsal, por exemplo, excluindo um ou mais aminoácidos. A estrutura covalente da espinha dorsal também pode ser alterada mudando átomos individuais da espinha dorsal para outros átomos (Deechongkit et al. J Am Chem Soc. 2004. 126(51):16762-71, integralmente incorporado para referência). Como é sabido na técnica e é ilustrado aqui, inserções ou deleções de aminoácidos em polipeptídeos Fc podem ser feitas inserindo ou deletando os nucleotídeos correspondentes no DNA que codifica o polipeptídio Fc. Alternativamente, como é conhecido na técnica, inserções ou deleções de aminoácidos podem ser feitas durante a síntese de polipeptídeos Fc.

[0138] O projeto de inserções ou deleções de aminoácidos que alteram a interação do polipeptídeo Fc com um ou mais parceiros de ligação (por exemplo, FcgamaR's, FcRn, C1q) pode ser feito considerando a estrutura do complexo do polipeptídeo Fc e seu parceiro de ligação. Em uma modalidade menos preferida, o projeto pode ser feito considerando a estrutura do polipeptídeo Fc e informações sobre a região Fc envolvida na ligação ao parceiro de ligação Esta informação pode ser obtida através de experimentos de mutagênese, experimentos de exibição de fago, comparações de homologia, modelagem por computador ou outros meios.

[0139] As posições preferidas na seqüência de aminoácidos para inserções ou deleções que afetam as interações de ligação de FC, mas não afetam a estrutura global, a estabilidade, a expressão ou o uso do polipeptídeo Fc, são em laços que estão envolvidos nas interações do parceiro de ligação Fc/Fc. Para alterar a ligação FcRn ao polipeptídeo Fc, as posições 244-257, 279-284, 307-317, 383-390 e 428-435 são locais de laços preferidos para inserções ou deleções (numeração do índice UE de Kabat et al. Burmeister et al. 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al. 2001, Mol Cell 7:867-877, todos integralmente incorporados para referência). Para alterar a ligação do receptor Fcgama ao polipeptídeo Fc, as posições 229-239, 266-273, 294-299 e 324-331 são locais de laços preferidos para inserções ou deleções (numeração do índice UE de Kabat et al. 1E4K código PDB 1E4K.pdb Sondermann et al. Nature. 2000 406:267, todos integralmente incorporados para referência). Laços são as regiões do polipeptídeo não envolvidas na estrutura alfa helicoidal ou beta em folha. As posições de laços são posições que não estão nem na estrutura alfa helicoidal ou ou beta em folha (van Holde, Johnson e Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, Chapter 1 pp2-67, integralmente incorporado para referência). Posições de laços são preferíveis porque os átomos da espinha dorsal são geralmente mais flexíveis e menos provavelmente envolvidos em ligações de hidrogênio em comparação com os átomos da espinha dorsal de alfa hélices e folhas beta. Portanto, o alongamento ou encurtamento de um laço, devido a uma inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos é menos provável de provocar grandes mudanças disruptivas ao polipeptídeo Fc, incluindo estabilidade, expressão ou outros problemas.

[0140] Inserções e deleções podem ser usadas para alterar o comprimento do polipeptídeo. Por exemplo, em regiões de laços, alterar o comprimento do laço resulta em flexibilidade alterada e entropia conformacional do laço. As inserções em um laço geralmente aumentam a entropia conformacional do laço, que pode ser definida como a constante de Boltzman multiplicada pelo logaritmo natural do número de conformações possíveis (van Holde, Johnson e Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, pp78, integralmente incorporado para referência). Ao inserir pelo menos um aminoácido em um polipeptídeo, o número total de conformações disponíveis para o polipeptídeo aumenta. Estas conformações adicionais podem ser benéficas para formar interações de parceiro de ligação Fc/Fc favoráveis já que o polipeptídeo Fc pode usar uma das conformações adicionais na ligação da proteína de ligação de Fc. Neste caso, a inserção pode conduzir a interações mais fortes de parceiros de ligação Fc/Fc. Se as conformações adicionais não são usadas na interface de ligação, então, a inserção pode levar a interações mais fracas de parceiros de ligação Fc/Fc, pois as conformações adicionais competiriam com a conformação competente de ligação. Da mesma forma, a deleção de um segmento de polipeptídeo também pode levar a interações mais fortes ou mais fracas de parceiros de ligação Fc/Fc. Se a deleção de um segmento que reduz o número possível de conformações da espinha dorsal remover a conformação competente de ligação, então, a deleção pode levar a interações mais fracas de parceiros de ligação Fc/Fc. Se a deleção não remover a conformação competente de ligação, então, a deleção pode conduzir a interações mais fortes de parceiros de ligação Fc/Fc, porque a deleção pode remover conformações que competem com a conformação competente de ligação.

[0141] Inserções e deleções podem ser usadas para alterar as posições e orientações dos aminoácidos no polipeptídeo Fc. Já que as inserções e deleções causam uma mudança na estrutura covalente da espinha dorsal, elas necessariamente provocam uma mudança nas posições dos átomos da espinha dorsal. A figura 7 compara as posições de espinha dorsal em alguns segmentos de laço, marcados L1 a L4, em três diferentes espinhas dorsais. A estrutura de espinha dorsal de referência contém quatro segmentos de laços, enquanto a espinha dorsal de deleção carece do segmento L1 e o segmento de inserção inclui um segmento adicional antes, ou seja, N terminal para o segmento L1. As deleções e inserções causam a maior alteração na estrutura da espinha dorsal perto do local da inserção ou deleção. Deletando um segmento perto do final do terminal N do laço, por exemplo, segmento L1, o laço encurta e os segmentos restantes mudam sua posição para mais próxima ao terminal N do laço. Isto tem o efeito de mover o segmento L2 para o local anterior do segmento L1 e para o terminal N do laço. Esta mudança de posição do segmento L2 para o segmento L1 pode reforçar a ligação do complexo de parceiro de ligação Fc/Fc e é preferida quando houver informação prévia sugerindo que o aminoácido ou aminoácidos localizados em L2 fazem interações favoráveis com o parceiro de ligação de Fc, quando localizado em L1. Por exemplo, se L2 contém alanina e tirosina e o uso de dois aminoácidos L1 em lugar de alanina e tirosina anteriormente leva a uma variante de Fc com ligação aumentada, então, a deleção de L1 pode criar uma variante Fc com elevada afinidade ao parceiro de ligação de Fc.

[0142] Da mesma forma, uma inserção de um segmento de polipeptídeo em um polipeptídeo Fc no lado do terminal N de um laço faz com que as posições dos segmentos de laços sejam mudadas para o lado do terminal C do laço. Na Figura 7, uma inserção de um ou mais aminoácidos antes, ou seja, N terminalmente ao segmento L1 altera a conformação da espinha dorsal incluindo uma troca do segmento L1 para o final do terminal C do laço. Este tipo de inserção é preferido quando os aminoácidos localizados no segmento L1 são conhecidos por fazerem interações favoráveis quando localizados nas posições L2, porque a inserção pode levar a interações mais fortes de parceiros de ligação Fc/Fc. Se as interações mais fracas de parceiros de ligação Fc/Fc são desejadas, então, a inserção pode ser usada para trocar aminoácido desfavorável para uma nova posição. Os segmentos de referência, deletados e inseridos (L1 e L4 na Figura 7) podem ser um ou mais de um aminoácido no polipeptídeo Fc.

[0143] Alternativamente, inserções ou deleções podem ser utilizadas no final do terminal C de laços de forma análoga às inserções ou deleções no final do terminal N de laços. Inserções no terminal C do laço podem levar a um movimento das posições de terminal N da inserção em direção ao terminal N do laço. Deleções no terminal C do laço podem levar a um movimento das posições do terminal N da deleção em direção ao terminal C do laço. A escolha da utilização de uma inserção ou deleção no final do terminal N ou terminal C do laço baseia-se nos aminoácidos localizados no laço, no desejo de aumento ou diminuição da afinidade de parceiros de ligação Fc/Fc e no deslocamento posicional desejado.

[0144] Inserções ou deleções podem ser utilizadas em qualquer região de um polipeptídeo Fc, incluindo as regiões de laços, alfa hélice e folha beta. Os locais preferidos para inserções e deleções incluem regiões de laço, que são aquelas que não são regiões alfa hélice ou folha beta. Os laços são preferidos porque eles geralmente aceitam alterações na espinha dorsal melhor do que alfa hélices ou folhas beta. Os locais especialmente preferidos para inserções ou deleções que resultam em mais fortes interações proteína/proteína estão nas bordas do terminal N ou terminal C de um laço. Se as cadeias laterais do laço estão envolvidas nas interações de parceiros de ligação Fc/Fc, então, inserções ou deleções nas bordas são menos propensas a causarem mudanças prejudiciais fortemente nas interações de ligação. As deleções dentro do centro exato do laço são mais propensas a remover resíduos importantes na interface de parceiros de ligação Fc/Fc e inserções dentro do centro exato do laço são mais propensas a criar interações desfavoráveis na interface de parceiro de ligação Fc/Fc. O número de resíduos deletados ou inseridos pode ser determinado pelo tamanho da mudança da espinha dorsal pretendida com inserções ou deleções de 15 ou menos resíduos preferidos, inserções ou deleções de 10 ou menos resíduos sendo mais preferidas e inserções ou deleções de 5 ou menos resíduos sendo a mais preferidas.

[0145] Uma vez que a posição e o tamanho de uma variante de deleção de Fc são projetados, a seqüência de polipeptídeo inteira é completamente determinada e o polipeptídeo pode ser construído por métodos conhecidos na técnica.

[0146] As variantes de inserção de Fc, no entanto, possuem a etapa adicional de projetar a seqüência de, pelo menos, um aminoácido a ser inserido. Inserções de resíduos polares, inclusive Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Gly, His, são preferíveis em posições esperadas para serem expostas no polipeptídeo Fc. Os aminoácidos menores, incluindo Ser, Thr e Ala são particularmente preferidos porque o tamanho pequeno é menos provável para de interfir estericamente com as interações de parceiros de ligação Fc/Fc. Ser e Thr também têm a capacidade de ligação de hidrogênio com átomos no parceiro de ligação Fc.

[0147] Inserções também têm a flexibilidade adicional de que o polipeptídeo inserido pode ser concebido para fazer interações favoráveis com o parceiro de ligação Fc como seria desejado quando mais forte ligação de parceiro de ligação Fc/Fc é desejada. O comprimento da inserção na espinha dorsal pode ser determinado por modelagem da espinha dorsal variante com uma seqüência simples e genérica a ser inserida. Por exemplo, inserções de poliserina, poliglicina ou polialanina de comprimentos diferentes podem ser construídas e modeladas. A modelagem pode ser feita por uma variedade de métodos, incluindo a modelagem de homologia com base em conhecidas estruturas tridimensionais de homólogos compreendendo a inserção, e por modelos de computador, incluindo MODELLER (M.A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000) e ROSETTA (Kuhlman et al. (2003). Science 302, 1364-8), ambos integralmente incorporados para referência. Normalmente, várias conformações de espinha dorsal são geradas inicialmente e a estrutura da espinha dorsal final pode ser determinada após as identidades da cadeia lateral serem estabelecidas. As cadeias laterais podem ser criadas por algoritmos PDA® (US 6188965, 6269312, 6403312, 6801861, 6804611, 6792356, 6950754 e USSN 09/782,004, 09/927,790, 10/101,499, 10/666,307; 10/666,311, 10/218,102, todos integralmente incorporados para referência).

[0148] Inserções e deleções podem ser feitas para alterar a ligação de polipeptídeos Fc a FcgamaR de forma análoga ao método descrito para alterar as propriedades de ligação de FcRn. Os domínios Fc se ligam à FcgamaR na posição indicada na figura 1. Estruturas do complexo Fc/FcgammaR, incluindo códigos PDB 1T89 e 1IIS (Radaev S et al. J. Biol. Chem. V276, p.16469-16477 integralmente incorporados para referência), demonstram os resíduos de interação e os laços entre as duas estruturas. Os resultados da mutagênese, tais como aqueles encontrados em US11/124,620 e US6737056, ambos integralmente incorporados para referência), todos têm utilidade em determinadas trocas apropriadas de posicionamento de espinha dorsal.

[0149] Inserções e deleções podem ser criadas em qualquer polipeptídeo além dos polipeptídeos Fc pelos métodos descritos aqui. Por exemplo, inserções ou deleções no membro da superfamília TNF, APRIL, podem ser concebidas com a ajuda de sua estrutura tridimensional (código PDB 1XU1.pdb, Hymowitz, et al. (2005), J. Biol. Chem. 280:7218, integralmente incorporado para referência). Inserções ou deleções podem ser projetadas para aumentar a ligação de APRIL ao seu receptor, TACI. Os resíduos de laço preferidos como locais de inserção ou deleção são resíduos Ser118-Val124, Asp164-Phe167, Pro192-Ala198, Pro221-Lys226. Estes laços interagem com TACI no complexo APRIL/TACI e mediam a ligação.

Polipeptídeos que incorporam variantes

[0150] As variantes IgG podem ser baseadas em seqüências de IgG humanas, e assim, as seqüências de IgG humanas, portanto, são usadas como sequências "base" contra as quais outras seqüências são comparadas incluindo, mas não limitando-se a, seqüências de outros organismos, por exemplo, sequências de roedores e primatas. As variantes de IgG também podem incluir seqüências de outras classes de imunoglobulina como IgA, IgE, IgD, IgM, e assim por diante. É considerado que, embora as variantes de IgG sejam projetadas no contexto de uma IgG original, as variantes podem ser modificadas ou "transferidas" para o contexto de outra, segunda IgG original. Isto é feito através da determinação dos resíduos “equivalentes" ou "correspondentes" e das substituições entre a primeira e a segunda IgG, geralmente com base na seqüência ou homologia estrutural entre as seqüências de IgGs. A fim de estabelecer homologia, a seqüência de aminoácidos de uma primeira IgG aqui destacada é diretamente comparada com a seqüência de uma segunda IgG. Depois de alinhar as seqüências, usando um ou mais programas de alinhamento de homologia conhecidos na técnica (por exemplo, utilizando resíduos conservados como entre espécies), permitindo inserções e deleções necessárias, a fim de manter o alinhamento (ou seja, evitando a eliminação de resíduos conservados através de deleção e inserção arbitrária), os resíduos equivalentes a determinados aminoácidos na seqüência primária da primeira variante de IgG são definidos. O alinhamento de resíduos conservados de preferência deve conservar 100% desses resíduos. Contudo, o alinhamento de mais de 75% ou tão pouco como 50% dos resíduos conservados também é adequado para definir os resíduos equivalentes. Os resíduos equivalentes também podem ser definidos através da determinação de homologia estrutural entre uma primeira e uma segunda IgG que está ao nível da estrutura terciária para IgGs cujas estruturas foram determinadas. Neste caso, os resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais coordenadas atômicas de dois ou mais dos átomos da cadeia principal de um resíduo de aminoácido específico do original ou precursor (N em N, CA em CA, C em C e O em O) estão dentro de 0,13 nm e de preferência 0,1 nm após o alinhamento. O alinhamento é obtido após o melhor modelo ser orientado e posicionado para dar a máxima sobreposição das coordenadas atômicas dos átomos na proteína não de hidrogênio das proteínas. Independentemente da forma como resíduos equivalentes ou correspondentes são determinados e independentemente da identidade da IgG original em que as IgGs são feitas, o que se deseja transmitir é que as variantes de IgG descobertas podem ser engenheiradas em qualquer segunda IgG original que tenha importante seqüência ou homologia estrutural com a variante de IgG. Assim, por exemplo, se um anticorpo de variante é gerado onde o anticorpo original é IgG1 humana usando os métodos descritos acima ou outros métodos de determinação de resíduos equivalentes, o anticorpo de variante pode ser engenheirado em outro anticorpo IgG1 original que liga um antígeno diferente, um anticorpo humano IgG2 original, um anticorpo IgA humano original, um anticorpo IgG2a de camundongo ou original IgG2b, e assim por diante. Novamente, como descrito acima, o contexto da variante IgG original não afeta a capacidade de transferir variantes de IgG para outras IgGs originais.

[0151] São fornecidos métodos para a engenheirar, produzir e selecionar variantes de IgG. Os métodos descritos não são destinados a restringir qualquer aplicação em particular ou teoria de operação. Em vez disso, os métodos fornecidos devem ilustrar de modo geral que uma ou mais variantes de IgG podem ser engenheiradas, produzidas e triadas experimentalmente para obter variantes de IgG com função efetora otimizada. Uma variedade de métodos é descrita para a concepção, produção e testes de variantes de anticorpo e proteína em USSN 10/754, 296 e USSN 10/672, 280, ambos integralmente incorporados para referência.

[0152] Uma variedade de métodos de engenheirar proteína pode ser usada para projetar variantes de IgG com função efetora otimizada. Em uma modalidade, um método de engenheirar com base em estrutura pode ser utilizado, em que as informações estruturais disponíveis são usadas para guiar substituições, inserções ou deleções. Em uma modalidade preferida, um método de triagem computacional pode ser utilizado, onde as substituições são projetadas com base na sua adequação energética em cálculos computacionais. Ver, por exemplo, USSN 10/754,296 e USSN 10/672,280 e referências citadas nele, todos integralmente incorporados para referência.

[0153] Um alinhamento de seqüências pode ser utilizado para orientar substituições nas posições identificadas. Uma pessoa versada na técnica considerará que a utilização das informações de seqüência pode reduzir a introdução de substituições que são potencialmente nocivas para a estrutura da proteína. A fonte das seqüências pode variar amplamente e inclui um ou mais dos bancos de dados conhecidos, incluindo, entre outros, o banco de dados Kabat (Northwestern University), Johnson & Wu, de 2001, Nucleic Acids Res. 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res. 28:214-218), o banco de dados IMGT (IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System®; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:307-310), e VBASE, todos integralmente incorporados para referência. As informações de seqüência de anticorpos podem ser obtidas, compiladas e/ou geradas a partir de alinhamentos de seqüência de seqüências de linhagem germinativa ou seqüências de anticorpos de ocorrência natural de qualquer organismo, incluindo, entre outros, mamíferos. Uma pessoa versada na técnica considerará que o uso de seqüências que são humanas ou substancialmente humanas pode ainda ter a vantagem de ser menos imunogênico quando administradas a um ser humano. Outros bancos de dados que são bancos de dados mais gerais de ácido nucléico ou proteína, ou seja, não particular a anticorpos, incluem, entre outros, Banco de Dados de Sequencia de Nucleotídeo SwissProt, GenBank Entrez e EMBL. As seqüências alinhadas podem incluir sequências VH, LV, CH e/ou CL. Existem inúmeros programas de alinhamento com base em seqüência e métodos conhecidos na técnica e todos esses encontram uso na geração de alinhamentos de seqüência.

[0154] Alternativamente, os métodos de mutagênese aleatória ou semi- aleatória podem ser usados para fazer as modificações de aminoácidos nas posições desejadas. Nestes casos, as posições são escolhidas aleatoriamente ou as mudanças de aminoácidos são feitas por meio de regras simplistas. Por exemplo, todos os resíduos podem ser mutados para alanina, denominado como varredura de alanina. Tais métodos podem ser unidos a abordagens mais sofisticadas de engenharia que utilizam métodos de seleção para selecionar os níveis mais elevados de diversidade de seqüência. Como é conhecido na técnica, há uma variedade de tecnologias de seleção que podem ser utilizadas para tais abordagens incluindo, por exemplo, as tecnologias de visualização como exibição de fago, exibição de ribossomo, exposição da superfície celular e similares, como descrito abaixo.

[0155] Métodos de produção e triagem de variantes de IgG são bem conhecidos na técnica. Os métodos gerais para biologia molecular de anticorpos, expressão, purificação e triagem são descritos em Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Biol Chem 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Biomed Eng 2:339-76. Veja também os métodos descritos em USSN 10/754,296; USSN 10/672,280 e USSN 10/822,231 e 11/124,620, todos integralmente incorporados para referência.

[0156] As variantes preferidas da presente invenção incluem aquelas encontradas na Figura 8. Alternativamente, as variantes preferidas da presente invenção incluem aquelas encontradas na Figura 9. Além disso, alternativamente as variantes preferidas da presente invenção incluem aquelas encontradas na Figura 10. Essas variantes têm mostrado ligação elevada ao receptor Fc, FcRn, como ilustrado nos exemplos.

Fabricação de variante IgG

[0157] As variantes de IgG podem ser feitas por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade, as seqüências de variante IgG são usadas para criar ácidos nucléicos que codificam as seqüências de elemento e que podem, então, ser clonadas em células hospedeiras, expressadas e ensaiadas, se desejado. Estas práticas são realizadas através de procedimentos conhecidos e uma variedade de métodos que podem encontrar uso nas mesmas é descrita em Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), ambos integralmente incorporados para referência. Os ácidos nucléicos que codificam as variantes de IgG podem ser incorporados a um vetor de expressão a fim de expressar a proteína. Os vetores de expressão geralmente incluem uma proteína operavelmente ligada, ou seja, colocada em uma relação funcional, com seqüências de controle ou regulatórias, marcadores selecionáveis, quaisquer parceiros de fusão e/ou elementos adicionais. As variantes de IgG podem ser produzidas por cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, de preferência um vetor de expressão, contendo ácido nucleico que codifica as variantes de IgG, em condições adequadas para induzir ou provocar a expressão da proteína. Uma grande variedade de células hospedeiras adequadas pode ser utilizada, incluindo, entre outros, células de mamíferos, bactérias, células de inseto e leveduras. Por exemplo, uma variedade de linhagens de células que podem encontrar uso é descrita no catálogo de linhagem de células ATCC, disponível da American Type Culture Collection, integralmente incorporado para referência. Os métodos de introdução de ácido nucléico exógeno em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica e variarão de acordo com a célula hospedeira utilizada.

[0158] Em uma modalidade preferida, as variantes de IgG são purificadas ou isoladas após a expressão. Os anticorpos podem ser isolados ou purificados em uma variedade de maneiras conhecidas por aqueles versados na técnica. Os métodos de purificação padrão incluem técnicas de cromatografia, eletroforese, imunológicas, precipitação, diálise, filtração, concentração e técnicas de cromatofocagem. Como se conhece na técnica, uma variedade de proteínas naturais se liga a anticorpos, por exemplo, proteínas bacterianas A, G, e L, e estas proteínas podem encontrar uso em purificação. Muitas vezes, a purificação pode ser ativada por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, as proteínas podem ser purificadas usando resina glutationa se uma fusão GST for empregada, cromatografia de afinidade Ni+2 se um His-tag for empregado, ou anticorpos anti-flag imobilizados se um flag-tag for utilizado. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar Antibody Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, integralmente incorporado para referência.

Triagem de variantes de IgG

[0159] As variantes de Fc podem ser triadas usando uma variedade de métodos, incluindo, entre outros, aqueles que usam ensaios in vitro, in vivo e ensaios baseados em células e tecnologias de seleção. As tecnologias de automação e alta produtividade podem ser utilizadas nos processos de triagem. A triagem pode empregar o uso de um parceiro de fusão ou rótulo, por exemplo, um rótulo imune, um rótulo isotópico ou rótulo de molécula pequena como um corante fluorescente ou colorimétrico.

[0160] Em uma modalidade preferida, as propriedades funcionais e/ou propriedades biofísicas de variantes de Fc são triadas em um ensaio in vitro. Em uma modalidade preferida, a proteína é triada quanto a funcionalidade, por exemplo, sua capacidade de catalisar uma reação ou sua afinidade de ligação ao seu alvo.

[0161] Como é conhecido na técnica, os subconjuntos de métodos de triagem são aqueles que selecionam os elementos favoráveis em uma biblioteca. Os métodos são aqui denominados "métodos de selecção" e estes métodos encontram uso na presente invenção para triar variantes Fc. Quando bibliotecas de proteínas são triadas usando um método de seleção, apenas aqueles elementos de uma biblioteca que são favoráveis, ou seja, que satisfazem alguns critérios de seleção, são propagados, isolados e/ou observados. Uma variedade de métodos de seleção é conhecida na técnica que podem encontrar uso na presente invenção para triar bibliotecas de proteína. Outros métodos de seleção que podem encontrar uso na presente invenção incluem métodos que não dependem de exibição, tais como métodos in vivo. Um subconjunto de métodos de seleção denominados métodos de "evolução direcionada" são aqueles que incluem a combinação ou criação de seqüências favoráveis durante a seleção, às vezes com a incorporação de novas mutações.

[0181] Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc são triadas usando um ou mais ensaios in vivo com base celular. Para tais ensaios, as proteínas purificadas ou não-purificas são normalmente adicionadas exogenamente de forma que as células estão expostas a variantes individuais ou grupos de variantes pertencentes a uma biblioteca. Estes ensaios são geralmente, mas nem sempre, baseados na função do polipeptídeo Fc, isto é, a capacidade do polipeptídeo Fc de se ligar a seu alvo e mediar algum evento bioquímico, por exemplo, a função efetora, inibição de ligação de ligando/receptor, apoptose e assim por diante. Tais ensaios envolvem frequentemente a monitoração da resposta de células à IgG, por exemplo, a sobrevivência da célula, a morte celular, alteração da morfologia celular, ou a ativação transcricional, como expressão de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, os ensaios podem medir a capacidade de variantes Fc para produzir ADCC, ADCP, ou CDC. Para alguns ensaios células adicionais ou componentes, ou seja, além das células-alvo, podem precisar ser adicionadas, por exemplo, complemento de soro ou de células efetoras, tais como monócitos do sangue periférico (PBMCs), células NK, macrófagos e assim por diante. Essas células adicionais podem ser de qualquer organismo, de preferência, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Os anticorpos podem provocar a apoptose de linhagens celulares expressando o alvo ou podem mediar ataque a células alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Métodos para monitorar morte celular ou a viabilidade são conhecidos na técnica, e incluem o uso de corantes, imunoquímica, citoquímicos e reagentes radioativos. A ativação transcricional pode também servir como um método para ensaiar função em ensaios baseados em células. Alternativamente, as triagens com base em células são realizadas utilizando células que foram transformadas ou transfectadas com ácidos nucléicos que codificam as variantes. Isto é, as variantes de Fc não são adicionadas exogenamente às células.

[0182] As propriedades biológicas das variantes de IgG podem ser caracterizadas em experimentos de células, tecidos e organismos inteiros. Como é conhecido na técnica, as drogas são frequentemente testadas em animais, incluindo, entre outros, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e macacos, a fim de medir a eficácia de um medicamento para o tratamento contra uma doença ou modelo de doença ou para medir a farmacocinética de uma droga, toxicidade e outras propriedades. Os animais podem ser denominados modelos de doenças. A terapêutica é frequentemente testada em camundongos, incluindo, entre outros, camundongos nude, camundongos SCID, camundongos de xenoenxerto e camundongos transgênicos (incluindo knockins e knockouts). Tal experimentação pode fornecer dados importantes para a determinação do potencial da proteína a ser usada como um terapêutico. Qualquer organismo, preferencialmente mamífero, pode ser utilizado para testes. Por exemplo, devido à sua semelhança genética com seres humanos, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados e, portanto, podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinética, ou outras propriedades de IgGs. Os testes em humanos são, em última instância, exigidos para a aprovação como drogas e, portanto, é claro que estes experimentos são considerados. Assim, IgGs podem ser testadas em seres humanos para determinar a sua eficácia terapêutica, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética e/ou outras propriedades clínicas.

Métodos de utilização de variantes IgG

[0183] As variantes de IgG podem encontrar uso em uma ampla gama de produtos. Em uma modalidade, a variante IgG é uma terapia, um diagnóstico ou um reagente de investigação, de preferência, um terapêutico. A variante de IgG pode encontrar uso em uma composição de anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Em uma modalidade preferida, as variantes de IgG são usadas para matar células-alvo que carregam o antígeno-alvo, por exemplo, as células cancerosas. Em uma modalidade alternativa, as variantes de IgG são usadas para bloquear, agonizar ou antagonizar o antígeno-alvo, por exemplo, para antagonizar uma citocina ou receptor de citocina. Em uma modalidade preferida, alternativamente as variantes de IgG são usadas para bloquear, agonizar ou antagonizar o antígeno-alvo e matar as células-alvo que carregam o antígeno alvo.

[0184] As variantes de IgG podem ser utilizadas para diversos fins terapêuticos. Em uma modalidade preferida, um anticorpo que inclui a variante de IgG é administrado a um paciente para tratar uma desordem relacionada ao anticorpo. Um "paciente" para os fins inclui os seres humanos e outros animais, de preferência, mamíferos e mais preferivelmente seres humanos. Por "desordem relacionada aos anticorpos" ou "desordem de resposta ao anticorpo" ou "condição" ou "doença" aqui queremos dizer uma desordem que pode ser amenizada com a administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma variante de IgG. As desordens relacionadas com anticorpos incluem, entre outros, doenças auto-imunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças neurológicas e doenças oncológicas e neoplásicas, incluindo câncer. "Câncer" e "cancerígenos" aqui se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que normalmente é caracterizada pelo crescimento não regulado da célula. Exemplos de câncer incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo lipossarcoma), tumores neuroendócrinos, mesotelioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia e malignidades linfóides.

[0185] Em uma modalidade, uma variante de IgG é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um paciente. Alternativamente, a variante de IgG é administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, incluindo, entre outros, agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, citocinas, agentes inibidores de crescimento, agentes anti- hormonais, inibidores da quinase, agentes anti-angiogênicos, cardioprotetores ou outros agentes terapêuticos. As variantes de IgG podem ser administradas concomitantemente com um ou mais esquemas terapêuticos. Por exemplo, uma variante de IgG pode ser administrada ao paciente, juntamente com quimioterapia, radioterapia ou quimioterapia e terapia de radiação. Em uma modalidade, a variante de IgG pode ser administrada em conjunto com um ou mais anticorpos, que pode ou não ser uma variante de IgG. De acordo com outra modalidade, a variante de IgG e uma ou mais outras terapias anti-câncer são empregadas para o tratamento de células cancerosas ex vivo. É considerado que o tratamento ex vivo como pode ser útil no transplante de medula óssea e, particularmente, transplante autólogo de medula óssea. É considerado que as variantes de IgG possam ser empregadas em combinação com ainda outras técnicas terapêuticas, como a cirurgia.

[0186] Uma variedade de outros agentes terapêuticos podem encontrar uso para a administração com as variantes IgG. Em uma modalidade, IgG é administrada com um agente anti-angiogênico. Por "agente anti-angiogênico" conforme usado aqui se entende um composto que bloqueia ou interfere de alguma forma, no desenvolvimento dos vasos sanguíneos. O fator anti- angiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou uma proteína, por exemplo, um anticorpo, fusão de Fc ou citocinas, que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção da angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido aqui é um anticorpo que se liga ao Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF). Em uma modalidade alternativa, IgG é administrada com um agente terapêutico que induz ou aumenta a resposta imune adaptativa, por exemplo, um anticorpo que atinge CTLA-4. Em uma modalidade alternativa, a IgG é administrada com um inibidor da tirosina quinase. Por "inibidor da tirosina quinase" conforme usado aqui se entende uma molécula que inibe, em certa medida, a atividade tirosina quinase de tirosina quinase. Em uma modalidade alternativa, as variantes IgG são administradas com uma citocina.

[0187] Composições farmacêuticas são consideradas em que uma variante IgG e um ou mais agentes terapeuticamente ativos são formulados. As formulações das variantes IgG são preparadas para armazenamento misturando a IgG com o grau desejado de pureza com transportadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington Pharmaceutical Sciences, 16 th edition, Osol, A. Ed. 1980, integralmente incorporado para referência), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem usadas na administração in vivo são preferivelmente estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. As variantes IgG e outros agentes terapeuticamente ativos divulgados aqui podem também ser formulados como imunolipossomas e/ou aprisionados em microcápsulas.

[0188] A concentração da variante IgG terapeuticamente ativa na formulação pode variar de cerca de 0,1 a 100% em peso. Em uma modalidade preferida, a concentração de IgG está na faixa de 0,003-1,0 molar. A fim de tratar um paciente, uma dose terapeuticamente eficaz da variante IgG pode ser administrada. Por "dose terapeuticamente eficaz" aqui se quer dizer uma dose que produz os efeitos para os quais ela é administrada. A dose exata dependerá da finalidade do tratamento e será determinável por uma pessoa versada na técnica através de técnicas conhecidas. As dosagens podem variar de 0,01-100 mg/kg de peso corporal igual ou superior, por exemplo, 0,01, 0,1, 1,0, 10 ou 50 mg/kg de peso corporal, com 1 a 10 mg/kg de preferência. Como é conhecido na técnica, os ajustes para a degradação de proteínas, a liberação sistêmica versus localizada, e taxa de síntese de protease nova, bem como a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, interação medicamentosa e a gravidade da condição podem ser necessários e serão determináveis com experimentação de rotina por aqueles versados na técnica.

[0189] A administração da composição farmacêutica compreendendo uma variante de IgG, de preferência sob a forma de uma solução aquosa estéril, pode ser feita em uma variedade de maneiras, incluindo, mas não limitado a, por via oral, subcutânea, intravenosa, parenteral, por via intranasal, intraótica, intraocular, retal, vaginal, transdérmica, via tópica (por exemplo, géis, pomadas, loções, cremes, etc.), por via intraperitoneal, por via intramuscular, intrapulmonar (por exemplo, tecnologia inalável AERx® comercialmente disponível de Aradigm ou sistema de liberação pulmonar Inhance® comercialmente disponível de Nektar Therapeutics, etc.) Terapêutico aqui descrito pode ser administrado concomitantemente com outros terapêuticos, ou seja, o terapêutico aqui descrito pode ser co-administrado com outras terapias ou terapêuticos incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, outros produtos biológicos, radioterapia, cirurgia, etc.

EXEMPLOS

[0190] Exemplos são fornecidos abaixo para ilustrar a presente invenção. Estes exemplos nao se destinam a restringir a presente invenção a qualquer aplicação particular ou teoria de operação. Para todas as posições discutidas na presente invenção, a numeração está de acordo com o índice da EU como em Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 a ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda , integralmente incorporado para referência). Aqueles versados na técnica de anticorpos considerarão esta convenção consiste em numeração não seqüencial em regiões específicas de uma seqüência de imunoglobulina, permitindo uma referência normalizada a posições conservadas em famílias de imunoglobulina. Assim, as posições de qualquer imunoglobulina dada como definida pelo índice da EU não corresponderão necessariamente a sua seqüência seqüencial.

EXEMPLO 1: Construção, expressão e purificação de DNA de variants Fc

[0191] Modificações de aminoácido foram engenheiradas na região Fc de anticorpos IgG para melhorar a afinidade deles ao receptor Fc neonatoal FcRn. Variantes foram triadas no context de numerosas cadeias constants de IgG humanas diferentes (Figura 2), incluindo sequências IgG1, IgG2 e uma IgG híbrida que contém o CH1 e a dobradiça superior de IgG1 e a região Fc de IgG2. Será apreciado por aqueles versados na tecnica que por causa das diferentes interações da região Fc de IgG1 e IgG2 com FcyRs e complemento, estas diferentes regiões de Fc original terão diferentes propriedades de função efetora mediada por FcyR e complement. Sequências exemplares de variants de Fc no context destas cadeias constants de IgG original são mostradas na Figura 3.

[0192] Variantes de Fc foram engenheiradas no contexto de um fator endotelial vascular alvo de anticorpo (VEGF). As regiões variáveis de cadeia pesada e leve (VH e VL) são aquelas de uma versão humanizada do anticorpo A4.6.1, também denominada bevacizumab (Avastin®), que é aprovada para o tratamento de uma variedade de cânceres. As sequências de aminoácido das regiões VH e VL deste anticorpo são mostradas na Figura 4.

[0193] Genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-VEGF foram construídos no vetor de expressão mamífero pTT5. Genes de cadeia constante IgG1 e IgG2 humanos foram obtidos de clones IMAGE e subclonados no vetor pTT5. O gene IgG1/2 foi construído usnado mutagênese PCR. Genes VH VL codificando os anticorpos anti-VEGF foram sintetizados comercialmente (Blue Heron Biotechnologies, Bothell WA), e subclonados nos vetores codificando as cadeias constantes apropriadas CL, IgG1, IgG2 e IgG1/2. Modificações de aminoácido foram construídas usando mutagênese direcionada a sítio usando os métodos de mutagênese direcionados a sítio QuikChange® (Stratagene, La Jolla CA). Todo o DNA foi seqüenciado para confirmar a fidelidade das sequências.

[0194] Plasmídeos contendo gene da cadeia pesada (VH-CY1-CY2-CY3) foram co-transfectados com plasmídeo contendo gene de cadeia leve (VL-CK) em células 293E usando lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e crescidos em meios FreeStyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após 5 dias de crescimento os anticorpos foram purificados do sobrenadante da cultura por afinidade a protein A usando a resina MabSelect (GE Healthcare). As concentrações de anticorpos foram determinadas pelo ensaio (Pierce) de ácido bicinconínico (BCA).

EXEMPLO 2. Anticorpos de variante Fc mantêm ligação a antígeno

[0195] A fidelidade dos anticorpos variantes expresados foi confirmada demonstrando que eles matinham especificidade ao antígeno. A ligação de VEGF foi monitorada usando ressonância de plasmon de superfície (SPR, Biacore), executada usando um instrumento Biacore 3000. VEGF recombinante (VEGF-165, PeproTech, Rocky Hill, NJ) foi aderido à superfície de chip de um CM5 acoplando com N-hidroxisuccinimida/N-etil-N’-(-3-dimetilamino-propil) carbodiimida (NHS/EDC) usando métodos padrao. Anticorpos WT e variantes foram injetados como analitos e a resposta, medida em unidades de ressonância (RU), foi adquirida. A fase de dissociação era lenta demais para medir as constantes de equilíbrio verdadeira e, assim, a ligação relativa foi determinada medindo as RU’s ao final da fase de associação que devia ser proporcional à concentração de proteína (que é mantida constante no experimento) e a constante da taxa de associação. Os dados (Figura 6) mostram que os anticorpos anti-VEGF variantes mantêm ligação a antígeno, em contraste com o anticorpo anti-Her2 de contrle negatico que não se liga a VEGF.

EXEMPLO 3. Medição de ligação a FcRn humano

[0196] A ligação de anticorpos variantes a FcRn humano was measured a pH 6.0, o pH ao qual ele é naturalmente ligado em endossomas. Vetores codificando microglobulina beta 2 e genes de cadeia alfa His-rotulados de FcRn foram construídos, co-transferidos para células 293T e purificados usando cromatografia de níquel. A afinidade de anticorpo para FcRn humano (hFcRn) a pH 6.0 foi medida em um instrumento Biacore 3000 acoplando FcRn humano a superfície de chip CM5 usando química padrão NHS/EDC. Anticorpos WT e variantes foram usados na fase móvel a concentração de 25-100 nM e a resposta foi medida em unidades de ressonância. As fases de associação e dissociação a pH 6.0 foram adquiridas, seguidas por uma injeção de tampão pH 7.4 para medir a liberação de anticorpo do receptor ao pH mais alto. Um cico com anticorpo e tampão apenas forneceu resposta da linha de base que foi subtraída de cada sensograma de amostra.

[0197] A Figura 7 mostra sensogramas Biacore para ligação de anticorpos IgG1 nativo e variante Fc selecionado a FcRn humano nos dois pH’s relevantes. Os dados mostram que os anticorpos tipo selvagem e variante se ligam prontamente a chip de FcRn a pH 6.0 e dissociam lentamente a esse pH, como eles fariam no endossoma, embora liberem rapidamente a pH7.4, como fariam mediante reciclagem de endossoma para a membrana e exposição ao pH mais alto do soro.

[0198] As curvas de associação/dissociação de FcRn não se encaixam em um modelo Langmuir simples, possivelmente devido à multi-valência de anticorpo e receptor ou heterogeneidade de chip. Pseudo valores Ka (denominados Ka*) foram determinados adequando a um modelo de mudança conformacional com a mudança no índice refrativo (RI) fixada a 0 RU. Estes valores para anticorpos variantes selecionados são plotados na Figura 8. A afinidade relativa de cada variante em comparação com a sua IgG original foi calculada de acordo com a equação Vezes = (WT Ka* / Variante Ka*). Os dados de ligação relativa para todas as variantes Fc em uma região Fc IgG1 são apresentados na Figura 9 e os dados de ligação para variantes em anticorpos com uma região Fc IgG2 (cadeias constantes IgG1 e IgG1/2) são apresentados na Figura 10. Para muitas variantes, o experimento de ligação foi repetido múltiplas vezes (n), para as as quais as vezes foram calculadas com referência ao WT IgG original dentro de cada experimento de ligação particular. A mediação destes dados forneceu uma média e desvio padrão conforme apresentados nas Figuras 9 e 10.

[0199] As Figuras 9 e 10 mostram numerosas variantes engenheiradas ligadas com afinidade maior a ligação de FcRn humano a pH 6.0 relativo a WT IgG1. As melhorias foram pesadamente dependentes da identidade da substituição a uma dada posição. For exemplo, usando 2 vezes como um critério para ligação melhorada numerosas mutações na posição 434 em IgG2 aumentaram a afinidade (A, S, Y, F e W), algumas eram neutras (dentro de 2 vezes de WT IgG2) (G, H, M e T) e numerosas substitutições reduziram a afinidade (< 0.5 vez) (D, E, K, P, R e V). Maior ligação no contexto de IgG1 necessariamente não se traduziu em ligação maior em IgG2 (for exemplo, 434T foi melhorada na ligação em IgG1, mas não em IgG2). Além disso, as melhorias proporcionadas por variantes simples nem sempre foram aditivas mediante combinação. A Figura 11a demonstra isto graficamente plotando a ligação FcRn em vezes experimentais por variantes de substituição dupla versus o produto da ligação FcRn em vezes pelas variantes simples individuais que as compõem. A linha reta representa aditividade perfeita, i.e, o valor que seria esperado ou previsto do produto das substituições simples. Numerosas variantes duplas caem nesta linha ou próximo a ela (259I/319I, 259I/428L, 319I/428L e 308F/428L). Várias variantes são menos do que aditivas (319I/308F, 252Y/428L e 428L/434M). Para estas variantes, particularly no caso das duas últimas (252Y/428L e 428L/434M), as melhorias na afinidade das substituições simples pareceriam ser incompatíveis uma com a outra quando combinadas. De modo surpreendente, as melhorias na afinidade de FcRn das variantes 259I/308F e 428L/434S foram maiores do que o esperado das afinidades de suas respectivas substituições simples. Estas substituições simples particulares tiveram melhorias sinérgicas inesperadas quando combinadas. A diferença entre afinidades experimentais e aquelas previstas das afinidades das variantes simples está plotada na Figura 11b, com variantes agrupadas de acordo com suas variantes simples compósitas (259I, 308F e 319I à esquerda e combinações com 482L à direita). A sinergia pode ser quantificada calculando as vezes do valor experimental em relação ao valor previsto seguido por normalização a 1 e conversão para uma porcentagem (% sinergia = 100x[(vezes experimentais/vezes previstas) - 1)]. Esta análise está plotada na Figura 11b, com variantes agrupadas de acordo com suas variantes simples compósitas. Este gráfico realça de novo a sinergia de algumas das variantes, particularmente 259I/308F e 428L/434S. As Figuras 11b e 11c também enfatizam a natureza não previsiva de combinar muitas das melhores substituições simples da triagem. Por exemplo, embora a combinação de 428L com 434S e 259I proporcionasse melhorias de ligação sinérgicas, 252Y ou 434M tiveram um impacto negativo quando combinadas com 428L. A dramática diferença entre combinar 428L com 434S versus 434M ainda realça a importância da particular identidade de aminoácido da substituição em uma dada posição.

EXEMPLO 4. Teste de variantes em outros contextos de anticorpo

[0200] Variantes de seleção foram construídas no contexto de anticorpos tendo como alvo outros antígenos, incluindo TNF (TNFα), CD25 (TAC), EGFR e IgE. A Figura 4 fornece as sequências de aminoácido das regiões VH e VL de anticorpos tendo como alvo estes antígenos que foram usados na invenção. Os anticorpos anti-TNF WT e variante de Fc contêm a região variável do anticorpo integralmente humano adalimumab (Humira®), atualmente aprovado para o tratamento de artrite reumatóide (RA), artrite idiopática juvenil (JIA), artrite psoríaca (PsA), espondilite anquilosante (AS) e doença de Crohn (CD). Os anticorpos anti-CD25 WT e variante de Fc são versões humanizadas do anticorpo anti-TAC (Junghans et al., 1990, Cancer Research 50:1495-1502) denominadas H1.8/L1 anti-TAC. Os anticorpos anti-EGFR WT e variante de Fc variant são versões humanizadas do anticorpo C225 murino, denominado H4.42/L3.32 C225. Finalmente, os anticorpos anti-IgE WT e variante de Fc contêm a região variável do anticorpo humanizado omalizumab (Xolair®), que é aprovado para o tratamento de asma alérgica.

[0201] Anticorpos WT e variante foram construídos, expressados e purificados como descrito acima. Anticorpos foram testados quanto a ligação a FcRn humano a pH 6.0 por Biacore como descrito acima. Os dados de ligação relativa dos anticorpos anti-TNF, -CD25, -EGFR e -IgE variantes a FcRn humano são fornecidos na Figura 12. Como se pode ver, as variantes melhoram a afinidade a FcRn no contexto de anticorpos tendo como alvo uma variedade de antígenos.

EXEMPLO 5. Experimentos farmacocinéticos em camundongo knock-in FcRn humano

[0202] Para testar a capacidade de variantes selecionadas melhorarem a meia vida in vivo, experimentos farmacocinéticos foram conduzidos em camundongos B6 que são knock-outs homozigotos para FcRn murino e knockins heterozigotos de FcRn humano (mFcRn-/-, hFcRn+) (Petkova et al., 2006, Int Immunol 18(12):1759-69, integralmente incorporado para referência), aqui denominados camundongos hFcRn ou hFcRn+. Uma injeção na veia da cauda intravenosa única de anticorpo anti-VEGF (2 mg/kg) foi dada a grupos de 4-7 camundongos fêmea randomizados por peso corporal (20-30g de faixa). Sangue (~50ul) foi colhido do plexus orbital em cada ponto no tempo, processado a soro e armazenado a -80°C até análise. As durações dos estudos foram de 28 ou 49 dias. Os animals não foram prejudicados durante estes estudos.

[0203] As concentrações de anticorpos foram determinadas usando dois ensaios ELISA. Nos primeiros dois estudos (denominados Estudo 1 e Estudo 2), anticorpo Fc anti-humano de cabra (Jackson Immuno research) foi aderido à placa, poços foram lavados com PBST (salina tamponada com fosfato com 0.05% Tween) e bloqueados com 3% BSA em PBST. Soro ou padrões de calibragem foram adicionados, seguidos por lavagem com PBST, adição de IgG anti-humano rotulado com európio (Perkin Elmer) e ainda lavagem com PBST. O sinal de fluorescência resolvido no tempo foi coletado. Para os Estudos 3-5, a concentração de soro foi detectada usando um ELISA similar, mas VEGF recombinante (VEGF-165, PeproTech, Rocky Hill, NJ) foi usado como reagente de captura e a detecção foi conduzida com anticorpo kapa anti- humano biotinilado e estreptavidina rotulada com europio. Parâmetros PK foram determinados para camundongos individuais com um modelo não compartimental usando WinNonLin (Pharsight Inc, Mountain View CA). Tempos nominais e dose foram usados com compensação uniforme de pontos. Os pontos no tempo usados (faixas lambda Z) foram de 4 dias até o fim do estudo, embora todos os pontos no tempo fossem usados para mutantes de liberação rápida, P257N e P257L.

[0204] Cinco estudos de anticorpo PK em camundongos mFcRn-/- hFcRn+ foram conduzidos. A Figura 13 mostra dados da concentração de soro para anticorpos IgG1 (Estudo 3) e IgG2 (Estudo 5) WT e variante, respectivamente. Parâmetros PK adequados de todos os estudos PK in vivo conduzidos em camundongos mFcRn-/- hFcRn+ são fornecidos na Figura 14. Os dados PK incluem meia vida que representa a fase beta que caracteriza a eliminação de anticorpo do soro, Cmax, que representa a concnetração de soro máxima observada, AUC, que representa a área sob a curva concetração tempo, e liberação, que representa a liberação de anticorpo do soro. Também prevista para cada variante é a melhoria em vezes calculada ou a redução na meia vida relativa ao anticorpo original IgG1 ou IgG2 [Vezes de meia vida = meia vida (variante) / meia vida (WT)].

[0205] Os dados mostram numerosos anticorpos variantes Fc engenheirados com afinidade FcRn intensificada a pH 6.0 que estendem a meia vida in vivo. A Figura 15a mostra um gráfico da meia vida in vivo versus the a ligação FcRn em vezes para os anticorpos IgG1, com variantes selecionadas rotuladas. Resultados de experimentos repetidos (circulados na figura) indicam que os dados do modelo in vivo são reproduzíveis. As melhores variantes simples incluem 308F e 434S, as melhores variantes duplas incluem 259I/308F, 308F/428L, 308F/434S e 428L/434S, e a melhor variante tripla é 259I/308F/428L. Há uma correlação geral entre afinidade a FcRn e meia vida in vivo, mas não é completamente previsível. Notadamente, as variantes 257L e 257N, que melhoraram a aligação FcRn em 3.4 e 3.5 vezes, respectivamente, reduziram a meia vida in vivo em 0.6 e 0.3, respectivamente. O gráfico também realça de novo a importância da identidade de aminoácido de substituição em uma dada posição - embora 308F/434S proporcionasse melhoria substancial de meia vida, 308F/434M foi escassamente melhor do que WT IgG1.

[0206] A Figura 15b mostra um gráfico da meia vida in vivo versus ligação de FcRn em vezes para os anticorpos IgG2 variantes com as variantes rotuladas. Quando os dados de IgG2 in vivo foram comparados com os dados de IgG1 in vivo (Figura 15c), um resultado surpreendente foi observado. As variantes forneceram uma melhoria substancialmente maior na meia vida in vivo no contexto de uma região de Fc de IgG2 do que o faz uma região Fc de IgG1. A variante simples mais longa e as meias vidas da variante dupla de todos os anticorpos em todos os 5 estudos eram 12.2 e 16.5, fornecidas por 434S IgG2 e 428L/434S IgG2, respectivamente. A melhoria dramática nas meias vidas para as variantes IgG2 relativas a IgG1 foi apesar do fato de que melhorias em vezes pelas variantes em IgG2 eram comparáveis ou mesmo mais baixas do que elas eram em IgG1 (vezes de 434S IgG1 = 3.8, vezes de 434S IgG2 = 4.9, vezes de 428L/434S IgG1 = 17.3, vezes de 428L/434S IgG2 = 14.8). Assim inesperadamente, o anticorpo IgG2 pode ser a melhor aplicação das variantes Fc para melhorar meia vida in vivo em mamíferos.

EXEMPLO 6. Imunoadesinas de variante

[0207] As variantes Fc da invenção também foram avaliadas quanto a suacapacidade de melhorar a meia vida de imunoadesinas (também chamdas de fusões Fc). Variantes Fc selecionadas foram engenheiradas no etanercept de imunoadesão anti-TNF (Enbrel®). Etanercept é uma fusão de receptor TNF humano 2 (TNF RII) e a região Fc de IgG1 humana e é clinicamente aprovado para o tratamento de artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, espondilite anquilosante, artrite psoríaca e psoríase. Uma versão de região Fc de IgG2 desta fusão Fc também foi construída e as variantes Fc selecionadas foram construídas neste contexto também. As sequências de aminoácido das imunoadesinas anti-TNF caracterizadas na invenção são fornecidas na Figura 16. Genes foram construídos usando PCR recursiva e subclonados no vetor pTT5 e variantes Fc foram construídas usando métodos de mutagênese QuikChange®. Imunoadesinas foram expressadas em células 293E e purificadas como descrito acima.

[0208] A especificidade de ligação das imunoadesinas purificadas foi confirmada por teste de ligação a TNF recombinante por Biacore. Imunoadesinas foram capturadas em um chip (Biacore) biosensor CM5 e Proteina A/G imobilizada (Pierce) gerado usando acoplamento de amina primária padrão. As imunoadesinas foram imobilizadas na superfície da Proteína A/G e TNF recombinante em diluições em série foi injetado sobre superfície ligada a anticorpo, seguido por uma fase de dissociação. Após cada ciclo, a superfície foi regenerada com tampão. Os dados foram processados zerando tempo e resposta antes da injeção de receptor e subtraindo de um canal de referência para compensar mudanças devidas às injeções. Dados cinéticos foram adequados a um modelo de ligação 1:1 (Langmuir). Constantes de associação de equilíbrio (Ka’s) obtidas destas adequações são fornecidas na Figura 17. Os resultados mostram que as imunoadesinas variantes retiveram afinidade para TNF comparável a enbrel comercial.

[0209] As imunoadesinas variantes foram testadas quanto a ligação a FcRn humano a pH 6.0 usando Biacore como descrito acima. Os resultados (Figura 18) indicam que, similar ao contexto de anticorpos, as variantes melhoram a ligação a FcRn em relação à sua imunoadesina original IgG1 e IgG2.

[0210] As meias vidas das imunoadesinas variantes foram testadas nos camundongos mFcRn-/- hFcRn+ como descrito acima. 12 camundongos por grupo foram injetados a 2 mg/kg de imunoadesina IgG1 variante e original. A concentração de soro foi detectada usando um ELISA similar àquele descrito acima, salvo que o anticorpo RII TNF anti-humano de cabra foi usado como reagente de captura; a deteção foi realizada com anticorpo kapa anti-humano biotinilado e estreptavidina rotulada com európio. A Figura 19 mostra dados da concentração de soro para imunoadesinas WT IgG1 Fc e Fc variante. Os parâmetros PK adequados, como descritos acima, do estudo PK são fornecidos na Figura 20. Igualmente é fornecido para cada variante o aumento percentual calculado na meia vida, calculado como 100 vezes a meia vida da fusão Fc variante sobre aquela do WT IgG1 Fc original. Os resultados indicam que as variantes estendem a meia vida in vivo no contexto da imunoadesina.

EXEMPLO 7. Experimento farmacocinético em primatas não humanos

[0211] As propriedades PK de biológicos em primatas não humanos estão bem estabelecidas para serem previsíveis as suas propriedades em humanos. Um estudo de PK foi realizado em macacos cynomolgus (macaca fascicularis) a fim de avaliar a capacidade dos anticorpos anti-VEGF variantes de melhorar a meia vida em primatas não humanos.

[0212] Na preparação para um estudo PK em macacos cynomolgus, a ligação dos anticorpos variantes ao cynomolgus (cyno) FcRn (cFcRn) a pH 6.0 foi medida. cFcRn foi construído, expressado e purified como descrito acima para FcRn humano. A ligação de anticorpos anti-VEGF variantes ao cFcRn foi medida usando Biacore como descrito acima. Os dados são fornecidos na Figura 21. Os resultados mostram que as variantes melhoram a afinidade para o cyno FcRn similarmente como elas fazem para FcRn humano. A dissociação a pH mais elevado (7.4) foi igualmente muito rápida (dados não mostrados), similar a que foi observado para ligação a FcRn humano. Estes resultados não são surpreendentes dada a alta homologia de sequência dos receptores humano e cyno (cadeia FcRn alfa 96%, beta-2-microglobulina 91%).

[0213] O PK das variantes foi estudado in vivo em primatas não humanos. Os macacos machos cynomolgus (macaca fascicularis, igualmente chamados crab-eating Macaque) pesando 2.3-5.1kg foram randomizados por peso e divididos em 5 grupos com 3 macacos por grupo. Aos macacos foi dada uma única infusão na veia periférica de 1 hora de 4 mg/kg de anticorpo. Amostras de sangue (1 ml) foram coletadas de uma veia separada de 5 minutos a 90 dias após a conclusão da infusão, processadas ao soro e armazenadas a -70C. Os animais não foram prejudicados durante estes estudos.

[0214] As concentrações de anticorpo foram determinadas usando o método de captura de VEGF como descrito acima. Os parâmetros PK foram determinados adequando as concentrações versus tempo a um modelo não compartimental como foi feito nos estudos PK de camundongo. Entretanto, os pontos no tempo do dia 10 ao dia 90 foram usados para determinações do parâmetro PK. Os resultados do PK são traçados na Figura 22, e os parâmetros adequados são fornecidos na Figura 23. Os resultados mostram que as variantes realçaram a meia vida in vivo do anticorpo até 3.2 vezes. No melhor caso (variante 428L/434S) a meia vida foi prolongada de 9.7 dias a 31.1 dias. Os resultados do PK obtidos em macacos cynomolgus são consistentes com aqueles obtidos em camundongos mFcRn-/- hFcRn+, validando o modelo de camundongo hFcRn como um sistema para avaliar as propriedades PK in vivo das variantes, e suportando as conclusões desses estudos.

[0215] Considerando que modalidades particulares da invenção foram descritas acima para finalidades de ilustração, será apreciado por aquelas hábeis na arte que variações numerosas dos detalhes podem ser feitas sem desviar da invenção como descrita nas reivindicações anexas. Todas as referências mencionadas neste são incorporadas em sua totalidade.

Claims (4)

1. Anticorpo anti-TNF, caracterizado pelo fato de que compreende: a. dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos, cada um possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; e, b. dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos, cada um possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, conforme definido na reivindicação 1, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade da mesma.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a doença autoimune é selecionada dentre: artrite reumatóide (RA), artrite idiopática juvenil (JIA), artrite psoríaca (PsA), espondilite anquilosante (AS) e doença de Crohn (CD).

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